JP2014523918A - 樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段を有する組成物 - Google Patents

Abstract

樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段、ならびにアジュバントとして顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むワクチンとして使用できる組成物。本組成物は、癌、バクテリア、ウイルス、真菌、寄生虫または原虫感染によって引き起こされる感染症、アレルギーおよび／または自己免疫疾患を処置するために使用できる。

Description

本発明は、樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とする（標的化する、又は標的指向化する）ための手段を含むワクチンとして使用することができる組成物に関する。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様はアジュバントとして使用される。一態様では、この組成物は、任意の温血動物における、癌、バクテリア、ウイルス、真菌、寄生虫または原虫感染によって引き起こされる感染症、アレルギー、および／または自己免疫疾患を処置するために使用できる。

発明の背景
ワクチンは、抗体を産生し、そして疾患に対する免疫性を提供する体内に注入される生物製剤である。ワクチンは予防的または治療的であり得る。ワクチンは、それらが製造できる容易さ、製造の低コスト、それらが投与される方法に関して潜在的な利点を提供する。有効なワクチンであるために特異的および強力なＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を誘発しなければならないので、治療用ワクチンの開発が課題である。

樹状細胞は、免疫応答のスペクトルを制御する高度に特異的抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。樹状細胞は、例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞のような、いくつかの免疫耐性機構を動員することができる。これらのリンパ球のそれぞれは、疾患細胞を認識し、そして殺す能力、ならびにＩＦＮ−γのような防御的サイトカインおよびＣＤ４Ｔ細胞を放出する能力をもつ。樹状細胞はまた、ＣＤ８^＋細胞溶解性細胞の援助と維持を提供し、一方、ＮＫおよびＮＫＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩ上の提示を妨げ、したがってＣＴＬ認識を免れる分子を排除することができる。このようにして、インビボにおいて抗原提示ならびにそれらが異なる機構により耐性を誘導しないように細胞を分化するための樹状細胞の成熟を達成するために、抗原が樹状細胞に運ばれることが免疫において非常に重要である。

抗原プロセシングから抗原提示細胞への樹状細胞の転移は、クラスＩおよびクラスＩＩ主要組織適合性タンパク質（ＭＨＣ）の発現の増加をしばしば伴う。活性化および成熟した樹状細胞は特異的Ｔ−細胞免疫を誘導し、癌および他の病状に対する耐性を誘導する。

多くの担体、例えばリポソーム、ミクロ粒子およびナノ粒子、更に毒素ベクター、ならびにモノクロナール及びポリクロナール抗体は、温血動物に種々の抗原を運搬することは周知の通りである。しかしながら、これらの担体の多くは、樹状細胞を標的とせず充分な免疫応答を刺激するための十分なアジュバント特性を有していない。

志賀毒素のＢサブユニット（毒素ベクター）は、直接または間接的にＧｂ３受容体を標的とするために使用できる汎用担体である。米国特許第6,613,882号は式Ｂ−Ｘのキメラポリペプチド（Ｂは志賀毒素のＢサブユニットまたはその機能等価物およびＸは治療的に有意なポリペプチドである）を記載する。米国特許第7,632,514 B2号は式ＳＴｘＢ−Ｚ（ｎ）−Ｃｙｓ−Ｘ（ＳＴｘＢは志賀毒素のＢサブユニットであり、Ｚはスルフィドリル基なしのアミノ酸リンカーであり、ｎは０、１、２またはポリペプチドであり、およびＣｙｓはシステインである）をもつ担体を記載する。

米国特許第0100266672号は、志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的機能等価物（Ｇｂ３受容体に結合することができ、および少なくとも最初の抗原と複合体を形成する）含み、そして、さらに第二の抗原および金属塩、油および水のエンマルジョン、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド、サポニンならびにそれらの組合せのグループから選択されるアジュバントを含む、ワクチン組成物を記載する。

様々な種類の担体がワクチンとして使用されているが、免疫原性、そしてそれゆえ様々な病状を処置するためのワクチンの有効性を改善するために、当分野における必要性が依然として存在する。

発明の要約
本発明は、樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段、当該手段に結合された当該少なくとも一つの抗原、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物を提供する。

別の態様では、本発明は、少なくとも一つの抗原と結合された樹状細胞を標的とする担体、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物を提供する。本態様では、担体は樹状細胞を標的とする任意の担体、例えば、抗体と複合されたリポソーム、抗体と複合されたミクロ粒子および抗体と複合されたナノ粒子、樹状細胞を標的とする毒素担体、または樹状細胞を標的とするモノクロナールもしくはポリクロナール抗体であることができる。モノクロナールまたはポリクロナール抗体のフラグメントは、それらがそれらの標的能力を維持する限りにおいてまた使用できる。

別の態様では、当該樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段は、抗−ＤＥＣ２０５抗体、好ましくはＣＤ２０５、ＮＬＤＣ−１４５、樹状細胞標的能力を維持するそれらのフラグメントおよびそれらの混合物である。

さらに別の態様では、本発明は、志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的機能等価物（樹状細胞を標的とし、少なくとも一つの抗原と結合された）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物を提供する。

本発明の組成物において、当該樹状細胞を標的とするための手段、または、当該樹状細胞を標的とする担体、樹状細胞を標的とする毒素担体、または樹状細胞を標的とするモノクロナールもしくはポリクロナール抗体、樹状細胞を標的とする志賀毒素のＢサブユニット、あるいはそれらの免疫学的機能等価物は、共有結合によって、または静電気的もしくは疎水性相互作用によって、または融合タンパク質として、少なくとも一つの抗原に結合される。

システイン基またはＺ（ｎ）−Ｃｙｓ基（Ｚはスルフィドリル基の欠如したアミノ酸であり、そしてｎは０、１またはポリペプチドである）を介して化学結合により、当該少なくとも一つの抗原と結合された志賀毒素のＢサブユニットまたは当該その免疫学的機能等価物は、本発明の別の態様である。

当該少なくとも一つの抗原は、癌抗原、感染症からの抗原（例えば、バクテリア抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原または原虫抗原）、自己免疫抗原、アレルギー抗原、およびそれらの混合物であることができる。したがって、当該組成物は、温血動物における様々な医学的疾患を処置するために使用できる。

少なくとも一つの抗原と結合された樹状細胞を標的とするための手段、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む、細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化するための組成物は、本発明のまた別の実施態様である。

少なくとも一つの抗原と結合された樹状細胞を標的とするための担体、または少なくとも一つの抗原と結合された樹状細胞を標的とするための毒素担体、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合されたモノクロナールもしくはポリクロナール抗体、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む、細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化するための組成物は、本発明のまた別の実施態様である。

樹状細胞を標的とし、そして少なくとも一つの抗原と結合された志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的機能等価物、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む、細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化するための組成物は、本発明のまた別の実施態様である。

本発明のさらに別の態様において、本明細書に記載の組成物は、薬物として、好ましくはワクチンとして使用される。したがって、本明細書に記載の組成物は、癌、バクテリア、ウイルス、真菌、寄生虫または原虫によって引き起こされる感染症、アレルギーおよび／または自己免疫疾患を処置するために使用できる。それらはまた、乳がんを処置するために使用できる。

さらに別の態様では、本発明は、少なくとも一つの抗原と結合された樹状細胞を標的とするための手段、または少なくとも一つの抗原と結合された樹状細胞を標的とする担体、または少なくとも一つの抗原と結合された樹状細胞を標的とする毒素担体、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合されたモノクロナールもしくはポリクロナール抗体、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む、温血動物にワクチン接種するための医薬の製造のための組成物を提供する。

さらに別の態様では、本発明は、志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的機能等価物（樹状細胞を標的とし、そして少なくとも一つの抗原と結合された）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む、温血動物にワクチン接種するための医薬の製造のための組成物を提供する。

少なくとも一つの抗原と結合された樹状細胞を標的とするための手段、または少なくとも一つの抗原と結合された樹状細胞を標的とするための担体、または少なくとも一つの抗原と結合された樹状細胞を標的とする毒素担体、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合されたモノクロナールもしくはポリクロナール抗体、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む、温血動物における癌、バクテリア、ウイルス、真菌、寄生虫または原虫感染によって引き起こされる感染症、アレルギーおよび自己免疫疾患を処置するための医薬の製造のための組成物は、本発明のさらに別の実施態様である。

志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的機能等価物（樹状細胞を標的とし、そしてなくとも一つの抗原と結合された）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む、温血動物における癌、バクテリア、ウイルス、真菌、寄生虫または原虫感染によって引き起こされる感染症、アレルギーおよび自己免疫疾患を処置するための医薬の製造のための組成物は、本発明のさらに別の実施態様である。

少なくとも一つの抗原と結合された、樹状細胞を標的とするための手段、または樹状細胞を標的とする担体、または樹状細胞を標的とする毒素担体、あるいは樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合されたモノクロナールもしくはポリクロナール抗体、あるいは志賀毒素のＢサブユニットもしくはその免疫学的機能等価物（樹状細胞を標的とし、そしてＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原と結合された）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む、乳癌、バクテリア、ウイルス、真菌、寄生虫または原虫感染によって引き起こされる感染症を処置するための医薬の製造のための組成物は、本発明のさらに別の実施態様である。

本明細書に記載の組成物と薬学的に許容されるビヒクルを含む、ワクチン接種のためのキットは、本発明の別の実施態様である。このワクチンは温血動物に同時、連続的、または別個の投与に適している。

別の態様では、本発明は、細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化するための方法を提供し、このような活性化を必要とする温血動物に、樹状細胞を標的とするための手段、または樹状細胞を標的とする担体、または少なくとも一つの抗原と結合された樹状細胞を標的とする毒素担体、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合されたモノクロナールもしくはポリクロナール抗体、または志賀毒素のＢサブユニットもしくはそれらの免疫学的機能等価物（樹状細胞を標的とし、そして一つの抗原と結合された）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物を投与することを含む方法を提供する。

温血動物における癌またはバクテリア、ウイルス、真菌、寄生虫または原虫感染によって引き起こされる感染症、アレルギーおよび自己免疫疾患を処置するための方法であって、そのような処置を必要性とする温血動物に、少なくとも一つの抗原と結合された樹状細胞を標的とするための手段、または少なくとも一つの抗原と結合された樹状細胞を標的とする担体、または少なくとも一つの抗原と結合された樹状細胞を標的とする毒素担体、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合されたモノクロナールもしくはポリクロナール抗体、または少なくとも一つの抗原と結合された志賀毒素のＢサブユニット、志賀毒素のＢサブユニットの免疫学的機能等価物（樹状細胞を標的とし、そして一つの抗原と結合された）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物を投与することを含む方法が、まださらに本発明の別の態様である。

乳がんを処置するためのさらに別の方法は、そのような乳がんの処置を必要とするヒトに、ＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原と結合された樹状細胞を標的とするための手段、またはＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原と結合された樹状細胞を標的とする担体、またはＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原と結合された毒素担体、またはＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原と結合された樹状細胞を標的とするモノクロナールもしくはポリクロナール抗体、または志賀毒素のＢサブユニットまたは志賀毒素のＢサブユニットとそれらの免疫学的機能等価物（樹状細胞を標的とし、そしてＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原と結合された）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物を投与することを含む方法が、まださらに本発明の別の態様である。

他の態様および実施態様は下記に記載され、または好ましい実施態様の以下の記述から容易に発生するであろう。

図１は、志賀毒素のＢサブユニット−ОＶＡ_{２５７−２６４}またはОＶＡ_{２５７−２６４}のみを２０μgのＧＭ−ＣＳＦ／ＣｐＧと共にマウスにワクチン接種した後の、エリスポットアッセイにおけるＬＴ−ＣＤ８抗−ОＶＡのＣＴＬ誘導を示す棒グラフである。これらの棒グラフは、グループによる４匹のマウスの平均値±標準偏差を示す。 図２は、志賀毒素のＢサブユニット−ОＶＡ_{２５７−２６４}またはОＶＡ_{２５７−２６４}のみを種々の濃度のαＧａｌ Ｃｅｒ、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＡまたはＧＭ−ＣＳＦ／ＣｐＧと共にマウスにワクチン接種した後の、四量体分析による抗−ОＶＡのＣＴＬ誘導における比較分析を示す棒グラフである。四量体Ｋ^ｂ−ОＶＡ_{２５７−２６４}の誘導が測定され、平均値±標準偏差で示される。 図３は、マウスにおけるＨｅＲ−２／ｎｅｕ ＨＬＡ−Ａ２限定四量体の四量体分析を用いた、志賀毒素のＢサブユニットと共にアジュバントとしてのＧＭ−ＣＳＦとＣｐＧの使用の間での共同作用を示す棒グラフである。マウスは、ＨｅＲ−２／ｎｅｕペプチドに結合された志賀毒素のＢサブユニットのみで、またはＣｐＧ（５０μg）と、またはＧＭ−ＣＳＦ（２０μg）と、または同量のＧＭ−ＣＳＦとＣｐＧの組合せとの混合物で免疫された。 図４は、２０μgＧＭ−ＣＳＦと共に、ＨＬＡ−Ａ２によって限定されたＨｅＲ−２／ｎｅｕペプチド（KIFGSLAFL（配列番号２）および配列RRAR（配列番号３））に相当するペプチドIBC002（RRARKIFGSLAFL（配列番号１））またはベクター化されていないペプチドIBC002または隣接配列無しの天然のＨｅＲ−２／ｎｅｕペプチドに結合された志賀毒素のＢサブユニットのエリスポットアッセイによるマウスにおけるＣＴＬ誘導の結果を示す棒グラフである。５０μgのＣｐＧは翌日に投与された。２回目の免疫はアジュバントなしで１４日目に実施された。 図５は、エリスポットアッセイにおいて、０．０１μg／mLＨｅＲ２／ｎｅｕ_{３６９−３７７}の低濃度で活性化された時、ワクチン接種後に誘導された抗−ＨｅＲ２／ｎｅｕ_{３６９−３７７}ＣＤ８^＋Ｔ細胞は良好な結合活性をもつことを示す棒グラフである。免疫およびエリスポットによるＣＴＬの活性化の新事実は、図４で記述されたように実施された。続く操作は実施例７で明らかにされる。 図６は、アジュバントとしてのＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧの組合せは、抗−ＤＥＣ２０５−ОＶＡ_{２５７−２６４}ＣＤ８^＋Ｔ細胞を誘発するために抗−ＤＥＣ２０５−ОＶＡ_{２５７−２６４}と共同作用した。この誘導は四量体Ｋ^ｂ−ОＶＡ_{２５７−２６４}で測定された。無関係のコントロールの四量体は各実験に含まれ、それによって観察されたバックグランド値（常に＜０．０５％）が特異値のために差し引かれた。図６Ａは、抗−ＤＥＣ２０５−ОＶＡ_{２５７−２６４}のみ（右）、またはＧＭ−ＣＳＦ（２０μg）およびＣｐＧ（５０μg）との組合せ（左）でマウスに皮下免疫した後に得られた特異抗−ОＶＡ_{２５７−２６４}特異ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセントの図解である。 図６は、アジュバントとしてのＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧの組合せは、抗−ＤＥＣ２０５−ОＶＡ_{２５７−２６４}ＣＤ８^＋Ｔ細胞を誘発するために抗−ＤＥＣ２０５−ОＶＡ_{２５７−２６４}と共同作用した。この誘導は四量体Ｋ^ｂ−ОＶＡ_{２５７−２６４}で測定された。無関係のコントロールの四量体は各実験に含まれ、それによって観察されたバックグランド値（常に＜０．０５％）が特異値のために差し引かれた。図６Ｂは、抗−ＤＥＣ２０５−ОＶＡ_{２５７−２６４}のみ、またはＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧと組合せて免疫されたマウスからの、抗−ОＶＡ_{２５７−２６４}ＣＤ８^＋Ｔ細胞の平均値（ｎ＝４マウス／グループ）±標準偏差を示す棒グラフである。コントロールの無関係な四量体で得られた平均バックグランド値がまた示されている。

好ましい実施態様の説明
本明細書で使用される略語「ＡＰＣ」は、抗原提示細胞を意味し、それらは、Ｔ細胞受容体と相互作用することができるその表面で外来抗原および主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）との複合体を提示する細胞である。

本明細書で使用される略語「ＧＭ−ＣＳＦ」は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を意味し、本発明の概要ではアジュバントとして使用される。

本明細書で使用される略語「ＩＦＡ」は不完全フロイドアジュバントを意味する。

略語「ＣＴＬ」は、細胞傷害性Ｔリンパ球を意味し、他の標的細胞を殺すリンパ球である。多くのＣＴＬはＴ細胞のＣＤ８^＋サブセットに属し、抗原のためのαβＴ−細胞受容体（ＴＣＲ）を使いて、クラスＩＭＨＣの溝に抗原を認識し、もしそれらが樹状細胞、ＴＣＲに特異的である抗原／ＭＨＣに遭遇したら、それらは細胞サイクルに入り「キラー細胞」に分化する。

略語「ＮＨＣ」は、主要組織適合遺伝子複合体を意味し、本明細書で使用されるように、Ｔリンパ球にペプチド抗原を提示するための免疫系機構である。

本明細書で使用される用語「アジュバント」は、薬物またはワクチンの薬理学的効果を助けるか、もしくは高める、または免疫系を刺激するために抗原の能力を増加する任意の物質を意味する。

本明細書で使用される「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド」は、Ｔｏｌｌ−様受容体９（ＴＬＲ９）に結合する非メチル化ＣｐＧモチーフを有する短いＤＮА配列である。ＴＬＲは、ＭＨＣおよび他の刺激分子のアップレギュ−ションを引き起こすＢ細胞および形質細胞様樹状細胞上に発現した受容体であり、より強力なＡＰＣ仲介性Ｔ細胞刺激をさらにもたらす。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの例は、ОＤＮ ２００６、ОＤＮ Ｄ３５、ОＤＮ １０１８ ＩＳＳ、ОＤＮ １７５８、ОＤＮ １８２６、ОＤＮ ２２１６、ОＤＮ ２００７、ОＤＮ １６６８、ОＤＮ １７２０、ОＤＮ ２００６、ОＤＮ ２０４１、ОＳＮ ７９０９、ＣｐＧ−２８等である。

本明細書で使用される「結合された」は、当該少なくとも一つの抗原と樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とする手段を物理的に結合するために当業者に公知のすべての可能な手段を包含する。特に、そのような用語は、樹状細胞を標的するための手段に化学的に結合している少なくとも一つ抗原、または樹状細胞を標的するための手段に遺伝子的に融合したまたは静電気的もしくは疎水性相互作用または他の相互作用を経て会合している少なくとも一つの抗原を指す。したがって、少なくとも一つの抗原は、樹状細胞を標的とする手段または樹状細胞を標的とするための担体、または志賀毒素のＢサブユニットのような樹状細胞を標的とするための毒素担体、または静電気的もしくは疎水性相互作用を経て樹状細胞を標的とするポリクロナールもしくはモノクロナール抗体と物理的に会合している、または化学的もしくは融合タンパク質を通して共有結合することができ、または米国特許第7,632,514号に記載されたようにシステイン残基を経て結合することができる。

本明細書で使用される用語「温血動物」は鳥類および哺乳動物類を含む。

本発明の組成物および方法で処置できる鳥類の実施例は、ルリツグミ、カーディナル、鳩、鷲、ガチョウ、七面鳥、雄鶏、雌鶏、アヒル、ウズラ、サギ、ツバメ、キツツキ、フクロウ、オオム等を含む。

用語「哺乳動物」は、ヒトを含み、皮膚を毛で被われている、雌であり、若年層を養うための乳産生の乳腺を特徴とする哺乳綱の種々の温血脊椎動物のすべてを包含する。特に動物は異なった医療病状をまた持ち得ることがよく知られているので、本発明はヒトの処置に限定されるのではなく、獣医的用途もまた包含する。

本発明の組成物と方法で処置される哺乳動物の実施例は、ヒト、飼育動物（例えば、犬および猫）、ウマ、マウス、ヤギ、シカ、ウシ、ウサギ、動物園の動物、クマ、サル、類人猿、ヒラジカ、バイソンを含むが、とはいえ、本発明はさらに他の哺乳動物種にも適用されうる。

本明細書で使用される略語「ＬＴ−ＣＤ８」は、身体の細胞を監視し、およびＭＨＣクラス経路における外来抗原フラグメントを発現する任意の細胞を破壊する細胞傷害性Ｔリンパ球であるＣＤ８^＋Ｔリンパ球を意味する。

本明細書で使用される略語「樹状細胞」は、形質細胞様樹状細胞、ＣＤ８^＋樹状細胞、ＣＤ８^-樹状細胞、骨髄系樹状細胞、炎症性樹状細胞、Ｔｉｐ樹状細胞およびランゲルハンス細胞を含むいずれものタイプの樹状細胞を意味する。このように、樹状細胞は、移住性樹状細胞（例えば、ランゲルハンス細胞および真皮樹状細胞）、リンパ組織常在性樹状細胞（例えば、胸腺および脾臓樹状細胞）および炎症性樹状細胞を含む。

「樹状細胞を標的とするための手段」によって、抗体、抗体と複合されたリポソーム、生体物質（例えば、抗体と複合されたナノ粒子、抗体と複合されたミクロ粒子）および毒素ベクターのような任意の手段を含む。別の態様において、樹状細胞を標的とする抗体は少なくとも一つの抗原に直接複合できる。抗体は樹状細胞受容体を標的とするモノクロナールまたはポリクロナール抗体でありうる。樹状細胞に抗原を標的とすることができる抗体の例は、マンノース受容体、Ｆｃγ受容体、アシアロ糖タンパク質受容体、血液ＤＣ抗原２（ＢＤＣＡ−２）、Ｃｌｅｃ９Ａ、Ｃｌｅｃ１２Ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８、ｃＤＣ、ＤＣＩＲ−２、ＦＩＲＥ、ＣＩＲＥ、ｄｅｃｔｉｎ−１、ｄｅｃｔｉｎ−２、ＤＣ−ＳＩＧＮ、Ｌ−ＳＩＧＮ、ＭＡＮＲ、ＭＭＲ、ＭＧＬ、ＣＤ２３、ＣＤ６９、ＣＤ９４、Ｌｙ−４９およびＮＫＧ２を標的とする抗体を含む。このように、抗−マンノース受容体抗体、抗−Ｃｌｅｃ９Ａ抗体、抗−Ｃｌｅｃ１２Ａ抗体、抗−ＣＤ１１ｃ抗体、抗−ＣＤ８抗体、抗−ｃＤＣ抗体、抗−ＤＣＩＲ−２抗体、抗−ＦＩＲＥ抗体、抗−ＣＩＲＥ抗体、抗−ｄｅｃｔｉｎ−１抗体、抗−ｄｅｃｔｉｎ−２抗体、抗−ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体、抗−Ｌ−ＳＩＧＮ抗体、抗−ＭＡＮＲ抗体、抗−ＭＭＲ抗体、抗−ＭＧＬ抗体、抗−ＣＤ２３抗体、抗−ＣＤ６９抗体、抗−ＣＤ９４抗体、抗−Ｌｙ−４９抗体および抗−ＮＫＧ２抗体が、本発明の組成と方法に使用できる。これらの抗体のフラグメントは、それらが樹状細胞に標的能力を維持する限り、また使用できる。

志賀毒素のＢサブユニットに関して「その免疫学的に機能等価物」によって、実施態様は、毒素が志賀毒素のＢサブユニットのように免疫学的に作用し、そしてＧｂ３細胞に結合することができ、および／またはそれらが少なくとも一つの抗原を内在化でき、そのようにして少なくとも一つの抗原が同じ抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩ経路またはＭＨＣクラスＩおよびＩＩ経路に提示されうることが意味される。さらに、免疫学的に機能等価物は樹状細胞を標的とすることができる。

本明細書で使用される「処置する」は、温血動物に医療や注意を与えることおよび／または特に治療用ワクチンまたは予防用ワクチンでありうるワクチンによって疾患と闘うことを意味する。

「ＣｐＧ−様」オリゴデオキシヌクレオチドとは、そのオリゴデオキシヌクレオチドは、互いに隣接した多量のヌクレオチドＧおよびＣの同じ内部モチーフを有するが、外部モチーフ（それらはＧとＣのヌクレオチドではなくＴｏｌｌ−様受容体９によって認識される）において異なりうることを意味する。内部のＧとＣヌクレオチドは、オリゴデオキシヌクレオチドの長さに基づいて少なくとも５０％ＧＣ含量を有する。

本明細書で使用される「少なくとも一つの抗原」とは、唯一の抗原が標的とされる、または一つ以上の抗原（本明細書で記載されたように例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の抗原）が手段または担体または毒素担体またはモノクロナールもしくはポリクロナール抗体によって、標的とされうることを意味する。本明細書で記載されたように、標的とするための手段、担体、または毒素またはモノクロナールもしくはポリクロナール抗体と結合できる異なった抗原の混合物は、本発明によってまた包含され、同様に、抗原のフラグメントはこれらのフラグメントがそれらの抗体産生活性を保持することを提供した。

さらに本発明によって包含されるのは、また、本発明に記載されたように、異なった抗原と結合させた、異なった担体または毒素担体またはモノクロナールもしくはポリクロナール抗体の混合物であり、本発明に記載されたように、異なった担体または毒素担体またはモノクロナールもしくはポリクロナール抗体とそれらに結合された異なった抗原とのこれらの異なった混合物の投与である。

「本質的に構成される」により、主要要素は組成物またはワクチンに存在するが、しかし、その組成物またはワクチンに物質的に影響を与えない微量の成分がまた存在しうることを意味する。

用語、「含む」、「から構成される」および「から本質的に構成される」は、本明細書を通じて交換されることができる。

より具体的には、本発明は、樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物を提供する。標的とするための手段は少なくとも一つの抗原と結合されている。

これらの組成物、本明細書に記載されたように、薬物、好ましくはワクチンとして使用できる。本ワクチンは、既存の病状を処置することができ、そしてしたがって治療用ワクチンであり、または、病状の進展を防ぐためであり、そしてしたがって予防用ワクチンである。予防用ワクチンは一般に体液性応答を起こし、一方、治療用ワクチンは一般にＣＤ８^＋Ｔリンパ球応答を引き起こすことが理解されるべきである。治療用ワクチンは、本明細書に記載の組成物および方法において特に重要である。

標的とするための手段は、抗体またはそのフラグメント（フラグメントが樹状細胞に標的能力を維持する）と結合されたリポソーム、抗体または抗体フラグメント（抗体フラグメントが樹状細胞に標的能力を維持する限り）と結合されたナノ粒子またはミクロ粒子のような生体物質、少なくとも一つの抗原と結合された毒素ベクターまたは樹状細胞を標的とするモノクロナールもしくはポリクロナール抗体（少なくとも一つの抗原と結合された）ならびにそれらの組合せのような手段を含む。

別の態様では、本発明は、少なくとも一つの抗原と結合された樹状細胞を標的とする担体、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物を提供する。この態様において、担体は、標的能力を維持する抗体またはそれらのフラグメントと結合されたリポソーム、抗体または抗体フラグメント（抗体フラグメントが樹状細胞に標的能力を維持する限りにおいて）と結合されたナノ粒子またはミクロ粒子のような生体物質、樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された毒素ベクター、およびこれらの組合せのような任意の担体で有り得る。別の態様では、樹状細胞を標的とするモノクロナールまたはポリクロナール抗体は少なくとも一つの抗原と結合される。

任意のタイプのリポソームは少なくとも一つの抗原を捕捉するために使用できる。天然または合成リン脂質（例えば、フホスホグリセリドおよびスフィンゴ脂質）はリポソームを製造するために使用できる。天然のリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびホスファチジルセリン）が使用できる。使用できる合成リン脂質はジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを含む。コレステロールは、用途によってはリポソームに組込むことができる。コレステロールは、コレステロール：ＰＣの比率、１：１または２：１モルで変化する濃度で組込むことができる。

リポソームは単層小胞または多重層小胞でありうる。リポソームはまた架橋できる。

本発明のリポソームは、受動的充填法または能動的充填法を用いて、当業者に公知の方法によって作ることができる。機械的分散法の例は、脂質フィルム水和法、ミクロエマルジョン法、超音波処理、フレンチプレス法、膜押し出し法（membrane extrusion methods）、乾燥再構成小胞法および凍結融解リポソーム法を含む。溶媒分散法は、エタノール注入、エーテル注入、二重エマルジョン小胞、逆相蒸発小胞および安定複数層小胞を含む。界面活性剤（例えば、コール酸塩およびTriton X（登録商標）１００）の使用、および透析、希釈またはカラムクロマトグラフィーによる界面活性剤の除去がリポソーム調製のためにまた使用できる。

少なくとも一つの抗原は、またナノ粒子を介して樹状細胞に輸送されうる。これらの粒子は１００ｎｍに等しいか、より小さいサイズである。それらは、天然の物質またはその誘導体、デンドリマー、フラーレン、ポリマー、シリカ、アルブミン、金、ヒドロゲル、および当業者に公知の他の物質から製造できる。ナノ粒子を製造するための天然物質の例は、キトサン、デキストラン、ゼラチン、アルギン酸塩、およびデンプンを含む。本発明のナノ粒子に使用できる様々なポリマーは、ポリ乳酸、ポリ（シアノ）アクリル酸塩、ポリエチレンアミン、ブロック共重合体、ポリカプロラクトン、およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール）（ＰＬＧＡ）酸を含む。

ナノ粒子は、デキストランコーティング、腸溶コーティング、ポリマーコーティング、金コーティング、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングおよび炭化水素コーティングなどの種々の物質でコーティングすることができる。

ナノ粒子は、摩擦、熱分解のような異なった方法を用いて、熱プラズマ法、気相法、多重エマルジョン溶媒蒸発法、ガス流量フォーカシング、エレクトロスプレイ、流体ナノ沈殿法、乳化拡散蒸発法、変更された位相反転／溶媒拡散法またはゾル−ゲル法を用いて、作ることができる。これらの方法は文献に記載されていて、当業者に公知である。

ミクロ粒子は、０．１〜１００μmの間のサイズをもつ粒子である。それらは、ナノ粒子のそれらと同様の物質を使って天然および合成ポリマーから製造される。したがって、セルロース、でんぷん、リゾホスファチジルコリン、ポリ（乳酸）、ホスホリルコリン、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、アルギン酸−スペルミン、ポリアミノ酸、ポリフォスファゼン、アルブミン、デキストラン、オイドラギットＳ１００、オイドラギットＬ１００、ゼラチンおよび３−（トリエトキシシリル）プロピル−末端ポリジメチルシロキサンは、ミクロ粒子をつくるために使用される物質のいくつかである。本発明のミクロ粒子は、他の物質でまたグラフト化されることができる。例として、ポリメチルメタアクリレートまたはポリアクリレートでグラフト化されたデンプンミクロ粒子またはシリコン−グラフト化デンプンミクロ粒子。

ミクロ粒子は、またナノ粒子のために上述したのと同じようなコーティング；すなわちデキストランコーティング、腸溶コーティング、ポリマーコーティング、金コーティング、オイドラギットＳ１００コーティング、ＰＥＧコーティングおよび炭化水素コーティングを用いてコートされることできる。

ミクロ粒子を処方する際に、いくつかの方法、例えば、噴霧乾燥、エマルジョン／蒸発、二重エマルジョン／蒸発、塩析、溶媒置換／沈殿法、凍結調製、およびオイルエマルジョン中のオイル／溶媒蒸発を使用することができる。これらおよび他の方法は、文献（例えば、Kendall et al, Eur. J. Pharm, Sci 37, 284-290 (2009)を参照）に記載されており、当業者に公知である。

樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段、樹状細胞を標的とする担体に関して、リポソーム、ミクロ粒子またはナノ粒子は、少なくとも一つの抗原がこれらの担体の内部に処方される。別の態様において、少なくとも一つの抗原はこれらの担体の外部に処方される。さらに別の態様において、少なくとも一つの抗原はこれら担体の内部および外部に処方される。異なった抗原の混合物は、本明細書に記載されたのと同様にして処方されることができる。

リポソーム、ミクロ粒子またはナノ粒子担体の内部に少なくとも一つの抗原を被包するために、担体は少なくとも一つの抗原の高濃度を含む媒質中で処方できる。非カプセル化抗原または抗原は、サイズ排除クロマトグラフィーまたは平衡透析のいずれかによって担体から除去できる。

少なくとも一つの抗原がリポソーム、ミクロ粒子またはナノ粒子担体の外部にあることが望まれる場合には、少なくとも一つの抗原は当業者に公知の手段（例えば静電気的もしくは疎水性相互作用を経て）を使って担体と結合でき、または化学的に共有結合できる。

少なくとも一つの抗原は、またリンカーを通して担体に付けることができる。使われるリンカーの種類は、担体のタイプ、担体に使われる物質およびそれらに複合されるべき少なくとも一つの抗原に依存する。リンカーの例は、チオール基結合、アルキル基結合、グリコール基結合、ペプチド基結合およびアルキルジスルフィド結合を含む。

他にも、リポソーム、ミクロ粒子またはナノ粒子を外部に付けられた、または内部に被包された、または両方に付けられた少なくとも一つの抗原は、これらの担体の外側にまた付けられる樹状細胞に抗原を標的とすることができるポリクロナールまたはモノクロナール抗体を有する。これらは、樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的するための手段である。抗体をリポソーム、ミクロ粒子またはナノ粒子に結合するいかなる手段（例えば、非共有結合、共有結合、吸着、静電気的もしくは疎水性相互作用を介して）を使用できる。

樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするために使われる抗体は、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体またはポリクロナールもしくはモノクロナール抗体のフラグメント（フラグメントがそれらの標的能力を維持する限りにおいて）であることができる。抗体はまたキメラ抗体でありうる。それらはポリクロナールおよびモノクロナール抗体ならびにそれらのフラグメントである。本発明に使用されるフラグメントは樹状細胞に結合する能力を保持するべきである。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ならびに樹状細胞に少なくとも一つの抗原を運搬する抗体のＦａｂフラグメントがまた使用できる。

別の態様では、ダイアボディ（例えば、Hollinger, P. and Winter, G. in Cancer Immunology, Immunotherapy vol 45 no,3-4 pp.128-130 (1997)によって記載された）、二特異性抗体（例えば、Hollinger et al, PNAS vol. 90 no. 14 pp6444-6448 (1993)に記載された）およびミニボディ（例えば、Tramontano et al in Journal of Molecular Recognition vol. 7 no. 1 pp9-24 (1994)により記載された）が使用できる。

本発明の抗体はマウス抗体またはヒト抗体であり得る。必要であれば、マウス抗体は、
「脱マウス化」（demurinization）されることができる。

樹状細胞に組成物を標的とするための本発明に使用される抗体の具体例は、マンノース受容体、Ｆｃγ受容体、アシアロ糖タンパク受容体、血液ＤＣ抗原２（ＢＤＣＡ−２）、ＣＤ２０５、ＮＬＤＣ−１４５、ＣｌｅＣ９Ａ、ＣｌｅＣ１２Ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８、ｃＤＣ、ＤＣＩＲ−２、ＦＩＲＥ、ＣＩＲＥ、ｄｅｃｔｉｎ−１、ｄｅｃｔｉｎ−２、ＤＣ−ＳＩＧＮ、Ｌ−ＳＩＧＮ、ＭＡＮＲ、ＭＭＲ、ＭＧＬ、ＣＤ２３、ＣＤ６９、ＣＤ９４、Ｌｙ−４９およびＮＫＧ２を標的とする抗体を含む。したがって、抗−マンノース受容体抗体、抗−ＣｌｅＣ９Ａ抗体、抗−ＣｌｅＣ１２Ａ抗体、抗−ＣＤ１１ｃ抗体、抗−ＣＤ８抗体、抗−ｃＤＣ抗体、抗−ＤＣＩＲ−２抗体、抗−ＦＩＲＥ抗体、抗−ＣＩＲＥ抗体、抗−ｄｅｃｔｉｎ−１抗体、抗−ｄｅｃｔｉｎ−２抗体、抗−ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体、抗−Ｌ−ＳＩＧＮ抗体、抗−ＭＡＮＲ抗体、抗−ＭＭＲ抗体、抗−ＭＧＬ抗体、抗−ＣＤ２３抗体、抗−ＣＤ６９抗体、抗−ＣＤ９４抗体、抗−Ｌｙ−４９抗体および抗−ＮＫＧ２抗体が、本発明の組成物と方法に使用できる。種々の抗体の混合物ならびにこれらの抗体のフラグメントが、それらが標的能力を保持する限りにおいて、また使用できる。

好ましい実施態様において、抗体は抗−ＤＥＣ２０５抗体、好ましくはＣＤ２０５、ＮＬＤＣ−１４５、樹状細胞標的能力を保持するそれらのフラグメント、およびそれらの混合物である。

一態様において、ＤＥＣ２０５膜糖タンパク質を標的とする標的抗体および本態様で使用できる抗体は、ＣＤ２０５抗体およびＮＬＤＣ−１４５抗体、およびそれらの混合物、およびそれらのフラグメント（抗体フラグメントがそれらの標的能力を保持する限りにおいて）である。

ポリクロナールおよびモノクロナール抗体ならびにそれらのフラグメントを産生する方法は、当業者に周知である。ポリクロナール抗体またはそれらの抗体フラグメントのために、精製されたポリペプチドのような免疫原、担体（例えば、ＧＴＳ、キーホールリンペットヘモシアニンまたは任意の適切な担体）に結合されたポリペプチド、または免疫ベクターに組込まれたポリペプチドがアジュバントと混合され、そして動物がその混合物で免疫される。免疫原調製物に対する動物の応答は、試験血を採取し、目的のポリペプチドに対する活性の力価を測定してモニターする。免疫原に対して適切なレベルの抗体が得られた時、血液を動物から回収し、そして抗血清を調製する。

モノクロナール抗体またはそれらのフラグメントの調製のために、動物は選択された抗原で免疫される。抗体形成細胞は、動物の脾臓から単離され、そして前もって培養によって増殖された腫瘍細胞に融合される。得られたハイブリドーマは培養によって増殖され、次にモノクロナール抗体は単離され、精製される。例えば、Kohler and Milstein Nature 256 (5517) pp. 495 (1975); Riechmann et al Nature 332 (6162) pp.323-327 (1998); Goding Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2^nd ed) Academic Press, New York, N.Y. (1986)を参照。

一実施態様では、少なくとも一つの抗原が、樹状細胞標的能力を保持する樹状細胞標的抗体または抗体フラグメントと直接結合される。本実施態様では、少なくとも一つの抗原は直接またはリンカーを介して抗体に結合される。少なくとも一つの抗原を結合する方法は、共有結合によって、融合タンパク質として、または静電気的もしくは疎水性相互作用もしくはイオン的相互作用によってできる。使用できるリンカーの例は、チオール基結合、アルキル基結合、グリコール基結合、ペプチド基結合およびアルキルジスルフィド基結合を含む。

長鎖ペプチドまたはリポペプチドは、樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするためにまた使用できる。例は、種々のバクテリアからのジアシル化リポタンパクおよび脂質基を含む。

樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするために使用できる毒素ベクターの例は、志賀毒素、本明細書に記載される志賀様毒素、炭疽菌毒素、ジフテリア毒素、アデニレートシクラーゼ毒素、コレラ毒素、シュードモナス外毒素などを含む。これら毒素の非毒素サブユニットが、任意の毒素サブユニットなしでまた使用できる。少なくとも一つの抗原とこれらの毒素を結合するための方法は、共有結合によって、融合タンパク質として、または静電気的もしくは疎水性相互作用またはイオン的相互作用によってできる。

志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的機能等価物（樹状細胞を標的とし、そして少なくとも一つの抗原を結合された）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物は本発明の別の態様である。

志賀毒素のＢサブユニットの配列は、Strockbine et al., J. Bacteriol, 170, 1116-22 (1988)に記載されている。免疫学的機能等価物は、毒素がＧｂ３受容体と結合でき、および／または抗原の内在化、およびＭＨＣクラスＩ経路またはＭＨＣクラスＩとＩＩの両方の経路への抗原の提示を引き起こす。したがって、大腸菌（E. coli）からの志賀様毒素（例えば、志賀様毒素１、志賀様毒素２および志賀様毒素２バリアント（例えば、志賀様毒素２ｃ、志賀様毒素２ｄ１、志賀様毒素２ｄ２、志賀様毒素２ｅ、志賀様毒素２ｆ、志賀様毒素２ｙ））のＢサブユニットがすべて免疫学的異能等価物と考えることができる。実施態様において、大腸菌（E. coli）からのべロ毒素−１またはべロ毒素−２またはべロ毒素２ｃまたはべロ毒素２ｖのＢサブユニットが、本発明の組成物の製剤における志賀毒素のＢサブユニットの代わりに使用できる。べロ毒素−１は志賀様毒素１の代替名であり、およびべロ毒素−２は志賀様毒素２の代替名であることが留意されるべきである。

志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的等価物は毒素活性を欠如し、したがって哺乳動物には無毒である。毒性の欠如は、志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的等価物のＧｂ３受容体への結合またはＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩもしくはＩＩ経路へ入ることに影響を与えない。

Ｇｂ３受容体への結合は、当業者によって公知の方法（例えば、Tarrago-Trani in Protein Extraction and Purification, 39:pp 170-176 (2004) 又はNishikawa et al in Chem Pharm Bull April 54(4): pp.522-7 (2006)によって記載され、参照によって本明細書に組込まれる）によって評価できる。

一実施態様において、志賀毒素のＢサブユニットは配列：

を有する。

次に、志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的等価物は、少なくとも一つの抗原に結合される。

別の態様において、志賀毒素のＢサブユニットまたは当該その免疫学的等価物は、システイン基またはＺ（ｎ）−Ｃｙｓ基（Ｚはスルフィドリル基を有さないアミノ酸であり、およびｎは０、１またはポリペプチドである）を経て化学結合を通して、当該少なくとも一つの抗原と結合している。

本明細書に記載の組成物、使用および方法に使用できる少なくとも一つの抗原は、温血動物からの癌抗原、感染症抗原（例えば、バクテリア抗原、ウイルス抗原、真菌抗原または寄生虫抗原）、アレルギー抗原、自己免疫抗原およびこれらの混合物を含む。

癌のための抗原は、精巣癌、卵巣癌、膵臓癌、メラノーマ、肺癌、前立腺癌、肝癌、乳癌、直腸癌、結腸癌、食道癌、胃癌、腎臓癌、肉腫、神経芽細胞腫、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫ならびに白血病からの抗原でありうる。

癌の免疫治療のために有用な癌抗原、例えば、メラノーマ治療のためのＭＡＧＥ Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ３または他のＭＡＧＥ抗原）、例えば、メラノーマ、肺癌、肉腫、膀胱癌のような多くの腫瘍型に発現している抗原（例えば、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥまたはＧＡＧＥ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＫＳＡ、ＰＡＰマンマグロビン、ＭＵＣ−１、ＣＥＡ、ＷＴ１、ＬＭＰ２、ＨＰＢＶ Ｅ６、Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、イディオタイプ、ｐ５３非変異、ＮＹ−ＥＳО−１、ＮＹ−ＥＳО−２、ＮＹ−ＥＳО−３、ＮＹ−ＥＳО−４、ＮＹ−ＥＳО−５、ＮＹ−ＥＳО−６、ＮＹ−ＥＳО−７、ＮＹ−ＥＳО−８、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異、ｇｐ１００、ｐ５３変異、プロテナーゼ３（ＰＲ１）、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ｎＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＥｐｈＡ２、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合）、ＮＡ１７ｍ ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリン Ｂ１、ポリシアル酸、ＭＴＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１ｍ ＧＭ３、ＢОＲＩＳｍ Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、精液タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ １、Ｂ７Ｈ３ｍレグマイン、Ｔｉｅ ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ−β、ＭＡＤ−ＣＴ−２Ｆｏｓ−関連抗原１、Cheever et al, "The Prioritization of Cancer Antigens: A National Institute Pilot Project for the Acceleration of Translational Research," Clinical Cancer Research, 15, pgs, 532305337 (August 31, 2009)に記載されているもの。一実施態様において、ＨＥＲ−２／ｎｅｕが少なくとも一つの抗原として使用される。これらの癌抗原のフラグメントはそれらが抗体産生を刺激する限りにおいてまた使用できる。

バクテリア感染症のための抗原は、大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ菌（Salmonella enterica）、髄膜炎菌（Neisseria meningitis）、リステリア菌（Listeria momocytogenes）、細菌性髄膜炎、肺炎クラジミア(Chlamydia pneumoniae)、ジフテリア菌、肺炎球菌、黄色ブドウ球菌、連鎖球菌（Streptoccoccus bacteria）、ヘリコバクタピロリ菌（Heliobacter pylori）、インフルエンザ菌血清型Ｂ、レジオネラ症、肺炎マイコプラズマ、百日咳、猩紅熱、毒素性ショック症候群、トラコーマ、尿管感染症、炭疽菌、ボツリヌス症、コレラ、チフス、淋病、とびひ、ハンセン病、レプトスピラ症、ライム病、類鼻疽、ＭＲＳＡ感染、ノカルジア症、百日咳、ペスト、肺炎球菌性肺炎、オウム病、Ｑ熱、ロッキーマウンテン紅斑熱、赤痢、破傷風、結核、野兎病および腸チフス熱からの抗原、およびそれらの混合物でありうる。これらのバクテリ抗原のフラグメントも、それらが抗体産生を刺激する限りにおいてまた使用できる。

ウイルス抗原はＡＩＤＳからの抗原（例えば、ｇａｇ、ｔａｔ ｎｅｆ、エンヴェロープ（例えば、それらのｇｐ１２０もしくはｇｐ１６０フラグメント））、水痘、風邪、サイトメガロウイルス、コロラドダニ熱、デング熱、エボラ出血熱、手足口病、ロタウイルス、コロナウイルス、肝炎、単純ヘルペス、帯状疱疹、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザ、ラッサ熱、麻疹、マールブルグ出血熱、伝染性単核球症、流行性耳下腺炎、ポリオ、進行性多巣性白質脳症、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、天然痘帯状疱疹ウイルス、ウイルス性脳症、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、西ナイル病、インフレエンザＡウイルス、エプスタイン−バーウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、成人Ｔ細胞白血病ウイルス、肝炎Ａウイルス、ポックスウイルス、および黄熱病からの抗原、およびそれらの混合物でありうる。これらのウイルス抗原のフラグメントも、それらが抗体産生を刺激するかぎりにおいてまた使用できる。

本発明において使用できる真菌抗原は、アレルギー性気管支アスペルギルス症、肺アスペルギローマ、水虫、バシディオボールス真菌症(basidiobolomycosis)、黒色砂毛症、ブラスト真菌症(blastomycosis)、カンジダ症、ツボカビ症、コクシジオイデス症、コニディオボラス真菌症（conidiobolomycosis）、黒穂病、クリプトコッカス症、クリプトコッカス・ガッティ、皮膚糸状菌症、二形性真菌、毛内菌、昆虫病原真菌、流行性リンパ管炎、食道カンジダ症、エキソトリクス（exothrix）、真菌血症、ヒストプラズマ症、マッソスポラ シカジナ（massospora cicadina）、真菌症、ピエドライア（piedraia）、ニューモシスチス肺炎、シロコッカス クラビジネチ-ジュグランダセアルム（sirococcus clavigignenti-juglandacearum）、スポロトリクム症、サウザンドがん腫病（thousand cankers disease）、白癬、白癬性毛瘡、頭部白癬、体部白癬、股部白癬、顔白癬、異型白癬、黒癬、癜風、鵞口瘡および白鼻症候群からの抗原およびそれらの混合物を含む。これらの真菌抗原のフラグメントは、それらが抗体産生を刺激する限りにおいてまた使用できる。

寄生虫や原虫感染症を治療に使用できる抗原は、アフリカトリパノソーマ症、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、シャーガス病、肝吸虫症、コクシゾウム症、クリプトスポリジウム症、嚢虫症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、自由生活アメーバ感染、ジアルジア症、顎口虫症、蠕虫、ヘキサミタ症、膜様条虫症、イソスポーラ症、リーシュマニア症、マラリア、メタゴニムス症、ハエウジ症、オンコセルカ症、シラミ、マラリア原虫、疥癬、住血吸虫症、テニア条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、鞭虫症、トリコモナス症、およびトリパノソーマ症からの抗原、およびそれらの混合物を含む。これらの寄生虫または原虫抗原のフラグメントもそれらが抗体産生を刺激する限りにおいてまた使用できる。

アレルギーを治療するために使用できる抗原は、タバコの煙アレルギー、化学物質アレルギー、布アレルギー、ゴキブリアレルギー、チリダニアレルギー、食物アレルギー、消化管アレルギー、牧草花粉アレルギー、花粉症（hay fever）、ハウスダストアレルギー、虫刺咬によるアレルギー、ラテックスアレルギー、カビアレルギー、ペットアレルギー、花粉アレルギー、ブタクサアレルギーおよび木の花粉アレルギーからの抗原およびそれらの混合物を含む。これらのアレルギー抗原のフラグメントもそれらが抗体産生を刺激する限りにおいてまた使用できる。

自己免疫疾患を治療するために使用できる抗原は、無塩酸自己免疫活動性慢性肝炎、アジソン病、円形脱毛症、萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗−ＧＢＭ腎炎または抗−ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、再生不良性貧血、リュウマチ、喘息、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、バロー病、ベーチェット病、バージャー病、水疱性類天疱瘡、心筋症、小児脂肪便症、慢性疲労性免疫機能障害症候群、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集疾患、大腸炎、頭蓋動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、ドゴー病、皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病、糖尿病１型、糖尿病２型、ドレスラー症候群、円板状エリテマトーデス、本態性混合型クリオグロブリン血症、好酸球性筋膜炎、表皮水疱症、エバンス症候群、線維筋痛症、線維性肺胞炎、胃炎、巨細胞動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー病、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、肝炎、ヒューズ症候群、特発性副腎萎縮、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性脱髄性多発神経炎、過敏性腸症候群、川崎病、扁平苔癬、ルーゲリック病、ルポイド肝炎、狼瘡、ライム病、メニエル病、混合性結合組織病、多発性骨髄腫、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、眼瘢痕性類天疱瘡、骨粗鬆症、扁平部炎、尋常性天疱瘡、多腺性自己免疫疾患、リウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リュウマチ熱、関節リュウマチ、サルコイドーシス、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、粘性血症候群（sticky blood syndrome）、スティル病、スティッフマン症候群、シデナム舞踏病(sydenham horea)、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎、潰瘍性大腸炎、尋常性白斑、ウェゲナー肉芽腫症およびウイルソン症候群からの抗原およびそれらの混合物を含む。これらの自己免疫疾患抗原のフラグメントも、それらが抗体産生を刺激する限りにおいてまた使用できる。

本発明の組成物および／または方法に使用される少なくとも一つの抗原の量は、使用される抗原に依存し、したがって各製剤で変化する。しかし、少なくとも一つの抗原は少なくとも有害な副作用なしに免疫防御応答を誘導すべきである。一般に、組成物は各抗原０．１〜１，０００μgの間で含有するであろう。別の態様では、組成物は各抗原０．１〜５００μgの間で含有するであろう。さらに別の態様では、組成物は各抗原０．１〜１００μgの間で含有するであろう。さらに別の態様では、各抗原０．１〜５０μgがまた組成物に使用できる。

樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段または樹状細胞を標的とする担体（例えば、リポソーム、ミクロ粒子およびナノ粒子）または樹状細胞を標的とする毒素担体または樹状細胞を標的とするモノクローナルもしくはポリクローナル抗体（それらは共有結合によって、または融合タンパク質として、または静電気もしくは疎水性相互作用によって、またはイオン相互作用によって少なくとも一つの抗原と結合している）を含む組成物。リポソーム、ミクロ粒子またはナノ粒子が担体として使用される場合、少なくとも一つの抗原はこれらの担体の外側に複合できるか、または被包化によって内部に処方できる。リポソーム、ミクロ粒子またはナノ粒子の外側に少なくとも一つの抗原を複合化する時、本明細書に記載のようなリンカーが使用できる。異なった抗原の混合物は本明細書に記載の異なった担体と結合できる。

一態様において、志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的等価物を含む組成物、少なくとも一つの抗原の結合は、共有結合によって、または融合タンパク質として、または静電気もしくは疎水性相互作用によって、またはイオン相互作用によってまたできる。その結合は志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的等価物に直接なされるか、または本明細書に記載のリンカー、またはシステイン基またはＺ（ｎ）−Ｃｙｓ基（Ｚはスルフィドリル基を欠如したアミノ酸であり、およびｎは０、１またはポリペプチドである）を介して結合できる。

少なくとも一つの抗原を共有結合するために、カップリング剤は、例えば、臭化シアン、シアヌル酸クロリド、２，２−ジクロロベンジジネムｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルフォン、または２，４−ジクロロニトロベンゼンを使用できる。一態様において、臭化シアンは少なくとも一つの抗原を共有結合するために使用される。

融合タンパク質（Haicheur et al, Journal of Immunology 165 pgs 3301-3308 (2000) に記載され、参照として本明細書に組込まれる）は結合の源であり、抗原を毒素担体または志賀毒素のＢサブユニットまたはそれらの免疫学的機能等価物に結合することができる。

非共有結合は、イオン相互作用、疎水性相互作用、および水素結合を介した結合を含む。したがって、イオン相互作用に関して、アスパラギン酸およびグルタミン酸上の負に荷電したカルボキシル基は、リジンおよびアルギニン残基上の正に荷電した遊離アミノ基によって引きつけられることがよく知られている。

少なくとも一つの抗原が、樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合した担体（例えば、リポソーム、ミクロ粒子およびナノ粒子）、樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された毒素担体、または（少なくとも一つの抗原と結合され、そして樹状細胞を標的とする）モノクローナルもしくはポリクローナル抗体と組み合わされると、次にそれらはアジュバント顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）と混合され、そしてそのような処置を必要とする温血動物に投与される。投与されるＧＭ−ＣＳＦの量は２〜５０μgの間で変化する。一態様において２０μgが投与され、別の態様において１０μgが、樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合した担体（例えば、リポソーム、ミクロ粒子およびナノ粒子）、樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された毒素担体、樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合されたモノクロナールもしくはポリクローナル抗体、または抗原と結合された志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的等価物と共に投与される。

本発明の一態様において、樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合した担体（例えば、リポソーム、ミクロ粒子およびナノ粒子）、少なくとも一つの抗原と結合し、そして樹状細胞を標的とする毒素担体、または少なくとも一つの抗原と結合し、そして樹状細胞を標的とするモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、または少なくとも一つの抗原と結合された志賀毒素のＢサブユニットまたはそれらの免疫学的等価物は、一般に、０日にアジュバントＧＭ−ＣＳＦと共に投与され、およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドまたはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドは１日目（day 1）に投与できる。

一態様において、樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された担体（例えば、リポソーム、ミクロ粒子およびナノ粒子）、少なくとも一つの抗原と結合し樹状細胞を標的とする毒素担体、または少なくとも一つの抗原と結合し樹状細胞を標的とするモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、または少なくとも一つの抗原と結合された志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的等価物は、同じ日に同時に、または同じ日もしくは異なった日に連続して、または同じ日もしくは異なった日に別個に、アジュバントＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドもしくはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドと共に投与できる。

任意のＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドまたはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドは第二番目のアジュバントとして使用できる。例えば、５’末端または３’末端または両方にポリＧ配列、内部パリンドローム配列、部分的ホスホロチオエート修飾骨格およびパリンドローム内にＧＣジヌクレオチドの特徴を有するクラスＡ オリゴデオキシヌクレオチド。クラスＡ オリゴデオキシヌクレオチドの例は、２２１６（Krug et al, European Journal of Immunology, 31 (7) pgs. 2154-63 (2001)に記載された）である。クラスＢ ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、5' Pu Py C G Py Pu-3'の１または６マー（mar）以上のｐＧモチーフを特徴とし、一般に長さは１８〜２８ヌクレオチドであり、完全にホスホロチオエート修飾骨格を有する。オリゴデオキシヌクレオチド２００７は、クラスＢに該当し、Krieg et al., Nature 374 (6522) Pgs, 546-9 (1995)に記載されている。

ＣｐＧアジュバントとして使用できる他のＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドまたはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドは、番号１７５８および１８２６（Liu et al, Blood, 92 3730-3736 (1998)に記載された）、番号１６６８、１７２０ｍ ２００６および２０４１（Deng et al, The Journal of Immunology, 167 4616-4626 (2001)に記載された）、番号７９０９（Speiser et al, The Journal of Clinical Investigation volume 115, No, 3, pgs, 739-746 (2005)に記載された）および番号２２１６，Ｄ３２およびＤ１９（Guzylack-Piriouにより記載された）を含む。

一実施態様では、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは

の配列を有することできる。

ＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドは、また本発明に包含され、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの代わりに使用できる。代わりに、ＣｐＧ−様およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは混合物として一緒に投与できる。

一態様では、１日目にＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドまたはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドは、一投与当り１〜１０００μgの間の投与量で投与される。別の態様では一投与当り１〜５００μgの間で投与される。さらに別の態様では一投与当り１〜１００μgで投与される。さらに別の態様では一投与当り１〜５０μgの間で投与される。

アジュバントＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧもしくはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドは０日にアジュバントとして一緒に投与される。

温血動物は、樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された担体（例えば、リポソーム、ミクロ粒子およびナノ粒子）、少なくとも一つの抗原と結合された樹状細胞を標的とする毒素担体、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合されたモノクロナールもしくはポリクローナル抗体、または少なくとも一つの抗原と結合された志賀毒素のＢサブユニットまたはそれらの免疫学的等価物を含む組成物を含有するブースター量を、最初の投与後少なくとも１４日以上で投与できる。このブースター投与量はアジュバントと共には投与されない。

別の態様では、少なくとも一つの抗原と結合された志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的等価物を含むブースター投与量は、最初の投与後少なくとも１４日以上で投与できる。このブースター投与量はアジュバントと共には投与されない。

本明細書に記載の組成物は、粘膜的に、または全身的に投与できる。全身に送達する場合には、それは一般的に経皮を通して、皮下または筋肉内経路である。一実施態様では、本発明の組成物とアジュバントは、筋肉内投与される。別の実施態様では、本発明の組成物は腫瘍に直接注射される。

一態様では、樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された担体（例えば、リポソーム、ミクロ粒子およびナノ粒子）、樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された毒素担体、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合されたモノクロナールもしくはポリクローナル抗体、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む、疾患を処置するための（特に癌、バクテリア、ウイルス、真菌、寄生虫または原虫感染によって引き起こされる感染症、アレルギーおよび／または自己免疫疾患を処置するための）細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化するための組成物が、本発明の一部分を形成する。一態様では、当該少なくとも一つの抗原はＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原であり、そして当該疾患は乳がんである。

樹状細胞を標的とし、そして少なくとも一つの抗原と結合された志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的等価物、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む、疾患を処置するための（特に癌、バクテリア、ウイルス、真菌、寄生虫または原虫感染によって引き起こされる感染症、アレルギーおよび／または自己免疫疾患を処置するための）細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化するための組成物は、本発明の別の態様を形成する。一態様では、当該少なくとも一つの抗原はＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原であり、そして当該疾患は乳がんである。

細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化するための、および／または疾患を処置するための（特に癌、バクテリア、ウイルス、真菌、寄生虫または原虫感染によって引き起こされる感染症、アレルギーおよび／または自己免疫疾患を処置するための）、樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された担体（例えば、リポソーム、ミクロ粒子およびナノ粒子）、樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された毒素担体、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合されたモノクロナールもしくはポリクローナル抗体、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物の使用は、本発明の別の態様である。一態様では、当該少なくとも一つの抗原はＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原であり、そして当該疾患は乳がんである。

細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化するための、および／または疾患を処置するための（特に癌、バクテリア、ウイルス、真菌、寄生虫または原虫感染によって引き起こされる感染症、アレルギーおよび／または自己免疫疾患を処置するための）、樹状細胞を標的とし、そして少なくとも一つの抗原を結合された志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的等価物、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物の使用は、さらに本発明の別の態様である。一態様では、当該少なくとも一つの抗原はＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原であり、そして当該疾患は乳がんである。

温血動物における癌、バクテリア、ウイルス、真菌、寄生虫または原虫感染によって引き起こされる感染症、アレルギーおよび／または自己免疫疾患を処置するための医薬を製造するための、樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された担体（例えば、リポソーム、ミクロ粒子およびナノ粒子）、樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された毒素担体、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合されたモノクロナールもしくはポリクローナル抗体、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物の使用は、本発明の別の態様である。

温血動物における癌、バクテリア、ウイルス、真菌、寄生虫または原虫感染によって引き起こされる感染症、アレルギーおよび／または自己免疫疾患を処置するための医薬を製造するための、樹状細胞を標的とし、そして少なくとも一つの抗原と結合された志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的等価物、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物の使用は、さらに本発明の別の態様である。

本発明はまた、乳がんを治療するための医薬を製造するための、樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された担体（例えば、リポソーム、ミクロ粒子およびナノ粒子）、樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された毒素担体、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合されたモノクロナールもしくはポリクローナル抗体、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物の使用に関する。一実施態様では、当該少なくとも一つの抗原はＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原である。

乳がんを処置するための医薬を製造するために、樹状細胞を標的とし、そしてＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原と結合された志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的等価物と（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドまたはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物の使用は、さらに本発明の別の態様である。

免疫学的機能等価物は組成物のために上記され、そして本組成物の使用に関して本明細書に適用する。それらはＧｂ３受容体と結合でき、および／または抗原の内在化およびＭＨＣクラスＩ経路またはＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩの両方の経路に抗原の提示を引き起こす任意の毒素を含む。したがって、大腸菌（E. coli）からの志賀様毒素（例えば、志賀様毒素１、志賀様毒素２および志賀様毒素２バリアント（例えば、志賀様毒素２ｃ、志賀様毒素２ｄ１、志賀様毒素２ｄ２、志賀様毒素２ｅ、志賀様毒素２ｆ、志賀様毒素２ｙ））のＢサブユニットは、免疫学的機能等価物と考えることができる。一実施態様において、大腸菌からのベロ毒素−１またはベロ毒素−２またはベロ毒素２ｃまたはベロ毒素２ｖのＢサブユニットが、本発明の組成物の製剤に志賀毒素のＢサブユニットの代わりに使用できる。

樹状細胞を標的とする志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的機能等価物は、組成物について上記と同じ方法で；すなわち、共有結合によって、または静電気的もしくは疎水性相互作用によって、または融合タンパク質として結合される。

組成物に関して上記と同じ抗原は、本発明の使用態様（例えば、癌抗原およびＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原）において使用できる。

同様に、組成物に関して上記と同じＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドは本発明の使用態様において使用できる。

細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化するための方法であって、樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された担体（例えば、リポソーム、ミクロ粒子およびナノ粒子）、樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された毒素担体、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合されたモノクロナールもしくはポリクローナル抗体、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物を、そのような活性化を必要とする温血動物に投与することを含む当該方法は、さらに本発明の別の態様である。

細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化するための方法であって、樹状細胞を標的とし、そして少なくとも一つの抗原を結合された志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的等価物、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物を、そのような活性化を必要とする温血動物に投与することを含む当該方法は、さらに本発明の別の態様である。

癌、バクテリア、ウイルス、真菌、寄生虫または原虫感染によって引き起こされる感染症、アレルギーおよび自己免疫疾患を処置する方法であって、樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された担体（例えば、リポソーム、ミクロ粒子およびナノ粒子）、樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された毒素担体、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合されたモノクロナールもしくはポリクローナル抗体、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物を、そのような処置を必要とする温血動物に投与することを含む当該方法は、さらに本発明の別の態様である。

さらに別の態様において、癌、バクテリア、ウイルス、真菌、寄生虫または原虫感染によって引き起こされる感染症、アレルギーおよび自己免疫疾患を処置する方法であって、樹状細胞を標的とし、そして少なくとも一つの抗原を結合された志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的等価物、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物を、そのような処置を必要とする温血動物に投与することを含む当該方法が提供される。

乳がんを処置するための方法であって、樹状細胞にＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原を標的とするための手段、または樹状細胞を標的とするＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原と結合された担体（例えば、リポソーム、ミクロ粒子およびナノ粒子）、樹状細胞を標的とするＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原と結合された毒素担体、または樹状細胞を標的とするＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原と結合されたモノクロナールもしくはポリクローナル抗体、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物を、そのような処置を必要とする温血動物に投与することを含む当該方法が提供される。

乳がんを処置するための方法であって、樹状細胞を標的とし、およびＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗原を結合された志賀毒素のＢサブユニットまたはその免疫学的等価物、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物を、そのような処置を必要とする温血動物に投与することを含む当該方法。

本明細書に記載の本発明の少なくとも一つの組成物、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバント、ならびに少なくとも一つの薬学的に許容されるビヒクルを含むワクチン接種のためのキットは、さらに本発明の別の実施態様である。

薬学的に許容されるビヒクルは滅菌水、生理食塩水または緩衝液を含む。

本明細書に記載のワクチンまたはワクチン接種のためのキットは、温血動物に同時、連続的、または別個投与のために適切である。

少なくとも一つの抗原と結合された樹状細胞を標的とするための手段、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された担体（例えば、リポソーム、ミクロ粒子およびナノ粒子）、樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合された毒素担体、または樹状細胞を標的とする少なくとも一つの抗原と結合されたモノクロナールもしくはポリクローナル抗体、または樹状細胞を標的とし、そして少なくとも一つの抗原と結合された志賀毒素のＢサブユニットまたはそれらの免疫学的等価物、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物を含む製品の組合せ（また、パーツのキットとして指定された）は、まださらに本発明の別の態様である。

本発明の多くの実施態様および／または態様が記載された。にもかかわらず、種々の改変が本発明の精神および視野から逸脱することなくなされ得ることは理解されるであろう。

実施例
実施例１− 抗原に志賀毒素のＢサブユニットのカップリング
１Ａ− ＭＡＧＥに志賀毒素のＢサブユニットのリコンビナント結合
ＭＡＧＥ抗原に志賀毒素（ＳＴｘＢ）のＢサブユニットを結合するための工程は、参照として本明細書に組込まれている米国特許第６６１３８８２号に記載されている。さらに具体的には、使用されたプラスミドは、Su et al, Infect Immun, 60, pgs. 33-45 (1992)に記載されたｐＳＵ１０８プラスミドであった。

使用されたＰＣＲプライマーは、

であった。

使用されたＰＣＲプライマーは、志賀ＡｔｐＥ（５’）ベクターから特異なプライマーであり、および次の配列：

を有した。

これらのプライマーは、ＳＵ１０８プラスミドの制限部位ＳｐｈＩおよびＳａｌＩでクローン化されるフラグメントを生成した。

オリゴヌクレオチド硫酸塩１：

から構成されたグリコシル化部位およびＫＤＥＬ配列を含むアダプターフラグメントは、１６℃で一晩ライゲートされた。

得られたフラグメントは、ｐＳＵ１０８のＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位でクローン化され、そしてＢ−Ｇｌｙｃ−ＫＤＥＬをコードするｃＤＮＡを含有した。

リコンビナントフラグメントは、前出のSu et alによって記載された技術を用いてまた精製された。要するに、ｐＳＵ１０８から得られたリコンビナント発現プラスミドを含むＥｃｏｌｉ細胞は３０℃で一晩培養した。次に、培養物を５０℃でアンピシリンの５０mg／mLを補充したＬＢで５倍に希釈した。４２℃で４時間インキュベーションした後、細胞は１０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ、ｐＨ８で十分に洗浄し、１０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ、ｐＨ８、２５％スクロース、１mM ＥＤＴＡで１０分間インキュベーションし、最後にＰＭＳＦおよプロテアーゼ阻害剤の混合物（ロイペプチン、キモスタチン、ペプスタチン、アンチパインおよびアプロチニン）の１mMを含有する水−氷混合物中に迅速に再懸濁した。最終工程はペリプラズムの破裂に導いた。清澄化の後、上清をＱＦＦカラム（ファルマシア）に添加し、２０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ（ｐＨ７．５）中ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。構成物によって、Ｂフラグメントは１２０mMおよび４００mMの間で溶出された。次に、Ｂフラグメントを含有するフラクションは２０mMのＴｒｉｓ／ＨＣＬ、ｐＨ７．５で透析し、モノＱ カラム（ファルマシア）に再添加し、前述と同様に溶出した。得られたタンパク質は、ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル電気泳動を使って９５％の純度程度を有すると評価され、次に、使用まで−８０℃で保存した。

１Ｂ− 志賀毒素のＢサブユニットの化学結合
ＳＴｘＢ発現プラスミドは、参照として本明細書に含まれている米国特許第７６３２５１４号に従って最初に調製された。さらに具体的には、前出のSu et alによって記載されたプラスミドｐＳＵ１０８は、Ｂ−フラグメントｃＤＮＡの３’末端にシステインコドンｔｇｔを導入するように修飾され、配列番号１０および配列番号１１はＤＮＡフラグメントを産生するためにプラスミド特異プライマーＳｈｉｇａＡｔｐＥおよびＳｈｉｇａ−ｆｄならびにプライマーＡおよびＢと共に使用され、プライマーＳｈｉｇａＡｔｐＥとＳｈｉｇａ−ｆｄでの二番目のＰＣＲで、ｐＳＵ１０８のＳｐｈＩおよびＳａｌＩ制限部位にクローン化されるフラグメントを産生する。ＰＣＲによって得られた配列はジデオキシシークエンシングによって確かめられた。

ペリプラズム抽出物は、３０℃で一晩増殖した培養液の１２５μLと１２５mLのＬＢ／Ａｍｐをイノキュレートして得られ、さらに３０℃で一晩増殖した。次に、培養物は５０℃で３７５mLのＬＢ／Ａｍｐに移し、４２℃で４時間イキュベーションした。培養物は細胞をペレット化するために遠心分離し、次に１０mMのＴｒｉｓ／ＨＣＬ（ｐＨ８．０）で３回洗浄した。次に、細胞は２００mLの２５％スクロース、１mMＥＤＴＡ、１０mMのＴＲＩＳ／ＨＣＬ（ｐＨ８．０）に再懸濁し、室温で１０分間イキュベーションした。次に、細胞はペレット化するためにさらに遠心分離し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む氷冷水の２００mL中に再懸濁した。再懸濁した細胞は、氷上で１０分間イキュベーションし、遠心分離し、そして上清を回収した。２０mMのＴｒｉｓ／ＨＣＬ（ｐＨ８．０）を加えた。

ペリプラズム抽出物は、ＱＦＦアニオン交換カラム（ファルマシア）に添加し、２３０mMのＮａＣｌで溶出した。ＳＴｘＢ−Ｃｙｓを含むフラクションを集め、４倍希釈し、そしてモノＱ アニオン交換カラム（ファルマシア）に添加し、２３０mMのＮａＣｌで溶出させた。PallFiltronのミクロ濃縮装置で濃縮した後、集めたフラクションはセファデックス７５ゲル濾過カラムに通した。純度は９５％以上であった。

ＳＴｘＢ−ＣｙｓのＢ−フラグメントは本質的には単量体であった。しかしながら、いくつかの構築では、システインは五量体内で隣接するフラグメントがジスルフィド結合で会合しているＢ−フラグメントの天然のＣ−末端から２個以上のアミノ酸のところに付け加えられた。

三つの異なった担体は次のように作成された：

ＣｙｓをＢサブユニットのＣ−末端に直接付加したＳＴｘＢ−Ｃｙｓ。このタンパク質は精製カラムから単体として溶出された。

ＳＴｘＢ−Ｃｙｓは野生型ＢフラグメントのＣ−末端とＣｙｓの間のクローニングカセットから生じる２個のアミノ酸の短いスペーサーをもつ担体である。そのタンパク質の大部分は精製カラムからに二量体として溶出した。これらは還元条件下で分離することができ、そして五量体のＢ−サブユニット複合体内の単量体間のジスルフィル結合の形成を示唆している。

ＳＴｘＢ−Ｇｌｙｃ−Ｃｙｓ−ＫＤＥＬは、Ｃｙｓが９個のアミノ酸長からなるグリコシルカセットとＣ−末端ＫＤＥＬペプチドの間に位置した担体である。タンパク質の大部分は精製カラムから二量体として溶出した。これらは還元状態下で分離され、そして五量体のＢ−サブユニット複合体内の単体間のジスルフィド結合の形成を示唆している。

三つの抗原ペプチド（鶏オボアルブミン由来のＳＬ８抗原ペプチドをもつ１６個のアミノ酸の合成ペプチドであるＰｅｐ１、鶏オボアルブミン由来のＳＬ８抗原ペプチドおよびＣ−末端にＨｉｓ−タグを有し２４個のアミノ酸の合成ペプチドであるＰｅｐ２、および抗原提示細胞のプラズマメンブレンでＭＨＣクラスＩ複合体上のペプチドを直接交換できるオボアルブミンからのＳＬ８抗原ペプチド）がＳＴｘＢに結合された。

二つのタイプの条件（還元条件と非還元条件）が抗原ペプチドをＳＴｘＢに結合するために用いられた。還元条件下では、融合タンパク質はＤＴＴで一晩処理され、次にＮ−末端にブロミドアセテート基をもつ活性化ペプチドが過剰に加えられた。融合タンパク質を使う最初の結合実験のために使用された条件は、主に単量体（タンパク質ＳＴｘＢＺ_２−ＣｙｓおよびＳＴｘＢ−Ｇｌｙｃ−Ｃｙｓ−ＫＤＥＬ）を二量体化するであろう。非還元下では、融合タンパク質はＮ−末端をブロミドアセテートで活性化したペプチドと直接反応させた。

使用された結合のための最適条件は次のようである：ＳＴｘＢ−Ｃｙｓを２０mMホウ酸バッファー、ｐＨ９．０、１５０mM ＮａＣｌに対して透析した。透析後、ＳＴｘＢ−Ｃｙｓは１mg／mLに濃縮した。Ｎ−末端活性化ペプチドは無水ブロモアセテートで活性化した。Ｎ−末端活性化ペプチドは１２mM ＤＭＳОに溶解した。次に活性化ペプチドはタンパク質濃度で０．２mMに希釈し、室温で１２時間インキュべートした。次に結合したＳＴｘＢ−活性化ペプチドはＰＢＳに対して透析した。

１Ｃ− Оｖａ_{２５７−２６４}、ＩＢＣ００２およびＨＥＲ−２／Ｎｅｕペプチドの化学結合
１．１− ＳｔｘＢの合成
ＳＴｘＢは、プラスミドｐＳＵ１０８から、前出のSu et alによって記載されたのと同様に、ただし、Ｃ−末端にＣｙｓなしで調製された。

１．２− Оｖａ_{２５７−２６４}、およびＨＥＲ−２／ｎｅｕの合成
Оｖａ_{２５７−２６４}、ＩＢＣ００２（配列番号１）およびＨＥＲ−２／ｎｅｕは、Ｃ−末端からＮ−末端へＦｍｏｃ／ｔＢｕ手法に従って、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂（IRIS Biotech Tentage、０．２５mmol／ｇ）の１００μmolのスケールで化学的に合成された。

樹脂上のアミノ酸の連続的カプリングは、電磁波を用いてLiberty CEM型の自動ペプチド合成機で実施された。

１．３− Ｎ−末端にブロモアセチル基の導入
ペプチドは次に手動で処理された。

Ｆｍｏｃ保護はＤＭＦ：ピペリジン（８０：２０）の混合物と５分間そして次に撹拌下で１５分間インキュベーションして除去した。次に、樹脂はＤＭＦで４回洗浄した。

ブロモ酢酸の２０当量は、ゲル濾過カラムで使用される前に無水化した４mLのジクロロメタン中に１０当量のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）と２０分間撹拌して酸無水物として活性化された。ロータリーエバポレーターで濃縮した後、無水ブロモ酢酸は４mLのＤＭＦに可溶化し、樹脂に加えた。３０分間撹拌の後、樹脂はＤＭＦで２分間３回、ＤＣＭで２分間３回、最後に膜真空ポンプによる乾燥前にエーテルで２回洗浄した。

１．４− 開裂、脱保護および精製
二つの樹脂は、８mLのＴＦＡおよび４００μLのアニソールを含む開裂溶液と撹拌下で１時間処理された。エーテル：ヘプタンの１：１混合物で氷上で沈殿および２回洗浄の後、ペプチドは分取ＨＰＬＣに注入する前に５％の酢酸の溶液に取りあげられた。

ペプチドを含んだフラクションが集められ、凍結され、凍結乾燥された。

２． ＳＴｘＢ／Ｃｙｓに２ブロモアセチル化ペプチドの結合
２．１ チオエーテル結合を形成するために選択された条件
ＳＴｘＢ−Ｃｙｓ中に存在するシステインは、共有結合性チオエーテル結合を形成するためにペプチド上に存在するブロモアセチル機能と特異的に結合することができる。次の条件：ＰＢＳ中に５mg／mLでＳＴｘＢ／Ｃｙｓの４μLおよび１１μLのＰＢＳ中に１、２または９当量のペプチドが、試された。室温で撹拌下一晩イキュベーションの後、溶液はＭＡＬＤＩ質量スペクトロスコピーによって分析された。ＭＡＬＤＩ質量スペクトル上で結合物の凖定量的形成が観察された。

これらの二つのペプチドの結合反応がすべての条件で準合計であれば、精製の間に過剰のペプチドを取り除くかなければならないことはなく、ＳＴｘＢ−Ｃｙｓの最大の消費をもつために１．５当量の過剰で結合反応を実施するように決定された。

２．２ ＳＴｘＢ−Ｃｙｓの２００μgにペプチドの結合
次の条件：５mg／mLＰＢＳでＳＴｘＢの４０μL、水中２．５６mMのペプチドの１５μLおよびＰＢＳの９５μL、が用いられた。室温で一晩イキュベーションした後、反応はＬＣ／ＭＣを用いて終結していることが示された。

２．３ ＳＴｘＢ−Ｃｙｓの５mgに二つのペプチドの結合
スケールは２．２の結果：５mg／mLＰＢＳでＳＴｘＢの２２０μL、水中２．５６mMのペプチドの７５μLおよびＰＢＳの４７５μL、に基づいて増加された。これらの生成物はゲル濾過クロマトグラフィーで精製された。

実施例２− ＧＭ−ＣＳＦ／ＣｐＧとの組合せでＳＴｘＢ−ОＶＡまたはОＶＡのみでマウスにワクチン接種後のエリスポット（Elispot）アッセイの比較
各グループ４匹のマウス（ｎ＝４および３回実験）は、０日に、２０μgのＧＭ−ＣＳＦと混合して２０μgのオボアルブミン（ОＶＡ）に結合された志賀毒素（ＳＴｘＢ）のＢサブユニットまたはОＶＡのみで免疫された。翌日、５０μgのCpG

がマウスに投与された。１４日目に各グループのマウスにオボアルブミン（ОＶＡ）に結合された（ＳＴｘＢ）またはОＶＡのみをアジュバント無しで投与した。２１日目に脾細胞をマウスから取りだし、単核細胞を脾細胞から単離した。次にエリスポットアッセイが実施された。

さらに具体的には、エリスポットアッセイは次のように実施された。ＬＴ−ＣＤ８抗−ОＶＡのコーティグ抗体を滅菌ＰＢＳに１５μg／mLに希釈した。ミリポアプレートの９６ウエルのそれぞれに１００μLを加え、４０℃で一晩インキュベーションした。プレートは４回洗浄し、非特異結合部位はブロッキングバッファー（１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ）でブロックした。

２１日目に脾臓を摘出し、単核細胞をフィコール−ハイパックを使用してマウスから得られた脾臓細胞から単離した。細胞を洗浄し、そして生きた細胞を数えた。細胞を、４ｘ１０^６細胞／mLの濃度でＲＰＭＩの組織培養液中に再懸濁した。ウエル当り細胞懸濁液の１００μLを加えた。

刺激剤濃度は２Ｘ（１〜１０μg／mL）に調節され、刺激剤の１００μLが各ウエルに加えられた。細胞は加湿５％ＣО_２インキュベーター中で３７℃で４０時間インキュベートした。

ウエルから細胞を取り除き、６回洗浄してElispotを展開した。細胞は蒸留水中で２回、洗浄バッファー中で４回洗って取り除いた。ビオチン化ｍＡｂ（抗−ОＶＡ_{２５７−２６４}）を１μg／mLにブロッキングバッファーで希釈し、そして１００μLを各ウエルに加えた。プレートを室温で１〜２時間インキュベートした。ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼをブロッキングバッファー中に１：１０００に希釈し、そして１００μLを各ウエルに加えた。次にプレートを室温で１〜２時間インキュベートした。ウエルを洗浄した後、基質の１００μLを加え、プレートは黒色スポットが現れるまでインキュベートした。呈色展開は水道水で洗浄することによって停止し、プレートは放置して乾燥させた。

スポットの数は自動機械で計測された。

結果は図１に示される。図に示されるように、ＳＴｘＢ−ОＶＡがアジュバントＧＭ−ＣＳＦとＣｐＧと共に投与された時にОＶＡのみが同じアジュバントと共に投与された時よりもより多くのＣＴＬ誘導が得られた。

実施例３− 種々のアジュバントを用いてＳＴｘＢ−ОＶＡまたはОＶＡのみでワクチン接種した後の抗ОＶＡ ＬＴ−ＣＤ８誘導の比較分析
マウス（ｎ＝４および２回実験）は、種々のアジュバントを用いてОＶＡと結合された志賀毒素のＢサブユニットまたはОＶＡのみで免疫された。ＳＴｘＢ−ОＶＡは次の組合せ：２０μgＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＡ（ＩＦＡのｖｏｌ／ｖｏｌ）、１０μgＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＡ、２０μgＧＭ−ＣＳＦおよび５０μgＣｐＧならびに１μgのαＧａｌＣｅｒと共に投与された。Оｖａは２０μgＧＭＣＳＦ／ＩＦＡおよび２０μgＧＭ−ＣＳＦ／５０μgＣｐＧと共に投与された。翌日、２番目のアジュバントのＣｐＧが投与された。１４日後、アジュバントなしで抗原が再び投与された。２１日目に脾細胞をマウスから取りだし、単核細胞をフィコールで精製した。四量体Ｋ^ｂ−ОＶＡ_{２５７−２６４}／ＬＴ−ＣＤ８ペプチドを認識するＣＴＬのパーセントを測定した。コントロールとしてＫ^ｂ−ＶＳＶ（Vascular Stomatitis Virus）が用いられ、コントロールから得られた背景のノイズを示されたパーセントから差し引いた。

結果は、得られた結果の平均値プラスまたはマイナスの標準偏差として図２に示される。図２に示されるように、マウスがＧＭ−ＣＳＦ／ＣｐＧと共にワクチン接種された時に他のアジュバントと比較して抗−ОＶＡ_{２５７−２６４}−ＬＴ−ＣＤ８の強い誘導が起り、ОＶＡ_{２５７−２６４}のみではほとんど誘導を起こさなかった。

実施例４− 四量体分析によって示された、志賀毒素Ｂサブユニットとの組合せにおけるアジュバントとしてのＧＭ−ＣＳＦとＣｐＧ間の共同作用
マウス（ｎ＝４および２回実験）は、５０μgＣｐＧもしくは２０μgＧＭ−ＣＳＦのいずれかまたは５０μgＣｐＧと２０μgＧＭ−ＣＳＦの両方の組合せを用いて、Ｈｅｒ２／ｎｅｕペプチドに結合された志賀毒素のＢサブユニット（ＳＴｘＢ−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）の２０μgで免疫した。ＧＭＣＳＦとの組合せが用いられた場合にはＳＴｘＢ−Ｈｅｒ２／ｎｅｕの２４時間後にＣｐＧを投与した。１４日目に、ＳＴｘＢ−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ単独での２回目の免疫を行った。２１日目に脾細胞を取りだし、ＬＴ−ＣＤ８をミルテニー（Miltenyi）カラムで精製した。四量体当りＨｅｒ２／ｎｅｕＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドを認識するＣＴＬのパーセントをサイトメトリーで測定した。無関係の四量体がＨｅｒ２／ｎｅｕに対する反応の特異性を確かめるために各実験で使用された。無関係のポリマーから得られた背景のノイズを示されたパーセントから差し引いた。

結果は図３に示されている。

実施例５− エリスポットアッセイによって示される志賀毒素のＢサブユニットとの組合せにおけるアジュバントとしてのＧＭ−ＣＳＦとＣｐＧ間の共同作用
Ｔｇ ＨＬＡ−Ａ２（Pascolo S.J. J. Exp. Med. 1997）マウスは、２０μgのＧＭ−ＣＳＦと共に、配列(RRARKIFGSLAFL)（配列番号１）をもつペプチドＩＢＣ００２（プロセシングをうけたＨＬＡ−Ａ２に限定したＨｅｒ２／ｎｅｕペプチド(KIFGSLAFL)（配列番号２）および隣接配列（RRAR）（配列番号３）に相当する）に結合された志賀毒素のＢサブユニット（ＳＴｘＢ）の２０μgで、あるいはベクター化されないペプチドＩＢＣ００２であるいは隣接配列なしの天然のＨｅｒ２／ｎｅｕペプチドで２回免疫された。翌日、ＣｐＧの５０μgが投与された。アジュバントなしで抗原での２回目の免疫は１４日目に実施された。次に、マウスから脾細胞を取りだし、単核球をフィコールで精製した。いくつかの精製した脾細胞は天然のＨｅｒ２／ｎｅｕペプチドで感作された。結果は図４に示されている。

図３および４に示されるように、これらの結果は、ＳＴｘＢが抗原Ｈｅｒ２／ｎｅｕペプチドならびにアジュバントＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧと共に投与された時に、細胞傷害性Ｔ-−リンパ球（ＣＴＬ）誘導を実証する。この効果はＨｅｒ２／ｎｅｕペプチドだけを投与した時には観察されなかった。抗原に結合されたＳＴｘＢベクターで投与した時ＧにＭ−ＣＳＦとＣｐＧアジュバント間に共同作用があることを強く示している。

実施例６− 樹状細胞に提示
ОＶＡを実施例Ｃ１における上記の操作法にしたがって、志賀毒素のＢサブユニットに結合した。基本的にはОＶＡを化学的結合によってＳＴｘＢ−Ｃｙｓに結合した。ОＶＡ_{２５７−２６４}はＭＢＳ（ピアス社、Rockford, Il）のヘテロ二官能性架橋剤を用いてリジン側鎖のアミノ基を介して最初に活性化された。次に活性化されたОＶＡをＳＴｘＢ−Ｃｙｓと反応させ、そして反応生成物はゲル濾過によって精製した。

Ｄ１樹状細胞株をＩＭＤＭ（シグマ社）（１０％加熱活性化したＦＣＳ、２mMグルタミン（シグマ社）、５mMピルビン酸ナトリウムおよび５０μＭ ２−メルカプトエタノールを添加した）中で、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子−産生ＮＩＨ３Ｔ３（Ｒ１培養液）からの３０％調製培養液と共に培養した（Winzler et al J. Exp, Med: 185:317 (1997)により記述されたように）。Ｂ３Ｚは、ＩＬ−２プロモーターからＮＦ−ＡＴ因子により駆動されるＬａｃＺ構造をもつＫ^ｂのコンテキスト内のОＶＡ_{２５７−２６４}ペプチドに特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞ハイブリドーマである。

ОＶＡ由来のＳＬ８Ｋ^ｂ−制限ペプチド提示のために１０^５の樹状細胞を５時間抗原で最初にパルスし、２回洗浄し、Ｂ３Ｚハイブリドーマ細胞（２ｘ１０^５細胞／ウエル）を用いて一晩共に培養した。基質としてОＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）を用いる呈色測定法がＢ３Ｚ溶解物中のβ−ガラクトシダーゼを検出するために使われる。

ＳＴｘＢ−Ｃｙｓに化学的に結合された全長サイズのОＶＡで感作したＤ１樹状細胞は、Ｂ３Ｚ抗−ＳＬ８−特異ＣＤ８−Ｔ細胞ハイブリドーマに免疫優性ОＶＡ−由来ＳＬ８ペプチドを提示することができる。ＳＬ８提示のためにＤ１細胞株を感作するのに、５ｎＭ程の低濃度のＳＴｘＢ−Ｃｙｓ−ОＶＡで十分であった。反して、ＳＴｘＢ−ＣｙｓなしでОＶＡのみでインキュベートされた細胞株では、ＳＬ８ペプチドの提示をすることができなかった。

実施例７− ワクチン接種後誘導される抗−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ_{３６９−３７７}ＣＤ８^＋Ｔ細胞は良好な結合活性をもつ
ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス（Pascolo S J Exp Med 1997）（ｎ＝４マウス／グループ）はＨＡＬ−Ａ２によって限定されるＨｅｒ２_{３６９−３７７}ペプチドと細胞内プロセシングを有利にする隣接配列（RRAR）に相当するRRARKIFGSLAFLペプチドに結合された志賀毒素のＢサブユニット（ＳＴｘＢ）をＧＭ−ＣＳＦ（２０μg）と混合して皮下経由で免疫した。翌日、ＣｐＧの５０μgを投与した。アジュバントなしでのワクチンの２回目の免疫は１４日目に実施した。次にマウスから脾細胞を取りだし、そしてミルテニーカラム（Miltenyi Biotec SAS. Paris France）でＣＤ８^＋Ｔ細胞を精製した。ＣＤ８陰性分画は抗原提示細胞として使用され、Ｈｅｒ２_{３６９−３７７}の種々の濃度でパルスしあるいはパルスなしで、次に精製されたＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に２４時間インキュベートした。特異Ｈｅｒ２／ｎｅｕ_{３６９−３７７}によって活性化されたＴ細胞の検出は会社によって推薦されたようにDiaclone-Gen-Probe（Besancon. France）からのＩＦＮγエリスポットによって測定された。結果は得られた平均値プラスまたはマイナス標準偏差として示される。

結果は図５に示され、そしてワクチン接種後誘導された抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ_{３６９−３７７}ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、それらがエリスポットアッセイにおいて０．０１μg／mLのほどの低い濃度のＨｅｒ２／ｎｅｕ_{３６９−３７７}で活性化できるように、良好な結合活性を有することを実証する。

実施例８− ＤＥＣ２０５抗体にクラス−１オボアルブミンの結合
ＤＥＣ２０５ジスルフィド架橋の部分的還元は、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ（１０mM）ｐＨ７．４中に２mg／mLの最終濃度に希釈されたＤＥＣ２０５（ＤＥＣ２０５ ７mg／mLＰＢＳ、ｐＨ７．４（Biotem））の２mgを用いて実施され、１００mM ＭＥＳＮＡ（（２−メルカプトエタンスルフォン酸ナトリウム塩）（シグマ）１Ｍ、ＥＤＴＡ（１０mM）溶液）と３７℃で１５分間インキュベーションして還元し、ＤＥＣ２０５抗体上の遊離のチオールを生成した。

ＭＥＳＮＡは、還元された抗体をＰＤ１０脱塩カラムに充填することによて取り除き、そして直ちにＢＣＡアッセイを用いてタンパク質量を測定した。

Ｑ１１Ｌペプチド（Ｎ末端ブロモ酢酸修飾化Ｑ１１Ｌ（RRAR配列で隣接されたОＶＡ２５７−２６４）ペプチド、凍結乾燥形（Polypeptide ））を５モル過剰のＱ１１Ｌペプチドを用いて、４℃で一晩、ＰＢＳ−ＥＤＴＡバッファー中で還元したＤＥＣ２０５抗体と結合した。

次に、ＤＥＣ２０５−Ｑ１１Ｌ結合物はゲル濾過によって精製した。結合物は、セファデックスＧ２００カラムを用いてＰＢＳバッファーで平衡化したセファデックスＧ２００カラムによるゲル濾過によって遊離のＱ１１Ｌペプチドから分離した。

次に、ＤＥＣ２０５−Ｑ１１Ｌ結合物は、ＤＥＣ２０５、ＤＥＣ２０５＋ＭＥＳＮＡ、Ｇ２００ゲル濾過からのｂ１分画、およびＧ２００ゲル濾過からのｂ２分画を用いて、非還元（−ＤＴＴ）および還元（＋ＤＴＴ）条件下で８％アクリルアミドゲル上でコマシ染色にかけられた。ｂ１およびｂ２分画は、約９５ｋＤａに想定上のＨＬｃ−Ｑ１１Ｌ結合物（ＨＬｃ＝ＤＥＣ２０５の重および軽鎖）を示した。

また、ウエスタンブロットは、ＤＥＣ２０５、ＤＥＣ２０５＋ＭＥＳＮＡ、Ｇ２００ゲル濾過からのｂ１分画とｂ２分画のプールを用いて、非還元（−ＤＴＴ）および還元（＋ＤＴＴ）条件下で８％アクリルアミド変性ゲルでの泳動の後に、実施された。還元条件（＋ＤＴＴ）下では、遊離チオールにＱ１１Ｌペプチドの結合による約５５ｋＤａに重鎖のわずかなシフトがあった。

ウエスタンブロットにおける５５ｋＤａの分子量は還元条件（＋ＤＴＴ）に言及する。これらの条件下では、想定上の結合物の重鎖および軽鎖の間に存在する残ったジスルフィド架橋はＤＴＴによって開裂する。生成物はペプチドに結合された重鎖であり、５５ｋＤａのサイズのあたりにわずかにシフトしてあらわれる。要約すると、９５ｋＤａ産物（−ＤＴＴ）は５５ｋＤａ産物（＋ＤＴＴ）となり、そして軽鎖はこの分析では見ることはできない。これらのシフトは非還元条件で９５ｋＤａのサイズのあたりに見られる。

実施例９− ＧＭ−ＣＳＦとＣｐＧの組合せは強力なカクテルアジュバントであり、樹状細胞を標的とする能力を与えられたワクチンの抗原−特異ＣＤ８^＋Ｔ細胞を増加する
Ｑ１１Ｌ ОＶＡ由来のペプチド（ＲＲＡＲアミノ酸で隣接されたОＶＡ_{２５７−２６４}）を、ＡＴＣＣから得られた抗−ＤＥＣ２０５ｍＡｂに結合した。

マウス（ｎ＝４／グループ）は、抗−ＤＥＣ２０５−ОＶＡ_{２５７−２６４}（２０μg）のみ、またはＧＭ−ＣＳＦ（２０μg）との組合せで免疫した。翌日、５０μgのＣｐＧを投与した。アジュバントなしでのワクチンによる２回目の免疫は１１日目に実施した。１７日目に脾細胞をマウスから取りだし、そしてＣＤ８^＋Ｔ細胞をミルテニーカラム（Miltenyi Biotec SAS. Paris France）で精製した。四量体Ｋ^ｂ−ОＶＡ_{２５７−２６４}／ＬＴ−ＣＤ８ペプチドを認識するＣＴＬのパーセントを測定した。コントロールとしてＫ^ｂ−ＶＳＶ（Vascular Stomatitis Virus）を用いて、コントロールから得られた背景のノイズを示されたパーセントから差し引いた。

結果は、図６Ａ（抗−ＤＥＣ２０５−ОＶＡ２５７−２６４のみまたはＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧと混合で免疫されたマウスから誘導されたＣＴＬの図解）およびＢ（得られた平均結果プラスまたはマイナス標準偏差として）に示される。

図６Ｂに示されるように、マウスを抗−ＤＥＣ２０５−ОＶＡ_{２５７−２６４}とＧＭ−ＣＳＦ／ＣｐＧでワクチン接種した時に、ＤＥＣ２０５−ОＶＡ_{２５７−２６４}のみでワクチン接種したマウスに比較して、抗ОＶＡ_{２５７−２６４}／ＬＴ−ＣＤ８の有意により高い誘導が起った。これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＣｐＧの組合せが、樹状細胞を標的とする能力を付与されたワクチンの抗原−特異ＣＤ８^＋Ｔ細胞を増加するための強力なカクテルアジュバントである事を実証する。

本発明は様々な好ましい実施態様の用語で記述されてきたが、当業者は種々の修飾、置換、省略および変化はそれらの範囲からそれることなくなされることができることを理解するであろう。従って、本発明の視野はそれらの請求項の範囲によって制限され、それらと等価物を包含することが意図される。

Claims (15)

1. 樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段、当該標的とするための手段と結合された当該少なくとも一つの抗原、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび／またはＣｐＧ−様オリゴデオキシヌクレオチドを含むアジュバントを含む組成物、好ましくは医薬組成物。
2. 当該標的とするための手段が、樹状細胞を標的とする担体であり、当該担体が、抗体と複合されたリポソーム、抗体と複合されたミクロ粒子、抗体と複合されたナノ粒子、毒素担体、またはモノクロナールもしくはポリクロナール抗体である、請求項１に記載の組成物。
3. 当該少なくとも一つの抗原が、当該樹状細胞を標的とするための手段と、または当該樹状細胞を標的とする担体と、共有結合を介して、または静電気的相互作用により、または疎水性相互作用により、または融合タンパク質もしくはキメラタンパク質として結合された、請求項１または２に記載の組成物。
4. 当該少なくとも一つの抗原が、癌からの抗原、感染症からの抗原（例えば、バクテリア抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫もしくは原虫抗原）、アレルギー抗原、または自己免疫抗原、あるいはそれらの混合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 当該少なくとも一つの抗原が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 当該ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドが、
   
   の配列を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 樹状細胞に当該少なくとも一つの抗原を標的とするための当該手段が、志賀毒素のＢサブユニット（例えば、配列番号４の志賀毒素のＢサブユニット）、またはその免疫学的機能等価物である毒素担体であり、当該免疫学的機能等価物が、好ましくは志賀様毒素１、志賀様毒素２、志賀様毒素２ｃ、志賀様毒素２ｄ１、志賀様毒素２ｄ２、志賀様毒素２ｅ、志賀様毒素２ｆ、志賀様毒素２ｙ、ベロ毒素−１、ベロ毒素−２、ベロ毒素２ｃまたはベロ毒素２ｖである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 当該志賀毒素のＢサブユニットまたは当該その免疫学的等価物が、当該少なくとも一つの抗原にシステイン基またはＺ（ｎ）−Ｃｙｓ基（ここでは、Ｚはスルフィドリル基を有さないアミノ酸であり、ｎは０、１、またはポリペプチドである）を介して、化学的結合によって結合された、請求項７に記載の組成物。
9. 当該樹状細胞に少なくとも一つの抗原を標的とするための手段が、抗−ＤＥＣ２０５抗体であり、好ましくはＣＤ２０５、ＮＬＤＣ−１４５、それらの樹状細胞標的能力を保持するそれらのフラグメント、およびそれらの混合物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
10. 当該少なくとも一つの抗原が、同じかまたは異なった手段もしくは担体と結合された異なった抗原の混合物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 薬物としての、好ましくはワクチンとしての、上記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
12. 癌、バクテリア、ウイルス、真菌、寄生虫または原虫によって引き起こされる感染症、アレルギーおよび／または自己免疫疾患を処置するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
13. 乳がんを処置するための、請求項１２に記載の使用。
14. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に許容されるビヒクルを含む、ワクチン接種のためのキット。
15. 温血動物に同時、連続的または別個の投与のために適切な請求項１４に記載のワクチンまたはワクチン接種のためのキットである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。