JP2014520890A

JP2014520890A - 癌細胞の標的浸透圧溶解

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Publication number: JP2014520890A
Application number: JP2014521754A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ポール、デニス; ジェイ．グールド、ハリー
Original assignee: Louisiana State University
Current assignee: Louisiana State University
Priority date: 2011-07-21
Filing date: 2012-07-19
Publication date: 2014-08-25
Anticipated expiration: 2032-07-19
Also published as: CA2877994A1; AU2012284010A1; EP2734214A1; WO2013012997A1; EP2734214B1; AU2012284010B2; US8921320B2; JP5945597B2; US20130184218A1; US20150080327A1; CA2877994C; EP2734214A4

Abstract

ナトリウム−カリウム−アデノシントリホスファターゼ（Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ）を遮断する薬剤と、例えば電気刺激又は薬学的刺激によるその後ＶＧＳＣ活性化との併用療法を使用する、電圧依存性ナトリウムチャネル（ＶＧＳＣ）を過剰発現する腫瘍細胞の標的浸透圧溶解（ＴＯＬ）を開発した。ＶＧＳＣの活性化により、非癌細胞よりもはるかに多量のナトリウムが癌細胞内に誘導される。このナトリウム勾配に続いて水が癌細胞内に入り、膨潤及び溶解が引き起こされる。非癌性細胞は、ＶＧＳＣを過剰発現しないため、細胞に進入することになるナトリウム及び水はより少量であり、非癌性細胞は溶解しない。この方法は、高度浸潤性乳癌、前立腺癌、肺小細胞癌、非小細胞肺癌、リンパ腫、中皮腫、神経芽腫、及び子宮頚癌を含むがこれらに限定されない、ＶＧＳＣを過剰発現する全ての細胞に適用可能である。

Description

本発明は、電圧依存性ナトリウムチャネル（ＶＧＳＣ又は「ナトリウムチャネル」）を過剰発現する癌細胞を標的とし、ナトリウム−カリウム−アデノシントリホスファターゼ（Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ又は「ナトリウムポンプ」）を最初に遮断し、その後ＶＧＳＣを刺激してナトリウム及び水を癌細胞に進入させることにより、それら癌細胞の浸透圧溶解を引き起こす方法に関する。

転移癌の化学療法及び放射線療法は、正常組織及び異常組織の両方に毒性であるため、臨床医は、患者を死亡させる前に新生物疾患を死滅させようとする困難な課題；治療と救命とのバランスに直面する。従来の癌治療には全て、治療期間をはるかに超えて続く場合がある毒性、病的状態の増大、及び生活の質の低下が伴う。現在の抗新生物治療の主な関心は、癌細胞の標的治療であり、例えば、癌細胞により発現又は過剰発現されるが、正常組織ではされないタンパク質を標的とすることである。

多くの浸潤癌細胞タイプは、電圧依存性ナトリウムチャネル（ＶＧＳＣ；又は「ナトリウムチャネル」）を、正常細胞の１０００倍を超えて過剰発現する（１、２、７）。ＶＧＳＣを過剰発現する癌細胞は、高度浸潤性乳癌（４、１０、１３、２７）、前立腺癌（２、６、７、８、１８、１９、２０、２１、２２、２６）、肺小細胞癌（３、２３）、非小細胞肺癌（２８）、リンパ腫（９）、神経芽腫（２５）、及び子宮頚癌（５）を含むがこれらに限定されない上皮癌である。上皮癌には分類されない中皮腫も、ＶＧＳＣを過剰発現することが知られている（１２）。これらのナトリウムチャネルが活性化されると、Ｎａ^＋は、細胞内へと誘導される。これらの癌では、転移の程度は、ＶＧＳＣの発現増加と直接的に関連している（１、７；特許文献１も参照されたい）。生理学的に、これら癌細胞は、ニューロン及び心筋細胞等の正常興奮性細胞と、ある細胞特性を共有する（例えば、活動電位の伝導）。特許文献１には、乳癌を含む癌の治療として、ＶＧＳＣの阻害剤の使用が開示されている。

米国では、毎年１６０万人が上皮細胞癌を罹患し、そのうち４０％が、「高度浸潤性」であり、ＶＧＳＣを過剰発現するとみなされている（１０）。悪性／転移性癌と診察された患者は、現在、外科手術、化学療法、及び／又は放射線で治療されるが、それらは大がかりで外観を損なうことが多い。米国では、毎年４００，０００人を超える人々が上皮細胞癌で死亡しており、全世界では、その１０倍の人々が死亡していると推定されている。加えて、浸潤癌と診察された別の１，２００，０００人の米国患者が、従来の手術、化学療法、及び／又は放射線での治療に成功している。乳房細胞癌は、高度浸潤癌の一例である。米国では、毎年４０，０００人を超える人々が乳房細胞癌で死亡しており、全世界では、４６５，０００人が死亡している。これら死亡の９０％超は、原発腫瘍の転移による。加えて、浸潤性乳癌と診察された別の１７０，０００人の米国患者が、従来の乳房切除、乳腺腫瘍摘出、化学療法、及び／又は放射線での治療に成功している。毎年２０７，０００人が乳癌を罹患し、そのうち４０％が、「高浸潤性」であり、ＶＧＳＣを過剰発現すると考えられている（１０）。

「電圧依存性ナトリウムチャネル」と呼ばれるナトリウムチャネルのファミリーは、細胞膜内外の電位勾配のわずかな変化（＞４０ｍＶ）に感受性であるため、そのように命名されている。また、それらは、多くの形態の刺激：膜の機械的異常、超音波（２９）、磁場（２９）、及び幾つかの薬剤により活性化されることが示されている。ＶＧＳＣファミリーには９つのメンバーが存在し、アイソフォームの多くの変異体が存在する。それらは、Ｎａ_ｖ１．Ｘと命名されており、Ｘは、１〜９である。サブタイプは、文字ａ、ｂ等で指定される。

Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅは、動物細胞中の遍在性膜貫通型タンパク質であり、より多くの荷電イオン、主にナトリウムイオンが、細胞内よりも細胞外に位置している、細胞膜内外のイオン不均衡を維持するように機能する。これにより、恒常性のバランスの取れた電気化学的勾配が生じる。イオン不均衡が電圧変化の存在下で変化すると、活動電位が発生し、浸透圧を一時的に細胞内高浸透圧状態へと変化させる。ナトリウム不均衡の回復は、Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅにより行われる必須機能である。Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅが適切に機能しないと、浸透圧バランスを回復するために、ナトリウムに続いて水が細胞に進入し、それにより細胞容積が増加する。正常細胞では、この細胞容積の変化は、膜に伸展性があるため許容される。Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ機能を遮断すると、細胞興奮性の喪失及び細胞容積の増加に結び付く場合がある。強心配糖体を含む、多くの阻害剤が知られている。アイソザイムは、強心配糖体薬の各々に対する感受性が異なる。３０個を超える薬剤が、ナトリウムポンプ活性を阻害することが示されている。それらには、ウアバイン、ジギタリス、及びその活性成分であるジゴキシン及びジギトキシンが含まれる。

特許文献２には、細胞アポトーシスを引き起こすことにより膵臓癌を治療するための、単独で又は他の標準的癌治療剤と併用した強心配糖体（例えば、ウアバイン及びプロスシラリジン）の使用が開示されている。

特許文献３には、癌治療として細胞アポトーシスを誘導するための、ジゴキシン及びウアバインを含む強心配糖体の使用が開示されている。

米国特許第７，３９３，６５７号明細書米国特許出願公開第２００７／０１０５７９０号明細書米国特許出願公開第２００９／００１８０８８号明細書

本発明者らは、過剰なＶＧＳＣを発現する癌細胞にて、Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ（ナトリウムポンプ）を遮断し、その後ＶＧＳＣを活性化させると、細胞は溶解し、死滅することを発見した。ＶＧＳＣが活性化されると、Ｎａ^＋が細胞内に誘導されるが、ナトリウムポンプが阻害されているため、Ｎａ^＋を細胞外に汲み出すことができない。Ｎａ^＋勾配に基づいて水が細胞内に流れ込むため、細胞に流れ込む水は、膜伸展性を超過すると、Ｎａ^＋チャネルを過剰発現する（つまり、より多くのＮａ^＋が細胞に入ることが可能になる）細胞を膨潤及び破裂させる。ＶＧＳＣを過剰発現しない正常細胞に進入するＮａ^＋はより少量であるため、正常組織は膨潤又は溶解しない。本発明者らは、この２段階治療を「標的浸透圧溶解」（ＴＯＬ；ＴａｒｇｅｔｅｄＯｓｍｏｔｉｃＬｙｓｉｓ）と呼び、この治療が、高度浸潤癌細胞の治療に有効であることを示した。加えて、本発明者らは、幾つかの高度浸潤癌細胞が、Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ（ナトリウムポンプ）を過剰発現し、過剰発現したＶＧＳＣによるＮａ^＋流入の増加を補償することを示した（未発表；データ非表示）。例えば、ＭＣＦ−７乳癌細胞は、Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅを８〜１０倍過剰発現するが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞は、Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅを２倍しか過剰発現しない。

要約すると、本発明者らは、浸潤癌のｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏモデルの両方で、ＴＯＬの効力を実証した。本発明者らは、ＴＯＬの誘導には、癌細胞の電気的刺激及び薬学的刺激の両方が有用であることを示した。本発明者らは、ＴＯＬが、４つの異なる組織タイプに由来する７つの細胞株に有効であることを実証した。正常組織と比較してナトリウムチャネル発現が１００倍増加しているだけで、ＴＯＬ治療に対する感受性を付与するのに十分であるが、溶解するまでの時間は、ナトリウムチャネル発現の度合いに反比例する。本発明者らは、比較的高濃度のナトリウムチャネルを正常に発現する正常な組織でさえ、ＴＯＬが、これらの組織に影響しないことをｉｎｖｉｖｏで実証した。最終的に、本発明者らは、ナトリウムポンプを遮断する任意の薬剤又は方法を使用して、ＴＯＬを誘導することができることを実証した。

対照、並びにウアバイン（ナトリウムポンプ遮断剤）のみによる処理、ベラトリジン（ナトリウムチャネル刺激因子）のみによる処理、及びウアバイン及びベラトリジンの組み合わせによる処理（標的浸透圧溶解）の、培養乳癌細胞の細胞生存率に対する効果を示す図である。０日目に、生理食塩水及び無電気刺激（生理食塩水−無刺激）、生理食塩水及び電気刺激（生理食塩水−刺激）、ウアバイン及び無刺激（ウアバイン−無刺激）、又はウアバイン及び電気刺激（ウアバイン−刺激）で単回処理した後のマウス乳癌異種移植片の経時的な腫瘍容積の変化を示す図である。

本発明者らは、Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅを遮断する薬剤と、例えば電気刺激、磁気的刺激、超音波刺激（２９）、又は薬学的刺激によるその後のＶＧＳＣ活性化との併用療法による、ＶＧＳＣを過剰発現する腫瘍細胞の標的浸透圧溶解（ＴＯＬ）を開発した。ＶＧＳＣの活性化により、非癌細胞よりもはるかに多量のナトリウムが癌細胞内に誘導される。このナトリウム勾配に続いて水が癌細胞内に入り、膨潤及び溶解を引き起こす。非癌性細胞は、ＶＧＳＣを過剰発現しないため、正常細胞に進入するナトリウム及び水はより少量であり、細胞は溶解しないであろう。

この方法は、ＶＧＳＣを過剰発現する全ての癌細胞に適用可能である。ＶＧＳＣを過剰発現する癌は、文献により、又は当技術分野で公知の方法（例えば、米国特許出願公開第２００９／００７４６６５号）で癌細胞のＶＧＳＣをアッセイすることにより、特定することができる。例えば、現在までアッセイされた上皮癌細胞は全て、ＶＧＳＣを過剰発現することが示されており、そうした上皮癌細胞には、高浸潤性乳癌（４、１０、１３、２７）、前立腺癌（２、６、７、８、１８、１９、２０、２１、２２、２６）、肺小細胞癌（３、２３）、非小細胞肺癌（２８）、リンパ腫（９）、神経芽腫（２５）、及び子宮頚癌（５）が含まれるがこれらに限定されない。上皮癌には分類されない中皮腫も、ＶＧＳＣを過剰発現することが知られている（１２）。現在まで研究された上皮癌は全て、ＶＧＳＣを過剰発現することが示されているため、神経膠腫、神経腫、肝癌、卵巣癌、膀胱癌、膵臓癌、甲状腺癌、脾臓癌、胃癌、子宮頚癌、皮膚癌、精巣癌、腎癌、及び口腔癌を含むが、それらに限定されない、上皮細胞癌と分類される他の癌は、ＶＧＳＣを過剰発現することが予想される。

Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅ遮断剤は、直接投与により又は静脈内投与により単一腫瘍に、静脈内投与又は腔内投与により単一器官又は領域に、又は静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、若しくは経口投与により全身に送達することができる。ナトリウムチャネルの電気的又は薬学的刺激は、単一腫瘍、単一器官、身体の区画、又は全身に送達することができる。理論的には、全てのタイプ及びサブタイプのＶＧＳＣファミリーは、等しくこの技術に感受性であるはずである。現在までに試験された細胞株は、Ｎａ_ｖ１．５、Ｎａ_ｖ１．５ａ、及びＮａ_ｖ１．７を過剰発現し、それらは全て標的溶解をもたらした。

Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅを遮断するために使用することができる医薬化合物の例は多数存在する。例えば、米国特許出願公開第２００７／０１０５７９０号及び第２００９／００１８０８８号を参照されたい。そのような化合物には、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：ウアバイン（ｇ−ストロファンチン）；ジヒドロウアバイン；ウアバイン八水和物；ウアバゲニン；ジゴキシン；ジギトキシン；ジギタリス；アセチルジギトキシン；アセチルジゴキシン；ラナトシドＣ；デスラノシド；メチルジゴキシン；ギトホルマート；オレアンデリン（ｏｌｅａｎｄｅｒｉｎ）；オレアンドリゲニン；ブホトキシン；ブホタリン；マリノブファゲニン（３，５−ジヒドロキシ−１４，１５−エポキシブホジエノリド（ｂｕｆｏｄｉｅｎｏｌｉｄｅ）；パリトキシン；オリゴマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、及びＧ；ルタマイシン（オリゴマイシンＤ）；ルタマイシンＢ；ストロファンチン（ｇ−ストロファンチン、アコカンテリン）；ｋ−β−ストロファンチン；ストロファンチジン；ｋ−ストロファントシド；シマリン；エリシモシド（カルデノリド）；ヘルベチコシド；ペルボシド；視床下部Ｎａ．，Ｋ．−ＡＴＰａｓｅ阻害因子（ＨＩＦ）；ＨＩＦのアグリコン；アレノブファギン；シノブファギン；マリノブファギン；プロスシラリジン；シリロシド；ダイグレモンチアニン；及びＮａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅの他の全ての阻害剤、各々の組み合わせ及び誘導体。

腫瘍組織を電気的に刺激する方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第７，７４２，８１１号を参照）。幾つかの例には、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：直流又は交流（ＤＣ又はＡＣ）の使用；腫瘍に対する電極の直接的適用の使用；複数転移を有する器官に対する電極の直接的適用の使用；深部筋肉刺激装置を使用した経皮的電気刺激；経皮的電気神経刺激（「ＴＥＮＳ」）ユニット又は類似のもの；並びに４０ｍＶ以上及び好ましくは約１Ｖの電圧での全身電気刺激。加えて、神経組織及びナトリウムポンプ（２９）を刺激するために、磁場及び超音波が使用されている。

ＶＧＳＣの活性を増加させることが知られている医薬化合物の例は、当技術分野で公知である。例には、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：ベラトリジン；ベラセビン；アンチラトキシン（ＡＴＸ）；ＡＴＸＩＩ；バトラコトキシン；アコニチン；グラヤノトックス（ｇｒａｙａｎｏｔｏｘ）；グラヤノトキシンＩＩＩヘミ（酢酸エチル）；アンチラトキシン；ナイジェリシン；グラミシジン；α−ポンピリドトキシン；β−ポンピリドトキシン；ホイアミドＡ；ブレベトキシン（ＰｂＴｘ−２）；シグアトキシン；サソリ神経毒；ＢＤＦ９１４８；ＤＰＩ２０１−１０６；ＴＣ０１０１０２９（ＳＣＮＭ１）；シペルメトリン；アルファメトリン；パリトキシン；並びに上記の各々の全ての組み合わせ及び自明な誘導体。

本発明者らは、標的浸透圧溶解技術が、（１）高度浸潤性腫瘍を有する患者の生存率を増加させ；（２）乳癌患者の定型的乳房切除及び乳腺腫瘍摘出の数を減らし；（３）治療により病的状態の程度を低減し；（４）治療からの回復時間を低減し；及び（５）ＶＧＳＣを過剰発現する全ての癌に適用可能であると予想する。

本発明者らは、下述のｉｎｖｉｖｏＴＯＬ試験にて、乳癌マウスモデルでは生存率が３０〜４０％であったこと示しており、このｉｎｖｉｔｒｏ実験により、パラメータが最適化されれば、成功率はより高くなることが示唆されている。ｉｎｖｉｖｏＴＯＬの制限要因は、ナトリウムポンプ阻害剤の腫瘍細胞への送達効率である。初期の試験的研究では、高度に血管新生され、したがって阻害剤の送達がより効率的であった腫瘍は、ＴＯＬ処理後に溶解された。対照的に、ほとんど血管新生されていない腫瘍は、依然として生存可能であった。薬剤送達が更に向上すれば、ＶＧＳＣを過剰発現するほぼ全て癌（例えば、全乳癌の４０％）が、ＴＯＬで治療可能になると考えられ、乳癌の場合には、乳房切除及び乳腺腫瘍摘出は、最大４０％低減されるはずである。これは、再建手術の必要性も低減するであろう。

標的浸透圧溶解は、従来の癌治療よりも多くの利点を有することが予想される。化学療法は、典型的には、癌性組織だけでなく健康組織にも損傷を引き起こし、回復の長期化及び病的状態の慢性化に結び付く。それと比較して、ＴＯＬは、ＶＧＳＣを過剰発現する細胞のみを破壊することになる。したがって、より選択的な疾患組織の損傷が予想される。これは、治療の長期的有害効果がより少なくなることに寄与するであろう。放射線療法は、典型的には、癌性組織周囲の健康組織を死滅させることになる。これは、化学療法と同様に、回復の長期化及び病的状態の慢性化に結び付くことが多い。ＴＯＬは、ＶＧＳＣを過剰発現する細胞に対して選択性であるために、腫瘍周辺の損傷がほとんどない。

化学療法及び放射線療法（「ＲＴ」）の有害効果はよく知られており、治療遵守が問題であることが多い。本発明者らは、癌のＴＯＬは、最適化されれば、わずか１回又は２回の治療しか必要とせず、各治療は数時間しか続かず、各治療からの回復は２〜５週間であると考える。治療の有害効果が、従来療法と比較して最小限であると予想されるため、治療遵守は、従来療法よりも向上すると予想される。

化学療法及び放射線療法（ＲＴ）に関して現在問題となっている別の問題は、これら治療に起因する長期的又は恒久的損傷である。化学療法は、壊死性及び脱髄性神経障害、記憶の変化、性的及び受精能変化を生じさせることが知られている。ＲＴの長期的な有害効果は、治療に応じて大きく異なるが、脳全体を照射する場合、種々の神経障害及び慢性的疼痛、運動障害、及び認識障害を生じさせることが知られている。ＴＯＬでは、慢性的有害効果はより少ないことが予想され、生活の質は、従来治療と比較して、ほとんどの患者で向上するであろう。

化学療法及び／又は放射線療法からの回復は、典型的には数か月間かかる。ＴＯＬ治療からの回復には、死細胞の吸収が伴うことになり、発熱及び他のインフルエンザ様症状を呈するであろう。発熱及び他の症状の程度は、腫瘍の転移及び大きさの程度に応じて様々であろう。発熱及び関節痛は、一般的な鎮痛解熱治療で緩和することができる（アセトアミノフェン、ＮＳＡＩＤ等）。したがって、治療直後の生活の質は、従来治療の場合よりも高くなると考えられる。

ＴＯＬの２つの考え得る有害反応が生じる場合がある。ラットでは、後根神経節におけるＮａ_ｖ１．７ＶＧＳＣの過剰発現は、炎症に関連している（１５、１６、１７）。したがって、関節リウマチ、クローン病、又は感染症等の主要な炎症疾患を有する患者では、ＴＯＬは、潜在的に末梢神経系に対する障害を生じさせる場合がある。有害反応の第２の可能性は、細胞が溶解すると共に放出されるタンパク質に対する自己免疫反応の発生であることが考えられる。癌細胞が溶解すると共に、Ｔ細胞により患者由来でないと認識される異常なタンパク質が放出される可能性がある。この副作用は、細胞の非特異的溶解を引き起こす化学療法剤及び放射線治療で知られている。

この技術の１つの実施形態は、非腫瘍細胞で見られるものよりもＶＧＳＣの発現が増加している転移性腫瘍細胞を溶解する方法であって、以下の２つのステップを含む方法である：ステップ１は、Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅの活性を阻害する化合物を腫瘍細胞に投与することであり、ステップ２は、ＶＧＳＣの活性を増加させる化合物を腫瘍細胞に投与することである。これらの２ステップの組み合わせは、腫瘍細胞に過剰なナトリウムを取り込ませることになり、これにより、次いで細胞に水を流入させることになる。腫瘍細胞は、過剰な水により膨潤し、最終的には溶解することになる。

この技術の第２の実施形態は、非腫瘍細胞で見られる活性よりも、ＶＧＳＣの発現が増加している転移性腫瘍細胞を溶解する方法であって、以下のステップを含む方法である：ステップ１は、Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅの活性を阻害する化合物を腫瘍細胞に投与することであり、ステップ２は、ＶＧＳＣの活性を増加させる電気刺激を腫瘍細胞に与えることである。ここでも、上記と同様に、腫瘍細胞は、過剰なナトリウムを取り込んで、細胞に水を流入させることになり、膨潤し、最終的には溶解することになる。

この技術の第３の実施形態は、非腫瘍細胞で見られる活性よりも、ＶＧＳＣの発現が増加している転移性腫瘍細胞を溶解する方法であって、以下のステップを含む方法である：ステップ１は、Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅの活性を阻害する化合物を腫瘍細胞に投与することであり、ステップ２は、ＶＧＳＣの活性を増加させる磁気刺激を腫瘍細胞に与えることである。

この技術の第４の実施形態は、非腫瘍細胞で見られる活性よりも、ＶＧＳＣの発現が増加している転移性腫瘍細胞を溶解する方法であって、以下のステップを含む方法である：ステップ１は、Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅの活性を阻害する化合物を腫瘍細胞に投与することであり、ステップ２は、ＶＧＳＣの活性を増加させる超音波刺激を腫瘍細胞に与えることである。

第５の実施形態は、上記実施形態により溶解される可能性のある転移性腫瘍細胞を特定するための方法であって、ＶＧＳＣの発現度合いについて腫瘍細胞をアッセイし、その発現度合いを正常な非腫瘍細胞の発現度合いと比較することを含み、上記の方法を使用して溶解される可能性のある転移性腫瘍細胞は、ＶＧＳＣをより高度に発現する腫瘍細胞であるとする方法である。

実施例１
（乳癌細胞の標的浸透圧溶解）
ＴＯＬの有効性を、乳癌のｉｎｖｉｔｒｏモデルを使用して試験した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を、９６ウェルプレートで完全培養密度まで培養した。これらの乳癌細胞は、ＶＧＳＣを１４００倍過剰発現することが知られている。これらの細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、又はＤＭＥＭに溶解させた強心配糖体薬剤（公知のナトリウムポンプ阻害剤）ウアバイン（１０ｐＭ〜１００ｎＭ；ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．社、ミズーリ州セントルイス）若しくはジギトキシン（１００ｐＭ〜１μＭ；Ｓｉｇｍａ社）と３０分間接触させた。ナトリウムポンプ阻害剤に接触させた後、各ウェルの底部に接触するように配置された陽極及び陰極、又はプレート底部のプリント回路を使用して、細胞に電流（０Ｖ、１００ｍＶ、又は１ＶＤＣ）を流した。電流は、Ｇｒａｓｓ社製ＳＤ９型刺激装置（ＧｒａｓｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、マサチューセッツ州クィンシー）を使用し、白金線電極を介して発生させた。細胞を、１ｎＭ以上のウアバイン又は１０ｎＭ以上のジゴキシンと接触させ、１００ｍＶ又は１Ｖの電流と接触させた２４ウェルのうちの６ウェルでは、全ての癌細胞が死滅した（データ非表示）。

実施例２
（癌のｉｎｖｉｖｏモデルを使用した標的浸透圧溶解）
癌のｉｎｖｉｖｏモデルとして、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をマトリゲルに懸濁し、５匹のヌードマウス（Ｊ−ＮＵ）の背中に皮下注射した。各マウスには、０．７５〜１．２ｃｍの腫瘍が３〜５週間で発生した。その後、１０ｍｇ／ｋｇのウアバイン又は生理食塩水をマウスに皮下注射した。３０分後、４％イソフルランでマウスに麻酔をかけ、皮膚の小さな切開部から腫瘍を露出させた。陽極及び陰極を各腫瘍に挿入し、１２０回の連続１ＶＤＣパルス（１０ミリ秒、２Ｈｚで１分間）を、上記で説明されているように陽極及び陰極を介して送達した。合計１１個の腫瘍を試験した。３個の腫瘍は、ウアバインで処理され、電気的に刺激されたマウス（Ｏ−ＥＳ実験）由来であった。残りのうち、２個は、生理食塩水で処理され、電気的に刺激されなかったマウス（Ｓ−ＮＳ対照）に由来し、３個は、ウアバインで処理されたが、電気的に刺激されなかったマウス（Ｏ−ＮＳ対照）に由来し、３個は、生理食塩水で処理され、電気的に刺激されたマウス（Ｓ−ＥＳ対照）に由来した。電気刺激は、１５分後及び３０分後に繰り返した。１日後、マウスを、Ｎａ^＋−ペントバルビタールの過量投与で屠殺し、４％緩衝パラホルムアルデヒドで灌流し、腫瘍を摘出した。腫瘍を５μｍに切片化し、ヘマトキシリン及びエオジンで染色した。実験群（Ｏ−ＥＳ群）の３個の腫瘍のうち、１匹のマウスに由来する腫瘍は、処理後に８０％の細胞死を示した。しかしながら、同じマウスの腫瘍の底部から採取した正常筋肉は、細胞死の徴候を示さなかった。Ｏ−ＥＳ群の他の２匹のマウスは、高度には血管新生されていない腫瘍を有していたため、ウアバインは効果的に腫瘍細胞に分布することができなかった。結果的に、溶解は、これら２匹のマウスの腫瘍では見られなかった。他の３つの処理群の腫瘍は、いずれも細胞溶解の徴候を一切示さなかった。

実施例３
（複数細胞株の癌のｉｎｖｉｔｒｏ標的浸透圧溶解）
最初に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス、カタログ番号ＨＴＢ−２６）乳癌細胞を、完全培養密度まで９６ウェルプレートで培養した。これら細胞は、ＶＧＳＣを１００倍過剰発現する。これらの細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ニューヨーク州グランドアイランド）、又はＤＭＥＭに溶解させた強心配糖体薬剤ウアバイン（１０ｐＭ〜１００ｎＭ）若しくはジゴキシン（１００ｐＭ〜１μＭ）と３０分間接触させた。実施例１と同様に、各ウェルの底部に接触するように配置された陽極及び陰極により、細胞に電流（０Ｖ、１００ｍＶ、又は１ＶＤＣ）を流した。１ｎＭ以上のウアバイン又は１０ｎＭ以上のジゴキシンと接触させた２４ウェルのうちの６ウェルでは、全ての癌細胞が死滅した。これらの６つのウェルのうち、１つのウェルは１０ｎＭウアバイン及び１ＶＤＣに接触させたものであり、１つは１００ｎＭウアバイン及び１００ｍＶＤＣで処理したものであり、１つは１００ｎＭウアバイン及び１ＶＤＣで処理したものであり、２つは１００ｎＭジゴキシン及び１ＶＤＣで処理したものであり、１つは１μＭジゴキシン及び１００ｍＶＤＣで処理したものであった。

また、本発明者らは、現在ＦＤＡにより臨床での使用が認可されている２つの強心配糖体薬剤ウアバイン及びジゴキシンを、複数の癌株のｉｎｖｉｔｒｏ溶解に使用した。ＴＯＬが、ＶＧＳＣを過剰発現するあらゆる癌に有効であり、任意のナトリウムポンプ遮断剤を使用することができることを実証するために、本発明者らは、最も一般的な致死性癌の４つを代表する組織タイプに由来する７つの癌細胞株を培養した。細胞株は、以下の通りであった：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）；ＭＣＦ−７（乳癌；ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２２）；ＬＮＣａＰ（前立腺癌；ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１７４０）；ＤＵ１４５（前立腺癌；ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−８１）；ＭＣＡ−３８（結腸癌；オーガスト・オチョア（ＡｕｇｕｓｔｏＯｃｈｏａ）博士提供）；Ａ５４９（非小細胞肺癌；ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１８５）；及び３ＬＬ（非小細胞肺癌；オーガスト・オチョア博士提供、ルイジアナ州立大学、ルイジアナ州ニューオーリンズ）。細胞を、３５ｍｍ径培養皿中の、４ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１０μＭインスリンで補完されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ社）に１８〜２４時間播種した。その後、細胞を、１００ｎＭウアバイン、１μＭジゴキシン、又は無薬剤中で１５〜４５分間インキュベートした。Ｇｒａｓｓ社製ＳＤ９型刺激装置（ＧｒａｓｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、マサチューセッツ州クィンシー）を使用し、ＤａｖｉｄＫｏｐｆＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製マイクロマニピュレータ（カリフォルニア州ターザナ）で適所に保持された白金線電極を介して、１秒当たり２００パルスの２ＶＤＣ電流を個々の細胞に流し、溶解するまでの時間を測定した。代表的な実験の映像記録を、ライカ社製ＤＭＩＬ顕微鏡に取り付けられたキヤノン社製ＶｉｘｉａＨＦＭ４００カメラをデジタルで使用して録画した。映像は請求に応じて入手可能である。各細胞種及び各薬剤についての溶解までの平均時間（±ＳＥＭ）は、表１に示されており、単位は秒で表されている。表１に示されるように、対照はいずれも、５分間の時間制限内に溶解しなかった。癌細胞は全て溶解し、溶解するまでの時間は、ＶＧＳＣの発現が最大であることが知られている細胞の場合に、より迅速であった。

実施例４
（ＶＧＳＣの薬学的刺激を使用した乳癌のｉｎｖｉｔｒｏＴＯＬ）
培養したＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７乳癌細胞の生存率に対する、ウアバイン（ナトリウムポンプ阻害剤）及びベラトリジン（ナトリウムポンプ刺激因子）の組み合わせの効果を評価した。前者の細胞は、ＶＧＳＣを１０００倍超過剰発現するのに対し、後者の細胞は、ＶＧＳＣを１００倍過剰発現する（２４）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はＤＭＥＭで培養し、ＭＣＦ−７細胞はＤＭＥＭ＋１０μＭインスリンで培養した。遠心した後、両細胞株をＤＭＥＭ＋１０μＭインスリンに再懸濁して、Ｎａ^＋−Ｋ^＋−ＡＴＰａｓｅが正常に機能することを確実にし、１００μｌ容積のおよそ５０００個の細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。１８時間後、培地を吸引し、細胞を、１００μｌのＤＭＥＭ＋１０μＭインスリン（「培地」）のみ、培地＋１００ｎＭウアバイン、培地＋３０μＭベラトリジン、又は培地＋１００ｎＭウアバイン＋３０μＭベラトリジンで処理した。１時間後、１０μｌのアラマーブルーを各ウェルに添加し、この添加の４時間後に細胞生存率を決定した。決定は全て４重重複で取得し、実験は３回繰り返した。結果は、図１に示されている。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では、ウアバイン単独は、培地単独対照と比較して、細胞生存率の減少を生じさせなかった。ベラトリジン単独は、培地単独処理細胞と比較して、ＭＤＬ−ＭＢ−２３１細胞生存率を１５％低減させた（図１）。この初期実験では、ベラトリジン及びウアバインの併用は、細胞生存率を３０％低減させた。ＭＣＦ−７細胞では、この処理はいずれも細胞生存率に効果を及ぼさなかった（データ非表示）。画像の録画のため、この実験は、上記のように、３５ｍｍペトリ皿で繰り返した。

実施例５
（乳癌異種移植片のｉｎｖｉｖｏ標的浸透圧溶解）
癌のｉｎｖｉｖｏモデルとして、マトリゲルに懸濁した４百万個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、５匹のヌードマウス（Ｊ−ＮＵ）の背中に皮下注射した。各マウスには、０．７５〜１．２ｃｍの腫瘍が３〜５週間で発生した。マウスに、１０ｍｇ／ｋｇのウアバイン又は生理食塩水を皮下注射し、３０分後に４％イソフルランで麻酔をかけた。皮膚の小さな切開部からマウスの腫瘍を露出させた。陽極及び陰極を各腫瘍に挿入し、Ｇｒａｓｓ社製ＳＤ９刺激装置を使用して、１２０回の連続１ＶＤＣパルス（１０ミリ秒、１秒間当たり２回のパルスで１分間）を、銅製陽極及び陰極を介して送達した。幾つかの対照は刺激を受けなかった。合計１１個の腫瘍を試験した。３個の腫瘍は、１０ｍｇ／ｋｇの皮下投与ウアバインで処理され、電気的に刺激されたマウス（Ｏ−ＥＳ実験）に由来した。残りのうち、２個の腫瘍は、生理食塩水で処理され、電気的に刺激されなかったマウス（Ｓ−ＮＳ対照）に由来し、３個は、１０ｍｇ／ｋｇの皮下投与ウアバインで処理されたが、電気的に刺激されなかったマウス（Ｏ−ＮＳ対照）に由来し、３個は、生理食塩水で処理され、電気的に刺激されたマウス（Ｓ−ＥＳ対照）に由来した。電気刺激は、１５分後及び３０分後に繰り返した。１日後、マウスを、Ｎａ^＋−ペントバルビタールの過量投与で屠殺し、４％緩衝パラホルムアルデヒドで灌流し、腫瘍を摘出した。腫瘍を５μｍに切片化し、ヘマトキシリン及びエオジンで染色した。実験群（Ｏ−ＥＳ群）の３個の腫瘍のうち、１匹のマウスに由来する腫瘍は、処理後に８０％の細胞死を示した。しかしながら、同じマウスの腫瘍の基部から採取した正常筋肉は、細胞死の徴候を示さなかった（画像は未表示）。Ｏ−ＥＳ群の他の２匹のマウスは、高度には血管新生されていない腫瘍を有していたため、ウアバインは効果的に腫瘍細胞に分布することができなかった。結果的に、溶解は、これら２匹のマウスの腫瘍では見られなかった。３つの対照処理群の腫瘍は、いずれも細胞溶解の徴候を一切示さなかった。

この実験を、１０匹のマウスを使用して繰り返した（１対照群当たり２匹及び実験群では４匹）。５０％マトリゲルに懸濁した４００万個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、Ｊ／Ｎｕマウスに皮下注射し、明白に血管新生される（外観が赤みがかる）まで腫瘍を成長させた。刺激パラメータは、１０ＶＤＣ、２００パルス／秒で１ミリ秒のパルスであった。薬剤処理は、ここでも１０ｍｇ／ｋｇの皮下投与ウアバインであった。１日後、動物を屠殺し、灌流し、腫瘍を摘出し、ヘマトキシリン及びエオジン染色用に調製した。腫瘍の各々に由来する染色切片は、訓練された組織学者が評価した。試験的実験と同様に、対照はいずれも、溶解のいかなる徴候も示さなかった。１つの対照腫瘍は中心壊死を示した。これは急速に増殖している腫瘍に一般的である。ウアバイン及び電気刺激で処理された腫瘍の４つは全て、合計腫瘍容積の５０％〜８０％の細胞溶解面積を示した。

健康な非癌性細胞に対してＴＯＬ治療が影響を及ぼさないことを実証するために、Ｊ／Ｎｕマウスに１０ｍｇ／ｋｇのウアバインを皮下注射した。３０分後、筋肉、末梢神経、心臓、及び脳を、以前の実験のパラメータで電気的に刺激した。これらの組織を選択した理由は、ＶＧＳＣの通常の発現が最も高く、したがって、健康細胞の溶解に最も感受性であると予想されるためである。１日後、動物を、ペントバルビタールの過剰投与で屠殺し、ヘマトキシリン及びエオジン染色用に処理した。これら組織はいずれも、溶解の徴候を示さなかった。

実施例６
（単回ＴＯＬ治療後の腫瘍成長：）
治療後生存率に対する効果を実証するために、２０匹のＪ／Ｎｕマウスを、以前の試験と同様に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で処理した。腫瘍の血管新生が明白になったら、マウスを４処理群：生理食塩水−無刺激；生理食塩水−刺激（２×１分間の電気刺激）；ウアバイン（１０ｍｇ／ｋｇ）−無刺激；及びウアバイン（１０ｍｇ／ｋｇ）−刺激（２×１分間の電気刺激）に分割した。図２の０日目の各処理群に、一回のみの処理を施した。その後、腫瘍断面積を、ノギスを用いて３週間隔日で測定した。腫瘍成長を、処理前の大きさに対するパーセントとして表し、時間に対してプロットした。図２には、４群全ての結果が示されている。図２に示されているように、ウアバイン及び電気刺激で処理したマウスの腫瘍は、他の３群の腫瘍よりも７０％小さかった（ｐ＜０．０１）。

要約すると、本発明者らは、浸潤癌のｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏモデルの両方で、ＴＯＬの効力を実証した。本発明者らは、ＴＯＬの誘導には、癌細胞の電気的刺激及び薬学的刺激が両方ともが有用であることを示した。本発明者らは、４つの異なる組織タイプに由来する７つの細胞株で、ＴＯＬを実証した。正常組織と比較してナトリウムチャネル発現が１００倍増加しているだけで、ＴＯＬ治療に対する感受性を付与するのに十分であるが、溶解するまでの時間は、ナトリウムチャネル発現の度合いに反比例する。本発明者らは、比較的高濃度のナトリウムチャネルを正常に発現する正常な組織でさえ、ＴＯＬが、これらの組織に影響しないことをｉｎｖｉｖｏで実証した。最終的に、本発明者らは、ナトリウムポンプを遮断する任意の薬剤又は方法を使用して、ＴＯＬを誘導することができることを実証した。

参考文献

本明細書で引用された全ての参考文献の完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。優先権書類である米国特許仮出願第６１／５１０，２５８号の完全な開示も、参照により組み込まれる。

Claims

対象体の癌性腫瘍の大きさを減少させる方法であって、
（ａ）腫瘍細胞が、正常細胞と比較して、電圧依存性ナトリウムチャネルを過剰発現することを特定するステップ、
（ｂ）ナトリウム−カリウム−アデノシントリホスファターゼの活性又は発現を減少させる薬剤化合物を投与するステップ、及び
（ｃ）腫瘍を刺激して、前記電圧依存性ナトリウムチャネルの活性を増加させるステップを含み、
前記電圧依存性ナトリウムチャネルの刺激、及び前記ナトリウム−カリウム−アデノシントリホスファターゼの阻害が、前記腫瘍細胞の溶解を引き起こす方法。
前記対象体が動物である、請求項１に記載の方法。
前記対象体が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
前記対象体がヒトである、請求項１に記載の方法。
前記電圧依存性ナトリウムチャネルを過剰発現する癌性腫瘍が、乳癌、前立腺癌、肺小細胞癌、非小細胞肺癌、リンパ腫、中皮腫、神経芽腫、神経膠腫、神経腫、肝癌、卵巣癌、膀胱癌、膵臓癌、甲状腺癌、脾臓癌、胃癌、子宮頚癌、皮膚癌、精巣癌、腎癌、口腔癌、及び子宮頚癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記癌性腫瘍が乳癌である、請求項１に記載の方法。
前記癌性腫瘍が前立腺癌である、請求項１に記載の方法。
前記癌性腫瘍が結腸癌である、請求項１に記載の方法。
前記癌性腫瘍が肺小細胞癌である、請求項１に記載の方法。
前記癌性腫瘍が非肺小細胞癌である、請求項１に記載の方法。
前記ナトリウム−カリウム−アデノシントリホスファターゼの活性又は発現を阻害する薬剤化合物が、ジゴキシン、ジギトキシン、ジギタリス、ウアバイン、オレアンドリン、ジヒドロウアバイン、ウアバイン八水和物、ウアバゲニン、アセチルジギトキシン、アセチルジゴキシン、ラナトシドＣ、デスラノシド、メチルジゴキシン、ギトホルマート、オレアンドリゲニン、ブホトキシン、ブホタリン、マリノブファギン、パリトキシン；オリゴマイシン、ルタマイシン、ルタマイシンＢ、ストロファンチン、ｋ−β−ストロファンチン、ストロファンチジン、ｋ−ストロファントシド、シマリン、エリシモシド（カルデノリド）、ヘルベチコシド、ペルボシド、視床下部ナトリウム−カリウム−アデノシントリホスファターゼ阻害因子（ＨＩＦ）、ＨＩＦのアグリコン、アレノブファギン、シノブファギン、マリノブファギン、プロスシラリジン、シリロシド、及びダイグレモンチアニンからなる群から選択される１つ又は複数の薬剤化合物である、請求項１に記載の方法。
前記ナトリウム−カリウム−アデノシントリホスファターゼの活性又は発現を阻害する薬剤化合物がウアバインである、請求項１に記載の方法。
前記ナトリウム−カリウム−アデノシントリホスファターゼの活性又は発現を阻害する薬剤化合物がジギトキシンである、請求項１に記載の方法。
前記電圧依存性ナトリウムチャネルの刺激が、前記電圧依存性ナトリウムチャネルの活性を刺激する薬剤の投与である、請求項１に記載の方法。
前記刺激薬剤が、ベラトリジン、ベラセビン、アンチラトキシン（ＡＴＸ）、ＡＴＸＩＩ、バトラコトキシン、アコニチン、グラヤノトックス、グラヤノトキシンＩＩＩヘミ（酢酸エチル）、アンチラトキシン、ナイジェリシン、グラミシジン、α−ポンピリドトキシン、β−ポンピリドトキシン、ホイアミドＡ、ブレベトキシン（ＰｂＴｘ−２）、シグアトキシン、サソリ神経毒、シペルメトリン、アルファメトリン、及びパリトキシンからなる群から選択される１つ又は複数の薬剤である、請求項１４に記載の方法。
前記刺激薬剤がベラトリジンである、請求項１４に記載の方法。
前記電圧依存性ナトリウムチャネルの刺激が、前記腫瘍に流される電流である、請求項１に記載の方法。
前記電圧依存性ナトリウムチャネルの刺激が、前記腫瘍に加えられる超音波に由来する、請求項１に記載の方法。
前記電圧依存性ナトリウムチャネルの刺激が、前記腫瘍に加えられる磁場に由来する、請求項１に記載の方法。