JP2014517276A - 血小板感受性に関係する方法と組成物 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
アスピリン治療後の耐性血小板で減少するもの
1. 細胞質アクチン-1(SPAN P60709)
2. クラスリン重鎖1(SPAN Q00610)
3. 78kDaグルコース関係タンパク質(GRP-78)(熱ショックタンパク質A5)(SPAN P11021)
4. ピルビン酸キナーゼアイソザイムM1/M2(SPAN P14618)
5. RAB GDP解離インヒビターα(SPAN P31150)
アスピリン治療後の耐性血小板で増加するもの
6. インテグリンβ3(糖タンパク質IIIaおよびCD61としても知られる)(Swiss Prot受託番号(SPAN P05106);(SPAN P23219)。
前記抗血小板剤を用いて治療する患者から血小板を含有するサンプルを得るステップ;
血小板耐性に関連する1以上のマーカータンパク質の前記サンプル中のタンパク質発現レベルを決定するステップ;
前記タンパク質発現レベルを対応する参照レベルと比較するステップ;および
前記参照レベルと比較した前記1以上のマーカータンパク質の発現レベルの差異に基づいて抗血小板剤に対する血小板感受性を決定するステップ
を含むものである前記方法を提供する。
個人から得た血小板を含有するサンプルを抗血小板剤と接触させるステップ;
表3、表4、表5および表6から選択される血小板耐性に関連する1以上のマーカータンパク質のタンパク質発現レベルを決定するステップ;
前記タンパク質発現レベルを抗血小板剤を用いる治療前に前記サンプルから得た前記タンパク質レベルと比較するステップ;および
前記1以上のマーカータンパク質の発現の変化に基づいて抗血小板剤に対する血小板感受性を決定するステップ
を提供してもよい。
抗血小板剤を用いて治療中の個人から得た血小板を含有するサンプル中の表3、表4、表5および表6から選択される血小板耐性に関連する1以上のマーカータンパク質のタンパク質発現レベルを決定するステップ;
前記タンパク質発現レベルを同じ1以上のマーカータンパク質に対する1以上の参照発現レベルと比較するステップ;および
前記対応する参照レベルと比較した前記1以上のマーカータンパク質の発現レベルの変化に基づいて抗血小板剤に対する血小板感受性を決定するステップ
を含むものである前記方法を提供する。
インテグリンβ3アイソフォームA(IGB3A)AKWDTANNPLYKEATSTFTNITYR(配列番号1)もしくはAKWDTANNPLYKEATSTFTNITYRGT(配列番号2);
インテグリンβ3アイソフォームB(IGB3B)AKWDTVRDGAGRFLKSLV(配列番号3);および
インテグリンβ3アイソフォームC(IGB3C)AKWDTHYAQSLRKWNQPV(配列番号4)
から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードする配列を含む核酸分子とハイブリダイズできることが好ましい。
前記ペプチドレベルを、前記抗血小板剤に対して血小板耐性を表すことを予め確認したペプチドレベルと比較するステップ;および前記1以上のペプチドの発現の変化に基づいて抗血小板剤に対する血小板感受性を決定するステップを含むものである。前記比較ステップは既知量の対応する合成ペプチドを用いて治療した個人からのペプチドの量を決定するステップを含んでもよい。合成ペプチドは個人からのペプチドと配列が同一であるが、同重体タグまたは重同位体などの標識により識別することができる。
ミオシン LK*K*ANLQIDQINTDLNLER 配列番号5
EK*QLAAENR 配列番号6
DELADEIANSSGK*GALALEEK*R 配列番号7
INFDVNGYIVGANIETYLLEK*SR 配列番号8
タリン-1 ALEATTEHIR 配列番号9
DPPSWSVLAGHSR 配列番号10
VSEK*VSHVLAALQAGNR 配列番号11
LAQVAK*AVTQALNR 配列番号12
K*FFYSDQNVDSR 配列番号13
ビンキュリン EAEAASIK*IR 配列番号14
GILSGTSDLLLTFDEAEVR 配列番号15
SLGEISALTSK*LADLR 配列番号16
DPSASPGDAGEQAIR 配列番号17
ITGB3 K*LTSNLR 配列番号18
VLEDRPLSDK*THIALDGR 配列番号19
ITGB3A WDTANNPLYK 配列番号38
EATSTFTNITYR 配列番号39
DTANNPLYKEATSTFTNITYRGT 配列番号40
AK*WDTANNPLYK*EATSTFTNITYR 配列番号20
ITGB3B DTVRDGAGRFLKSLV 配列番号41
ITGB3C DTHYAQSLRKWNQPVSI 配列番号42
共用ITGB3 DASHLLVFTT 配列番号43
DGRLAGIVQPN 配列番号44
COX-1 VCDLLK*AEHPTWGDEQLFQTTR 配列番号21
VPDASQDDGPAVER 配列番号22
VPDASQDDGPAVERSTEL 配列番号23
WFWEFVNATFIR 配列番号24
LQPFNEYR 配列番号25
ピルビン酸キナーゼ
LDIDSPPITAR 配列番号26
LNFSHGTHEYHAETIK*NVR 配列番号27
GIFPVLCK*DPVQEAWAEDVDLR 配列番号28
TATESFASDPILYRPVAVALDTK*GPEIR 配列番号29
EAEAAIYHIQLFEELR 配列番号30
クラスリン LK*LLLPWLEAR 配列番号31
K*DPELWGSVLLESNPYR 配列番号32
NLQNLLILTAIK*ADR 配列番号33
RAB GDP K*FDLGQDVIDFTGHALALYR 配列番号34
YGK*SPYLYPLYGLGELPQGFAR 配列番号35
NPYYGGESSSITPLEELYK*R 配列番号36
K*QNDVFGEAEQ 配列番号37
[記号K*は同位体タグまたは同重体タグを保持する改変されたリシン残基を表す]から選択される。
ミオシン LK*K*ANLQIDQINTDLNLER 配列番号5
タリン-1 ALEATTEHIR 配列番号9
DPPSWSVLAGHSR 配列番号10
VSEK*VSHVLAALQAGNR 配列番号11
ビンキュリン EAEAASIK*IR 配列番号14
GILSGTSDLLLTFDEAEVR 配列番号15
ITGB3 K*LTSNLR 配列番号18
VLEDRPLSDK*THIALDGR 配列番号19
ITGB3A WDTANNPLYK 配列番号38
EATSTFTNITYR 配列番号39
DTANNPLYKEATSTFTNITYRGT 配列番号40
AK*WDTANNPLYK*EATSTFTNITYR 配列番号20
ITGB3B DTVRDGAGRFLKSLV 配列番号41
ITGB3C DTHYAQSLRKWNQPVSI 配列番号42
共用ITGB3 DASHLLVFTT 配列番号43
DGRLAGIVQPN 配列番号44
RAB GDP K*FDLGQDVIDFTGHALALYR 配列番号34
[記号K*は同位体タグまたは同重体タグを保持する改変されたリシン残基を表す]ならびに表2に見出されるそれらのそれぞれの遷移体のいずれかの1以上から選択される。
ITGB3 K*LTSNLR 配列番号18
VLEDRPLSDK*THIALDGR 配列番号19
ITGB3A WDTANNPLYK 配列番号38
EATSTFTNITYR 配列番号39
DTANNPLYKEATSTFTNITYRGT 配列番号40
AK*WDTANNPLYK*EATSTFTNITYR 配列番号20
ITGB3B DTVRDGAGRFLKSLV 配列番号41
ITGB3C DTHYAQSLRKWNQPVSI 配列番号42
共用ITGB3 DASHLLVFTT 配列番号 43
DGRLAGIVQPN 配列番号 44
[記号K*は同位体タグまたは同重体タグを保持する改変されたリシン残基を表す]から選択される1、2または3つである。
ミオシン LK*K*ANLQIDQINTDLNLER 配列番号5
タリン-1 ALEATTEHIR 配列番号9
DPPSWSVLAGHSR 配列番号10
VSEK*VSHVLAALQAGNR 配列番号11
ビンキュリン EAEAASIK*IR 配列番号14
GILSGTSDLLLTFDEAEVR 配列番号15
ITGB3 K*LTSNLR 配列番号18
VLEDRPLSDK*THIALDGR 配列番号19
AK*WDTANNPLYK*EATSTFTNITYR 配列番号20
RAB GDP K*FDLGQDVIDFTGHALALYR 配列番号34
から選択される合成ペプチドを含むものである。
ITGB3 K*LTSNLR 配列番号18
VLEDRPLSDK*THIALDGR 配列番号19
ITGB3A WDTANNPLYK 配列番号38
EATSTFTNITYR 配列番号39
DTANNPLYKEATSTFTNITYRGT 配列番号40
AK*WDTANNPLYK*EATSTFTNITYR 配列番号20
ITGB3B DTVRDGAGRFLKSLV 配列番号41
ITGB3C DTHYAQSLRKWNQPVSI 配列番号42
共用ITGB3 DASHLLVFTT 配列番号 43
DGRLAGIVQPN 配列番号 44
から選択される1、2または3つの合成ペプチドを含むものである。
(a)分析物質と結合できる結合剤がその上に固定された固体支持体;
(b)標識を含む現像剤;および
(c)洗浄液、希釈剤およびバッファーから成る群より選択される1以上の成分
を含むものである。
(a)抗血小板剤治療の短期コース(例えば、アスピリンなどの薬剤投与)を個人に施すステップ;
(b)抗血小板剤誘導フェーズの終わりに前記個人から得た血小板を含有するサンプル中のインテグリンβ、好ましくはインテグリンβ-3A、ピルビン酸キナーゼアイソザイムM1/M2、クラスリン重鎖、RAB GDP解離インヒビターα、プロスタグランジンG/Hシンターゼ1(COX1)、アクチン-1および熱ショックタンパク質A5から成る群より選択される1以上のマーカータンパク質のレベルを測定するステップ:
(c)個人の血小板サンプル中に検出される1以上の前記マーカータンパク質のレベルを抗血小板剤耐性を表すことが既知の参照発現レベルと比較するステップ;および
(d)血小板耐性の存在または非存在に応じて適当な抗血小板療法を選択するステップを含むものである前記方法を提供する。
用語「抗血小板剤」は血小板凝集を阻害する抗血小板剤または医薬品を含む。抗血小板剤はCOX-1経路のインヒビターまたはCOX-1酵素自体のインヒビターを含む。好ましい実施形態において、抗血小板剤はアスピリンである。
次に、本発明を実施する手段として行うことができる様々なアッセイを記載する。本発明は最も一般的には抗血小板剤に対する血小板感受性の決定に関するが、抗血小板剤がアスピリンである実施形態が好ましい。従って、単純化のために、以下の記載はアスピリンだけを参照している。しかし、他の抗血小板剤、とりわけ、アスピリンと同じまたは同等の作用機構を有する抗血小板剤をアスピリンの代わりに用いることができる。
アスピリン耐性に感受性のロバストでかつ信頼しうるマーカーの不足を解決するために、本発明者らはアスピリンの治療用量(毎日300mg)を1か月間、経口投与した後に、耐性および感受性が既知であるサンプル由来の血小板抽出物の比較プロテオーム研究を行った。
アスピリン治療後の耐性血小板中で減少するもの
1. 細胞質アクチン-1(SPAN P60709)
2. クラスリン重鎖1(SPAN Q00610)
3. 78kDaグルコース関係タンパク質(GRP-78)(熱ショックタンパク質A5(SPAN P11021)としても公知)
4. ピルビン酸キナーゼアイソザイムM1/M2(SPAN P14618)
5. RAB GDP解離インヒビターα(SPAN P31150)
[ここで、この発見結果は、本発明者らが観察したように、このタンパク質の複数の型、増加するいくつかのペプチド、例えばC-末端領域、および減少する他のペプチドが存在することを示す。これは、このタンパク質の翻訳後改変における変化がアスピリン耐性と連結しうることを示唆するのであろう]
アスピリン治療後の耐性血小板中で増加するもの
6. インテグリンβ3(Swiss Prot受託番号(SPAN P05106);(SPAN P23219)アイソフォームA。
アスピリン耐性の候補マーカーを立証するために、発見実験で調製したTMT標識したトリプシンペプチドの選択反応モニタリング(SRM)を用いる質量分析アッセイを開発した。質量分析においてSRMは最高負荷サイクルによる走査型であり、三連四重極(QQQ)質量分析計において高感度で1以上の特異的イオン遷移体のモニタリングに用いられる。ここで、Q1は特定の親イオン質量対電荷比(m/z)(Q1はスキャンされない)に設定され、選んだペプチド前駆体がQ2中に通過するようにする。Q2でペプチドは断片化され、SRM法のそれぞれのペプチドに対して、衝突エネルギーがその親イオンの最適な診断電荷断片(遷移体)を生じるように設定され、そして親イオンはQ3中に通過する。最後に、Q3が続いて、診断断片の特異的m/zに設定され、その結果、この正確な遷移体をもつイオンだけが検出されうる。歴史的に、薬物代謝物などの小分子を定量するために使われていて、同じ原理をペプチド、あるいは内因性部分またはタンパク質の酵素消化物から産生されるものに応用することができる。再び歴史的に、実験を三連四重極質量分析計を用いて行ったが、四重極をイオントラップと組み合わせする最近のハイブリッド計器設計の導入により類似したおよび改善された実験を行うことが可能である。現代的な設備、例えばABI 4000 QTRAP(ハイブリッドイオントラップ/四重極)およびTSQ Vantage(三連四重極質量分析計)では、多数の個々のSRMスキャンを1つの実験中に一緒にループさせて複雑な混合物中の多数の特異的イオン(100までの異なるイオン)の存在を検出することができるそれ故に、現在では1回のクロマトグラフィ分離で多数のタンパク質からの複数ペプチドを測定しかつ定量することが実行可能である。SRM LCピーク下の面積を用いて存在する分析物質の量を定量する。典型的な実験では、標準濃度曲線を目的の分析物質に対して作製する。未知サンプルを次いで同一条件下で試験し、未知サンプル中の分析物質の濃度をピーク面積と標準濃度曲線を用いて決定することができる。
アスピリン耐性被験者の決定
94名の健常な被験者から、2名の被験者を血小板凝集測定の測定値(アゴニストのアラキドン酸およびADP)および尿中の11-デヒドロTXB2を用いてアスピリン耐性と決定した。真アスピリン耐性被験者と規定するには、被験者が両方の基準について異常な応答を有しなければならない。被験者は毎日300gアスピリンを1か月間摂取した。
被験者から60mlの全血液を肘前静脈から蝶型(登録商標)19-ゲージニードルを用いて採取し、NaClクエン酸三ナトリウム(最終濃度0.38%)中に採集した。血液を遠心分離(10分間、210 x g、室温)し、血小板の濃厚な血漿(PRP)を作製し、これを新しく洗浄したセファロースTM CL-2Bゲルカラムに適用した。血小板をカラムからNa-Tyrode液(0.82% NaCl、0.022% KCl、0.022% KH2PO4、0.1% グルコース、0.052% HEPES(Na塩)、0.068% HEPES(酸)、0.008% MgCl2.H2O、0.38% クエン酸三ナトリウム)を用いて溶出し、ゲル濾過した血小板(GFP)を得た(Fine et al., 1976, Am J Pathol 84:11-24, 197)。GFPを次いで5ml体積に分割し、1660 xg、20分間、4℃にて遠心分離して血小板ペレットを得た。ペレットを100μl血小板溶解バッファー(0.88% NaCl、0.21% NaF、0.018% オルトバナジン酸Na、0.39% Tris塩基)に氷上で30分間溶解し、氷上でさらに5分間超音波処理した。溶解したサンプルを6500 xgにて1分間4℃で遠心分離し、エッペンドルフに移し、そして-80℃にてプロテオーム実験が必要とするまで貯蔵した。
血小板タンパク質濃度はBCA(ビシンコニン酸)による比色アッセイを用いて「ビウレット」反応に基づいて定量した(Smith et al., 1985, Circulation 99, 620-625)。この反応では、タンパク質をCu2+を含有するアルカリ溶液に加えると、Cu1+への還元が起こって着色複合体が形成される。この複合体は1分子のCu1+による2分子のBCAのキレート化により形成され、562nmにて強い吸収を示し、これがタンパク質濃度の増加と直線関係にある。1:1希釈の溶解液をddH2Oを用いて作り、このプロセスを各血小板サンプルに対して繰り返した。濃度0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6mg/mlのウシ血清アルブミン(BSA)をタンパク質標準として調製した。各BSA標準を同じ溶解バッファーに1:1で希釈し、血小板溶解液を作るのに用いた。ddH2Oブランクも、光吸収のバックグランドレベルに対する全ての吸収値を補正するために作った。次に、10μlの標準、ブランクまたは血小板溶解液(三重で)を96ウエルプレート中のウエルに加えた。BCA試薬A(BCA-Na2、2% Na2CO3.H2O、0.16% 酒石酸Na2、0.4% NaOH、および0.95% NaHCO3)と試薬B(ddH2O中の4% CuSO4.5H2O)を50:1の比で混合し、200μlをプレートの各ウエルに加え、30分間、37℃にてインキュベートした。各ウエルの吸収を、96-ウエルプレート分光光度計(Spectra Max 190)を用いて562nmで測定した。血小板溶解液中のタンパク質濃度を、吸収-対-標準BSA濃度の標準曲線から決定した。得た平均タンパク質血小板濃度は3.6μg/μlであった。
各被験者サンプル(アスピリン治療の前後)のアリコート(100μg)を、無処理タンパク質レベルでTMT六重体を用いて個々に標識した(図1)。全てのサンプルを製造業者プロトコルに従って標識した。2名のアスピリン耐性および4名のアスピリン感受性被験者(全部で12サンプル)から得たアスピリン治療前後のサンプルを選択して発見フェーズ実験を行った。TMT六重体による標識化については、12サンプルを2セット標識化した(表1)。発見フェーズ実験については、30μgアリコートの各標識サンプルをTMT六重体実験で組み合わせた。残りの70μgは別に保存して立証段階に備えた。
GeLC-MS/MSによる分析に先立って、30μgの各サンプルをTMT六重体実験で1:1:1:1:1:1で混合した。組み合わせたサンプルをGeLC-MS/MSにより分析し、全ゲルレーンを15セクションに切除した。各セクションを75μM C18 PepMap カラム上のRP-クロマトグラフィにより2時間LC勾配(1-40% ACN;0.05% FA、200nl/min)にわたって分離した。ペプチドをESIによりQ-Tof micro(Waters)に付属したZスプレー源を用いてイオン化した。データに応じて取得することにより、その強度に基づく前駆体イオンの選択が可能になり、CID断片化による配列決定を行った。衝突エネルギープロファイルをTMT標識したペプチドの分析用に最適化した。無処理タンパク質標識化とその後のトリプシン消化によりArg-Cペプチドを作製した。
TMT発見結果に基づく標的タンパク質/ペプチドの選択
候補タンパク質から発見研究で同定したペプチドがプロテオタイプでありかつロバストなSRM定量に好適な特徴を有すれば、すなわち、完全に加水分解され、既知の改変を含有せず(in vivoまたは実験での)かつQ3選択に好適なMS/MS断片を有すれば、それを採りあげた。1つのタンパク質当たり6つ迄のペプチド(表2)を選択して標的化定量を行った。
TMT標識した被験者サンプル(70/90μg、チェック)を還元し、アルキル化し、溶液で消化し、そしてRPおよびSCXクロマトグラフィにより精製した。SRM分析の前に、個々の被験者サンプルをRP-クロマトグラフィにより、9分間、ACN勾配(5〜30%)、0.2%蟻酸中、100μl/min(カラム上の全タンパク質負荷20μg)の条件で分離した。洗浄およびカラム平衡化時間を含む本方法の全試験時間は30分であった。SRMをPinpointTM ソフトウエアを介して可視化し、全てのピークを可視的に立証した。ピーク面積をMicrosoft ExcelTMに出力した。遷移体を合計してそれぞれのペプチドに対する全遷移体の総強度を得た。各アスピリン前サンプルに対するSRMピーク面積を各アスピリン後サンプルに対するSRMピーク面積と相対的に測定した。規準化はハウスキーピングタンパク質、タリンおよびビンキュリンとの比較により達成した。次いでITGB3(タンパク質の特定のアイソフォームを表すペプチドは別の測定値と考えられる)を除いて、特別なタンパク質に関係する全ペプチドの比を平均化した。最後に、アスピリン治療後:前の比をアスピリン耐性と感受性被験者の間で比較した。
被験者から得た血小板溶解液(各10μg)を等体積のLaemmliサンプルバッファー(2x)(125mM Tris塩基、4%SDS、20%グリセリン、4%β-メルカプトエタノール、0.04%ブロモフェノールブルー)と混合し、続いて12.5% SDS-PAGEゲルに負荷した。タンパク質をPVDF膜に移し、特異的抗体を用いて次の通り検出した。対のブロットを、抗-GP111a C-末端特異的抗体(Santa Cruz Biotechnology, Item code sc-6626, C-20)または抗GP111a N-末端特異的抗体(Santa Cruz Biotechnology, Item code sc-6627, N-20)とそれぞれインキュベートした。バンドをスキャンし、濃度測定分析をImage J システム(the National Institutes of Health, Bethesda, USAが開発してJava系の画像処理プログラム)を用いて実施した。
インテグリンβ3およびその3つの既知アイソフォームを測定するさらに目的に適った方法を得るために、本発明者らは選択反応モニタリング(SRM)質量分析アッセイを開発した。インテグリンβ3の全てのアイソフォームに見出される共有領域を表すが、その他はヒトプロテオーム内で一意的である特異的ペプチド(DASHLLVFTT(配列番号43)およびDGRLAGIVQPN(配列番号44))を、総インテグリンβ3レベルを測定するために選択した。配列番号40、41および42に対応する3つの追加のペプチドを用いてA、BおよびC型それぞれに対するアイソタイプ特異的な定量を得た。
50mlの全血液を被験者より、肘前静脈から蝶型(登録商標)19-ゲージニードルを用いてクエン酸三ナトリウム(最終濃度0.32%)中に採取した。血液を遠心分離(20分間、200 x g、室温)して血小板の濃厚な血漿(PRP)を得て、これに0.3Mクエン酸(目標値pH 6.5)を加えて酸性にした。さらに遠心分離(15分間、1200xg、室温)して血小板ペレットを作り、これを直ぐにクエン酸洗浄バッファー(組成については付表1を参照されたい)に再懸濁し、プロスタグランジンE1(Sigma)を最終濃度10nMまで加えた。残留赤血球および単球の除去をさらなる遠心分離(3分間、200xg、室温)にて行い、血小板の濃厚な上清をデカントして得た。最終の遠心分離(15分間、1200xg、室温)は洗浄した血小板ペレットを生じ、これを-80℃にて貯蔵した。
洗浄した血小板ペレットを、プロテアーゼインヒビターカクテル(Sigma Aldrich, UK)を含有する溶解バッファー[NaCl 150mM、Tris塩基32mM、NaF 50mM、オルトバナジン酸Na 1mM、これに1mlエチレンジアミン四酢酸(EDTA;0.1Mストック溶液)および1ml Triton-X 100を加えた後、濃HCLでpH 7.6におよび体積100mlに調節した]に再懸濁し、30分間氷上に置いた後、氷上でさらに5分間撹拌した。サンプルを遠心分離(5分間、9000xg、4℃)して細胞のデブリスを除去した。この上清を-80℃にて貯蔵した。
ビシンコニン酸アッセイ(BCA)を96ウエルプレートの分光光度計(SpectraMAX 190、Molecular Devices)用に三重で準備した。濃度10、8、6、4、2、1および0.5mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)標準を連続希釈して調製した。BCA試薬AおよびB(Pierce)を50:1希釈で調製し、200μlを各ウエルに加えた。10μLのBSA標準または血小板溶解液をこれらの指定したウエルに加えた。溶解液を含有するウエルが対照を与えた。調製したプレートを次いでインキュベートし(30分間、37℃)、そして光吸収を562nmにて測定した。標準曲線をBSA標準を用いてプロットし、血小板溶解液内のタンパク質の濃度を標準化グラフから計算した。健常な被験者から得た血小板溶解液のタンパク質濃度は21.4+/-5.96ug/uLであった。
二次予防のためにアスピリンを処方された個人におけるアスピリン感受性を、機能性と生化学アッセイの組み合わせを用いて試験した。虚血性心臓病集団において、光透過率凝集測定をある範囲のアゴニストに応答するPRPについて実施し、機能的血小板活性を評価した。アスピリン療法の結果として血小板活性化の予想される阻害を示さない個人は機能的にアスピリン耐性であるとみなした。ELISAを全血液について実施し、トロンボキサンA2レベルを測定した。トロンボキサンA2レベルを抑制できない個人は生化学的にアスピリン耐性であるとみなした。
血小板サンプル(100μgまで)をLaemmli(2×濃縮サンプル)バッファーに1:1で希釈し、スタッキングゲル中に仕込んで全サンプルを1つのバンドに濃縮した。
SRMをPinpoint(ThermoFisher)を介して可視化し、全てのピーク整合を可視的に立証した。ピーク面積をMicrosoft Excelに出力した。遷移体を合計してそれぞれのペプチドに対する全遷移体の合計強度を得た。内因性ペプチドの合計量(明の網掛けバー)を、100fmolスパイクした重ペプチドに対する相対的ピーク面積に基づいて計算した。アスピリンによる治療前後のサンプルを利用し得た個人については、前後の比を計算してペプチドレベルの変化を評価した。アスピリン治療前後の比をアスピリン耐性と感受性被験者の間で比較した。健常な正常コホートについて、アスピリン前後のサンプルは利用できなかったので、合計タンパク質1μg当たりの基礎pgで測定されたペプチドレベルを報じた。
バッファーマトリックス中の全ペプチドは、低fmol領域で検出限界(LOD)および定量化限界(LOQ)で良い直線性を示した(図11)。次いでこれらの外部標準曲線を用いて血小板タンパク質抽出物中のインテグリンβ3(合計および各アイソタイプ)の量を定量した。予備的な用量発見研究において10μgの合計タンパク質負荷は外部標準曲線の中範囲内にインテグリンβ3レベルを与えることを見出した。プールした参照サンプルにおいて、合計インテグリンβ3の濃度は25pg/μg血小板タンパク質と計算され、アイソフォームAについてはこのレベルは55pg/μg血小板タンパク質と同等であった。合計インテグリンβ3レベルとアイソフォームAとの間の隔絶は標的タンパク質内の様々な部位における消化効率の差異を反映しうる。合計インテグリンβ3とアイソフォームの測定値に対する全体的な精度と再現性は良く、両方のアッセイについてCVは10%未満である。血小板サンプル中のアイソフォームBおよびCに対する内因性ペプチドを検出することはできなかった。アイソフォームBペプチド(配列番号41)については、これは除去できなかった有意なマトリックス妨害効果に因るものであった。アイソフォームCについては、これは、弱いシグナルは検出可能であるが、定量限界未満である内因性レベルによると思われる。
血小板中のインテグリンβ3のアイソタイプを決定する質量分析法の開発に加えて、本発明者らはまたアスピリン治療に応答してその発現が変わることが示された6つのバイオマーカーを測定する補完的な方法を開発した。6つのマーカーはインテグリンβ3(合計)およびインテグリンβ3アイソフォームA、熱ショックタンパク質A5、ピルビン酸キナーゼアイソザイムM1/M2、RAB GDP1αおよびプロスタグランジンG/Hシンターゼである。各マーカーに対して2つもしくは3つのプロテオタイプのトリプシンペプチドを選択し、重同位体標準合成ペプチドを商業供給者(Thermo Scientific, Belgium)から購入した。
実施例3から得た血小板調製物をアスピリン耐性の6つのバイオマーカーを同時測定するSRM法にも用いた。
血小板アスピリン耐性アッセイバージョン2.0を用いる分析の前に、サンプルを5fmol/μLのその方法の各重AQUAペプチド(表2参照)および200μg/mLグルカゴンを含有する溶液に再懸濁した。SRMの前にサンプルをRP-クロマトグラフィにより9分間にわたり0.2%蟻酸中のACN勾配(5〜30%)で100μl/minにて分離した。血小板アスピリン耐性アッセイバージョン2は、5つのタンパク質からの17種のペプチドを網羅する96種のSRM遷移体を含有する。SRMサイクルタイムは2秒であり、各SRM遷移体に与えられたスキャン時間を最大化するために使われる保持時間ウインドウを伴った。SRM遷移体を表6(図10)に掲げた。洗浄および平衡化する時間を含むこの方法の全試験時間は30分間であった。
バッファーマトリックス中の全てのペプチドは、低fmol領域で検出限界(LOD)および定量化限界(LOQ)で良い直線性を示した(図13)。次いでこれらの外部標準曲線を用いて血小板タンパク質抽出物中の6つのバイオマーカーの量を定量した。予備的な用量発見研究において20μgの合計タンパク質負荷はRAB GDP1αを除く全てのタンパク質に対する外部標準曲線の中範囲内に、レベルを与えることを見出した。合計タンパク質量を増加する試験はまた、このアッセイの全てのペプチドの測定において直線応答を示し、いずれのペプチドについてもマトリックス干渉はなかった。
ここに提示した結果は、アスピリン治療前後のタンパク質発現変化のモニタリングによりアスピリン耐性を決定するための、選択したバイオマーカー候補の発見と立証を示すものである。TMT技術を適用すると、発見と評価の両方の段階に同じサンプルセットを用いることが可能であった。サンプルを無処置のタンパク質レベルで標識して、ペプチドレベルで標識する場合のサンプルプロセシングおよび消化の結果としてしばしば見られる技術的変動を低減した。
Claims (59)
- 表3、表4、表5または表6に記載の1以上のタンパク質もしくはそれらの断片または前記1以上のタンパク質に対する抗体の存在もしくは量の、抗血小板剤に対する血小板耐性のマーカーとしての使用であって、前記1以上のタンパク質がインテグリンβ3を含むものである前記使用。
- 表3、表4、表5または表6に記載の1以上のタンパク質もしくはそれらの断片をコードする核酸の存在もしくは量の、抗血小板剤に対する血小板耐性のマーカーとしての使用であって、前記1以上のタンパク質がインテグリンβ3を含むものである前記使用。
- 前記1以上のタンパク質がインテグリンβ3アイソフォームA、細胞質アクチン-1;クラスリン重鎖1;78kDaグルコース関係タンパク質(GRP-78);ピルビン酸キナーゼアイソザイムM1/M2;およびRAB GDP解離インヒビターα、またはそれらの断片から成る群より選択される少なくとも1つを含むものである、請求項1または請求項2に記載の使用。
- 前記1以上ののタンパク質がインテグリンβ3アイソフォームA、またはそれらの断片を含むものである、請求項3に記載の使用。
- 前記それらの断片がインテグリンβ3アイソフォームAのC-末端を含むものである、請求項4に記載の使用。
- 前記1以上のタンパク質が細胞質アクチン-1;クラスリン重鎖1;78kDaグルコース関係タンパク質(GRP-78);ピルビン酸キナーゼアイソザイムM1/M2;およびRAB GDP解離インヒビターα;およびインテグリンβ3アイソフォームA、またはそれらの断片を含むものである、請求項3に記載の使用。
- 前記抗血小板剤がアスピリンである、先行する請求項のいずれか1つに記載の使用。
- 生体サンプル中の表3、表4、表5または表6に記載の1以上のマーカータンパク質の存在、発現の増加もしくは減少を定量するために用いる結合剤。
- 前記結合剤が抗体である、請求項8に記載の結合剤。
- 前記結合剤が核酸分子である、請求項8に記載の結合剤。
- 前記結合剤がペプチドである、請求項8に記載の結合剤。
- 前記1以上のタンパク質が少なくとも細胞質アクチン-1;クラスリン重鎖1;78kDaグルコース関係タンパク質(GRP-78);ピルビン酸キナーゼアイソザイムM1/M2;およびRAB GDP解離インヒビターα;およびインテグリンβ3アイソフォームA、またはそれらの断片を含むものである、請求項8〜11のいずれか1項に記載の結合剤。
- 前記1以上のタンパク質がインテグリンβ3アイソフォームAまたはその断片を含むものである、請求項12に記載の結合剤。
- 前記それらの断片がインテグリンβ3アイソフォームAのC-末端配列を含むものである、請求項13に記載の結合剤。
- 前記1以上のタンパク質が細胞質アクチン-1;クラスリン重鎖1;78kDaグルコース関係タンパク質(GRP-78);ピルビン酸キナーゼアイソザイムM1/M2;およびRAB GDP解離インヒビターα;およびインテグリンβ3アイソフォームA、またはそれらの断片を含むものである、請求項12に記載の結合剤。
- アミノ酸配列AKWDTANNPLYKEATSTFTNITYR、またはAKWDTANNPLYKEATSTFTNITYRをコードする核酸配列を含む核酸分子と特異的に結合することができる、請求項14に記載の結合剤。
- 固体支持体に固定された、請求項8〜16のいずれか1項に記載の結合剤。
- さらに標識を含むものである、請求項8〜17のいずれか1項に記載の結合剤。
- 抗血小板剤に対する血小板感受性を決定する方法であって、
血小板を含有するサンプルを前記抗血小板剤で治療中の個人から得るステップ;
表3、表4、表5および表6から選択される血小板耐性に関連する1以上のマーカータンパク質のタンパク質発現レベルを定量するステップ;
前記タンパク質発現レベルを1以上の参照発現レベルと比較するステップ;および
前記1以上のマーカータンパク質の発現の差異に基づいて、抗血小板剤に対する血小板感受性を決定するステップ
を含むものである前記方法。 - 抗血小板剤に対する血小板感受性を決定する方法であって、
個人から得た血小板を含有するサンプルを抗血小板剤と接触させるステップ;
表3、表4、表5および表6から選択される血小板耐性に関連する1以上のマーカータンパク質のタンパク質発現レベルを定量するステップ;
前記タンパク質発現レベルを1以上の参照発現レベルと比較するステップ;および
1以上の参照発現レベルと比較した1以上のマーカータンパク質の発現の差異に基づいて抗血小板剤に対する血小板感受性を決定するステップ
を含むものである前記方法。 - 抗血小板剤に対する血小板感受性を決定する方法であって、
予め抗血小板剤を投与した個人から得たサンプル中の表3、表4、表5または表6から選択される血小板耐性に関連する1以上のタンパク質発現レベルを定量するステップ;
前記タンパク質発現レベルを1以上の参照発現レベルと比較するステップ;および
1以上の参照発現レベルと比較した前記1以上のマーカータンパク質の発現の差異に基づいて抗血小板剤に対する血小板感受性を決定するステップ
を含むものである前記方法。 - 前記1以上のタンパク質が細胞質アクチン-1;クラスリン重鎖1;78kDaグルコース関係タンパク質(GRP-78);ピルビン酸キナーゼアイソザイムM1/M2;およびRAB GDP解離インヒビターα;およびインテグリンβ3アイソフォームA、またはそれらの断片を含むものである、請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1以上の参照発現レベルは前記個人から得たものであって、前記抗血小板剤による治療前に得たサンプルについてである、請求項19〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1以上の参照発現レベルは抗血小板剤耐性または抗血小板剤感受性を表す他の個人および/またはin vitro研究からの複数のサンプルからの予めマーカータンパク質について定量した平均発現レベルである、請求項19〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1以上のタンパク質がインテグリンβ3アイソフォームA、またはその断片を含むものである、請求項19〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記その断片はインテグリンβ3アイソフォームAのC-末端配列を含むものである、請求項25に記載の方法。
- 前記1以上のタンパク質は細胞質アクチン-1;クラスリン重鎖1;78kDaグルコース関係タンパク質(GRP-78);ピルビン酸キナーゼアイソザイムM1/M2;およびRAB GDP解離インヒビターα;およびインテグリンβ3アイソフォームA、またはそれらの断片を含むものである、請求項19〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 抗血小板剤がアスピリンである、請求項19〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 抗血小板剤に対する血小板感受性を決定する方法であって、
(a)個人から得た血小板を含有するサンプルを、1以上のマーカータンパク質、前記マーカータンパク質に対する抗体または前記マーカータンパク質をコードする核酸分子と、前記タンパク質、抗体または核酸分子が結合剤と結合する条件下で特異的に結合しうる結合部位を有する結合剤と接触させるステップ;および
(b)結合剤と結合したタンパク質抗体または核酸の存在または量を決定するステップ;
を含むものである、前記1以上のマーカータンパク質が表3、表4、表5および表6から選択される前記方法。 - ステップ(b)が
(i)固体支持体を、占有結合部位、非占有の結合部位またはタンパク質、抗体または核酸と結合しうる現像剤と接触させるステップであって、前記現像剤が標識を含むステップ、および
(ii)前記標識を検出してサンプル中のタンパク質、抗体または核酸の存在または量を表す値を得るステップ
を含むものである、請求項29に記載の方法。 - 前記結合剤を固体支持体上に固定する、請求項29または請求項30に記載の方法。
- 前記1以上のマーカータンパク質は細胞質アクチン-1;クラスリン重鎖1;78kDaグルコース関係タンパク質(GRP-78);ピルビン酸キナーゼアイソザイムM1/M2;およびRAB GDP解離インヒビターα;およびインテグリンβ3アイソフォームA、またはそれらの断片から成る群より選択される少なくとも1つを含むものである、請求項29〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1以上のタンパク質がインテグリンβ3アイソフォームA、またはその断片を含むものである、請求項32に記載の方法。
- 前記その断片がインテグリンβ3アイソフォームAのC-末端配列を含むものである、請求項33に記載の方法。
- 前記1以上のタンパク質が細胞質アクチン-1;クラスリン重鎖1;78kDaグルコース関係タンパク質(GRP-78);ピルビン酸キナーゼアイソザイムM1/M2;およびRAB GDP解離インヒビターα;およびインテグリンβ3アイソフォームA、またはそれらの断片を含むものである、請求項32に記載の方法。
- 前記結合剤がアミノ酸配列AKWDTANNPLYKEATSTFTNITYRとまたはアミノ酸配列AKWDTANNPLYKEATSTFTNITYRをコードする核酸配列を含む核酸分子と特異的に結合しうる、請求項29〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記個人が前記抗血小板剤で治療中である、請求項29〜36のいずれか1項に記載の方法。
- 抗血小板剤に対する血小板感受性のプロテオーム分析に利用できるマーカータンパク質を決定する方法であって、
(a)前記抗血小板剤に耐性であることが既知の血小板を含有する第1のサンプルを得るステップ;
(b)前記抗血小板剤に感受性であることが既知の血小板を含有する第2のサンプルを得るステップ;
(c)第1と第2の血小板サンプルにおいて発現されるタンパク質のレベルを比較するステップ;および
(d)どのタンパク質が耐性血小板において差別的に発現されるかを定量するステップ
を含むものである前記方法。 - さらに差別的に発現されるタンパク質を同定するための結合剤を作製するステップを含むものである、請求項38に記載の方法。
- 前記結合剤がペプチド、抗体または核酸分子である、請求項39に記載の方法。
- 前記抗血小板剤がアスピリンである、請求項38または請求項39に記載の方法。
- 個人の抗血小板剤に対する血小板感受性を決定するために用いるキットであって、
(a)その上に固定された、分析物質と結合することができる結合剤を有する固体支持体;
(b)標識を含む現像剤;ならびに
(c)洗浄液、希釈剤およびバッファーから成る群より選択される1以上の成分
を含むものであり;
前記分析物質が表3、表4、表5および表6に記載の1以上のマーカータンパク質またはそれらの断片、前記1以上のマーカータンパク質またはそれらの断片に対する1以上の抗体、および前記マーカータンパク質またはそれらの断片をコードする核酸分子から選択される前記キット。 - 前記1以上のマーカータンパク質が細胞質アクチン-1;クラスリン重鎖1;78kDaグルコース関係タンパク質(GRP-78)(熱ショックタンパク質A5としても知られる);ピルビン酸キナーゼアイソザイムM1/M2;およびRAB GDP解離インヒビターα;およびインテグリンβ3アイソフォームA、またはそれらの断片から選択される少なくとも1つを含むものである、請求項42に記載のキット。
- 抗血小板剤に対する血小板感受性を決定する方法であって、
(a)個人から血小板サンプルを得るステップ;
(b)前記タンパク質を消化してペプチドの集団を作製するステップ;
(c)表2に掲げた1以上の遷移体の選択反応モニタリングを用いて配列番号5〜34に対応する前記ペプチドの1以上の存在量を定量するステップ;
(d)前記1以上のペプチドの存在量を予め定量した抗血小板耐性に関係するペプチド存在量と比較するステップ;および
(e)前記1以上の存在量の差異に基づいて血小板感受性を決定するステップ
を含むものである前記方法。 - 予め定量したペプチド存在量を、表2から選択される対応する合成ペプチドの既知量を用いて定量する、請求項44に記載の方法。
- 予め定量したペプチド存在量を、抗血小板治療後の前記個人から得たペプチド集団を用いて定量する、請求項44に記載の方法。
- 配列番号5〜34から成る群より選択される1以上の合成ペプチドを含む抗血小板感受性を決定するための調製物。
- 前記1以上の合成ペプチドが
ミオシン LK*K*ANLQIDQINTDLNLER 配列番号5
タリン-1 ALEATTEHIR 配列番号9
DPPSWSVLAGHSR 配列番号10
VSEK*VSHVLAALQAGNR 配列番号11
ビンキュリン EAEAASIK*IR 配列番号14
GILSGTSDLLLTFDEAEVR 配列番号15
ITGB3 K*LTSNLR 配列番号18
VLEDRPLSDK*THIALDGR 配列番号19
AK*WDTANNPLYK*EATSTFTNITYR 配列番号20
RAB GDP K*FDLGQDVIDFTGHALALYR 配列番号34
から選択される、請求項44に記載の調製物。 - 前記1以上の合成ペプチドが
ITGB3 K*LTSNLR 配列番号18
VLEDRPLSDK*THIALDGR 配列番号19
AK*WDTANNPLYK*EATSTFTNITYR 配列番号20
から選択される、請求項45に記載の調製物。 - それぞれのペプチドが水素、炭素、酸素、窒素または硫黄から選択される1以上の安定な重同位体を含有する、請求項44〜46のいずれか1項に記載の調製物。
- 前記合成ペプチドが同重体タグで標識されている、請求項44〜46に記載の調製物。
- 抗血小板剤に対する耐性のリスクを評価するための、請求項44〜48のいずれか1項に記載の調製物。
- 抗血小板剤がアスピリンである、請求項49に記載の調製物。
- 個人におけるアスピリンに対する血小板耐性のリスクを評価する方法であって、ITGB3アイソフォームA、Bおよび/またはCの血小板サンプル中の発現プロファイルを決定するステップを含むものである前記方法。
- 表2に掲げた遷移体の1以上を用いる選択反応モニタリングにおいて配列番号18、19および/または20を用いる、請求項51に記載の方法。
- 抗血小板剤による治療を受ける個人において心血管の疾患または脳血管の疾患をモニタリングする方法であって、ITGB3アイソフォームA、Bおよび/またはCの血小板サンプルにおける発現プロファイルを決定するステップを含むものである前記方法。
- 表2に掲げた遷移体の1以上を用いる選択反応モニタリングアッセイに配列番号18、19または20を用いる、請求項52に記載の方法。
- 心血管の疾患が虚血性の心臓病である、請求項53または請求項54に記載の方法。
- 脳血管の疾患が一過性虚血性の発作または虚血性の脳卒中である、請求項53に記載の方法。
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