JP2014516963A - Ｇタンパク質共役レセプターを結晶化するための新規融合パートナー - Google Patents

Abstract

Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＣＰＲｓ）と、融合パートナーとを含むＧＰＣＲ融合パートナータンパク質が説明される。前記融合パートナーは、前記ＧＰＣＲの第５ヘリックス及び第６ヘリックスの間の第３細胞内ループの一部又は全部を置換するか、あるいは、Ｎ末端又はＣ末端に結合される、ルブレドキシン、シトクロムｂ５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ、ｂＲＩＬ＋、ＢＲＩＬ）、Ｔ４リゾチームのＣ末端断片（Ｃ末端−Ｔ４Ｌ）、フラボドキシン又はキシリナーゼのような融合パートナーである。結晶状態のＧＰＣＲ融合パートナータンパク質、任意的には該ＧＰＣＲのＸ線結晶学的構造決定に適する品質の結晶状態のＧＰＣＲ融合パートナータンパク質が説明される。前記ＧＰＣＲのＸ線結晶学的構造決定用にＧＰＣＲ融合パートナータンパク質の結晶化を補助するために、ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質をに融合パートナーを使用する方法が説明される。タンパク質データバンクのスクリーニングを通じて他の適当な融合パートナーを同定する方法も説明される。

Description

関連出願の説明

本件出願は、２０１１年５月１３日出願の米国仮出願６１／４８５，８７２号と、２０１２年３月３０日出願の米国仮出願６１／６１８，４２４号とを基礎とする優先権を主張し、前記出願のそれぞれは引用によってその全体が本明細書に取り込まれる。

本発明は、Ｇタンパク質共役レセプター（以下、「ＧＰＣＲｓ」という。）の細胞内ドメインの一部が置換され、あるいは、ＧＰＣＲｓのＮ末端又はＣ末端に連結される、融合パートナーを有するＧＰＣＲｓを含む融合パートナータンパク質であって、該融合パートナータンパク質は前記ＧＰＣＲｓの構造決定を支える回折品質の結晶形成に適する、融合パートナータンパク質に関する。

連邦政府によって支援された研究及び開発に関する声明
合衆国政府は、国立衛生研究所、国立一般医科学研究所（ＮＩＨ ＮＩＧＭＳ）によって付与されたグラントＮｏ．Ｐ５０ＧＭ０７３１９７に従い、本発明に関する権利の一部を有する。

Ｇタンパク質共役レセプターは、さまざまな構造的及び機能的特性を共有する膜結合タンパク質の広範なクラスを含む（非特許文献１及び２）。ＧＰＣＲｓは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦという６種類のクラスの１つに分類される（非特許文献１及び２を参照せよ。）。ＧＰＣＲｓは、７個の膜貫通ヘリックス領域と、内在性リガンドと結合する１個の細胞外部分とを含む。この細胞外リガンド結合ドメインは、ＧＰＣＲ機能を変調させる医薬製剤の標的部位である頻度が高い。

タンパク質の結晶化は、活性部位又はリガンド結合部位のような前記タンパク質の正確な３次元構造を作成するための高分解能構造解析を可能にする結晶構造を得るために行われ、かかる構造的な情報は、次には前記タンパク質の機能及び挙動を予測するために利用される場合がある。結晶化と、Ｘ線結晶学による構造決定とには、高度に精製され濃縮されたレセプターから着実に成長でき、結晶化スクリーン中で安定な、回折性の高い結晶が必要である。ＧＰＣＲｓは精製用の界面活性剤ミセル内で不安定なことがしばしばあり、結晶接触の形成に利用できるのに十分なタンパク質表面積が足りない場合があるので、ＧＰＣＲｓは未改変状態では結晶化が困難である。

タンパク質への融合パートナーの取り込みは、未改変状態で結晶化が困難なタンパク質の結晶化を補助するために使われてきた（非特許文献３、４及び５）。

Ｔ４リゾチーム（以下、「Ｔ４Ｌ」という。）は、所望の生化学的、薬理学的及び構造的特性を保持して結晶化可能なＧＰＣＲ融合タンパク質に融合パートナーとして利用されてきた。Ｔ４Ｌは、β２−アドレナリン作動性レセプター（β２ＡＲ）と、Ａ２Ａ−アデノシンレセプター（Ａ_２Ａ）との利用可能な細胞内ループ内に、レセプター安定性及び結晶化の補助のために融合パートナーとして取り込まれて、できたＧＰＣＲ融合タンパク質の構造決定という結果につながった。Ｔ４Ｌの取り込みは、これら２種類のレセプターの発現、精製及び結晶化を有意に改善することがわかった（特許文献１及び２、非特許文献６、７及び８）。β２ＡＲ（拡散可能なホルモン及び神経伝達物質に応答するＧＰＣＲｓの広範に研究されたプロトタイプ）の構造的柔軟性を克服し、結晶化を促進するために、Ｔ４Ｌが前記ＧＰＣＲの第３細胞内ループの大半を置換するようにβ２ＡＲ融合タンパク質が改変され、ほぼ本来の薬理学的特性を保持しつつ、高分解能構造解析用に結晶化できたβ２ＡＲ−Ｔ４Ｌが得られた。部分的逆作動薬のカラゾロールと結合したヒトβ２ＡＲ−Ｔ４Ｌの分解能２．４オングストロームの結晶構造が決定され、この構造が拡散可能なリガンドと結合したヒトＧタンパク質共役レセプターの高分解能像を提供した。該高分解能像は、リガンド結合部位へのアクセスは第２細胞外ループによって可能になり、第２細胞外ループは、狭いスペースを隔てた１対のジスルフィド架橋と、前記ループ内の短いヘリックスセグメントとによって、結合窩洞（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｖｉｔｙ）から突出する（ヒト６）。β２ＡＲ−Ｔ４Ｌの報告された高分解能構造の文脈の範囲内のアドレナリン作動性レセプターリガンド結合突然変異体の解析は、逆作動薬結合と、カテコールアミン作動薬に対応するために必要な構造的変化とについての洞察を提供する（非特許文献７）。

米国特許第７，７９０，９５０号明細書 国際公開第２００９／０５５５０９ Ａ２号パンフレット

Friedrickssonら、Mol. Pharmacol. 63(6): 1256-1272, (2003) Friedrickssonら、 Mol. Pharmacol. 67(5): 1414-1425, (2005) Engelら、"Insertion of carrier proteins into hydrophilic loops of the Escherichia coli lactose permease," Biochemica et Biophysica Acta 1564:38-46 (2002) Prive、"Fusion proteins as Tools for Crystallization: the Lactose Permease from Escherichia coli," Acta Cryst., D50:375-379 (1994) Priveら、 "Engineering the Lac Permease for Purification and Crystallization," Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 28(1):29-34 (1996) Cherezov, V., Rosenbaum, D.M., Hanson, M.A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T.S., Choi, H.J., Kuhn, P., Weis, W.I., Kobilka, B.K., and Stevens, R.C., "High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor," Science 318: 1258-1265, (2007) Rosenbaum, D.M., Cherezov, V., Hanson, M.A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T.S., Choi, H.J., Yao, X.J., Weis, W.I., Stevens, R.C., and Kobilka, B.K., "GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2-adre accommodate nergic receptor function," Science 318: 1266-1273, (2007) Jaakola, E.Pら、"The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor bound to an antagonist," Science 322:1211-1217, (2008)

一部の実施態様では本発明は、ＧＰＣＲｓと、ルブレドキシン、チトクロム_ｂ５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ、ｂＲＩＬ、ＢＲＩＬ）、Ｔ４リゾチームＣ末端断片（Ｃ末端−Ｔ４Ｌ）、フラボドキシン、キシラナーゼその他の本発明の方法に従って選択される融合パートナーとの組合せの融合パートナータンパク質を含む組成物を提供する。一部の実施態様では、前記融合パートナーは、前記ＧＰＣＲの第５ヘリックス及び第６ヘリックスの間の第３細胞内ループの一部又は全部を置換する。一部の他の実施態様では、前記融合パートナーは、前記ＧＰＣＲのＣ末端又はＮ末端に連結する。一部の他の実施態様では、前記ＧＰＣＲのＣ末端又はＮ末端が切り取られ、前記融合パートナーはかかる切り取られた末端に連結する。一部の実施態様では、前記融合パートナータンパク質は結晶状態である。さらなる実施態様では、かかる結晶は、前記ＧＰＣＲのＸ線結晶学的な構造決定に適する品質である。一部の実施態様では、かかる構造（又はその一部）は、少なくとも３．５オングストロームと少なくとも１．５オングストロームとの間の分解能で得られる場合がある。一部のさらなる非限定的な実施態様では、かかる構造（又はその一部）は、少なくとも、３．５、３．４、３．３、３．４、３．１、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．４又は２．４オングストロームの分解能で得られる場合がある。

一部の実施態様では本発明は、結晶状態のＧＰＣＲの調製方法を提供し、該方法は、Ｎ末端から、ＧＰＣＲの最初の５個の膜貫通ドメインと、融合パートナードメインと、第６及び第７膜貫通ドメインとを含むアミノ酸配列を発現するのに適するヌクレオチド配列を調製することを含む。

一部の実施態様では本発明は、本発明に従ってさらに評価するために適当な候補融合パートナーを選択する方法を提供する。一部のかかる実施態様では本発明は、複数の候補融合パートナーをスクリーニングするプロセスを含む方法であって、前記候補融合パートナーに関するデータが利用可能であり、（ｉ）Ｎ末端とＣ末端との距離が、１５オングストロームか１０オングストロームか５オングストロームか以内であること、（ｉｉ）分子量が、２５ｋＤ（か２０ｋＤか１５ｋＤか）未満であること、（ｉｉｉ）少なくとも３、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４又は２．３オングストロームの回折分解能で結晶化されていることが実証されていること、（ｉｖ）２種類以上の化学条件のセットで結晶を形成できる能力があること、及び、（ｖ）２個以上の空間群を有する結晶を形成できる能力があることという基準のうち１つ以上を具備する候補融合パートナーを選択するステップを含む、方法を提供する。一部の実施態様では前記方法は、前記（ｉ）の基準なしで実施される。

β２−アドレナリン作動性レセプター（β２ＡＲ）に挿入されてβ２ＡＲ−融合パートナータンパク質を形成する候補融合パートナーＣ末端Ｔ４Ｌに関する、リガンド存在下（Ｔｉｍｏｌｏｌ−ＮＡ）及び非存在下（ＮＡ−ＮＡ）で抽出及び１次精製されたβ２ＡＲ−融合パートナータンパク質と、２次精製されたリガンド結合分子種（Ｔｉｍｏｌｏ０ｌ−Ｎｉ）のＳＥＣデータ。 β２−アドレナリン作動性レセプター（β２ＡＲ）に挿入されてβ２ＡＲ−融合パートナータンパク質を形成する候補融合パートナーＢｒｉｌに関する、リガンド存在下（Ｔｉｍｏｌｏｌ−ＮＡ）及び非存在下（ＮＡ−ＮＡ）で抽出及び１次精製されたβ２ＡＲ−融合パートナータンパク質と、２次精製されたリガンド結合分子種（Ｔｉｍｏｌｏ０ｌ−Ｎｉ）のＳＥＣデータ。 β２−アドレナリン作動性レセプター（β２ＡＲ）に挿入されてβ２ＡＲ−融合パートナータンパク質を形成する候補融合パートナーのルブレドキシンに関する、リガンド存在下（Ｔｉｍｏｌｏｌ−ＮＡ）及び非存在下（ＮＡ−ＮＡ）で抽出及び１次精製されたβ２ＡＲ−融合パートナータンパク質と、２次精製されたリガンド結合分子種（Ｔｉｍｏｌｏ０ｌ−Ｎｉ）のＳＥＣデータ。 β２−アドレナリン作動性レセプター（β２ＡＲ）に挿入されてβ２ＡＲ−融合パートナータンパク質を形成する候補融合パートナーのキシラナーゼに関する、リガンド存在下（Ｔｉｍｏｌｏｌ−ＮＡ）及び非存在下（ＮＡ−ＮＡ）で抽出及び１次精製されたβ２ＡＲ−融合パートナータンパク質と、２次精製されたリガンド結合分子種（Ｔｉｍｏｌｏ０ｌ−Ｎｉ）のＳＥＣデータ。 β２−アドレナリン作動性レセプター（β２ＡＲ）に挿入されてβ２ＡＲ−融合パートナータンパク質を形成する候補融合パートナーのフラボドキシンに関する、リガンド存在下（Ｔｉｍｏｌｏｌ−ＮＡ）及び非存在下（ＮＡ−ＮＡ）で抽出及び１次精製されたβ２ＡＲ−融合パートナータンパク質と、２次精製されたリガンド結合分子種（Ｔｉｍｏｌｏ０ｌ−Ｎｉ）のＳＥＣデータ。 左から右に、分子量標準、β２ＡＲ−Ｔ４Ｌ、β２ＡＲ−Ｃ末端Ｔ４Ｌ、β２ＡＲ−Ｂｒｉｌ、β２ＡＲ−ルブレドキシン、β２ＡＲ−キシラナーゼ及びβ２ＡＲ−フラボドキシンのそれぞれの最終精製産物の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動図。 安定化されたβ２ＡＲ−シトクロムＢ５６２融合パートナータンパク質（β２ＡＲ−Ｂｒｉｌ）の結晶化及び１次回折に関するデータで、発現及び精製されたβ２ＡＲ−Ｂｒｉｌの異なる濃度からの分注のタンパク質の量を示す分析的ＳＥＣ波形図。 安定化されたβ２ＡＲ−シトクロムＢ５６２融合パートナータンパク質（β２ＡＲ−Ｂｒｉｌ）の結晶化及び１次回折に関するデータで、存在するタンパク質の量について正規化された、異なる濃度からの分注の分析的ＳＥＣ波形図。 安定化されたβ２ＡＲ−シトクロムＢ５６２融合パートナータンパク質（β２ＡＲ−Ｂｒｉｌ）の結晶化及び１次回折に関するデータで、ＳＥＣ後に得られた高品質の単分散タンパク質を示すβ２ＡＲ−ＢｒｉｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動図。 精製されたβ２ＡＲ−Ｂｒｉｌが１次元で成長する大きな複屈折性結晶を形成することを示す、β２ＡＲ−Ｂｒｉｌ結晶の複屈折性を示すデジタル画像。 トリプトファンの蛍光によりタンパク質の結晶であることを確認する、β２ＡＲ−Ｂｒｉｌ結晶のトリプトファン蛍光を示すデジタル画像。 β２ＡＲ−Ｂｒｉｌ結晶の回折のデジタル画像。 結晶化添加剤トリメチルアミンＮ−オキシドを包接することにより得られたβ２ＡＲ−Ｂｒｉｌ結晶に関するデータで、優良な結晶成長及び回折特性を示す、トリメチルアミンＮ−オキシド添加剤の最適条件存在下で得られる結晶のデジタル画像。 名目的な分解能２．８オングストロームでＸ線を回折する結晶を示す、回折結果。 アデノシンＡ２Ａレセプター（Ａ_２Ａ）に挿入された候補融合パートナーのパネルに関するデータで、左から右へ、分子量標準、Ａ_２Ａ−ＢＲＩＬ、Ａ_２Ａ−フラボドキシン、Ａ_２Ａ−Ｔ４ＬＣ末端、Ａ_２Ａ−ルブレドキシン、Ａ_２Ａ−キシラナーゼ、Ａ_２Ａ−Ｔ４Ｌの発現及び精製を特徴づける１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動図。 アデノシンＡ２Ａレセプター（Ａ_２Ａ）に挿入された候補融合パートナーのパネルに関するデータで、単分散性及び均一性を分析するためにＡ_２Ａ−融合パートナータンパク質のそれぞれの分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）解析の波形図（２８０ｎｍの紫外線吸収で測定されたタンパク質レベル）。 アデノシンＡ２Ａレセプター（Ａ_２Ａ）に挿入された候補融合パートナーのパネルに関するデータで、既知アデノシンＡ_２ＡリガンドのＡ_２Ａ拮抗薬ＺＭ２４１２８５存在下でのＡ_２Ａ−ＢＲＩＬ、Ａ_２Ａ−フラボドキシン、Ａ_２Ａ−ルブレドキシン及びＡ_２Ａ−Ｔ４Ｌの安定性誘導を測定する熱変性アッセイ結果図。 アデノシンＡ２Ａレセプター（Ａ_２Ａ）に挿入された候補融合パートナーのパネルに関するデータで、既知アデノシンＡ_２ＡリガンドのＡ_２Ａ作動薬ＵＫ４３２０９７存在下でのＡ_２Ａ−ＢＲＩＬ、Ａ_２Ａ−フラボドキシン、Ａ_２Ａ−ルブレドキシン及びＡ_２Ａ−Ｔ４Ｌの安定性誘導を測定する熱変性アッセイ結果図。 作動薬ＵＫ４３２０９７に結合したＡ_２Ａ−ＢＲＩＬの結晶のデジタル画像。 ＮＯＰ１レセプターに挿入された候補融合パートナーのパネルに関するデータで、左から右へ、ＮＯＰ１−ＢＲＩＬ、ＮＯＰ１−フラボドキシン、ＮＯＰ１−Ｔ４ＬＣ末端、ＮＯＰ１−ルブレドキシン、ＮＯＰ１−キシラナーゼ、ＮＯＰ１−Ｔ４Ｌ−７２７、ＮＯＰ１−Ｔ４Ｌ−７２２、分子量標準及びＮＯＰ１−３７Ａが懸架されたレーンの１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットが抗ＦＬＡＧ抗体でプローブされたブロット図のデジタル画像。 ＮＯＰ１レセプターに挿入された候補融合パートナーのパネルに関するデータで、各ＮＯＰ１−融合パートナータンパク質のパネルの単分散性及び均一性を分析するための分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）解析の結果図。 ＮＯＰ１−ＢＲＩＬ、ＮＯＰ１−フラボドキシン及びＮＯＰ１の原型のＩＬ３−３７Ａ（対照）についての熱変性アッセイ結果を比較する結果図。 ＮＯＰ１−Ｔ４Ｌの複数の変異体についての熱変性アッセイ結果を比較する結果図。 ＣＣＲ５レセプターに挿入された候補融合パートナーのパネルに関するデータで、左から右へ、ＣＣＣＲ５−ＢＲＩＬ（「１４２３（ＣｙｔＢ）」と表示）、ＣＣＲ５−フラボドキシン（「１４２４（Ｆｌａｖｏ−）」と表示）、ＣＣＲ５−Ｔ４ＬＣ末端（「１４２５（Ｔ４＿Ｃ）」と表示）、ＣＣＲ５−ルブレドキシン（「１４２６（Ｒｕｂｒｅ−）」と表示）、ＣＣＲ５−キシラナーゼ（「１４２７（Ｘｙｌａｎａｓｅ）」と表示）及び分子量標準が懸架されたレーンの１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットが抗ＦＬＡＧ抗体でプローブされたブロット図のデジタル画像。 ＣＣＲ５レセプターに挿入された候補融合パートナーのパネルに関するデータで、ＣＣＲ５−Ｔ４Ｌ、ＣＣＲ５−ＢＲＩＬ（ＣＣＲ５−ＣｙｔＢ）、ＣＣＲ５−フラボドキシン、ＣＣＲ５−Ｔ４ＬＣ末端（「Ｔ４＿Ｃ」と表示）、ＣＣＲ５−ルブレドキシン及びＣＣＲ５−キシラナーゼの単分散性及び均一性を分析するための分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）解析の結果図。 本発明の方法の適用により同定された、適当な融合パートナーとして提案される可溶性タンパク質ドメインのセットを同定する表。 本発明の方法の適用により同定された、適当な融合パートナーとして提案される可溶性タンパク質ドメインのセットを同定する表。 本発明の方法の適用により同定された、適当な融合パートナーとして提案される可溶性タンパク質ドメインのセットを同定する表。

方法及び組成物が提供される。組成物は、ＧＰＣＲと融合パートナーとを組み合わせた融合パートナータンパク質を含む組成物の形状で提供され、該融合パートナーは、本明細書に列挙される原理に従って選択される。一部の実施態様では、前記融合パートナーは、ルブレドキシン、シトクロムｂ_５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ）、Ｔ４リゾチームＣ末端断片（Ｃ末端−Ｔ４Ｌ）、フラボドキシン又はキシラナーゼから選択される。一部の実施態様では、前記融合パートナータンパク質のアミノ酸配列は、ルブレドキシン、シトクロムｂ_５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ）、Ｔ４リゾチームＣ末端断片（Ｃ末端−Ｔ４Ｌ）、フラボドキシン又はキシラナーゼのうちの１種類と少なくとも９０％の相同性がある配列である。一部の実施態様では、前記融合パートナータンパク質のアミノ酸配列は、ルブレドキシン、シトクロムｂ_５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ）、Ｔ４リゾチームＣ末端断片（Ｃ末端−Ｔ４Ｌ）、フラボドキシン又はキシラナーゼのうちの１種類と少なくとも７０％の相同性がある配列で、かつ、かかる融合パートナーの原型（ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）との折り畳み類似性が実証される。

本明細書に説明されるＧＰＣＲｓは、天然に存在するＧＰＣＲｓと、これらの変異体との両方を含み、あるＧＰＣＲの７個の膜貫通ドメインと、細胞内又は細胞外領域の１個以上か、片方又は両方の末端かの置換又は欠失とを有するタンパク質を含む場合がある。一部の実施態様では本発明は、第５及び第６膜貫通ドメインの間の一部か実質的に全部かが融合パートナーで置換されたＧＰＣＲを含む融合パートナータンパク質コンストラクトを提供する。一部の実施態様では本発明は、ＧＰＣＲか、Ｃ末端及び／又はＮ末端が切り取られたＧＰＣＲかのＣ末端又はＮ末端のいずれかに融合パートナーが連結している、ＧＰＣＲか、Ｃ末端及び／又はＮ末端が切り取られたＧＰＣＲかを含む融合パートナータンパク質コンストラクトを提供する。

ＧＰＣＲの結晶学的構造研究、例えば、ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質のＸ線結晶学により該ＧＰＣＲの構造決定に適するタンパク質の結晶化を補助するために新規融合パートナーを使用する方法が提供される。本方法から得られる組成物が提供される。

ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を形成するために、融合パートナーをＧＰＣＲの細胞内ドメインに挿入することによってＧＰＣＲの結晶学的構造研究に適するタンパク質の結晶化を補助するために新規融合パートナーを使用し、該ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を発現及び精製し、その後、精製されたＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を結晶化し、結晶化されたＧＰＣＲ融合パートナータンパク質の結晶学的構造研究を行い、前記結晶化されたＧＰＣＲ融合パートナータンパク質の結晶学的構造研究から前記ＧＰＣＲの構造的特徴を決定する方法であって、該融合パートナーは、ルブレドキシン、シトクロムｂ５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ）、Ｔ４リゾチームＣ末端断片（Ｃ末端Ｔ４Ｌ）、フラボドキシン又はキシリナーゼのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、方法が提供される。

ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を形成するために、ＧＰＣＲのＮ末端又はＣ末端に融合パートナーを連結させることによって、該ＧＰＣＲの結晶学的構造研究に適するタンパク質の結晶化を補助するために新規融合パートナーを使用し、該ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を発現及び精製し、その後、精製されたＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を結晶化し、結晶化されたＧＰＣＲ融合パートナータンパク質の結晶学的構造研究を行い、前記結晶化されたＧＰＣＲ融合パートナータンパク質の結晶学的構造研究から前記ＧＰＣＲの構造的特徴を決定する方法であって、該融合パートナーは、ルブレドキシン、シトクロムｂ５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ）、Ｔ４リゾチームＣ末端断片（Ｃ末端Ｔ４Ｌ）、フラボドキシン又はキシリナーゼのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、方法が提供される。

ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質の結晶化を改良し、補助するために、結晶学的構造研究に適するＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を回収し、新規融合パートナーを使用する方法が提供される。ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質の発現を改良し、ＧＰＣＲ融合タンパク質の結晶化を補助するために新規融合パートナーを使用する方法が提供される。ＧＰＣＲ融合タンパク質の精製を改良しＧＰＣＲ融合パートナータンパク質の結晶化を補助するために新規融合パートナーを使用する方法が提供される。

結晶化と、Ｘ線結晶学による構造決定とのために望ましい生化学的及び構造的特性を有するＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を回収するためにＧＰＣＲの利用可能な細胞内ループに取り込むための有望な新規融合パートナーを同定し、予測し、選択し、スクリーニングし、評価するための方法が提供される。ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を同定し、選択し、スクリーニングし、評価するための方法が提供される。

結晶学的構造研究に適するＧＰＣＲ融合パートナータンパク質の結晶化を補助するための融合パートナーとして使用可能な新規タンパク質構造、ドメイン構造、タンパク質、ポリペプチドドメイン又はこれらの均等物を探索し、スクリーニングし、データベースのマイニングを行う方法が提供される。

結晶学的構造研究に適するＧＰＣＲ融合パートナータンパク質の結晶化を補助するために適する有望な新規融合パートナーを同定し、予測し、選択肢、スクリーニングし、評価する方法が提供される。一部のかかる実施態様では、前記融合パートナーは、Ｔ４Ｌと比較して改善された成績を提供する。

結晶学的構造研究に適するＧＰＣＲ融合パートナータンパク質の結晶化を補助ために適する融合パートナーを提供できる新規タンパク質構造、ドメイン構造、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン又はこれらの均等物を同定するために探索し、スクリーニングし、データベースのマイニングを行う方法が提供される。一部のかかる実施態様では、前記融合パートナーは、Ｔ４Ｌと比較して改善された成績を提供する。

結晶化と結晶学的構造研究とに望ましい生化学的及び構造的特性を有するＧＰＣＲ融合パートナータンパク質が提供される。

結晶化と結晶学的構造研究とに望ましい生化学的及び構造的特性を有するＧＰＣＲ融合パートナータンパク質の結晶が提供される。

結晶化と、Ｘ線結晶学による構造決定とに望ましい生化学的及び構造的特性をを有するＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を回収するために利用可能なＧＰＣＲの細胞内ループに取り込むための有望な新規融合パートナーを同定する方法が提供される。本発明の同定方法に従うＧＰＣＲ融合パートナータンパク質が提供される。

結晶化と、Ｘ線結晶学による構造決定とに望ましい生化学的及び構造的特性をを有するＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を回収するために利用可能なＧＰＣＲの細胞内ループへの取り込みか、ＧＰＣＲのＮ末端又はＣ末端への連結かのために有望な新規融合パートナーを選択する方法が提供される。本発明の選択方法に従うＧＰＣＲ融合パートナータンパク質が提供される。

結晶化と、Ｘ線結晶学による構造決定とに望ましい生化学的及び構造的特性をを有するＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を回収するために利用可能なＧＰＣＲの細胞内ループへの取り込みか、ＧＰＣＲのＮ末端又はＣ末端への連結かのために有望な新規融合パートナーをスクリーニングする方法が提供される。本発明のスクリーニング方法に従うＧＰＣＲ融合パートナータンパク質が提供される。

結晶化と、Ｘ線結晶学による構造決定とに望ましい生化学的及び構造的特性をを有するＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を回収するために利用可能なＧＰＣＲの細胞内ループへの取り込みか、ＧＰＣＲのＮ末端又はＣ末端への連結かのために有望な新規融合パートナーを評価する方法が提供される。本発明の評価方法に従うＧＰＣＲ融合パートナータンパク質が提供される。

大腸菌フラボドキシン（ＰＤＢ ＩＤ：１ＡＧ９、分子量：２０ｋＤ）、結核菌推定タンパク質（ＰＤＢ ＩＤ：２ＡＳＦ、ＭＷ：１５ｋＤ）、大腸菌ＣＨＥＹ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＪＢＥ、分子量：１４ｋＤ）、 ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）ＢＰＴ１ （ＰＤＢ ＩＤ：１Ｇ６Ｘ、分子量：７ｋＤ）、Ｔ４リゾチームＣ末端断片 （「Ｃ末端Ｔ４Ｌ」 ＰＤＢ ＩＤ：２Ｏ７Ａ、Ｔ４腸内細菌ファージ、１４ｋＤ）、フラボドキシン（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｉ１Ｏ、硫酸還元菌（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ）突然変異体Ｙ９８Ｈ、１６ｋＤ）、シトクロムｂ_５６２ＲＩＬ（「Ｂｒｉｌ」ＰＤＢ ＩＤ：１Ｍ６Ｔ、大腸菌可溶性シトクロムｂ５６２、１２ｋＤ）及び走化性タンパク質ｃｈｅＡ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＴＱＧ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来ＣｈｅＡホスホトランスフェラーゼドメイン、１１．９ｋＤ）を含むが、これらに限られない、新規融合パートナーを使用する方法が提供される。一部の実施態様では本発明は、前記融合パートナーのいずれかとの配列相同性が７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の融合パートナーを提供し、一部の実施態様では、かかる融合パートナーと高度の折り畳み類似性を有するか、実質的な折り畳み類似性を有するものが提供される。

以下を含むが、これらに限られない、ＧＰＣＲｓの結晶学的構造研究に適するタンパク質の結晶化を補助する新規融合パートナーを使用する方法が提供される。５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｄ、５−ｈｔ１ｅ、５−ＨＴ１Ｆ、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｂ、５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ４、５−ｈｔ５ａ、５−ＨＴ６、５−ＨＴ７、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、Ａ３、アルファ１Ａ−アドレノセプター（ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ）、アルファ１Ｂ−アドレノセプター、アルファ１Ｄ−アドレノセプター、アルファ２Ａ−アドレノセプター、アルファ２Ｂ−アドレノセプター、アルファ２Ｃ−アドレノセプター、ベータ１−アドレノセプター、ベータ２−アドレノセプター、ベータ３−アドレノセプター、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｃ５Ｌ２、ＡＴ１、ＡＴ２、ＡＰＪ、ＧＰＢＡ、ＢＢ１、ＢＢ２、ＢＢ３、Ｂ１、Ｂ２、ＣＢ１、ＣＢ２、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＣＸ３ＣＲ１、ＸＣＲ１、ＣＣＫ１、ＣＣＫ２、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、ＥＴＡ、ＥＴＢ、ＧＰＥＲ、ＦＰＲ１、ＦＰＲ２／ＡＬＸ、ＦＰＲ３、ＦＦＡ１、ＦＦＡ２、ＦＦＡ３、ＧＰＲ４２、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ３、グレリン、ＦＳＨ、ＬＨ、ＴＳＨ、ＧｎＲＨ、ＧｎＲＨ２、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、ＨＣＡ１、ＨＣＡ２、ＨＣＡ３、ｋｉｓｓｐｅｐｔｉｎ、ＢＬＴ１、ＢＬＴ２、ＣｙｓＬＴ１、ＣｙｓＬＴ２、ＯＸＥ、ＦＰＲ２／ＡＬＸ、ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３、ＬＰＡ４、ＬＰＡ５、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４、Ｓ１Ｐ５、ＭＣＨ１、ＭＣＨ２、ＭＣ１、ＭＣ２、ＭＣ３、ＭＣ４、ＭＣ５、ＭＴ１、ＭＴ２、モチリン、ＮＭＵ１、ＮＭＵ２、ＮＰＦＦ１、ＮＰＦＦ２、ＮＰＳ、ＮＰＢＷ１、ＮＰＢＷ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５、ＮＴＳ１、ＮＴＳ２、デルタ、カッパ、ミュー、ＮＯＰ、ＯＸ１、ＯＸ２、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、Ｐ２Ｙ１１、Ｐ２Ｙ１２、Ｐ２Ｙ１３、Ｐ２Ｙ１４、ＱＲＦＰ、ＰＡＦ、ＰＫＲ１、ＰＫＲ２、ＰＲＲＰ、ＤＰ１、ＤＰ２、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ４、ＦＰ、ＩＰ１、ＴＰ、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、ＰＡＲ４、ＲＸＦＰ１、ＲＸＦＰ２、ＲＸＦＰ３、ＲＸＦＰ４、ｓｓｔ１、ｓｓｔ２、ｓｓｔ３、ｓｓｔ４、ｓｓｔ５、ＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３、ＴＲＨ１、ＴＡ１、ＵＴ、Ｖ１Ａ、Ｖ１Ｂ、Ｖ２、ＯＴ、ＣＣＲＬ２、ＣＭＫＬＲ１、ＧＰＲ１、ＧＰＲ３、ＧＰＲ４、ＧＰＲ６、ＧＰＲ１２、ＧＰＲ１５、ＧＰＲ１７、ＧＰＲ１８、ＧＰＲ１９、ＧＰＲ２０、ＧＰＲ２１、ＧＰＲ２２、ＧＰＲ２５、ＧＰＲ２６、ＧＰＲ２７、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ３２、ＧＰＲ３３、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ３５、ＧＰＲ３７、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＧＰＲ３９、ＧＰＲ４２、ＧＰＲ４５、ＧＰＲ５０、ＧＰＲ５２、ＧＰＲ５５、ＧＰＲ６１、ＧＰＲ６２、ＧＰＲ６３、ＧＰＲ６５、ＧＰＲ６８、ＧＰＲ７５、ＧＰＲ７８、ＧＰＲ７９、ＧＰＲ８２、ＧＰＲ８３、ＧＰＲ８４、ＧＰＲ８５、ＧＰＲ８７、ＧＰＲ８８、ＧＰＲ１０１、ＧＰＲ１１９、ＧＰＲ１２０、ＧＰＲ１３２、ＧＰＲ１３５、ＧＰＲ１３９、ＧＰＲ１４１、ＧＰＲ１４２、ＧＰＲ１４６、ＧＰＲ１４８、ＧＰＲ１４９、ＧＰＲ１５０、ＧＰＲ１５１、ＧＰＲ１５２、ＧＰＲ１５３、ＧＰＲ１６０、ＧＰＲ１６１、ＧＰＲ１６２、ＧＰＲ１７１、ＧＰＲ１７３、ＧＰＲ１７４、ＧＰＲ１７６、ＧＰＲ１８２、ＧＰＲ１８３、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＬＰＡＲ６、ＭＡＳ１、ＭＡＳ１Ｌ、ＭＲＧＰＲＤ、ＭＲＧＰＲＥ、ＭＲＧＰＲＦ、ＭＲＧＰＲＧ、ＭＲＧＰＲＸ１、ＭＲＧＰＲＸ２、ＭＲＧＰＲＸ３、ＭＲＧＰＲＸ４、ＯＰＮ３、ＯＰＮ５、ＯＸＧＲ１、Ｐ２ＲＹ８、Ｐ２ＲＹ１０、ＳＵＣＮＲ１、ＴＡＡＲ２、ＴＡＡＲ３、ＴＡＡＲ４ 、ＴＡＡＲ５、ＴＡＡＲ６、ＴＡＡＲ８、ＴＡＡＲ９、ＣＣＰＢ２、ＣＣＲＬ１、ＦＹ、ＣＴ、カルシトニンレセプター様、ＣＲＦ１、ＣＲＦ２、ＧＨＲＨ、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、グルカゴン、セクレチン、ＰＴＨ１、ＰＴＨ２、ＰＡＣ１、ＶＰＡＣ１、ＶＰＡＣ２、ＢＡＩ１、ＢＡＩ２、ＢＡＩ３、ＣＤ９７、ＣＥＬＳＲ１、ＣＥＬＳＲ２、ＣＥＬＳＲ３、ＥＬＴＤ１、ＥＭＲ１、ＥＭＲ２、ＥＭＲ３、ＥＭＲ４Ｐ、ＧＰＲ５６、ＧＰＲ６４、ＧＰＲ９７、ＧＰＲ９８、ＧＰＲ１１０、ＧＰＲ１１１、ＧＰＲ１１２、ＧＰＲ１１３、ＧＰＲ１１４、ＧＰＲ１１５、ＧＰＲ１１６、ＧＰＲ１２３、ＧＰＲ１２４、ＧＰＲ１２５、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲ１２８、ＧＰＲ１３３、ＧＰＲ１４３、ＧＰＲ１４４、ＧＰＲ１５７、ＬＰＨＮ１、ＬＰＨＮ２、ＬＰＨＮ３、ＣａＳ、ＧＰＲＣ６、ＧＡＢＡＢ１、ＧＡＢＡＢ２、ｍＧｌｕ１、ｍＧｌｕ２、ｍＧｌｕ３、ｍＧｌｕ４、ｍＧｌｕ５、ｍＧｌｕ６、ｍＧｌｕ７、ｍＧｌｕ８、ＧＰＲ１５６、ＧＰＲ１５８、ＧＰＲ１７９、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＧＰＲＣ５Ｃ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＳＭＯ。評価されるＧＰＣＲｓは、以下を含むが、これらに限られない。クラスＢセクレチン様ＧＰＣＲｓ、クラスＣ代謝型グルタミン酸／フェロモンＧＰＣＲｓ、ｃＡＭＰレセプター鋤鼻レセプター（Ｖ１Ｒ及びＶ３Ｒ）及び味覚レセプターＴ２Ｒ。評価されるＧＰＣＲｓは、以下を含むが、これらに限られない。クラスＡＧＰＣＲ、クラスＢＧＰＣＲ、クラスＣＧＰＣＲ、クラスＤＧＰＣＲ、クラスＥＧＰＣＲ及びクラスＦＧＰＣＲ。

候補ＧＰＣＲｓは、β２アドレナリン作動性レセプター（β２ＡＲ）、Ａ２Ａアデノシンレセプター（Ａ_２Ａ）、Ｓ１Ｐ１、ＮＯＰ１を含むオピオイドレセプター（ＯＬＲ）、ケモカインレセプターＣＸＣＲ３（ＣＸＣＲ３）、ケモカインレセプターＣＣＲ５（ＣＣＲ５）、ＰＴＨＲ１、ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４及びＳ１Ｐ５を含むが、これらに限られない。

評価基準及びパラメーター
有望な融合パートナーと、得られるＧＰＣＲ融合パートナータンパク質とを同定し評価するために、タンパク質のデータを探索し、スクリーニングし、あるいは、データベース「マイニング」を行うのに少なくとも以下の基準の一部を使う方法が本明細書に提供される。１つの局面では、結晶学的構造研究に適するＧＰＣＲ融合パートナータンパク質の結晶化を補助するために適する融合パートナーを、一部の実施態様では、Ｔ４Ｌと比較して改善された成績を提供する融合パートナーを、提供するために有望な融合パートナーを同定し評価するために少なくとも以下の基準を用いる方法が提供される。当初の探索基準は以下の表１の基準を含むが、これらに限られない。

有望な新規融合パートナーを選択し評価するための追加の特徴又は基準は、相対的な特徴を含む場合がある、すなわち、サイズ（ｋＤ）、折り畳み回数（折り畳み多様性）のような異なるパラメーター数値を有する、有望な新規融合パートナーのセットが選択される場合がある。

融合パートナーが、ＧＰＣＲの末端に連結される融合パートナーとしての使用のために評価を求められる一部の実施態様では、該融合パートナーのＮ末端及びＣ末端の距離の近さに関する基準はあまり又は全く重要ではない。

一部の実施態様では本発明は、本発明に従うさらなる評価のために適する候補融合パートナーを選択する方法を提供する。一部のかかる実施態様では本発明は、複数のかかる候補融合パートナーをスクリーニングの過程を含む方法であって、以下の基準の１つ以上を具備する候補融合パートナーを選択するステップを含む方法を提供する。（ｉ）１５オングストロームか１０オングストロームか５オングストロームか以内しか離れていないＮ末端及びＣ末端を有すること、（ｉｉ）２５ｋＤ（か２０ｋＤか１５ｋＤ）か未満の分子量を有すること、（ｉｉｉ）少なくとも、３、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２，４又は２．３オングストロームの回折分解能で結晶化していることが実証されたこと、（ｉｖ）２セット以上の化学的条件で結晶形成する能力があること、（ｖ）２個以上の空間群を有する結晶を形成する能力があること。一部の実施態様では、前記方法は、前記（ｉ）の基準なしで実行される。一部の実施態様では、前記方法は、以下の追加の基準をも適用することによって実行される。（ｖｉ）少なくとも５０％のアルファヘリックス含量を有すること、及び、（ｖｉｉ）Ｎ末端かＣ末端かその両方かにアルファヘリックスドメインを有すること。いずれかの特定の理論に拘束されることなく、高含量のアルファヘリックスは前記融合タンパク質の安定性を改善し折り畳みを矯正する、より早い折り畳み速度論と対応することが提唱される。さらに、両端におけるアルファヘリックスドメインは、隣接するＧＰＣＲの膜貫通ドメインのアルファヘリックスモチーフに継続することによりより安定な折り畳みを促進する場合があり、ジャンクションが前記ＧＰＣＲのアルファヘリックスドメインと前記融合パートナーとの連続性のために選択され、１つの連続したアルファヘリックスドメインが前記ＧＰＣＲと前記融合パートナーとの間の１つ又は２つのジャンクションをまたぐように選択される場合は特により安定な折り畳みを促進する。

前記（ｉ）−（ｖｉｉ）の基準を含む本発明の方法を適用することにより、以下の候補融合パートナーが同定された（タンパク質データバンク識別番号を用いて列挙される）。２ｒｈｆ、２ｅｈｓ、２ｉｐ６、３ｉ７ｍ、１ｘ３ｏ、１ｕ８４、１ｈ７５、２ｈｕｊ、１ｙｓｑ、３ｌｓ０、２ｑｒ３、１ｚｕｈ、２ｂ８ｉ、２ｃｇｑ、３ｆｘｈ、３ｎｐｈ、２ｏ４ｄ、１ｔｍｙ、１ｖｋｕ及び２ｅｓ９。かかる探索と、前記基準（ｉ）−（ｖｉｉ）を具備する同定された候補融合パートナーとの結果の要約は図９に示される。

有望な融合パートナーの探索、スクリーニング、データベースマイニング及び同定
少なくとも表１に列挙される基準を満たす、有望な新規融合パートナーを探索し、スクリーニングし、及び／又はデータベースエントリーについてのタンパク質情報の検索可能なデータベースをマイニングする方法が本明細書に提供される。本明細書に提供される探索、スクリーニング及び／又はマイニングの方法に用いられる基準を少なくとも満たす有望な新規融合パートナーを同定する方法が本明細書に提供される。結晶学的構造研究に適するＧＰＣＲ融合パートナータンパク質の結晶化を補助するために適する融合パートナーを提供するために、本明細書に提供される、探索、スクリーニング及び／又はマイニングの方法に用いられる基準を少なくとも満たす有望な新規融合パートナーを同定する方法が本明細書に提供される。一部の実施態様では、Ｔ４Ｌと比較して改善された成績の融合パートナーが提供される。

代表的なデータベースは、タンパク質データバンク（ＰＤＢ、全世界タンパク質データバンク、ｗｗｗ．ｗｗｐｄｂ．ｏｒｇ）、ＪｅｎａＬｉｂ、ＭｏｄＢあせ、ＯＣＡ、ＳＣＯＰ、ＣＡＴＨ、Ｉｄｉｔｉｓを含むが、これらに限られない。

有望な融合タンパク質は、実験的柔軟性、実験的熱安定性、好熱生物由来の予め選択された構造を含むが、これらに限られない、パラメーターによってさらに特徴づけられる場合があり、補因子又は金属結合を要するタンパク質を排除される場合がある。

本明細書に提供されるデータベース検索、スクリーニング及び／又はマイニング方法によって同定される、有望な融合パートナーをさらに評価する方法が本明細書に提供される。表１の当初の探索基準を含むが、これらに限られない、追加の基準を用いて同定される有望な融合パートナーのそれぞれについて１以上のデータベースに提供される情報を評価するために追加の基準が用いられる。

データベースに記録される分子構造（データベースに含まれるエントリー）のコレクションのスクリーニングにオブジェクト指向構造化アプローチを用いる方法が提供される。１つの局面によると、オブジェクト指向構造化アプローチは、互換性のあるフォーマットでデータベースに記録された分子構造（オブジェクト）をスクリーニングするために提供され、実験条件、回折分解能及び著者のような関連するメタデータの活用を含む作業が前記「オブジェクト」について実行され、ユーザがグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）内で特定するさまざまなメタデータのいずれかに基づいて、該ユーザがデータベースのエントリーをプログラム上でフィルタリング及び／又はスクリーニングすることを可能にする。別の局面によると、ＧＵＩは前記データベースによって提供される一部の、多くの、又は、全ての属性を前記ユーザが探索できるようにするインターフェース制御装置とともに提供される。

非限定的な実施態様では、Ｖｉｓｕａｌ Ｓｔｕｄｉｏ Ｐｅｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ２００８（マイクロソフト社）が、本明細書で提供される方法を実施するためのアプリケーションを開発するのに用いられ、Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷＰＦ）のグラフィカルサブシステム及びＣ＃プログラミング言語（Ｃシャープ言語又はＣ＃言語）を含む、．ＮＥＴフレームワークｖ．３．５（マイクロソフト社）を活用する。さらなる非限定的な実施態様では、Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷＰＦ）が．ＮＥＴフレームワークｖ．３．５のグラフィカルサブシステムで、プログラム上のフィルタリング及び／又はバックエンド処理のようなアプリケーションのビジネス論理と、ソフトウェアのクライアントアプリケーションのグラフィカル・ユーザ・アプリケーション（ＧＵＩ）との隔離を可能にするアプリケーションを構築するためのプログラミングモデルを提供する。

ある非限定的な実施態様では、オブジェクト指向構造化アプローチが、各タンパク質構造ごとにＰＤＢＸＭＬファイルでＰＤＢレポジトリ内に記録された分子構造をスクリーニングするのに用いられる。単一のタンパク質構造（オブジェクト）を表す各ＰＤＢＸＭＬファイルは、ＸＭＬフォーマットと互換性のある．Ｎｅｔデータ構造内に参照され、実験条件、回折分解能及び著者のような関連するメタデータの探索を含む作業は前記「オブジェクト」上で実行され、ユーザがグラフィカル・ユーザ・インターフェース（ＧＵＩ）内で特定するさまざまなメタデータのいずれかに基づいて、該ユーザがデータベースのエントリーをプログラム上でフィルタリング及び／又はスクリーニングできる。別の非限定的な実施態様では、前記ＧＵＩは、前記データベースによって提供される全ての属性、例えば、ＲＣＳＢレポジトリをユーザが探索できるようにする戦略的なインターフェース制御装置を含む。

有望な融合パートナーについてデータベースマイニングを行う方法であって、マイニングが１回又は複数回行うことができ、マイニングが連続的又は間歇的にできる方法が提供される。データベース内に格納されるエントリーを検索（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）して、利用可能な構造を探索するためにデータを収集するデータベースマイニング方法が提供される。ローカルなデータ保存を前記データベースと同期する方法が提供される。１つの局面によると、データベース内に格納される全てのエントリーの自動的検索と、データベース内に格納されるエントリーの一部の自動的検索と、データベースに格納される選択されたエントリーの自動的検索と、１つ以上の検索基準を満足するエントリーの自動的検索とを含むが、これらに限られない、データベース内に格納されるエントリーの自動的検索の方法が提供される。さらに、データベースへの最近のデポジット（新規エントリー）、該データベースに格納されるエントリーの訂正、前記データベースに格納されるエントリーのさらなるアノテーションを含むが、これらに限られない、アップデートの検索方法であって、アップデートは自動的に検索されるか、スケジュール設定による探索（ｓｅａｒｃｈ）又は検索のような他の手段により検索されるかである、アップデートの検索方法が提供される。１つの局面によると、自動的なデータ収集は、データベースに存在する全てのエントリーの完全ダウンロードと、最近のデポジットその他の前記データベースへのアップデートのローカルな増分の自動的アップデートとを含む。

非限定的な実施態様では、データはデータベース中の全てのエントリーの自動的検索により収集される。別の非限定的な実施態様では、データはデータベース内の全てのエントリーを最初に自動的に検索し、その後、該データベースへの最近のデポジットをローカルな増分的アップデートを行うことによって収集される。非限定的な実施例では、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ）内に格納される全てのタンパク質データバンクのエントリの自動的検索は、（１）ローカルデータ保存がＰＤＢのＰＤＢＸＭＬリポジトリと同期されて、全ての既存のＰＤＢエントリーが完全にダウンロードされること、及び（２）前記ＲＣＳＢリポジトリへの最近のデポジットをローカルに増分的アップデートすることからなる。この例では、ｗｗＰＤＢの全世界のサーバーのコレクションから（ｗｗｗ．ｗｗｐｄｂ．ｏｒｇ経由で）直接ファイルを得るために、ｈｔｔｐ：プロトコールを用いてデータがローカルに同期された。さまざまな非限定的な実施態様では、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）の全エントリーのコレクションのサイズは、スクリーニングを行う時期に応じて、２００ＧＢから３２０ＧＢまでの範囲であった。ＰＤＢリポジトリが構造６０，０００件を超えるエントリーを格納したとき、ＰＤＢのリポジトリのローカルコピーのサイズは３２０ＧＢに達した。

非限定的な実施態様では、データはデータベース内の候補を同定する探索基準を用いることにより収集され、該データベースからの全エントリーが検索される。

新規融合パートナー及びＧＰＣＲ融合パートナータンパク質の評価
有望な新規融合パートナー（又は候補融合パートナー）は少なくとも１種類のＧＰＣＲの、少なくとも１カ所に取り込まれ、得られるＧＰＣＲ融合パートナータンパク質が決定されるであろう。１つの局面によると、有望な新規融合パートナーのそれぞれが少なくとも２種類の異なるレセプターに取り込まれるであろう。別の局面によると、同一のレセプターと同一の融合パートナーとを有する少なくとも２種類の別々のＧＰＣＲｓであって、有望な新規融合パートナーのそれぞれが前記融合パートナーが他とは異なる場所に取り込まれている、ＧＰＣＲｓを作製するために、前記有望な新規融合パートナーのそれぞれは同一のレセプターの少なくとも２カ所の異なる場所に取り込まれるであろう。別の局面によると、各レセプターについて少なくとも２種類の別々のＧＰＣＲ融合パートナータンパク質であって、異なるレセプターを有する別々のＧＰＣＲ融合パートナータンパク質が作製されるであろう。

ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を作製するためにＧＰＣＲｓに取り込まれるようにＰＤＢからデータベースマイニングされた有望な融合パートナーのセットは、以下を含むが、これらに限定されない。大腸菌フラボドキシン（ＰＤＢ ＩＤ：１ＡＧ９、ＭＷ：２０ｋＤ）、結核菌推定タンパク質Ｒｖ２０７４、（ＰＤＢ ＩＤ：２ＡＳＦ、ＭＷ：１５ｋＤ）、大腸菌走化性タンパク質ＣＨＥＹ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＪＢＥ、ＭＷ：１４ｋＤ）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）膵臓トリプシンインヒビターＢＰＴ１（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｇ６Ｘ、ＭＷ：７ｋＤ）。ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を作製するためにＧＰＣＲｓに取り込まれるようにＰＤＢからデータベースマイニングされた有望な融合パートナーの別のセットは、以下を含むが、これらに限定されない。Ｔ４リゾチームＣ末端断片（ＰＤＢ ＩＤ：２Ｏ７Ａ、Ｔ４腸内細菌ファージ、１４ｋＤ）、フラボドキシン（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｉ１Ｏ、硫酸還元菌（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ）突然変異体Ｙ９８Ｈ、１６ｋＤ）、シトクロムｂ_５６２ＲＩＬ（「Ｂｒｉｌ」ＰＤＢ ＩＤ：１Ｍ６Ｔ、大腸菌可溶性シトクロムｂ５６２、１２ｋＤ）及び走化性タンパク質ｃｈｅＡ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＴＱＧ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来ＣｈｅＡホスホトランスフェラーゼドメイン、１１．９ｋＤ）。上記の基準を用いることによって同定された、サイズ及び折り畳み（折り畳みの多様性）に変化がある有望な新規融合パートナーのセットの別の例は、以下を含むが、これらに限定されない。ルブレドキシン（ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＨＭ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来ルブレドキシン、６ｋＤ）、シトクロムｂ_５６２ＲＩＬ（「Ｂｒｉｌ」ＰＤＢ ＩＤ：１Ｍ６Ｔ、大腸菌可溶性シトクロムｂ５６２、１２ｋＤ）、Ｔ４リゾチームＣ末端断片 （「Ｃ末端Ｔ４Ｌ」 ＰＤＢ ＩＤ：２Ｏ７Ａ、Ｔ４腸内細菌ファージ、１４ｋＤ）、フラボドキシン（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｉ１Ｏ、硫酸還元菌（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ）突然変異体Ｙ９８Ｈ、１６ｋＤ）及びキシラナーゼ（ＰＤＢ ＩＤ：２Ｂ４５、エンド−１，４−ベータ−キシラナーゼＡ、２１ｋＤ）。別の実施例では、セットはさらに対照としてＴ４リゾチーム（Ｔ４Ｌ、１８ｋＤ）を含むが、これに限られない。

ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質のそれぞれは、ＴＭ−Ｖ及びＴＭ−ＶＩの細胞内端に対して異なる場所で前記ＧＰＣＲにコンビナトリアルに挿入された後、結晶化能について試験される。

評価されるＧＰＣＲｓは以下を含むが、これらに限られない。クラスＡのＧＰＣＲ、クラスＢのＧＰＣＲ、クラスＣのＧＰＣＲ、クラスＤのＧＰＣＲ、クラスＥのＧＰＣＲ及びクラスＦのＧＰＣＲ。候補ＧＰＣＲｓは、β２アドレナリン作動性レセプター（β２ＡＲ）、Ａ２Ａ−アデノシンレセプター（Ａ_２Ａ）、スフィンゴシン１−リン酸レセプター１型（Ｓ１Ｐ１）、ＮＯＰ１を含むオピオイドレセプター（ＯＬＲ）、ケモカインレセプターＣＸＣＲ３（ＣＸＣＲ３）、ケモカインレセプターＣＣＲ５（ＣＣＲ５）を含むが、これらに限られない。

融合パートナーのＧＰＣＲ細胞内ドメインへの取り込み
予想される融合パートナーにとって最適な場所は、今日までに解読された構造の解析により確立できる。融合タンパク質の取り込みはいかなる２次構造要素又は３次パッキング相互作用を邪魔すべきではなく、リガンド結合ポケットと干渉すべきではない。クラスＡレセプターについてのこれらの留意点を考慮すると、ループ置換のための信頼できる選択肢は、構造的な無秩序性（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）が最も高いように思われる、第３細胞内ループである。領域及びループの相対的な秩序性についてほとんど何も知られていないクラスＢのＧＰＣＲｓのような他のクラスの７回膜貫通型レセプターについては、他の場所が適切かもしれない。第３細胞内ループ内での正確な場所への変更は、各コンストラクトを最適化するプロセスの一部である。

一部の実施態様では、各ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質は、ＴＭ−Ｖ及びＴＭＶＩの細胞内両端に対して異なる場所で該ＧＰＣＲにコンビナトリアルに挿入された後、結晶化能について試験される。

本発明の特徴その他の詳細は、本発明のステップ又は本発明の部分の組合せのいずれであっても、以下に具体的に説明され、特許請求の範囲に記載される。本発明の特定の実施態様は図面により示されるが、本発明を限定するものとしてでなないことが理解されるであろう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく、さまざまな実施態様に用いることができる。変化の量は、前記ループの長さと、既知構造に対する配列相同性とに関係するであろう。本発明は、ＴＭ−Ｖ及びＴＭ−ＶＩの細胞内両端に対して１、４、５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５カ所又はそれ以上への挿入を含むが、平均して、２−３カ所の当初挿入ポイントが評価される。一部の実施態様では、各ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質は、ＧＰＣＲのＮ末端又はＣ末端か、Ｎ末端又はＣ末端が切り取られた形状のＧＰＣＲかに融合パートナーが連結された後、結晶化能について試験される。

本発明の一部の実施態様では、融合パートナーについてのＴＶ−Ｖ及びＴＭ−ＶＩの間の代替的なジャンクション場所が、結晶化に好適である可能性の指標としての融合タンパク質の熱安定性への効果について評価される。

評価
本明細書に提供されるとおりに探索することによって同定される、有望な融合パートナー（とりわけ、融合パートナー候補タンパク質、代替的融合パートナー、有望な担体タンパク質等ともいう。）の実行可能性は、本明細書に提供されるとおり評価される。非限定的な代表的実施態様では、β２アドレナリン作動性レセプター（β２ＡＲ）がモデルシステムとしての役割を果たす。該モデルシステムでは、本明細書に提供されるとおりに探索することによって同定された６種類の有望な融合パートナータンパク質のそれぞれが、Ｔ４リゾチームがβ２ＡＲ−Ｔ４Ｌとしてクローン化されて構造が解明されたのと同じβ２ＡＲの部位にクローン化された。すなわち、β２ＡＲと有望な融合パートナーとのコンストラクトのそれぞれのための発現ベクターは、所望のβ２ＡＲと有望な融合パートナーとのコンストラクトを発現産物とするように構築され、各β２ＡＲと有望な融合パートナーとのコンストラクトのそれぞれは、発現ベクターのウイルス産生と、中規模発現と、β２ＡＲと有望な融合パートナーとのコンストラクトの安定性及び単分散性の予備的な特徴づけとを通じて進められた。β２ＡＲと有望な融合パートナーとのコンストラクトを用いる非限定的な代表的実施態様では、２種類の有望な融合パートナータンパク質が考慮から外され、残る４種類のβ２ＡＲと有望な融合パートナーとのコンストラクトは発現の規模が拡大され、該β２ＡＲと有望な融合パートナーとのコンストラクトは結晶化トライアルに進められた。予備的な結晶のヒットは、発現の規模が拡大され、結晶化トライアルに進んだ前記４種類のコンストラクトのうち２種類について得られ、β２ＡＲ−ＢＲＩＬコンストラクトについては３種類の異なる結晶化条件で結晶化した。さらなる最適化が、高分解能構造決定を支持する可能性を判断するための予備的な回折研究に十分な大きさの結晶を成長させるのに十分な条件の同定につながった。この非限定的な代表的実施態様では、最良の結晶は約２．８オングストロームまで回折した。この非限定的な代表的実施態様では、前記最良の結晶が得られた条件は、過去の結晶化の努力で所望のレベルの分解能を達成することと関係づけられることが知られたパラメーターを調整することによって、サイズ、暑さ及び複屈折性が増大するようにさらに最適化された。

本明細書に説明されるとおりさまざまな有望な融合パートナー（代替的融合パートナー）をβ２ＡＲに取り込む非限定的な代表的実施態様に加えて、複数の追加のＧＰＣＲｓにおけるさまざまな有望な融合パートナーの有用性を探索するために、さらなる非限定的な実施態様が実施された。５種類の異なる有望な融合パートナーが、アデノシンＡ２Ａ、ＮＯＰ１及びＣＸＣＲ３というＧＰＣＲｓのそれぞれにクローン化され、前記有望な融合パートナーは最適化されたジャンクション部位に取り込まれた。これらのさらなる非限定的な実施態様では、ＧＰＣＲと有望な融合パートナーとのコンストラクトのそれぞれは、小規模発現の研究と、生物物理学的特徴づけとに回付された。一部の非限定的な実施態様では、アデノシンＡ２Ａ融合パートナータンパク質は予備的結果を伴う結晶化トライアルにさらに進められた。この観察に限定されることは望まないが、全体として結果は良好で、各標的ＧＰＣＲについての融合パートナーとしてのＴ４Ｌと比較するとき、少なくとも２種類の有望な融合パートナーで同等かそれ以上の結果が得られた。本明細書に提供される方法及び組成物によると、β２ＡＲ−Ｔ４Ｌ結晶を形成するための具体的な条件はβ２ＡＲ−ＢＲＩＬコンストラクトに適用されるのが一般的であった。

本明細書に提供される方法及び組成物は、特記されない場合を除いて既知の方法を用いて、特に、以下の文献に開示されるとおり、コンストラクト組み立て、クローニング、発現、精製、脂質立方相結晶化を含むがこれに限られない結晶化、熱安定性アッセイを含むが、これに限られない、評価、飽和等温線測定及び競合結合アッセイを含むリガンド結合アッセイ当業者の知識に従って実施される。Ｃｈｅｒｅｚｏｖら、２００４ （Ｃｈｅｒｅｚｏｖ， Ｖ．， Ｐｅｄｄｉ， Ａ．， Ｍｕｔｈｕｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ， Ｌ．， Ｚｈｅｎｇ， Ｙ． Ｆ．， ａｎｄ Ｃａｆｆｒｅｙ， Ｍ．， “Ａ ｒｏｂｏｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｌｉｐｉｄｉｃ ｍｅｓｏｐｈａｓｅｓ，” Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６０： １７９５−１８０７， ２００４）、Ｃｈｅｒｅｚｏｖら、２００７ （Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８： １２５８−１２６５， ２００７）、Ｒｏｓｅｎｂａｕｍら、２００７ （Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８： １２６６−１２７３， ２００７）、国際公開第２００９／０５５５０９ Ａ２号パンフレットとして公開されたＰＣＴ／ＵＳ０８／８０８４７と、米国出願公開第２０１１／００３１４３８ Ａ１号明細書として公開された米国特許出願第１２／７３９，１３４号（２０１１年２月１０日）とに開示されたＳｔｅｖｅｎｓら、Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ （Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ｓ． Ｃｏｌｏｗｉｃｋ及びＮ． Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １８版、１９９０）、Ｃａｒｅｙ及びＳｕｎｄｂｅｒｇ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌｓ． Ａ及びＢ （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９９２）。

実施例１ ＧＰＣＲｓに取り込むための有望な融合パートナーを同定するためのデータマイニング
タンパク質データバンク（ＰＤＢ、全世界タンパク質データバンク、ｗｗｗ．ｗｗｐｄｂ．ｏｒｇ）の当初のスクリーニングが前記表１に列挙された以下の基準を満たす有望な新規融合パートナーを同定するために実施された。有望な融合パートナーの候補のＮ末端及びＣ末端の距離は１５オングストローム以下のこと、分子量は２５ｋＤ未満のこと、有望な融合パートナーの結晶は回折分解能が３オングストロームを超えること、有望な融合パートナーの結晶は少なくとも２つの異なる化学条件で形成されること、及び、有望な融合パートナーの結晶は、１つ以上の空間群が得られること。以下の有望な融合パートナーがこのスクリーニングで同定された。大腸菌フラボドキシン（ＰＤＢ ＩＤ：１ＡＧ９、ＭＷ：２０ｋＤ）、結核菌推定タンパク質（ＰＤＢ ＩＤ： ２ＡＳＦ、ＭＷ：１５ｋＤ）、大腸菌ＣＨＥＹ（ＰＤＢ ＩＤ： １ＪＢＥ、ＭＷ：１４ｋＤ）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）ＢＰＴ１（ＰＤＢ ＩＤ： １Ｇ６Ｘ、ＭＷ：７ｋＤ）。

実施例２ Ｓ１Ｐ１融合パートナータンパク質
Ｓ１Ｐ１は、Ｓ１Ｐ_１−５と命名される５種類のＧＰＣＲｓと結合する体循環脂質の脂質シグナル分子スフィンゴシン１−リン酸（Ｓ１Ｐ）と結合するＧＰＣＲである。Ｓ１Ｐ_１は、免疫細胞トラフィッキングと、内皮のインテグリティの維持とを含む、免疫及び心臓循環器系の生理学的機能を選択的に調節する。４種類の新規Ｓ１Ｐ１融合パートナータンパク質が作製され、以下に説明されるとおり評価された。

以下のタンパク質のそれぞれが有望な融合パートナーとして評価された。Ｔ４リゾチームＣ末端断片（ＰＤＢ ＩＤ：２Ｏ７Ａ、Ｔ４腸内細菌ファージ、１４ｋＤ）、フラボドキシン（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｉ１Ｏ、硫酸還元菌（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ）突然変異体Ｙ９８Ｈ、１６ｋＤ）、シトクロムｂ_５６２ＲＩＬ（「Ｂｒｉｌ」ＰＤＢ ＩＤ：１Ｍ６Ｔ、大腸菌可溶性シトクロムｂ５６２、１２ｋＤ）及び走化性タンパク質ｃｈｅＡ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＴＱＧ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来ＣｈｅＡホスホトランスフェラーゼドメイン、１１．９ｋＤ）。

有望な融合パートナーのそれぞれが以下のとおりＳ１Ｐ１に取り込まれた。融合パートナーをコード化するｃＤＮＡコンストラクトがそれぞれの結晶構造で観察される全てのアミノ酸をコード化するように合成された。Ｓ１Ｐ１融合体を生成するために、ＰＣＲ利用部位特異的突然変異により、アミノ酸コドンＳ２３２／Ｒ２３３と、Ｋ２４３／Ａ２４４との間のＳ１Ｐ１ｃＤＮＡ内に融合パートナーのｃＤＮＡを挿入するための部位を新設するためにユニークな制限酵素切断部位がはじめに導入された。つぎに、融合パートナーｃＤＮＡ（すなわち、融合パートナーをコード化するｃＤＮＡ）は、Ｓ１Ｐ１レセプターＤＮＡ内に導入された部位に適合するコード化された末端制限酵素切断部位を含むプライマーを用いるＰＣＲによって増幅された。Ｓ１Ｐ１レセプター（ＧｅｎＢａｎｋ： Ｍ３１２１０．１）がさらなる改変のための基本コンストラクトとして使用され、そのアミノ酸配列は以下に示される。

ヒトＳ１Ｐ１レセプターＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ３１２１０．１のアミノ酸配列
ＭＧＰＴＳＶＰＬＶＫＡＨＲＳＳＶＳＤＹＶＮＹＤＩＩＶＲＨＹＮＹＴＧＫＬＮＩＳＡＤＫＥＮＳＩＫＬＴＳＶＶＦＩＬＩＣＣＦＩＩＬＥＮＩＦＶＬＬＴＩＷＫＴＫＫＦＨＲＰＭＹＹＦＩＧＮＬＡＬＳＤＬＬＡＧＶＡＹＴＡＮＬＬＬＳＧＡＴＴＹＫＬＴＰＡＱＷＦＬＲＥＧＳＭＦＶＡＬＳＡＳＶＦＳＬＬＡＩＡＩＥＲＹＩＴＭＬＫＭＫＬＨＮＧＳＮＮＦＲＬＦＬＬＩＳＡＣＷＶＩＳＬＩＬＧＧＬＰＩＭＧＷＮＣＩＳＡＬＳＳＣＳＴＶＬＰＬＹＨＫＨＹＩＬＦＣＴＴＶＦＴＬＬＬＬＳＩＶＩＬＹＣＲＩＹＳＬＶＲＴＲＳＲＲＬＴＦＲＫＮＩＳＫＡＳＲＳＳＥＮＶＡＬＬＫＴＶＩＩＶＬＳＶＦＩＡＣＷＡＰＬＦＩＬＬＬＬＤＶＧＣＫＶＫＴＣＤＩＬＦＲＡＥＹＦＬＶＬＡＶＬＮＳＧＴＮＰＩＩＹＴＬＴＮＫＥＭＲＲＡＦＩＲＩＭＳＣＣＫＣＰＳＧＤＳＡＧＫＦＫＲＰＩＩＡＧＭＥＦＳＲＳＫＳＤＮＳＳＨＰＱＫＤＥＧＤＮＰＥＴＩＭＳＳＧＮＶＮＳＳＳ（配列番号１）
融合パートナーｃＤＮＡは、標準的な分子生物学の技術を用いて前記Ｓ１Ｐ１レセプターをコードする配列に挿入された。まず、融合パートナーをコード化するｃＤＮＡと改変されたＳ１Ｐ１ｃＤＮＡとが制限酵素消化により切断され、精製された。次に、消化されたＰＣＲ産物とベクターとがライゲーションされ、大腸菌に形質転換された。得られたクローンはＤＮＡ配列決定により確認された。このプロセスでは、Ｓ１Ｐ１ベクターの制限酵素消化がレセプターのＩＣＬ３（Ｓ２３２−Ｋ２４３）の短いセグメントを除去し、挿入された融合パートナーｃＤＮＡによってその後置換され、Ｓ１Ｐ１レセプターのＲ２３１及びＫ２４３の間への挿入が行われた。レセプター融合の挙動を改善するために、Ｓ１Ｏ１レセプターのＣ末端はＳ１Ｐ１Ｍ３２５まで切り取られた。各レセプター融合コンストラクトの完全アミノ酸配列は以下に示される（融合パートナー配列は下線で示される）。

Ｓ１Ｐ１−ＢＲＩＬのアミノ酸配列
ＭＧＰＴＳＶＰＬＶＫＡＨＲＳＳＶＳＤＹＶＮＹＤＩＩＶＲＨＹＮＹＴＧＫＬＮＩＳＡＤＫＥＮＳＩＫＬＴＳＶＶＦＩＬＩＣＣＦＩＩＬＥＮＩＦＶＬＬＴＩＷＫＴＫＫＦＨＲＰＭＹＹＦＩＧＮＬＡＬＳＤＬＬＡＧＶＡＹＴＡＮＬＬＬＳＧＡＴＴＹＫＬＴＰＡＱＷＦＬＲＥＧＳＭＦＶＡＬＳＡＳＶＦＳＬＬＡＩＡＩＥＲＹＩＴＭＬＫＭＫＬＨＮＧＳＮＮＦＲＬＦＬＬＩＳＡＣＷＶＩＳＬＩＬＧＧＬＰＩＭＧＷＮＣＩＳＡＬＳＳＣＳＴＶＬＰＬＹＨＫＨＹＩＬＦＣＴＴＶＦＴＬＬＬＬＳＩＶＩＬＹＣＲＩＹＳＬＶＲＴＲＡＤＬＥＤＮＷＥＴＬＮＤＮＬＫＶＩＥＫＡＤＮＡＡＱＶＫＤＡＬＴＫＭＲＡＡＡＬＤＡＱＫＡＴＰＰＫＬＥＤＫＳＰＤＳＰＥＭＫＤＦＲＨＧＦＤＩＬＶＧＱＩＤＤＡＬＫＬＡＮＥＧＫＶＫＥＡＱＡＡＡＥＱＬＫＴＴＲＮＡＹＩＱＫＹＬＡＳＲＳＳＥＮＶＡＬＬＫＴＶＩＩＶＬＳＶＦＩＡＣＷＡＰＬＦＩＬＬＬＬＤＶＧＣＫＶＫＴＣＤＩＬＦＲＡＥＹＦＬＶＬＡＶＬＮＳＧＴＮＰＩＩＹＴＬＴＮＫＥＭＲＲＡＦＩＲＩＭ（配列番号２）
Ｓ１Ｐ１−フラボドキシンのアミノ酸配列
ＭＧＰＴＳＶＰＬＶＫＡＨＲＳＳＶＳＤＹＶＮＹＤＩＩＶＲＨＹＮＹＴＧＫＬＮＩＳＡＤＫＥＮＳＩＫＬＴＳＶＶＦＩＬＩＣＣＦＩＩＬＥＮＩＦＶＬＬＴＩＷＫＴＫＫＦＨＲＰＭＹＹＦＩＧＮＬＡＬＳＤＬＬＡＧＶＡＹＴＡＮＬＬＬＳＧＡＴＴＹＫＬＴＰＡＱＷＦＬＲＥＧＳＭＦＶＡＬＳＡＳＶＦＳＬＬＡＩＡＩＥＲＹＩＴＭＬＫＭＫＬＨＮＧＳＮＮＦＲＬＦＬＬＩＳＡＣＷＶＩＳＬＩＬＧＧＬＰＩＭＧＷＮＣＩＳＡＬＳＳＣＳＴＶＬＰＬＹＨＫＨＹＩＬＦＣＴＴＶＦＴＬＬＬＬＳＩＶＩＬＹＣＲＩＹＳＬＶＲＴＲＡＫＡＬＩＶＹＧＳＴＴＧＮＴＥＹＴＡＥＴＩＡＲＥＬＡＤＡＧＹＥＶＤＳＲＤＡＡＳＶＥＡＧＧＬＦＥＧＦＤＬＶＬＬＧＣＳＴＷＧＤＤＳＩＥＬＱＤＤＦＩＰＬＦＤＳＬＥＥＴＧＡＱＧＲＫＶＡＣＦＧＣＧＤＳＳＷＥＹＦＣＧＡＶＤＡＩＥＥＫＬＫＮＬＧＡＥＩＶＱＤＧＬＲＩＤＧＤＰＲＡＡＲＤＤＩＶＧＷＡＨＤＶＲＧＡＩＡＳＲＳＳＥＮＶＡＬＬＫＴＶＩＩＶＬＳＶＦＩＡＣＷＡＰＬＦＩＬＬＬＬＤＶＧＣＫＶＫＴＣＤＩＬＦＲＡＥＹＦＬＶＬＡＶＬＮＳＧＴＮＰＩＩＹＴＬＴＮＫＥＭＲＲＡＦＩＲＩＭ（配列番号３）
Ｓ１Ｐ１−キシリナーゼのアミノ酸配列
ＭＧＰＴＳＶＰＬＶＫＡＨＲＳＳＶＳＤＹＶＮＹＤＩＩＶＲＨＹＮＹＴＧＫＬＮＩＳＡＤＫＥＮＳＩＫＬＴＳＶＶＦＩＬＩＣＣＦＩＩＬＥＮＩＦＶＬＬＴＩＷＫＴＫＫＦＨＲＰＭＹＹＦＩＧＮＬＡＬＳＤＬＬＡＧＶＡＹＴＡＮＬＬＬＳＧＡＴＴＹＫＬＴＰＡＱＷＦＬＲＥＧＳＭＦＶＡＬＳＡＳＶＦＳＬＬＡＩＡＩＥＲＹＩＴＭＬＫＭＫＬＨＮＧＳＮＮＦＲＬＦＬＬＩＳＡＣＷＶＩＳＬＩＬＧＧＬＰＩＭＧＷＮＣＩＳＡＬＳＳＣＳＴＶＬＰＬＹＨＫＨＹＩＬＦＣＴＴＶＦＴＬＬＬＬＳＩＶＩＬＹＣＲＩＹＳＬＶＲＴＲＡＳＴＤＹＷＱＮＷＴＦＧＧＧＩＶＮＡＶＮＧＳＧＧＮＹＳＶＮＷＳＮＴＧＮＦＶＶＧＫＧＷＴＴＧＳＰＦＲＴＩＮＹＮＡＧＶＷＡＰＮＧＮＧＹＬＴＬＹＧＷＴＲＳＰＬＩＥＹＹＶＶＤＳＷＧＴＹＲＰＴＧＴＹＫＧＴＶＫＳＤＧＧＴＹＤＩＹＴＴＴＲＹＮＡＰＳＩＤＧＤＤＴＴＦＴＱＹＷＳＶＲＱＳＫＲＰＴＧＳＮＡＴＩＴＦＴＮＨＶＮＡＷＫＳＨＧＭＮＬＧＳＮＷＡＹＱＶＭＡＴＥＧＹＱＳＳＧＳＳＮＶＴＶＷＡＳＲＳＳＥＮＶＡＬＬＫＴＶＩＩＶＬＳＶＦＩＡＣＷＡＰＬＦＩＬＬＬＬＤＶＧＣＫＶＫＴＣＤＩＬＦＲＡＥＹＦＬＶＬＡＶＬＮＳＧＴＮＰＩＩＹＴＬＴＮＫＥＭＲＲＡＦＩＲＩＭ（配列番号４）
Ｓ１Ｐ１−ルブレドキシンのアミノ酸配列
ＭＧＰＴＳＶＰＬＶＫＡＨＲＳＳＶＳＤＹＶＮＹＤＩＩＶＲＨＹＮＹＴＧＫＬＮＩＳＡＤＫＥＮＳＩＫＬＴＳＶＶＦＩＬＩＣＣＦＩＩＬＥＮＩＦＶＬＬＴＩＷＫＴＫＫＦＨＲＰＭＹＹＦＩＧＮＬＡＬＳＤＬＬＡＧＶＡＹＴＡＮＬＬＬＳＧＡＴＴＹＫＬＴＰＡＱＷＦＬＲＥＧＳＭＦＶＡＬＳＡＳＶＦＳＬＬＡＩＡＩＥＲＹＩＴＭＬＫＭＫＬＨＮＧＳＮＮＦＲＬＦＬＬＩＳＡＣＷＶＩＳＬＩＬＧＧＬＰＩＭＧＷＮＣＩＳＡＬＳＳＣＳＴＶＬＰＬＹＨＫＨＹＩＬＦＣＴＴＶＦＴＬＬＬＬＳＩＶＩＬＹＣＲＩＹＳＬＶＲＴＲＭＫＫＹＴＣＴＶＣＧＹＩＹＮＰＥＤＧＤＰＤＮＧＶＮＰＧＴＤＦＫＤＩＰＤＤＷＶＣＰＬＣＧＶＧＫＤＱＦＥＥＶＥＥＡＳＲＳＳＥＮＶＡＬＬＫＴＶＩＩＶＬＳＶＦＩＡＣＷＡＰＬＦＩＬＬＬＬＤＶＧＣＫＶＫＴＣＤＩＬＦＲＡＥＹＦＬＶＬＡＶＬＮＳＧＴＮＰＩＩＹＴＬＴＮＫＥＭＲＲＡＦＩＲＩＭ（配列番号５）
さらなるＮ末端及びＣ末端改変をコード化する発現コンストラクト
Ｓ１Ｐ１レセプター融合体のセットをコード化する合成ｃＤＮＡは、Ｎ末端のヘマグルチニンシグナル配列と、Ｃ末端の１０個のヒスチジンタグに続くＦＬＡＧエピトープとを含むように改変されたｐＦａｓｔＢａｃにクローン化された。完成したＳ１Ｐ１−ＢＲＩＬコンストラクトにコード化されるアミノ酸配列の例は以下に示される。追加されたアミノ酸は下線で示される。

Ｓ１Ｐ１−ＢＲＩＬ発現コンストラクトの発現産物のアミノ酸配列
ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡＧＡＰＧＰＴＳＶＰＬＶＫＡＨＲＳＳＶＳＤＹＶＮＹＤＩＩＶＲＨＹＮＹＴＧＫＬＮＩＳＡＤＫＥＮＳＩＫＬＴＳＶＶＦＩＬＩＣＣＦＩＩＬＥＮＩＦＶＬＬＴＩＷＫＴＫＫＦＨＲＰＭＹＹＦＩＧＮＬＡＬＳＤＬＬＡＧＶＡＹＴＡＮＬＬＬＳＧＡＴＴＹＫＬＴＰＡＱＷＦＬＲＥＧＳＭＦＶＡＬＳＡＳＶＦＳＬＬＡＩＡＩＥＲＹＩＴＭＬＫＭＫＬＨＮＧＳＮＮＦＲＬＦＬＬＩＳＡＣＷＶＩＳＬＩＬＧＧＬＰＩＭＧＷＮＣＩＳＡＬＳＳＣＳＴＶＬＰＬＹＨＫＨＹＩＬＦＣＴＴＶＦＴＬＬＬＬＳＩＶＩＬＹＣＲＩＹＳＬＶＲＴＲＡＤＬＥＤＮＷＥＴＬＮＤＮＬＫＶＩＥＫＡＤＮＡＡＱＶＫＤＡＬＴＫＭＲＡＡＡＬＤＡＱＫＡＴＰＰＫＬＥＤＫＳＰＤＳＰＥＭＫＤＦＲＨＧＦＤＩＬＶＧＱＩＤＤＡＬＫＬＡＮＥＧＫＶＫＥＡＱＡＡＡＥＱＬＫＴＴＲＮＡＹＩＱＫＹＬＡＳＲＳＳＥＮＶＡＬＬＫＴＶＩＩＶＬＳＶＦＩＡＣＷＡＰＬＦＩＬＬＬＬＤＶＧＣＫＶＫＴＣＤＩＬＦＲＡＥＹＦＬＶＬＡＶＬＮＳＧＴＮＰＩＩＹＴＬＴＮＫＥＭＲＲＡＦＩＲＩＭＧＲＰＬＥＶＬＦＱＧＰＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号６）
Ｓ１Ｐ１レセプター融合発現コンストラクトを含む組換えバクミドＤＮＡは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）バキュロウイルス発現システムのマニュアルに概説されるとおりの標準的なプロトコールを用いて作製された。簡潔には、関心のある遺伝子を含むｐＦａｓｔＢａｃプラスミドがＤＨ１０ｂａｃ細胞に形質転換され、形質転換体が適当な寒天プレート上で色により選択された。前記形質転換体のプレートから白色のコロニーが選択されて、液体培養で増殖された。高分子量組換えバクミドＤＮＡがこれらの細菌の終夜培養から精製された。ＦｕｇｅｎｅＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（Ｓｆ−９）が精製バクミドＤＮＡでトランスフェクションされ、組換えウイルスが４日後に回収された。高力価ストックを製造するための増幅の後，Ｓｆ−９細胞が感染され、４８時間後に分析のために回収された。各クローンの細胞表面発現はフルオロフォア標識抗ＦＬＡＧ抗体を用いるフロー・サイトメトリーにより評価され、レセプター融合タンパク質の適切な折り畳み及び輸送を測定する指標として用いられた.
次に、可溶性タンパク質及び細胞内小器官を除去するためのダウンス型ホモジナイザーによる破砕と、遠心とにより、全膜画分が凍結された全細胞から単離された。

Ｓ１Ｐ１融合パートナータンパク質（Ｓ１Ｐ１融合レセプター）は、以下に詳しく説明するとおり、ドデシル−マルトシド（ＤＤＭ）抽出と、その後のＴａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）上の不動化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）とにより膜から精製された。凍結細胞膜は、室温の溶解バッファーを全体積２５ｍＬになるように添加することにより解凍された。Ｓ１Ｐ１レセプター拮抗薬Ｗ１４６が最終濃度１２５μＭになるように添加された。混合液は、リガンドでレセプターが完全に飽和されることを確実にするために、１時間室温でインキュベーションされ、その後、イオドアセトアミドを１ｍｇ／ｍＬの濃度になるまで添加去れ、さらに４℃で１時間インキュベーションされた。界面活性剤及びヘミこはく酸コレステリル（ＣＨＳ）が０．５％ＤＤＭ、０．１％ＣＨＳの最終濃度になるように添加することにより、レセプターの可溶化は開始された。可溶化バッファーは以下の成分からなる。５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、８００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ イミダゾール、０．１％ＤＤＭ、０．０２％ ＣＨＳ、１２５μＭ Ｗ１４６。可溶化は４℃２時間進行させられ、その後、前記混合液はＴｉ７０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）で３５分間７０，０００ｒｐｍで遠心された。上清は水で洗浄されたＴａｌｏｎスーパーフローＩＭＡＣ樹脂を１ｍＬ再懸濁するために用いられ，懸濁液は４℃終夜インキュベーションされた。Ｔａｌｏｎ樹脂とのインキュベーションの後，前記懸濁液は２５ｍＬのＢｉｏＲａｄ使い捨てカラムに注入され、素通り画分が回収され、その後の解析のために保存された。その後、回収されたＴａｌｏｎ樹脂は、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＤＤＭ、０．０１％ ＣＨＳ、２５０μＭ Ｗ１４６を含むバッファー２０ｍＬで洗浄された。レセプターは２００ｍＭ イミダゾールを添加された前記バッファーで溶出された。

溶出されたタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）と、その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥとにより解析された。簡潔には、各Ｓ１Ｐ１融合パートナータンパク質が、結晶化濃度、例えば、５０ｍｇ／ｍＬに調製され、３０倍に希釈され、ほぼ均一なＳ１Ｐ１融合パートナータンパク質を得るために、サイズ排除クロマトグラフィーを用いてサンプルが分離される、分析的ＨＰＬＣに注入された。Ｓ１Ｐ１−Ｃ末端−Ｔ４Ｌ、Ｓ１Ｐ１−フラボドキシン及びＳ１Ｐ１−ＢｒｉｌというＳ１Ｐ１融合パートナータンパク質は、リガンドの有無に関係なく安定で、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いる解析の波形図（データは示されない）により示されるとおり、５０ｍｇ／ｍＬを超える濃縮後でさえ単分散のままであった。Ｓ１Ｐ１融合パートナータンパク質に対応するＳＥＣ分画は、１０％ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離及び染色で評価され、各Ｓ１Ｐ１融合パートナーはほぼ均一にまで精製可能であることが確認された（データは示されない）。

各Ｓ１Ｐ１融合パートナータンパク質の発現レベルの当初の評価と、その後の小規模精製及びＳＥＣ分析との後、発現レベルが低く，ＳＥＣピークプロフィールが不良のため、Ｓ１Ｐ１−ｃｈｅＡ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＴＱＧ）についての作業は放棄された。Ｓ１Ｐ１−Ｃ末端−Ｔ４Ｌ、Ｓ１Ｐ１−フラボドキシン及びＳ１Ｐ１−Ｂｒｉｌという残りの３種類のコンストラクトは過剰発現去れ、以上に概説されたプロトコールを用いてほぼ均一にまで精製された。

実施例３．β２アドレナリン作動性レセプター融合パートナータンパク質
候補融合パートナーのパネルがそれぞれβ２−アドレナリン作動性レセプター（β２ＡＲ、ｂ２アドレナリン作動性レセプター）内にそれぞれ挿入され、得られた各β２ＡＲ融合パートナータンパク質は発現され、抽出され、精製されて、さまざまなは特性が決定された。β２ＡＲ−Ｔ４Ｌ、β２ＡＲ−Ｃ末端Ｔ４Ｌ、β２ＡＲ−Ｂｒｉｌ、β２ＡＲ−ルブレドキシン、β２ＡＲ−キシラナーゼ及びβ２ＡＲ−フラボドキシンのβ２ＡＲ融合パートナータンパク質について、β２ＡＲ融合体が構築され、発現され、評価された。

β２ＡＲ−Ｔ４Ｌ（ベータ−２アドレナリン作動性レセプター／Ｔ４−リゾチームキメラ ＰＤＢ ＩＤ ３Ｄ４Ｓ）と命名された、Ｔ４−リゾチームに融合されたβ２アドレナリン作動性レセプターの既に解明されたＸ線結晶構造をガイドとして用いて、もとのβ２ＡＲ−Ｔ４Ｌ（すなわち、ＰＤＢ ＩＤ ３Ｄ４Ｓ）中の直接置換する融合Ｔ４Ｌ配列に対応する位置でβ２ＡＲに候補融合パートナーが挿入された。そたがって。接合部位は元のβ２ＡＲ−Ｔ４Ｌと同一のままであった。全ての発現コンストラクトは、Ｎ末端にヘマグルチニンのシグナル配列と、その次のＦＬＡＧ Ｍ２エピトープとを有していた。基本コンストラクトのＣ末端は、精製を容易にするために、元のヒスチジン精製タグをヒスチジン６個から１０個に延長するようにさらに改変された。全てのβ２ＡＲ融合タンパク質をコード化する配列（レセプター融合体遺伝子）は、合成ｃＤＮＡのオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ法により構築され、制限酵素消化と、発現ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１へのライゲーションとによりクローン化された。

発現コンストラクトに使用されるβ２ＡＲのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００００１５．１）
ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡＤＹＫＤＤＤＤＡＭＧＱＰＧＮＧＳＡＦＬＬＡＰＮＲＳＨＡＰＤＨＤＶＴＱＱＲＤＥＶＷＶＶＧＭＧＩＶＭＳＬＩＶＬＡＩＶＦＧＮＶＬＶＩＴＡＩＡＫＦＥＲＬＱＴＶＴＮＹＦＩＴＳＬＡＣＡＤＬＶＭＧＬＡＶＶＰＦＧＡＡＨＩＬＭＫＭＷＴＦＧＮＦＷＣＥＦＷＴＳＩＤＶＬＣＶＴＡＳＩＷＴＬＣＶＩＡＶＤＲＹＦＡＩＴＳＰＦＫＹＱＳＬＬＴＫＮＫＡＲＶＩＩＬＭＶＷＩＶＳＧＬＴＳＦＬＰＩＱＭＨＷＹＲＡＴＨＱＥＡＩＮＣＹＡＥＥＴＣＣＤＦＦＴＮＱＡＹＡＩＡＳＳＩＶＳＦＹＶＰＬＶＩＭＶＦＶＹＳＲＶＦＱＥＡＫＲＱＬ（配列番号７）
β２ＡＲ−Ｔ４Ｌのアミノ酸配列
ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡＤＹＫＤＤＤＤＡＭＧＱＰＧＮＧＳＡＦＬＬＡＰＮＲＳＨＡＰＤＨＤＶＴＱＱＲＤＥＶＷＶＶＧＭＧＩＶＭＳＬＩＶＬＡＩＶＦＧＮＶＬＶＩＴＡＩＡＫＦＥＲＬＱＴＶＴＮＹＦＩＴＳＬＡＣＡＤＬＶＭＧＬＡＶＶＰＦＧＡＡＨＩＬＭＫＭＷＴＦＧＮＦＷＣＥＦＷＴＳＩＤＶＬＣＶＴＡＳＩＷＴＬＣＶＩＡＶＤＲＹＦＡＩＴＳＰＦＫＹＱＳＬＬＴＫＮＫＡＲＶＩＩＬＭＶＷＩＶＳＧＬＴＳＦＬＰＩＱＭＨＷＹＲＡＴＨＱＥＡＩＮＣＹＡＥＥＴＣＣＤＦＦＴＮＱＡＹＡＩＡＳＳＩＶＳＦＹＶＰＬＶＩＭＶＦＶＹＳＲＶＦＱＥＡＫＲＱＬＮＩＦＥＭＬＲＩＤＥＧＬＲＬＫＩＹＫＤＴＥＧＹＹＴＩＧＩＧＨＬＬＴＫＳＰＳＬＮＡＡＫＳＥＬＤＫＡＩＧＲＮＴＮＧＶＩＴＫＤＥＡＥＫＬＦＮＱＤＶＤＡＡＶＲＧＩＬＲＮＡＫＬＫＰＶＹＤＳＬＤＡＶＲＲＡＡＬＩＮＭＶＦＱＭＧＥＴＧＶＡＧＦＴＮＳＬＲＭＬＱＱＫＲＷＤＥＡＡＶＮＬＡＫＳＲＷＹＮＱＴＰＮＲＡＫＲＶＩＴＴＦＲＴＧＴＷＤＡＹＫＦＣＬＫＥＨＫＡＬＫＴＬＧＩＩＭＧＴＦＴＬＣＷＬＰＦＦＩＶＮＩＶＨＶＩＱＤＮＬＩＲＫＥＶＹＩＬＬＮＷＩＧＹＶＮＳＧＦＮＰＬＩＹＣＲＳＰＤＦＲＩＡＦＱＥＬＬＣＬＲＲＳＳＬＫＨＨＨＨＨＨ
（配列番号８）
β２ＡＲ−Ｃ末端Ｔ４Ｌ（Ｈａｎｓｏｎら、２００８参照）のアミノ酸配列
ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡＤＹＫＤＤＤＤＡＭＧＱＰＧＮＧＳＡＦＬＬＡＰＮＲＳＨＡＰＤＨＤＶＴＱＱＲＤＥＶＷＶＶＧＭＧＩＶＭＳＬＩＶＬＡＩＶＦＧＮＶＬＶＩＴＡＩＡＫＦＥＲＬＱＴＶＴＮＹＦＩＴＳＬＡＣＡＤＬＶＭＧＬＡＶＶＰＦＧＡＡＨＩＬＭＫＭＷＴＦＧＮＦＷＣＥＦＷＴＳＩＤＶＬＣＶＴＡＳＩＷＴＬＣＶＩＡＶＤＲＹＦＡＩＴＳＰＦＫＹＱＳＬＬＴＫＮＫＡＲＶＩＩＬＭＶＷＩＶＳＧＬＴＳＦＬＰＩＱＭＨＷＹＲＡＴＨＱＥＡＩＮＣＹＡＥＥＴＣＣＤＦＦＴＮＱＡＹＡＩＡＳＳＩＶＳＦＹＶＰＬＶＩＭＶＦＶＹＳＲＶＦＱＥＡＫＲＱＬＫＤＥＡＥＫＬＦＮＱＤＶＤＡＡＶＲＧＩＬＲＮＡＫＬＫＰＶＹＤＳＬＤＡＶＲＲＡＡＬＩＮＭＶＦＱＭＧＥＴＧＶＡＧＦＴＮＳＬＲＭＬＱＱＫＲＷＤＥＡＡＶＮＬＡＫＳＲＷＹＮＱＴＰＮＲＡＫＲＶＩＴＴＦＲＴＧＴＷＤＡＹＫＮＬＳＧＧＧＧＡＭＤＩＦＥＭＬＲＩＤＥＧＫＦＣＬＫＥＨＫＡＬＫＴＬＧＩＩＭＧＴＦＴＬＣＷＬＰＦＦＩＶＮＩＶＨＶＩＱＤＮＬＩＲＫＥＶＹＩＬＬＮＷＩＧＹＶＮＳＧＦＮＰＬＩＹＣＲＳＰＤＦＲＩＡＦＱＥＬＬＣＬＲＲＳＳＬＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号９）
β２ＡＲ−Ｂｒｉｌのアミノ酸配列
ＰＤＨＤＶＴＱＱＲＤＥＶＷＶＶＧＭＧＩＶＭＳＬＩＶＬＡＩＶＦＧＮＶＬＶＩＴＡＩＡＫＦＥＲＬＱＴＶＴＮＹＦＩＴＳＬＡＣＡＤＬＶＭＧＬＡＶＶＰＦＧＡＡＨＩＬＭＫＷＴＦＧＮＦＷＣＥＦＷＴＳＩＤＶＬＣＶＴＡＳＩＷＴＬＣＶＩＡＶＤＲＹＦＡＩＴＳＰＦＫＹＱＳＬＬＴＫＮＫＡＲＶＩＩＬＭＶＷＩＶＳＧＬＴＳＦＬＰＩＱＭＨＷＹＲＡＴＨＱＥＡＩＮＣＹＡＥＥＴＣＣＤＦＦＴＮＱＡＹＡＩＡＳＳＩＶＳＦＹＶＰＬＶＩＭＶＦＶＹＳＲＶＦＱＥＡＫＲＱＬＡＤＬＥＤＮＷＥＴＬＮＤＮＬＫＶＩＥＫＡＤＮＡＡＱＶＫＤＡＬＴＫＭＲＡＡＡＬＤＡＱＫＡＴＰＰＫＬＥＤＫＳＰＤＳＰＥＭＫＤＦＲＨＧＦＤＩＬＶＧＱＩＤＤＡＬＫＬＡＮＥＧＫＶＫＥＡＱＡＡＡＥＱＬＫＴＴＲＮＡＹＩＱＫＹＬＫＦＣＬＫＥＨＫＡＬＫＴＬＧＩＩＭＧＴＦＴＬＣＷＬＰＦＦＩＶＮＩＶＨＶＩＱＤＮＬＩＲＫＥＶＹＩＬＬＮＷＩＧＹＶＮＳＧＦＮＰＬＩＹＣＲＳＰＤＦＲＩＡＦＱＥＬＬＣＬＲＲＳＳＬＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１０）
β２ＡＲ−ルブレドキシンのアミノ酸配列
ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡＤＹＫＤＤＤＤＡＭＧＱＰＧＮＧＳＡＦＬＬＡＰＮＲＳＨＡＰＤＨＤＶＴＱＱＲＤＥＶＷＶＶＧＭＧＩＶＭＳＬＩＶＬＡＩＶＦＧＮＶＬＶＩＴＡＩＡＫＦＥＲＬＱＴＶＴＮＹＦＩＴＳＬＡＣＡＤＬＶＭＧＬＡＶＶＰＦＧＡＡＨＩＬＭＫＭＷＴＦＧＮＦＷＣＥＦＷＴＳＩＤＶＬＣＶＴＡＳＩＷＴＬＣＶＩＡＶＤＲＹＦＡＩＴＳＰＦＫＹＱＳＬＬＴＫＮＫＡＲＶＩＩＬＭＶＷＩＶＳＧＬＴＳＦＬＰＩＭＨＷＹＲＡＴＨＱＥＡＩＮＣＹＡＥＥＴＣＣＤＦＦＴＮＱＡＹＡＩＡＳＳＩＶＳＦＹＶＰＬＶＩＭＶＦＶＹＳＲＶＦＱＥＡＫＲＱＬＭＫＫＹＴＣＴＶＣＧＹＩＹＮＰＥＤＧＤＰＤＮＧＶＮＰＧＴＤＦＫＤＩＰＤＤＷＶＣＰＬＣＧＶＧＫＤＱＦＥＥＶＥＥＫＦＣＬＫＥＨＫＡＬＫＴＬＧＩＩＭＧＴＦＴＬＣＷＬＰＦＦＩＶＮＩＶＨＶＩＱＤＮＬＩＲＫＥＶＹＩＬＬＮＷＩＧＹＶＮＳＧＦＮＰＬＩＹＣＲＳＰＤＦＲＩＡＦＱＥＬＬＣＬＲＲＳＳＬＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１１）
β２ＡＲ−キシラナーゼのアミノ酸配列
ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡＤＹＫＤＤＤＤＡＭＧＱＰＧＮＧＳＡＦＬＬＡＰＮＲＳＨＡＰＤＨＤＶＴＱＱＲＤＥＶＷＶＶＧＭＧＩＶＭＳＬＩＶＬＡＩＶＦＧＮＶＬＶＩＴＡＩＡＫＦＥＲＬＱＴＶＴＮＹＦＩＴＳＬＡＣＡＤＬＶＭＧＬＡＶＶＰＦＧＡＡＨＩＬＭＫＭＷＴＦＧＮＦＷＣＥＦＷＴＳＩＤＶＬＣＶＴＡＳＩＷＴＬＣＶＩＡＶＤＲＹＦＡＩＴＳＰＦＫＹＱＳＬＬＴＫＮＫＡＲＶＩＩＬＭＶＷＩＶＳＧＬＴＳＦＬＰＩＱＭＨＷＹＲＡＴＨＱＥＡＩＮＣＹＡＥＥＴＣＣＤＦＦＴＮＱＡＹＡＩＡＳＳＩＶＳＦＹＶＰＬＶＩＭＶＦＶＹＳＲＶＦＱＥＡＫＲＱＬＡＳＴＤＹＷＱＮＷＴＦＧＧＧＩＶＮＡＶＮＧＳＧＧＮＹＳＶＮＷＳＮＴＧＮＦＶＶＧＫＧＷＴＴＧＳＰＦＲＴＩＮＹＮＡＧＶＷＡＰＮＧＮＧＹＬＴＬＹＧＷＴＲＳＰＬＩＥＹＹＶＶＤＳＷＧＴＹＲＰＴＧＴＹＫＧＴＶＫＳＤＧＧＴＹＤＩＹＴＴＴＲＹＮＡＰＳＩＤＧＤＤＴＴＦＴＱＹＷＳＶＲＱＳＫＲＰＴＧＳＮＡＴＩＴＦＴＮＨＶＮＡＷＫＳＨＧＭＮＬＧＳＮＷＡＹＱＶＭＡＴＥＧＹＱＳＳＧＳＳＮＶＴＶＷＫＦＣＬＫＥＨＫＡＬＫＴＬＧＩＩＭＧＴＦＴＬＣＷＬＰＦＦＩＶＮＩＶＨＶＩＱＤＮＬＩＲＫＥＶＹＩＬＬＮＷＩＧＹＶＮＳＧＦＮＰＬＩＹＣＲＳＰＤＦＲＩＡＦＱＥＬＬＣＬＲＲＳＳＬＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１２）
β２ＡＲ−フラボドキシンのアミノ酸配列
ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡＤＹＫＤＤＤＤＡＭＧＱＰＧＮＧＳＡＦＬＬＡＰＮＲＳＨＡＰＤＨＤＶＴＱＱＲＤＥＶＷＶＶＧＭＧＩＶＭＳＬＩＶＬＡＩＶＦＧＮＶＬＶＩＴＡＩＡＫＦＥＲＬＱＴＶＴＮＹＦＩＴＳＬＡＣＡＤＬＶＭＧＬＡＶＶＰＦＧＡＡＨＩＬＭＫＭＷＴＦＧＮＦＷＣＥＦＷＴＳＩＤＶＬＣＶＴＡＳＩＷＴＬＣＶＩＡＶＤＲＹＦＡＩＴＳＰＦＫＹＱＳＬＬＴＫＮＫＡＲＶＩＩＬＭＶＷＩＶＳＧＬＴＳＦＬＰＩＱＭＨＷＹＲＡＴＨＱＥＡＩＮＣＹＡＥＥＴＣＣＤＦＦＴＮＱＡＹＡＩＡＳＳＩＶＳＦＹＶＰＬＶＩＭＶＦＶＹＳＲＶＦＱＥＡＫＲＱＬＡＫＡＬＩＶＹＧＳＴＴＧＮＴＥＹＴＡＥＴＩＡＲＥＬＡＤＡＧＹＥＶＤＳＲＤＡＡＳＶＥＡＧＧＬＦＥＧＦＤＬＶＬＬＧＣＳＴＷＧＤＤＳＩＥＬＱＤＤＦＩＰＬＦＤＳＬＥＥＴＧＡＱＧＲＫＶＡＣＦＧＣＧＤＳＳＷＥＹＦＣＧＡＶＤＡＩＥＥＫＬＫＮＬＧＡＥＩＶＱＤＧＬＲＩＤＧＤＰＲＡＡＲＤＤＩＶＧＷＡＨＤＶＲＧＡＩＫＦＣＬＫＥＨＫＡＬＫＴＬＧＩＩＭＧＴＦＴＬＣＷＬＰＦＦＩＶＮＩＶＨＶＩＱＤＮＬＩＲＫＥＶＹＩＬＬＮＷＩＧＹＶＮＳＧＦＮＰＬＩＹＣＲＳＰＤＦＲＩＡＦＱＥＬＬＣＬＲＲＳＳＬＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３）
０．５ｍＭチモロール（リガンド）存在下での０．５％ｗ／ｖＤＤＭ／ＣＭＳ界面活性剤混合液でのインキュベーションと、その後の０．５ｍＭチモロール存在下での不動化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）での精製とにより、各β２ＡＲ融合パートナータンパク質は生体膜から抽出された。安定性と、リガンド結合に対する好ましい応答とを試験するために、同一のプロトコールがリガンド非存在下で用いられた。リガンド結合精製の場合には、タンパク質は少量の第２のＩＭＡＣ樹脂を用いる２次的な精製に供された。

１２．５ｍＬの凍結細胞膜が、２ｍＭチモロールを含む溶解バッファーを全体積２５ｍＬとなるように添加することによって溶解された。混合液は、レセプターがリガンドで完全に飽和することを担保するために４℃１時間インキュベーションされ、その後、イオドアセトアミドを１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように添加してさらに４℃で１時間インキュベーションされた。界面活性剤及びヘミこはく酸コレステリル（ＣＨＳ）が０．５％ＤＤＭ、０．１％ＣＨＳの最終濃度になるように添加することにより、レセプターの可溶化は開始された。可溶化バッファーは以下の成分からなる。５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール、０．１％ＤＤＭ、０．０２％ ＣＨＳ、５００μＭ チモロール。可溶化は４℃２．５時間進行させられ、その後、前記混合液はＴｉ７０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）で３５分間７０，０００ｒｐｍで遠心された。上清は水で洗浄されたＴａｌｏｎスーパーフローＩＭＡＣ樹脂を１ｍＬ再懸濁するために用いられ，懸濁液は４℃終夜インキュベーションされた。Ｔａｌｏｎ樹脂とのインキュベーションの後，前記懸濁液は２５ｍＬのＢｉｏＲａｄ使い捨てカラムに注入され、素通り画分が回収され、その後の解析のために保存された。その後、回収されたＴａｌｏｎ樹脂は、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＤＤＭ、０．０１％ ＣＨＳ、５００μＭ チモロールを含むバッファー２０ｍＬで洗浄された。レセプターは２００ｍＭ イミダゾールを添加された前記バッファーで溶出された。リガンドなしの精製は、全てのバッファーから拮抗薬チモロールを省略して同じステップを行うことにより達成された。

前記ＩＭＡＣ精製から回収された溶出液は、分析的ＳＥＣに注入され、紫外線吸光度及びトリプトファン蛍光による波形が監視された。ピークプロフィールが、レセプター融合タンパク質の収量及び相対的な品質を比較するために用いられた。簡潔には、機能的に折り畳まれたタンパク質の収量は、ピーク下面積を積分し、該面積をウシ血清アルブミンのような既知の濃度及び吸光係数を有する参照標準の面積と比較することによって推定された。タンパク質の品質はタンパク質のＳＥＣピークの単分散性に基づいて推定され、、２次的なピーク又は主ピークの２次的ショルダーがないこと（図１−Ａないし１−Ｅ）、及び、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの電気泳動及び全タンパク質染色（図１−Ｆ）とが、高品質を示す。

図１は、β２ＡＲに挿入された候補融合パートナーのパネルのそれぞれの結果及び特性を示す。図１−Ａないし１−Ｅは、リガンド存在下（黒の波形）と、リガンド非存在下（赤の波形）と、融合体のリガンド結合分子種の２次的精製（緑の波形）とにおける各β２ＡＲ融合パートナータンパク質の抽出及び１次精製に関するＳＥＣデータを示す。

図１−Fは、、左から右に、分子量標準、β２ＡＲ−Ｔ４Ｌ、β２ＡＲ−Ｃ末端Ｔ４Ｌ、β２ＡＲ−Ｂｒｉｌ、β２ＡＲ−ルブレドキシン、β２ＡＲ−キシラナーゼ及びβ２ＡＲ−フラボドキシンの各β２ＡＲ融合パートナータンパク質の最終精製産物の１０％ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

候補融合パートナータンパク質のパネルの当初評価に基づいて、４種類のコンストラクトが大規模発現及び精製後に脂質立方相における結晶化能についてさらに解析するために選択された。大規模発現及び精製後に脂質立方相における結晶化能についてさらに解析された前記４種類のβ２ＡＲ融合パートナータンパク質のうち、β２ＡＲ−Ｂｒｉｌは結晶ヒットの結果が得られた、すなわち、許容可能な結晶が得られた。β２ＡＲ−Ｂｒｉｌ融合パートナータンパク質は、当所の微結晶ヒトがあり、高分解能解説及び構造解読をさらに支持するように最適化された。さらに、β２ＡＲ−キシラナーゼは約５オングストロームの分解能まで回折する結晶を形成することに成功した。

β２ＡＲ−Ｂｒｉｌの発現及び精製は、チモロールの代わりにカラゾロールが含まれることを除いて本明細書に説明されたとおりに実施され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるアッセイで９５％を超える純度のタンパク質サンプルが得られた。得られた精製タンパク質は６０ｍｇ／ｍＬまで濃縮され、最終濃度及び不均一性のレベルを測定するために、分析的ＳＥＣにより解析された（図２−Ａないし２−Ｃ）。次に、精製及び濃縮された材料は、１０％ｗ／ｗコレステロールを含む脂質立方相に再構成された。前記再構成されたタンパク質脂質混合物の少量の分注が９６穴ガラス結晶化プレート上に分配され、結晶化を誘導する可能性のあるバッファー及び試薬で重層された。結晶化を誘導する具体的な試薬は、大きい複屈折結晶が形成されることで判断され（図２−Ｄ）、結晶のトリプトファン蛍光及び回折（図２−Ｆ）により性状がタンパク質であることが確認される。

β２ＡＲ−Ｂｒｉｌ融合パートナータンパク質のＦＲＡＰ研究
β２ＡＲ−ＢｒｉｌのＦＲＡＰ解析は、高分解能の結晶を形成する目的で、代替的な結晶化条件を同定するために実施された。β２ＡＲ−ＢｒｉｌはＣｙ３
蛍光色素（励起約５５０ｎｍ、発光約５７０ｎｍ）で標識された。Ｃｙ３単官能基Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（Ｃｙ３ ＮＨＳ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）がＤＭＦ中の５ｍｇ／ｍＬストック液から、前記精製プロトコールの第２のＩＭＡＣ精製カラムに結合した精製タンパク質に対し、色素／タンパク質のモル比２−５で添加された。得られた溶液は混合され、遮光条件下４℃２−３時間インキュベーションされた。このインキュベーション後、未反応色素は過剰の精製バッファーを用いてカラム洗浄された。カラムは過剰のバッファーの添加によりさらに洗浄され、カラムは暗黒条件下４℃、少なくとも１２時間インキュベーションされた。このインキュベーションの後、タンパク質が結合したカラムは、分光計分析を通じて未反応色素の証拠が全くなくまるまで追加のバッファーで洗浄された。標識されたタンパク質は前記ＩＭＡＣカラムから溶出され、濃縮され、脂質立方相結晶化環境に再構成された。光退色後の蛍光回復（ＦＲＡＰ）が、少量の脂質立方相β２ＡＲ−Ｂｒｉｌ（ＬＣＰ／ｂ２ｂｒｉｌ）材料が結晶化を可能にすると考えられるさまざまな条件でインキュベーションされた後、Ｃｙ３標識β２ＡＲ−Ｂｒｉｌの２次元側方拡散を測定するために用いられた。脂質立方相の結晶化マトリックス内での拡散解析の結果は、既知の結晶化条件が全く存在しない場合に、結晶化のスペースの探索を狭めるのに用いられる場合がある。代替的には、ＦＲＡＰ解析は、より大きな結晶を支持するために、標識タンパク質の回収の百分率を最大化し、拡散速度を最適化することによって、既知の条件を最適化するために用いられる場合がある。β２ＡＲ−Ｂｒｉｌについては、ＦＲＡＰ解析がより高い分解能の結晶を生成するために探索する代替的な結晶化条件を同定するのに用いられた。一部の実施態様では、β２ＡＲ−Ｂｒｌ融合パートナータンパク質は、β２ＡＲｗｔＮ１８７を用いて以上に説明されるとおり調製され、得られたβ２ＡＲ―ＢｒｉｌはＩＭＰＴ−１４９７と命名された。

ＬＣＰ−ＦＲＡＰ ＬＣＰ−ＦＲＡＰ解析用Ｃｙ３標識タンパク質は、ＬＣＰに再構成され、結晶化のセクションで説明されるとおり、ガラスサンドイッチプレート上に分配された。自動化ハイスループットＬＣＰ−ＦＲＡＰ解析のセットアップは、すでに説明された。簡潔には、ＬＣＰサンドイッチプレートは、ＺｅｉｓｓＡｘｉｏＩｍａｇｅｒＡ１蛍光顕微鏡と、Ｍｉｃｒｏｐｏｉｎｔ色素セルレーザー（Ｐｈｏｔｏｎｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）と、冷却ＣＣＤＦｉｒｅＷｉｒｅカメラＣｏｏｌＳｎａｐ ＨＱ２（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｏｒｉｃｓ）と、自動化ＸＹＺ顕微鏡ステージＭＳ−２０００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）とからな特注ＬＣＰ−ＦＲＡＰステーション上に懸架された。各ＬＣＰ液滴は、２５Ｈｘのパルスレートで１５−２０個のレーザーパルスを発光することにより退色させられた。蛍光画像は退色の直前及び直後に撮影された。３０分間の回復期間の後、蛍光回復を決定するために画像が再度撮影され、ＩｍａｇｅＰｒｏＡｄｖａｎｃｅｄ ＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＳｕｉｔｅ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）により解析された。

熱安定性アッセイ Ｎ−［４−（７−ジエチルアミノ−４−メチル−３−クマリンイル）フェニル］マレインイミド（ＣＰＭ）色素は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入さえ、将来の使用のためのストック溶液としてＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）に４ｍｇ／ｍＬに溶解された。前記ストック溶液は−８０℃で保管され、使用前に、色素希釈液（１０ｍＭ バッファー、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．０２５％ ＤＤＭ及び０．００５％ＣＨＳ）に１：４０で希釈された。熱変性アッセイは水晶蛍光測定用キュベット（Ｓｔａｒｎａ Ｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ａｔａｓｃａｄｅｒｏ）中に全体積２００μＬのサンプルで実施された。レセプター（４μｇ）は、最終体積２００μＬまで適当なバッファー液で希釈され、希釈された色素の５μＬがタンパク質溶液に添加され、３０分間４℃でインキュベーションされた。混合液は前記キュベットに移され、Ｃａｒｙ Ｅｘｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計（Ｖａｒｉａｎ、米国）により昇温速度２℃／分でデータが収集された。励起波長は３８７ｎｍで、発光波長は４６３ｎｍであった。全てのアッセイは２０℃から始まり９５℃までの温度範囲で実施された。安定性データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍプログラム（ＰｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）を用いて処理された。溶融温度（Ｔｍ）を決定するために、ボルツマン・シグモイド方程式が前記データに当てはめるために用いられた。

熱安定性 次に、異なるβ２ＡＲコンストラクトの熱安定性が評価された。加熱中のレセプター安定性を維持するために、アッセイは１００μＭのチモロール存在下で実施された。β２ＡＲ−Ｔ４Ｌに対して、β２ＡＲ−フラボドキシン及びβ２ＡＲ−Ｃ末端Ｔ４Ｌは、それぞれ、約９℃及び４℃安定性が悪かった。β２ＡＲキシリナーゼはβ２ＡＲ−Ｔ４Ｌより約３℃安定性が良かったが、β２ＡＲ−ＢＲＩＬ及びβ２ＡＲ−ルブレドキシンは両方ともβ２ＡＲ−Ｔ４Ｌより約８℃安定性が良かった。よって発明者らは、β２ＡＲ―ＢＲＩＬ及びβ２ＡＲルブレドキシンをさらなる結晶化研究用に選択した。

結晶化 膜タンパク質のメソ結晶化法は詳細に説明されている。タンパク質溶液は、モノオレイン：コレステロールが９：１の溶解脂質混合物と、４０％タンパク質ｔ０％脂質の比で特注のシリンジ型混合器で混合される。再構成ＬＣＰを含むシリンジは、自動結晶化ロボット（ＮＴ８−ＬＣＰ、Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ）に懸架され、３５−５０ｎＬのＬＣＰが９６穴ガラスサンドイッチプレート（ＭａｒｉｅｎＦｅｌｄ）に分注され、そのれか、沈澱剤８００ｎＬで重層される。液滴はカバースリップで封止され、自動インキュベーター／イメージャーＲｏｃｋＩｍａｇｅｒ１０００（Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ）中で２０℃でインキュベーション及び撮影される。β２ＡＲ−ＢＲＩＬ及びＡ_２ＡＡＲ−ＢＲＩＬの結晶は両方とも７日以内に成長した。

ＬＣＰ中でのタンパク質の拡散及び結晶化 発明者らは、β２ＡＲ−ＢＲＩＬはジャンクション部位の最適化を要さずに結晶を成長させることができたが、Ａ_２ＡＡＲ−ＢＲＩＬでは必要であった。結晶化のトライアルを先導するために、ＬＣＰ−ＦＲＡＰアッセイはＡ_２ＡＡＲ−ＢＲＩＬと類似のやり方で実施された。タンパク質は、ｐＨ７．５のバッファー中でＣｙ３−モノＮＨＳエステルで標識され、同様に、ＬＣＰ−ＦＲＡＰサンプル調製前に、純度、単分散性及び標識効率について分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）により評価された。４０％（ｗ／ｗ）のタンパク質溶液、５４％（ｗ／ｗ）モノオレイン、６％（ｗ／ｗ）コレステロールの最終比でを、タンパク質溶液を溶解モノオレインと混合することにより、標識されたタンパク質はＬＣＰに再構成され、以前に説明された自家製スクリーンを用いてインキュベーションされた。前記スクリーンのｐＨは、以前のβ２ＡＲ結晶化条件に基づいて、６．７及び８に調節された。３つのｐＨ全部の間で、β２ＡＲ−ＢＲＩＬは、ｐＨ７で最適に移動分画を示したが、これは、特定の沈澱剤を用いると６０％よりも高かった（補足図８ａ）。高い拡散回復性を示す条件は、結晶化トライアル用にさらに最適化された。最適化された結晶は約８０×１５ミクロンまで成長し、２．８オングストロームまで回折した。

Ｘ線データ収集 結晶学的データは、アルゴンヌ国立研究所の先端光子光源の２３ＩＤ−Ｂ／Ｄビームライン（ＧＭ／ＣＡ ＣＡＴ）で、波長１．０３３０オングストロームの１０μｍ集束ミニビームと、ＭａｒＭｏｓａｉｃ３００検出器とを用いて収集された。放射線損傷を低減するために、結晶は、減衰されないビームを用いて、３秒露出で５−１０コマ及び１°の振動の後、可能な場合には新たな位置に平行移動されるか、あるいは、交換された。構造決定のために、ＨＫＬ２０００を用いて５５個のＡ２ＡＡＲ結晶由来のデータセットが、積分、相似変換（ｓｃａｌｅｄ）及び合成された。当初の分子置換解読結果は、Ａ２ＡＡＲ−Ｔ４Ｌ／ＺＭ構造（ＰＤＢコード３ＥＭＬ）のＡ２ＡＡＲ部分を用いてＰｈａｓｅｒにより得られた。ＢＲＩＬ残基は、Ｃｏｏｔ及びＴｅｆｍａｃ５の間で繰り返し循環することにより、過剰なΣＡで重みづけられた２|Ｆｏ|−|Ｆｃ|密度中で手作業で構築され、得られたモデルは、収束するまで同じ手順を用いてさらに精密化された。

β２ＡＲ−Ｂｒｉｌの結晶化条件のさらなる最適化により、抜群の結晶成長及び回折特性（図３−Ａ）をもたらす結晶化補助剤（トリーメチルアミンＮ−オキシド）が同定された。トリーメチルアミンＮ−オキシドが含まれるとき、β２ＡＲ−Ｂｒｉｌ結晶は名目上の分解能２．８オングストロームまでＸ線を回折した（図３−Ｂ）。

実施例４ 候補融合パートナーとのアデノシンＡ２ａレセプター融合パートナータンパク質
候補融合パートナーのパネルがそれぞれアデノシンＡ２ａレセプター（Ａ_２Ａ、「Ａ２Ａ−アデノシンレセプター」、「ＡＤＯＲＡ２Ａ」、「アデノシンＡ_２Ａレセプター」、「Ａ２ａ」ともいう。）に挿入され、得られたそれぞれのＡ_２Ａ融合パートナータンパク質は、発現、抽出及び精製されて、さまざまな特性が測定された。

各Ａ_２Ａ融合パートナーコンストラクトは、ＤＮＡの短鎖オリゴマーがオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ法によって組み合わされる遺伝子合成技術により作製された。その後Ａ_２Ａの各融合パートナーは、レセプターのＮ末端にＦｌａｇエピトープアフィニティータグを、Ｃ末端に１０×ヒスチジンタグを取り込んだ、発現カセットの本願発明者の標準セットにサブクローニングされた。

全てのタンパク質は、上記に説明されたのと実質的に同じプロトコールを用いて、発現、回収及び精製された。Ａ_２Ａ融合パートナータンパク質発現コンストラクトを含む組換えバクミドＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）バキュロウイルス発現システムのマニュアルに概説されるとおりの標準的なプロトコールを用いて生成された。ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（Ｓｆ−９）が精製バクミドＤＮＡでトランスフェクションされ、組換えウイルスが回収され、高力価ストックを生成するように増幅された。Ｓｆ−９細胞が感染され、４８時間後に分析のため回収された。その後、全膜画分が凍結全細胞から単離された。Ａ_２Ａ融合パートナータンパク質（「Ａ２ａレセプター融合体」ともいう。）が、ドデシル−マルトシド（ＤＤＭ）抽出と、その後のＴａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）上での不動化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）とにより膜から精製された。溶出されたタンパク質は、収量及び均一性について電気泳動及び分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより分析された。許容できる高発現レベルを示す、選択されたＡ_２Ａ融合パートナータンパク質コンストラクトが、ＺＭ２４１３８５（拮抗薬）及びＵＫ−４３２０９７（作動薬）という２種類の異なるリガンドの存在下での熱変性アッセイ（ＣＰＭアッセイ）でのＡ_２Ａ融合パートナータンパク質のさらなる解析のために選択された。

以下のＡ_２Ａ融合パートナータンパク質が、作製され、評価された。Ａ_２Ａ−ＢＲＩＬ、Ａ_２Ａ−フラボドキシン、Ａ_２Ａ−Ｔ４ＬＣ末端Ｔ４Ｌリゾチーム断片（Ｔ４ｌ−Ｃ末端、図４では「Ｔ４Ｌ−ｆｒａｇ」と表示）、Ａ_２Ａ−ルブレドキシン、Ａ_２Ａ−キシラナーゼ及びＡ_２Ａ−Ｔ４Ｌ。発現及び精製後、Ａ_２Ａ−融合パートナータンパク質の生物物理学的特徴づけが図４に示されるとおり実施された。溶出されたタンパク質は、収量及び均一性について電気泳動により、単分散性及び均一性について分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより、既知Ａ_２Ａレセプターリガンドの安定性誘導について熱変性アッセイにより、解析された。

図４−Ａは、溶出されたＡ_２Ａ−ＢＲＩＬ、Ａ_２Ａ−フラボドキシン、Ａ_２Ａ−Ｔ４ＬＣ末端（Ｔ４Ｌ−ｆｒａｇ）、Ａ_２Ａ−ルブレドキシン、Ａ_２Ａ−キシラナーゼ及びＡ_２Ａ−Ｔ４Ｌについて、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及び全タンパク質染色を用いる収量及び均一性の解析を示す。図４−Ｂは、Ａ_２Ａ−ＢＲＩＬ、Ａ_２Ａ−フラボドキシン、Ａ_２Ａ−Ｔ４ＬＣ末端（Ｔ４Ｌ−ｆｒａｇ）、Ａ_２Ａ−ルブレドキシン、Ａ_２Ａ−キシラナーゼ及びＡ_２Ａ−Ｔ４Ｌの溶出精製標品の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）のタンパク質レベル（２８０ｎｍでの紫外線吸光度）を示す、分析的サイズ排除クロマトグラフィーによる単分散性及び均一性の解析を示す。

さらなる特徴づけでは、以下の表２に示すとおり、Ａ_２Ａ−融合パートナータンパク質は４０ｍＬ培養で発現させられ、発現レベルが測定され、各Ａ_２Ａ−融合パートナータンパク質の分子量が推測され、該融合パートナーのＮ末端とＣ末端との間の距離と関係づけられた。Ｎ末端とＣ末端との距離が短い、すなわち１０オングストローム未満の融合パートナーは、対応する各Ａ_２Ａ−融合パートナータンパク質についての発現レベルが低いことが示された。

許容できる高発現レベルを示す、選択されたＡ_２Ａ融合パートナータンパク質コンストラクトが、ＺＭ２４１３８５（拮抗薬）及びＵＫ−４３２０９７（作動薬）という２種類の異なるリガンドの存在下での熱変性アッセイ（ＣＰＭアッセイ）でのＡ_２Ａ融合パートナータンパク質のさらなる解析のために選択された。Ａ_２Ａ−ＢＲＩＬ、Ａ_２Ａ−フラボドキシン及びＡ_２Ａ−ルブレドキシンが好ましい特徴に基づいて選択され、Ａ_２Ａ−Ｔ４Ｌが対照として含まれた。各Ａ_２Ａ−融合パートナータンパク質が精製され、各Ａ_２Ａ−融合パートナータンパク質のストック溶液が前記ＺＭ２４１３８５（拮抗薬）及びＵＫ−４３２０９７（作動薬）という２種類のリガンドのそれぞれと組み合わされて、２０ないし９０℃の間での熱変性点について解析された。各Ａ_２Ａ−融合パートナータンパク質には、どの化合物が結合しているかに応じて変化する代表的な熱変性点（Ｔｍ）があった。図４−Ｃは、作動薬ＺＭ２４１２８５存在下でのＡ_２Ａ−ＢＲＩＬ、Ａ_２Ａ−フラボドキシン、Ａ_２Ａ−ルブレドキシン及びＡ_２Ａ−Ｔ４Ｌについての熱変性アッセイの結果を示す。図４−Ｄは、拮抗薬ＵＫ４３２０９７存在下でのＡ_２Ａ−ＢＲＩＬ、Ａ_２Ａ−フラボドキシン、Ａ_２Ａ−ルブレドキシン及びＡ_２Ａ−Ｔ４Ｌについての熱変性アッセイの結果を示す。それぞれの場合で少なくとも１種類の融合パートナーがＡ_２Ａ−Ｔ４Ｌと比較して優れており、Ａ_２Ａ−ＢＲＩＬ及びＡ_２Ａ−ルブレドキシンは、両方のリガンド条件下でＡ_２Ａ−Ｔ４Ｌと同等又は良好な安定性を示した。この分析にもとづき、Ａ_２Ａ−ＢＲＩＬ及びＡ_２Ａ−ルブレドキシンが、大規模発現、精製及び結晶化研究のために選択された。

リガンド結合及び下流シグナル伝達 リガンド結合及び下流シグナル伝達のアッセイは、Ａ２ＡＡＲの機能的活性に対する融合ドメインの効果を試験するために実施された。放射性リガンド結合アッセイが、１Ｍ ＮａＣｌ存在下又は非存在下で、作動薬（ＵＫ４３２０９７）及び拮抗薬（ＺＭ２４１３８５）の両方とともに実施された。融合ドメインは拮抗薬アフィニティーにはほとんど効果がなかったが、ＷＴＡ２ＡＡＲに対して全てのＡ２ＡＡＲキメラについて、作動薬アフィニティーは一貫して増強された。全てのキメラについて、作動薬アフィニティーは１Ｍ ＮａＣｌ存在下で低下した。ｃＡＭＰ蓄積アッセイは、融合ドメインが下流シグナル伝達を阻害したかどうか試験するために、両方のリガンドの存在下で実施された（補足図ＹＹ）。Ａ２ＡＡＲＣ末端Ｔ４Ｌを例外として、各キメラの基礎活性は作動薬又は拮抗薬のいずれかの存在下でほとんど又は全く応答を示さなかった。Ａ２ＡＡＲ−Ｃ末端Ｔ３Ｌは作動薬存在下では５０％シグナル伝達を起こすことができた（対応するリガンド存在下でのＷＴＡ２ＡＡＲによるシグナルが１００％と定義される）。

熱安定性 内在的な柔軟性のため、高い熱安定性はＧＰＣＲｓの結晶化では重要な測定基準である。前記タンパク質に対する融合ドメインの効果を試験するために、蛍光を利用する熱安定性アッセイが実施された。加熱前にレセプターを安定化するために、Ａ２ＡＡＲコンストラクトは、拮抗薬のＺＭ２４１３８５か、作動薬のＵＫ４３２０９７かのいずれかとともにインキュベーションされた。ＺＭ２４１３８５と結合するとき、Ａ２Ａ−ＢＲＩＬ、Ａ２Ａ−フラボドキシン及びＡ２Ａ−ルブレドキシンの全ては互いにほとんど同一の熱遷移温度で、Ａ２ＡＡＲ−Ｔ４Ｌの熱遷移温度より約６℃高かった。ＵＫ４３２０９７と結合するとき、Ａ２Ａ−ＢＲＩＬ及びＡ２Ａ−ルブレドキシンは同様の熱遷移温度を示したが、Ａ２ＡＡＲ−フラボドキシンの遷移温度はＡ２ＡＡＲ−Ｔ４Ｌと比較して１０℃以上低下した。プラスミドの高度に安定化するリガンドが利用可能であることは、結晶化に成功する条件を見つける可能性を高めるため、拮抗薬又は作動薬のいずれと結合したコンフォメーションにおいてもＡ２Ａ−ＢＲＩＬ及びＡ２Ａ−ルブレドキシンの熱安定性が改善したことは、これらのタンパク質を結晶化トライアルのための魅力的な候補にする。Ａ２ＡＡＲ−ＢＲＩＬ及びＡ２ＡＡＲ−ルブレドキシンがさらなる結晶化研究のために選択された。

ジャンクションの最適化 Ｔ４Ｌの挿入のために本来最適化されたジャンクションにもとづいて、ジャンクションのＡ２ＡＡＲ側の界面が選ばれたとき、Ａ２ＡＡＲ−ＢＲＩＬ又はＡ２ＡＡＲ−ルブレドキシンのいずれかを用いる脂質立方相（ＬＣＰ）での当初の結晶化トライアルはまったく結晶を形成しなかった。ここで、Ｎ末端及びＣ末端の間の距離が、Ｔ４Ｌでは１０．１オングストロームで、ＢＲＩＬ（１３．７オングストローム）及びルブレドキシン（１１．６オングストローム）とは異なる。前記界面の２次構造は、３種類のドメインの全ての間でも異なり、Ｔ４Ｌ界面は垂直なα−ヘリックスからなり、ＢＲＩＬは逆平行なα−ヘリックスで、ルブレドキシンはループでできている。これらの考察は、タンパク質の熱安定性を改善するために、ジャンクションのＡ２ＡＡＲ側のもともとの残基を追加又は除去する試験をもたらした。Ａ２ＡＡＲ−ＢＲＩＬ及びＡ２ＡＡＲ−ルブレドキシンの両方の安定性を改善できる複数の代替的なジャンクションが同定された。これらのうち、Ａ２ＡＡＲ−ＢＲＩＬについて最も安定なジャンクションは、ジャンクションのＴＭ６側の残基３個の除去又は添加のいずれかを行うことであり、タンパク質の安定性を約４℃高めた。Ａ２ＡＡＲ−ルブレドキシンについては、最も安定なジャンクションは、ＴＭ５で残基２個追加するか、ＴＭ６で残基３個除去するかであり、両方ともタンパク質の安定性を約４℃高めた。

ＬＣＰにおけるタンパク質の拡散及び結晶化 ＺＭ２４１３８５と複合体を形成した状態の熱安定化Ａ２ＡＡＲ−ＢＲＩＬ及びＡ２ＡＡＲ−ルブレドキシンのコンストラクトは、ハイスループットＬＣＰ−ＦＲＡＰアッセイによりさらに評価された。タンパク質のコアとの干渉を最小にするため、タンパク質はｐＨ７．５でＣｙ３−モノＮＨＳエステルでＮ末端に優占的に標識された。全てのタンパク質サンプルは、ＬＣＰ−ＦＲＡＰサンプル調製前に分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）により、純度、単分散性及び標識効率について評価された。標識されたタンパク質は、タンパク質溶液４０％（ｗ／ｗ）、モノオレイン５４％（ｗ／ｗ）及びコレステロール６％（ｗ／ｗ）の最終比で溶融モノオレインとタンパク質溶液を混合することにより、ＬＣＰ中で再構成され、上記で解説された自家製スクリーンとともにインキュベーションされた。スクリーンのｐＨは、以前のＡ２ＡＡＲ結晶化条件にもとづいて４、５及び６に調整された。３つのｐＨ全てのうち、Ａ２ＡＡＲ−ＢＲＩＬ及びＡ２ＡＡＲ−ルブレドキシンの両方はｐＨ５で最適移動画分を示したが、これは特定の沈澱剤の７０％を超える高さであった。発明者らは、９６穴条件を通じて得られたＡ２ＡＡＲ−ＢＲＩＬの移動画分は、Ａ２ＡＡＲ−ルブレドキシンの移動画分より一貫して高いことを見つけ出し、クエン酸、酒石酸、硝酸及びチオシアン酸を含めて、７０％を超える移動画分回収率になる条件に焦点を当てて、さらなる結晶化トライアルにＡ２ＡＡＲ−ＢＲＩＬで進んだ。各ウェルに０．８μＬの沈澱剤溶液とともにＬＣＰで重層され、ガラスのカバースリップで封止された４０−５０ｎＬのタンパク質を用いて、ＮＴ８−ＬＣＰ結晶化ロボット（Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ）により９６穴ガラスサンドイッチプレート（Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ）中で結晶化トライアルは実行された。（Ｃｈｅｒｅｚｏｖら、２００４、Ｃａｆｆｅｒｙ及びＣｈｅｒｅｚｏｖ、２００９）。２５−２８％（ｖ／ｖ）のＰＥＧ４００、０．０４ないし０．０６Ｍのチオシアン酸ナトリウム、２％（ｖ／ｖ）の２，５−ヘキサンジオール、１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５で、最高の回折品質結晶が７日間以内に得られた。結晶は平均サイズ６０×１０×３μｍまで成長し、１．７オングストロームまで回折した。Ａ２ＡＡＲ−ＢＲＩＬの高分解能結晶構造は１．８オングストロームで解読された。

実施例５ アデノシンＡ２ａレセプター融合パートナータンパク質のｂ５６７ＲＩＬとのコンジュゲート
融合パートナー−ＧＰＣＲタンパク質コンジュゲートは、第３細胞内ループをアポ−シトクロムｂ５６２ＲＩＬで置換することによりアデノシンレセプターで作製され、１．８オングストロームの分解能で構造を解読することを可能にする結晶が得られた。ここでは発明者らは、ヒトＡ２Ａアデノシンレセプター（Ａ２ＡＡＲ）の第３細胞内ループ（ＩＣＬ３）を熱安定化アポシトクロムｂ５６２ＲＩＬ（ＢＲＩＬ）で置換し、高アフィニティーでサブタイプ選択的拮抗薬のＺＭ２４１３８５と複合体を形成した状態のこのキメラタンパク質（「Ａ２ＡＡＲ−ＢＲＩＬ−ΔＣ」という。）の分解能１．８オングストロームでの結晶構造を決定した（表Ｓ１）。

ＺＭ２４１３８５と複合体を形成した状態のＡ２ＡＡＲ−ＢＲＩＬ−ΔＣコンストラクトが、脂質立方相という、コレステロールの豊富な膜様環境で結晶化された。全体的な１．８オングストロームの分解能の構造は、Ａ２ＡＡＲ−Ｔ４Ｌ−ΔＣ／ＺＭ２４１３８５の本来の結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ ３ＥＭＬ、２．６オングストロームの分解能）とほぼ同一で、Ａ２ＡＡＲの８２％にわたる全原子ＲＭＳＤ＝０．４４オングストロームであり、熱安定化突然変異体Ａ２ＡＡＲ／ＺＭ２４１３８５の構造（ＰＤＢ ＩＤ ３ＰＷＨ、３．３オングストローム）ともほぼ同一で、Ａ２ＡＡＲの８４％にわたるＲＭＳＤ＝０．７０オングストロームであった。Ａ２ＡＡＲの全ての不活性状態の構造では欠落している細胞外ループ２（ＥＣＬ２）の遠位部分が完全に解読される。ＢＲＩＬジャンクション部位近傍のＶ及びＶＩヘリックスの細胞質端のコンフォメーションは、Ａ２ＡＡＲ−Ｔ４Ｌ−ΔＣ／ＺＭ２４１３８５におけるＴ４Ｌによって生じたコンフォメーションの変形とは対照的に、未改変ＩＣＬ３を有するＡ２ＡＡＲ構造でのコンフォメーションによく似ている。

前記１．８オングストロームの構造は、レセプターあたり２３個の秩序立った脂質鎖と、３個のコレステロールとを含む。一緒になって、これらは各タンパク質分子の周囲にほぼ完全な脂質２重層を形成し、結晶の接触を仲介する。細胞外側の脂質は電子密度がより強く、より秩序がよいように見える。この構造のコレステロール３個全てがレセプターの細胞外側半分に結合し、他の脂質のＢ−因子（４３ないし７５平方オングストローム）と比較してＢ−因子が低い（２５ないし２７平方オングストローム）。これらのコレステロールのうち２個（ＣＬＲ１及びＣＬＲ３）は、対称性と関係するレセプターに結合し、フェース・ツー・フェース（ｆａｃｅ ｔｏ ｆａｃｅ）相互作用を形成することによって結晶格子パッキングを仲介する。第３のコレステロール分子（ＣＬＲ２）は結晶のコンタクトに参加しない。興味深いことには、ＣＬＲ２及びＣＬＲ３がヘリックスＶＩの沿った疎水性の溝を占め、これらのコレステロールに挟まれたＰｈｅ２５５６．５７の芳香環と広いコンタクトを形成する（図３Ｃ）。イソロイシン、バリン又はフェニルアラニンというこの構造で観察されるタイプのスタッキング相互作用を全て補助できる疎水性残基として、レセプターのアデノシンファミリーでは位置６．５７は保存される。さらに、ＣＬＲ２はセリン２６３の主鎖カルボキシル基と水素結合（２．６オングストローム）を形成し、ＣＬＲ３のヒドロキシル基はＥＣＬ３のＣｙｓ２５９のイオウと極性相互作用（４．０オングストローム）をするが、ＥＣＬ３はＣｙｓ２５９とＣｙｓ２６２のジスルフィド結合によって安定化されるループである。ヘリックスＶＩのこの領域のコレステロールによる特異的結合及びコンフォメーション安定化は、本レセプターのリガンド結合ポケット内のＡｓｎ２５３６．５５側鎖の位置を固定することによって、Ａ２ＡＡＲにおいて機能的役割を果たす場合がある。この鍵となる残基は、全てのアデノシンレセプターに存在し、作動薬及び拮抗薬の両方の複合体におけるリガンドの中心コアの環外アミン基を固定する。

Ａ２ＡＡＲ−ＢＲＩＬ−ΔＣのＤＮＡは、５’末端にＡｓｃＩ、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩの制限部位を有するＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成された。野生型ヒトＡ２ＡＡＲと、ＢＲＩＬとよばれる大腸菌由来熱安定化アポシトクロムｂ５６２（Ｍ７Ｗ、Ｈ１０２Ｉ、Ｋ１０６Ｌ）という配列にもとづき、以下の特徴を含む。（ａ）ＢＲＩＬのＡｌａ１ないしＬｅｕ１０６の残基が、Ａ２ＡＡＲのＩＣＬ３領域内のＬｙｓ２０９ないしＧｌｙ２１８の間に挿入された。（ｂ）Ａ２ＡＡＲのＣ末端残基３１７−４１２は切り取られた。ｐＦａｓｔＢａｃ１−８３０４００と命名される発現ベクターは、ＢａｍＨＩが隣接するＨＡシグナル配列と、その後のＮ末端のＦＬＡＧタグ及びＣ末端の１０×Ｈｉｓタグとを有する、発現カセットを含む改変ｐＦａｓｔＢａｃ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。前記発現カセットの要素は、標準的なＰＣＲ法を利用する部位特異的突然変異を用いて導入された。前記発現カセットは、合成されたＡ２ＡＡＲ−ＢＲＩＬ−ΔＣのＤＮＡの標準的な制限酵素消化及びその後のライゲーションを可能にするＡｓｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ対応制限部位も含んだ。

生化学てき特徴づけのために、全てのコンストラクトはＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いてｐＦａｓｔＢａｃ１−８３０４００発現ベクターから消化された。消化後、インサートは内在的制限部位ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐｃＤＮＡ３．１（−）にサブクローニングされ、その配列が確認された。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ新生仔血清（ＮＣＳ）、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０ＩＵ／ｍＬペニシリンが添加されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる培養液中で３７℃、７％ＣＯ２で増殖された。細胞は週２回１：１５の比で１０ｃｍ径のプレート上に継代された。細胞はリン酸カルシウム沈澱法（４０）を用いて示されたプラスミド（各１０μｇ）でトランスフェクションされた。全ての実験はトランスフェクション後４８時間で実施された。細胞表面のレセプター測定及び酵素結合免疫吸着アッセイ トランスフェクションの２４時間後に、細胞はポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた９６穴プレートにウェルあたり１０５個の細胞密度で分配された。さらに２４時間後、細胞表面レセプターは培養液中のマウス抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）１次抗体（Ｓｉｇｍａ、１：１０００）で２０分間２７℃で標識された。その後細胞は、２５ｍＭＨＥＰＥＳが添加されたＤＭＥＭで１回洗浄され、セイヨウカラシペロキシダーゼをコンジュゲートされた、ヤギで作製された抗マウスＩｇＧ（Ｂｒｕｎｓｗｉｇ）（１：５０００）が添加された培養液中でさらに３０分間３７℃でインキュベーションされた。前記細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄された。最後に、前記細胞は３，３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とともに５分間遮光室温でインキュベーションされた。反応は、１Ｍ Ｈ３ＰＯ４で停止され、５分間後に４５０ｎｍでの吸光度がＶＩＣＴＯＲ２プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて計測された。２次抗体又は１次抗体が添加されない対照実験が実施された。両方の場合で吸光度は観察されなかった。

ＨＥＫ２９３細胞膜を用いる競合結合アッセイ ［３Ｈ］ＺＭ２４１３８５（２７．４Ｃｉ／ミリモル）がＡＲＣ Ｉｎｃ．社（米国、ミズーリ州、セントルイス）から入手された。ＺＭ２４１３８５及びＣＧＳ２１６８０はＡｓｃｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（英国、ブリストル）から入手され、ＵＫ４３２０９７はＡｘｏｎ（オランダ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ）から入手された。その他の材料は商業的な入手先から購入され、入手可能な最高純度であった。ＨＥＫ２９３細胞は、上記のとおり増殖され、トランスフェクションされた。膜は以下のとおり調製された。トランスフェクションの４８時間後、細胞は５ｍＬＰＢＳにかきとることによりプレートから発明がされ、回収され、７００×ｇ（毎分３０００回転）５分間で遠心された。プレート（１０ｃｍ径）８枚に由来するペレットがプールされ、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む氷冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーｐＨ７．４の８ｍＬに再懸濁された。ＵｌｔｒａＴｈｕｒｒａｘが細胞懸濁液を破砕するのに用いられた。膜及び細胞質画分はＮｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ ＬＥ−８０Ｋ超遠心機で４℃２０分間１００，０００×ｇ（毎分３１，０００回転）の遠心により分離された。ペレットは、４ｍＬのＴｒｉｓバッファーに再懸濁され、破砕及び遠心のステップが繰り返された。Ｔｒｉｓバッファー（２ｍＬ）が前記ペレットを再懸濁するのに用いられ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）が内在性アデノシンを分解するために添加された（０．８ＩＵ／ｍＬ）。膜は２５０μＬの分注にして−８０℃で保存された。膜タンパク質濃度は、ＮＣＡ（ビシンコニン酸）法を用いて測定された。競合結合実験のためには、放射性リガンド不足を防ぐため、全結合が添加された放射活性の１０％未満であることを確保するように、２５μｇの膜が最初１点実験に用いられ、その後、６ないし２０μｇのタンパク質が曲線全体の実験に用いられた。膜の分注は、アッセイバッファー（５ｍＭのＭｇＣｌ２が添加された５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）全体積１００μＬ中で２５℃２時間インキュベーションされた。放射性リガンド置換実験は、１Ｍ ＮａＣｌの非存在下及び存在下で、競合リガンド（ＺＭ２４１３８５又はＵＫ４３２０９７）の５種類の濃度を用いて実施された。［３Ｈ］ＺＭ２４１３８５は約４．０ｎｍの濃度で使用された。比特異的結合は１００μＭのＣＧＳ２１６８０存在下で測定され、全結合の１０％未満であった。Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅハーベスター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いる、結合及び遊離放射性リガンドを分離するために９６穴ＧＦ／Ｂフィルタープレートを通す迅速真空濾過によりインキュベーションは停止された。その後フィルターは、氷冷洗浄バッファー（５ｍＭ ＭｇＣｌ２が添加された５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄された。フィルターに結合した放射活性は、ＰＥ１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｗａｌｌａｃ Ｔｒｉｌｕｘシンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてシンチレーション分光計測法に測定された。

細胞内ｃＡＭＰ測定による下流シグナル伝達の証明 ＨＥＫ２９３細胞は上記のとおり増殖及びトランスフェクションされた。細胞はトランスフェクションの４８時間後に回収され、産生されたｃＡＭＰ量は推奨されたプロトコールに従って、ＬＡＮＣＥ Ｕｌｔｒａ ｃＡＭＰ３８４キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定された。簡潔には、ウェルあたり４０００個の細胞が、刺激バッファー（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ ＢＳＡ、５０μＭ ロリプラム、５０μＭ シロスタミド及び０．８ＩＵ／ｍＬ ＡＤＡが添加されたＰＢＳ）中で３０分間３７℃で、ＺＭ２４１３８５（１００ｎＭ、約１００×Ｋｉ）非存在下又は存在下でのＵＫ４３２０９７（３０ｎＭ、約ＥＣ８０）か、ＺＭ２４１３８５（１００ｎＭ）単独かの単一濃度でプレインキュベーションされた。その後、製造者の指示書にしたがって検出及び抗体溶液が添加され、そして、１時間室温遮光条件でインキュベーションされた。発生した蛍光強度は、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）マルチラベルリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、オランダ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ）で定量化された。

Ｓｆ９細胞でのレセプター発現及び精製 高力価組換えバキュロウイルス（ｍＬあたりウイルス粒子１０^８個を超える）がＢａｃ ｔｏ Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて得られた。簡潔には、組換えバキュロウイルスは、３μＬのＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）及びトランスフェクション培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（Ｓｆ９）に標的遺伝子配列を含む組換えバクミド５μｇをトランスフェクションすることにより生成された。細胞懸濁液は、２７℃で振盪しながら４日間インキュベーションされた。Ｐ０ウイルスストックは４日後に単離され、高力価バキュロウイルスストックを作製するために用いられた。ウイルス力価は、細胞をｇｐ６４−ＰＥ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で染色後フロー・サイトメトリー法により実施された（４２）。２−３×１０^６個／ｍＬの密度のＳｆ９細胞はＰ２ウイルスとともにＭＯＩ（感染多重度）３で感染された。細胞は感染４８時間後に遠心により回収され、使用時まで−８０℃で保存された。１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭ ＫＣｌ及びＥＤＴＡ不含完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む低張バッファー中で凍結細胞ペレットを解凍することにより、昆虫細胞膜は破壊された。単離された生の膜の大規模洗浄が、可溶性タンパク質及び膜会合タンパク質を除去するために、同一の低張バッファー中でのダウンス破砕及び遠心の繰り返し（約２−３回）と、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭ ＫＣｌを含む高浸透圧バッファー中でのダウンス破砕及び遠心の繰り返し（約３−４回）とによって実施された。精製された膜は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭ ＫＣｌ及び４０％グリセロール中で再懸濁され、液体窒素中で瞬間凍結され、さらなる使用まで−８０℃で保存された。可溶化の前に、精製された膜が、４ｍＭ テオフィリン（Ｓｉｇｍａ）、２．０ｍｇ／ｍＬ イオドアセタミド（Ｓｉｇｍａ）及びＥＤＴＡ不含完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）の存在下氷上で解凍された。３０分間４℃のインキュベーション後、膜は０．５％（ｗ／ｖ）ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＤＭ）（Ａｎａｔｒａｃｅ）及び０．１％（ｗ／ｖ）ヘミこはく酸コレステリル（ＣＨＳ）（Ｓｉｇｍａ）存在下で２．５−４時間４℃インキュベーションにより可溶化された。可溶化されない物質は１５０，０００×ｇ、４５分間の遠心により除去された。上清は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、８００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ、０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＳ及び２０ｍＭ イミダゾールを含むバッファー中のＴＡＬＯＮ ＩＭＡＣ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とともにインキュベーションされた。終夜結合後、前記樹脂は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、８００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、２５ｍＭ イミダゾール、０．１％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＣＤＨ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、９ｍＭ ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）及び２５μＭ ＺＭ２４１３８５（Ｔｏｃｒｉｓ、ＤＭＳＯ中の１００ｍＭストックとして調製）のカラム体積の１０倍で洗浄され、その後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、８００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５０ｍＭ イミダゾール、０．０５％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ、０．０１％（ｗ／ｖ）ＣＨＳ及び２０μＭ ＺＭ２４１３８５のカラム体積の４倍で洗浄された。前記レセプターは、最少体積の２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、８００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２２０ｍＭ イミダゾール、０．０２５％（ｗ／ｖ）ＤＤＭ、０．００５％（ｗ／ｖ）ＣＨＳ及び２５μＭ ＺＭ２４１３８５で溶出された。ＺＭ２４１３８５存在下で精製されたレセプターは、１００ｋＤａ分子量カットオフのＶｉｖａｓｐｅｉｎ濃縮器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、約０．４ｍｇ／ｍＬから６０ｍｇ／ｍＬまで濃縮された。レセプターの純度及び単分散性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）を用いて追跡された。

結晶化 ＺＭ２４１３８５との複合体を形成したＡ２ＡＡＲ−ＢＲＩＬ−ΔＣのタンパク質サンプルは、機械的シリンジ混合器を用いて溶融脂質と混合することにより、脂質立方相（ＬＣＰ）内に再構成された。タンパク質−ＬＣＰ混合液は、４０％（ｗ／ｗ）タンパク質溶液、５４％（ｗ／ｗ）モノオレイン（Ｓｉｇｍａ）及び６％（ｗ／ｗ）コレステロール（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を含んだ。結晶化トライアルは、各ウェルに０．８μＬの沈澱剤溶液で重層され、ガラスのカバースリップで封止された、４０−５０ｎＬのタンパク質を含むＬＣＰを用いるＮＴ８−ＬＣＰ結晶化ロボット（Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ）により９６穴ガラスサンドイッチプレート（Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ）中で実施された。ＬＣＰ中でのタンパク質再構成及び結晶化のトライアルは、室温（約２１−２３℃）で実施された。結晶化プレートは、２０℃のインキュベーター／イメージャー（ＲＯｃｋＩｍａｇｅｒ １０００、Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ）内で保存及び撮影された。平均サイズ６０×１０×３μＭの回折品質の結晶は、２５−２８％（ｖ／ｖ） ＰＥＧ４００、０．０４ないし０．０６Ｍ チオシアン酸ナトリウム、２％（ｖ／ｖ）２，５−ヘキサンジオール、１００ｍＭ クエン酸ナトリウムＰＨＡ５．０中で７日以内に得られた。結晶は、５０μＭのＭｉＴｅＧｅｎマイクロマウントを用いてＬＣＰから直接回収され、追加の結晶保護剤を添加することなく液体窒素内で直ちに瞬間凍結された。

Ｘ線データ収集及び処理 結晶学的データはアルゴンヌ国立研究所の先端光子光源の２３ＩＤ−Ｂ／Ｄビームライン（ＧＭ／ＣＡ ＣＡＴ）で、波長１．０３３０オングストロームの１０μｍ集束ミニビームと、ＭａｒＭｏｓａｉｃ３００検出器とを用いて収集された。放射線損傷を低減するために、結晶は、減衰されないビームを用いて、３秒露出で５コマ及び０．５°の振動の後、可能な場合には新たな位置に平行移動されるか、あるいは、交換された。ＨＫＬ２０００を用いて５５個のデータセットが、積分、相似変換（ｓｃａｌｅｄ）及び合成された。

構造決定及び精密化 当初の分子置換解読結果は、Ａ２ＡＡＲ−Ｔ４Ｌ−ΔＣ／ＺＭ構造（ＰＤＢコード３ＥＭＬ）のＡ２ＡＡＲドメインを探索モデルとして用いてＰｈａｓｅｒにより得られた。ＢＲＩＬ残基は、Ｃｏｏｔ及びＴｅｆｍａｃ５の間で繰り返し循環することにより、過剰なΣＡで重みづけられた２|Ｆｏ|−|Ｆｃ|密度中で手作業で構築され、得られたモデルは、収束するまで同じ手順を用いてさらに精密化された。全てのコレステロールについて観察された優秀な電子密度が、このタイプの分子を他のタンパク質に結合した脂質を信頼可能なように区別することと、これらの確信のある配置及び配向を可能にした（図３Ｃ、Ｄ）。しかし、他の脂質についての電子密度は、一義的にこれらの頭部（ｈｅａｄｇｒｏｕｐ）を同定するのに十分明確ではなかった。そこで、結晶化に用いられた主要な脂質成分であるモノオレイン（ＯＬＣ）とよく適合した数個を例外として、タンパク質の疎水性表面近傍の細長い電子密度のチューブのたいていは、オレイン酸（ＯＬＡ）としてモデル化された。データ収集及び精密化の統計は表Ｓ１に示される。

実施例６ 候補融合パートナーとのオピオイドレセプター融合パートナータンパク質
候補融合パートナーのパネルがそれぞれオピオイドレセプター１（ＮＯＰ１）に挿入され、それぞれの得られたＮＯＰ１−融合パートナータンパク質が、さまざまな特性を測定するために、発現、抽出及び精製された。ＮＯＰ１は、融合パートナーのＢｒｉｌ（ＢＲＩＬ、ｂＲＩＬ）、フラボドキシン、Ｃ末端−Ｔ４Ｌ、ルブレドキシン、キシリナーゼ及びＴ４Ｌ（対照）との以下に説明される研究のための融合パートナータンパク質を準備するために用いられた。

各ＮＯＰ１−融合パートナーコンストラクトは、ＤＮＡの短鎖オリゴマーがオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ法により組み合わされる遺伝子合成技術により作製された。その後、ＮＯＰ１についての各融合パートナーは、レセプターのＮ末端にＦｌａｇエピトープアフィニティータグを、Ｃ末端に１０×ヒスチジンタグを取り込んだ、発現カセットの本願発明者の標準セットにサブクローニングされた。

発現結果の予備的な解析は、ＮＯＰ１−フラボドキシン融合パートナータンパク質（ＮＯＰ１−フラボドキシン）は最高レベルの発現との結果であった。ＮＯＰ１−ＢＲＩＬは２番目に高い発現レベルであった。

全ての融合タンパク質は、実質的に同じプロトコールを用いて、発現、回収及び精製された。ＮＯＰ１レセプター融合発現コンストラクトを含む組換えバクミドＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）バキュロウイルス発現システムのマニュアルに概説されるとおりの標準的なプロトコールを用いて生成された。ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（Ｓｆ−９）が精製バクミドＤＮＡでトランスフェクションされ、組換えウイルスが回収され、高力価ストックを生成するように増幅された。Ｓｆ−９細胞が感染され、４８時間後に分析のため回収された。その後、全膜画分が凍結全細胞から単離された。ＮＯＰ１融合パートナータンパク質が、ドデシル−マルトシド（ＤＤＭ）抽出と、その後のＴａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）上での不動化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）とにより膜から精製された。溶出されたタンパク質は、収量及び均一性についてレセプターのＮ末端のＦｌａｇエピトープに対する抗体を利用するウェスタンブロット法を用いる１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での電気泳動により分析され（図６−Ａ）、単分散性について分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）により分析された（図６−Ｂ）。

抗Ｆｌａｇ抗体を利用するウェスタンブロット法を用いる１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルと、分析的ＳＥＣとの解析は、融合パートナーとしての完全長Ｔ４Ｌの挿入は、野生型ＮＯＰ１と比較して前記コンストラクト（ＮＯＰ１−Ｔ４Ｌをコード化するコンストラクト）の発現が有意に低く、単分散性が悪いという結果をもたらし、これらは両方ともコンストラクトの安定性が低いことを示す。これに対し、ＮＯＰ１−フラボドキシン及びＮＯＰ１−ｂＲＩＬのコンストラクトは、発現レベルが有意に高く（図６−Ａ）、単分散性が改善する（図６−Ｂ）。

図７に示すとおり、熱遷移温度を測定するためにコンストラクトは熱変性アッセイで解析された。完全長ＮＯＰ１−Ｔ４Ｌ対照と、代替的な融合タンパク質のＮＯＰ１−フラボドキシン及びＮＯＰ１−ｂＲＩＬとの比較は、フラボドキシン及びｂＲＩＬの代替的融合パートナーの両方の安定性がより高いことを示す（図７−Ａ）。融合パートナーとしての完全長Ｔ４Ｌは、Ｔ４ＬがＮＯＰ１に挿入されるジャンクションの位置に関係なく、野生型に対してＴｍが１０℃低下するようにみえるが（図７−Ｂ）、対照的に、ＮＯＰ１−フラボドキシンもＮＯＰ１−ｂＲＩＬも遷移温度への負の効果はなかった（図７−Ａ）。

ジャンクションの最適化 第３細胞内ループのコンテキストでの融合パートナーの最適な配置についての当初の推測は、例えばＮＯＰ１のような新たなレセプター標的を椎弓するときにはしばしば理想的ではないことが考慮された。当初の発現及びａＳＥＣ結果にもとづいて、フラボドキシンが、レセプターと融合タンパク質との間のジャンクション部位の最適化を探索するための良い候補として選択された。Ｎ末端Ｆｌａｇエピトープのウェスタンブロットと組み合わされたＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析にもとづいてえ、最適なフラボドキシンの配置は、安定性が悪いことを示す高分子量のオリゴマー分子種の消失によって検出できることが見いだされた（図７−Ａ）。

実施例７ ケモカインＣＣＲ５レセプター融合パートナータンパク質
ケモカインレセプターＣＣＲ５が、融合パートナーのＢｒｉｌ（ｃｙｔＢ、ＢＲＩＬ、ｂＲＩＬ）、フラボドキシン、Ｃ末端−Ｔ４Ｌ、ルブレドキシン、キシリナーゼ及びＴ４Ｌ（対照）との以下に説明される研究のための融合パートナータンパク質を準備するために用いられた。

各ＣＣＲ５−融合パートナーコンストラクトは、ＤＮＡの短鎖オリゴマーがオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ法により組み合わされる遺伝子合成技術により作製された。その後、ＣＣＲ５についての各融合パートナーは、レセプターのＮ末端にＦｌａｇエピトープアフィニティータグを、Ｃ末端に１０×ヒスチジンタグを取り込んだ、発現カセットの本願発明者の標準セットにサブクローニングされた。

発現結果の予備的な解析は、ＣＣＲ５−ルブレドキシン及びＣＣＲ５−Ｔ４Ｌが最高レベルの発現との結果であった（図８−Ａ）。

全ての融合タンパク質は、実質的に同じプロトコールを用いて、発現、回収及び精製された。ＣＲ５レセプター融合発現コンストラクトを含む組換えバクミドＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）バキュロウイルス発現システムのマニュアルに概説されるとおりの標準的なプロトコールを用いて生成された。ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（Ｓｆ−９）が精製バクミドＤＮＡでトランスフェクションされ、組換えウイルスが回収され、高力価ストックを生成するように増幅された。Ｓｆ−９細胞が感染され、４８時間後に分析のため回収された。その後、全膜画分が凍結全細胞から単離された。ＣＣＲ５融合パートナータンパク質が、ドデシル−マルトシド（ＤＤＭ）抽出と、その後のＴａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）上での不動化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）とにより膜から精製された。溶出されたタンパク質は、収量及び均一性についてレセプターのＮ末端のＦｌａｇエピトープに対する抗体を利用するウェスタンブロット法を用いる１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での電気泳動により分析され（図８−Ａ）、単分散性について分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）により分析された（図８−Ｂ）。

抗Ｆｌａｇ抗体を利用するウェスタンブロット法を用いる１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルと、分析的ＳＥＣとの解析は、完全長Ｔ４Ｌの挿入は、野生型と比較して発現が有意に低く、単分散性が悪いという結果をもたらし、これらは両方ともコンストラクトの安定性が低いことを示す。これに対し、ＣＣＲ５−ルブレドキシン及びＣＣＲ５−Ｃ末端Ｔ４Ｌタンパク質は、発現レベルが有意に高く（図８−Ａ）、単分散性が改善する（図８−Ｂ）。

実施例８ ＢＲＩＬとコンジュゲートされたノシセプチン／オルファニンＦＱペプチドレセプターＦｕｓｉｏｐｎパートナータンパク質
ノシセプチン／オルファニンＦＱ（Ｎ／ＯＦＱ）ペプチド（ＮＯＰ）レセプターがＢａｎｙｕコンパウンド−２４（Ｃ−２４）由来の低分子拮抗薬との複合体状態で解読され、リガンドレセプター認識及び選択性の原子レベルの詳細を明かにした。Ｃ−２４はＮ／ＯＦＱの近縁誘導体である、ＮＯＰ選択的ペプチド拮抗薬ＵＦＰ−１０１の最初の４個のＮ末端残基を模倣する。ｈＮＯＰのＮ末端が、熱安定化アポシトクロムｂ５６２ＲＩＬ（ＢＲＩＬ）と置換され、コンパウンド−２４（Ｃ−２４）との複合体状態でのこのレセプター融合体のＸ線結晶構造が決定された。Ｃ−２４はレセプターに与える熱安定性にもとづいて、ｈＮＯＰ−ＢＲＩＬコンストラクトとの共結晶化のために選択された。ＢＲＩＬ−ΔＮ−ｈＮＯＰ−ΔＣ融合タンパク質も他のリガンド存在下で結晶化に成功した。

ＢＲＩＬ−ΔＮ−ｈＮＯＰ−ΔＣ 脂質立方相（ＬＣＰ）で成長する膜タンパク質と一致して、ＢＲＩＬ−ΔＮ−ｈＮＯＰ−ΔＣ融合タンパク質は層状Ｉ型結晶パッキング格子（ｌａｙｅｒｅｄ ｔｙｐｅ Ｉ ｃｒｙｓｔａｌ ｐａｃｋｉｎｇ ｌａｔｔｉｃｅ）を形成する。Ｐ２１格子の非対称ユニット内に２個の逆平行なレセプター分子があり、ＮＲＩＬドメインの１つは無秩序性（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）があるが、第２のドメインは隣接する層からの２個のレセプターと結晶格子接触を形成する。前記２個のレセプターの電子密度は、解読されたＢＲＩＬ融合ドメインと比較するとき、Ｂ−因子も低く優秀であった（ｈＮＯＰ：Ａ＝５２．７、ｈＮＯＰ：Ｂ＝５２．３に対し、ＢＲＩＬ＝８２．４平方オングストローム）。前記２個のｈＮＯＰ分子の膜貫通（ＴＭ）コアはＣαＲＭＳＤの０．６オングストロームとほぼ同一である。

Claims (41)

1. Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）融合パートナータンパク質を含む組成物であって、
   該タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、
   （ｉ）前記ＧＰＣＲの第１膜貫通ドメインないし第５膜貫通ドメインを含む、ＧＰＣＲの部分を含む第１のドメインと、
   （ｉｉ）ルブレドキシン、シトクロムｂ５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ）、フラボドキシン、キシラナーゼ又はＴ４リゾチームのＣ末端断片からなるリストから選択されるタンパク質と少なくとも９０％の相同性がある融合パートナーのアミノ酸配列を含む、第２のドメインと、
   （ｉｉｉ）前記ＧＰＣＲの第６膜貫通ドメインと第７膜貫通ドメインとを含む、第３のドメインとを含む、組成物。
2. Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）融合パートナータンパク質を含む組成物であって、
   該タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、
   （ｉ）ＧＰＣＲを含む第１のドメインと、
   （ｉｉ）ルブレドキシン、シトクロムｂ５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ）、フラボドキシン、キシラナーゼ又はＴ４リゾチームのＣ末端断片からなるリストから選択されるタンパク質と少なくとも９０％の相同性がある融合パートナーのアミノ酸配列を含む、第２のドメインとを含む、組成物。
3. ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を含む組成物であって、
   該タンパク質はＮ末端からＣ末端まで、
   （ｉ）ルブレドキシン、シトクロムｂ５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ）、フラボドキシン、キシラナーゼ又はＴ４リゾチームのＣ末端断片からなるリストから選択されるタンパク質と少なくとも９０％の相同性がある融合パートナーのアミノ酸配列を含む、第１のドメインと、
   （ｉｉ）ＧＰＣＲを含む第２のドメインとを含む、組成物。
4. ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を含む組成物であって、
   該タンパク質はＮ末端からＣ末端まで、
   （ｉ）前記ＧＰＣＲの第１膜貫通ドメインないし第５膜貫通ドメインを含む、ＧＰＣＲの部分を含む第１のドメインと、
   （ｉｉ）２ｒｈｆ、２ｅｈｓ、２ｉｐ６、３ｉ７ｍ、１ｘ３ｏ、１ｕ８４、１ｈ７５、２ｈｕｊ、１ｙｓｑ、３ｌｓ０、２ｑｒ３、１ｚｕｈ、２ｂ８ｉ、２ｃｇｑ、３ｆｘｈ、３ｎｐｈ、２ｏ４ｄ、１ｔｍｙ、１ｖｋｕ及び２ｅｓ９からなるリストから選択されるタンパク質と少なくとも９０％の相同性がある融合パートナーのアミノ酸配列を含む、第２のドメインと、
   （ｉｉｉ）前記ＧＰＣＲの第６膜貫通ドメインと第７膜貫通ドメインとを含む第３のドメインとを含む、組成物。
5. Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）融合パートナータンパク質を含む組成物であって、
   該タンパク質はＮ末端からＣ末端まで、
   （ｉ）ＧＰＣＲを含む第１のドメインと、
   （ｉｉ）２ｒｈｆ、２ｅｈｓ、２ｉｐ６、３ｉ７ｍ、１ｘ３ｏ、１ｕ８４、１ｈ７５、２ｈｕｊ、１ｙｓｑ、３ｌｓ０、２ｑｒ３、１ｚｕｈ、２ｂ８ｉ、２ｃｇｑ、３ｆｘｈ、３ｎｐｈ、２ｏ４ｄ、１ｔｍｙ、１ｖｋｕ及び２ｅｓ９からなるリストから選択されるタンパク質と少なくとも９０％の相同性がある融合パートナーのアミノ酸配列を含む、第２のドメインとを含む、組成物。
6. ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を含む組成物であって、
   該タンパク質はＮ末端からＣ末端まで、
   （ｉｉ）２ｒｈｆ、２ｅｈｓ、２ｉｐ６、３ｉ７ｍ、１ｘ３ｏ、１ｕ８４、１ｈ７５、２ｈｕｊ、１ｙｓｑ、３ｌｓ０、２ｑｒ３、１ｚｕｈ、２ｂ８ｉ、２ｃｇｑ、３ｆｘｈ、３ｎｐｈ、２ｏ４ｄ、１ｔｍｙ、１ｖｋｕ及び２ｅｓ９からなるリストから選択されるタンパク質と少なくとも９０％の相同性がある融合パートナーのアミノ酸配列を含む、第１のドメインと、
   （ｉｉ）ＧＰＣＲを含む第２のドメインとを含む、組成物。
7. 前記ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質は結晶状態である、請求項１−６いずれか１項に記載の組成物。
8. 前記ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質は、少なくとも３オングストロームの分解能での前記ＧＰＣＲのＸ線結晶学的構造の決定を補助するのに十分な品質である、請求項７に記載の組成物。
9. 前記融合パートナーは、前記ＧＰＣＲの第５膜貫通ドメインと第６膜貫通ドメインとの間の第３細胞内ドメインに対応するドメインを実質的に含む、請求項１又は４に記載の組成物。
10. 前記融合パートナーのアミノ酸配列はルブレドキシンと少なくとも９５％の相同性がある、請求項１−９いずれか１項に記載の組成物。
11. 前記融合パートナーのアミノ酸配列はシトクロムｂ５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ）と少なくとも９５％の相同性がある、請求項１−９いずれか１項に記載の組成物。
12. 前記融合パートナーのアミノ酸配列はフラボドキシンと少なくとも９５％の相同性がある、請求項１−９いずれか１項に記載の組成物。
13. 前記融合パートナーのアミノ酸配列はキシラナーゼと少なくとも９５％の相同性がある、請求項１−９いずれか１項に記載の組成物。
14. 前記ＧＰＣＲは天然に存在するＧＰＣＲである、請求項１−９いずれか１項に記載の組成物。
15. 前記ＧＰＣＲは天然に存在するＧＰＣＲの変異体である、請求項１−９いずれか１項に記載の組成物。
16. 前記ＧＰＣＲはクラスＡのＧＰＣＲである、請求項１−９いずれか１項に記載の組成物。
17. 前記ＧＰＣＲはＳ１Ｐ１レセプターである、請求項１−９いずれか１項に記載の組成物。
18. 前記ＧＰＣＲはβ２アドレナリン作動性レセプター（β２ＡＲ）である、請求項１−９いずれか１項に記載の組成物。
19. 前記融合パートナーは、ルブレドキシン、シトクロムｂ５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ）、フラボドキシン又はキシリナーゼから選択される、請求項１−６いずれか１項に記載の組成物。
20. 前記ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質はβ２ＡＲ−Ｂｒｉｌである、請求項１８に記載の組成物。
21. 前記ＧＰＣＲはアデノシンＡ２ａレセプターである、請求項１−９いずれか１項に記載の組成物。
22. 前記融合パートナーは、ルブレドキシン、シトクロムｂ５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ）、フラボドキシン又はキシリナーゼから選択される、請求項２１に記載の組成物。
23. 前記ＧＰＣＲはＮＯＰ１レセプターである、請求項１−９いずれか１項に記載の組成物。
24. 前記融合パートナーは、ルブレドキシン、シトクロムｂ５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ）、フラボドキシン又はキシリナーゼから選択される、請求項２３に記載の組成物。
25. 前記ＧＰＣＲはＣＣＲ５レセプターである、請求項１−９いずれか１項に記載の組成物。
26. 前記融合パートナーは、ルブレドキシン、シトクロムｂ５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ）、フラボドキシン又はキシリナーゼから選択される、請求項２５に記載の組成物。
27. 前記組成物は、結晶化補助剤としてトリ−メチルアミンＮ−オキシドをさらに含む、請求項１−２６いずれか１項に記載の組成物。
28. Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）の結晶学的な構造研究に適するタンパク質の結晶化を補助するために融合パートナーを用いる方法であって、
    （ａ）ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を形成するために前記ＧＰＣＲの細胞内ドメインに融合パートナーを取り込むこと、
    （ｂ）前記ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を発現及び精製すること、及び、
    （ｃ）前記精製されたＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を結晶化させることを含み、
    前記融合パートナーは、ルブレドキシン、シトクロムｂ５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ）、フラボドキシン又はキシリナーゼからなるグループから選択されるタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性がある、方法。
29. Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）の結晶学的な構造研究に適するタンパク質の結晶化を補助するために融合パートナーを用いる方法であって、
    （ａ）ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を形成するために、前記ＧＰＣＲのＮ末端又はＣ末端に融合パートナーを結合すること、
    （ｂ）前記ＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を発現及び精製すること、及び、
    （ｃ）前記精製されたＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を結晶化させることを含み、
    前記融合パートナーは、ルブレドキシン、シトクロムｂ５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ）、フラボドキシン又はキシリナーゼからなるグループから選択されるタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性がある、方法。
30. 前記ＧＰＣＲはクラスＡＧＰＣＲである、請求項２８又は２９に記載の方法。
31. 前記ＧＰＣＲは、β２−アドレナリン作動性レセプター（β２ＡＲ）、Ａ２Ａ−アデノシンレセプター、Ｓ１Ｐ１レセプター、ＯＬＲ１レセプター又はＣＣＲ５レセプターから選択される、請求項３０に記載の方法。
32. 前記融合パートナーはルブレドキシンのアミノ酸配列を含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
33. 前記融合パートナーはシトクロムｂ５６２ＲＩＬ（Ｂｒｉｌ）のアミノ酸配列を含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
34. 前記融合パートナーはＴ４リゾチームのＣ末端断片（Ｃ末端−Ｔ４Ｌ）のアミノ酸配列を含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
35. 前記融合パートナーはフラボドキシンのアミノ酸配列を含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
36. 前記融合パートナーはキシリナーゼのアミノ酸配列を含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
37. 前記融合パートナーは、前記ＧＰＣＲのＴＭ５及びＴＭ６領域の間の細胞内ドメインに取り込まれる、請求項２８又は２９に記載の方法。
38. 前記精製されたＧＰＣＲ融合パートナータンパク質を結晶化させるステップは、結晶化補助剤の存在下で実行されることをさらに含む、請求項２８−３７いずれか１項に記載の方法。
39. 前記結晶化補助剤はトリ−メチルアミンＮ−オキシドである、請求項３８に記載の方法。
40. ＧＰＣＲタンパク質と融合パートナーとの融合タンパク質に使用するための候補融合パートナーを選択する方法であって、
    得られる前記融合タンパク質は回折品質の結晶の形成を補助し、
    （ａ）タンパク質に関する情報を有する１つ以上のデータベースを提供するステップと、
    （ｂ）
    （ｉ）Ｎ末端及びＣ末端が１５オングストローム未満しか離れていないこと、
    （ｉｉ）分子量が２５ｋＤ未満であること、
    （ｉｉｉ）少なくとも３オングストロームの回折分解能で結晶化されることが実証されていること、
    （ｉｖ）２組以上の化学的条件で結晶を形成する能力があること、及び、
    （ｖ）２つ以上の空間群を有する結晶を形成する能力があることという基準を満足するタンパク質について、かかる１つ以上のデータベースを検索するステップと、
    （ｃ）前記基準（ｉ）−（ｖ）を満足する１種類以上のタンパク質を候補融合パートナーとして選択するステップとを含む、方法。
41. ステップ（ｂ）において、前記１つ以上のデータベースは、
    （ｖｉ）少なくとも５０％のアルファ−ヘリックス含量を有すること、及び
    （ｖｉｉ）Ｎ末端か、Ｃ末端か、その両方かにアルファ−ヘリックスドメインを有することという基準をも満足し、かつ、
    ステップ（ｃ）において、（ｉ）−（ｖｉｉ）の基準を満足する候補融合パートナーが選択される、請求項４０に記載の方法。