JP2014515020A - 陰イオン性高分子及び陽イオン性高分子イオン複合体基盤高感度磁気共鳴映像ナノ造影剤及びその製造方法 - Google Patents

陰イオン性高分子及び陽イオン性高分子イオン複合体基盤高感度磁気共鳴映像ナノ造影剤及びその製造方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、陰イオン性及び陽イオン性高分子を含有するナノ複合体及びこれらの製造方法に関し、生体親和性高分子物質のポリガンマグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）とキトサンのイオン性自己組立性を利用して、酸化鉄基盤ナノ粒子をγ−ＰＧＡ／キトサン高分子複合体内部に封入して製造したポリガンマグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）／キトサン／マンガン酸化鉄ナノ粒子の複合体及びその製造方法に関する。本発明による陰イオン性ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）と陽イオン性キトサンを利用したイオン性組み立てを介して、酸化鉄基盤ナノ粒子は高分子複合体内部で封入して、複合体内部に閉じ込められている酸化鉄基盤ナノ粒子が、互いの相互作用により磁気共鳴信号増幅の相乗効果を誘発するため、一つの粒子として存在する時より優れた造影効果を有する特徴がある。

Description

本発明は、陰イオン性及び陽イオン性高分子を含有するナノ複合体及びその製造方法に関し、生体親和性高分子物質のポリガンマグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）とキトサンのイオン性自己組立性（ｉｏｎｉｃ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）を利用して、酸化鉄基盤ナノ粒子をγ−ＰＧＡ／キトサン高分子複合体内部に封入して製造したポリガンマグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）／キトサン／マンガン酸化鉄ナノ粒子の複合体及びその製造方法に関する。
磁気共鳴映像（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ、ＭＲＩ）は、磁場を発生する大きな磁石筒の中に人体が入った後、高周波を発生させて、身体部位にある水素原子核を共鳴させて、各組織から出る信号の差を測定して、コンピュータを介して再構成して、映像化する技術である。磁石で構成された装置から人体に高周波を照射して、人体からこだまのような信号が発散されると、これを受けて、デジタル情報に変換して、映像化することをいう。
磁気共鳴映像（ＭＲＩ）は、Ｘ線を利用した検査である単純Ｘ線撮影やＣＴとは違って、非電離放射線である高周波を利用する検査であるため、人体には事実上害がないことが重要な長所の一つである。人体に害がない磁場と非電離放射線である高周波を利用して、ＣＴに比べて、造影剤なしで体内軟部組織の優れたコントラストが得られ、そして水素原子核を含有した組織の生化学的特性に関する情報を得ることができる。人体を断面で見せるという点では、ＣＴと似ているがＣＴでは人体を横で切った形である横断面映像が中心になるが、ＭＲＩは、患者の姿勢変化なしに望む方向に応じて、人体に対して横軸方向、縦軸方向、斜め方向等の映像を自由に得ることができる長所もある。
しかし、人体は、７０％以上が水分からなり、その濃度の部分的な差も大きくないために、磁気共鳴信号を映像化する過程でイメージの感度が低い傾向を示すため、同じ臓器内で、正常組織と異常組織を区分するのに限界があり、病気の早期診断が容易ではないことが短所である。
ＭＲＩ造影剤とは、信号の差を極大化させて、磁気共鳴映像の感度を向上させる補助物質として既に臨床に広く利用されており、大きくＴ１とＴ２造影剤に分れるが、Ｔ１は標識された部分が周辺の組織より明るく見える効果がある反面、Ｔ２は標識された部分が暗く見える効果がある。現在、臨床に利用されている代表的なＴ１造影剤は、ガドリニウムイオン（Ｇｄ２＋）があって、Ｔ２造影剤には酸化鉄ナノ粒子が用いられる。
最近では、ＭＲＩ造影剤を利用して、人体内の特定部位を標識して、経時的発達過程を観察するか、または特定細胞又は外部物質を標識して人体内部に取り込ませた後、その移動経路を探索する研究が活発に進められている。これは、これまで究明できなかった疾患の発病原因を明らかにするか、新薬の治療過程、または代謝過程を明らかにできる手がかりを提供する。
現在臨床に用いられている代表的な酸化鉄ナノ粒子基盤造影剤は、水溶液相に塩化第一鉄水和物（ＦｅＣｌ２・Ｈ２Ｏ）と塩化第二鉄水和物（ＦｅＣｌ３・Ｈ２Ｏ）を溶解させた後、塩基の雰囲気を誘導して、鉄イオンを還元させる方法で得られる。この時、多糖類の一種であるデキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ）を添加して、酸化鉄ナノ粒子表面にコーティング膜を形成するようになるが、これは粒子の安全性を維持するためである。このように合成されたナノ粒子は、生体親和性が優れる長所があるが、粒子の大きさが小さく、表面結晶性が落ちて、磁気共鳴信号増幅効果が低い。また、人体内の特定部位を選択的に標識するためのターゲットリガンドを化学的に結合させられる官能基がない短所がある。結果的に、ターゲット指向的な粒子形成が難しく、細胞や分子単位の標識を感知するには、その造影効果が十分ではないとの限界を示している。
最近、水溶液法で合成された酸化鉄ナノ粒子の代替物質として、有機溶媒相で高温状態で合成された酸化鉄ナノ粒子の応用が注目を浴びているが、この方法は、高温の状態で鉄イオンの粒子形成が徐々に起きるため、その大きさと形が非常に均一に形成され、表面結晶性も非常に優れている。また、合成時粒子安定化のために添加する界面活性剤の量や反応温度を変化させることで、ナノ粒子の大きさを簡単に調節することができる長所がある。最近酸化鉄粒子にマンガンやコバルトのような遷移金属を少量添加することによって信号増幅効果を画期的に向上させたナノ粒子が報告されているが、有機溶媒相で合成を行うため、疎水性を示して、人体内に取り込むためには必ず水溶液相への相転移（Ｐｈａｓｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）過程が必須である。これのため、疎水性ナノ粒子の表面を両親性リン脂質や疎水性基を化学的に導入した生分解性高分子物質でコーティングする方法が利用されているが、このような方法は、粒子安定性と生体適合性の側面から多くの問題がある。
また、イオン結合をする陰イオンと陽イオンを含むナノ粒子の製造方法（米国特許出願公開ＵＳ２００９／０１８０９６６号明細書）は、金属イオンを磁気共鳴映像造影剤で用いて、陰イオン及び陽イオン性高分子と複合体を形成するか、これはナノ粒子形態の磁気共鳴映像造影剤を利用したものよりは磁気映像共鳴信号の感度が顕著に落ちるものである。また、金属イオンは、毒性が非常に強く、現実的に磁気共鳴映像造影剤として用いることは難しいという問題がある。
そこで、本発明者等は、生体親和性高分子物質であるポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）とキトサンのイオン性自己組立性を利用して、磁気共鳴映像ナノ造影剤を製造しようと鋭意努力した結果、酸化鉄基盤ナノ粒子をポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）とキトサン高分子複合体内部に封入した場合、磁気共鳴信号を効果的に増加させて、人体内の特定細胞や器官の標識感度を向上させることを確認して、本発明を完成した。
本発明の目的は、酸化鉄基盤ナノ粒子をポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）とキトサン高分子複合体内部に封入して、磁気共鳴信号を効果的に増加させて、人体内の特定細胞や機関の標識感度を向上させるナノ粒子磁気共鳴映像ナノ造影剤を含有する陰イオン性高分子と陽イオン性高分子を含有するナノ粒子複合体の製造方法を提供することにある。
前記目的を解決するために、本発明は（ａ）陰イオン性高分子を含む有機溶媒溶液と磁気共鳴映像ナノ造影剤を含む有機溶媒溶液を混合して、陰イオン性高分子／磁気共鳴映像ナノ造影剤複合体を取得する工程；及び（ｂ）前記取得された陰イオン性高分子／磁気共鳴映像ナノ造影剤複合体に陽イオン性高分子を添加して、陰イオン性高分子及び陽イオン性高分子のイオン結合によって形成された高分子複合体に磁気共鳴映像ナノ造影剤が封入されているナノ粒子複合体を取得する工程を含む陰イオン性高分子及び陽イオン性高分子のイオン結合によって形成された高分子複合体に磁気共鳴映像ナノ造影剤が封入されているナノ粒子複合体の製造方法を提供する。
本発明はまた、前記方法で製造されて、陰イオン性高分子及び陽イオン性高分子のイオン結合によって形成された高分子複合体に磁気共鳴映像ナノ造影剤が封入されているナノ粒子複合体を提供する。
本発明の他の特徴及び実施態様は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になる。
酸化鉄基盤ナノ粒子を封入したポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン複合体合成方法に関するものである。 水溶液相に分散したポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン／酸化鉄基盤ナノ粒子複合体の近くに永久磁石を並べて置いた時、時間経過に応じた粒子の磁性に関する図面である。 (Ａ）ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン／酸化鉄基盤ナノ粒子複合体のＤＬＳを介して、測定した複合体の大きさ；(Ｂ）ＴＥＭを介して確認した酸化鉄ナノ粒子を封入したγ−ＰＧＡ／キトサン複合体の内部の様子と粒子の大きさ；及び(Ｃ）ＳＥＭを介して確認した複合体の粒子の大きさと均質度を示した図面である。 ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン／酸化鉄基盤ナノ粒子複合体のＭＲＩ信号増幅効果を示した図面である。 ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン／酸化鉄基盤ナノ粒子複合体を細胞に処理してプルシアンブルー染色で細胞内の粒子伝達有無の確認及びＭＲＩを介した細胞標識能力を示した図面である。
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する実験方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
一観点において、本発明は、（ａ）陰イオン性高分子を含む有機溶媒溶液と磁気共鳴映像ナノ造影剤を含む有機溶媒溶液を混合して、陰イオン性高分子／磁気共鳴映像ナノ造影剤複合体を取得する工程；及び（ｂ）前記取得された陰イオン性高分子／磁気共鳴映像ナノ造影剤複合体に陽イオン性高分子を添加して、陰イオン性高分子及び陽イオン性高分子のイオン結合によって形成された高分子複合体に磁気共鳴映像ナノ造影剤が封入されているナノ粒子複合体を取得する工程を含む、陰イオン性高分子及び陽イオン性高分子のイオン結合によって形成された高分子複合体に磁気共鳴映像ナノ造影剤が封入されているナノ粒子複合体の製造方法に関する。
本発明において、前記陰イオン性高分子は、ポリグルタミン酸（Ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、ポリアクリル酸（Ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸（Ａｌｇｉｎａｔｅ）、カラギナン（Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ポリスチレンスルホン酸塩（Ｐｏｌｙ（ｓｔｙｒｅｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ））、カルボキシメチルセルロース（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、セルロース硫酸塩（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｕｌｆａｔｅ）、デキストラン硫酸塩（Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）、ヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ）、ヘパリン硫酸塩（Ｈｅｐａｒｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）、ポリメチレンコグアニジン（Ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｃｏ−ｇｕａｎｉｄｉｎｅ））及びコンドロイチン硫酸塩（Ｃｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）からなる群から選択されることを特徴とする。
本発明は、生体親和性素材である陰イオン性高分子及び陽イオン性高分子のイオン結合性を利用して、酸化鉄基盤ナノ粒子をコーティングする方法に関し、用いられたポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）は、韓国清麹醤から由来したバチルス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）により生合成された超高分子量の天然アミノ酸高分子物質として、優れた生体適合性と生分解能力を有している。構成アミノ酸であるグルタミン酸に存在する多量のカルボキシル基によって、陰イオン性高分子に分類され、陽イオン性ミネラルとの反応性が優れており、食品添加剤、健康機能食品、化粧品、及び医薬品への多様な応用が期待される。特に、疎水性薬物や有用蛋白質及び抗原を封入する効果が優れて、薬物伝達システム（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）に活用しようとする研究が活発に進められているが、この時封入物の安定性を確保するために、陽イオン性高分子であるキトサンとイオン性自己組立を誘導して、ゲル化（ｇｅｌａｔｉｏｎ）させたナノ粒子を形成することができる。
本発明において、前記陽イオン性高分子は、キトサン（Ｃｈｉｔｏｓａｎ）、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ））、ポリＬ−リジン（Ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ））、ポリジアリルジメチル塩化アンモニウム（Ｐｏｌｙ（ｄｉａｌｌｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ））、ポリアリルアミン（Ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ））、塩酸塩（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ポリオルニチン（Ｐｏｌｙ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、ポリビニルアミン塩酸塩（Ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌａｍｉｎｅ）ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ポリ２−ジメチルアミノエチルメタクリレート（Ｐｏｌｙ（２−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））、ポリアミドアミン（Ｐｏｌｙ（ａｍｉｄｏ ａｍｉｎｅ））、デンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）及びゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）からなる群から選択されることを特徴とする。
本発明の陽イオン性高分子として用いられたキトサンは、海老、カニのような甲殻類から由来する天然動物性食物繊維であり、溶解状態で陽電荷（＋）を帯びる陽イオン性高分子物質である。グルコサミン結合からなるキトサンは、その分子構造が人体組織と非常に類似する構造をなしており、人体親和性が非常に優秀で、免疫反応（拒否反応）が起きないために、種々の食医薬品分野に応用されている。
本発明において、前記磁気共鳴映像ナノ造影剤は、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、プラセオジム（ｐｒａｓｅｏｄｙｍｉｕｍ、ＰＲ）、サマリウム（ｓａｍａｒｉｕｍ、Ｓｍ）、ユーロピウム（ｅｕｒｏｐｉｕｍ、Ｅｕ）、テルビウム（ｔｅｒｂｉｕｍ、Ｔｂ）、ジスプロシウム（ｄｙｓｐｒｏｓｉｕｍ、Ｄｙ）、ホルミウム（ｈｏｌｍｉｕｍ、Ｈｏ）、エルビウム（ｅｒｂｉｕｍ、Ｅｒ）、ツリウム（ｔｈｕｌｉｕｍ、Ｔｍ）、イッテルビウム（ｙｔｔｅｒｂｉｕｍ、Ｙｂ）、ルテニウム（ｌｕｔｅｔｉｕｍ、Ｌｕ）及びこれらの複合体からなるナノ粒子群から選択されることを特徴とする。
本発明で、磁気共鳴映像ナノ造影剤とは、磁気共鳴映像造影効果が出る酸化鉄ナノ粒子として、有機溶媒で合成したマンガンがドープされた酸化鉄（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子を用いて、これは短い炭化水素鎖からなる界面活性剤で安定化されていて、疎水性性質を示す。
本発明の一様態では、陰イオン性高分子としてＰＧＡ、陽イオン性高分子としてキトサンを用いて、酸化鉄基盤ナノ粒子を磁気共鳴映像ナノ造影剤として、γ−ＰＧＡ／キトサン複合体内部に封入して製造したナノ複合体を提示している。しかし、前記陰イオン性高分子は、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、アルギン酸、カラギナン、ヒアルロン酸、ポリスチレンスルホン酸塩、カルボキシメチルセルロース、セルロース硫酸塩、デキストラン硫酸塩、ヘパリン、ヘパリン硫酸塩、ポリメチレンコグアニジン及びコンドロイチン硫酸塩からなる群から選択でき、前記陽イオン性高分子は、キトサン、ポリエチレンイミン、ポリＬ−リジン、ポリジアリルジメチル塩化アンモニウム、ポリアリルアミン、塩酸塩、ポリオルニチン、ポリビニルアミン塩酸塩、ポリ２−ジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリアミドアミン、デンドリマー及びゼラチンからなる群から選択でき、前記磁気共鳴映像ナノ造影剤は、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、プラセオジム（ＰＲ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテニウム（Ｌｕ）及びこれらの複合体からなるナノ粒子群から選択できることは当業者にとって自明である（Hyon Bin Na. et al., Advanced Materials, 21:2133, 2009; Conroy Sun. et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 60:1252, 2008; Jian Lu. et al., Biomaterials, 30:2919, 2009; J. Lee. et al., Nature Medicine, 13:95, 2007）。
他の観点において、本発明は、前記方法で製造され、陰イオン性高分子及び陽イオン性高分子のイオン結合によって形成された高分子複合体に磁気共鳴映像ナノ造影剤が封入されているナノ粒子複合体に関する。
本発明の他の様態においては、生体親和的な天然高分子であるポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン複合体内部に酸化鉄基盤ナノ粒子を封入して、優れた磁気共鳴信号増幅効果を示す磁気共鳴映像ナノ造影剤を開発するために、酸化鉄基盤ナノ粒子は、高分子量（５００ｋＤａ）のポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）でコーティングして、有機溶媒相から水溶液相に相転移を誘導した。その次に、粒子の均一性と安定性を確保してターゲット特異的リガンドを導入し易しい官能基であるアミン（ａｍｉｎｅ）基を導入するために、キトサンでその表面を再度コーティングした。この時、ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）とキトサンは、いかなる化学的な修飾なしに単純なイオン性自分組立で複合体を形成して、生体親和性を一層高めようとした。また、高分子量のポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）を利用することによって、ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン複合体内部に相当な数の酸化鉄基盤ナノ粒子が封入される効果を得ることができた。これは、複合体内部に閉じ込められている酸化鉄基盤ナノ粒子の相互作用により、磁気共鳴信号増幅の相乗効果を誘発するため、一つの粒子として存在する時より優れた造影効果を示す。
本発明のまた他の様態で、磁気共鳴映像造影効果を示す酸化鉄ナノ粒子として、有機溶媒で合成したマンガンがドープされた酸化鉄（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子を用いた。これは、短い炭化水素鎖からなる界面活性剤で安定化されていて、疎水性性質を有する。従って、粒子は有機溶媒相に均一に分散し、８ｎｍ程度の径を有する球状である。マンガンがドープされた酸化鉄（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子を水溶液相に相転移させるために、５００ｋＤａ分子量のポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）でコーティングした。ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）は、グルタミン酸のガンマ-カルボキシル基とアルファ−アミノ基がマミド結合したガンマ−ポリペプチド形態の構造で、アルファ−カルボキシル基が露出して、陰イオン性を有するようになるが、この部分が酸化鉄ナノ粒子表面を攻撃して、炭化水素界面活性剤を押し出して表面に結合を形成するようになる。その中の一部のカルボキシル基は、結合を形成することなく、外部に露出するため、コーティングされた表面が陰電荷を帯びるようになる。ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）がコーティングされたマンガンがドープされた酸化鉄（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子に陽イオン性のキトサンを加えると、イオン性相互作用によって、球状の高分子複合体が形成される。キトサンは、本来Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位体からなるキチンという物質を脱アセチル化させて得られる物質であり、本発明で用いたキトサンは、分子量が５０ｋＤａ程度で脱アセチル化が８０％程度である。グルタルアルデヒド（Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）は、キトサンのアミン基を架橋させ鎖と鎖との間の結合力を増加させる役割を果たす。
また、ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ））を粒子表面に少量結合させることによって、粒子のペギル化（Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）による粒子安定性及び溶解度向上、ＲＥＳ（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｙｓｔｅｍ）細胞による取り込み（ｕｐｔａｋｅ）を防止して、血中半減期を高める効果を与える。
ＭＲＩ ｒｅｌａｘｉｖｉｔｙとは、ナノ粒子が含んでいる磁気性元素、すなわち、鉄（Ｆｅ）やマンガン（Ｍｎ）の単位濃度を基準として、Ｔ１やＴ２緩和時間が減少する程度を示す値である。これは、造影剤の磁気共鳴信号増幅能力を数値化したもので、Ｔ２造影剤の場合ｒ２で表記する。
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当分野において通常の知識を有する者にとって自明である。
≪実施例１：試薬及び粒子製造≫
実施例１−１：試薬の製造
アセチルアセトン鉄（III）（Ｉｒｏｎ（III） ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）とアセチルアセトンマンガン（II）（ｍａｎｇａｎｅｓｅ（II） ａｃｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔe）を原料でとして、有機溶媒である１−オクタデセン（１−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｅ）上で高温反応して、マンガンがドープされた酸化鉄ナノ粒子（ＭｎＦｅ２Ｏ４）を合成し、この時ナノ粒子の安定剤として界面活性剤であるオレイン酸（ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を添加した。そして、分子量５００ｋＤａのポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）（（株）バイオリーダーズ、韓国）、分子量５０ｋＤａのキトサン（（株）ＭＩＲＡＥ ＢＩＯＴＥＣＨ、韓国）、ＰＥＧ−ＮＨＳ（（株）サンバイオ、韓国）を準備した。
実施例１−２：酸化鉄ナノ粒子の相転移過程
ポリガンマグルタミン酸（ＰＧＡ）（分子量：５００ｋＤａ）をＤＭＳＯ溶媒に１０ｍｇ／ｍＬ濃度で溶かし、マンガンがドープされた酸化鉄（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子は、クロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）上で１０ｍｇ／ｍＬに分散させた。前記二つの溶液を密閉された容器中において、窒素ガスで泡立ち（ｂｕｂｂｌｉｎｇ）を１０分以上続け、窒素雰囲気を作った後、各々の溶液１０ｍＬを混ぜた後、温度６０℃で２時間撹拌して、ポリガンマグルタミン酸／マンガンがドープされた酸化鉄（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子を製造した。製造された複合体に溶液に残っている界面活性剤と反応不純物を取り除くために、ヘキサン、エタノール及びクロロホルムを混合した有機溶媒を（ｈｅｘａｎｅ：ｅｔｈａｎｏｌ：ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ＝２：１：１）加えた後、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液は捨て、下に残った沈殿物を真空状態デシケーターで一日程度放置し残っている有機溶媒を完全に取り除いた。有機溶媒が完全に取り除かれた複合体に５０ｍＭのＮａＨＣＯ３溶液を２０ｍＬ程度加えた後、残った沈殿物が完全に溶けるまでボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）し、音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を行った後、０．２μｍセルロースフィルター（ａｄｖｅｎｔｅｃ）を利用してろ過した。
実施例１−３：ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／酸化鉄ナノ粒子とキトサンのイオン性結合複合体形成
キトサンは、水溶液に１０ｍｇ／ｍＬ濃度で溶かし、水１０ｍＬを撹拌しながら、キトサン溶液３ｍＬを添加して、ピペットを利用して、実施例１−２で準備したポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／マンガン酸化鉄（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子溶液１ｍＬを添加し、６００ｒｐｍで２時間撹拌して、さらに１０μＬのグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を添加して、１時間撹拌した。ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン／マンガン酸化鉄（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子複合体水溶液相に存在するアミン基の定量は、ニンヒドリン（ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ）法で実施した。この時、標準溶液としてＬ−リジン（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）溶液を利用した。
実施例１−４：ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン／酸化鉄ナノ粒子複合体のペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）
前記実施例１−３で準備したポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン／マンガン酸化鉄（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子複合体に含まれたアミン基のモル濃度比２倍モル濃度のＰＥＧ−ＮＨＳを３次蒸溜水に溶かし、二つの溶液の体積を１：１で混ぜた後、１２時間程度撹拌した。反応しない高分子物質とＮＨＳを取り除くために、５０００ｒｐｍで１０分程度遠心分離し、上澄み液を捨て、沈殿物を３次蒸溜水に再分散させた後、再度遠心分離して精製した。ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン／マンガン酸化鉄（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子複合体の大きさは、ＤＬＳ、ＴＥＭ、及びＳＥＭで観察した。
その結果、ＤＬＳで測定した粒子の大きさは、９０〜２００ｎｍの分布を示していることを確認することができた（図３Ａ）。これは、人体内に取り込ませた時、ＥＰＲ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果に適した大きさであり、異常組織でのターゲット指向的な特性を持つ。
ＴＥＭを介して、粒子の大きさと内部を観察してみた結果、相当数のマンガン−酸化鉄ナノ粒子を球状のポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン高分子複合体内部にお封入していることが確認された（図３Ｂ）。これは先に説明したように、マンガン−酸化鉄ナノ粒子が、高分子複合体内部で相互作用を起こしながらＭＲＩ信号を効果的に増幅させる相乗効果が期待できる。
また、ＳＥＭを介して、粒子の表面形状と大きさを観察した結果、ＤＬＳで測定された大きさと似た９０〜２００ｎｍ程度の球状の粒子を観察することができた（図３Ｃ）。
≪実施例２：ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン／マンガン酸化鉄（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子複合体の活性測定≫
実施例２−１：ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン／マンガン酸化鉄（ＭｎＦｅ ２ Ｏ ４ ）ナノ粒子のＭＲＩ緩和能（ｒｅｌａｘｉｖｉｔｙ）測定
前記の実施例１−３で準備したポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン／マンガン酸化鉄（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子複合体溶液のＭＲＩ緩和能は、４．７Ｔ小動物用ＭＲＩを利用して測定し、溶液相に存在する鉄とマンガン元素の定量は、ＩＣＰ−ＡＥＳで測定した。
その結果、ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン／マンガン酸化鉄（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子複合体のｒ２は、５０７（Ｆｅ＋Ｍｎ）ｍＭ−１ｓ−１程度であり、すでに相溶化された水溶液相で合成されたデキストラン基盤酸化鉄粒子のｒ２値より４倍以上増加した数値であることを確認することができた（図４）。
実施例２−２：ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン／マンガン酸化鉄（ＭｎＦｅ ２ Ｏ ４ ）ナノ粒子複合体細胞内伝達
実施例２−１で製造したナノ粒子複合体を癌細胞のＨｅＬａ細胞内に伝達する実験を実施した。粒子は、２５μｇ／ｍＬ濃度で処理した後、プルシアンブルー（ｐｒｕｓｓｉａｎ ｂｌｕｅ）で染色して、伝達有無を確認した。
ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン／マンガン酸化鉄（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子複合体の表面は、キトサンのアミン基によって陽電荷を帯びるが、これは一般的に陰電荷を帯びている細胞膜によく付着し、細胞内の伝達が容易との特徴があり、粒子は２５μｇ／ｍＬ濃度で処理した後、プルシアンブルーで染色して、伝達の有無を確認した（図５）。
実施例２−３：ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン／マンガン酸化鉄（ＭｎＦｅ ２ Ｏ ４ ）ナノ粒子複合体で標識された細胞のＭＲＩイメージ
実施例２−２で粒子を処理した細胞を集めて、４．７Ｔ小動物ＭＲＩ装備でＭＲＩイメージを得ることができた。
ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン／マンガン酸化鉄（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子複合体によって標識された細胞は、ＭＲＩイメージ上でも確認できるが、標識されない細胞は、周辺の水と共に明るく見られるが、標識された細胞は、暗く示されることを確認することができる。
これらのことから、ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）／キトサン／マンガン酸化鉄（ＭｎＦｅ２Ｏ４）ナノ粒子複合体が、特定細胞内によく伝達される特性を示し、ＭＲＩイメージ結果、少量の粒子だけでも磁気共鳴信号によるイメージ暗化（ｄａｒｋｅｎｉｎｇ）効果が起きることを確認することができた（図５）。
以上説明したように、本発明による陰イオン性ポリガンマグルタミン酸（γＰＧＡ）と陽イオン性キトサンを利用したイオン性組み立てを介して、酸化鉄基盤ナノ粒子は高分子複合体内部で封入して、複合体内部に閉じ込められている酸化鉄基盤ナノ粒子が、互いの相互作用により磁気共鳴信号増幅の相乗効果を誘発するため、一つの粒子として存在する時より優れた造影効果がある特徴がある。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

Claims (5)

  1. 次の工程を含む陰イオン性高分子及び陽イオン性高分子のイオン結合によって形成された高分子複合体に磁気共鳴映像ナノ造影剤が封入されているナノ粒子複合体の製造方法:
    （ａ）陰イオン性高分子を含む有機溶媒溶液と磁気共鳴映像ナノ造影剤を含む有機溶媒溶液とを混合して、陰イオン性高分子／磁気共鳴映像ナノ造影剤複合体を取得する工程；及び
    （ｂ）前記取得された陰イオン性高分子／磁気共鳴映像ナノ造影剤複合体に陽イオン性高分子を添加して、陰イオン性高分子及び陽イオン性高分子のイオン結合によって形成された高分子複合体に磁気共鳴映像ナノ造影剤が封入されているナノ粒子複合体を取得する工程。
  2. 前記陰イオン性高分子は、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、アルギン酸、カラギナン、ヒアルロン酸、ポリスチレンスルホン酸塩、カルボキシメチルセルロース、セルロース硫酸塩、デキストラン硫酸塩、ヘパリン、ヘパリン硫酸塩、ポリメチレンコグアニジン及びコンドロイチン硫酸塩からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子複合体の製造方法。
  3. 前記陽イオン性高分子は、キトサン、ポリエチレンイミン、ポリＬ−リジン、ポリジアリルジメチル塩化アンモニウム、ポリアリルアミン、塩酸塩、ポリオルニチン、ポリビニルアミン塩酸塩、ポリ２−ジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリアミドアミン、デンドリマー及びゼラチンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子複合体の製造方法。
  4. 前記磁気共鳴映像ナノ造影剤は、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、プラセオジム（ＰＲ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテニウム（Ｌｕ）及びこれらの複合体からなるナノ粒子群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子複合体の製造方法。
  5. 請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の方法で製造され、陰イオン性高分子及び陽イオン性高分子のイオン結合によって形成された高分子複合体に磁気共鳴映像ナノ造影剤が封入されているナノ粒子複合体。
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