KR20220110532A - 조율가능한 자기 나노입자에 대한 조성물 및 방법 - Google Patents

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KR20220110532A
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엘리 매팅리
병희 유
즈드라브카 메다로바
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Abstract

본 개시내용은 질환 (예를 들어, 암)의 치료, 방지, 또는 이미징에서의 사용을 위한 나노입자 조성물, 질환의 치료, 방지, 또는 이미징을 필요로 하는 대상체에서의 나노입자 조성물로의 질환의 치료, 방지, 또는 이미징 방법, 및 본 개시내용의 나노입자 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 나노입자 조성물은 자기 나노입자 염화제2철, 염화제1철, 또는 이들의 조합, 및 하나 이상의 아민 기로 관능화된 덱스트란 코팅을 포함할 수 있다.

Description

조율가능한 자기 나노입자에 대한 조성물 및 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2019년 12월 5일 출원된 미국 가출원 번호 62/943,927의 이익을 청구한다. 이것의 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 조율가능한 자기 특성 및 조율가능한 표면 개질 (예를 들어, 아민 기 개질)을 갖는 나노입자 조성물, 이들 나노입자 조성물을 제조하는 방법, 및 이들 나노입자 조성물의 사용 방법을 제공한다. 나노입자 조성물은 염화제1철, 염화제2철, 덱스트란, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
의료 이미징은 대상체에 관한 정보를 수집하기 위해 사용된다. 이미징의 일부 유형에서는, 조영제가 대상체에게 투여된다. 조영제는 대상체 내의 바이오입자 또는 다른 관심 구조에 선택적으로 결합한다. 이어서 의료 이미징 장치를 사용하여 이 조영제가 검출되고, 수집된 정보는 이미지 등을 개발하는 데 사용된다.
단일 의료 이미지로도 많은 정보가 모아질 수 있지만, 높은 공간적 및 시간적 해상도, 높은 검출 감도, 및 단층촬영 능력을 갖는 종합적인 정량적 진단 정보를 제공하기 위해서는 다수의 이미징 기술이 필수적이다. 과거에, 이는 다수의 조영제가 각각의 수행 양식(modality)에 대하여 단일 대상체에게 투여되어야 함을 의미하였다.
다양한 유형의 양식에 의한 검출에 적합한 다중양식 조영제가 개발되었다. 이들 다중양식 조영제는 전형적으로 별도의 양식에 의해 각각 검출가능한 다수의 엔티티(entity)를 포함한다. 다수의 엔티티는 전형적으로 화학 링커를 사용하여 함께 합쳐져 각각의 다수의 엔티티 모두를 각각 함유하는 입자를 형성한다. 그러나, 화학 링커는 종종 세포 및 조직 내에서 또는 시간에 따라 달라지는 안정성을 갖고, 이는 엔티티의 일부가 분리되고, 그에 따라 이들 조영제의 품질 및 유용성을 저하시킬 수 있음을 의미한다.
다수의 엔티티를 함께 화학적으로 연결하는 것의 문제를 피하기 위해, 일부는 코어-쉘 구조를 갖는 조영제를 형성하고자 시도하였다. 그러나, 지금까지, 임상적으로 적용될 수 있는 코어-쉘 구조를 개발하는 것에 상당한 문제가 있다. 추가로, 현재 이용가능한 입자는 표적화 모이어티로의 조율가능한 표면 관능화 및 조율가능한 자기 특성을 갖지 않는다.
따라서, 임상적으로 적용하능하고 표면 관능화 및 물리적 특성 (예를 들어, 자기 특성)에 있어 디자인의 유연성을 제공하는 다중양식 조영제에 대한 필요성이 존재한다.
요약
본 개시내용의 특정 측면은, 염화제2철, 염화제1철, 또는 이들의 조합; 및 하나 이상의 아민 기로 관능화된 덱스트란 코팅을 포함하는 자기 나노입자를 포함하며, 여기서 하나 이상의 아민 기의 수는 약 5 내지 약 1000의 범위인 나노입자 조성물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 50 중량(wt)% 내지 약 100 wt%의 염화제2철 및 약 0 wt% 내지 약 50 wt%의 염화제1철을 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 0.65 g의 염화제2철 및 약 0.4 g의 염화제1철을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노 기의 수는 약 5 내지 약 150의 범위이다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 50 wt% 내지 약 100 wt%의 염화제2철을 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 1.2 g의 염화제2철을 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 염화제1철을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노 기의 수는 약 246 내지 약 500의 범위이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 염화제2철, 염화제1철, 또는 이들의 조합; 및 덱스트란 코팅을 포함하는 자기 나노입자를 포함하며, 여기서 자기 나노입자는 약 6 내지 약 40 범위의 비-선형성 지수를 갖는 것인 나노입자 조성물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 50 중량(wt)% 내지 약 80 wt%의 염화제2철 및 약 50 wt% 내지 약 20 wt%의 염화제1철 염화제1철을 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 0.54 g의 염화제2철 및 약 0.2 g의 염화제1철을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자기 나노입자는 8 내지 14의 비-선형성 지수를 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 0 중량(wt)% 내지 약 50 wt%의 염화제2철 및 약 100 wt% 내지 약 50 wt%의 염화제1철 염화제1철, 또는 약 80 wt% 내지 약 [ 100 wt%]의 염화제2철 및 약 0 wt% 내지 약 20 wt%의 염화제1철 염화제1철을 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 0.54 g의 염화제2철 및 약 0.4 g의 염화제1철을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자기 나노입자는 약 8 내지 약 67 범위의 비-선형성 지수를 갖는다. 일부 실시양태에서, 자기 나노입자는 약 67의 비-선형성 지수를 갖는다. 일부 실시양태에서, 자기 나노입자는 약 3 nm 내지 약 50 nm의 직경을 갖는 산화철 결정 코어를 갖고, 자기 나노입자의 유체역학 직경은 약 7 nm 내지 약 200 nm이다.
일부 실시양태에서, 자기 나노입자는 약 0.1 내지 약 0.25의 다분산성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 덱스트란 코팅은 약 1 kDa 내지 약 15 kDa 범위의 분자량을 갖는 덱스트란을 포함한다. 일부 실시양태에서, 덱스트란 코팅은 약 10 kDa의 분자량을 갖는 덱스트란을 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 덱스트란 코팅의 표면에 부착된 약물 페이로드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 약물 페이로드는 하나 이상의 아민 기에 컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 약물 페이로드는 약물, 항체, 성장 인자, 핵산, 핵산 유도체, 핵산 단편, 단백질, 단백질 유도체, 단백질 단편, 사카라이드, 폴리사카라이드 단편, 사카라이드 유도체, 글리코시드, 글리코시드 단편, 글리코시드 유도체, 이미징 조영제, 또는 이들의 임의의 조합이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 임의의 나노입자 조성물 및 적어도 하나의 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은, 치료 유효량의 본 개시내용의 임의의 나노입자 조성물을 대상체의 신체, 신체 부분, 조직, 세포, 또는 체액의 일부에서 적어도 조직 표적 부위에 투여하는 단계; 자기 나노입자 조성물 및 조직 표적 부위에 에너지를 투여하는 단계; 나노입자 조성물 및 조직 표적 부위의 신호를 검출하는 단계; 및 검출된 신호에 기초하여 조직 표적 부위의 이미지를 얻는 단계를 포함하는, 조직 표적 부위의 이미징을 필요로 하는 대상체에서의 조직 표적 부위의 이미징 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 이미징은 자기 공명 이미징, 자기 입자 이미징, 또는 이들의 조합이고, 에너지는 자기장이다. 일부 실시양태에서, 질환은 암이고, 조직 표적 부위는 종양이다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 대상체의 표적 부위에 축적된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 질환의 이미징을 필요로 하는 대상체에서의 질환의 이미징 방법에서의 사용을 위한 본 개시내용의 임의의 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은, 덱스트란을 물 중에 용해시키는 단계; 덱스트란을 에피클로로히드린으로 가교시키는 단계; 염화제1철 용액, 염화제2철 용액, 또는 이들의 조합을 제조하는 단계; 염화제1철 용액, 염화제2철 용액, 또는 이들의 조합을 덱스트란에 첨가함으로써 혼합물을 제조하는 단계; 염기를 교반하면서 혼합물에 첨가하고 혼합물을 빙조에 적용하는 단계; 및 혼합물을 약 75℃ 내지 약 90℃의 온도에 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 염기의 첨가 단계는 산화철 결정, 산화철 수화물, 또는 이들의 조합의 형성을 방지하고, 여기서 혼합물은 약 50 중량(wt)% 내지 100 wt%의 염화제2철 및 약 0 wt% 내지 50 wt%의 염화제1철을 포함하는 것인, 본 개시내용의 임의의 나노입자 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은, 덱스트란을 물 중에 용해시키는 단계; 덱스트란을 에피클로로히드린으로 가교시키는 단계; 염화제1철 용액, 염화제2철 용액, 또는 이들의 조합을 제조하는 단계; 염화제1철 용액, 염화제2철 용액, 또는 이들의 조합을 덱스트란에 첨가함으로써 혼합물을 제조하는 단계; 염기를 교반하면서 혼합물에 첨가하고 혼합물을 빙조에 적용하는 단계; 및 혼합물을 약 75℃ 내지 약 90℃의 온도에 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 염기의 첨가 단계는 산화철 결정, 산화철 수화물, 또는 이들의 조합의 형성을 방지하고, 여기서 혼합물은 50 wt% 내지 약 80 wt%의 염화제2철 및 약 50 wt% 약 20 wt%의 염화제1철을 포함하는 것인, 본 개시내용의 임의의 나노입자 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
용어 "자성"은 자기장에 대해 응답성인 조성물을 기재하기 위해 사용된다. 자기 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 나노입자 조성물 중 임의의 것)의 비-제한적 예는 상자성, 초상자성, 강자성, 또는 반자성인 물질을 함유할 수 있다. 자기 조성물의 비-제한적 예는 마그네타이트; 페라이트 (예를 들어, 망가니즈, 코발트, 및 니켈의 페라이트); Fe(II) 산화물; 및 헤마타이트, 및 이들의 금속 합금의 군으로부터 선택된 금속 산화물을 함유한다. 추가의 자기 물질은 본원에 기재되고 관련 기술분야에 공지되어 있다.
용어 "반자성"은 1 이하인 상대 투자율(magnetic permeability)을 갖고 자기장에 의해 반발되는 조성물을 기재하기 위해 사용된다.
용어 "상자성"은 외부 적용 자기장의 존재 하에서만 자기 모멘트를 발생시키는 조성물을 기재하기 위해 사용된다.
용어 "강자성" 또는 "강자성"은 자기장에 매우 민감하고 외부 적용 자기장이 제거된 후에 자기 특성 (자기 모멘트)을 보유할 수 있는 조성물을 기재하기 위해 사용된다.
용어 "나노입자"란, 약 2 nm 내지 약 200 nm (예를 들어, 10 nm 내지 200 nm, 2 nm 내지 100 nm, 2 nm 내지 40 nm, 2 nm 내지 30 nm, 2 nm 내지 20 nm, 2 nm 내지 15 nm, 100 nm 내지 200 nm, 및 150 nm 내지 200 nm)의 직경을 갖는 물체를 의미한다. 나노입자의 비-제한적 예는 본원에 기재된 나노입자를 포함한다.
용어 "자기 나노입자"란, (본원에서 정의된 바와 같이) 자성인 나노입자 (예를 들어, 본원에 기재된 나노입자 중 임의의 것)를 의미한다. 자기 나노입자의 비-제한적 예는 본원에 기재되어 있다. 추가의 자기 나노입자는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
용어 "핵산"이란, 임의의 단일- 또는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 또는 RNA, cDNA, 반-합성, 또는 합성 기원)를 의미한다. 용어 핵산은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어 염기에서의 변형 및/또는 당에서의 변형을 함유함) 및/또는 두 뉴클레오티드를 연결하는 포스포디에스테르 결합에서의 변형을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 적어도 하나의 락킹된 뉴클레오티드 (LNA)를 함유할 수 있다. 핵산의 비-제한적 예는 본원에 기재되어 있다. 핵산의 추가의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
용어 "이미징"이란, 생물리학적 기술 (예를 들어, 전자기 에너지 흡수 및/또는 방출)을 사용한 대상체의 적어도 하나의 조직의 가시화를 의미한다. 이미징의 비-제한적 실시양태는 자기 공명 이미징 (MRI), X선 컴퓨터 단층촬영, 및 광학 이미징을 포함한다.
용어 "대상체" 또는 "환자"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 예를 들어, 실험, 진단, 예방, 및/또는 치료 목적을 위해, 본 개시내용의 조성물 또는 방법이 투여될 수 있는 임의의 포유류 (예를 들어, 인간 또는 수의 대상체, 예를 들어, 개, 고양이, 말, 소, 염소, 양, 마우스, 래트, 또는 토끼)를 지칭한다. 대상체는 치료를 추구하거나 필요로 할 수 있거나, 치료를 요할 수 있거나, 치료를 수용하고 있는 중이거나, 치료를 수용할 것이거나, 특정 질환 또는 병태에 대하여 훈련된 전문가에 의해 돌봄 하에 있다.
명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "나노입자"에 대한 언급은 나노입자의 혼합물을 포함하고, "나노 입자"에 대한 언급은 둘 이상의 이러한 나노입자의 혼합물을 포함하고, 기타 등등이다.
범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값으로부터, 및/또는 "약" 또 다른 특정 값까지로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현되는 경우, 또 다른 실시양태는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 선행사 "약"의 사용에 의해 근사치로서 표현되는 경우, 특정 값은 또 다른 실시양태를 형성함을 이해할 것이다. 추가로, 범위 각각의 종점은 다른 종점과 관련하여, 또한 다른 종점에 대해 독립적으로 모두 중요함을 이해할 것이다.
본 개시내용의 특정 실시양태는 질환의 치료, 방지, 진단, 및/또는 이미징을 필요로 하는 대상체에서 질환의 치료, 방지, 진단, 및/또는 이미징을 위해 나노입자 조성물 중 임의의 것을 사용하는 방법을 포함한다. 치료 및/또는 이미징 목적을 위해 인간 신체에서 표적 부위에 성공적으로 도달하기 위한 필수적 요건을 충족시킬 수 있는 조율가능하고 개선된 나노입자 조성물에 대한 필요성이 현재 존재한다. 본 개시내용의 나노입자 조성물 및 나노입자 조성물의 사용 방법은 상기 언급된 필수적 요건을 해결한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물의 주요 물리적 특징 (예를 들어, 아미노화 및 자기 강도)은 특정 성분의 농도 (예를 들어, 염화제1철 또는 염화제2철의 농도)를 변조함으로써 미세-조율될 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 물리적 특징 (예를 들어, 아미노화, 자기 강도, 크기, 및 다분산성)의 변화 없이 스케일-업될 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 장기간 안정성 (예를 들어, 적어도 최대 6개월)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 자기 나노입자는, 다른 합성 방법에 비해 저렴하고 환경-친화적인, 수성 매질 중에서의 침전 방법에 의해 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 나노입자 조성물의 사용 방법은 질환 (예를 들어, 암)과 관련된 증상을 방지하고/거나, 치료하고/거나, 감소시키고/거나, 제거할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 나노입자 조성물의 사용 방법은 표적 부위 (예를 들어, 종양)의 이미징을 보조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 표적 부위 (예를 들어, 종양)의 이미징 및 치료를 필요로 하는 대상체에서 그 이미징 및 치료에 동시에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 표적 부위 (예를 들어, 종양)로의 페이로드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 지속된 전달을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은, 종래 약물 전달 비히클에 대한 도달이 어려운 표적 부위 (예를 들어, 종양 또는 종양 코어)로의 페이로드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 전달이 가능하다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 생체적합성이고 약 0.25시간 내지 약 24시간의 반감기로 혈액 순환에서 남아 있을 수 있다.
값이 본 개시내용에서 범위로 기재되는 경우, 종점이 포함된다. 또한, 기재는, 구체적 수치 또는 구체적 하위범위가 명시적으로 언급되었는지의 여부와 관계 없이 이러한 범위 내에 포함되는 구체적 수치 뿐만 아니라 이러한 범위 내의 모든 가능한 하위범위의 개시를 포함함을 이해하여야 한다.
본 개시내용의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도로부터, 또한 청구범위로부터 명백할 것이다.
본 개시내용의 특징의 다양한 실시양태가 본원에 기재되어 있다. 그러나, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공되는 것이며, 본 개시내용의 범위로부터 벗어나지 않으면서 많은 변형, 변화, 및 대체가 관련 기술분야의 통상의 기술자에 따라 일어날 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 본원에 기재된 구체적 실시양태에 대한 다양한 대안 또한 본 개시내용의 범위 내에 있음을 이해하여야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서의 사용을 위한 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있으며; 관련 기술분야에 공지되어 있는 다른 적합한 방법 및 물질이 사용될 수도 있다. 물질, 방법, 및 예는 단지 예시적인 것이며, 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 언급된 모든 공개, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목, 및 다른 참조문헌은 그 전체가 참조로 포함된다. 상충의 경우, 정의를 비롯하여 본 명세서가 우선시될 것이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 상세사항이 하기 첨부 도면 및 설명에 기재된다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도로부터, 또한 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 본 개시내용의 나노입자를 제조하는 방법 동안 덱스트란 용해를 위한 셋업의 예를 나타낸다.
도 2은 본 개시내용의 나노입자를 제조하는 방법 동안 덱스트란 용해를 위한 셋업의 예를 나타낸다.
도 3은 6N-염산에 노출된 아미노화된, 덱스트란-코팅된 나노입자의 흡광도 스펙트럼을 나타내고, 이 용액은 자외선/가시광 (UV/Vis) 분광측정에 의해 측정되어 모니터링되었다.
도 4는 자기 나노입자 (MNP) 당 약 60-90개의 아민 기를 갖는 "조건 1" 나노입자의 크기 특성화를 나타내고; 크기는 동적 광 산란에 의해 측정시 약 11.48 나노미터 (nm)였다.
도 5는 MNP 당 약 250개의 아민 기를 갖는 "조건 2" 나노입자의 크기 특성화를 나타내고; 크기는 동적 광 산란에 의해 측정시 약 15.6 nm였다.
도 6은 UV/Vis 분광측정에 의해 측정시 자기 나노입자 (MNP) 당 약 250개의 아민 기를 갖는 "조건 2" 나노입자의 흡광도 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 UV/Vis 분광측정에 의해 측정시 자기 나노입자 (MNP) 당 약 60-90개의 아민 기를 갖는 "조건 1" 나노입자 및 MNP 당 약 246-500개의 아민 기를 갖는 "조건 2" 나노입자의 흡광도 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 조건 1 MNP에서의 올리고뉴클레오티드 로딩의 분석에 대한 겔 전기영동의 예를 나타낸다. 나노입자 당 아미노 기에 대한 올리고뉴클레오티드 (oligo)의 비율을 변화시킴으로써, oligo/자기 나노입자 (oligo/MN)의 수가 점진적으로 증가할 수 있다. oligo/MN 수는 나노입자 당 oligo의 몰비를 나타낸다. oligo의 수는 64개 아민/MNP로 시험되었고, 반응비를 변화시켜 oligo의 로딩을 최대화하였다. 이들 MNP는 표 3에서의 조건에 의해 (즉, 1:1의 Fe3+/Fe2+ 비율을 갖는 MNP), 또한 과량의 수산화암모늄 첨가의 존재 하에 합성되었다.
도 9는 나노입자의 자기 특성의 정량화를 위한 자기 입자 분광측정을 나타낸다. 자기 특성의 주요 기준으로서, 나타낸 제제를 갖는 샘플 사이에서 비-선형성 지수를 비교하였다.
도 10은, 동적 광 산란에 의해 측정시, 약 149.3 nm의 평균 나노입자 크기 및 0.9 nm의 표준 편차를 갖는 Fe3+:Fe2+의 1:1 비율 및 12.1의 비-선형성 지수를 갖는 예시 나노입자를 나타낸다.
도 11은 나노입자의 자기 특성의 정량화를 위한 자기 입자 분광측정을 나타낸다. 표 4에 나타낸 "조건 B"에 따라 합성된 나노입자의 비-선형성 지수는 9.7111인 것으로 계산되었다.
도 12는, 동적 광 산란에 의해 측정시, 약 127.1 nm의 평균 나노입자 크기 및 0.21 nm의 표준 편차를 갖는 도 11의 나노입자를 나타낸다.
도 13은 나노입자의 자기 특성의 정량화를 위한 자기 입자 분광측정을 나타낸다. 표 4에 나타낸 "조건 C"에 따라 합성된 나노입자의 비-선형성 지수는 8.8326인 것으로 계산되었다. 이 측정은 나노입자의 안정성에 대한 확인을 위해 합성 후 1개월에 측정되었다.
도 15는, 동적 광 산란에 의해 측정시, 약 63.47 nm의 평균 나노입자 크기 및 0.61 nm의 표준 편차를 갖는 도 14의 나노입자를 나타낸다.
도 16은 나노입자의 자기 특성의 정량화를 위한 자기 입자 분광측정을 나타낸다. 표 4에 나타낸 "조건 E"에 따라 합성된 나노입자의 비-선형성 지수는 14.3731인 것으로 계산되었다.
도 17은 나노입자의 자기 특성의 정량화를 위한 자기 입자 분광측정을 나타낸다. 표 4에 나타낸 "조건 E"에 따라 합성된 나노입자의 비-선형성 지수는 나노입자의 안정성에 대한 확인을 위해 약 1개월 동안 저장 후 15.6437인 것으로 계산되었다.
도 18은, 약 2개월 동안 저장 후, 동적 광 산란에 의해 측정시, 약 181.83 nm의 평균 나노입자 크기 및 1.0 nm의 표준 편차를 갖는 도 16의 나노입자를 나타낸다.
도 19는 나노입자의 자기 특성의 정량화를 위한 자기 입자 분광측정을 나타낸다. 표 4에 나타낸 "조건 F"에 따라 합성된 나노입자의 비-선형성 지수는 14.806인 것으로 계산되었다.
도 20은 나노입자의 자기 특성의 정량화를 위한 자기 입자 분광측정을 나타낸다. 도 19의 나노입자의 비-선형성 지수는 약 1개월 동안 저장 후 14.2168인 것으로 계산되었다.
도 21은, 약 2개월 동안 저장 후, 동적 광 산란에 의해 측정시, 약 185.97 nm의 평균 나노입자 크기 및 0.25 nm의 표준 편차를 갖는 도 19의 나노입자를 나타낸다.
도 22는 현탁액 안정화를 위한 아민 기로의 예시 나노입자의 표면 개질 및 향상된 혈액 순환을 위한 폴리에틸렌 글리콜-2000 (PEG-2000)으로의 예시 나노입자의 표면 개질을 개략적으로 나타내는 것이다.
상세한 설명
본원에 기재된 자기 나노입자는 조율가능한 자기 특성 및 표면 관능화를 갖는 것이 가능한 것으로 발견되었다. 이들 특징을 갖는 자기 나노입자 뿐만 아니라 이들 자기 나노입자를 제조하는 방법 및 이들 자기 나노입자를 투여하는 것에 의한 질환의 치료, 방지, 및/또는 이미징을 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료, 방지, 및/또는 이미징 방법이 본원에서 제공된다.
나노입자 조성물
염화제2철, 염화제1철, 또는 이들의 조합, 및 덱스트란 코팅을 포함하는 자기 나노입자를 포함하는 나노입자 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 상이한 나노입자 조성물 중 둘 이상의 혼합물을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 조율가능한 표면 관능화를 갖는 적어도 하나의 자기 나노입자, 및 조율가능한 자기 특성을 갖는 적어도 하나의 자기 나노입자를 함유한다.
조율가능한 아민 기 관능화
일부 실시양태에서, 자기 나노입자는 하나 이상의 아민 기로 관능화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 관능화는 자기 나노입자의 표면에서 나타난다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아민 기는 덱스트란 코팅에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아민 기는 덱스트란 코팅의 하나 이상의 히드록실 기를 치환한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아민 기의 수는 염화제2철, 염화제1철, 또는 이들의 조합의 농도에 기초하여 조율가능하다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 5 내지 약 1000개의 아민 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 5 내지 25, 25 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 250, 250 내지 300, 300 내지 350, 350 내지 400, 450 내지 500, 500 내지 550, 550 내지 600, 600 내지 650, 650 내지 700, 700 내지 750, 750 내지 800, 800 내지 850, 850 내지 900, 900 내지 950, 또는 950 내지 1000개의 아민 기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 자기 나노입자는 자기 물질 (예를 들어, 염화제2철 및/또는 염화제1철)의 코어를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 0.60 g 내지 약 0.70 g의 염화제2철 및 약 0.3 g 내지 약 0.5 g의 염화제1철을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 약 0.60 g 내지 약 0.70 g의 염화제2철 및 약 0.3 g 내지 약 0.5 g의 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물이 약 5 내지 150개의 아민 기로 관능화된다. 일부 실시양태에서는, 약 0.65 g의 염화제2철 및 약 0.4 g의 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물이 약 60 내지 90개의 아민 기로 관능화된다. 일부 실시양태에서는, 약 0.65 g의 염화제2철 및 약 0.4 g의 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물이 약 5 내지 150개의 아민 기로 관능화된다. 일부 실시양태에서, 약 0.65 g의 염화제2철 및 약 0.4 g의 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물이 약 1 내지 150개의 아민 기로 관능화된다. 일부 실시양태에서는, 약 0.65 g의 염화제2철 및 약 0.4 g의 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물이 약 적어도 1 내지 10개의 아민 기, 10 내지 20개의 아민 기, 약 20 내지 30개의 아민 기, 약 30 내지 40개의 아민 기, 약 40 내지 50개의 아민 기, 약 50 내지 60개의 아민 기, 약 60 내지 70개의 아민 기, 약 70 내지 80개의 아민 기, 약 80 내지 90개의 아민 기, 약 90 내지 100개의 아민 기, 약 100 내지 110개의 아민 기, 약 110 내지 120개의 아민 기, 약 120 내지 130개의 아민 기, 약 130 내지 140개의 아민 기, 또는 약 140 내지 150개의 아민 기로 관능화된다.
일부 실시양태에서, 약 1 g 내지 약 1.4 g의 염화제2철을 포함하는 나노입자 조성물. 일부 실시양태에서는, 약 1 g 내지 약 1.4 g의 염화제2철을 포함하는 나노입자 조성물이 약 246 내지 500개의 아민 기로 관능화된다. 일부 실시양태에서는, 약 1.2 g의 염화제2철을 포함하는 나노입자 조성물이 약 246 내지 500개의 아민 기로 관능화된다. 일부 실시양태에서, 약 246 내지 500개의 아민 기로 관능화된 나노입자 조성물은 염화제2철을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서는, 약 1.2 g의 염화제2철을 포함하는 나노입자 조성물이 약 200 내지 600개의 아민 기로 관능화된다. 일부 실시양태에서는, 약 1.2 g의 염화제2철을 포함하는 나노입자 조성물이 약 적어도 200 내지 250개의 아민 기, 250 내지 300개의 아민 기, 약 300 내지 350개의 아민 기, 약 350 내지 400개의 아민 기, 약 400 내지 450개의 아민 기, 약 450 내지 500개의 아민 기, 약 500 내지 550개의 아민 기, 약 550 내지 600개의 아민 기, 또는 그 초과로 관능화된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 덱스트란 코팅에 컨쥬게이션된 아민 기의 수는, 자기 나노입자를 제조하는 데 사용되는 염화제2철 및 염화제1철의 농도를 제어함으로써 미세-조율될 수 있다.
조율가능한 자기 특성
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 염화제2철, 염화제1철, 또는 이들의 조합의 농도에 기초하여 조율가능한 자기 강도를 갖는 자기 나노입자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 MNP 당 총 철 중에 약 0.1% 내지 약 99.9%의 제2철 이온 및 약 99.9% 내지 약 0.1%의 제1철 이온을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약 60% 내지 약 80%의 염화제2철 및 약 20% 내지 약 40%의 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물은 약 80%보다 높은 양의 염화제1철을 갖는 나노입자 조성물보다 더 강한 자기 특성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 약 70%의 제2철 이온 및 약 30% g의 제1철 이온을 포함하는 나노입자 조성물은 약 30%보다 높은 양의 제1철 이온을 갖는 나노입자 조성물보다 더 강한 자기 특성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 자기 나노입자의 자기 강도는 자기 입자 분광측정에 의해 비-선형성 지수 (NLI)를 측정함으로써 정량화될 수 있다. NLI는 입자가 자기 입자 이미징 또는 자기 나노입자의 비-선형 거동에 의존하는 다른 기술에 적절한지의 여부를 결정하기 위해 사용되는 기준이다. NLI는 자기 입자 분광계 시스템에서의 파라미터인 F3에 대한 F1의 비율을 계산함으로써 결정될 수 있다. F1/F3은 입자의 자화 대 외부 자기장을 비교한다. F1은 푸리에(Fourier) 분해에 따른 외부 자기 여기 ("구동") 주파수의 크기이고, F3은 구동 주파수의 제3 고조파의 크기를 지칭하고 (예를 들어, 구동 주파수가 25kHz인 경우, F1은 25kHz이고 F3은 75kHz임); 그에 따라, F1 및 F3은 주파수의 크기로 계산되고, 푸리에 분해 공정은 시간 도메인에서 비-선형 상관관계를 분석하는 것을 가능하게 한다. 입자가 자기 입자 분광계에 의해 사용되는 외부 자기장에 선형 비례하는 자기 특성을 가지면, 그의 비-선형성 지수는 매우 클 수 있다. 입자가 자기 입자 분광계에 의해 사용되는 외부 자기장에 선형 비례하는 자기 특성을 가지면, 그의 비-선형성 지수는 매우 클 수 있다. 외부 자기장에 의해 자화될 때의 자기 강도에 대하여 외부 자기장이 없는 입자의 투자율 ("자기 강도" 또는 도 9, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 및 20에서 "dM/dH")이 클수록, 비-선형성 지수가 작을 것이다 (예를 들어, 이것이 1에 가깝게 접근할수록, 방형파 자화 응답의 NLI). 역으로, 입자의 완전히 자화된 상태와 입자의 초기 자기 강도가 유사할수록, 비-선형성 지수가 클 것이다. NLI은 특정 여기 조건과 관련됨에 따라, 본원에 존재하는 모든 측정 전반에 걸쳐 동일한 외부장이 사용되었지만 (4.5mT/μ0의 피크 크기를 갖는 사인(sinusoidal)장), 방법 및 분석은 다른 작업 조건에 유사하게 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 6 내지 약 40 범위의 NLI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 6 내지 약 70 범위의 NLI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 8.5 내지 약 14.8 범위의 NLI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 8 내지 약 14 범위의 NLI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 6의 NLI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 8의 NLI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 14의 NLI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 67의 NLI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 6 내지 7, 7 내지 8, 8 내지 9, 9 내지 10, 10 내지 11, 11 내지 12, 12 내지 13, 13 내지 14, 14 내지 15, 15 내지 16, 16 내지 17, 17 내지 18, 18 내지 19, 19 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 또는 60 내지 70 범위의 NLI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 약 0.54 g의 염화제2철 및 약 0.2 g의 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물은 약 8.5 내지 약 14.8 범위의 비-선형성 지수를 갖는다. 일부 실시양태에서, 약 0.54 g의 염화제2철 및 약 0.2 g의 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물은 약 12의 비-선형성 지수를 갖는다.
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 80% 내지 약 100%의 염화제2철 및 약 20% 내지 약 0%의 염화제1철을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약 0% 내지 약 50%의 염화제2철 및 약 100% 내지 약 50%의 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물은 약 0.4 g보다 낮은 양의 염화제1철을 갖는 나노입자 조성물보다 더 약한 자기 특성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 약 0.54 g의 염화제2철 및 약 0.4 g의 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물은 약 0.2 g보다 낮은 양의 염화제1철을 갖는 나노입자 조성물보다 더 약한 자기 특성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 약 0.54 g의 염화제2철 및 약 0.4 g의 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물은 약 50 내지 약 120 범위의 비-선형성 지수를 갖는다. 일부 실시양태에서, 약 0.54 g의 염화제2철 및 약 0.4 g의 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물은 약 67의 비-선형성 지수를 갖는다.
따라서, 일부 실시양태에서, 자기 나노입자의 자기 특성 (예를 들어, 자기 강도)은, 자기 나노입자를 제조하는 데 사용되는 염화제2철 및 염화제1철의 농도를 제어함으로써 미세-조율될 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 8 μM 내지 약 217 μM 범위의 철 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 8 μM 내지 약 15 μM, 약 15 μM 내지 약 25 μM, 약 25 μM 내지 약 50 μM, 50 μM 내지 약 60 μM, 약 60 μM 내지 약 70 μM, 약 70 μM 내지 약 80 μM, 80 μM 내지 약 90 μM, 약 90 μM 내지 약 100 μM, 약 100 μM 내지 약 110 μM, 110 μM 내지 약 120 μM, 약 120 μM 내지 약 130 μM, 약 130 μM 내지 약 140 μM, 140 μM 내지 약 150 μM, 약 150 μM 내지 약 160 μM, 약 160 μM 내지 약 170 μM, 170 μM 내지 약 180 μM, 약 180 μM 내지 약 190 μM, 약 190 μM 내지 약 200 μM, 200 μM 내지 약 210 μM, 약 210 μM 내지 약 220 μM 범위의 철 농도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL 범위의 철 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약 1 mg/mL 내지 약 5 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 15 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 또는 약 20 mg/mL 내지 약 25 mg/mL 범위의 철 농도를 갖는다.
다른 물리적 특성
일부 실시양태에서, 약물 전달에 사용되는 나노입자의 중요 특성은 나노입자의 생분해성, 독성 프로파일, 및 약동학/약역학을 포함한다. 나노입자의 조성 및/또는 크기는 그의 생물학적 운명의 중요 결정인자이다. 예를 들어, 보다 큰 나노입자는 전형적으로 간에 의해 섭취되고 분해되는 반면, 보다 작은 나노입자 (직경 <30 nm)는 전형적으로 장시간 동안 (때로는 인간에서 24시간 혈액 반감기에 걸쳐) 순환되고 종양 및 전이와 같은 과투과성 혈관을 갖는 기관의 간질 및 림프절에 축적된다.
일부 실시양태에서, 자기 나노입자는 약 2 나노미터 (nm) 내지 약 200 nm (예를 들어, 약 2 nm 내지 약 10 nm, 약 10 nm 내지 약 30 nm, 약 5 nm 내지 약 25 nm, 약 10 nm 내지 약 25 nm, 약 15 nm 내지 약 25 nm, 약 20 nm 내지 약 25 nm, 약 25 nm 내지 약 50 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 약 70 nm 내지 약 200 nm, 약 80 nm 내지 약 200 nm, 약 100 nm 내지 약 200 nm, 약 140 nm 내지 약 200 nm, 및 약 150 nm 내지 약 200 nm), 예를 들어, 적어도 약 2, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 70, 80, 100, 120, 125, 140, 또는 150 nm, 최대 약 10, 20, 25, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 또는 250 nm의 직경을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 자기 나노입자는 구형 또는 타원형일 수 있거나 무정형 형상을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 자기 나노입자는 약 2 nm 내지 약 200 nm (예를 들어, 약 10 nm 내지 약 200 nm, 약 2 nm 내지 약 30 nm, 약 5 nm 내지 약 25 nm, 약 10 nm 내지 약 25 nm, 약 15 nm 내지 약 25 nm, 약 20 nm 내지 약 25 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 약 70 nm 내지 약 200 nm, 약 80 nm 내지 약 200 nm, 약 100 nm 내지 약 200 nm, 약 140 nm 내지 약 200 nm, 및 약 150 nm 내지 약 200 nm)의 직경 (나노입자 조성물의 외부 표면 상의 임의의 2개의 지점 사이)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 2 nm 내지 약 30 nm의 직경을 갖는 자기 나노입자는 대상체 내의 종양, 림프절, 및 전이 병변으로 국소화된다. 일부 실시양태에서, 약 40 nm 내지 약 200 nm의 직경을 갖는 자기 나노입자는 간으로 국소화된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 자기 나노입자는 약 0.05 내지 약 0.25의 다분산 지수 (PDI)를 가질 수 있다. PDI는 본질적으로 주어진 샘플 내의 크기 집단의 분포를 나타낸다. PDI의 수치는 0.0 (입자 크기에 대하여 완벽하게 균일한 샘플에 대하여) 내지 1.0 (다수의 입자 크기 집단을 갖는 고도로 다분산성인 샘플에 대하여)의 범위이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 자기 나노입자는 약 0.050 내지 0.100, 약 0.100 내지 0.110, 약 0.110 내지 0.120, 약 0.120 내지 0.130, 약 0.130 내지 0.140, 약 0.140 내지 0.150, 약 0.150 내지 0.160, 약 0.160 내지 0.170, 약 0.170 내지 0.180, 약 0.180 내지 0.190, 약 0.190 내지 0.200, 약 0.200 내지 0.210, 약 0.210 내지 0.220, 약 0.230 내지 0.240, 또는 약 0.240 내지 0.250의 PDI를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 자기 물질 또는 입자는 자기장에 대해 응답성인 반자성, 상자성, 초상자성, 또는 강자성 물질을 함유할 수 있다. 치료용 자기 나노입자의 비-제한적 예는 마그네타이트; 페라이트 (예를 들어, 망가니즈, 코발트, 및 니켈의 페라이트); Fe(II) 산화물, 및 헤마타이트, 및 이들의 금속 합금의 군으로부터 선택된 금속 산화물을 함유하는 자기 물질의 코어를 함유한다. 본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 치료용 자기 나노입자의 위치 또는 국소화는 대상체에서 이미징 (예를 들어, 자기 나노입자의 하나 이상의 용량 투여 후 대상체에서 이미징)될 수 있다.
중합체 코팅
본원에 기재된 자기 나노입자는 코어 자기 물질 상의 (예를 들어, 자기 물질의 표면 상의) 중합체 (예를 들어, 덱스트란) 코팅을 함유한다. 중합체 물질은 하나 이상의 생물학적 작용제 (예를 들어, 본원에 기재된 핵산 중 임의의 것)의 부착 또는 커플링에 적합할 수 있다. 하나 이상의 생물학적 작용제 (예를 들어, 핵산)는 화학적 커플링 (예를 들어, 공유 결합)에 의해 중합체 코팅에 부착될 수 있다.
산화철 나노입자의 합성 방법은, 예를 들어, 물리적 및 화학적 방법을 포함한다. 예를 들어, 산화철은, 예를 들어, 실시예 1-8에 기재된 바와 같이, 수용액 중에서의 Fe2+ 및 Fe3+ 염의 공-침전에 의해 제조될 수 있다. 생성된 코어는 마그네타이트 (Fe3O4), 마그헤마이트 (γ-Fe2O3) 또는 둘의 혼합물로 이루어진다. 음이온성 염 내용물 (예를 들어, 염화물, 질산염, 황산염 등)에 대하여, 수용액 중의 Fe2+ 및 Fe3+ 비율, pH, 및 이온 강도는 모두 나노입자의 크기 제어에서 역할을 한다. 질소 또는 아르곤과 같은 불활성 기체 하에 무산소 환경에서 반응을 수행함으로써 합성된 나노입자의 산화를 방지하고 그의 자기 특성을 보호하는 것이 중요하다. 산화철 나노입자가 마이크로입자로 응집되는 것을 방지하기 위해 공-침전 공정 동안 코팅 물질이 첨가될 수 있다. 숙련된 실무자는 임의 수의 공지된 표면 코팅 물질이 산화철 나노입자의 안정화에 사용될 수 있으며, 이들 중에는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 지방 산, 폴리펩티드, 키토산, 젤라틴 등의 합성 및 천연 중합체가 포함됨을 인지할 것이다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 PEG를 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 PEG-2000을 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 PEG-1000, PEG-3000, PEG-3350, PEG-4000, PEG-6000, PEG-8000, PEG-12,000, PEG-20,000, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 중합체 코팅은 덱스트란이다. 일부 실시양태에서, 덱스트란 코팅은 자기 나노입자에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 덱스트란 코팅은 약 1 킬로달톤 (kDa) 내지 약 15 kDa 범위의 분자량을 갖는 덱스트란을 포함한다. 일부 실시양태에서, 덱스트란 코팅은 약 1 kDa의 분자량을 갖는 덱스트란을 포함한다. 일부 실시양태에서, 덱스트란 코팅은 약 5 kDa의 분자량을 갖는 덱스트란을 포함한다. 일부 실시양태에서, 덱스트란 코팅은 약 10 kDa의 분자량을 갖는 덱스트란을 포함한다. 일부 실시양태에서, 덱스트란 코팅은 약 15 kDa의 분자량을 갖는 덱스트란을 포함한다. 일부 실시양태에서, 덱스트란 코팅은, 실시예 2에 기재된 바와 같은, 화학적으로 가교된 덱스트란을 포함한다. 자기 물질의 코어를 코팅하는 데 사용될 수 있는 대안적 적합한 중합체는 제한 없이 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리에테르우레탄, 폴리술폰, 플루오린화 또는 염소화된 중합체, 예컨대 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 및 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 및 폴리에스테르를 포함한다. 자기 물질의 코어를 코팅하는 데 사용될 수 있는 중합체의 추가 예는 폴리올레핀, 예컨대 폴리부타디엔, 폴리디클로로부타디엔, 폴리이소프렌, 폴리클로로프렌, 폴리비닐리덴 할라이드, 폴리비닐리덴 카르보네이트, 및 폴리플루오린화된 에틸렌을 포함한다. 스티렌/부타디엔, 알파-메틸 스티렌/디메틸 실록산, 또는 다른 폴리실록산을 포함한 많은 공중합체가 또한 자기 물질의 코어를 코팅하는 데 사용될 수 있다 (예를 들어, 폴리디메틸 실록산, 폴리페닐메틸 실록산, 및 폴리트리플루오로프로필메틸 실록산). 자기 물질의 코어를 코팅하는 데 사용될 수 있는 추가의 중합체는 폴리아크릴로니트릴 또는 아크릴로니트릴-함유 중합체, 예컨대 폴리 알파-아크릴아니트릴 공중합체, 알키드 또는 테르페노이드 수지, 및 폴리알킬렌 폴리술포네이트를 포함한다.
약물 페이로드
일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 약물 페이로드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 약물 페이로드는 덱스트란 코팅의 표면에 부착 (예를 들어, 공유 결합을 통해)될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약물 페이로드는 약물, 항체, 성장 인자, 핵산, 핵산 유도체, 핵산 단편, 단백질, 단백질 유도체, 단백질 단편, 펩티드, 소분자, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 약물 페이로드는 중합체 코팅 (예를 들어, 덱스트란 코팅)의 하나 이상의 아민 기에 컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 약물 페이로드는 핵산이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 안티센스 RNA, 소간섭 RNA (siRNA), DNA, 마이크로RNA 모방체, 압타머, 또는 리보자임이다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 (변형된 염기 또는 당을 함유하는 뉴클레오티드)를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 포스페이트 (포스포디에스테르) 백본 내의 적어도 하나의 변형을 함유할 수 있다. 이들 변형의 도입은 안정성을 증가시키거나 핵산 분자의 혼성화 또는 용해도를 개선시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 약물 페이로드 (예를 들어, 핵산)는 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합을 함유하는 화학 모이어티를 통해 자기 나노입자에 (예를 들어, 자기 나노입자의 중합체 코팅에) 부착된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 아미드 결합을 함유하는 화학 모이어티를 통해 자기 나노입자에 부착된다. 핵산을 자기 나노입자에 공유 연결하기 위해 사용될 수 있는 추가의 화학 모이어티는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
약물 페이로드를 자기 나노입자에 공유 연결하기 위해 다양한 상이한 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 자기 나노입자에 대한 약물 페이로드의 부착을 위해 카르보디이미드가 사용된다.
제약 조성물
본 개시내용의 나노입자 조성물 중 임의의 것 및 적어도 하나의 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물이 또한 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 자기 나노입자를 포함한다. 본원에 기재된 자기 나노입자의 유형 중 임의의 것 2개 이상 (예를 들어, 2, 3, 또는 4개)이 임의의 조합으로 제약 조성물에 존재할 수 있다. 제약 조성물은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방식으로 제제화될 수 있다.
제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로 (예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내, 피하, 또는 복강내)와 상용성이 되도록 제제화된다. 조성물은 멸균 희석제 (예를 들어, 멸균수 또는 식염수), 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매, 항박테리아 또는 항진균제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등, 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중황산나트륨, 킬레이팅제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산, 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트, 또는 포스페이트, 및 등장제, 예컨대 당 (예를 들어, 덱스트로스), 폴리알콜 (예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨), 또는 염 (예를 들어, 염화나트륨), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 또한 리포솜 현탁액이 제약상 허용가능한 담체로서 사용될 수 있다. 조성물의 조제물은 앰풀, 일회용 시린지, 또는 다중 용량 바이알 내에서 제제화되고 봉입될 수 있다. 요구되는 경우 (예를 들어, 주사용 제제에서와 같이), 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴, 또는 계면활성제의 사용에 의해, 적당한 유동성이 유지될 수 있다. 흡수를 지연시키는 작용제 (예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴)의 포함에 의해 나노입자 조성물의 흡수가 연장될 수 있다. 대안적으로, 생분해성, 생체적합성 중합체 (예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산)를 포함할 수 있는, 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템에 의해 제어 방출이 달성될 수 있다. 본원에 기재된 자기 나노입자 중 임의의 것 중 하나 이상을 함유하는 조성물은 투여 단위 형태 (즉, 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유하는 물리적으로 분리된 단위)의 비경구 (예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내, 피하, 또는 복강내) 투여를 위해 제제화될 수 있다.
조성물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양 또는 실험 동물 (예를 들어, 원숭이)에서의 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, LD50 (집단의 50%에 대한 치사량) 및 ED50 (집단의 50%에서의 치료 유효 용량)을 결정할 수 있다: 치료 지수는 LD50:ED50의 비율임. 높은 치료 지수를 나타내는 작용제가 바람직하다. 작용제가 바람직하지 않은 부작용을 나타내는 경우, 잠재적 위험을 최소화하기 위해 (즉, 원치않는 부작용을 감소시키기 위해) 주의를 기울여야 한다. 독성 및 치료 효능은 다른 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터가 대상체 (예를 들어, 인간)에서의 사용을 위한 임의의 주어진 작용제의 적절한 투여량의 제제화에 사용될 수 있다. 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4종의) 자기 나노입자 (예를 들어, 본원에 기재된 자기 나노입자 중 임의의 것)의 치료 유효량은, (예를 들어, 동일한 질환을 갖지만 치료를 수용하지 않거나 상이한 치료를 갖는 대조군 대상체, 또는 치료 전의 동일한 대상체에 비해) 암을 갖는 대상체에서의 암 세포 침입 또는 전이를 감소시키거나, 대상체에서의 전이 암을 치료하거나, 대상체에서의 전이 종양 크기를 감소 또는 안정화시키거나, 대상체에서의 전이 종양 성장의 속도를 감소시키거나, 대상체 (예를 들어, 인간)에서의 전이 암의 하나 이상의 증상의 중증도, 빈도수, 및/또는 지속기간을 감소시키거나, 대상체에서의 전이 암의 증상의 수를 감소시키는 양일 것이다.
본원에 기재된 자기 조성물 중 임의의 것의 유효성 및 투여는, 대상체 (예를 들어, 인간)에서의 전이 암의 하나 이상의 증상의 관찰에 의해서 뿐만 아니라, 관련 기술분야에 공지되어 있는 방법을 사용하는 의료 전문가에 의해 결정될 수 있다. 특정 인자가 대상체를 효과적으로 치료하기 위해 요구되는 투여량 및 시기에 영향을 줄 수 있다 (예를 들어, 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상체의 일반적 건강 및/또는 연령, 및 다른 질환의 존재).
예시적 용량은 대상체의 체중 1 킬로그램 당 본원에 기재된 나노입자 조성물 중 임의의 것의 밀리그램 또는 마이크로그램 양을 포함한다. 이들 용량은 폭넓은 범위를 포괄하지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 본원에 기재된 나노입자 조성물을 포함한 치료 작용제가 그의 효력에 있어 다양하며, 유효량은 관련 기술분야에 공지되어 있는 방법에 의해 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 전형적으로, 먼저 상대적으로 낮은 용량이 투여되고, 적절한 응답이 얻어질 때까지 담당 의료 전문가 (치료적 응용의 경우) 또는 조사자 (여전히 발달 단계에 있을 때)가 이후에 점차 용량을 증가시킬 수 있다. 추가로, 임의의 특정 대상체에 대한 구체적 용량 수준은 사용되는 구체적 화합물의 활성, 대상체의 연령, 체중, 일반적 건강, 성별, 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도, 및 생체내에서의 나노입자 조성물의 반감기를 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 것임을 이해한다.
제약 조성물은 투여에 대한 지시와 함께 용기, 팩, 또는 분배기 내에 포함될 수 있다.
합성 방법
일부 실시양태에서는, 실시예 1-8에 상술된 바와 같은, 본 개시내용의 나노입자 조성물 중 임의의 것을 제조하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 덱스트란을 물 중에 용해시키고, 염화제1철 용액, 염화제2철 용액, 또는 이들의 조합을 제조하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 염화제1철 용액, 염화제2철 용액, 또는 이들의 조합을 덱스트란에 첨가함으로써 혼합물을 제조하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 염기를 교반하면서 혼합물에 첨가하고 혼합물을 빙조에 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 약 10 mL 내지 15 mL의 염기를 혼합물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 약 25 mL 내지 30 mL의 염기를 혼합물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 약 10 mL 내지 15 mL, 15 mL 내지 20 mL, 20 mL 내지 25 mL, 25 mL 내지 30 mL 또는 그 초과의 염기를 혼합물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기는 수산화암모늄이다. 일부 실시양태에서, 염기는 수산화나트륨이다. 일부 실시양태에서, 방법은 약 10 mL의 수산화암모늄을 혼합물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 약 15 mL의 수산화암모늄을 혼합물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 약 25 mL의 수산화암모늄을 혼합물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 약 30 mL의 수산화암모늄을 혼합물에 첨가하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 수산화암모늄을 교반하면서 혼합물에 첨가하고 혼합물을 빙조에 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 덱스트란 코팅 상의 히드록실 기의 동일한 부위에 아민 기를 도입하기 위해 과량의 암모니아 또는 수산화암모늄이 요구된다. 일부 실시양태에서, 방법은 약 60 mL의 수산화암모늄을 혼합물 (예를 들어, 나노입자 전구체 조성물)에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 혼합물을 약 75℃ 내지 약 90℃의 온도에 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 수산화암모늄이 첨가된 후 혼합물을 약 75℃ 내지 약 90℃의 온도에 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수산화암모늄의 첨가 단계는 산화철 결정, 산화철 수화물, 또는 이들의 조합의 형성을 방지한다. 일부 실시양태에서, 수산화암모늄의 첨가 단계는 덱스트란 코팅을 하나 이상의 아민 기로 관능화한다.
일부 실시양태에서, 방법은 덱스트란을 에피클로로히드린으로 가교시키는 것을 포함한다. 에피클로로히드린은 덱스트란 중합체 백본 상의 2개의 히드록실 기를 가교시키기 위해 사용될 수 있는 화학물질이다. 일부 실시양태에서, 에피클로로히드린에 의한 가교는 산화철 코어의 표면 상의 덱스트란 코트의 화학적 안정화를 보장한다. 일부 실시양태에서, 에피클로로히드린은 중합되어 덱스트란 중합체 백본 상의 히드록실 기 사슬을 연장시킬 수 있고, 이는 아민 기로 치환될 수 있는 히드록실 기의 증가를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 혼합물에 대한 수산화암모늄의 첨가는 반응 혼합물 중의 남아 있는 미반응 에피클로로히드린을 파괴한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 나노입자 조성물 중 임의의 것은 스케일-업이 가능하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 방법은 약 21 mL의 제1 나노입자 조성물의 제1 최종 부피를 얻는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 나노입자 조성물 (예를 들어, 자기 나노입자의 작은 스케일 배치)은 물리적 특성의 제1 세트를 갖는 것을 특징으로 하는 제1 자기 나노입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 약 21 mL 초과의 제2 나노입자 조성물 (예를 들어, 자기 나노입자의 큰 스케일 배치)의 제2 최종 부피를 얻는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 나노입자 조성물의 제2 최종 부피는 약 20 mL 내지 약 30 mL, 약 30 mL 내지 약 40 mL, 약 40 mL 내지 약 50 mL, 약 50 mL 내지 약 60 mL, 약 60 mL 내지 약 70 mL, 약 70 mL 내지 약 80 mL, 약 80 mL 내지 약 90 mL, 약 90 mL 내지 약 100 mL, 약 100 mL 내지 약 100 mL, 또는 약 110 mL 내지 약 120 mL이다.
일부 실시양태에서, 제2 나노입자 조성물은 물리적 특성의 제2 세트를 갖는 것을 특징으로 하는 제2 자기 나노입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 물리적 특성의 제1 및 제2 세트는 대략 동일하다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 나노입자 조성물 중 임의의 것은 그의 물리적 특성 (예를 들어, 크기, PDI, 또는 NLI)에 대한 변화 없이 스케일-업될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 나노입자 조성물 중 임의의 것은 그의 물리적 특성에 대한 변화 없이 스케일-업될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 물리적 특성은 직경, 자기 강도, 다분산 지수, 표면 전하, 비-선형 지수 값, PDI 값, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 나노입자 조성물은 적어도 약 1일 내지 약 6개월 또는 그 초과 동안 안정적이다. 용어 "안정적" 또는 "안정성"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 자기 나노입자 또는 조성물이 제조된 날로부터 이들이 저장된 후의 샘플인 날까지 측정 및 비교시 이들의 동일한 샘플의 물리적 특성 중 임의의 것의 변화가 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 나노입자 조성물은 적어도 약 1일 내지 약 5일 동안, 약 5일 내지 10일, 약 10일 내지 약 15일 동안, 약 15일 내지 30일, 약 30일 내지 약 40일 동안, 약 40일 내지 50일, 약 50일 내지 약 60일, 약 3개월 내지 약 4개월, 약 4개월 내지 약 5개월, 약 5개월 내지 약 6개월, 또는 그 초과 동안 안정적이다.
치료 방법
일부 실시양태에서는, 질환의 치료, 방지, 또는 이미징을 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료, 방지, 또는 이미징 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 치료 유효량의 본원에 개시된 나노입자 조성물 중 임의의 것을 대상체의 신체, 신체 부분, 조직, 세포, 또는 체액의 일부에서 적어도 표적 부위에 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 나노입자 조성물 중 임의의 것은 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 나노입자 조성물 중 임의의 것은 질환의 이미징 (예를 들어, 자기 공명 이미징 (MRI)을 통한)을 필요로 하는 대상체에서의 질환의 이미징 방법에서 사용된다. 일부 실시양태에서는, 대상체에서의 암 세포 침입 또는 전이의 감소 (예를 들어, 현저한 또는 관찰가능한 감소) 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 적어도 하나의 나노입자 조성물을 대상체에서의 암 세포 침입 또는 전이를 감소시키기에 충분한 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 에너지를 자기 나노입자 조성물 및 표적 부위에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 에너지는 광 에너지 또는 자기 에너지이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 에너지의 투여 단계는 자기장을 투여하거나 본원에 기재된 나노입자 조성물 중 임의의 것이 투여된 대상체를 자기 공명 이미징을 위해 자기장에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 대상체의 신체, 신체 부분, 조직, 세포, 또는 체액의 일부를 이미징하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 질환을 치료, 방지 (예를 들어, 조기 단계에 암의 검출을 가능하게 함으로써 암 세포의 추가 전이를 방지함), 및/또는 이미징할 수 있다. 일부 실시양태에서, 질환은 암이다. 일부 실시양태에서, 질환은 전이 암이다. 일부 실시양태에서, 표적 부위는 종양 부위이다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 대상체의 표적 부위에 축적된다 (예를 들어, 본 개시내용의 자기 나노입자의 크기로 인해). 일부 실시양태에서, 방법은 나노입자 조성물을 사용하여 표적 부위를 이미징하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이미징은 자기 공명 이미징을 사용하여 수행된다.
일부 실시양태에서, 에너지를 자기 나노입자 조성물 및 표적 부위에 투여하는 단계는 임의적 단계이다. 예를 들어, 자기 조성물은 치료용 조성물 및 이미징 작용제 (예를 들어, 조영제) 둘 다로서가 아니라 치료용 조성물 단독으로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 자기 조성물은 치료용 조성물 및 이미징 작용제 (예를 들어, 조영제) 둘 다로서가 아니라 이미징 작용제 단독으로서 사용될 수 있다.
투여(dosing, administration) 및 조성물
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 나노입자 조성물은 의료 전문가 (예를 들어, 의사, 의사의 조수, 간호사, 또는 실험실 또는 진료소 직원), 대상체 (즉, 자가-투여)에 의해 투여될 수 있다. 투여는 임상 셋팅 (예를 들어, 진료소 또는 병원)에서, 보조 생활 시설에서, 또는 약국에서 수행될 수 있다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물은 질환 (예를 들어, 암, 예컨대 원발성 암 또는 전이 암)을 갖는 것으로 진단된 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 전이 암을 갖는 것으로 진단된 바 있다. 전이 암의 비-제한적 예는 유방암, 방광암, 결장암, 신장암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 위암, 갑상선암, 및 자궁암을 포함한다. 일부 비-제한적 실시양태에서, 대상체는 남성 또는 여성, 성인, 청소년, 또는 아동이다. 대상체는 암 또는 전이 암 (예를 들어, 림프절에서의 전이 암)의 하나 이상의 증상을 경험하였을 수 있다. 대상체는 또한 암 (예를 들어, 원발성 또는 전이 암)의 중증 또는 진행된 단계를 갖는 것으로 진단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 적어도 하나의 림프절 내에 존재하는 전이 종양을 갖는 것으로 식별되었을 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 이미 림프절제술 및/또는 유방절제술을 받았을 수 있다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 대상체는 본원에 기재된 나노입자 조성물 또는 제약 조성물 중 임의의 것 중 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4종)을 함유하는 조성물의 적어도 하나의 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 30개) 용량을 투여받는다. 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 적어도 하나의 나노입자 조성물 또는 제약 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 나노입자 조성물 또는 제약 조성물 중 임의의 것)은 대상체에게 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 자기 입자 또는 제약 조성물은 대상체에서의 림프절 내로 직접 투여된다 (주사된다).
일부 실시양태에서, 대상체는 적어도 하나의 나노입자 조성물 또는 제약 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 나노입자 조성물 또는 제약 조성물 중 임의의 것) 및 적어도 하나의 추가의 치료 작용제를 투여받는다. 적어도 하나의 추가의 치료 작용제는 화학요법 작용제 (예를 들어, 시클로포스파미드, 메클로레타민, 클로람부실, 멜팔란, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 발루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에토포시드, 테니포시드, 타플루포시드, 아자시티딘, 아자티오프린, 카페시타빈, 시타라빈, 독시플루리딘, 플루오로우라실, 겜시타빈, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 티오구아닌, 블레오마이신, 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 보르테조밉, 카르필조밉, 살리노스포라미드 A, 전체-트랜스 레티노산, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 및 비노렐빈) 및/또는 진통제 (예를 들어, 아세트아미노펜, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페나메이트, 메페남산, 멜록시캄, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 페닐부타존, 피록시캄, 술린닥, 톨메틴, 셀레콕십, 부프레노르핀, 부토르파놀, 코데인, 히드로코돈, 히드로모르폰, 레보르파놀, 메페리딘, 메타돈, 모르핀, 날부핀, 옥시코돈, 옥시모르폰, 펜타조신, 프로폭시펜, 및 트라마돌)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가의 치료 작용제 및 적어도 하나의 자기 나노입자 (예를 들어, 본원에 기재된 나노입자 조성물 중 임의의 것)는 동일한 조성물 (예를 들어, 동일한 제약 조성물) 중에서 투여된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가의 치료 작용제 및 적어도 하나의 자기 나노입자는 상이한 투여 경로를 사용하여 대상체에게 투여된다 (예를 들어, 적어도 하나의 추가의 치료 작용제는 경구 투여에 의해 전달되고 적어도 하나의 자기 나노입자는 정맥내 투여에 의해 전달됨).
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 적어도 하나의 나노입자 조성물 또는 제약 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 나노입자 조성물 또는 제약 조성물 중 임의의 것) 및, 임의로, 적어도 하나의 추가의 치료 작용제는 대상체에게 적어도 주 1회 (예를 들어, 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회, 하루 1회, 하루 2회, 또는 하루 3회) 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 2종의 상이한 나노입자 조성물이 동일한 조성물 (예를 들어, 액체 조성물) 중에서 투여된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 나노입자 조성물 및 적어도 하나의 추가의 치료 작용제는 동일한 조성물 (예를 들어, 액체 조성물) 중에서 투여된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 나노입자 조성물 및 적어도 하나의 추가의 치료 작용제는 2종의 상이한 조성물 (예를 들어, 적어도 하나의 나노입자 조성물을 함유하는 액체 조성물 및 적어도 하나의 추가의 치료 작용제를 함유하는 고체 경구 조성물) 중에서 투여된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가의 치료 작용제는 환제, 정제, 또는 캡슐로서 투여된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가의 치료 작용제는 지속-방출 경구 제제 중에서 투여된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 치료 작용제는 적어도 하나의 나노입자 조성물 또는 제약 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 나노입자 조성물 또는 제약 조성물 중 임의의 것)의 투여 전에 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 치료 작용제는 적어도 하나의 나노입자 조성물 또는 제약 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 자기 입자 또는 제약 조성물 중 임의의 것)의 투여 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 치료 작용제 및 적어도 하나의 나노입자 조성물 또는 제약 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 나노입자 조성물 또는 제약 조성물 중 임의의 것)은, 대상체에서 하나 이상의 추가의 치료 작용제 및 적어도 하나의 나노입자 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 나노입자 조성물 중 임의의 것)의 생활성 기간에 중복이 존재하도록 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 연장된 기간 (예를 들어, 적어도 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 또는 10년)에 걸쳐 적어도 하나의 나노입자 조성물 또는 제약 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 나노입자 조성물 또는 제약 조성물 중 임의의 것)을 투여받을 수 있다. 숙련된 의료 전문가는 치료의 유효성에 따라 또는 진단을 위해 본원에 기재된 방법 중 임의의 것을 사용하는 치료 기간의 길이를 결정할 수 있다 (예를 들어, 상기 방법 및 관련 기술분야에 공지되어 있는 것들을 사용하여). 본원에 기재된 바와 같이, 숙련된 의료 전문가는 또한, 대상체에게 투여되는 나노입자 조성물 (및/또는 하나 이상의 추가의 치료 작용제)의 정체 및 수를 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)시킬 수 있고, 또한 치료의 유효성의 평가에 기초하여 대상체에 대한 적어도 하나의 나노입자 조성물 (및/또는 하나 이상의 추가의 치료 작용제)의 투여의 투여량 및 빈도수를 조정할 (예를 들어, 증가 또는 감소시킬) 수 있다 (예를 들어, 상기 방법 및 관련 기술분야에 공지되어 있는 것들을 사용하여). 숙련된 의료 전문가는 또한, 치료를 중단할 때 (예: 예를 들어, 대상체의 증상이 현저히 감소될 때)를 결정할 수 있다.
실시예
본 개시내용의 특정 실시양태를 하기 실시예에서 추가로 기재하며, 이들은 청구범위에 기재된 임의의 실시양태의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1 - 모듈식 아미노 페이로드를 사용한 자기 나노입자 (MN)의 합성
둥근 바닥 플라스크를 함유하는, 아이스를 갖는, 유리 플레이트를 포함하는 예시 셋업을 사용하여 자기 나노입자 (MN)의 합성을 수행하였다. 둥근 바닥 플라스크는 하기에 추가로 기재된 반응 성분을 함유하였다. 둥근 바닥 플라스크를 핫 플레이트/교반 플레이트 상에 배치하였다.
MN의 제제는 덱스트란 (9 g/30 mL D.I.수), 0.65 g 염화제2철, 0.4 g 염화제1철, 및 15 mL NH4OH (28%)를 포함하였다.
먼저, 9 그램의 덱스트란 T10을 탈이온수 (D.I.수) 중에 용해시켜 원추형 튜브 내에서 30 mL (30% w/v)를 형성하였다. 덱스트란 T10 (기술적 품질)은 10 kDa의 평균 분자량을 갖는 고순도 덱스트란 분획이다. 용액이 실온에서 3일 내에 침전물을 형성함에 따라 덱스트란의 신선한 용액을 제조하였다.
다음으로, 덱스트란을 실온에서 1 hr 동안 회전기 상에서 탈이온 (D.I.)수 중에 가용화시켰다. 생성된 용액은 무색이었지만, 이는 기포를 가지며 약간 흐리게 보일 수 있다. 적당한 열을 적용하여 덱스트란을 완전히 용해시킬 수 있다. 덱스트란 용해를 위한 셋업의 예가 도 1에 나타나 있다.
자기 교반 바를 함유하는 250 mL 둥근 바닥 플라스크 내로 0.2 마이크로미터 (μm)/0.45 μm 필터를 사용하여 덱스트란 용액을 여과하였다. 튜브 내의 임의의 잔류 덱스트란을 필요한 경우 증류수와 함께 사용할 수 있다. 2-목 둥근 바닥 플라스크 (Rbf) 내의 용해된 용액을 온화한 자기 교반 및 질소 (또는 아르곤) 버블링 (공기 퍼징 아님) 하에 빙조에서 30분 동안 냉각시켜 용해된 산소를 제거하였다.
다음으로, 염화제2철 스톡 용액을 제조하였다. "조건 1"에 사용된 염화제2철의 양은 염화제2철 6수화물 (FeCl3·6H2O) 0.65 g이었고, 1.2 g의 염화제2철 6수화물 (FeCl3·6H2O)을 "조건 2"에 대해 사용하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 염을 약 5 mL의 DI 수 중에 용해시켰다. 스톡 용액은 갈색을 나타내었고, 0.22 μm 필터 유닛을 사용하여 이를 여과하고, 저온의 어두운 장소에 저장하였다. 철 염 조성물 중의 다른 요소를 뺌으로써 철의 양을 계산하였다. 염화제1철 4수화물 병을 데시케이터 내에 저장하여 공기에 의한 산화를 최소화하였다. 분말 염화제1철은 녹색이어야 하고, 병 내의 갈색 결정의 형성은 철 산화 (즉, Fe(II)로부터 Fe(III)로의 전환)의 표시이며, 이는 고품질 초상자성 나노입자를 얻기 위해 피해야 한다.
다음으로, 염화제1철 용액 (FeCl2·4H2O)을 제조하였다. 0.4 g의 염화제1철 (조건 1)을 신선하게 칭량하고, 에펜도르프(Eppendorf) 튜브 내에서 1 mL의 D.I.수 중에 용해시켜 진주빛 밝은 청록색 용액을 형성하였다. 조건 2의 제제화에서는 0.0 g의 염화제1철이 사용되었다. 염화제1철의 용해를 위해, D.I.수를 질소로 10분 (min) 동안 퍼징하여 물 중의 용해된 산소 기체를 제거하였다. 용해 후 여과가 필요하지 않았지만, 완전한 용해를 달성하도록 보장하기 위해 용해 단계를 15 min 내내 수행하였다 (0.4 g의 염화제1철 - 즉, 조건 1에 대해). 철 염 조성물 중의 다른 요소를 무시함으로써 철의 양을 계산하였다.
1 mL의 염화제2철 스톡 용액 중 0.65 g의 염화제2철 (조건 1), 및 2-5 mL 중의 1.2 g의 염화제2철 용액 (조건 2)을 저온 덱스트란 용액 중에 첨가하였다. 혼합물을 플라스크 내에서 지속적인 질소 (또는 아르곤) 버블링 하에 1시간 동안 교반하였다. 30 min 후, 표 1에 나타낸 바와 같이, 1 mL 염화제1철 용액 (0.4 g FeCl2 (조건 1) 또는 (0.0 g FeCl2 (조건 2)을 플라스크에 첨가하였다. 공기 접촉을 최소화함으로써 산화를 방지하기 위해 Rbf의 모든 목부를 고무 마개로 단단히 캡핑하였지만, 하나의 목부는 고무 마개의 상단에 니들 (18G)을 갖는 기체 유출구를 가졌다.
표 1 - 모듈식 아미노 페이로드를 사용한 자기 나노입자 (MN)의 제제화
Figure pct00001
다음으로, 불활성 기체로의 퍼징을 중단하였다. 공기 접촉 없이 수산화암모늄을 첨가하기 위해 캐뉼러 튜브를 연결하였다. 이 단계에서, 교반 속도는 점도 변화를 극복하기 위해 최대로 셋팅하였다. 반응 혼합물은 초기에 매우 점성이 되었고 아미-그린(army-green) 색으로 변하였다. 수산화암모늄의 느린 적정을 수행하였다. 수산화암모늄을 서서히 첨가하는 경우, 점도가 증가하여 제2철/제1철 혼합물 중의 수산화암모늄의 균질 혼합을 방해하여, 큰 입자가 형성된다.
격렬한 교반을 빙조에서 30 min 동안 계속하였다. 반응 혼합물 하에 빙조를 유지하고, 전체 공정 동안 교반을 유지하였다. 60분 후, 하나의 목부를 수-냉각 응축기와 연결하고, 다른 목부를 불활성 기체와 연결하여 고열에서 퍼징하였다 (반응 혼합물에서가 아님). 고온에서 범핑이 일어나지 않도록 주의하였다. 반응 Rbf를 오일 배쓰 내로 이전하고, 이는 90℃로 예열되었다. 90분 동안 오일 배쓰에서 교반을 계속하였다. 온도계를 반응 혼합물에서 유지하여 온도를 측정하고, 온도를 적어도 약 75 내지 85℃에서 유지하였다. 이 단계 후 기체 유동을 중단하고, 용액을 실온으로 서서히 냉각시켰다. 이들 시리즈의 반응 종료시 덱스트란 코팅된 자기 나노입자의 형성이 달성되었다. 최종 용액의 부피는 약 40 mL였다.
생성된 용액을 아미콘(Amicon) 튜브 (50K 원심 필터 유닛)에 의해 정제하여 미반응 덱스트란, 철 염, 및 수산화암모늄을 제거하였다. 나노입자 현탁액을 먼저 원심분리 (30 내지 45분 동안 ~1,500 x g (RCF) 3-4k RPM)로 농축시켰고, 이는 필터 상의 고도로 농축된 나노입자 현탁액 및 필터 유닛 하의 나노입자-무함유 용리를 형성하였다. 필터 하의 용리액을 폐기하고, 나노입자 펠릿을 D.I.수 중에 재현탁시키고, 동일한 필터 유닛을 사용하여 재원심분리하였다. 용리액이 D.I.수의 pH 또는 중성 pH를 나타낼 때까지 이 단계를 반복하였다. 초기에, 원심분리는 용액의 점도, 입자 불순물의 큰 크기, 및 혼합물 중의 보다 많은 양의 미반응, 유리 덱스트란으로 인해 약 1 hr이 걸렸다. 그러나, 최초 3 또는 4개 원심분리 단계 후, 대부분의 유리 덱스트란이 제거되었고, 비교적 짧은 원심분리 단계 (원심분리 단계 당 약 15 min)에서 나노입자의 재현탁 및 농축이 수행되었다. 세척 단계를 7회 반복하였다. 자기 나노입자의 생성된 정제된 용액을 증류수 중에 재현탁시켰다. 최종 부피를 21 mL로 조정하고, 용액을 밤새 냉장고에 (예를 들어, 약 4℃에서) 그대로 두었다.
실시예 2 - 가교 및 아미노화
나노입자를 수산화나트륨, 에피클로로히드린 및 수산화암모늄을 사용한 일련의 반응 단계로 가교시키고 아미노화하였다. 21 mL의 MN을 35 mL 수산화나트륨 (NaOH), 14 mL 에피클로로히드린 + 60 mL 수산화암모늄 (NH4OH)과 혼합하였다. 실험을 흄 후드에서 수행하고, 합성에서 사용된 화학물질로의 노출을 최소화하도록 안전 수칙을 지켰다. 35 mL의 NaOH (5 M)를 4℃에서 저장하였다. 펠릿 (ACROS 134070010, 1 kg, CAS 1310-732)으로부터 5M NaOH 용액을 제조하기 위해, 200 g을 칭량하고 유리병에 첨가하였다. 1 L 물 (밀리포어)을 병에 첨가하고, 병을 캡핑하고, 혼합물을 선회시켰다.
NaOH (5 M)의 저온 35 mL를 빙조 내 250 mL 둥근 바닥 플라스크 내에서 21 mL의 나노입자 현탁액 중에 첨가하였다. 반응 혼합물을 빙조 내에서 기체 유동 없이 15분 동안 교반하였다. 14 mL의 에피클로로히드린을 격렬한 교반 하에 반응 혼합물 중에 첨가하였다. 에피클로로히드린 첨가 후 생성된 용액은 2개의 액체 상을 형성하였다. 혼합 후, 온도를 실온에서 유지하였다. 가교 반응을 실온에서 격렬한 교반 하에 8시간 동안 계속하였다. 가교 반응은 발열성이었고, 온도를 모니터링하고 35℃를 초과하지 않도록 제어하였다.
에피클로로히드린을 사용하여 덱스트란 중합체 백본 상의 2개의 히드록실 기를 가교시켰다. 에피클로로히드린에 의한 가교는 MN의 산화철 코어의 표면 상의 덱스트란 코팅의 화학적 안정화를 보장하였다. 에피클로로히드린은 사슬 연장을 위해 중합되는 것이 가능하고, 이는 이후에 아민으로 치환될 히드록실 기의 증가를 제공할 수 있다.
이어서, 생성된 균질 용액을 수산화암모늄과 반응시켜 최종 나노입자 조성물을 아미노화하였다. 60 mL의 수산화암모늄 (NH4OH, 28%)을 조건 1 및 조건 2 둘 다에 대하여 반응 혼합물 중에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 둥근 바닥 플라스크의 목부를 고무 마개로 캡핑하여 암모니아 증발을 방지하였고, 이는 고수율의 아미노화를 얻기 위해 중요하다. 반응이 끝난 후, 용액 (~150 mL)을 투석 백 (MWCO 12-14kDa) 내로 옮기고, 흄 후드 내에서 지속적인 교반 하에 비커 내에서 4-6 L의 증류수에 대하여 투석하였다. 투석을 2일에 걸쳐 수회 반복하여 모든 미반응 수산화암모늄 및 부산물을 제거하였다 (6-7회). 투석 백으로부터의 암모니아 냄새가 사라지고 pH가 중성이 될 때까지 이를 계속하였다. 그 후, 이를 3-4회 더 반복하였다. 투석 셋업의 예가 도 2에 나타나 있다.
이후에 아미콘 원심분리 유닛 (MWCO 30kDa, 2.8k rpm, 15 min.)을 사용하여 생성된 갈색빛 흑색 나노입자 현탁액을 20 mL로 농축시켰다. 농축된 나노입자를 100 mM PBS 완충제 (pH 7.4) 중에 현탁시켰다. 아미콘 원심분리 유닛 (MWCO 30kDa, 2.8k 회전/분 (RPM), 15 min.)을 사용하여 용액을 PBS 완충제로 1회 더 세척하였다. PBS 완충제 (pH 7.4)를 사용하여 부피를 15 mL로 조정하였다. 나노입자 용액을 14500 rpm으로 원심분리하였다. 그 후, 0.1 μm 필터 유닛을 사용하여 큰 입자를 여과하였다. 철 검정을 수행하여 용액 중의 철의 양을 결정하였다. PBS 완충제 (pH=7.4)를 사용하여 부피를 조정하여 12 mg Fe/mL로 만들었다. 나노사이저(Nanosizer)를 사용하여 동적 광 산란에 의해 나노입자의 크기 (약 22 ± 3 nm의 직경)를 결정하였다.
실시예 3 - MN의 철 농도의 특성화
하기에 기재된 바와 같이 철 검정을 수행함으로써 철 함량을 결정하고 나노입자 농도의 계산에 활용하였다. 8개의 표준 철 용액 및 4개의 샘플을 사용하여 하기에 기재된 철 검정을 사용하여 철의 양을 결정하였다. 10 μL의 철 표준물 및 나노입자 용액을 980 μL의 6 N HCl 중에 첨가하였다. 10 μL의 과산화수소 (H2O2, H2O 중 30%)를 각각의 혼합물 중에 첨가하였다. 철 표준물 대신에 10 μL의 증류수를 980 μL의 6 N HCl 및 10 μL의 H2O2 중에 첨가함으로써 블랭크 샘플을 제조하였다. 이 공정 동안 산화철 코어를 소화시켰다. 410 nm에서의 광학 밀도 (OD) 값을 UV-vis 분광분석에 의해 결정하였다. 표준물을 사용하여 보정 곡선을 얻었다. 얻어진 보정 곡선을 사용하여 나노입자 용액 중의 철 함량의 농도를 결정하였다. UV-Vis 곡선의 예가 도 3에 나타나 있다. 실험 전에, 농도는 8.7 μM (즉, 1 mg/mL)의 철 내지 216.9 μM (즉, 25 mg/mL)의 철인 것으로 나타났다.
SPDP 정량화
725 μl 물을 25 μL의 컨쥬게이션된 나노입자에 첨가하였다. 동일한 희석액의 2개의 튜브를 준비하였다 (즉, TCEP 소화를 갖거나 갖지 않음). 25 μL의 3% TCEP를 첨가하였다. 용액을 실온에서 약 10분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 용액을 소형 아미콘 필터 (에펜도르프 스타일; 100k 컷 오프)를 통해 여과하였다. 이어서 용액을 7000 RPM으로 약 2-5 min 동안 스피닝하였다. 여액의 흡광도를 343 nm에서 측정하였다. TCEP를 갖는 여액의 343 nm에서 측정된 흡광도 데이터는 약 0.33이었고, TCEP 처리를 갖지 않는 여액에서는 피크가 나타나지 않았다. 나노입자 당 SPDP의 총 수를 하기와 같이 계산하였다. SPDP의 총 수: 0.33 X 10 6 X 30 (희석 배수)/8100 (흡광 계수) = 1200. 나노입자 농도는 20 μM (2.2 mg/mL)이었기 때문에, 1200 SPDP를 10 μM로 나눔으로써 나노입자 당 SPDP의 수를 계산하였고 60 SPDP/μM NP를 얻었다.
실시예 4 - 나노입자 크기 및 아민 기 함량의 특성화
동적 광 산란을 사용하여 나노입자 크기를 결정하였다. 실험 전에, 도 4 및 5에 나타낸 바와 같이, 약 20 내지 35 nm만큼 큰, 또한 약 11.5 내지 15.6 nm만큼 작은 반경을 갖는 나노입자를 합성하였다.
나노입자에 컨쥬게이션된 SPDP (N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트)의 수에 의해 아민 함량을 정량화하였다. SPDP는 아미노 및 술프히드릴 기에 대해 반응성인 헤테로-이관능성 링커이다. 환원제 (3% TCEP)에 의해 SPDP-관능화된 나노입자를 분열시켜 피리딘-2-티온 (P2T)의 검출가능한 부산물을 방출시켰다. 343 nm에서의 최대 흡광도 피크 (8.08 x 103/cm/M의 343 nm에서의 흡광 계수)를 모니터링함으로써 P2T의 정량화를 달성하였다. P2T의 수는 용액 중의 반응성 아민 기의 수를 제공한다. 따라서, 나노입자 당 아민 기의 수는 P2T 대 나노입자의 농도의 비율에 의해 계산되었다.
간단히, 분취량의 나노입자 현탁액 (100 μL)을 800 μL의 포스페이트 완충 식염수 (PBS, pH 7.4) 중에 희석하였다. SPDP 병을 동결기로부터 제거하고 실온으로 평형화한 후 개방하여 병 내의 수분 축적을 피하였다. 이는 SPDP의 NHS 에스테르의 가수분해를 방지하기 위해 중요하였다. 100 mM SPDP 스톡 용액을 무수 DMSO 중에서 제조하였다. SPDP는 제한된 수 용해도를 갖고, 따라서, SPDP의 결정화를 방지하기 위해 나노입자 용액을 서서히 (DMSO 중의) SPDP 용액 중으로 적정하였다. 100 μL의 나노입자를 800 μL의 PBS 완충제로 희석하고, 100 μL의 100 mM SPDP 용액을 첨가하였다. 혼합물을 저온실에서 회전기 상에서 인큐베이션하였다 (약 16 내지 20 hr 동안).
용리액으로서 PBS 완충제를 사용하여 일회용 세파덱스(Sephadex) PD-10 컬럼을 사용하여 나노입자를 정제하였다. 1000 μL의 용리액을 수집하였다. 450 μL의 정제된 SPDP-관능화된 나노입자를 50 μL의 3% TCEP와 혼합하고 (PD-10 컬럼 후에 ~1000 μL로부터), 혼합물을 실온에서 20 min 동안 그대로 두었다. TCEP는 SPDP를 환원시켜 피리딘-2-티온을 방출시키고, 이는 흡광도 분광분석에 의해 검출가능하다. 나노입자 상의 SPDP의 활성을 유지하기 위해 혼합물에서 DTT (디티오트레이톨) 또는 TCEP 잔기를 포함한 디술피드 환원제, 또는 다른 오염물을 피하였다.
반응 혼합물을 아미콘 여과 유닛 (0.5 mL, MWCO 100 kDa) 내로 옮기고, 10 min 동안 ~10,000 x g (RCF)를 사용하여 마이크로원심분리에서 원심분리하였다. P2T를 함유하는 용리액을 회수하고, UV-vis 분광분석에 의해 아민 정량화에 사용하였다. 필터 유닛 상의 보유된 나노입자 펠릿을 폐기하였다. 8개의 표준 철 용액 및 4개의 샘플을 사용하여 하기에 기재된 철 검정을 사용하여 정제된 SPDP-관능화된 나노입자 용액 중의 철의 양을 결정하였다.
간단히, 10 μL의 철 표준물 및 나노입자 용액을 980 μL의 6 N HCl 중에 첨가하였다. 10 μL의 과산화수소 (H2O2, H2O 중 30%)를 각각의 혼합물 중에 첨가하였다. 철 표준물 대신에 10 μL의 증류수를 980 μL의 6 N HCl 및 10 μL의 H2O2 중에 첨가함으로써 블랭크 샘플을 제조하였다. 이 공정 동안 산화철 코어를 소화시켰다. 410 nm에서의 광학 밀도 (OD) 값을 UV-vis 분광분석에 의해 결정하였다. 표준물을 사용하여 보정 곡선을 얻었다. 얻어진 보정 곡선을 사용하여 나노입자 용액 중의 철 함량의 농도를 결정하였다.
각각의 나노입자가 나노입자 당 평균 2064개의 철 원자를 갖는다는 가정에 의해 나노입자 현탁액 중의 철 농도를 측정한 후에 나노입자 농도를 결정하였다. 일반적으로, 농도는 약 12 mg/mL인 것으로 결정되었고, 이는 100 μM 나노입자 용액과 등가이다.
예상 외의 놀라운 결과가 나타났다: 반응에서 사용된 FeCl3 및 FeCl2의 양을 변화시킴으로써, 나노입자 당 아미노 기의 수가 변조될 수 있었다. FeCl3 및 FeCl2 둘 다를 포함하는 조건 1은 나노입자 당 약 60-90개의 아미노 기를 제공하였다. 조건 2는 나노입자 당 약 246-500개의 아미노 기의 혼입을 제공하였고, 이는 특이하게 높은 수였다. 410 nm에서의 P2T 흡광도를 나타내는 UV-Vis 스펙트럼의 예가 도 6 및 7에 나타나 있다.
아민 기 정량화
100 μL의 MN을 에펜도르프 튜브 내에서 100 μl PBS와 혼합하고 4℃에 적용하였다. DMSO 중의 SPDP의 20 mM 용액 (100 μl 중 1 mg)을 제조하였다. 저온 나노입자 용액을 SPDP 용액에 적가하였다 (반응은 발열성이었음). 용액을 실온 (RT)에서 30 min 동안 인큐베이션하였다. 이어서 용액을 PD-10 컬럼을 통해 정제하고 중력을 사용하여 PBS와 평형화하였다. 약 2 mL를 수집하였다. 2개의 350 μl 분취량 ("샘플" 및 "대조군")을 2개의 아미콘 필터 (마이크로콘)에 배치하였다. 30 μl TCEP (35 mM)를 샘플에 첨가하고, 샘플을 10 min 동안 단독으로 남겨두었다. 샘플 및 대조군 둘 다를 RT에서 20 min 동안 6000 RPM으로 스핀 다운하였다. 30 μl TCEP (35 mM)를 대조군 용리액에 첨가하였다. 샘플 및 대조군 둘 다 PBS 중에 1:4.86의 비율로 희석하였다. 샘플 및 대조군의 광학 밀도 (OD)를 343 nm에서 판독하였다. 하기에 나타낸 식을 사용하여 아민 기의 수를 계산하였다. 큐벳 내에서, 샘플을 20*1.0857*4.86) = 105.53배 희석하였다. 큐벳 내의 철의 농도 = 철 스톡 용액의 농도 / 105.53. 큐벳 내의 [결정] = 큐벳 내의 [Fe] / 0.116 (상수) = [결정] (μM). 큐벳 내의 [피리딘-2-티온] = 델타 OD/0.0081 (흡광 계수) = [피리딘 2 티온] (μM) NH2/xtal = 큐벳 내의 [xtals] / 큐벳 내의 [피리딘-2-티온].
실시예 5 - MN에 대한 올리고뉴클레오티드의 컨쥬게이션
본원에 기재된 바와 같이, MN을 티올화된 올리고뉴클레오티드로 관능화하였다. PBS 완충제 (pH 7.4) 중에서 10 mg Fe (약 1 mL와 등가임)를 혼합함으로써 스톡 나노입자 용액을 제조하였다. 이후에 나노입자를 SPDP에 컨쥬게이션하여 추가의 컨쥬게이션 단계를 위해 나노입자에 티올 반응성 말단을 제공하였다. 상기에 지시된 바와 같이, SPDP 병을 동결기로부터 제거하고 실온으로 평형화한 후 (약 30 min 동안) 개방하여 병 내의 수분 축적을 피하였다. 10 mg의 SPDP를 500 μL의 무수 DMSO 중에 용해시키고, 저온 13 mL 팔콘(Falcon) 튜브 내로 옮기고 즉시 사용하였다. 나노입자 용액을 와류 및 피펫팅을 통해 서서히 SPDP 용액 중으로 적정하였다. 빠르게 가수분해되기 때문에 매번 신선한 SPDP 용액을 제조하여야 했다.
어둡게 밤새 인큐베이션 후 PBS 완충제 (pH 7.4)에 대하여 일회용 PD-10 컬럼을 사용하여 나노입자를 정제하여 유리 미반응 SPDP 분자를 제거한다. 컬럼 내의 나노입자 밴드의 최종 부분을 폐기하여 나노입자로부터 유리 SPDP를 완전히 분리한다. 철 검정을 사용하여 최종 나노입자 용액의 농도를 계산하였다. 이어서 티올 반응성 말단을 갖는 나노입자를 티올-변형된 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이션하였다. 티올-변형된 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제 무함유 물 중에 1 mM의 최종 농도로 용해시켰다. 이어서 올리고뉴클레오티드를 3% 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)으로 처리하여 올리고뉴클레오티드 구성물에서 보호 디술피드 결합을 분열시킴으로써 티올 기를 활성화시켰다. 3% TCEP는 각각의 사용 전에 신선하게 제조하였다. 100 μL의 TCEP 용액을 1000 μL의 올리고뉴클레오티드 스톡 용액 (1 mM)에 첨가하고 10분 동안 인큐베이션하였다. 이후에 아세트산암모늄/에탄올 침전 방법을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 정제하였다.
간단히, 500 μL의 9.5 M 아세트산암모늄을 올리고뉴클레오티드 혼합물에 첨가하였다. 이후에, 2300 μL의 저온 에탄올 (200 프루프, 분자 생물학 등급)을 혼합물에 첨가하였다. 튜브에서 백색의 흐린 올리고뉴클레오티드 침전이 관찰되었다. 이어서 용액을 -80℃에서 1시간 동안 두었다. 이후에, 올리고뉴클레오티드 혼합물을 4℃에서 15분 동안 20,000 x g (RCF)로 원심분리하였다. 원심분리 종료 후 튜브 저부에 백색 올리고뉴클레오티드 펠릿이 형성되었다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 물 중의 100% 에탄올 및 70% 에탄올로 수회 세척하였다. 이후에 펠릿을 고속 진공 농축기에 의해 건조시키고 뉴클레아제 무함유 물 중에 1 mM의 최종 농도로 재현탁시켰다. 나노입자를 저온실에서 적어도 1일 동안 회전기 상에서 1 대 13 (최대 1:40) 몰비로 활성화된 올리고뉴클레오티드와 혼합하였다. 나노입자 용액을 0.22 μm 시린지 필터로 여과하여 임의의 큰 오염물을 제거하였다. 시험관내 또는 생체내 연구를 위해, PBS (pH 7.4) 중에서 G-50 세파덱스 일회용 신속 스핀 컬럼을 사용하여 100 μL의 나노입자를 정제하였다.
철 검정, 동적 광 산란, 및 겔 전기영동을 사용하여 생성된 치료용 산화철 나노프로브의 농도, 크기, 및 올리고뉴클레오티드 로딩을 특성화하였다. 작은 동물들로의 생체내 연구를 위해 필요한 경우 원심분리 하에 0.5 mL 아미콘 여과 유닛 (MWCO 100 kDa, 아미콘 울트라(Ultra)-0.5 mL 원심 필터)을 사용하여 나노입자를 농축시켰다. 올리고뉴클레오티드 로딩의 분석을 위한 겔 전기영동의 예가 도 8에 나타나 있다. oligo 대 아미노 기/나노입자의 비율을 변화시킴으로써, oligo/나노입자의 수가 점진적으로 증가하고 미세-조율될 수 있다.
폴리아크릴아미드 겔에서의 oligo 로딩의 분석
적절한 양 (예를 들어, 10 μl)의 TCEP-소화된 MN을 에펜도르프 튜브에 첨가하였다. 유리 oligo를 대조군으로서 사용하여 겔 내에 밴드를 위치시키고 정량화하였다. 2 μL의 핵산 로딩 완충제 (5x)를 첨가하고 혼합하였다. 각각의 샘플을 70℃에서 3 min 동안 가열하였다. 각각의 샘플을 RT로 냉각시키고, 이를 급속히 스핀 다운하였다. 전체 액체를 15% TBE-우레아 (폴리아크릴아미드) 겔 또는 4-20% PAGE 상에 주의깊게 로딩하였다. 겔을 130 볼트에서 약 30-40 min 동안 1x TBE 완충제를 사용하여 진행시켰다. 겔을 플라스틱 카세트로부터 주의깊게 제거하였다. 겔을 20 min 동안 에티듐 브로마이드 (1 μg/mL; 5 μl 스톡을 50 mL 물에 첨가함)로 염색하였다. 에티듐 브로마이드 용액을 이후에 이를 적당히 폐기하기 위해 디캔팅 및 저장하고, 겔을 매번 물로 약 5 min 동안 2회 세척하였다. 다음으로, 겔을 UV 광 하에 가시화하였다.
실시예 6 - 제어가능한 자기 특성을 갖는 자기 나노입자 (MN)의 합성
둥근 바닥 플라스크를 함유하는, 아이스를 갖는, 유리 플레이트를 포함하는 예시 셋업을 사용하여 자기 나노입자 (MN)의 합성을 수행하였다. 둥근 바닥 플라스크는 하기에 추가로 기재된 반응 성분을 함유하였다. 둥근 바닥 플라스크를 핫 플레이트/교반 플레이트 상에 배치하였다.
MN의 제제는 덱스트란 (9 g/30 mL D.I.수), 0.54 g 염화제2철, 0.24 g 염화제1철, 및 1 mL NH4OH (28%)를 포함하였다. 이 제제는 자기 특성에 있어 최소 비-선형성 지수를 제공하였다.
먼저, 9 그램의 덱스트란 T10을 탈이온수 (D.I.수) 중에 용해시켜 원추형 튜브 내에서 30 mL (30% w/v)를 형성하였다. 덱스트란 T10 (기술적 품질)은 10 kDa의 평균 분자량을 갖는 고순도 덱스트란 분획이다. 용액이 실온에서 3일 내에 침전물을 형성함에 따라 덱스트란의 신선한 용액을 제조하였다.
다음으로, 덱스트란을 실온에서 1 hr 동안 회전기 상에서 탈이온 (D.I.)수 중에 가용화시켰다. 생성된 용액은 무색이었지만, 이는 기포를 가지며 약간 흐리게 보일 수 있다. 적당한 열을 적용하여 덱스트란을 완전히 용해시킬 수 있다. 덱스트란 용해를 위한 셋업의 예가 도 1에 나타나 있다.
자기 교반 바를 함유하는 250 mL 둥근 바닥 플라스크 내에서 0.2 마이크로미터 (μm)/0.45 μm 필터를 사용하여 덱스트란 용액을 여과하였다. 튜브 내의 임의의 잔류 덱스트란을 필요한 경우 증류수와 함께 사용할 수 있다. 2-목 둥근 바닥 플라스크 (Rbf) 내의 용해된 용액을 온화한 자기 교반 및 질소 (또는 아르곤) 버블링 (공기 퍼징 아님) 하에 빙조에서 30분 동안 냉각시켜 용해된 산소를 제거하였다.
다음으로, 염화제2철 스톡 용액을 제조하였다. 염화제2철 및 염화제1철의 양은, "조건 1"에 대하여 0.54 g의 염화제2철 6수화물 (FeCl3·6H2O) 및 0.2 g의 염화제1철 4수화물 (FeCl2·4H2O)이었고, "조건 2"에 대하여 0.54 g의 염화제2철 6수화물 (FeCl3·6H2O) 및 0.4 g의 염화제1철 4수화물 (FeCl2·4H2O)이었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 염을 약 5 mL의 DI 수 중에 용해시켰다. 스톡 용액은 갈색을 나타내었고, 0.22 μm 필터 유닛을 사용하여 이를 여과하고, 저온의 어두운 장소에 저장하였다. 철 염 조성물 중의 다른 요소를 뺌으로써 철의 양을 계산하였다. 염화제1철 4수화물 병을 데시케이터 내에 저장하여 공기에 의한 산화를 최소화하였다. 분말 염화제1철은 녹색이어야 하고, 병 내의 갈색 결정의 형성은 철 산화 (즉, Fe(II)로부터 Fe(III)로의 전환)의 표시이며, 이는 고품질 초상자성 나노입자를 얻기 위해 피해야 한다.
다음으로, 염화제1철 용액 (FeCl2·4H2O)을 제조하였다. 0.2 g의 염화제1철 (조건 1)을 신선하게 칭량하고, 에펜도르프 튜브 내에서 1 mL의 D.I.수 중에 용해시켜 진주빛 밝은 청록색 용액을 형성하였다. 조건 2의 제제화에서는 0.4 g의 염화제1철이 사용되었다. 염화제1철의 용해를 위해, D.I.수를 질소로 10분 (min) 동안 퍼징하여, 비-자기 산화 철 (녹)을 생성할 수 있는 물 중의 용해된 산소 기체를 제거하였다. 용해 후 여과가 필요하지 않았지만, 완전한 용해를 달성하도록 보장하기 위해 용해 단계를 15 min 내내 수행하였다 (0.4 g의 염화제1철 - 즉, 조건 1에 대해). 철 염 조성물 중의 다른 요소를 무시함으로써 철의 양을 계산하였다.
1 mL의 염화제2철 스톡 용액 중 0.545 g의 염화제2철 (조건 1 및 조건 2)을 저온 덱스트란 용액 중에 첨가하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 1 mL 염화제1철 용액 (0.2 g FeCl2 (조건 1) 또는 (0.4 g FeCl2 (조건 2))을 플라스크에 첨가하였다. 혼합물을 플라스크 내에서 지속적인 질소 (또는 아르곤) 버블링 하에 1시간 동안 교반하였다. 공기 접촉을 최소화함으로써 산화를 방지하기 위해 Rbf의 모든 목부를 고무 마개로 단단히 캡핑하였지만, 하나의 목부는 고무 마개의 상단에 니들 (18G)을 갖는 기체 유출구를 가졌다.
표 2 - 제어가능한 자기 특성을 갖는 자기 나노입자 (MN)의 제제화
Figure pct00002
1. 다음으로, 불활성 기체로의 퍼징을 중단하였다. 공기 접촉 없이 수산화암모늄을 첨가하기 위해 캐뉼러 튜브를 연결하였다. 1 mL의 농축된 저온 (~4℃) 수산화암모늄 (NH4OH, 28%)을 빙조 내의 반응 혼합물 중에 신속히 첨가하였다. 이 단계에서, 교반 속도는 점도 변화를 극복하기 위해 최대로 셋팅하였다. 수산화암모늄을 서서히 첨가하는 경우, 점도가 증가하여 제2철/제1철 혼합물 중의 수산화암모늄의 균질 혼합을 방해하여, 큰 입자가 형성된다. 가외의 수산화암모늄 또는 1 mL 미만의 수산화암모늄이 첨가되지 않았음이 보장되었다.
표 3
Figure pct00003
격렬한 교반을 빙조에서 15 min 동안 계속하였다. 반응 혼합물 하에 빙조를 유지하고, 전체 공정 동안 교반을 유지하였다. 15분 후, 하나의 목부를 수-냉각 응축기와 연결하고, 다른 목부를 불활성 기체와 연결하여 고열에서 퍼징하였다 (반응 혼합물에서가 아님). 고온에서 범핑이 일어나지 않도록 주의하였다. 반응 Rbf를 오일 배쓰 내로 이전하고, 이는 90℃로 예열되었다. 60분 동안 오일 배쓰에서 교반을 계속하였다. 온도계를 반응 혼합물에서 유지하여 온도를 측정하고, 온도를 적어도 약 75 내지 85℃에서 유지하였다. 혼합물을 60분 초과 동안 가열하지 않았다. 이 단계 후 기체 유동을 중단하고, 용액을 실온으로 서서히 냉각시켰다. 이들 시리즈의 반응 종료시 덱스트란 코팅된 자기 나노입자의 형성이 달성되었다. 최종 용액의 부피는 40 mL 미만이었다. 교반을 실온에서 12시간 동안 계속하였다. D.I.수를 첨가함으로써 부피를 40 mL로 셋팅하였다. 용액을 50 mL 원추형 튜브 내로 옮기고 14,000 RPM으로 1 hr 동안 원심분리에 의해 큰 입자를 제거하였다. 용액을 아미콘 필터 유닛 (10 mL x 4) 내로 옮기고, 입자를 50 mL 원추형 튜브 내에서 폐기하였다.
생성된 용액을 아미콘 튜브 (50K 원심 필터 유닛)에 의해 정제하여 미반응 덱스트란, 철 염, 및 수산화암모늄을 제거하였다. 나노입자 현탁액을 먼저 원심분리 (3시간 동안 4,500 RPM)로 농축시켰고, 이는 필터 상의 고도로 농축된 나노입자 현탁액 및 필터 유닛 하의 나노입자-무함유 용리를 형성하였다. 필터 하의 용리액을 폐기하고, 나노입자 겔-유사 펠릿을 D.I.수 중에 재현탁시키고, 동일한 필터 유닛을 사용하여 재원심분리하였다. 용리액이 D.I.수의 pH 또는 중성 pH를 나타낼 때까지 이 단계를 반복하였다. 초기에, 원심분리는 용액의 점도, 입자의 큰 크기, 및 혼합물 중의 보다 많은 양의 미반응, 유리 덱스트란으로 인해 약 1 hr이 걸렸다. 그러나, 최초 3 또는 4개 원심분리 단계 후, 대부분의 유리 덱스트란이 제거되었고, 비교적 짧은 원심분리 단계 (원심분리 단계 당 약 15 min)에서 나노입자의 재현탁 및 농축이 수행되었다. 세척 단계를 7회 반복하였다. 자기 나노입자의 생성된 정제된 용액을 증류수 중에 재현탁시켰다. 최종 부피를 21 mL로 조정하고, 용액을 밤새 냉장고에 (예를 들어, 약 4℃에서) 그대로 두었다.
실시예 7 - MN의 자기 특성의 특성화
샘플을 자기 입자 분광계 (MPS)에 의해 분석하고, 비-선형성 지수 (NLI)를 나노입자의 자기 특성의 기준으로서 사용하였다. 도 9, 11, 13-14, 16-17, 및 19-20은 각각의 MN 샘플에 대한 NLI 값을 포함한 예시 MPS 분석 데이터를 나타낸다. 이들 MN의 합성 및 특성화를 위한 표면 개질 단계는 이전 실시예에 기재된 것과 동일하였다.
반응 혼합물 중의 염화제1철 및 염화제2철의 비율을 변조함으로써 자기 특성을 제어하였다. 수성 매질 중의 나노입자의 현탁액 안정성을 개선시키기 위해, 자기 특성의 제어가 중요하다. 이 시스템에서, 표면은 표면에 양전하를 갖추도록 디자인되었고, 이는 장기간 저장 동안 나노입자의 응고/불안정성을 초래할 수 있는 브라운(Brownian) 운동에서의 입자간 자기 인력을 극복할 수 있다. 입자 당 아미노화 정도는 64 초과였고, 이는 수성 매질 중에서의 현탁액 안정성을 보장하였다.
자기 특성과 관련하여, 비-선형성 지수 (NLI)는 외부 자기장에 대한 응답성을 정량화하기 위해 사용되는 자기 입자의 잘 특성화된 특성이다. 입자가 주어진 자기장이 적용되었을 때의 특성에 비해 외부 자기장 없이 보다 강한 자기 특성 (투과성)을 갖는 경우, NLI는 보다 작아지고, 관계는 외부 자기장에 대한 비-선형 상관성을 나타내고, 따라서 상기 비-선형성에 의존하는 이미징 및 치료적 기술에 대해 보다 잘 적합화되고, 그 일례는 자기 입자 이미징 (MPI)이다.
실시예 8 - 상이한 스케일의 MN의 합성
둥근 바닥 플라스크를 함유하는, 아이스를 갖는, 유리 플레이트를 포함하는 예시 셋업을 사용하여 자기 나노입자 (MN)의 합성을 수행하였다. 둥근 바닥 플라스크는 하기에 추가로 기재된 반응 성분을 함유하였다. 둥근 바닥 플라스크를 핫 플레이트/교반 플레이트 상에 배치하였다.
MN의 제제는 덱스트란 (18 g/60 mL D.I.수), 0.54 g 염화제2철, 0.2 g 염화제1철, 및 1 mL NH4OH (28%)를 포함하였다. 이 제제는 자기 특성에 있어 최소 비-선형성 지수를 제공하였다.
먼저, 18 그램의 덱스트란 T10을 탈이온수 (D.I.수) 중에 용해시켜 원추형 튜브 내에서 60 mL (30% w/v)를 형성하였다. 덱스트란 T10 (기술적 품질)은 10 kDa의 평균 분자량을 갖는 고순도 덱스트란 분획이다. 용액이 실온에서 3일 내에 침전물을 형성함에 따라 덱스트란의 신선한 용액을 제조하였다.
다음으로, 덱스트란을 실온에서 1 hr 동안 회전기 상에서 탈이온 (D.I.)수 중에 가용화시켰다. 생성된 용액은 무색이었지만, 이는 기포를 가지며 약간 흐리게 보일 수 있다. 적당한 열을 적용하여 덱스트란을 완전히 용해시킬 수 있다. 덱스트란 용해를 위한 셋업의 예가 도 1에 나타나 있다.
자기 교반 바를 함유하는 250 mL 둥근 바닥 플라스크 내에서 0.2 마이크로미터 (μm)/0.45 μm 필터를 사용하여 덱스트란 용액을 여과하였다. 튜브 내의 임의의 잔류 덱스트란을 필요한 경우 증류수와 함께 사용할 수 있다. 2-목 둥근 바닥 플라스크 (Rbf) 내의 용해된 용액을 온화한 자기 교반 및 질소 (또는 아르곤) 버블링 (공기 퍼징 아님) 하에 빙조에서 30분 동안 냉각시켜 용해된 산소를 제거하였다.
다음으로, 염화제2철 스톡 용액을 제조하였다. 염화제2철의 양은, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, DI 수 100 mL 중의 염화제2철 6수화물 0.54 g이이었다. 스톡 용액은 갈색을 나타내었고, 0.22 μm 필터 유닛을 사용하여 이를 여과하고, 저온의 어두운 장소에 저장하였다. 철 염 조성물 중의 다른 요소를 뺌으로써 철의 양을 계산하였다. 염화제1철 4수화물 병을 데시케이터 내에 저장하여 공기에 의한 산화를 최소화하였다. 분말 염화제1철은 녹색이어야 하고, 병 내의 갈색 결정의 형성은 철 산화 (즉, Fe(II)로부터 Fe(III)로의 전환)의 표시이며, 이는 고품질 초상자성 나노입자를 얻기 위해 피해야 한다.
다음으로, 염화제1철 용액 (FeCl2·4H2O)을 제조하였다. 0.20 g의 염화제1철 (조건 1)을 신선하게 칭량하고, 에펜도르프 튜브 내에서 1 mL의 D.I.수 중에 용해시켜 진주빛 밝은 청록색 용액을 형성하였다. 조건 2의 제제화에서는 0.4 g의 염화제1철이 사용되었다. 염화제1철의 용해를 위해, D.I.수를 질소로 10분 (min) 동안 퍼징하여 물 중의 용해된 산소 기체를 제거하였다. 용해 후 여과가 필요하지 않았지만, 완전한 용해를 달성하도록 보장하기 위해 용해 단계를 10 min 내내 수행하였다 (0.4 g의 염화제1철 - 즉, 조건 1에 대해).
염화제2철 스톡 용액을 저온 덱스트란 용액 중에 첨가하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 1 mL 염화제1철 용액 1 eq. 0.2 g FeCl2를 플라스크에 첨가하였다. 혼합물을 플라스크 내에서 지속적인 질소 (또는 아르곤) 버블링 하에 1시간 동안 교반하였다. 공기 접촉을 최소화함으로써 산화를 방지하기 위해 Rbf의 모든 목부를 고무 마개로 단단히 캡핑하였지만, 하나의 목부는 고무 마개의 상단에 니들 (18G)을 갖는 기체 유출구를 가졌다.
표 4 - 스케일-업을 위한 자기 나노입자 (MN)의 제제화
Figure pct00004
다음으로, 불활성 기체로의 퍼징을 중단하였다. 공기 접촉 없이 수산화암모늄을 첨가하기 위해 캐뉼러 튜브를 연결하였다. 1 mL의 농축된 저온 (~4℃) 수산화암모늄 (NH4OH, 28%)을 빙조 내의 반응 혼합물 중에 신속히 첨가하였다. 이 단계에서, 교반 속도는 점도 변화를 극복하기 위해 최대로 셋팅하였다. 반응 혼합물은 초기에 매우 점성이 되었고 아미-그린 색으로 변하였다. 수산화암모늄 적정이 끝난 후 점도가 떨어졌다. 수산화암모늄을 서서히 첨가하는 경우, 점도가 증가하여 제2철/제1철 혼합물 중의 수산화암모늄의 균질 혼합을 방해하여, 큰 입자가 형성된다. 가외의 수산화암모늄 또는 1 mL 미만의 수산화암모늄이 첨가되지 않았음이 보장되었다.
격렬한 교반을 빙조에서 15 min 동안 계속하였다. 반응 혼합물 하에 빙조를 유지하고, 전체 공정 동안 교반을 유지하였다. 15분 후, 하나의 목부를 수-냉각 응축기와 연결하고, 다른 목부를 불활성 기체와 연결하여 고열에서 퍼징하였다 (반응 혼합물에서가 아님). 고온에서 범핑이 일어나지 않도록 주의하였다. 반응 Rbf를 오일 배쓰 내로 이전하고, 이는 60℃로 예열되었다. 90분 동안 오일 배쓰에서 교반을 계속하였다. 온도계를 반응 혼합물에서 유지하여 온도를 측정하고, 온도를 적어도 약 75 내지 85℃에서 유지하였다. 혼합물을 60분 초과 동안 가열하지 않았다. 이 단계 후 기체 유동을 중단하고, 용액을 실온으로 서서히 냉각시켰다. 이들 시리즈의 반응 종료시 덱스트란 코팅된 자기 나노입자의 형성이 달성되었다. 최종 용액의 부피는 약 40 mL였다. 교반을 실온에서 12시간 동안 계속하였다. D.I.수를 첨가함으로써 부피를 40 mL로 셋팅하였다. 용액을 50 mL 원추형 튜브 내로 옮기고 14,000 RPM으로 1 hr 동안 원심분리에 의해 큰 입자를 제거하였다. 용액을 아미콘 필터 유닛 (10 mL x 4) 내로 옮기고, 입자를 50 mL 원추형 튜브 내에서 폐기하였다.
생성된 용액을 아미콘 튜브 (50K 원심 필터 유닛)에 의해 정제하여 미반응 덱스트란, 철 염, 및 수산화암모늄을 제거하였다. 나노입자 현탁액을 먼저 원심분리 (3시간 동안 4,500 RPM)로 농축시켰고, 이는 필터 상의 고도로 농축된 나노입자 현탁액 및 필터 유닛 하의 나노입자-무함유 용리를 형성하였다. 필터 하의 용리액을 폐기하고, 나노입자 펠릿을 D.I.수 중에 재현탁시키고, 동일한 필터 유닛을 사용하여 재원심분리하였다. 용리액이 D.I.수의 pH 또는 중성 pH를 나타낼 때까지 이 단계를 반복하였다. 초기에, 원심분리는 용액의 점도, 입자의 큰 크기, 및 혼합물 중의 보다 많은 양의 미반응, 유리 덱스트란으로 인해 약 3 hr이 걸렸다. 그러나, 최초 3 또는 4개 원심분리 단계 후, 대부분의 유리 덱스트란이 제거되었고, 비교적 짧은 원심분리 단계 (원심분리 단계 당 약 15 min)에서 나노입자의 재현탁 및 농축이 수행되었다. 세척 단계를 7회 반복하였다. 자기 나노입자의 생성된 정제된 용액을 증류수 중에 재현탁시켰다. 최종 부피를 21 mL로 조정하고, 용액을 밤새 냉장고에 (예를 들어, 약 4℃에서) 그대로 두었다. 샘플을 자기 입자 분광계 (MPS)에 의해 분석하고, 비-선형성 지수 (NLI)를 계산하였다. NLI 값을 나노입자의 자기 특성의 기준으로서 사용하였다.
이 스케일-업 연구는, 총 철 농도에 있어 실시예 1-6에 기재된 연구보다 18배 더 큰 스케일-업을 나타내었다. 극복된 주요 난관은 산화철 결정 형성 단계, 수산화암모늄 첨가 단계에서 높은 점도였다. 기계적 교반기의 사용은 상기에 기재된 단계에서의 균질 혼합의 문제를 해결하였고, 적정 없이, 미리 고정된 부피를 부음으로써 가능한 한 최소 시간 내에 수산화암모늄의 첨가를 수행하였다. 수산화암모늄의 부피는 표 4에 나타낸 바와 같이 총 철 화합물의 양에 비례한다. 총 철 농도에 대한 덱스트란 용액의 증가는 결정 형성 단계에서의 점도를 감소시켰다. 이들 결과는 60 mL 덱스트란 용액 중의 18 eq 총 철 농도의 가혹 조건에서 탁월한 비-선형성 지수를 갖는 자기 나노입자의 대량 생산을 입증하였다.
다른 실시양태
본 발명을 그의 상세한 설명과 함께 기재하였지만, 상기 설명은, 첨부된 청구범위의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 예시하도록 의도된 것임을 이해하여야 한다. 다른 측면, 이점, 및 변형이 하기 청구범위의 범위 내에 포함된다.

Claims (31)

  1. 자기 나노입자를 포함하는 나노입자 조성물이며,
    자기 나노입자는
    염화제2철, 염화제1철, 또는 이들의 조합; 및
    하나 이상의 아민 기로 관능화된 덱스트란 코팅
    을 포함하고,
    여기서 하나 이상의 아민 기의 수는 약 5 내지 약 1000의 범위인
    나노입자 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 약 50 중량(wt)% 내지 약 100 wt%의 염화제2철 및 약 0 wt% 내지 약 50 wt%의 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 약 0.65 g의 염화제2철 및 약 0.4 g의 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노 기의 수가 약 5 내지 약 150의 범위인 나노입자 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 약 50 wt% 내지 약 100 wt%의 염화제2철을 포함하는 나노입자 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 약 1.2 g의 염화제2철을 포함하는 나노입자 조성물.
  7. 제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 염화제1철을 포함하지 않는 나노입자 조성물.
  8. 제1항, 제5항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노 기의 수가 약 246 내지 약 500의 범위인 나노입자 조성물.
  9. 자기 나노입자를 포함하는 나노입자 조성물이며,
    자기 나노입자는
    염화제2철, 염화제1철, 또는 이들의 조합; 및
    덱스트란 코팅
    을 포함하고,
    여기서 자기 나노입자는 약 6 내지 약 40 범위의 비-선형성 지수를 갖는 것인
    나노입자 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 약 50 중량(wt)% 내지 약 80 wt%의 염화제2철 및 약 50 wt% 내지 약 20 wt%의 염화제1철 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 약 0.54 g의 염화제2철 및 약 0.2 g의 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 자기 나노입자가 8 내지 14 범위의 비-선형성 지수를 갖는 것인 나노입자 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 약 0 중량(wt)% 내지 약 50 wt%의 염화제2철 및 약 100 wt% 내지 약 50 wt%의 염화제1철 염화제1철, 또는 약 80 wt% 내지 약 [ 100 wt%]의 염화제2철 및 약 0 wt% 내지 약 20 wt%의 염화제1철 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 약 0.54 g의 염화제2철 및 약 0.4 g의 염화제1철을 포함하는 나노입자 조성물.
  15. 제9항 또는 제13항에 있어서, 자기 나노입자가 약 8 내지 약 67 범위의 비-선형성 지수를 갖는 것인 나노입자 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 자기 나노입자가 약 67의 비-선형성 지수를 갖는 것인 나노입자 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 자기 나노입자가 약 3 nm 내지 약 50 nm의 직경을 갖는 산화철 결정 코어를 갖고, 자기 나노입자의 유체역학 직경이 약 7 nm 내지 약 200 nm인 나노입자 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 자기 나노입자가 약 0.1 내지 약 0.25의 다분산성을 갖는 것인 나노입자 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 덱스트란 코팅이 약 1 kDa 내지 약 15 kDa 범위의 분자량을 갖는 덱스트란을 포함하는 것인 나노입자 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 덱스트란 코팅이 약 10 kDa의 분자량을 갖는 덱스트란을 포함하는 것인 나노입자 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 덱스트란 코팅의 표면에 부착된 약물 페이로드를 추가로 포함하는 나노입자 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 페이로드가 하나 이상의 아민 기에 컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드인 나노입자 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 페이로드가 약물, 항체, 성장 인자, 핵산, 핵산 유도체, 핵산 단편, 단백질, 단백질 유도체, 단백질 단편, 사카라이드, 폴리사카라이드 단편, 사카라이드 유도체, 글리코시드, 글리코시드 단편, 글리코시드 유도체, 이미징 조영제, 또는 이들의 임의의 조합인 나노입자 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 나노입자 조성물 및 적어도 하나의 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
  25. 조직 표적 부위의 이미징을 필요로 하는 대상체에서의 조직 표적 부위의 이미징 방법이며,
    치료 유효량의 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 나노입자 조성물을 대상체의 신체, 신체 부분, 조직, 세포, 또는 체액의 일부에서 적어도 조직 표적 부위에 투여하는 단계;
    자기 나노입자 조성물 및 조직 표적 부위에 에너지를 투여하는 단계;
    나노입자 조성물 및 조직 표적 부위의 신호를 검출하는 단계; 및
    검출된 신호에 기초하여 조직 표적 부위의 이미지를 얻는 단계
    를 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 이미징이 자기 공명 이미징, 자기 입자 이미징, 또는 이들의 조합이고, 에너지가 자기장인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 질환이 암이고, 조직 표적 부위가 종양인 방법.
  28. 제25항에 있어서, 나노입자 조성물이 대상체의 표적 부위에 축적되는 것인 방법.
  29. 질환의 이미징을 필요로 하는 대상체에서의 질환의 이미징 방법에서의 사용을 위한 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 조성물.
  30. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 나노입자 조성물을 제조하는 방법이며,
    덱스트란을 물 중에 용해시키는 단계;
    덱스트란을 에피클로로히드린으로 가교시키는 단계;
    염화제1철 용액, 염화제2철 용액, 또는 이들의 조합을 제조하는 단계;
    염화제1철 용액, 염화제2철 용액, 또는 이들의 조합을 덱스트란에 첨가함으로써 혼합물을 제조하는 단계;
    염기를 교반하면서 혼합물에 첨가하고 혼합물을 빙조에 적용하는 단계; 및
    혼합물을 약 75℃ 내지 약 90℃의 온도에 적용하는 단계
    를 포함하며, 여기서 염기의 첨가 단계는 산화철 결정, 산화철 수화물, 또는 이들의 조합의 형성을 방지하고,
    여기서 혼합물은 약 50 중량(wt)% 내지 100 wt%의 염화제2철 및 약 0 wt% 내지 50 wt%의 염화제1철을 포함하는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 나노입자 조성물을 제조하는 방법이며,
    덱스트란을 물 중에 용해시키는 단계;
    덱스트란을 에피클로로히드린으로 가교시키는 단계;
    염화제1철 용액, 염화제2철 용액, 또는 이들의 조합을 제조하는 단계;
    염화제1철 용액, 염화제2철 용액, 또는 이들의 조합을 덱스트란에 첨가함으로써 혼합물을 제조하는 단계;
    염기를 교반하면서 혼합물에 첨가하고 혼합물을 빙조에 적용하는 단계; 및
    혼합물을 약 75℃ 내지 약 90℃의 온도에 적용하는 단계
    를 포함하며, 여기서 염기의 첨가 단계는 산화철 결정, 산화철 수화물, 또는 이들의 조합의 형성을 방지하고,
    여기서 혼합물은 50 wt% 내지 약 80 wt%의 염화제2철 및 약 50 wt% 약 20 wt%의 염화제1철을 포함하는 것인 방법.
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