JP2023504525A - 調整可能な磁性ナノ粒子のための組成物および方法 - Google Patents

調整可能な磁性ナノ粒子のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、疾患（たとえば、がん）の処置、予防、または撮像において使用するためのナノ粒子組成物、それを必要とする対象における疾患を、ナノ粒子組成物を用いて処置、予防、または撮像する方法、および本開示のナノ粒子組成物を調製する方法を提供する。ナノ粒子組成物は塩化第二鉄、塩化第一鉄、またはそれらの組合せと、１以上のアミン基で官能化されたデキストランコーティングとを含む磁性ナノ粒子を含み得る。【選択図】 なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月５日に出願された米国仮出願第６２／９４３，９２７号の利益を主張するものである。前述の内容全体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は調整可能な磁気特性および調整可能な表面修飾（たとえば、アミン基修飾）を有するナノ粒子組成物、これらのナノ粒子組成物を調製する方法、およびこれらのナノ粒子組成物を使用する方法を提供する。ナノ粒子組成物は塩化第一鉄、塩化第二鉄、デキストラン、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。
医用撮像は、対象についての情報を収集するために使用される。撮像の種類のいくつかでは、造影剤が対象に投与される。造影剤は対象における目的の生体粒子または他の構造体に選択的に結合する。この造影剤は次に医用撮像装置を使用して検出され、収集された情報は画像の現像などに使用される。
１枚の医用画像からでも多くの情報を収集することができるが、高い空間および時間分解能、高い検出感度、および断層撮影能力を有する包括的な定量診断情報を得るためには、複数の撮像技術が必要である。そのため、従来は、１人の対象に対して複数の造影剤を投与し、それぞれのモダリティを実施することが多かった。
様々な種類のモダリティによる検出に適したマルチモーダル造影剤が開発されている。これらのマルチモーダル造影剤は、一般に、それぞれ別々のモダリティにより検出可能な複数の実態を含む。複数の実態は、一般に化学的リンカーを使用して互いに結合され、それぞれがそれぞれの複数の実態のすべてを含有する粒子が作られる。しかし、化学的リンカーは、細胞および組織において、または時間経過に伴い安定性が変化することが多いため、一部の実態が分離し、これらの造影剤の品質および有用性が損なわれる可能性がある。
複数の実態を化学的に互いに結合させることの問題を回避するため、コアシェル構造を有する造影剤の形成が試みられている。しかし、今日まで、臨床的に応用が可能なコアシェル構造の開発には大きな問題があった。さらに、現在利用可能な粒子は、部位を標的とした調整可能な表面官能化、および調整可能な磁気特性を欠いている。
したがって、臨床的に応用が可能で、表面官能化および物理特性（たとえば、磁気特性）の観点から設計に自由度があるマルチモーダル造影剤が求められている。
本開示の特定の態様は、塩化第二鉄、塩化第一鉄、またはそれらの組合せと；１つ以上のアミン基で官能化されたデキストランコーティングとを含む磁性ナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、１つ以上のアミン基の数が約５～約１０００の範囲である、ナノ粒子組成物を対象とする。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約５０重量（ｗｔ）％～約１００ｗｔ％の塩化第二鉄および約０ｗｔ％～約５０ｗｔ％の塩化第一鉄を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約０．６５ｇの塩化第二鉄および約０．４ｇの塩化第一鉄を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ基の数は約５～約１５０の範囲である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約５０ｗｔ％～約１００ｗｔ％の塩化第二鉄を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約１．２ｇの塩化第二鉄を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は塩化第一鉄を含まない。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ基の数は約２４６～約５００の範囲である。
別の態様では、本開示は、塩化第二鉄、塩化第一鉄、またはそれらの組合せと；デキストランコーティングとを含む磁性ナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、磁性ナノ粒子が約６～約４０の範囲の非線形性指数を有する、ナノ粒子組成物を対象とする。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約５０重量（ｗｔ）％～約８０ｗｔ％の塩化第二鉄および約５０ｗｔ％～約２０ｗｔ％の塩化第一鉄を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約０．５４ｇの塩化第二鉄および約０．２ｇの塩化第一鉄を含む。いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子は８～１４の範囲の非線形性指数を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約０重量（ｗｔ）％～約５０ｗｔ％の塩化第二鉄および約１００ｗｔ％～約５０ｗｔ％の塩化第一鉄を含むか、または約８０ｗｔ％～約１００ｗｔ％の塩化第二鉄および約０ｗｔ％～約２０ｗｔ％の塩化第一鉄を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約０．５４ｇの塩化第二鉄および約０．４ｇの塩化第一鉄を含む。いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子は約８～約６７の範囲の非線形性指数を有する。いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子は約６７の非線形性指数を有する。いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子は約３ｎｍ～約５０ｎｍの直径を有する酸化鉄結晶コアを有し、磁性ナノ粒子の流体力学的直径は約７ｎｍ～約２００ｎｍである。
いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子は約０．１～約０．２５の多分散性を有する。いくつかの実施形態では、デキストランコーティングは約１ｋＤａ～約１５ｋＤａの範囲の分子量を有するデキストランを含む。いくつかの実施形態では、デキストランコーティングは約１０ｋＤａの分子量を有するデキストランを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物はデキストランコーティングの表面に付着した薬物ペイロードをさらに含む。いくつかの実施形態では、薬物ペイロードは１つ以上のアミン基とコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、薬物ペイロードは薬物、抗体、成長因子、核酸、核酸誘導体、核酸断片、タンパク質、タンパク質誘導体、タンパク質断片、糖、多糖断片、糖誘導体、グリコシド、グリコシド断片、グリコシド誘導体、撮像造影剤、またはそれらの任意の組合せである。
別の態様では、本開示は、本開示の任意のナノ粒子組成物と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物を対象とする。
別の態様では、本開示は、治療有効量の本開示の任意のナノ粒子組成物を、少なくとも、対象の身体、身体部分、組織、細胞または体液の一部における組織標的部位に投与することと；エネルギーを磁性ナノ粒子組成物および組織標的部位に投与することと；ナノ粒子組成物および組織標的部位のシグナルを検出することと；検出されたシグナルに基づいて組織標的部位の画像を得ることとを含む、それを必要とする対象における組織標的部位を撮像する方法を対象とする。
いくつかの実施形態では、撮像は磁気共鳴撮像、磁性粒子撮像、またはそれらの組合せであり、エネルギーは磁場である。いくつかの実施形態では、疾患はがんであり、組織標的部位は腫瘍である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は対象の標的部位に蓄積する。
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象における疾患を撮像する方法において使用するための、本開示の任意の組成物を対象とする。
別の態様では、本開示は、本開示の任意のナノ粒子組成物を調製する方法であって、デキストランを水に溶解させることと；デキストランをエピクロロヒドリンで架橋することと；塩化第一鉄溶液、塩化第二鉄溶液、またはそれらの組合せを調製することと；塩化第一鉄溶液、塩化第二鉄溶液、またはそれらの組合せをデキストランに加えて、混合物を調製することと；混合物を撹拌および氷浴に供しながら、混合物に塩基を加えることと；混合物を約７５℃～約９０℃の温度に供することとを含み、塩基を加えるステップが酸化鉄結晶、酸化鉄水和物、またはそれらの組合せの形成を妨げ、混合物が約５０重量（ｗｔ）％～１００ｗｔ％の塩化第二鉄および約０ｗｔ％～５０ｗｔ％の塩化第一鉄を含む、方法を対象とする。
別の態様では、本開示は、本開示の任意のナノ粒子組成物を調製する方法であって、デキストランを水に溶解させることと；デキストランをエピクロロヒドリンで架橋することと；塩化第一鉄溶液、塩化第二鉄溶液、またはそれらの組合せを調製することと；塩化第一鉄溶液、塩化第二鉄溶液、またはそれらの組合せをデキストランに加えて、混合物を調製することと；混合物を撹拌および氷浴に供しながら混合物に塩基を加えることと；混合物を約７５℃～約９０℃の温度に供することとを含み、塩基を加えるステップが酸化鉄結晶、酸化鉄水和物、またはそれらの組合せの形成を妨げ、混合物が５０ｗｔ％～約８０ｗｔ％の塩化第二鉄および約５０ｗｔ％～約２０ｗｔ％の塩化第一鉄を含む、方法を対象とする。
用語「磁性」は、磁場に反応する組成物を表すために使用される。磁性組成物の非限定的な例（たとえば、本明細書に記載されるナノ粒子組成物のいずれか）は、常磁性、超常磁性、強磁性、または反磁性である材料を含有することができる。磁性組成物の非限定的な例は、磁鉄鉱；フェライト（たとえば、マンガン、コバルト、およびニッケルのフェライト）；Ｆｅ（ＩＩ）酸化物；および赤鉄鉱、ならびにそれらの金属合金の群から選択される金属酸化物を含有する。追加の磁性材料は本明細書に記載され、当技術分野で公知である。
用語「反磁性」は、１以下の比透磁率を有し、磁場により反発される組成物を表すために使用される。
用語「常磁性」は、外部から印加される磁場の存在下でのみ磁気モーメントを発現する組成物を表すために使用される。
用語「強磁性」または「強磁性」は、磁場の影響を強く受け、外部から印加された磁場が除去された後も磁気特性（磁気モーメント）を保持することができる組成物を表すために使用される。
用語「ナノ粒子」は、約２ｎｍ～約２００ｎｍの間（たとえば、１０ｎｍ～２００ｎｍの間、２ｎｍ～１００ｎｍの間、２ｎｍ～４０ｎｍの間、２ｎｍ～３０ｎｍの間、２ｎｍ～２０ｎｍの間、２ｎｍ～１５ｎｍの間、１００ｎｍ～２００ｎｍの間、および１５０ｎｍ～２００ｎｍの間）の直径を有する物体を意味する。ナノ粒子の非限定的な例としては、本明細書に記載されるナノ粒子が挙げられる。
用語「磁性ナノ粒子」は、（本明細書で定義される）磁性を有するナノ粒子（たとえば、本明細書に記載されるナノ粒子のいずれか）を意味する。磁性ナノ粒子の非限定的な例は、本明細書に記載される。追加の磁性ナノ粒子は、当技術分野で公知である。
用語「核酸」は、任意の一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチド（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成、または合成由来）を意味する。用語核酸は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド（たとえば、塩基における修飾および／または糖における修飾を含有する）および／または２つのヌクレオチドを連結するホスホジエステル結合における修飾を含有するオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸は少なくとも１つのロックドヌクレオチド（ＬＭＡ）を含有することができる。核酸の非限定的な例は、本明細書に記載される。核酸の追加の例は、当技術分野で公知である。
用語「撮像」は、生物物理学的技術（たとえば、電磁エネルギーの吸収および／または放出）を使用した、対象の少なくとも１つの組織の可視化を意味する。撮像の非限定的な実施形態としては、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）、Ｘ線コンピュータ断層撮影、および光学的撮像が挙げられる。
本明細書で使用される用語「対象」または「患者」は、本開示の組成物または方法が、たとえば、実験的、診断的、予防的、および／または治療的目的のために適用され得る任意の哺乳動物（たとえば、ヒトまたは獣医学的対象（たとえば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、またはウサギ）を指す。対象は、特定の疾患または状態について、処置を求めるまたは必要とする可能性がある、処置を必要とする、処置を受けている、処置を受ける予定である、または訓練を受けた専門家によるケアを受けている。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り複数の指示対象を含む。したがって、たとえば、「ナノ粒子」という言及は、ナノ粒子の混合物を含み、「ナノ粒子」という言及は、２つ以上のそのようなナノ粒子の混合物を含む、などである。
範囲は、本明細書では、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表され得る。そのような範囲を表すとき、別の実施形態では、１つの特定の値から、および／または、他の特定の値までが含まれる。同様に、値が近似値として表されるとき、先行詞「約」を使用することにより、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。範囲のそれぞれの終点は、他の終点との関連において、および他の終点から独立しての両方で重要であることがさらに理解されるであろう。
本開示の特定の実施形態は、それを必要とする対象における疾患の処置、予防、診断、および／または撮像のためにナノ粒子組成物のいずれかを使用する方法を含む。現在、処置および／または撮像目的のために人体の標的部位に上手く到達するための必要要件を満たすことのできる、調整可能で改善されたナノ粒子組成物が求められている。本開示のナノ粒子組成物およびナノ粒子組成物を使用する方法は、上述の必要要件に対処するものである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物の重要な物理的性質（たとえば、アミノ化および磁気強度）は、特定の成分の濃度（たとえば、塩化第一鉄または塩化第二鉄の濃度）を調節することにより微調整することができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、物理的性質（たとえば、アミノ化、磁気強度、サイズ、および多分散性）に変化を与えることなくスケールアップすることができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は長期安定性（たとえば、少なくとも６か月まで）を有することができる。いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子は水性媒体中の沈殿法により調製することができ、これは環境に優しく他の合成方法よりも安価である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるナノ粒子組成物を使用する方法は、疾患（たとえば、がん）に関連する症状を予防、処置、軽減、および／または除去することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるナノ粒子組成物を使用する方法は、標的部位（たとえば、腫瘍）の撮像を補助することができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、それを必要とする対象における標的部位（たとえば、腫瘍）を同時に撮像し処置するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、標的部位（たとえば、腫瘍）へのペイロード（たとえば、オリゴヌクレオチド）の持続的送達を可能にする。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、薬物送達ビヒクルが従来到達することが困難である標的部位（たとえば、腫瘍または腫瘍コア）へのペイロード（たとえば、オリゴヌクレオチド）の送達が可能である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は生体適合性であり、約０．２５時間～約２４時間の半減期で血液循環中に留まることができる。
本開示において値が範囲によって記載されている場合、終点が含まれる。さらに、その記載は、特定の数値または特定の部分範囲が明示的に記載されているかどうかにかかわらず、そのような範囲内のすべての可能な部分範囲、ならびにそのような範囲内に入る特定の数値の開示を含むと理解されたい。
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
この開示の特徴の様々な実施形態が本明細書に記載される。しかし、そのような実施形態は単に例として提供されるものであり、この開示の範囲を逸脱することなく、当業者によれば、多数の変形、変更、および置換が起こり得ることを理解されたい。また、本明細書に記載される特定の実施形態に対する様々な代替案も、この開示の範囲内であることを理解されたい。
本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、別段に定義されない限り、この発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書には、本発明において使用するための方法および材料が記載されるが、当技術分野で公知である他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法および実施例は例示的に過ぎず、限定的であることを意図していない。本明細書で言及されるすべての出版物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、およびその他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合、定義を含めて、本明細書が優先する。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付図面および以下の説明に記載される。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本開示のナノ粒子を調製する方法中のデキストラン溶解のためのセットアップの一例を表す図である。 本開示のナノ粒子を調製する方法中のデキストラン溶解のためのセットアップの一例を表す図である。 ６Ｎ塩酸に曝露されたアミノ化されたデキストランコーティングナノ粒子の吸光スペクトルを示す図であり、この溶液は紫外線／可視光（ＵＶ／Ｖｉｓ）分光測定法により測定してモニターしたものである。 磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）あたり約６０～９０個のアミン基を有する「条件１」ナノ粒子のサイズ評価を示す図である；サイズは、動的光散乱により測定したところ、約１１．４８ナノメートル（ｎｍ）であった。 ＭＮＰあたり約２５０個のアミン基を有する「条件２」ナノ粒子のサイズ評価を示す図である；サイズは、動的光散乱により測定したところ、約１５．６ｎｍであった。 ＵＶ／Ｖｉｓ分光測定法により測定した、磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）あたり約２５０個のアミン基を有する「条件２」ナノ粒子の吸光スペクトルを示す図である。 ＵＶ／Ｖｉｓ分光測定法により測定した、磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）あたり約６０～９０個のアミン基を有する「条件１」ナノ粒子、およびＭＮＰあたり約２４６～５００個のアミン基を有する「条件２」ナノ粒子の吸光スペクトルを示す図である。 条件１ＭＮＰにおけるオリゴヌクレオチド負荷を解析するためのゲル電気泳動の一例を示す図である。ナノ粒子あたりのオリゴヌクレオチド（オリゴ）とアミノ基の比を変えることにより、オリゴ／磁性ナノ粒子（オリゴ／ＭＮ）の数を漸次増加させることができる。オリゴ／ＭＮの数は、ナノ粒子あたりのオリゴのモル比を表す。オリゴの数を６４アミン／ＭＮＰで検証し、オリゴの負荷が最大となるように反応比を変化させた。これらのＭＮＰを、表３の条件（すなわち、１：１のＦｅ３＋／Ｆｅ２＋比を有するＭＮＰ）により、過剰な水酸化アンモニウム添加の存在下で合成した。 ナノ粒子の磁気特性の定量化のための磁性粒子分光測定法を示す図である。磁気特性の主な基準として、示した配合の試料間で非線形性指数を比較した。 動的光散乱により測定した約１４９．３ｎｍの平均ナノ粒子サイズおよび０．９ｎｍの標準偏差を有する、１：１のＦｅ３＋：Ｆｅ２＋比と、１２．１の非線形性指数とを有するナノ粒子例を示す図である。 ナノ粒子の磁気特性の定量化のための磁性粒子分光測定法を示す図である。表４に示す「条件Ｂ」に従って合成したナノ粒子の非線形性指数は９．７１１１と算出された。 動的光散乱により測定した約１２７．１ｎｍの平均ナノ粒子サイズおよび０．２１ｎｍの標準偏差を有する、図１１のナノ粒子を示す図である。 ナノ粒子の磁気特性の定量化のための磁性粒子分光測定法を示す図である。表４に示す「条件Ｃ」に従って合成したナノ粒子の非線形性指数は８．８３２６と算出された。この測定は、ナノ粒子の安定性を確認するために、合成から１カ月後に行われた。 表面修飾のために１０／２０に精製されたもの。 動的光散乱により測定した約６３．４７ｎｍの平均ナノ粒子サイズおよび０．６１ｎｍの標準偏差を有する、図１４のナノ粒子を示す図である。 ナノ粒子の磁気特性の定量化のための磁性粒子分光測定法を示す図である。表４に示す「条件Ｅ」に従って合成したナノ粒子の非線形性指数は１４．３７３１と算出された。 ナノ粒子の磁気特性の定量化のための磁性粒子分光測定法を示す図である。表４に示す「条件Ｅ」に従って合成したナノ粒子の非線形性指数は、安定性を確認するために約１カ月間保管した後に、１５．６４３７と算出された。 約２か月間保管した後の、動的光散乱により測定した約１８１．８３ｎｍの平均ナノ粒子サイズおよび１．０ｎｍの標準偏差を有する、図１６のナノ粒子を示す図である。 ナノ粒子の磁気特性の定量化のための磁性粒子分光測定法を示す図である。表４に示す「条件Ｆ」に従って合成したナノ粒子の非線形性指数は１４．８０６と算出された。 ナノ粒子の磁気特性の定量化のための磁性粒子分光測定法を示す図である。図１９のナノ粒子の非線形性指数は、約１カ月間保管した後に、１４．２１６８と算出された。 約２か月間保管した後の、動的光散乱により測定した約１８５．９７ｎｍの平均ナノ粒子サイズおよび０．２５ｎｍの標準偏差を有する、図１９のナノ粒子を示す図である。 懸濁液安定化のためのナノ粒子例のアミン基での表面修飾および血液循環の促進のためのナノ粒子例のポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ－２０００）での表面修飾を表す模式図である。
本明細書に記載される磁性ナノ粒子は、調整可能な磁気特性および表面官能化を有することが可能であることが発見された。これらの特徴を有する磁性ナノ粒子、ならびにこれらの磁性ナノ粒子を調製する方法、およびこれらの磁性ナノ粒子を投与することにより、それを必要とする対象における疾患を処置、予防、および／または撮像する方法が、本明細書に提供される。
ナノ粒子組成物
本明細書に提供されるのは、塩化第二鉄、塩化第一鉄、またはそれらの組合せ、およびデキストランコーティングを含む磁性ナノ粒子を含むナノ粒子組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は２つ以上の本明細書に記載される異なるナノ粒子組成物を含有することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、調整可能な表面官能化を有する少なくとも１つの磁性ナノ粒子、および調整可能な磁気特性を有する少なくとも１つの磁性ナノ粒子を含有する。
調整可能なアミノ基官能化
いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子は１つ以上のアミン基で官能化され得る。いくつかの実施形態では、官能化は磁性ナノ粒子の表面で起こる。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミン基はデキストランコーティングに共有結合される。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミン基はデキストランコーティングの１つ以上のヒドロキシル基を置換する。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミン基の数は、塩化第二鉄、塩化第一鉄、またはそれらの組合せの濃度に基づいて調整可能である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約５～約１０００個のアミン基を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約５～２５、２５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４５０～５００、５００～５５０、５５０～６００、６００～６５０、６５０～７００、７００～７５０、７５０～８００、８００～８５０、８５０～９００、９００～９５０、または９５０～１０００個のアミン基を含む。
いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子は磁性材料（たとえば、塩化第二鉄および／または塩化第一鉄）のコアを含有することができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約０．６０ｇ～約０．７０ｇの塩化第二鉄および約０．３ｇ～約０．５ｇの塩化第一鉄を含む。いくつかの実施形態では、約０．６０ｇ～約０．７０ｇの塩化第二鉄および約０．３ｇ～約０．５ｇの塩化第一鉄を含むナノ粒子組成物は、約５～１５０個のアミン基で官能化される。いくつかの実施形態では、約０．６５ｇの塩化第二鉄および約０．４ｇの塩化第一鉄を含むナノ粒子組成物は、約６０～９０個のアミン基で官能化される。いくつかの実施形態では、約０．６５ｇの塩化第二鉄および約０．４ｇの塩化第一鉄を含むナノ粒子組成物は、約５～１５０個のアミン基で官能化される。いくつかの実施形態では、約０．６５ｇの塩化第二鉄および約０．４ｇの塩化第一鉄を含むナノ粒子組成物は、約１～１５０個のアミン基で官能化される。いくつかの実施形態では、約０．６５ｇの塩化第二鉄および約０．４ｇの塩化第一鉄を含むナノ粒子組成物は、少なくとも約１～１０個のアミン基、１０～２０個のアミン基、約２０～３０個のアミン基、約３０～４０個のアミン基、約４０～５０個のアミン基、約５０～６０個のアミン基、約６０～７０個のアミン基、約７０～８０個のアミン基、約８０～９０個のアミン基、約９０～１００個のアミン基、約１００～１１０個のアミン基、約１１０～１２０個のアミン基、約１２０～１３０個のアミン基、約１３０～１４０個のアミン基、または約１４０～１５０個のアミン基で官能化される。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約１ｇ～約１．４ｇの塩化第二鉄を含む。いくつかの実施形態では、約１ｇ～約１．４ｇの塩化第二鉄を含むナノ粒子組成物は約２４６～５００個のアミン基で官能化される。いくつかの実施形態では、約１．２ｇの塩化第二鉄を含むナノ粒子組成物は約２４６～５００個のアミン基で官能化される。いくつかの実施形態では、約２４６～５００個のアミン基で官能化されるナノ粒子組成物は塩化第二鉄を含まない。いくつかの実施形態では、約１．２ｇの塩化第二鉄を含むナノ粒子組成物は約２００～６００個のアミン基で官能化される。いくつかの実施形態では、約１．２ｇの塩化第二鉄を含むナノ粒子組成物は、少なくとも約２００～２５０個のアミン基、２５０～３００個のアミン基、約３００～３５０個のアミン基、約３５０～４００個のアミン基、約４００～４５０個のアミン基、約４５０～５００個のアミン基、約５００～５５０個のアミン基、約５５０～６００個のアミン基、またはそれより多くのアミン基で官能化される。
このように、いくつかの実施形態では、デキストランコーティングにコンジュゲートされるアミン基の数は、磁性ナノ粒子を調製するために使用される塩化第二鉄および塩化第一鉄の濃度を制御することにより微調整され得る。
調整可能な磁気特性
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は塩化第二鉄、塩化第一鉄、またはそれらの組合せの濃度に基づいて調整可能な磁気強度を有する磁性ナノ粒子を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＮＰあたりの全鉄中にナノ粒子組成物は約０．１％～約９９．９％の第二鉄イオン、および約９９．９％～約０．１％の第一鉄イオンを含む。いくつかの実施形態では、約６０％～８０％の塩化第二鉄および約２０％～約４０％の塩化第一鉄を含むナノ粒子組成物は、約８０％よりも多い量の塩化第一鉄を有するナノ粒子組成物よりも強い磁気特性を有する。いくつかの実施形態では、約７０％の第二鉄イオンおよび約３０％ｇの第一鉄イオンを含むナノ粒子組成物は、約３０％よりも多い量の第一鉄イオンを有するナノ粒子組成物よりも強い磁気特性を有する。
いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子の磁気強度は磁性粒子分光測定法によって非線形性指数（ＮＬＩ）を測定することにより定量化され得る。ＮＬＩは、粒子が磁性ナノ粒子の非線形挙動に依存する磁性粒子撮像またはその他の技術に適切かどうかを決定するために使用される基準である。ＮＬＩは、磁性粒子分光計システムのパラメータであるＦ１とＦ３の比を算出することにより決定され得る。Ｆ１／Ｆ３は外部磁場に対する粒子の磁化を比較したものである。Ｆ１はフーリエ分解後の外部磁気励起（「駆動」）周波数の大きさであり、Ｆ３は駆動周波数の第３高調波の大きさ（たとえば、駆動周波数が２５ｋＨｚの場合、Ｆ１は２５ｋＨｚであり、Ｆ３は７５ｋＨｚである）を指し、このようにＦ１およびＦ３を周波数の大きさで算出し、フーリエ分解の過程で時間領域における非線形相関を解析することが可能となる。粒子が、磁性粒子分光計が使用する外部磁場に線形に比例する磁気特性を有する場合、その非線形性指数は非常に大きくなる可能性がある。粒子が、磁性粒子分光計が使用する外部磁場に線形に比例する磁気特性を有する場合、その非線形性指数は非常に大きくなる可能性がある。外部磁場により磁化されたときの磁気強度に対して、外部磁場のない粒子の透磁率（図９、１１、１３、１４、１６、１７、１９、および２０における「磁気強度」または「ｄＭ／ｄＨ」）が大きいほど、非線形性指数は小さくなる（たとえば、方形波磁化応答のＮＬＩである１に近くなる）。逆に、その完全に磁化された状態に対して粒子の初期磁気強度が似ているほど、非線形性指数は大きくなる。ＮＬＩは特定の励磁条件に関連するため、本明細書に示すすべての測定で同じ外部磁場（ピークの大きさが４．５ｍＴ／μ０の正弦波場）を使用したが、方法および解析は他の動作条件にも同様に適用することが可能である。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約６～約４０の範囲のＮＬＩを有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約６～約７０の範囲のＮＬＩを有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約８．５～約１４．８の範囲のＮＬＩを有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約８～約１４の範囲のＮＬＩを有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約６のＮＬＩを有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約８のＮＬＩを有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約１４のＮＬＩを有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約６７のＮＬＩを有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は６～７、７～８、８～９、９～１０、１０～１１、１１～１２、１２～１３、１３～１４、１４～１５、１５～１６、１６～１７、１７～１８、１８～１９、１９～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０の範囲のＮＬＩを有する。いくつかの実施形態では、約０．５４ｇの塩化第二鉄および約０．２ｇの塩化第一鉄を含むナノ粒子組成物は、約８．５～約１４．８の範囲の非線形性指数を有する。いくつかの実施形態では、約０．５４ｇの塩化第二鉄および約０．２ｇの塩化第一鉄を含むナノ粒子組成物は、約１２の非線形性指数を有する。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約８０％～約１００％の塩化第二鉄および約２０％～約０％の塩化第一鉄を含む。いくつかの実施形態では、約０％～約５０％の塩化第二鉄および約１００％～約５０％の塩化第一鉄を含むナノ粒子組成物は、約０．４ｇよりも少ない量の塩化第一鉄を有するナノ粒子組成物よりも弱い磁気特性を有する。いくつかの実施形態では、約０．５４ｇの塩化第二鉄および約０．４ｇの塩化第一鉄を含むナノ粒子組成物は、約０．２ｇよりも少ない量の塩化第一鉄を有するナノ粒子組成物よりも弱い磁気特性を有する。
いくつかの実施形態では、約０．５４ｇの塩化第二鉄および約０．４ｇの塩化第一鉄を含むナノ粒子組成物は、約５０～約１２０の範囲の非線形性指数を有する。いくつかの実施形態では、約０．５４ｇの塩化第二鉄および約０．４ｇの塩化第一鉄を含むナノ粒子組成物は、約６７の非線形性指数を有する。
このように、いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子の磁気特性（たとえば、磁気強度）は、磁性ナノ粒子を調製するために使用される塩化第二鉄および塩化第一鉄の濃度を制御することにより微調整され得る。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約８μＭ～約２１７μＭの範囲の鉄濃度を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約８μＭ～約１５μＭ、約１５μＭ～約２５μＭ、約２５μＭ～約５０μＭ、５０μＭ～約６０μＭ、約６０μＭ～約７０μＭ、約７０μＭ～約８０μＭ、８０μＭ～約９０μＭ、約９０μＭ～約１００μＭ、約１００μＭ～約１１０μＭ、１１０μＭ～約１２０μＭ、約１２０μＭ～約１３０μＭ、約１３０μＭ～約１４０μＭ、１４０μＭ～約１５０μＭ、約１５０μＭ～約１６０μＭ、約１６０μＭ～約１７０μＭ、１７０μＭ～約１８０μＭ、約１８０μＭ～約１９０μＭ、約１９０μＭ～約２００μＭ、２００μＭ～約２１０μＭ、約２１０μＭ～約２２０μＭの範囲の鉄濃度を有する。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約１ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの範囲の鉄濃度を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は約１ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬ、または約２０ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの範囲の鉄濃度を有する。
他の物理特性
いくつかの実施形態では、薬物送達に使用されるナノ粒子の重要な特性には、ナノ粒子の生分解性、毒性プロファイル、および薬物動態学／薬力学が含まれる。ナノ粒子の組成および／またはサイズは、その生物学的な運命の重要な決定要素である。たとえば、大きなナノ粒子は通常肝臓により取り込まれ分解されるが、小さいナノ粒子（直径３０ｎｍ未満）は通常長時間循環し（ヒトでは時に２４時間を超える血中半減期）、腫瘍および転移巣などの高透過性の脈管構造を有するリンパ節および臓器の間質に蓄積する。
いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子は約２ナノメートル（ｎｍ）～約２００ｎｍの間（たとえば、約２ｎｍ～約１０ｎｍの間、約１０ｎｍ～約３０ｎｍの間、約５ｎｍ～約２５ｎｍの間、約１０ｎｍ～約２５ｎｍの間、約１５ｎｍ～約２５ｎｍの間、約２０ｎｍ～約２５ｎｍの間、約２５ｎｍ～約５０ｎｍの間、約５０ｎｍ～約２００ｎｍの間、約７０ｎｍ～約２００ｎｍの間、約８０ｎｍ～約２００ｎｍの間、約１００ｎｍ～約２００ｎｍの間、約１４０ｎｍ～約２００ｎｍの間、および約１５０ｎｍ～約２００ｎｍの間）、たとえば、少なくとも約２、５、１０、１５、２０、２５、５０、７０、８０、１００、１２０、１２５、１４０、または１５０ｎｍ、最大で約１０、２０、２５、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、または２５０ｎｍの直径を有することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される磁性ナノ粒子は球形もしくは楕円形であることができ、または不規則な形状を有することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される磁性ナノ粒子は約２ｎｍ～約２００ｎｍの間（たとえば、約１０ｎｍ～約２００ｎｍの間、約２ｎｍ～約３０ｎｍの間、約５ｎｍ～約２５ｎｍの間、約１０ｎｍ～約２５ｎｍの間、約１５ｎｍ～約２５ｎｍの間、約２０ｎｍ～約２５ｎｍの間、約５０ｎｍ～約２００ｎｍの間、約７０ｎｍ～約２００ｎｍの間、約８０ｎｍ～約２００ｎｍの間、約１００ｎｍ～約２００ｎｍの間、約１４０ｎｍ～約２００ｎｍの間、および約１５０ｎｍ～約２００ｎｍの間）の直径（ナノ粒子組成物の外表面上の任意の２点間）を有することができる。いくつかの実施形態では、約２ｎｍ～約３０ｎｍの間の直径を有する磁性ナノ粒子は、対象内の腫瘍、リンパ節、および転移性病変に局在する。いくつかの実施形態では、約４０ｎｍ～約２００ｎｍの間の直径を有する磁性ナノ粒子は、肝臓に局在する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される磁性ナノ粒子は約０．０５～約０．２５の多分散性指数（ＰＤＩ）を有することができる。ＰＤＩは、本質的に所与の試料内のサイズ集団の分布を表すものである。ＰＤＩの数値は０．０（粒子サイズについて完全に均一な試料）～１．０（複数の粒子サイズ集団を持つ高度に多分散な試料）の範囲である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される磁性ナノ粒子は約０．０５０～０．１００、約０．１００～０．１１０、約０．１１０～０．１２０、約０．１２０～０．１３０、約０．１３０～約０．１４０、約０．１４０～約０．１５０、約０．１５０～０．１６０、約０．１６０～０．１７０、約０．１７０～０．１８０、約０．１８０～０．１９０、約０．１９０～０．２００、約０．２２０～０．２１０、約０．２１０～０．２２０、約０．２３０～０．２４０、または約０．２４０～０．２５０のＰＤＩを有することができる。
いくつかの実施形態では、磁性材料または粒子は、磁場に反応する反磁性、常磁性、超常磁性、または強常磁性材料を含有することができる。治療用磁性ナノ粒子の非限定的な例は、磁鉄鉱；フェライト（たとえば、マンガン、コバルト、およびニッケルのフェライト）；Ｆｅ（ＩＩ）酸化物、および赤鉄鉱、ならびにそれらの金属合金の群から選択される金属酸化物を含有する磁性材料のコアを含有する。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、治療用磁性ナノ粒子の位置または局在を対象において撮像することができる（たとえば、磁性ナノ粒子の１つ以上の用量の投与に続いて対象において撮像される）。
ポリマーコーティング
本明細書に記載される磁性ナノ粒子は、コア磁性材料の上（たとえば、磁性材料の表面上）にポリマー（たとえば、デキストラン）コーティングを含有する。ポリマー材料は１つ以上の生物学的物質（たとえば、本明細書に記載される核酸のいずれかなど）を付着または結合させるのに適している場合がある。１つ以上の生物学的薬物（たとえば、核酸）は、化学的結合（たとえば、共有結合）によりポリマーコーティングに付着させることができる。
酸化鉄ナノ粒子の合成方法としては、たとえば、物理的および化学的方法が挙げられる。たとえば、酸化鉄は、たとえば実施例１～８に記載されるように、水溶液中のＦｅ２＋およびＦｅ３＋塩の共沈により調製することができる。結果として生じるコアは、磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）、マグへマイト（γ－Ｆｅ２Ｏ３）、またはその２つの混合物からなる。水溶液中のアニオン性塩の含有量（たとえば、塩化物、硝酸塩、硫酸塩など）、Ｆｅ２＋とＦｅ３＋の比、ｐＨ、およびイオン強度のすべてが、ナノ粒子のサイズを制御する役割を担う。窒素またはアルゴンなどの不活性ガス下の無酸素環境において反応を行うことにより、合成されたナノ粒子の酸化を防ぎその磁気特性を保護することは重要である。酸化鉄ナノ粒子のマイクロ粒子への塊状集積を防ぐために、共沈過程中にコーティング材料を加えることができる。熟練した専門家は、酸化鉄ナノ粒子を安定化させるために任意の数の公知の表面コーティング材料を使用することができることを理解するであろうが、その中でも合成および天然ポリマー、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、脂肪酸、ポリペプチド、キトサン、ゼラチンなどを使用することができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物はＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物はＰＥＧ－２０００を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物はＰＥＧ－１０００、ＰＥＧ－３０００、ＰＥＧ－３３５０、ＰＥＧ－４０００、ＰＥＧ－６０００、ＰＥＧ－８０００、ＰＥＧ－１２，０００、ＰＥＧ－２０，０００、またはそれらの任意の組合せを含む。
いくつかの実施形態では、ポリマーコーティングはデキストランである。いくつかの実施形態では、デキストランコーティングは磁性ナノ粒子に共有結合している。いくつかの実施形態では、デキストランコーティングは約１キロダルトン（ｋＤａ）～約１５ｋＤａの範囲の分子量を有するデキストランを含む。いくつかの実施形態では、デキストランコーティングは約１ｋＤａの分子量を有するデキストランを含む。いくつかの実施形態では、デキストランコーティングは約５ｋＤａの分子量を有するデキストランを含む。いくつかの実施形態では、デキストランコーティングは約１０ｋＤａの分子量を有するデキストランを含む。いくつかの実施形態では、デキストランコーティングは約１５ｋＤａの分子量を有するデキストランを含む。いくつかの実施形態では、デキストランコーティングは、実施例２に記載されるように化学的に架橋されたデキストランを含む。磁性材料のコアをコーティングするために使用することができる代替の適切なポリマーとしては、限定されないが、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエーテルウレタン、ポリスルホン、フッ素化または塩素化ポリマー、たとえば、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、およびポリプロピレン、ポリカーボネート、ならびにポリエステルが挙げられる。磁性材料のコアをコーティングするために使用することができるポリマーの追加の例としては、ポリオレフィン、たとえば、ポリブタジエン、ポリジクロロブタジエン、ポリイソプレン、ポリクロロプレン、ポリビニリデンハライド、ポリビニリデンカーボネート、およびポリフッ素化エチレンが挙げられる。また、スチレン／ブタジエン、アルファ－メチルスチレン／ジメチルシロキサン、または他のポリシロキサンを含む多くのコポリマーも、磁性材料のコアをコーティングするために使用することができる（たとえば、ポリジメチルシロキサン、ポリフェニルメチルシロキサン、およびポリトリフルオロプロピルメチルシロキサン）。磁性材料のコアをコーティングするために使用することができる追加のポリマーとしては、ポリアクリロニトリルまたはアクリロニトリル含有ポリマー、たとえば、ポリアルファ－アクリロニトリルコポリマー、アルキドまたはテルペノイド樹脂、およびポリアルキレンポリスルホネートが挙げられる。
薬物ペイロード
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は薬物ペイロードをさらに含む。いくつかの実施形態では、薬物ペイロードはデキストランコーティングの表面に付着させることができる（たとえば、共有結合を介して）。いくつかの実施形態では、薬物ペイロードは、薬物、抗体、成長因子、核酸、核酸誘導体、核酸断片、タンパク質、タンパク質誘導体、タンパク質断片、ペプチド、小分子、またはそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、薬物ペイロードはポリマーコーティング（たとえば、デキストランコーティング）の１つ以上のアミン基にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、薬物ペイロードは核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は一本鎖または二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸はアンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ、マイクロＲＮＡ模倣物、アプタマー、またはリボザイムである。いくつかの実施形態では、核酸分子は少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド（修飾された塩基または糖を含有するヌクレオチド）を含有することができる。いくつかの実施形態では、核酸分子はリン酸（ホスホジエステル）骨格に少なくとも１つの修飾を含有することができる。これらの修飾の導入により、核酸分子の安定性を高め、またはハイブリダイゼーションもしくは溶解性を向上することができる。
いくつかの実施形態では、薬物ペイロード（たとえば、核酸）は、チオエーテル結合またはジスルフィド結合を含有する化学部位を介して磁性ナノ粒子（たとえば、磁性ナノ粒子のポリマーコーティング）に付着させる。いくつかの実施形態では、核酸は、アミド結合を含有する化学部位を介して磁性ナノ粒子に付着させる。核酸を磁性ナノ粒子に共有結合させるために使用することができる追加の化学部位は、当技術分野で公知である。
薬物ペイロードを磁性ナノ粒子に共有結合させるために、様々な異なる方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、薬物ペイロードの磁性ナノ粒子への付着のためにカルボジイミドが使用される。
医薬組成物
また、本明細書では、本開示のナノ粒子組成物のいずれかと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物も提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は本明細書に記載される磁性ナノ粒子を含む。本明細書に記載される磁性ナノ粒子のいずれかのタイプの２つ以上（たとえば、２つ、３つ、または４つ）が、任意の組合せで医薬組成物中に存在することができる。医薬組成物は、当技術分野で公知の任意の方法で製剤化することができる。
医薬組成物は、その意図する投与経路（たとえば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、または腹腔内）に適合するように製剤化される。組成物は、滅菌希釈剤（たとえば、滅菌水または生理食塩水）、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、もしくは他の合成溶媒、抗菌剤もしくは抗真菌剤、たとえば、ベンジルアルコールもしくはメチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど、抗酸化剤、たとえば、アスコルビン酸もしくは重硫酸ナトリウム、キレート剤、たとえば、エチレンジアミン四酢酸、緩衝剤、たとえば酢酸塩、クエン酸塩、もしくはリン酸塩、および等張剤、たとえば、糖（たとえば、デキストロース）、ポリアルコール（たとえば、マンニトールまたはソルビトール）、もしくは塩（たとえば、塩化ナトリウム）、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。リポソーム懸濁液も薬学的に許容される担体として使用することができる。組成物の調製物は製剤化され、アンプル、使い捨て注射器、または複数回用量バイアルに封入することができる。必要な場合（たとえば、注射可能な製剤の場合のように）、たとえば、レシチンなどのコーティングまたは界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。吸収を遅延させる作用物質（たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含むことにより、ナノ粒子組成物の吸収を延ばすことができる。あるいは、生分解性、生体適合性ポリマー（たとえば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸）を含むことができる植込み錠およびマイクロカプセル化送達システムにより、制御放出を達成することができる。本明細書に記載される磁性ナノ粒子のいずれかを１つ以上含有する組成物は、非経口（たとえば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、または腹腔内）用に、投与量単位形態（すなわち、投与の容易さと投与量の均一性のために所定量の活性化合物を含有する物理的に個別の単位）に製剤化することができる。
組成物の毒性および治療効果は、細胞培養物または実験動物（たとえば、サル）において標準的な薬学的手順により決定することができる。たとえば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効である用量）を決定し、ＬＤ５０：ＥＤ５０の比を治療指数とすることができる。高い治療指数を示す作用物質が好ましい。作用物質が望ましくない副作用を示す場合、潜在的な損傷を最小化する（すなわち、望ましくない副作用を軽減する）ように注意を払うべきである。毒性および治療効果は、他の標準的な薬学的手順により決定することができる。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、対象（たとえば、ヒト）において使用する任意の所与の作用物質の適切な投与量を製剤化する際に使用することができる。１つ以上（たとえば、１つ、２つ、３つ、または４つ）の磁性ナノ粒子（たとえば、本明細書に記載される磁性ナノ粒子のいずれか）の治療的有効量は、がんを有する対象においてがん細胞の浸潤もしくは転移を減少させる、対象において転移性がんを処置する、対象において転移性腫瘍サイズを減少もしくは安定化させる、対象において転移性腫瘍増殖速度を減少させる、対象（たとえば、ヒト）において転移性がんの１つ以上の症状の重症度、頻度、および／もしくは持続時間を減少させる、または対象において転移性がんの症状の数を減少させる（たとえば、同じ疾患を有するが処置を受けていない、もしくは異なる処置を受けている対照の対象、または処置の前の同じ対象と比較して）量である。
本明細書に記載される磁性組成物のいずれかの有効性および投薬は、当技術分野で公知の方法を使用して医療専門者により、ならびに対象（たとえば、ヒト）における転移性がんの１つ以上の症状の観察により決定され得る。特定の因子は、対象を効果的に処置するために必要となる投与量およびタイミングに影響を与える場合がある（たとえば、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の全身の健康および／または年齢、ならびに他の疾患の存在）。
例示的な用量は、対象の体重１キログラムあたり、本明細書に記載されるナノ粒子組成物のいずれかのミリグラムまたはマイクログラムの量を含む。これらの用量は広い範囲をカバーするが、当業者であれば、本明細書に記載されるナノ粒子組成物を含む治療剤は、その効力が様々であり、有効量は当技術分野で公知の方法により決定することができることを理解するであろう。通常、最初は比較的低用量で投与し、その後、適切な反応が得られるまで、担当の医療専門家（治療応用の場合）または研究者（まだ開発段階で取り組んでいる場合）が徐々に用量を増やすことができる。さらに、任意の特定の対象に対する特定の用量レベルは、用いられる特定の化合物、対象の年齢、体重、全身の健康、性別、および食事、投与の時間、投与の経路、排出率、ならびにインビボでのナノ粒子組成物の半減期などの様々な要因に依存することが理解される。
医薬組成物は、投与のための説明書とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含むことができる。
合成方法
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、実施例１～８に詳述されるように、本開示のナノ粒子組成物のいずれかを調製する方法である。いくつかの実施形態では、方法は、デキストランを水に溶解することと、塩化第一鉄溶液、塩化第二鉄溶液、またはそれらの組合せを調製することとを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、塩化第一鉄溶液、塩化第二鉄溶液、またはそれらの組合せをデキストランに加えて、混合物を調製することを含む。
いくつかの実施形態では、上記方法は、混合物を撹拌および氷浴に供しながら、混合物に塩基を加えることを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、約１０ｍＬ～１５ｍＬの塩基を混合物に加えることを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、約２５ｍＬ～３０ｍＬの塩基を混合物に加えることを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、少なくとも約１０ｍＬ～１５ｍＬ、１５ｍＬ～２０ｍＬ、２０ｍＬ～２５ｍＬ、２５ｍＬ～３０ｍＬ、またはそれより多い塩基を混合物に加えることを含む。いくつかの実施形態では、塩基は水酸化アンモニウムである。いくつかの実施形態では、塩基は水酸化ナトリウムである。いくつかの実施形態では、上記方法は、約１０ｍＬの水酸化アンモニウムを混合物に加えることを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、約１５ｍＬの水酸化アンモニウムを混合物に加えることを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、約２５ｍＬの水酸化アンモニウムを混合物に加えることを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、約３０ｍＬの水酸化アンモニウムを混合物に加えることを含む。
いくつかの実施形態では、上記方法は、混合物を撹拌および氷浴に供しながら、水酸化アンモニウムを混合物に加えることを含む。いくつかの実施形態では、デキストランコーティング上のヒドロキシル基の同じ部位にアミン基を導入するために、過剰量のアンモニアまたは水酸化アンモニウムが必要とされる。いくつかの実施形態では、方法は、約６０ｍＬの水酸化アンモニウムを混合物（たとえば、ナノ粒子前駆体組成物）に加えることを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、混合物を約７５℃～約９０℃の温度に供することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、水酸化アンモニウムを加えた後に混合物を約７５℃～約９０℃の温度に供することを含む。いくつかの実施形態では、水酸化アンモニウムを加えるステップは、酸化鉄結晶、酸化鉄水和物、またはそれらの組合せの形成を妨げる。いくつかの実施形態では、水酸化アンモニウムを加えるステップは、デキストランコーティングを１つ以上のアミン基で官能化する。
いくつかの実施形態では、上記方法は、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋することを含む。エピクロロヒドリンは、デキストランポリマー骨格上の２つの水酸基を架橋するために使用することができる化学物質である。いくつかの実施形態では、エピクロロヒドリンによる架橋は、酸化鉄コアの表面上のデキストランコートの化学的安定化を保証する。いくつかの実施形態では、エピクロロヒドリンは重合してデキストランポリマー骨格上のヒドロキシル基鎖を延ばし、その結果、アミン基で置換され得るヒドロキシル基を増加させることが可能である。いくつかの実施形態では、水酸化アンモニウムの混合物への添加は、反応混合物中の、残存する未反応のエピクロロヒドリンを破壊する。
いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子組成物のいずれかは、スケールアップすることが可能である。たとえば、いくつかの実施形態では、上記方法は、約２１ｍＬの第１のナノ粒子組成物の第１の最終体積をもたらすことをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のナノ粒子組成物（たとえば、磁性ナノ粒子の小スケールバッチ）は、第１の物理特性のセットを有することを特徴とする第１の磁性ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、少なくとも約２１ｍＬよりも大きい第２のナノ粒子組成物の第２の最終体積（たとえば、磁性ナノ粒子の大スケールバッチ）をもたらすことをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のナノ粒子組成物の第２の最終体積は、約２０ｍＬ～約３０ｍＬ、約３０ｍＬ～約４０ｍＬ、約４０ｍＬ～約５０ｍＬ、約５０ｍＬ～約６０ｍＬ、約６０ｍＬ～約７０ｍＬ、約７０ｍＬ～約８０ｍＬ、約８０ｍＬ～約９０ｍＬ、約９０ｍＬ～約１００ｍＬ、約１００ｍＬ～約１００ｍＬ、または約１１０ｍＬ～約１２０ｍＬである。
いくつかの実施形態では、第２のナノ粒子組成物は、第２の物理特性のセットを有することを特徴とする第２の磁性ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の物理特性のセットはほぼ同じである。いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子組成物のいずれかは、その物理特性（たとえば、サイズ、ＰＤＩ、またはＮＬＩ）を変化させずにスケールアップすることができる。いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子組成物のいずれかは、その物理特性を変化させずにスケールアップすることができる。いくつかの実施形態では、第１および第２の物理特性は、直径、磁気強度、多分散性指数、表面電荷、非線形性指数値、ＰＤＩ値、またはそれらの任意の組合せを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノ粒子組成物は、少なくとも約１日～約６か月以上の間安定である。本明細書で使用される用語「安定な」または「安定性」は、磁性ナノ粒子または組成物の同じ試料を、それが調製された日から保管後の試料である日まで測定して比較した場合に、物理特性のいずれにも変化がないことを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノ粒子組成物は、少なくとも約１日～約５日間、約５日～約１０日間、約１０日～約１５日間、約１５日～３０日間、約３０日～約４０日間、約４０日～５０日間、約５０日～約６０日間、約３カ月～約４カ月間、約４カ月～約５カ月間、約５カ月～約６カ月間、またはそれより長く安定である。
処置の方法
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、それを必要とする対象における疾患を処置、予防、または撮像する方法である。いくつかの実施形態では、上記方法は、治療有効量の本明細書に開示されるナノ粒子組成物のいずれかを、少なくとも、対象の身体、身体部分、組織、細胞、または体液の一部の標的部位に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子組成物のいずれかは、それを必要とする対象における疾患を処置する方法で使用される。いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子組成物のいずれかは、それを必要とする対象における疾患を撮像する方法（たとえば、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）による）で使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、対象におけるがん細胞浸潤または転移を減少させる（たとえば、顕著な、または観察可能な減少）方法である。いくつかの実施形態では、上記方法は、本明細書に記載される少なくとも１つのナノ粒子組成物を、対象におけるがん細胞浸潤または転移を減少させるのに十分な量で対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、上記方法は、エネルギーを磁性ナノ粒子組成物および標的部位に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、エネルギーは光エネルギーまたは磁気エネルギーである。たとえば、いくつかの実施形態では、エネルギーを投与するステップは、磁場を与えること、または本明細書に記載されるナノ粒子組成物のいずれかを投与された対象を磁気共鳴撮像のために磁場に曝露することを含んでいてよい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、対象の身体、身体部分、組織、細胞、または体液の一部を撮像するために使用される。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、疾患を処置、予防（たとえば、がんの早期での検出を可能にすることによりがん細胞のさらなる転移を予防する）、および／または撮像することができる。いくつかの実施形態では、疾患はがんである。いくつかの実施形態では、疾患は転移性がんである。いくつかの実施形態では、標的部位は腫瘍部位である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は対象の標的部位に蓄積する（たとえば、本開示の磁性ナノ粒子のサイズに起因する）。いくつかの実施形態では、方法は、ナノ粒子組成物を使用して標的部位を撮像することをさらに含む。いくつかの実施形態では、撮像は磁気共鳴撮像を使用して実施される。
いくつかの実施形態では、エネルギーを磁性ナノ粒子組成物および標的部位に投与するステップは、任意のステップである。たとえば、磁性組成物は、治療用組成物としてのみ使用され、治療用組成物および撮像剤（たとえば、造影剤）の両方として使用されない場合がある。いくつかの実施形態では、磁性組成物は、撮像剤（たとえば、造影剤）としてのみ使用され、治療用組成物および撮像剤の両方として使用されない。
投薬、投与、および組成物
本明細書に記載される方法のいずれかでは、ナノ粒子組成物は、医療専門者（たとえば、医師、医師助手、看護師、または実験室もしくは診療所職員）、対象（すなわち、自己投与）により投与することができる。投与は、臨床現場（たとえば、診療所または病院）、介護施設、または薬局で実施することができる。
本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、疾患（たとえば、原発性がんまたは転移性がんなどのがん）を有すると診断された対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象は転移性がんを有すると診断されている。転移性がんの非限定的な例としては、乳がん、膀胱がん、結腸がん、腎臓がん、肺がん、メラノーマ、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、直腸がん、胃がん、甲状腺がん、および子宮がんが挙げられる。いくつかの非限定的な実施形態では、対象は男性もしくは女性、成人、若者、または子供である。対象は、がんまたは転移性がん（たとえば、リンパ節における転移性がん）の１つ以上の症状を経験したことがあり得る。対象はまた、重度または進行期のがん（たとえば、原発性または転移性がん）を有すると診断され得る。いくつかの実施形態では、対象は少なくとも１つのリンパ節に存在する転移性腫瘍を有すると特定されている場合がある。いくつかの実施形態では、対象はすでにリンパ切除および／または乳房切除を受けている場合がある。
本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、本明細書に記載されるナノ粒子組成物または医薬組成物のいずれかの少なくとも１つ（たとえば、１つ、２つ、３つ、または４つ）を含有する組成物の少なくとも１つ（たとえば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、または３０）の用量を投与される。本明細書に記載される方法のいずれかでは、少なくとも１つのナノ粒子組成物または医薬組成物（たとえば、本明細書に記載されるナノ粒子組成物または医薬組成物のいずれか）は、対象に、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも磁性粒子または医薬組成物は、対象のリンパ節に直接投与（注射）される。
いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１つのナノ粒子組成物または医薬組成物（たとえば、本明細書に記載されるナノ粒子組成物または医薬組成物のいずれか）および少なくとも１つの追加の治療剤を投与される。少なくとも１つの追加の治療剤は化学療法剤（たとえば、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、タフルポシド（tafluposide）、アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メルカプトプリン、メトトレキセート（methotrexate）、チオグアニン、ブレオマイシン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ（carfilzomib）、サリノスポラミドＡ、ａｌｌ－ｔｒａｎｓレチノイン酸、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）および／または鎮痛剤（たとえば、アセトアミノフェン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラック、メクロフェナメート（meclofenamate）、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、セレコキシブ、ブプレノルフィン、ブトルファノール、コデイン、ヒドロコドン、ヒドロモルホン、レボルファノール、メペリジン、メタドン、モルヒネ、ナルブフィン、オキシコドン、オキシモルホン、ペンタゾシン、プロポキシフェン、およびトラマドール）であり得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤および少なくとも１つの磁性ナノ粒子（たとえば、本明細書に記載されるナノ粒子組成物のいずれか）は、同じ組成物（たとえば、同じ医薬組成物）で投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤および少なくとも１つの磁性ナノ粒子は異なる投与経路を使用して対象に投与される（たとえば、経口投与により送達される少なくとも１つの追加の治療剤および静脈内投与により送達される少なくとも１つの磁性ナノ粒子）。
本明細書に記載される方法のいずれかでは、少なくとも１つのナノ粒子組成物または医薬組成物（たとえば、本明細書に記載されるナノ粒子組成物または医薬組成物のいずれか）、および任意に少なくとも１つの追加の治療剤は、少なくとも１週間に１回（たとえば、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、１週間に４回、１日１回、１日２回、または１日３回）対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なるナノ粒子組成物は同じ組成物（たとえば、液体組成物）で投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのナノ粒子組成物および少なくとも１つの追加の治療剤は同じ組成物（たとえば、液体組成物）で投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのナノ粒子組成物および少なくとも１つの追加の治療剤は２つの異なる組成物（たとえば、少なくとも１つのナノ粒子組成物を含有する液体組成物および少なくとも１つの追加の治療剤を含有する固体経口組成物）で投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、丸薬、錠剤、またはカプセル剤として投与される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は徐放性経口製剤で投与される。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤は、少なくとも１つのナノ粒子組成物または医薬組成物（たとえば、本明細書に記載されるナノ粒子組成物または医薬組成物のいずれか）を投与する前に対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤は、少なくとも１つのナノ粒子組成物または医薬組成物（たとえば、本明細書に記載される磁性粒子または医薬組成物のいずれか）を投与した後に対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤および少なくとも１つのナノ粒子組成物または医薬組成物（たとえば、本明細書に記載されるナノ粒子組成物または医薬組成物のいずれか）は、対象において１つ以上の追加の治療剤と少なくとも１つのナノ粒子組成物（たとえば、本明細書に記載されるナノ粒子組成物のいずれか）の生物活性期間に重複が存在するように、対象に投与される。
いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１つのナノ粒子組成物または医薬組成物（たとえば、本明細書に記載されるナノ粒子組成物または医薬組成物のいずれか）を長期間（たとえば、少なくとも１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、１年、２年、３年、４年、５年または１０年）にわたって投与されることが可能である。熟練した医療専門家は、処置の有効性を診断または追跡するための本明細書に記載される方法のいずれかを使用して（たとえば、上記の方法および当技術分野で公知の方法を使用して）、処置期間の長さを決定することができる。本明細書に記載されるように、熟練した医療専門家は、対象に投与されるナノ粒子組成物（および／または１つ以上の追加の治療剤）の同一性および数を変更する（たとえば、増やすまたは減らす）こともでき、処置の有効性の評価に基づいて少なくとも１つのナノ粒子組成物（および／または１つ以上の追加の治療剤）の対象への投与の投与量または頻度を調節する（たとえば、増やすまたは減らす）こともできる（たとえば、本明細書に記載される方法および当技術分野で公知の方法のいずれかを使用して）。熟練した医療専門家は、処置を中止する時期（たとえば、対象の症状が著しく減少したとき）をさらに決定することができる。
本開示の特定の実施形態は、以下の実施例でさらに説明されるが、これは、特許請求の範囲に記載されるいかなる実施形態の範囲も限定するものではない。
[実施例１]
－モジュール式アミノペイロードを有する磁性ナノ粒子（ＭＮ）の合成
磁性ナノ粒子（ＭＮ）の合成は、氷とともにガラス板を含む、丸底フラスコを含有するセットアップ例を使用して行った。丸底フラスコには、以下にさらに記載される反応成分を入れた。丸底フラスコをホットプレート／撹拌プレートの上に置いた。
ＭＮの配合は、デキストラン（９ｇ／３０ｍＬのＤ．Ｉ．水）、０．６５ｇの塩化第二鉄、０．４ｇの塩化第一鉄、および１５ｍＬのＮＨ４ＯＨ（２８％）を含むものとした。
まず、９グラムのデキストランＴ１０を脱イオン水（Ｄ．Ｉ．水）に溶解させて、コニカルチューブ内に３０ｍＬ（３０％ｗ／ｖ）とした。デキストランＴ１０（技術的品質）は、平均分子量１０ｋＤａの高純度デキストラン画分である。デキストランの溶液は、室温で３日以内に沈殿を形成するため、新しい溶液を調製した。
次に、デキストランを脱イオン（Ｄ．Ｉ．）水中に、回転機で室温で１時間かけて溶解させた。得られた溶液は無色であったが、気泡でわずかに濁って見える場合がある。デキストランを完全に溶解させるために、適度な熱を加えることができる。デキストラン溶解のセットアップの一例を図１に示す。
デキストラン溶液を０．２マイクロメートル（μｍ）／０．４５μｍのフィルターを使用してろ過し、磁気撹拌子を入れた２５０ｍＬの丸底フラスコに入れた。チューブ内に残ったデキストランは、必要に応じて蒸留水と合わせることができる。２つ口丸底フラスコ（Ｒｂｆ）内の溶解溶液を、穏やかに磁気撹拌し、窒素（またはアルゴン）バブリング（エアパージングではない）で溶存酸素を除去しながら、氷浴中で３０分間冷やした。
次に、塩化第二鉄の原液を調製した。「条件１」に使用した塩化第二鉄の量は、０．６５ｇの塩化第二鉄六水和物（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）であり、１．２ｇの塩化第二鉄六水和物（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）を「条件２」に使用した。表１に示すように、塩を約５ｍＬのＤＩ水に溶解させた。原液は褐色を呈し、０．２２μｍフィルターユニットを使用してろ過し、冷暗所に保管した。鉄塩組成物中の他の元素を引くことにより、鉄の量を算出した。塩化第一鉄四水和物の瓶は、空気による酸化を最小限に抑えるため、デシケーターに保管した。粉末の塩化第一鉄は緑色であるべきで、瓶内での褐色の結晶の生成は鉄の酸化（すなわち、Ｆｅ（ＩＩ）からＦｅ（ＩＩＩ）への変換）を示しており、これは高品質の超常磁性ナノ粒子を得るためには避けるべきである。
次に、塩化第一鉄溶液（ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）を調製した。０．４ｇｒの塩化第一鉄（条件１）を新しく秤量し、エッペンドルフチューブ内で１ｍＬのＤ．Ｉ．水に溶解させ、真珠光沢のある明青緑色の溶液を得た。条件２の配合では、０．０ｇｒの塩化第一鉄を使用した。塩化第一鉄の溶解のために、Ｄ．Ｉ．水を窒素で１０分間（ｍｉｎ）パージして、水中の溶存酸素ガスを除去した。溶解後にろ過は不要であるが、完全な溶解が達成されたことを確認するために、１５分間（０．４ｇの塩化第一鉄、すなわち条件１の場合）、溶解のステップを行った。鉄塩組成物中の他の元素を無視することにより、鉄の量を算出した。
０．６５ｇの塩化第二鉄が含まれる塩化第二鉄の原液１ｍＬ（条件１）、および１．２ｇの塩化第二鉄が含まれる塩化第二鉄の原液２～５ｍＬ（条件２）を、冷えたデキストラン溶液に加えた。フラスコ内を一定に窒素（またはアルゴン）バブリングしながら、混合物を１時間撹拌した。３０分後、表１に示すように、１ｍＬの塩化第一鉄溶液（０．４ｇのＦｅＣｌ２（条件１）または（０．０ｇのＦｅＣｌ２（条件２）をフラスコに加えた。Ｒｂｆの口はすべてゴム栓で密栓して、空気接触を最小限にすることにより酸化を防いだが、１つの口にはゴム栓の上に針（１８Ｇ）によるガス排出口を設けた。
Figure 2023504525000002
次に、不活性ガスによるパージングを停止した。水酸化アンモニウムを空気接触させずに加えるためのカニューレチューブを接続した。このステップでは、粘性の変化を克服するために撹拌速度を最大に設定した。反応混合物は初めは非常に粘性が高くなり、アーミーグリーン色に変化した。水酸化アンモニウムのゆっくりとした滴定を行った。水酸化アンモニウムをゆっくり加えた場合、粘性が増加して、第二鉄／第一鉄混合物への水酸化アンモニウムの均一混合が阻害され、大きな粒子が生じる。
氷浴中で３０分間激しく撹拌を続けた。反応混合物下の氷浴を維持し、全工程中、撹拌を維持した。６０分後、一方の口を水冷式コンデンサーに接続し、他方の口を不活性ガスに接続して高温でパージした（反応混合物中にではない）。高温で突沸が発生しないように注意した。反応Ｒｂｆを９０℃に予熱された油浴に移した。撹拌を油浴中で９０分間続けた。温度計を反応混合物中に保持して温度を測定し、温度は少なくとも約７５～８５℃に維持した。このステップの後、ガスの流れを止め、溶液をゆっくりと室温まで冷やした。これらの一連の反応の最後に、デキストランでコートされた磁性ナノ粒子の形成が達成された。最終的な溶液の体積は約４０ｍＬであった。
得られた溶液をＡｍｉｃｏｎチューブ（５０Ｋ遠心式フィルターユニット）で精製して、未反応のデキストラン、鉄塩、および水酸化アンモニウムを除去した。ナノ粒子懸濁液は、まず遠心分離（約１，５００×ｇ（ＲＣＦ）３～４ｋＲＰＭ、３０～４５分間）で濃縮し、フィルター上の高濃度のナノ粒子懸濁液、およびフィルターユニット下のナノ粒子を含まない溶出液を得た。フィルター下の溶出液を捨て、ナノ粒子ペレットをＤ．Ｉ．水に再懸濁し、同じフィルターユニットを使用して再遠心分離した。このステップを、溶出液がＤ．Ｉ．水のｐＨまたは中性のｐＨを示すまで繰り返した。最初は、溶液の粘性、粒子の不純物のサイズが大きいこと、および混合物中の未反応の遊離デキストランの量が多いことから、遠心分離に約１時間を要した。しかし、最初の３～４回の遠心分離ステップの後、遊離デキストランのほとんどが除去され、ナノ粒子の再懸濁および濃縮は比較的短い遠心分離ステップ（１回の遠心分離ステップにつき約１５分）で行われた。洗浄ステップは７回繰り返した。得られた磁性ナノ粒子の精製溶液は、蒸留水に再懸濁した。最終体積を２１ｍＬに調節し、溶液を冷蔵庫（たとえば、約４℃）で一晩休ませた。
[実施例２]
－架橋およびアミノ化
水酸化ナトリウム、エピクロロヒドリン、および水酸化アンモニウムを使用した一連の反応ステップで、ナノ粒子を架橋およびアミノ化した。２１ｍＬのＭＮを３５ｍＬの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、１４ｍＬのエピクロロヒドリン＋６０ｍＬの水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）と混合した。実験は換気フード内で実施し、合成に使用する化学物質への曝露を最小限に抑えるため、安全対策をとった。３５ｍＬのＮａＯＨ（５Ｍ）を４℃で保管した。ペレット（ＡＣＲＯＳ １３４０７００１０、１ｋｇ、ＣＡＳ １３１０－７３２）から５ＭのＮａＯＨ溶液を調製するために、２００ｇを秤量し、ガラス瓶に加えた。１Ｌの水（ｍｉｌｌｌｉｐｏｒｅ）を瓶に加え、瓶にキャップをし、混合物を振り混ぜた。
氷浴中の２５０ｍＬの丸底フラスコ内の冷えた２１ｍＬのナノ粒子懸濁液に、冷えた３５ｍＬのＮａＯＨ（５Ｍ）を加えた。反応混合物を氷浴中でガスの流れなしで１５分間撹拌した。激しく撹拌しながら、反応混合物に１４ｍＬのエピクロロヒドリンを加えた。エピクロロヒドリンの添加後、得られた溶液は２つの液相を形成した。混合後、温度を室温に維持した。室温で激しく撹拌しながら、架橋反応を８時間続けた。架橋反応は発熱性であり、温度をモニターし、３５℃を超えないように制御した。
エピクロロヒドリンは、デキストランポリマー骨格上の２つのヒドロキシル基を架橋するために使用した。エピクロロヒドリンによる架橋により、ＭＮの酸化鉄コア表面上のデキストランコーティングの化学的安定化を確実にした。エピクロロヒドリンは、鎖を延ばすために重合することが可能であり、その結果、後にアミンで置換されるヒドロキシル基を増加させることが可能である。
それから、得られた均一溶液を水酸化アンモニウムと反応させて、最終的なナノ粒子組成物をアミノ化した。条件１および条件２の両方について、６０ｍＬの水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ、２８％）を反応混合物に加えた。反応混合物を室温で４８時間撹拌した。丸底フラスコの口には、アンモニアが蒸発するのを防ぐために、ゴム栓で蓋をした。これは、高いアミノ化収率を得るために重要である。反応終了後、溶液（約１５０ｍＬ）を透析バッグ（ＭＷＣＯ １２～１４ｋＤａ）に移し、ビーカー内で４～６Ｌの蒸留水に対して、換気フード内で絶えず撹拌しながら透析した。２日間かけて数回透析を繰り返して、未反応の水酸化アンモニウムおよび副生成物をすべて除去した（６～７回）。これを、透析バッグからのアンモニア臭が消え、ｐＨが中性になるまで続けた。この後、それをさらに３～４回繰り返した。透析セットアップの一例を図２に示す。
得られた褐色がかった黒色のナノ粒子組成物懸濁液を、Ａｍｉｃｏｎ遠心分離ユニット（ＭＷＣＯ ３０ｋＤａ、２．８ｋｒｐｍ、１５分）を使用して２０ｍＬに濃縮した。濃縮したナノ粒子を、１００ｍＭのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁した。溶液をＡｍｉｃｏｎ遠心分離ユニット（ＭＷＣＯ ３０ｋＤａ、２．８ｋ毎分回転（ＲＰＭ）、１５分）を使用してＰＢＳ緩衝液でもう１回洗浄した。体積をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を使用して１５ｍＬに調節した。ナノ粒子溶液を１４５００ｒｐｍで遠心分離した。その後、０．１μｍのフィルターユニットで大きな粒子をろ別した。溶液中の鉄の量を決定するために、鉄アッセイを実施した。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）を使用して、１２ｍｇ Ｆｅ／ｍＬとなるように体積を調節した。ナノ粒子のサイズ（直径約２２±３ｎｍ）を、Ｎａｎｏｓｉｚｅｒを使用する動的光散乱により決定した。
[実施例３]
－ＭＮの鉄濃度の評価
鉄含有量を、以下に記載されるように鉄アッセイの実施により決定し、ナノ粒子濃度の算出に利用した。鉄の量を、８つの標準鉄溶液および４つの試料を使用し、以下に記載される鉄アッセイを使用して決定した。１０μＬの鉄標準品およびナノ粒子溶液を９８０μＬの６ＮのＨＣｌに加えた。１０μＬの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、Ｈ２Ｏ中３０％）を各混合物に加えた。鉄標準品の代わりに１０μＬの蒸留水を９８０μＬの６ＮのＨＣｌおよび１０μＬのＨ２Ｏ２に加えることにより、ブランク試料を調製した。この工程の間に、酸化鉄コアは消化された。４１０ｎｍの光学密度（ＯＤ）値を、ＵＶ－ｖｉｓ分光法で決定した。標準品を使用して検量線を得た。ナノ粒子溶液中の鉄分の濃度を、得られた検量線を使用して決定した。ＵＶ－Ｖｉｓ曲線の一例を図３に示す。事前の実験では、濃度は８．７μＭ（すなわち１ｍｇ／ｍＬ）の鉄～２１６．９μＭ（すなわち２５ｍｇ／ｍＬ）の鉄の間であることが判明した。
ＳＰＤＰ定量化
７２５μｌの水を２５μｌのコンジュゲートされたナノ粒子に加えた。同じ希釈度の２本のチューブを用意した（すなわち、ＴＣＥＰ消化の有または無）。２５μｌの３％ＴＣＥＰを加えた。溶液を室温で約１０分間インキュベートした。次に、溶液を小型のアミコンフィルター（エッペンドルフ式；１００ｋカットオフ）でろ過した。それから、溶液を７０００ＲＰＭで約２～５分間回転させた。ろ液の吸光度を３４３ｎｍで測定した。ＴＣＥＰを有するろ液の３４３ｎｍで測定した吸光度データは約０．３３であり、ＴＣＥＰ処理なしのろ液ではピークは見られなかった。ナノ粒子あたりのＳＰＤＰの総数を以下のように算出した。ＳＰＤＰの総数：０．３３×１０ ６×３０（倍希釈）／８１００（吸光係数）＝１２００。ナノ粒子濃度が２０μＭ（２．２ｍｇ／ｍＬ）であったため、１２００ＳＰＤＰを１０μＭで割ることによりナノ粒子あたりのＳＰＤＰ数を算出すると、６０ＳＰＤＰ／μＭ ＮＰとなった。
[実施例４]
－ナノ粒子サイズおよびアミン基含有量の評価
ナノ粒子サイズを動的光散乱を使用して決定した。事前の実験では、半径が約２０～３５ｎｍと大きいナノ粒子、ならびに図４および５に示すように約１１．５～１５．６ｎｍと小さいナノ粒子が合成された。
アミン含有量は、ナノ粒子にコンジュゲートされたＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）の数で定量化した。ＳＰＤＰは、アミノ基およびスルフヒドリル基に反応するヘテロ二官能性リンカーである。ＳＰＤＰ－官能化ナノ粒子を還元試薬（３％ＴＣＥＰ）により切断して、検出可能な副産物であるピリジン－２－チオン（Ｐ２Ｔ）を放出させた。Ｐ２Ｔの定量化は３４３ｎｍの最大吸光度ピークをモニターすることで達成した（３４３ｎｍの吸光係数８．０８×１０３／ｃｍ／Ｍ）。Ｐ２Ｔの数は、溶液中の反応性アミン基の数を示す。したがって、ナノ粒子あたりのアミン基の数は、ナノ粒子の濃度に対するＰ２Ｔの濃度の比により算出した。
簡潔に述べると、ナノ粒子懸濁液のアリコート（１００μＬ）を８００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で希釈した。ＳＰＤＰの瓶は、瓶内に水分が蓄積するのを避けるため、開ける前に冷凍庫から取り出し、室温に平衡させた。これは、ＳＰＤＰのＮＨＳエステルの加水分解を防ぐために重要であった。１００ｍＭのＳＰＤＰ原液を無水ＤＭＳＯで調製した。ＳＰＤＰは水溶性が限られているため、ＳＰＤＰの結晶化を防ぐために、ナノ粒子溶液をＳＰＤＰ溶液（ＤＭＳＯ中）にゆっくりと滴定した。１００μＬのナノ粒子を８００μＬのＰＢＳ緩衝液で希釈し、１００μＬの１００ｍＭのＳＰＤＰ溶液を加えた。混合物を低温室内の回転機上でインキュベートした（約１６～２０時間）。
ナノ粒子を、ＰＢＳ緩衝液を溶出液として使用して、使い捨てのＳｅｐｈａｄｅｘ ＰＤ－１０カラムを使用して精製した。１０００μＬの溶出液を回収した。４５０μＬの精製したＳＰＤＰ－官能化ナノ粒子（ＰＤ－１０カラム後の約１０００μＬのうち）を５０μＬの３％ＴＣＥＰと混合し、混合物を室温で２０分間休ませた。ＴＣＥＰはＳＰＤＰを還元してピリジン－２－チオンを放出し、これは吸光度分光法により検出可能である。ナノ粒子上のＳＰＤＰの活性を維持するために、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）もしくはＴＣＥＰ残基などのジスルフィド還元剤、または他の混入物が混合物に含まれることを避けた。
反応混合物をＡｍｉｃｏｎろ過ユニット（０．５ｍＬ、ＭＷＣＯ １００ｋＤａ）に移し、微量遠心機で約１０，０００×ｇ（ＲＣＦ）を使用して１０分間遠心分離した。Ｐ２Ｔを含有する溶出液を回収し、ＵＶ－ｖｉｓ分光法によるアミン定量化に使用した。フィルターユニット上に保持されたナノ粒子ペレットは捨てた。精製したＳＰＤＰ－官能化ナノ粒子溶液中の鉄の量を、８つの標準鉄溶液および４つの試料を使用し、以下に記載される鉄アッセイを使用して決定した。
簡潔に述べると、１０μＬの鉄標準品およびナノ粒子溶液を９８０μＬの６ＮのＨＣｌに加えた。１０μＬの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、Ｈ２Ｏ中３０％）を各混合物に加えた。鉄標準品の代わりに１０μＬの蒸留水を９８０μＬの６ＮのＨＣｌおよび１０μＬのＨ２Ｏ２に加えることにより、ブランク試料を調製した。この工程の間に、酸化鉄コアは消化された。４１０ｎｍの光学密度（ＯＤ）値を、ＵＶ－ｖｉｓ分光法で決定した。標準品を使用して検量線を得た。ナノ粒子溶液中の鉄分の濃度を、得られた検量線を使用して決定した。
ナノ粒子濃度は、各ナノ粒子がナノ粒子あたり平均２０６４個の鉄原子を有すると仮定することにより、ナノ粒子懸濁液中の鉄濃度を測定した後に決定した。概ね、濃度は、１００μＭナノ粒子溶液と同等の約１２ｍｇ／ｍＬであると決定された。
反応で使用するＦｅＣｌ３およびＦｅＣｌ２の量を変えることにより、ナノ粒子あたりのアミノ基の数を調節することができるという、予想外の驚くべき結果が得られた。ＦｅＣｌ３およびＦｅＣｌ２の両方を含む条件１では、ナノ粒子あたり６０～９０個のアミノ基が得られた。条件２では、ナノ粒子あたり約２４６～５００個のアミノ基が組み込まれ、異常に多数の結果となった。４１０ｎｍのＰ２Ｔ吸光度を表すＵＶ－Ｖｉｓスペクトルの一例を図６および７に示す。
アミン基定量化
１００μＬのＭＮを１００μＬのＰＢＳとエッペンドルフチューブ内で混合し、４℃にした。ＳＰＤＰのＤＭＳＯ中２０ｍＭ溶液（１００μｌ中に１ｍｇ）を調製した。冷えたナノ粒子溶液をＳＰＤＰ溶液に滴下した（反応は発熱性であった）。溶液を室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。それから、溶液をＰＤ－１０カラムに通して精製し、重力を利用してＰＢＳで平衡化した。約２ｍＬを回収した。２つの３５０μｌのアリコート（「試料」および「対照」）を２つのＡｍｉｃｏｎフィルター（ｍｉｃｒｏｃｏｎ）に入れた。３０μｌのＴＣＥＰ（３５ｍＭ）を試料に加え、試料を１０分間そのままにした。試料および対照の両方をＲＴで６０００ＲＰＭで２０分間スピンダウンした。３０μｌのＴＣＥＰ（３５ｍＭ）を対照溶出液に加えた。試料および対照の両方をＰＢＳ中に１：４．８６の比で希釈した。試料および対照の光学密度（ＯＤ）を３４３ｎｍで読み取った。アミン基の数を、以下に示す計算式を使用して算出した。キュベット内で、試料を２０＊１．０８５７＊４．８６）＝１０５．５３倍に希釈した。キュベット内の鉄の濃度＝鉄原液の濃度／１０５．５３。キュベット内の［結晶］＝キュベット内の［Ｆｅ］／０．１１６（定数）＝［結晶］μＭ。キュベット内の［ピリジン－２－チオン］＝デルタＯＤ／０．００８１（吸光係数）＝［ピリジン－２－チオン］μＭ ＮＨ２／結晶＝キュベット内の［結晶］／キュベット内の［ピリジン－２－チオン］。
[実施例５]
－オリゴヌクレオチドのＭＮへのコンジュゲーション
ＭＮを、本明細書に記載されるように、チオール化オリゴヌクレオチドで官能化した。１０ｍｇのＦｅ（約１ｍＬに相当）をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に混合することによりナノ粒子原液を調製した。さらなるコンジュゲーションステップでナノ粒子にチオール反応性末端を与えるために、ナノ粒子を後でＳＰＤＰにコンジュゲートさせた。上記のように、ＳＰＤＰの瓶は、瓶内に水分が蓄積するのを避けるため、瓶を開ける前に冷凍庫から取り出し、室温に平衡させた（約３０分間）。１０ｍｇのＳＰＤＰを５００μＬの無水ＤＭＳＯに溶解させ、冷えた１３ｍＬのファルコンチューブに移し、直ちに使用した。ナノ粒子溶液を、ボルテックスおよびピペッティングにより、ＳＰＤＰ溶液にゆっくりと滴定した。ＳＰＤＰはすぐに加水分解してしまうため、毎回新しいＳＰＤＰ溶液を調製しなければならなかった。
暗所で一晩インキュベートした後、ナノ粒子をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して使い捨てのＰＤ－１０カラムを使用して精製して、遊離した未反応のＳＰＤＰ分子を除去する。カラム内のナノ粒子バンドの最後の部分を捨てて、遊離のＳＰＤＰをナノ粒子から完全に分離させる。最終的なナノ粒子溶液の濃度は、鉄アッセイを使用して算出した。それから、チオール反応性末端を有するナノ粒子をチオール修飾オリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせた。チオール修飾オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ不含水に溶解して、最終濃度を１ｍＭにした。それから、オリゴヌクレオチドコンストラクトの保護ジスルフィド結合を切断することによりチオール基を活性化させるために、オリゴヌクレオチドを３％トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で処理した。３％ＴＣＥＰは、毎回使用する前に新しく調製した。１００μＬのＴＣＥＰ溶液を１０００μＬのオリゴヌクレオチド原液（１ｍＭ）に加え、１０分間インキュベートした。その後、酢酸アンモニウム／エタノール沈殿法を使用してオリゴヌクレオチドを精製した。
簡潔に述べると、５００μＬの９．５Ｍ酢酸アンモニウムをオリゴヌクレオチド混合物に加えた。その後、２３００μＬの冷えたエタノール（２００プルーフ（proof）、分子生物学グレード）を混合物に加えた。白く濁ったオリゴヌクレオチドの沈殿がチューブ内に観察された。それから、溶液を－８０℃で１時間放置した。その後、オリゴヌクレオチド混合物を４℃で１５分間、２０，０００×ｇ（ＲＣＦ）で遠心分離した。遠心分離終了後、チューブの底に白色のオリゴヌクレオチドペレットが形成された。上清を捨て、ペレットを１００％エタノールおよび水中７０％エタノールで数回洗浄した。その後、ペレットをスピード真空濃縮装置で乾燥させ、ヌクレアーゼ不含水に再懸濁して最終濃度を１ｍＭにした。ナノ粒子を活性化オリゴヌクレオチドと１対１３（最大１：４０）のモル比で、低温室内の回転機上で少なくとも１日混合した。ナノ粒子溶液を０．２２μｍのシリンジフィルターでろ過して、大きな混入物を除去した。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの研究では、１００μＬのナノ粒子をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＧ－５０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ使い捨てクイックスピンカラムを使用して精製した。
得られた治療用酸化鉄ナノプローブの濃度、サイズ、およびオリゴヌクレオチド負荷を、鉄アッセイ、動的光散乱、およびゲル電気泳動を使用して評価した。小動物を用いたｉｎ ｖｉｖｏの研究では、必要であれば、ナノ粒子を０．５ｍＬ Ａｍｉｃｏｎろ過ユニット（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ遠心式フィルター）を使用して、遠心分離により濃縮した。オリゴヌクレオチド負荷を解析するためのゲル電気泳動の一例を図８に示す。オリゴとアミノ基／ナノ粒子の比を変えることにより、オリゴ／ナノ粒子の数を漸次増加させ微調整することができる。
ポリアクリルアミドゲルにおけるオリゴ負荷の解析
適切な量（たとえば、１０μＬ）のＴＣＥＰ消化ＭＮを、エッペンドルフチューブに加えた。対照として遊離オリゴを使用して、ゲル中のバンドの位置を特定し、定量した。２μｌの核酸ローディングバッファー（５×）を加え、混合した。各試料を７０℃で３分間加熱した。各試料をＲＴまで冷やし、素早くスピンダウンした。全液体を１５％ＴＢＥ－尿素（ポリアクリルアミド）ゲルまたは４～２０％ＰＡＧＥに注意深くロードした。１×ＴＢＥバッファーを使用して、１３０ボルトで約３０～４０分間ゲルを泳動させた。ゲルをプラスチックカセットから慎重に取り出した。ゲルを臭化エチジウム（１μｇ／ｍＬ；５μｌの原液を５０ｍＬの水に加えたもの）で２０分間染色した。臭化エチジウム溶液は、後で適切に処理するためにデカントして保存し、ゲルは水で２回、１回につき約５分間洗浄した。次に、ゲルをＵＶ光で可視化した。
[実施例６]
－制御可能な磁気特性を有する磁性ナノ粒子（ＭＮ）の合成
磁性ナノ粒子（ＭＮ）の合成は、氷とともにガラス板を含む、丸底フラスコを含有するセットアップ例を使用して行った。丸底フラスコには、以下にさらに記載される反応成分を入れた。丸底フラスコをホットプレート／撹拌プレートの上に置いた。
ＭＮの配合は、デキストラン（９ｇ／３０ｍＬのＤ．Ｉ．水）、０．５４ｇの塩化第二鉄、０．２４ｇの塩化第一鉄、および１ｍＬのＮＨ４ＯＨ（２８％）を含むものとした。この配合により、磁気特性の非線形性指数が最小となった。
まず、９グラムのデキストランＴ１０を脱イオン水（Ｄ．Ｉ．水）に溶解して、コニカルチューブ内に３０ｍＬ（３０％ｗ／ｖ）とした。デキストランＴ１０（技術的品質）は、平均分子量１０ｋＤａの高純度デキストラン画分である。デキストランの溶液は、室温で３日以内に沈殿を形成するため、新しい溶液を調製した。
次に、デキストランを脱イオン（Ｄ．Ｉ．）水中に、回転機で室温で１時間かけて溶解させた。得られた溶液は無色であったが、気泡でわずかに濁って見える場合がある。デキストランを完全に溶解させるために、適度な熱を加えることができる。デキストラン溶解のセットアップの一例を図１に示す。
デキストラン溶液を０．２マイクロメートル（μｍ）／０．４５μｍのフィルターを使用してろ過し、磁気撹拌子を入れた２５０ｍＬの丸底フラスコに入れた。チューブ内に残ったデキストランは、必要に応じて蒸留水と合わせることができる。２つ口丸底フラスコ（Ｒｂｆ）内の溶解溶液を、穏やかに磁気撹拌し、窒素（またはアルゴン）バブリング（エアパージングではない）で溶存酸素を除去しながら、氷浴中で３０分間冷やした。
次に、塩化第二鉄の原液を調製した。塩化第二鉄および塩化第一鉄の量は、「条件１」について０．５４ｇの塩化第二鉄六水和物（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）および０．２ｇの塩化第一鉄四水和物（ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）、ならびに「条件２」について０．５４ｇの塩化第二鉄六水和物（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）および０．４ｇの塩化第一鉄四水和物（ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）であった。表２に示すように、塩を約５ｍＬのＤＩ水に溶解させた。原液は褐色を呈し、０．２２μｍフィルターユニットを使用してろ過し、冷暗所に保管した。鉄塩組成物中の他の元素を引くことにより、鉄の量を算出した。塩化第一鉄四水和物の瓶は、空気による酸化を最小限に抑えるため、デシケーターに保管した。粉末の塩化第一鉄は緑色であるべきで、瓶内での褐色の結晶の生成は鉄の酸化（すなわち、Ｆｅ（ＩＩ）からＦｅ（ＩＩＩ）への変換）を示しており、これは高品質の超常磁性ナノ粒子を得るためには避けるべきである。
次に、塩化第一鉄溶液（ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）を調製した。０．２ｇの塩化第一鉄（条件１）を新しく秤量し、エッペンドルフチューブ内で１ｍＬのＤ．Ｉ．水に溶解させ、真珠光沢のある明青緑色の溶液を得た。条件２の配合では、０．４ｇｒの塩化第一鉄を使用した。塩化第一鉄の溶解のために、Ｄ．Ｉ．水を窒素で１０分間（ｍｉｎ）パージして、非磁性の酸化された鉄（さび）を生じさせる可能性のある水中の溶存酸素ガスを除去した。溶解後にろ過は不要であるが、完全な溶解が達成されたことを確認するために、１５分間（０．４ｇの塩化第一鉄、すなわち条件１の場合）、溶解のステップを行った。鉄塩組成物中の他の元素を無視することにより、鉄の量を算出した。
０．５４５ｇの塩化第二鉄が含まれる塩化第二鉄の原液１ｍＬ（条件１および条件２）を、冷えたデキストラン溶液に加えた。表２に示すように、１ｍＬの塩化第一鉄溶液（０．２ｇのＦｅＣｌ２（条件１）または（０．４ｇのＦｅＣｌ２（条件２））をフラスコに加えた。フラスコ内を一定に窒素（またはアルゴン）バブリングしながら、混合物を１時間撹拌した。Ｒｂｆの口はすべてゴム栓で密栓し、空気接触を最小限にすることにより酸化を防いだが、１つの口にはゴム栓の上に針（１８Ｇ）によるガス排出口を設けた。
Figure 2023504525000003
１．次に、不活性ガスによるパージングを停止した。水酸化アンモニウムを空気接触させずに加えるためのカニューレチューブを接続した。１ｍＬの濃縮された冷えた（約４℃）水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ，２８％）を氷浴中で反応混合物に素早く加えた。このステップでは、粘性の変化を克服するために撹拌速度を最大に設定した。水酸化アンモニウムをゆっくり加えた場合、粘性が増加して、第二鉄／第一鉄混合物への水酸化アンモニウムの均一混合が阻害され、大きな粒子が生じる。余分な水酸化アンモニウムまたは１ｍＬ未満の水酸化アンモニウムを加えないことを確実にした。
Figure 2023504525000004
氷浴中で１５分間激しく撹拌を続けた。反応混合物下の氷浴を維持し、全工程中、撹拌を維持した。１５分後、一方の口を水冷式コンデンサーに接続し、他方の口を不活性ガスに接続して高温でパージした（反応混合物中にではない）。高温で突沸が発生しないように注意した。反応Ｒｂｆを９０℃に予熱された油浴に移した。撹拌を油浴中で６０分間続けた。温度計を反応混合物中に保持して温度を測定し、温度は少なくとも約７５～８５℃に維持した。混合物は６０分を超えては加熱なかった。このステップの後、ガスの流れを止め、溶液をゆっくりと室温まで冷やした。これらの一連の反応の最後に、デキストランでコートされた磁性ナノ粒子の形成が達成された。最終的な溶液の体積は４０ｍＬ未満であった。撹拌を室温で１２時間続けた。Ｄ．Ｉ．水を加えることにより、体積を４０ｍＬとした。溶液を５０ｍＬのコニカルチューブに移し、１４，０００ＲＰＭで１時間の遠心分離により大きな粒子を除去した。溶液をＡｍｉｃｏｎフィルターユニット（１０ｍＬ×４）に移し、粒子を５０ｍＬのコニカルチューブに捨てた。
得られた溶液をＡｍｉｃｏｎチューブ（５０Ｋ遠心式フィルターユニット）で精製して、未反応のデキストラン、鉄塩、および水酸化アンモニウムを除去した。ナノ粒子懸濁液は、まず遠心分離（４，５００ＲＰＭ、３時間）で濃縮し、フィルター上の高濃度のナノ粒子懸濁液、およびフィルターユニット下のナノ粒子を含まない溶出液を得た。フィルター下の溶出液を捨て、ナノ粒子ゲル様ペレットをＤ．Ｉ．水に再懸濁し、同じフィルターユニットを使用して再遠心分離した。このステップを、溶出液がＤ．Ｉ．水のｐＨまたは中性のｐＨを示すまで繰り返した。最初は、溶液の粘性、粒子のサイズが大きいこと、および混合物中の未反応の遊離デキストランの量が多いことから、遠心分離に約１時間を要した。しかし、最初の３～４回の遠心分離ステップの後、遊離デキストランのほとんどが除去され、ナノ粒子の再懸濁および濃縮は比較的短い遠心分離ステップ（１回の遠心分離ステップにつき約１５分）で行われた。洗浄ステップは７回繰り返した。得られた磁性ナノ粒子の精製溶液は、蒸留水に再懸濁した。最終体積を２１ｍＬに調節し、溶液を冷蔵庫（たとえば、約４℃）で一晩休ませた。
[実施例７]
－ＭＮの磁気特性の評価
試料を磁性粒子分光計（ＭＰＳ）により解析し、非線形性指数（ＮＬＩ）をナノ粒子の磁気特性の基準として使用した。図９、１１、１３～１４、１６～１７、および１９～２０は、各ＭＮ試料についてのＮＬＩ値などのＭＰＳ解析データの例を示す。これらのＭＮの合成および評価のための表面修飾ステップは、これまでの実施例に記載されたものと同じであった。
反応混合物中の塩化第一鉄と塩化第二鉄の比を調節することにより、磁気特性を制御した。水性媒体中でのナノ粒子の懸濁安定性を向上させるためには、磁気特性の制御が重要である。このシステムでは、表面に正電荷を付与することで、長期保存の間にナノ粒子の凝結／不安定性をもたらし得るブラウン運動における粒子間の磁気引力を克服できるように表面を設計した。粒子あたりのアミノ化の度合いは６４より大きく、水性媒体中での懸濁安定性が確保された。
磁気特性の点では、非線形性指数（ＮＬＩ）は、外部磁場に対する応答性を定量化するために使用される磁性粒子の十分に特徴づけられた特性である。粒子が、所与の磁場を印加したときの特性と比較して外部磁場がないときに強い磁気特性（透磁率）を有するとき、ＮＬＩが小さくなり、外部磁場に対して非線形相関関係を示すため、前記非線形性に依存する撮像および治療的技術により適合しており、一つの例は磁性粒子撮像（ＭＰＩ）である。
[実施例８]
－異なるスケールでのＭＮの合成
磁性ナノ粒子（ＭＮ）の合成は、氷とともにガラス板を含む、丸底フラスコを含有するセットアップ例を使用して行った。丸底フラスコには、以下にさらに記載される反応成分を入れた。丸底フラスコをホットプレート／撹拌プレートの上に置いた。
ＭＮの配合は、デキストラン（１８ｇ／６０ｍＬのＤ．Ｉ．水）、０．５４ｇの塩化第二鉄、０．２ｇの塩化第一鉄、および１ｍＬのＮＨ４ＯＨ（２８％）を含むものとした。この配合により、磁気特性の非線形性指数が最小となった。
まず、１８グラムのデキストランＴ１０を脱イオン水（Ｄ．Ｉ．水）に溶解して、コニカルチューブ内に６０ｍＬ（３０％ｗ／ｖ）とした。デキストランＴ１０（技術的品質）は、平均分子量１０ｋＤａの高純度デキストラン画分である。デキストランの溶液は、室温で３日以内に沈殿を形成するため、新しい溶液を調製した。
次に、デキストランを脱イオン（Ｄ．Ｉ．）水中に、回転機で室温で１時間かけて溶解させた。得られた溶液は無色であったが、気泡でわずかに濁って見える場合がある。デキストランを完全に溶解させるために、適度な熱を加えることができる。デキストラン溶解のセットアップの一例を図１に示す。
デキストラン溶液を０．２マイクロメートル（μｍ）／０．４５μｍのフィルターを使用してろ過し、磁気撹拌子を入れた２５０ｍＬの丸底フラスコに入れた。チューブ内に残ったデキストランは、必要に応じて蒸留水と合わせることができる。２つ口丸底フラスコ（Ｒｂｆ）内の溶解溶液を、穏やかに磁気撹拌し、窒素（またはアルゴン）バブリング（エアパージングではない）で溶存酸素を除去しながら、氷浴中で３０分間冷やした。
次に、塩化第二鉄の原液を調製した。塩化第二鉄の量は、以下の表４に示すように、１００ｍＬのＤＩ水中の０．５４ｇの塩化第二鉄六水和物であった。原液は褐色を呈し、０．２２μｍフィルターユニットを使用してろ過し、冷暗所に保管した。鉄塩組成物中の他の元素を引くことにより、鉄の量を算出した。塩化第一鉄四水和物の瓶は、空気による酸化を最小限に抑えるため、デシケーターに保管した。粉末の塩化第一鉄は緑色であるべきで、瓶内での褐色の結晶の生成は鉄の酸化（すなわち、Ｆｅ（ＩＩ）からＦｅ（ＩＩＩ）への変換）を示しており、これは高品質の超常磁性ナノ粒子を得るためには避けるべきである。
次に、塩化第一鉄溶液（ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）を調製した。０．２０ｇｒの塩化第一鉄（条件１）を新しく秤量し、エッペンドルフチューブ内で１ｍＬのＤ．Ｉ．水に溶解させ、真珠光沢のある明青緑色の溶液を得た。条件２の配合では、０．４ｇｒの塩化第一鉄を使用した。塩化第一鉄の溶解のために、Ｄ．Ｉ．水を窒素で１０分間（ｍｉｎ）パージして、水中の溶存酸素ガスを除去した。溶解後にろ過は不要であるが、完全な溶解が達成されたことを確認するために、１０分間（０．４ｇの塩化第一鉄、すなわち条件１の場合）、溶解のステップを行った。
塩化第二鉄の原液を、冷えたデキストラン溶液に加えた。表４に示すように、１ｍＬの塩化第一鉄溶液（１当量０．２ｇのＦｅＣｌ２）をフラスコに加えた。フラスコ内を一定に窒素（またはアルゴン）バブリングしながら、混合物を１時間撹拌した。Ｒｂｆの口はすべてゴム栓で密栓して、空気接触を最小限にすることにより酸化を防いだが、１つの口にはゴム栓の上に針（１８Ｇ）によるガス排出口を設けた。
Figure 2023504525000005
次に、不活性ガスによるパージングを停止した。水酸化アンモニウムを空気接触させずに加えるためのカニューレチューブを接続した。１ｍＬの濃縮された冷えた（約４℃）水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ，２８％）を氷浴中で反応混合物に素早く加えた。このステップでは、粘性の変化を克服するために撹拌速度を最大に設定した。反応混合物は初めは非常に粘性が高くなり、アーミーグリーン色に変化した。水酸化アンモニウムの滴定が終わった後に、粘性は失われた。水酸化アンモニウムをゆっくり加えた場合、粘性が増加して、第二鉄／第一鉄混合物への水酸化アンモニウムの均一混合が阻害され、大きな粒子が生じる。余分な水酸化アンモニウムまたは１ｍＬ未満の水酸化アンモニウムを加えないことを確実にした。
氷浴中で１５分間激しく撹拌を続けた。反応混合物下の氷浴を維持し、全工程中、撹拌を維持した。１５分後、一方の口を水冷式コンデンサーに接続し、他方の口を不活性ガスに接続して高温でパージした（反応混合物中にではない）。高温で突沸が発生しないように注意した。反応Ｒｂｆを６０℃に予熱された油浴に移した。撹拌を油浴中で９０分間続けた。温度計を反応混合物中に保持して温度を測定し、温度は少なくとも約７５～８５℃に維持した。混合物は６０分を超えては加熱しなかった。このステップの後、ガスの流れを止め、溶液をゆっくりと室温まで冷やした。これらの一連の反応の最後に、デキストランでコートされた磁性ナノ粒子の形成が達成された。最終的な溶液の体積は約４０ｍＬであった。撹拌を室温で１２時間続けた。Ｄ．Ｉ．水を加えることにより、体積を４０ｍＬとした。溶液を５０ｍＬのコニカルチューブに移し、１４，０００ＲＰＭで１時間の遠心分離により大きな粒子を除去した。溶液をＡｍｉｃｏｎフィルターユニット（１０ｍＬ×４）に移し、粒子を５０ｍＬのコニカルチューブに捨てた。
得られた溶液をＡｍｉｃｏｎチューブ（５０Ｋ遠心式フィルターユニット）で精製して、未反応のデキストラン、鉄塩、および水酸化アンモニウムを除去した。ナノ粒子懸濁液は、まず遠心分離（４，５００ＲＰＭ、３時間）で濃縮し、フィルター上の高濃度のナノ粒子懸濁液、およびフィルターユニット下のナノ粒子を含まない溶出液を得た。フィルター下の溶出液を捨て、ナノ粒子ペレットをＤ．Ｉ．水に再懸濁し、同じフィルターユニットを使用して再遠心分離した。このステップを、溶出液がＤ．Ｉ．水のｐＨまたは中性のｐＨを示すまで繰り返した。最初は、溶液の粘性、粒子のサイズが大きいこと、および混合物中の未反応の遊離デキストランの量が多いことから、遠心分離に約３時間を要した。しかし、最初の３～４回の遠心分離ステップの後、遊離デキストランのほとんどが除去され、ナノ粒子の再懸濁および濃縮は比較的短い遠心分離ステップ（１回の遠心分離ステップにつき約１５分）で行われた。洗浄ステップは７回繰り返した。得られた磁性ナノ粒子の精製溶液は、蒸留水に再懸濁した。最終体積を２１ｍＬに調節し、溶液を冷蔵庫（たとえば、約４℃）で一晩休ませた。試料を磁性粒子分光計（ＭＰＳ）により解析し、非線形性指数（ＮＬＩ）を算出した。ＮＬＩ値をナノ粒子の磁気特性の基準として使用した。
このスケールアップ研究では、全鉄濃度の点で、実施例１～６に記載した研究の１８倍のスケールアップを実証した。克服した主なハードルは、酸化鉄結晶形成のステップ、水酸化アンモニウム添加のステップにおける粘性の高さであった。機械式撹拌装置の使用により上記のステップにおける均一混合の問題を解決し、水酸化アンモニウムの添加は、あらかじめ決められた量を注ぐことにより、かつ滴定なしで、できるだけ短時間で実施された。水酸化アンモニウムの体積は、表４に示すように、全鉄化合物の量に比例する。デキストラン溶液対全鉄濃度の増加により、結晶形成ステップにおける粘性が減少した。これらの結果から、６０ｍＬのデキストラン溶液中の１８当量の全鉄濃度という過酷な条件で、優れた非線形性指数を有する磁性ナノ粒子が大量生産されることが実証された。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と合わせて説明したが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図しており、限定することを意図していないことを理解されたい。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。

Claims (31)

  1. 塩化第二鉄、塩化第一鉄、またはそれらの組合せと、
    １つ以上のアミン基で官能化されたデキストランコーティングと
    を含む磁性ナノ粒子を含み、
    前記１つ以上のアミン基の数が約５～約１０００の範囲である、ナノ粒子組成物。
  2. 約５０重量（ｗｔ）％～約１００ｗｔ％の塩化第二鉄および約０ｗｔ％～約５０ｗｔ％の塩化第一鉄を含む、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
  3. 約０．６５ｇの塩化第二鉄および約０．４ｇの塩化第一鉄を含む、請求項２に記載のナノ粒子組成物。
  4. 前記１つ以上のアミノ基の数が約５～約１５０の範囲である、請求項１～３のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。
  5. 約５０ｗｔ％～約１００ｗｔ％の塩化第二鉄を含む、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
  6. 約１．２ｇの塩化第二鉄を含む、請求項５に記載のナノ粒子組成物。
  7. 塩化第一鉄を含まない、請求項１、５または６に記載のナノ粒子組成物。
  8. 前記１つ以上のアミノ基の数が約２４６～約５００の範囲である、請求項１、５、６または７に記載のナノ粒子組成物。
  9. 塩化第二鉄、塩化第一鉄、またはそれらの組合せと、
    デキストランコーティングと
    を含む磁性ナノ粒子を含み、
    前記磁性ナノ粒子が約６～約４０の範囲の非線形性指数を有する、
    ナノ粒子組成物。
  10. 約５０重量（ｗｔ）％～約８０ｗｔ％の塩化第二鉄および約５０ｗｔ％～約２０ｗｔ％の塩化第一鉄を含む、請求項９に記載のナノ粒子組成物。
  11. 約０．５４ｇの塩化第二鉄および約０．２ｇの塩化第一鉄を含む、請求項１０に記載のナノ粒子組成物。
  12. 前記磁性ナノ粒子が８～１４の範囲の非線形性指数を有する、請求項１１に記載のナノ粒子組成物。
  13. 約０重量（ｗｔ）％～約５０ｗｔ％の塩化第二鉄および約１００ｗｔ％～約５０ｗｔ％の塩化第一鉄を含むか、または約８０ｗｔ％～約１００ｗｔ％の塩化第二鉄および約０ｗｔ％～約２０ｗｔ％の塩化第一鉄を含む、請求項９に記載のナノ粒子組成物。
  14. 約０．５４ｇの塩化第二鉄および約０．４ｇの塩化第一鉄を含む、請求項１３に記載のナノ粒子組成物。
  15. 前記磁性ナノ粒子が約８～約６７の範囲の非線形性指数を有する、請求項９または１３に記載のナノ粒子組成物。
  16. 前記磁性ナノ粒子が約６７の非線形性指数を有する、請求項１５に記載のナノ粒子組成物。
  17. 前記磁性ナノ粒子が約３ｎｍ～約５０ｎｍの直径を有する酸化鉄結晶コアを有し、前記磁性ナノ粒子の流体力学的直径が約７ｎｍ～約２００ｎｍである、請求項１から１６のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。
  18. 前記磁性ナノ粒子が約０．１～約０．２５の多分散性を有する、請求項１から１７のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。
  19. 前記デキストランコーティングが約１ｋＤａ～約１５ｋＤａの範囲の分子量を有するデキストランを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。
  20. 前記デキストランコーティングが約１０ｋＤａの分子量を有するデキストランを含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。
  21. 前記デキストランコーティングの表面に付着した薬物ペイロードをさらに含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。
  22. 前記薬物ペイロードが前記１つ以上のアミン基とコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドである、請求項１から２１のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。
  23. 前記薬物ペイロードが薬物、抗体、成長因子、核酸、核酸誘導体、核酸断片、タンパク質、タンパク質誘導体、タンパク質断片、糖、多糖断片、糖誘導体、グリコシド、グリコシド断片、グリコシド誘導体、撮像造影剤、またはそれらの任意の組合せである、請求項１から２２のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。
  24. 請求項１から２３のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
  25. 治療有効量の請求項１から２４のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物を、少なくとも、対象の身体、身体部分、組織、細胞または体液の一部における組織標的部位に投与することと；
    エネルギーを前記磁性ナノ粒子組成物および前記組織標的部位に加えることと；
    前記ナノ粒子組成物および前記組織標的部位のシグナルを検出することと；
    前記検出されたシグナルに基づいて前記組織標的部位の画像を得ることと
    を含む、それを必要とする対象における組織標的部位を撮像する方法。
  26. 前記撮像が磁気共鳴撮像、磁性粒子撮像、またはそれらの組合せであり、前記エネルギーが磁場である、請求項２５に記載の方法。
  27. 疾患ががんであり、前記組織標的部位が腫瘍である、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記ナノ粒子組成物が前記対象の前記標的部位に蓄積する、請求項２５に記載の方法。
  29. それを必要とする対象における疾患を撮像する方法において使用するための、請求項１から２４のいずれか一項に記載の組成物。
  30. デキストランを水に溶解させることと；
    前記デキストランをエピクロロヒドリンで架橋することと；
    塩化第一鉄溶液、塩化第二鉄溶液、またはそれらの組合せを調製することと；
    前記塩化第一鉄溶液、塩化第二鉄溶液、またはそれらの組合せを前記デキストランに加えて、混合物を調製することと；
    前記混合物を撹拌および氷浴に供しながら、前記混合物に塩基を加えることと；
    前記混合物を約７５℃～約９０℃の温度に供することと
    を含み、
    前記塩基を加えるステップが、酸化鉄結晶、酸化鉄水和物、またはそれらの組合せの形成を妨げ、
    前記混合物が、約５０重量（ｗｔ）％～１００ｗｔ％の塩化第二鉄および約０ｗｔ％～５０ｗｔ％の塩化第一鉄を含む、
    請求項１から２４のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物を調製する方法。
  31. デキストランを水に溶解させることと；
    前記デキストランをエピクロロヒドリンで架橋することと；
    塩化第一鉄溶液、塩化第二鉄溶液、またはそれらの組合せを調製することと；
    前記塩化第一鉄溶液、塩化第二鉄溶液、またはそれらの組合せを前記デキストランに加えて、混合物を調製することと；
    前記混合物を撹拌および氷浴に供しながら前記混合物に塩基を加えることと；
    前記混合物を約７５℃～約９０℃の温度に供することと
    を含み、
    前記塩基を加えるステップが、酸化鉄結晶、酸化鉄水和物、またはそれらの組合せの形成を妨げ、
    前記混合物が、５０ｗｔ％～約８０ｗｔ％の塩化第二鉄および約５０ｗｔ％～約２０ｗｔ％の塩化第一鉄を含む、
    請求項１から２４のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物を調製する方法。
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