JP2014511880A - 治療の方法及びそのために有用な剤 - Google Patents

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Abstract

本発明は、概して、腫瘍性状態を治療する方法に及びそれに有用な剤に関する。より詳細には、本発明は、球状物質及び細胞毒素の共投与を介して、局所化された様式での固形腫瘍の治療を促進する方法に関する。本発明の方法は、原発性及び転移性の腫瘍の治療を含む、治療的処置の範囲で有用である。
【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、概して、腫瘍性状態の治療の方法及びそれに有用な剤に関する。より詳細には、本発明は、球状物質及び細胞毒素の共投与を介して局所化された様式で、固形腫瘍の治療を促進する方法に関する。本発明の方法は、原発性及び転移性の腫瘍の治療を含む治療的処置の範囲で有用である。
発明の背景
この明細書において著者により参照された刊行物の書誌の詳細は、明細書の最後にアルファベット順で集めてある。
任意の先行刊行物（若しくはそれに由来する情報）についての又は公知のいずれの事項についてのこの明細書における参照は、先行刊行物（若しくはそれに由来する情報）又は公知の事項が、この明細書が関連する試みの分野における慣用の一般知識の部分を形成するという、同意若しくは承認又はいずれの形式の示唆でもないし、そのように解されるべきではない。
悪性腫瘍（すなわち、ガン）は、無制御の様式で増殖し、正常組織を侵食し、しばしば、起源の組織とは離れた場所に転移し増殖する。一般的に、ガンは、悪性形質転換と呼ばれるあまり分かっていないプロセスを経た、１個又は数個のみの正常細胞に由来する。ガンは、身体のほぼいずれの組織からでも生じうる。上皮細胞に由来するもの（ガン腫と呼ばれる）は、最も普通の種類のガンである。肉腫は、線維芽細胞、筋細胞及び脂肪細胞等の細胞から生じる、間葉組織の悪性腫瘍である。リンパ組織の固形悪性腫瘍は、リンパ腫と呼ばれ、リンパ球及び他の造血細胞の骨髄及び血液−骨の悪性腫瘍は、白血病と呼ばれる。
ガンは、先進工業国の三大死亡原因のうちの１つである。感染性疾患の治療及び循環器系疾患の予防の改善が続いていることにより、平均余命は増大し、ガンは、これらの国々で最も共通した致死的疾患となっているようである。したがって、ガンをうまく治療することは、患者を死亡させることなくすべての悪性細胞を取り除き又は破壊することを必要とする。これを達成するための理想的方法は、腫瘍の細胞とその正常な細胞同等物の細胞とを識別するであろう腫瘍に対する免疫応答を誘導することであろう。しかしながら、ガンの治療に対する免疫学的アプローチは、持続できない結果を伴い、１世紀にわたり、試みられてきた。
したがって、ガンを治療する現在の方法は、外科的切除（可能であれば）、必要であれば、続いての放射線療法及び／又は化学療法の長く使用されたプロトコールに従い続けている。このある程度粗い形態の治療の成功率は、かなり変動するが、腫瘍がより進行し転移するに従い、一般的に顕著に減少する。さらに、これらの治療は、手術による美観の損失及び傷（例えば、乳房切除又は手足の切断）、化学療法による重篤な悪心及び嘔吐、最も顕著には、ほとんどのガン治療の一部を形成し、投薬の主な制限要素である、毒性薬物の相対的に非特異的な標的化メカニズムの結果として引き起こされる、毛包、腸、骨髄等の正常細胞への損傷を含む、重篤な副作用を伴う。
なおさらに、一般的な化学療法剤は、血液の供給から約７０ミクロンを更に超えて組織内へ有意には浸透しない（非特許文献１、非特許文献２）。ほとんどの固形腫瘍の速い増殖及び乏しい血管形成は、多くの腫瘍細胞を、組織に浸透する薬物の能力を非常に超えた状態にしている。決定的に、多くの細胞は、それらの生存を可能にし薬物耐性を生じさせる、致死量以下の用量を経験する。
固形腫瘍は、ガンによる最も多くの死を引き起こし、ガン腫として知られている気管支及び消化管の内膜の腫瘍を主に含む。オーストラリアでは２０００年に、ガンは、男性の死亡の３０％及び女性の死亡の２５％を占めた（非特許文献３）及びそれは、米国では２００１年に、男性の２４％及び女性の２２％の死亡を占めた（非特許文献４）。固形腫瘍は、一旦身体中に広がりすなわち「転移する」と、通常は治癒可能ではない。転移性固形腫瘍の予後は、最近の５０年間でほんのわずかに改善されている。固形腫瘍を治癒する最良の機会は、固形腫瘍がその生じた内面に局在化しており、腫瘍又はその他の場所に流入するリンパ節のいずれにも広がっていない時の、手術及び／又は放射線療法等の局所的治療法の使用のままである。それにもかかわらず、この初期の段階でさえ、特に腫瘍が流入するリンパ節にまで広がった場合、微小転移として知られているガンの微細な沈着物が、身体全体にすでに広がっているかもしれず、その後に患者の死を導く。この意味で、ガンは、全身的に投与される治療を必要とする全身疾患である。それらの原発性腫瘍についての最終的な局所治療として手術及び／又は放射線療法を受けた及び微小転移を有する患者のうちで、少数の割合が、細胞毒性の化学療法又はホルモン等のアジュバント全身治療を追加することにより、ガンを治癒するかもしれないし、少なくともガンからの長期寛解を達成するかもしれない。
慣習的に、固形ガンは、手術及び／又は放射線療法を用いて、そして、その転移ステージの間、全身的に投与される細胞毒性の薬物（これは、しばしば、正常及び悪性の細胞の両方の細胞周期に干渉する）を用いて、局所的に治療されてきた。悪性組織の治療へのこのアプローチの相対的選択性は、細胞毒性の薬物のダメージからの正常な組織のより迅速な回復にある程度基づいている。さらに最近では、ガンの標的化療法が、正常な非悪性組織への有害事象を最小化しつつ、悪性組織への送達のその特異性及び／又は精度を向上することにより、ガン治療の治療率を向上することを目標としている。２つの主なクラスの標的化療法は、（ｉ）チロシンキナーゼインヒビターである、メシル酸イマチニブ（Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標））、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））及びエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））等の小分子インヒビター、並びに（ｉｉ）リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））及びトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））等のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。
標的化療法の開発と並行して、少なくとも２つの従来の抗ガン治療（例えば、化学療法及び放射線療法）を新規な方法で組み合わせるという、ガン治療法の開発への別のアプローチもされている。治療の異なる様式間の相乗性効果を開発することによって、集学療法が治療効果を改善し、その結果、併用治療の治療割合は、個別の治療の各々の治療割合を上回っている。
外部ビーム照射と、５−フルオロウラシル及びシスプラチン等の放射線感作化学療法薬物と、を使用する集学治療（化学放射線療法）は、局所腫瘍の制御を改善したこと及び遠位の失敗の割合を減少したことの両方により、頭頸、肺、食道、胃、膵臓及び直腸の固形腫瘍等の固形腫瘍の多数において、生存を改善した（非特許文献５）。放射線感作薬物は腫瘍応答を増大するが、それらはまた、隣接する正常組織への毒性も増大し、これは、特に、強力な新世代の放射線感作剤であるゲムシタビン及びドセタキセルに当てはまる。しかしながら、放射線量を減少することにより、ゲムシタビンの細胞毒性用量は、より良好に臨床的に許容されるものとなっている（非特許文献５）。化学放射線療法は、インビボで明らかにされるのみでありうる相互に強化する耐性機構を克服しうる。
放射免疫療法（ＲＩＴ）は、致死用量の放射線を標的抗原を有する細胞に送達するために、抗原−抗体の相互作用の特異性及び結合力を利用した全身治療である。β粒子を放射するラジオアイソトープ（例えば、１３１ヨウ素、９０イットリウム、１８８レニウム、及び６７銅）が、通常、治療的適用のため、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を標識するために使用される。β放射からのエネルギーは、ミリメーターで測定される距離に亘り比較的低い強度で放出される（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。したがって、９０イットリウム等の高エネルギーβ放射体が、より大きく異種性の固形腫瘍の治療に有用である（非特許文献９）。送達される低い放射線用量にもかかわらず、周囲の宿主細胞を観察した際のＲＩＴの顕著な予期しない生物学的効果により、放射免疫療法への研究の関心は復活してきている（非特許文献１０）。さらに、ＲＩＴにより送達されるより低いが生物学的に有効な用量の放射線が、外部ビーム放射線療法として伝達される更に高い用量の放射線よりも、高い細胞破壊効果を有していた（非特許文献１１）。それにもかかわらず、固形腫瘍の治療としてのＲＩＴの効果は、腫瘍中の標的抗原を取り囲む組織バリアを通る抗体の低い浸透により妨害されうるし、これは、結果的に、抗体の循環半減期を延長する（非特許文献１２）。さらに、ＲＩＴは、しばしば、腫瘍内での標的抗原の発現の不均一性により、妨害される。したがって、ＲＩＴは、腫瘍細胞の分子標的化を提供することができるが、ＲＩＴの主な制限には、十分な標的化を達成するために、全身的に送達される大量の放射線から生じうる、毒性が残っている（非特許文献１２、非特許文献１３）。要するに、ＲＩＴを用いる有用な治療指標は、臨床的に達成するのが困難であると証明されている（非特許文献１４）。
正常細胞を残しつつ、腫瘍を差別的に標的化することを可能にするであろう、腫瘍関連抗原はまた、ガン研究の中心である。豊富な広範な抗原がより集中した到達可能なＲＩＴ用のターゲットを提供しうるが、これを採用する研究は、非常に限られている。
ナノ粒子技術の開発はまた、新規で効果的なガン治療の開発の点で、面白い新たなフロンティアとして認められた。しかしながら、診断的な又は治療的ないずれかの目的で腫瘍を標的化するためにナノ粒子等の球状物質を使用する以前の試みは、治療剤に照らして、広範なものであるが、残念なことに、最小の成功しか存在していない。診断の場合、腫瘍中への粒子の比較的浅い浸透は、腫瘍を可視化する目的を達成するのに十分である。しかしながら、治療剤の送達の点で、そのような浅い浸透は、腫瘍全体に亘り（特に、腫瘍の内部まで）、すべての腫瘍の破壊を達成すべき場合に必要とされるように、剤を効果的に送達するのに十分ではない。治療剤に関しては、具体的には、非常に多様な異なる物質への粒子の結合が、今までのところ、治療剤が、任意の機会の有効性を有することに必須の必要条件である、効果的な腫瘍浸透を達成する見込みに応えることに失敗している。
著しい努力がまた、効果的な治療剤を開発するための手段として、腫瘍のｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＲ）効果を利用してなされている。いずれの一つの理論又は作用機序に本発明を制限するものではないが、これは、特定のサイズの分子（典型的には、リポソーム又は高分子薬物）が、腫瘍組織に優先的に蓄積する傾向があるという考えに基づいて、よく記載されている事項である。この考えの一般的な説明は、腫瘍細胞は迅速に増殖するために、それらは血管の産生を刺激しなければならないことである。ＶＥＧＦ及び他の増殖因子は、ガンの血管新生に関与する。１５０〜２００μｍ程度の小ささのサイズの腫瘍細胞の凝集物は、それらの栄養的及び酸素の供給のための新脈管構造により運搬される血液供給に依存するようになる。これらの新たに形成された腫瘍の血管は、通常、形状及び構造において、異常である。これらは、広い開窓、平滑筋層の欠損、又はより広い管腔を有する神経支配、を有する不十分に整列した不完全な内皮細胞、及び、損なわれたアンジオテンシンＩＩの機能的レセプター、を含む。さらに、腫瘍組織は、通常、有効なリンパ排出を欠いている。すべてのこれらの因子は、異常な分子及び体液輸送動態（特に、高分子薬物に対する）を導く。したがって、固形腫瘍への選択的薬物ターゲティングを達成するための一つの方法は、固形腫瘍における高分子薬物のＥＰＲ効果を著しく規定する、腫瘍組織への抗ガン剤の能動的及び選択的な輸送の点で、腫瘍脈管構造のこれらの異常を発見することと考えられている。それらの大きな分子サイズに起因して、ナノサイズ化された静脈内投与される高分子抗ガン剤は、腎クリアランスを回避する。しばしば、それらは、正常な血管の密接な内皮接合部を透過しえないが、それらは、腫瘍脈管構造において血管外遊出しえ、腫瘍近傍にトラップされるようになりうる。しかしながら、ＥＰＲ効果は、効果的に又はうまく利用されていない。
Ｐｒｉｍｅａｕ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ２００５， １１：８７８２−８７８８ Ｍｉｎｃｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ ２００６， ６：５８３−５９２ Ｃａｎｃｅｒ ｉｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ ２０００， ２００３ Ａｒｉａｓ ｅｔ ａｌ． ２００３， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｉｔａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５２：１１１−１１５ ＴＳ Ｌａｗｒｅｎｃｅ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ （Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ） １７：２３−２８， ２００３ Ｗａｌｄｍａｎｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６５７−１６６２， １９９１； Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２１−１２６， １９９２ Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６：１９０２−１９０９， １９９５ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８１：９８５−９９２， １９９９ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：７−３４， ２００１ Ｘｕｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９９：１３７６５−１３７７０， ２００２ Ｄａｄａｃｈｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １０１：１４８６５−１４８７０， ２００４ Ｂｒｉｔｚ−Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４４：１９４５−１９６１， ２００３ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１４９３−１５０１， ２００４ Ｓｅｌｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １０４：１６５５−１６６１， １９９９
効果的な細胞のエンドサイトーシスを達成するように方向付けられた様々なナノ粒子が、設計されている。しかしながら、これが達成可能な場合でさえ、組織浸透の問題は、未だ、今日までうまく克服されていない別個の問題である。ナノ粒子を薬物送達のためのベクターとして使用するという一般的な考えは、文献で広く議論されているが、深い腫瘍浸透性は達成されておらず、価値は制限されている。
薬物の効果的な腫瘍分布が（何らかの手段によって）達成されている場所でさえ、更なる問題は、固形腫瘍内の腫瘍性細胞が、遅延された代謝を示しうるという事実である。これは、細胞毒性の薬物がこれらの細胞に浸透する場合でさえ、それが有効に代謝されない場合、腫瘍の生存率に限られた影響を有することを意味する。
したがって、固形ガン（特に、転移性ガン）に対する改良された全身療法を開発する緊急の持続した必要性が存在する。
本発明につながる作業において、安定化剤により分散された状態で維持される球状物質が、ナノ粒子技術を用いてすでに達成可能であるよりも、固形腫瘍モデル中へのより深い浸透を達成しうることが特定された。これは、細胞毒素を球状物質と共投与することに基づく、固形腫瘍（原発性及び転移性の両方とも）を治療するための効果的な手段の開発を可能にした。この毒素を連続して又は同時のいずれかで送達することにより、より深い浸透、したがって、毒素へのより広範な細胞の暴露が達成される。腫瘍に関連する網内系クリアランスのより少ない効果のおかげで、標的化された治療の形態が、効果的に達成される。なおさらに、本発明の粒子により浸透される腫瘍による毒素の取り込みが効果的であることが観察されており、これは、腫瘍細胞代謝のアップレギュレーションを示唆している。したがって、本発明の方法は、同等のタイプの腫瘍の従来の治療に照らして標準的に予測されるであろうものに比べて、顕著に改善された結果及び／又は減少された副作用により特徴付けられる様式で、腫瘍及びその転移への細胞毒性のより効果的に局所化された送達及び取り込みを達成するための手段を提供する。転移性疾患に関する現在のプロトコールは、化学療法剤の標的化されていない全身送達に基づいているので、これは極めて有意な進歩である。
発明の要旨
この明細書及び付随する特許請求の範囲の全体に亘り、文脈がそれ以外のことを必要としなければ、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」並びに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等のその変形物は、述べられた整数値（ｉｎｔｅｇｅｒ）若しくは工程又は整数値若しくは工程の群を含むが、任意の他の整数値若しくは工程又は整数値若しくは工程の群を排除しないことを、意味すると理解される。
本明細書中で使用される用語「に由来する」は、特定の整数値又は整数値の群が特定された種に起源があるが、必ずしも特定の源から直接得られるものではないことを示すとして解釈される。さらに、本明細書中で使用される単数形の「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が他のことを明確に規定しない場合、複数の指示対象を含む。
他に定義されていなければ、本明細書中で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、この発明が属する当業者により共通して理解されるものと同じ意味を有する。
本発明の一つの局面は、対象における固形腫瘍を治療する方法に関し、該方法は、有効量の球状物質及び細胞毒素を、該腫瘍への該球状物質及び毒素の分布を促進するのに十分な時間及び条件下、該対象に共投与することを含み、ここで、
（ｉ） 該球状物質は、液体キャリア中の分散物の形態で投与され、該球状物質は、安定化剤により分散された状態に維持されており、
（ｉｉ） 該安定化剤は、（ａ）該安定化剤を該球状物質に固定し（ｂ）該安定化剤の残部とは異なる、固定部位を含み、
ここで、該球状物質及び毒素は、該固形腫瘍に浸透する。
便宜上、安定化剤により分散された状態に維持されている該球状物質を、本明細書中、「安定化された球状物質」として参照しうる。
一実施態様では、安定化剤は、立体安定化剤であり、該立体安定化剤は、立体安定化するポリマーセグメント及び固定部位を含み、ここで、該立体安定化するポリマーセグメントは、固定部位とは異なり、ここで、該固定部位は、該安定化剤を該球状物質に固定する。
したがって、該方法は、該対象に、有効量の球状物質及び細胞毒素を、該腫瘍への該球状物質及び毒素の分布を促進するために十分な時間及び条件下で、共投与することを含みえ、ここで、
（ｉ） 該球状物質は、液体キャリア中の分散物の形態で投与され、該球状物質は、立体安定化剤により分散された状態に維持されており、
（ｉｉ） 該立体安定化剤は、立体安定化するポリマーセグメント及び固定部位を含み、ここで、該立体安定化するポリマーセグメントは、固定部位とは異なり、ここで、該固定部位は、該安定化剤を該球状物質に固定し、
ここで、該球状物質及び毒素は、該固形腫瘍に浸透する。
別の実施態様では、該固形腫瘍は良性である。
更なる実施態様では、該腫瘍は悪性である。
更に別の実施態様では、該固定部位は、固定するポリマーセグメントである。その場合、該安定化剤は、固定するポリマーセグメントを含むか、又は、該立体安定化剤は、立体安定化するポリマーセグメント及び固定するポリマーセグメントを含む。
更なる実施態様では、該安定化剤は固定部位を含み、該安定化剤又は固定部位の一方又は両方が、リビング重合技術により重合されている１つ以上のエチレン系不飽和モノマーに由来し、ここで、該固定部位は、該安定化剤の残部とは異なり、ここで、該固定部位は、該安定化剤を該球状物質に固定する。この実施態様によれば、該固定部位は、固定するポリマーセグメントとして参照されうる。
別の実施態様では、該立体安定化剤は、立体安定化するポリマーセグメント及び固定するポリマーセグメントを含み、これらの一方又は両方は、リビング重合技術により重合されている１つ以上のエチレン系不飽和モノマーに由来し、ここで、該立体安定化するポリマーセグメントは、該固定するポリマーセグメントとは異なり、ここで、該固定するポリマーセグメントは、該安定化剤を該球状物質に固定する。
別の局面では、本発明は、対象における悪性固形腫瘍を治療する方法を提供し、該方法は、該対象に、有効量の球状物質及び細胞毒素を、該腫瘍への該球状物質及び毒素の分布を促進するために十分な時間及び条件下で、共投与することを含み、ここで、
（ｉ） 該球状物質は、液体キャリア中の分散物の形態で投与され、該球状物質は、安定化剤により分散された状態に維持されており、
（ｉｉ） 該安定化剤は、（ａ）該安定化剤を該球状物質に固定し（ｂ）該安定化剤の残部とは異なる、固定部位を含み、
ここで、該球状物質及び毒素は、該固形腫瘍に浸透する。
安定化剤が、立体安定化するポリマーセグメント及び固定部位を含む立体安定化剤である場合、該立体安定化するポリマーセグメントは、該固定部位とは異なり、対象において悪性固形腫瘍を治療する方法は、該対象に、有効量の球状物質及び細胞毒素を、該腫瘍への該球状物質及び毒素の分布を促進するために十分な時間及び条件下で、共投与することを含み、ここで、
（ｉ） 該球状物質は、液体キャリア中の分散物の形態で投与され、該球状物質は、立体安定化剤により分散された状態に維持されており、
（ｉｉ） 該立体安定化剤は、立体安定化するポリマーセグメント及び固定部位を含み、ここで、該立体安定化するポリマーセグメントは、該固定部位とは異なり、ここで、該固定部位は、該球状物質に該安定化剤を固定し、
ここで、該球状物質及び毒素は、該固形腫瘍に浸透する。
一実施態様では、該悪性固形腫瘍は、転移性悪性固形腫瘍である。「転移性」についての参照は、転移を経たか転移を経うるかいずれかの腫瘍への参照として理解されるべきである。
別の実施態様では、該悪性固形腫瘍は、中枢神経系腫瘍、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、小児腫瘍、扁平上皮ガン等の頭頸部ガン、乳及び前立腺のガン、肺ガン、腎細胞腺ガン等の腎ガン、食道胃ガン、肝細胞ガン、腺ガン及び膵島細胞腫瘍等の膵胆管新生物、結腸直腸ガン、子宮頸ガン、肛門ガン、子宮又は他の生殖器系のガン、尿管又は膀胱のものであるような尿路ガン、精巣胚細胞腫瘍又は卵巣胚細胞腫瘍等の胚細胞腫瘍、卵巣上皮ガン等の卵巣ガン、未知の原発性のガン腫、カポジ肉腫等のヒト免疫不全関連の悪性腫瘍、リンパ腫、白血病、悪性メラノーマ、肉腫、甲状腺のものであるような内分泌腫瘍、中皮腫又は他の胸膜若しくは腹膜の腫瘍、神経内分泌腫瘍或いはカルチノイド腫瘍である。
「共投与」により、安定化された球状物質及び細胞毒素は、独立した別々の実体として投与されることが意味される。換言すれば、投与の時点で、安定化された球状物質及び細胞毒素は、互いに、共有的にも化学的にも結合していない。
本発明の背景において、安定化された球状物質及び細胞毒素の共投与は、同時の及び逐次の投与の両方を包含する。同時投与は、安定化された球状物質及び細胞毒素が同じ処方物中又は２つの異なる処方物中に存在するが、それにもかかわらず、それぞれが実質的に同時に投与される場合を包含する。逐次投与の場合、安定化された球状物質がある工程において投与され、細胞毒素が別の工程における異なる時間に投与される場合、複数工程の手順が使用される。細胞毒素は、安定化された球状物質の投与の前に投与されうる。逐次投与における安定化された球状物質と細胞毒素との投与間の時間差は、変化しうるが、一般的に、約１分から約４日間まで、例えば、約１分から約２時間まで、又は約１分から約２４時間まで、又は約１分から約１２時間まで、又は約１分から約６時間まで、又は約１分から約３時間まで、又は約１分から約１時間まで、の範囲である。
逐次投与において、安定化された球状物質は、一般的に、細胞毒素の前に、投与される。
球状物質及び細胞毒素は、同じ又は異なる経路で投与されうる。
本発明をいずれか１つの理論又は作用機序に制限する者ではないが、一旦、球状物質が腫瘍に浸透すると、投与された細胞毒素の効果的な浸透も達成される。
本明細書中に提供した教示を考慮すると、本明細書中に記載した要素についての投与プロトコールを選択及び設計することは、当業者の技能の十分な範囲内であると理解される。
更なる局面では、対象において固形腫瘍を治療する方法が提供され、該方法は、
（ａ） 該対象に、有効量の球状物質を、該腫瘍への該球状物質の分布を促進するために十分な時間及び条件下で、投与すること、ここで、
（ｉ） 該球状物質は、液体キャリア中の分散物の形態で投与され、該球状物質は、安定化剤により分散された状態で維持されており、
（ｉｉ） 該安定化剤は、（ａ）該安定化剤を該球状物質に固定し（ｂ）該安定化剤の残部とは異なる、固定部位を含み；
（ｂ） 該対象に、有効量の細胞毒素を、該球状物質の投与に続いて、投与すること；
を含み、ここで、該球状物質及び毒素は、該固形腫瘍に浸透する。
安定化剤が、立体安定化するポリマーセグメント及び固定部位を含む立体安定化剤である場合（ここで、該立体安定化するポリマーセグメントは、該固定部位とは異なる。）、対象において固形腫瘍を治療する方法は、
（ａ） 該対象に、有効量の球状物質を、該腫瘍への該球状物質の分布を促進するために十分な時間及び条件下で、投与すること、ここで、
（ｉ） 該球状物質は、液体キャリア中の分散物の形態で投与され、該球状物質は、立体安定化剤により分散された状態に維持されており、
（ｉｉ） 該立体安定化剤は、立体安定化するポリマーセグメント及び固定部位を含み、ここで、該立体安定化するポリマーセグメントは、該固定部位とは異なり、ここで、該固定部位は、該安定化剤を該球状物質に固定し、
（ｂ） 該対象に、有効量の細胞毒素を、該球状物質の投与に続いて、投与すること
を含み、ここで、該球状物質及び毒素は、該固形腫瘍に浸透する。
更に別の局面では、対象において固形腫瘍を治療する方法が提供され、該方法は、該対象に、有効量の球状物質及び細胞分裂阻害又は細胞破壊の剤を、該腫瘍に該球状物質及び毒素の分布を促進するために十分な時間及び条件下で、共投与することを含み、ここで、
（ｉ） 該球状物質は、液体キャリア中の分散物の形態で投与され、該球状物質は、安定化剤により分散された状態に維持されており、
（ｉｉ） 該安定化剤は、（ａ）該安定化剤を該球状物質に固定し（ｂ）該安定化剤の残部とは異なる、固定部位を含み、
ここで、該球状物質及び該細胞分裂阻害又は細胞破壊の剤は、該固形腫瘍に浸透する。
安定化剤が、立体安定化するポリマーセグメント及び固定部位を含む立体安定化剤である場合（ここで、該立体安定化するポリマーセグメントは、該固定部位とは異なる。）、対象における固形腫瘍を治療する方法は、該対象に、有効量の球状物質及び細胞分裂阻害又は細胞破壊の剤を、該腫瘍への該球状物質及び毒素の分布を促進するために十分な時間及び条件下で、共投与することを含み、ここで、
（ｉ） 該球状物質は、液体キャリア中の分散物の形態で投与され、該球状物質は、立体安定化剤により分散された状態で維持されており、
（ｉｉ） 該立体安定化剤は、立体安定化するポリマーセグメント及び固定部位を含み、ここで、該立体安定化するポリマーセグメントは、該固定部位とは異なり、ここで、該固定部位は、該安定化剤を該球状物質に固定し、
ここで、該球状物質及び該細胞分裂阻害又は細胞破壊の剤は、該固形腫瘍に浸透する。
細胞毒性剤の例には、アクチノマイシンＤ、アドリアマイシン、三酸化ヒ素、アルパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトサール、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルチコステロイド、カリケアミシン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビナ（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎａ）、ゲムシタビン、ジェムザール、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン（Ｍｅｒｃａｐｔｏｍｕｒｉｎｅ）、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、プラチノール（Ｐｌａｔｉｎｏｌ）、プラチネックス（Ｐｌａｔｉｎｅｘ）、プロカルビジン（Ｐｒｏｃａｒｂｉｚｉｎｅ）、ラルチトレキセド（Ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｅｌ）、リキシン、ステロイド、ストレプトゾトシン、タキソール、タキソテール、チオグアニン、チオテパ、トムデックス、トポテカン、トレオスルファン、三水和物、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎａ）、ビノレルビン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｓｉｎ）、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｓｉｎ）、マホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソウレア、マイトマイシンＣ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、アムサクリン、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｄｉｌ）、メチルシクロヘキシルニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシパーオキシシクロホスホルアミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、コルヒチン、トリメトレキサート、テニポシド、ジエチルスチルベストロールが挙げられるが、これらに限定されない。
「細胞毒素」への参照はまた、伝統的には細胞毒性剤として解されないが、それにもかかわらず、細胞傷害（例えば、ヌクレオフォスミン等のＤＮＡ傷害、又は他の剤との相乗的プロセスの一部として細胞傷害を誘導する剤）を誘導するということに基づいて、本規定の範囲内である任意の他の分子まで及ぶことが理解されるべきである。例として、触媒抗体、プロドラッグ、ＣＨＫ１／２インヒビター（例えば、ＣＢＰ−５０１又はＡＺＤ７７６２）、ヒストンデアセチラーゼインヒビター（例えば、ボリノスタット）、リガンド又はＢＨ３ミメティックを含む腫瘍壊死因子関連アポトーシス（例えば、ＡＢＴ７３７）、小分子インヒビター（例えば、チロシンキナーゼインヒビターであるメシル酸イマチニブ（Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標））、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））及びエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）））、及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（例えば、リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））及びトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）））が挙げられる。
更に別の実施態様では、組み合わせ治療は、例えば、ＣＨＫ１／２インヒビターとともにゲムシタビン、又はＣＨＫ１／２インヒビターとともにイリノテカンを包含しうる。
球状物質及び／又は安定化剤は、腫瘍へのより特異的なターゲティングを達成するために、リガンドに結合されうる。これは、必ずしも全ての状況において適用可能ではないが、所定の腫瘍について適切な標的分子が存在する限りにおいて、これは、更なる有用な特異性を提供しうる。
そのような実施態様によれば、対象における固形腫瘍を治療する方法が提供され、該方法は、該対象に、有効量の球状物質及び細胞毒素を、該腫瘍への該球状物質及び毒素の分布を促進するために十分な時間及び条件下で、共投与することを含み、ここで、
（ｉ） 該球状物質は、液体キャリア中の分散物の形態で投与され、該球状物質は、安定化剤により分散された状態に維持されており、
（ｉｉ） 該安定化剤は、（ａ）該安定化剤を該球状物質に固定し（ｂ）該安定化剤の残部とは異なる、固定部位を含み、
ここで、該球状物質及び／又は該安定化剤は、腫瘍分子に指向するリガンドと、連結、結合又はその他の方法で会合され、ここで、該球状物質及び毒素は、該固形腫瘍に浸透する。
安定化剤が、立体安定化するポリマーセグメント及び固定部位を含む立体安定化剤である場合（ここで、該立体安定化するポリマーセグメントは、該固定部位とは異なる）、対象における固形腫瘍を治療する方法もまた提供され、該方法は、該対象に、有効量の球状物質及び細胞毒素を、該腫瘍への該球状物質及び毒素の分布を促進するために十分な時間及び条件下で、共投与することを含み、ここで、
（ｉ） 該球状物質は、液体キャリア中の分散物の形態で投与され、該球状物質は、立体安定化剤により安定化された状態で維持されており、
（ｉｉ） 該立体安定化剤は、立体安定化するポリマーセグメント及び固定部位を含み、ここで、該立体安定化するポリマーセグメントは、該固定部位とは異なっており、ここで、該固定部位は、該安定化剤を該球状物質に固定し、
ここで、該球状物質及び／又は該立体安定化剤は、腫瘍分子に指向するリガンドと、連結、結合又はその他の方法で会合されており、ここで、該球状物質及び毒素は、該固形腫瘍に浸透する。
更に別の局面では、固形腫瘍を治療するための医薬の製造における、球状物質及び細胞毒素の使用が提供され、ここで、
（ｉ） 該球状物質は、液体キャリア中の分散物の形態であり、該球状物質は、安定化剤により分散された状態に維持されており、
（ｉｉ） 該安定化剤は、（ａ）該安定化剤を該球状物質に固定し（ｂ）該安定化剤の残部とは異なる、固定部位を含み、
ここで、該球状物質及び毒素は、該固形腫瘍に浸透する。
安定化剤が、立体安定化するポリマーセグメント及び固定部位を含む立体安定化剤であり、ここで、該立体安定化するポリマーセグメントは該固定部位とは異なる場合、固形腫瘍の治療用の医薬の製造における、球状物質及び細胞毒素の使用が提供され、ここで、
（ｉ） 該球状物質が、液体キャリア中の分散物の形態であり、該球状物質が、立体安定化剤により分散された状態に維持されており、
（ｉｉ） 該立体安定化剤は、立体安定化するポリマーセグメント及び固定部位を含み、ここで、該立体安定化するポリマーセグメントは、該固定部位とは異なり、ここで、該固定部位は、該安定化剤を該球状物質に固定し、
ここで、該球状物質及び毒素は、該固形腫瘍に浸透する。
本発明の更なる局面及び／又は実施態様を以下に詳細に論ずる。
図１：立体的に安定化されたナノ粒子は、スフェロイド中に浸透可能である。スフェロイドにおけるＮＰ２粒子の蓄積のＴＥＭイメージ。矢印は、ナノ粒子蓄積の領域を示す。四角で囲った領域を拡大し、右側にイメージを示す。示されているのはスケールバー。 図２：ナノ粒子が、蛍光活性化合物の拡散に影響を及ぼしうる。蛍光活性化合物であるａ）ドキソルビシン及びｂ）ミトキサントロンと、実施例２、３及び５からのナノ粒子との共投与。ＤＬＤ−１スフェロイド中への蛍光薬物拡散の単一共焦点イメージ。スケールバー２００μｍ。 図３：試験したナノ粒子の大多数は、スフェロイドからの細胞増殖に影響を与えなかった。実施例１、２、４、８、９、１２、１３、１５、１６及び１８に列挙したナノ粒子の、実施例２９に記載したようにノーマライズした細胞増殖のプロット。エラーバーは標準誤差を示す。 図４：ナノ粒子コアの組成は、ナノ粒子の有効性に影響しない。ドキソルビシンと共投与した、実施例２、４、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７及び１８からのナノ粒子の、実施例２９に記載したようにノーマライズした細胞増殖のプロット。未処置のコントロールのスフェロイドは、３３１％＋／−２３のノーマライズした増殖値を有した。エラーバーは標準誤差を示す。 図５：ナノ粒子のサイズは、ナノ粒子の有効性とは相関しない。ドキソルビシンと共投与した、実施例１、２、４、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７及び１８に列挙したナノ粒子の、実施例２９に記載したようにノーマライズした細胞増殖のプロット。未処置のコントロールのスフェロイドは、３３１％＋／−２３のノーマライズした増殖値を有した。エラーバーは標準誤差を示す。 図６：５〜１０％のアミン官能化ポリマーを用いて安定化したナノ粒子は、ドキソルビシンの有効性を増大する。ドキソルビシンと共投与した、実施例２、３、４、５、２０、２１、２２及び２４に列挙したナノ粒子の、実施例２９に記載したようにノーマライズした細胞増殖のプロット。未処置のコントロールのスフェロイドは、３３１％＋／−２３のノーマライズした増殖値を有した。エラーバーは標準誤差を示す。 図７：ドキソルビシン単独と比較した、異なるコアを有する５％アミン官能化安定化剤末端基コーティングを有するＮＰとドキソルビシンとの共投与の有効性。ドキソルビシンと共投与した、実施例２、８、９及び１２に列挙したナノ粒子の、実施例２９に記載したようにノーマライズした細胞増殖のプロット。未処置のコントロールのスフェロイドは、３３１％＋／−２３のノーマライズした増殖値を有した。エラーバーは標準誤差を示す。 図８：２つの異なるガン細胞株から製造したスフェロイドの生存率に対する、ナノ粒子と共投与した場合の活性化合物の効果。活性化合物（表２）と共投与した、実施例２、３、４及び５に列挙したナノ粒子の、実施例２９に記載したようにノーマライズした細胞増殖のプロット。未処置のＤＬＤ−１コントロールのスフェロイドは、３３１％＋／−２３のノーマライズした増殖値を有した。未処置のＰＡ−１コントロールのスフェロイドは、２９４％＋／−２１のノーマライズした増殖値を有した。エラーバーは標準誤差を示す。 図９：活性化合物及びナノ粒子の共投与と比較した、活性化合物の遅延投与の効果。実施例２、３、４及び５に列挙したナノ粒子の、実施例２９に記載したようにノーマライズした細胞増殖のプロット。ＤＬＤ−１スフェロイドを、ナノ粒子及び活性化合物を共投与するか（ライトグレーのバー）、ナノ粒子を投与し、次いで、２４時間後に活性化合物で処置するか（ダークグレーバー）のいずれかを行った。未処置のＤＬＤ−１コントロールのスフェロイドは、３３１％＋／−２３のノーマライズした増殖値を有した。エラーバーは標準誤差を示す。 図１０：活性化合物及びナノ粒子の共投与と比較した、活性化合物の遅延投与の効果。実施例２、３、４及び５に列挙したナノ粒子の、実施例２９に記載したようにノーマライズした細胞増殖のプロット。ＰＡ−１スフェロイドを、ナノ粒子及び活性化合物を共投与するか（ライトグレーバー）、ナノ粒子を投与し、次いで、２４時間後に、活性化合物で処置するか（ダークグレーバー）のいずれかを行った。未処置のＰＡ−１コントロールのスフェロイドは、２９４％＋／−２１のノーマライズした増殖値を有した。エラーバーは標準誤差を示す。 図１１：ＤＬＤ−１及びＰＡ−１細胞について、最も効果的に共投与されたナノ粒子及び活性の組み合わせ。ＤＬＤ−１スフェロイド（Ａ）及びＰＡ−１スフェロイド（Ｂ）において、活性化合物と共投与した、実施例２、５、１４、２０、２１及び２２に列挙したナノ粒子の実施例２９に記載したようにノーマライズした細胞増殖のプロット。エラーバーは標準誤差を示す。 図１２：ドキソルビシンと、ＮＰ１９又はＮＰ２３ではなくＮＰ２との共投与が、スフェロイド全体に亘るドキソルビシンの拡散を促進する。１μＭドキソルビシン及び示したナノ粒子で処置したスフェロイドにおけるドキソルビシン拡散の共焦点イメージ。スケールバー２００μｍ。 図１３は、本発明に従い使用されうる安定化された球状物質の概略図を示す。 図１４は、本発明に従い使用されうる安定化された球状物質の概略図を示す。 図１５は、安定化された球状物質の流体力学的容積を示す概略図を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、部分的には、特定のタイプの安定化剤により分散された状態に維持されている球状物質が、粒子技術を用いて従来達成されうるよりも、固形腫瘍中へのより深いより効果的な浸透を達成しうることを決定したことに基づいている。これらの球状物質により達成される浸透の性質は、球状物質と共投与される毒素の顕著により広い腫瘍内での細胞分布と、さらに、細胞毒性のより効果的な誘導との両方を達成した。腫瘍の部位からの網内系クリアランスが、正常細胞におけるよりも顕著に効果が弱いので、本発明の方法は、より効果的な腫瘍浸透を可能にするだけではなく、さらに、腫瘍部位に局在化しそれにより濃縮することを可能にする細胞毒素のより低い濃度での送達を可能にする。これは、そのような治療が、患者に許容されうる最も高い用量で、さらに、数ヶ月に亘る複数繰り返されるラウンドに照らして、送達されるであろう場合に、従来の全身的化学療法に照らして、明らかであろう副作用を減少する。この進歩は、今ここに、化学療法の標的化されていない全身送達を介した原発性腫瘍及び転移性疾患の治療から脱却する現実的な手段を提供する。
本明細書における「固形腫瘍」への参照は、被包型若しくは非被包型の腫瘤又は他の増殖形態或いは腫瘍性細胞を含む細胞凝集体への参照として理解されるべきである。「腫瘍性細胞」への参照は、異常な増殖を示す細胞への参照として理解されるべきである。用語「増殖（ｇｒｏｗｔｈ）」は、その最も広義の意味で理解されるべきであり、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）への参照を包含する。この文脈で、句「異常な増殖」は、正常な細胞増殖に比して、細胞分裂速度の増大、細胞分裂数の増加、細胞分裂期間の長さの減少、細胞分裂期の頻度又は制御されない増殖における増大、及びアポトーシスの回避、のうちの１つ以上を示す細胞増殖への参照として意図される。本発明をいずれの方法でも制限するものではないが、用語「新生物（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）」の従来の医学的意味は、正常な増殖制御に対する応答性の欠損として生じる新たな細胞増殖を、例えば、腫瘍性細胞増殖を、参照する。新生物は、良性、前悪性又は悪性のいずれかでありうる「腫瘍」を包含する。用語「新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）」は、病変、腫瘍又は他の被包型若しくは非被包型の腫瘤、他の増殖形態或いは腫瘍性細胞を含む細胞凝集体への参照として理解されるべきである。
用語「新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）」は、本発明の背景において、病理組織学的なタイプ若しくは侵襲性の状態に関係なく、すべてのタイプのガン性増殖又は発ガンプロセス、転移性組織若しくは悪性に形質転換された細胞、組織又は器官への参照を包含することが理解されるべきである。
用語「ガン腫」は、当業者により認識され、呼吸器系ガン腫、消化器官系ガン腫、尿生殖器系ガン腫、精巣ガン腫、乳ガン腫、前立腺ガン腫、内分泌系ガン腫及びメラノーマを包含する、上皮性又は内分泌性の組織の悪性病変を示す。例示的なガン腫としては、胸部の組織から形成されるものが挙げられる。当該用語はまた、ガン肉腫（例えば、それには、ガン性及び肉腫性の組織から構成される悪性腫瘍が包含される。）を包含する。「腺ガン」は、腺組織由来の又はそこで腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する、ガン腫を示す。
新生物を包含する腫瘍性細胞は、任意の組織に由来する任意の細胞タイプ（例えば、上皮性又は非上皮性の細胞）でありうる。本発明により包含される新生物及び腫瘍性細胞の例には、中枢神経系腫瘍、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫及び他の小児腫瘍、頭頸部ガン（例えば、扁平上皮ガン）、乳及び前立腺のガン、肺ガン（小細胞及び非小細胞の肺ガンの両方）、腎ガン（例えば、腎細胞腺ガン）、食道胃ガン、肝細胞ガン、膵胆管新生物（例えば、腺ガン及び膵島細胞腫瘍）、結腸直腸ガン、子宮頸部及び肛門のガン、子宮及び他の生殖器系ガン、尿路ガン（例えば、尿管及び膀胱の）、胚細胞腫瘍（例えば、精巣胚細胞腫瘍又は卵巣胚細胞腫瘍）、卵巣ガン（例えば、卵巣上皮ガン）、未知の原発性のガン腫、ヒト免疫不全関連の悪性腫瘍（例えば、カポジ肉腫）、リンパ腫、悪性メラノーマ、肉腫、内分泌腫瘍（例えば、甲状腺の）、中皮腫及び他の胸膜又は腹膜の腫瘍、神経内分泌腫瘍並びにカルチノイド腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、本発明は、悪性腫瘍性状態、なおより好ましくは転移性腫瘍性状態、の治療に関する。本発明の方法は、任意の新生物の治療に適用されうるが、転移した新生物の治療の点で特に有用であると理解されるだろう。いずれか１つの理論又は作用機序に本発明を限定するものではないが、転移していない原発性腫瘍は、本発明の方法或いは腫瘍の外科的切除又は放射線療法等の従来の治療レジメン、のいずれかにより治療可能である。しかしながら、転移してしまった腫瘍は、転移性小結節のたいていの広範な広がり及び増殖に起因して、これらの従来の治療レジメンのいずれでも治癒できない。したがって、それらの状態は、全身的化学療法の投与により現在は治療可能なのみであり、この治療レジメンは、しばしば、治癒可能性を限定する重篤な副作用を引き起こす。なおさらに、転移していない原発性腫瘍の状況でさえ、化学療法は、未だしばしば、転移性の拡散が生じたがまだ検出可能出ない場合における手術及び放射線後に、推奨される。これは、伝統的に侵襲性として考えられるガン（例えば、乳ガン及び結腸ガン）の状況で、特に一般的な方法である。本発明の方法は、ここで、侵襲性の全身的化学療法治療レジメンの適用に対する代替物を提供する。本発明の細胞毒性剤の全身的投与は、腫瘍にさらに局所化された態様で送達することが可能であり、腫瘍性細胞によりさらに効果的に代謝されるので、細胞毒素のより低い用量の投与を介して、副作用の発生を最小化しうる。
一実施態様では、該固形腫瘍は、良性である。
別の実施態様では、該固形腫瘍は、悪性である。
好ましくは、該悪性固形腫瘍は、転移性悪性固形腫瘍である。「転移性」についての参照は、転移（ｍｅｔａｓｔａｔｉｓａｔｉｏｎ）を生じたか転移を生じうるかのいずれかの腫瘍への参照として理解されるべきである。
一実施態様では、該悪性固形腫瘍は、中枢神経系腫瘍、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、小児腫瘍、頭頸部ガン（例えば、扁平上皮ガン）、乳及び前立腺のガン、肺ガン、腎ガン（例えば、腎細胞腺ガン）、食道胃ガン、肝細胞ガン、膵胆管新生物（例えば、腺ガン及び膵島細胞腫瘍）、結腸直腸ガン、子宮頸ガン、肛門ガン、子宮若しくは他の生殖器系ガン、尿路ガン（例えば、尿管又は膀胱の）、胚細胞腫瘍（例えば、精巣胚細胞腫瘍若しくは卵巣胚細胞腫瘍）、卵巣ガン（例えば、卵巣上皮ガン）、未知の原発性ガン腫、ヒト免疫不全関連の悪性腫瘍（例えば、カポジ肉腫）、リンパ腫、白血病、悪性メラノーマ、肉腫、内分泌腫瘍（例えば、甲状腺の）、中皮腫若しくは他の胸膜又は腹膜の腫瘍、神経内分泌腫瘍又はカルチノイド腫瘍である。
本明細書中上記に詳述したように、本発明の方法は、安定化された球状物質との細胞毒素の共投与に基づく。腫瘍に標的化するために、診断的又な治療的のいずれかの目的で、球状物質（例えば、ナノ粒子）を使用する従来のの試みは、広範なものであったが、治療剤という背景では、最小限の成功である。診断剤の場合、腫瘍中への粒子の比較的浅い浸透が、腫瘍を可視化する目的を達成するのに十分であった。しかしながら、治療剤の送達の点では、そのような浅い浸透は、腫瘍全体に亘って（特に、腫瘍の内部に）、当該剤を効果的に輸送するのには十分ではなかった。治療剤に関しては、特に、広範で種々の異なる物質への粒子の結合が、これまでは、効果的な腫瘍浸透の達成の保証（これは、治療剤が有効性の任意のチャンスを有するために必須要件である）を、満たさなかった。
効果的な治療剤を開発する手段として、腫瘍のｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＲ）効果を利用するための著しい努力がまたなされてきた。本発明をいずれか１つの理論又は作用機序に制限するものではないが、これは、特定のサイズの分子（典型的には、リポソーム又は高分子薬物）が腫瘍組織に選択的に蓄積するという考えに基づき、よく記載されている事象である。この事象についての一般的な説明は、腫瘍細胞が迅速に増殖するために、それらは、血管の産生を刺激しなければならないということである。ＶＥＧＦ及び他の増殖因子は、ガンの血管新生に関与する。１５０〜２００μｍ程度のサイズの腫瘍細胞凝集体が、その栄養学的及び酸素の供給のための新脈管構造により運搬される血液供給に依存するようになる。これらの新たに形成された腫瘍の血管は、通常、形及び構造において、異常である。それらは、広い開窓、平滑筋層の欠如、又はより広い内腔を有する神経支配を有する不十分に整列した不完全な内皮細胞、及び、損なわれたアンジオテンシンＩＩに対する機能的レセプターを含む。さらに、腫瘍組織は、通常、効果的なリンパ排出を欠いている。これらすべての因子が、異常な分子及び流体輸送動力学（特に、高分子薬物の場合）を導く。したがって、固形腫瘍への選択的薬物標的化を達成するための１つの方法は、腫瘍組織への抗ガン剤の能動的で選択的な輸送（特に、固形腫瘍における高分子薬物のＥＰＲ効果を規定する）の点で、腫瘍の脈管構造のこれらの異常を発見することであると考えられている。それらの大きな分子サイズに由来し、静脈内に投与されたナノサイズ化された高分子抗ガン剤は、腎クリアランスを回避する。しばしば、それらは、正常な血管の堅固な内皮の接合部に浸透しえないが、それらは、腫瘍脈管構造において血管外遊出しえ、腫瘍近傍にトラップされるようになる。しかしながら、ＥＰＲ効果は、効果的に又はうまく利用されてきていない。
効果的な細胞性エンドサイトーシスを達成するために指向する様々なナノ粒子が設計されてきた。しかしながら、これがたとえ達成可能であったとしても、組織浸透の組織は、今日まで、うまく克服されていないまだ別々のものである。薬物を送達するためのベクターとしてのナノ粒子の使用の一般的な考えは、広く文献で議論されているが、深い腫瘍浸透は達成されておらず、価値は限られている。
薬物の効果的腫瘍分布が（何らかの方法により）達成される場合でさえ、さらなる問題は、固形腫瘍内の腫瘍性細胞は、遅延した代謝を示しうるという事実である。これは、これらの細胞への細胞毒性薬物が浸透した場合でさえ、効果的に代謝されない場合、腫瘍の生存率への限られた影響を有することを意味する。
本発明をいずれか１つの理論又は作用機序に限定するものではないが、本発明の方法は、その治療的結果を、球状物質による腫瘍の深い浸透（それによりこれが同時又は逐次的な細胞毒素による浸透を可能にする）、及び、細胞死を達成するための毒素の効果的な代謝を可能にすること、の両方により、その治療的結果を達成すると考えられる。さらに本発明をいずれの方法でも制限するものではないが、これは、遅延するか休止させる細胞性代謝をアップレギュレートするように作用する、それらの設計による、本明細書中に規定した球状物質に起因しうるものと考えられる。
本発明の細胞毒素は、細胞増殖を遅延させるか細胞死を誘導するかのいずれか（例えば、細胞を直接死滅されることによってか、又は、アポトーシスを誘導するシグナルを伝達するかのいずれかによって）を起こす、任意のタンパク質性の若しくは非タンパク質性の分子又は分子群として理解されるべきである。すなわち、当該剤は、細胞分裂阻害性又は細胞破壊性のいずれかでありうる。本発明の方法が、１つの細胞毒素又は複数の細胞毒素（すなわち、薬物の「カクテル」）を送達するために設計されうることが、当業者により理解されるだろう。どのように進めるのが最善かに関する決定は、慣用の手順の問題として、当業者によりなされるだろう。例えば、腫瘍タイプに依存して、特定の特異的薬物又は薬物の組み合わせが、特に使用するのに望ましいと考えられる。細胞毒性薬剤の特性及び使用に関する知識体系は、広範であり、当業者が、慣用の手順の問題として、本発明のパラメーターを満たす投与プロトコールを設計しうることが、理解されるだろう。
本明細書において「細胞毒素」への参照は、したがって、細胞を傷害するか破壊するように作用する任意の剤への参照として理解されるべきである。本発明をいずれか１つの理論又は作用機序に限定するものではないが、多くのそのような剤は、アポトーシスプロセスの誘導を介して、機能する。しかしながら、これは、そのような剤が機能する唯一のメカニズムではなく、対象の傷害又は細胞死は、いくらか他のメカニズムにより誘導されうることが考えられうる。細胞毒性剤の例には、アクチノマイシンＤ、アドリアマイシン、三酸化ヒ素、アルパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトサール、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルチコステロイド、カリケアミシン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビナ（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎａ）、ゲムシタビン、ジェムザール、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン（Ｍｅｒｃａｐｔｏｍｕｒｉｎｅ）、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、プラチノール（Ｐｌａｔｉｎｏｌ）、プラチネックス（Ｐｌａｔｉｎｅｘ）、プロカルビジン（Ｐｒｏｃａｒｂｉｚｉｎｅ）、ラルチトレキセド（Ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｅｌ）、リキシン、ステロイド、ストレプトゾトシン、タキソール、タキソテール、チオグアニン、チオテパ、トムデックス、トポテカン、トレオスルファン、三水和物、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎａ）、ビノレルビン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｓｉｎ）、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｓｉｎ）、マホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソウレア、マイトマイシンＣ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、アムサクリン、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｄｉｌ）、メチルシクロヘキシルニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシパーオキシシクロホスホルアミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、コルヒチン、トリメトレキサート、テニポシド、ジエチルスチルベストロールが挙げられるが、これらに限定されない。
しかしながら、「細胞毒素」への参照は、細胞毒性剤として伝統的には考えられていないかもしれないが、しかしながら、それが細胞の損傷を誘導することに基づき、本定義の範囲内に入る、任意の他の分子にまで及ぶものとして理解されるべきである（例えば、ヌクレオフォスミン等のＤＮＡ損傷、又は、別の剤との相乗的プロセスの一部として細胞傷害を誘導する剤）。例には、触媒抗体、プロドラッグ、ＣＨＫ１／２インヒビター（例えば、ＣＢＰ−５０１又はＡＺＤ７７６２）、ヒストンデアセチラーゼインヒビター（例えば、ボリノスタット）、腫瘍壊死因子関連のアポトーシス誘導リガンド若しくはＢＨ３ミメティック（例えば、ＡＢＴ７３７）、小分子インヒビター（例えば、チロシンキナーゼインヒビターである、メシル酸イマチニブ（Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標））、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））及びエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）））、並びにモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（例えば、リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））及びトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）））が挙げられる。
さらに別の実施態様では、組み合わせ治療は、例えば、ＣＨＫ１／２インヒビターとともにゲムシタビン、又はＣＨＫ１／２インヒビターとともにイリノテカンを包含しうる。
なおさらなる実施態様では、細胞毒素は、ＲＮＡ干渉のメカニズムとして機能する分子でありうる。本発明をいずれか１つの理論又は作用機序に限定するものではないが、「ＲＮＡ干渉」は、配列特異的な様式でｍＲＮＡの翻訳を劣化させるか又は阻止することに基づく遺伝子サイレンシングのメカニズムを広く記載している。この技術を、選択的に遺伝子発現をノックダウンさせるために適用する点で、ノックダウンしようとする遺伝子に特異的な外来性の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、細胞内環境に導入されうる。一旦、ｄｓＲＮＡが細胞内に入ると、それは、ＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素（ダイサー）により、２つのヌクレオチドオーバーハングを３’末端に含む二本鎖の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）２１〜２３ヌクレオチド長に切断される。ＡＴＰ依存工程では、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られているマルチサブユニットのタンパク質複合体に組み込まれ、これは、ｓｉＲＮＡを標的ＲＮＡ配列に導く。巻き戻されたｓｉＲＮＡ及びアンチセンス鎖は、ＲＩＳＣに結合されたままで、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼの組み合わせによる、相補的標的ｍＲＮＡ配列の分解を方向付ける。しかしながら、ＲＮＡｉメカニズムは、高等真核生物における微生物防御機構としてのその役割に照らして、元々同定された一方で、ＲＮＡｉに基づく遺伝子発現のノックダウンはまた、内因性の遺伝子発現を調節するためのメカニズムとして機能しうることも知られている。特に、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、典型的には２０〜２５ヌクレオチドである内因性の一本鎖ＲＮＡの形態であり、ＤＮＡから内因的に転写されるが、タンパク質には翻訳されない。ｍｉＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、一般的には、ｍｉＲＮＡ配列及び適切な逆相補鎖を含む。このＤＮＡ配列が、一本鎖ＲＮＡ分子に転写される場合、ｍｉＲＮＡ配列及びその逆相補鎖塩基は対になり、二本鎖ＲＮＡヘアピンループ（これは、プライマリｍｉＲＮＡ構造（プリｍｉＲＮＡ）を形成する）を形成する。核酸酵素は、該ヘアピンの塩基を切断して、プレｍｉＲＮＡを形成する。該プレｍｉＲＮＡ分子は、次いで、核から細胞質へと能動的に輸送され、そこで、ダイサー酵素は、該ヘアピンの塩基から、２０〜２５ヌクレオチドを切断して、成熟ｍｉＲＮＡを遊離する。
上で詳述したＲＮＡ干渉メカニズムの両方が、選択的に遺伝子発現をノックダウンして、効果的に同じ結果を達成するが、外因的に投与したｄｓＲＮＡの使用に基づくＲＮＡｉは、一般的に、ｍＲＮＡ分解を生じるが、一方、ｍｉＲＮＡの作用に基づくＲＮＡｉは、一般的に、ｍＲＮＡ分解を含まないメカニズムにより、翻訳抑制を生じる。本発明の背景において意図されるＲＮＡ干渉は、これらＲＮＡｉ遺伝子ノックダウンメカニズムの両方への参照を包含することが理解されるべきである。ノックダウンメカニズムに基づくこのｍｉＲＮＡの誘導は、本発明の方法に従って、ｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡまたはプリｍｉＲＮＡ分子と同じ配列の外因性ＲＮＡオリゴヌクレオチドを投与することによって、達成されうるであろう。しかしながら、これらの外因性ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ分解（外因性ｓｉＲＮＡ集団を導入した際に観察されるものと類似の）、又はｍＲＮＡ翻訳抑制（これは、それにより内因性ｍｉＲＮＡ分子が機能するメカニズムと類似する。）のいずれかを導きうると理解されるべきである。本発明の目的の点で、いずれの遺伝子ノックダウンメカニズムの発生も許容可能である。
本明細書において論ずるＲＮＡ干渉メカニズムは、ＲＮＡ干渉メカニズムを誘導しうるＲＮＡオリゴヌクレオチドの使用を介して達成される。したがって、「ＲＮＡオリゴヌクレオチド」への参照は、二本鎖又は一本鎖であり、そして、標的化した遺伝子の発現をノックダウンするように指向されたＲＮＡ干渉メカニズムの誘導に影響を与えるか、或いは、そのようなメカニズムの発生をダウンレギュレートするか防止することのいずれかが可能な、ＲＮＡ核酸分子への参照として理解されるべきである。この点で、対象オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉メカニズムを直接調節可能でありうるか、或いは、それは、ヘアピン領域の切除を必要とするヘアピン二本鎖ＲＮＡ、ダイサーによる切断を必要とする長鎖二本鎖ＲＮＡ分子、又は、切断を同様に必要とするプレｍｉＲＮＡ等の前駆体分子に特有のような、さらなるプロセシングを必要としうる。対象オリゴヌクレオチドは、二本鎖（典型的には、ＲＮＡ干渉に影響するという関連でそのまま）又は一本鎖（内因性に発現された遺伝子に結合するのに適したＲＮＡオリゴヌクレオチドを産生するためのみに探求される場合がありうる）でありうる。本発明の背景において使用するのに適したＲＮＡオリゴヌクレオチドの例には以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（ｉ） 長鎖二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）−これらは、一般的に、それら自身のベクターによりお互い別々に転写されるセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖のハイブリダイゼーションの結果として産生される。そのような二本鎖分子は、ヘアピンループにより特徴付けられない。これらの分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖を生成するために、ダイサー等の酵素により切断されることを必要とする。この切断事象は、好ましくは、ｄｓＲＮＡが転写される細胞中で起きる。
（ｉｉ） ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）−これらの分子は、ステムループ配置を示し、一般的に、核酸スペーサー領域（例えば、イントロン）により分離されている逆方向反復配列を有する構築物の転写の結果である。これらの分子は、一般的に、ｓｉＲＮＡを生成するために、切除されるべきヘアピンループ及びダイサーにより切断されるべき残りの直鎖二本鎖分子の両方を必要とする長鎖ＲＮＡ分子である。このタイプの分子は、単一ベクターにより発現可能であるという利点を有する。
（ｉｉｉ） 低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）−これらは、合成的に生成されうるか、又は、その自身のプロモーター及び４〜５チミジン転写終結部位によりそれぞれ特徴付けられるタンデムセンス及びアンチセンス鎖を含むベクターの発現に基づくプロモーターにより、組換えで発現されうる。これは、逐次的にアニールする２つの別々の転写物の産生を可能にする。これらの転写は、一般的に、２０〜２５ヌクレオチド長のオーダーである。したがって、これらの分子は、ＲＮＡｉ経路におけるこれらの官能性を可能にするさらなる切断は必要としない。
（ｉｖ） 低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）−これらの分子もまた、「低分子ヘアピンＲＮＡ」として知られており、それらがｓｉＲＮＡ分子と類似の長さである２０〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子の逆方向反復配列を含むベクターから発現される点を除いて、ｓｉＲＮＡ分子と同様の長さである。逆方向反復配列は、ヌクレオチドスペーサーで分離されている。ヘアピン（ループ）領域の切断後に、官能性ｓｉＲＮＡ分子が生成する。
（ｖ） マイクロＲＮＡ／小分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ／ｓｔＲＮＡ）−ｍｉＲＮＡ及びｓｔＲＮＡは、一般的に、天然の内因的に発現された分子を示すことが理解される。したがって、ｍｉＲＮＡの活性を模倣することを意図された分子の設計及び投与は、合成的に生成された又は組換えで発現されたｓｉＲＮＡ分子の形態を取るが、しかしながら、本発明の方法は、本質的に同一のＲＮＡ配列及び全体構造を示すとの理由から、ｍｉＲＮＡ、プリｍｉＲＮＡ又はプレｍｉＲＮＡ分子を模倣することを意図されたオリゴヌクレオチドの設計及び発現にまで及ぶ。そのように組換えにより生成された分子は、ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡのいずれかとして参照されうる。
（ｖｉ） 空間的な発生（ｓｐａｔｉａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）（ｓｄＲＮＡ）、ストレス応答（ｓｒＲＮＡ）又は細胞周期（ｃｃＲＮＡｓ）を媒介するｍｉＲＮＡ。
（ｖｉｉ） 内因的に発現されたｍｉＲＮＡ又はｓｔＲＮＡ或いは外因的に誘導されたｓｉＲＮＡ機能をハイブリダイズ及び防止するように設計されたＲＮＡオリゴヌクレオチド。これらの分子は、ＲＮＡ干渉メカニズムを引き起こすように設計されたものではなく、むしろ、細胞内環境に存在するｍｉＲＮＡ及び／又はｓｉＲＮＡ分子によるこの経路のアップレギュレーションを防止するように設計されたものと理解されるだろう。それらがハイブリダイズするｍｉＲＮＡに対するそれらの影響の点で、これは、より古典的なアンチセンス阻害を反映している。
任意の所定の状況で使用するために最も適したＲＮＡオリゴヌクレオチドを当業者は決定しうると理解される。例えば、対象オリゴヌクレオチドが、その標的核酸分子と１００％の相補性を示すことが好ましいが、しかしながら、該オリゴヌクレオチドは、配列特異的様式でＲＮＡ干渉応答を誘導するのに十分なハイブリダイゼーションが可能なまでの、ある程度のミスマッチを示しうる。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも７０％の配列相補性、より好ましくは少なくとも９０％の相補性、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列相補性を含むことが好ましい。
本発明で使用するのに適切なオリゴヌクレオチドの設計に関する別の例では、対象オリゴヌクレオチドの特定の構造及び長さ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ヘアピンｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、プリｍｉＲＮＡなどの形態をとるかどうか）を決定するのは、当業者の技術の範囲内である。例えば、ステムループＲＮＡ構造（例えば、ヘアピンｄｓＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ）は、例えば、センス及びアンチセンスのＲＮＡ鎖を別々にコードする２つのコンストラクトを利用して生成される二本鎖ＤＮＡよりも、遺伝子ノックダウンを達成する点で、より効率的であることが、一般的に理解される。なおさらに、介在するスペーサー領域の性質及び長さは、所定のステムループＲＮＡ分子の機能性に影響を与えうる。なおさらに別の例では、長鎖ｄｓＲＮＡ（これは、ダイサー等の酵素による切断を必要とする。）、又は短鎖ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）の選択は、特定の細胞環境に照らして、インターフェロン応答が生じうるリスクがある場合に（これは、短鎖ｄｓＲＮＡ分子を使用する場合よりも、長鎖ｄｓＲＮＡを使用する場合により顕著なリスクである。）、関連がありうる。なおさらに別の例では、使用されるのに必要な一本鎖又は二本鎖の核酸分子もまた、求める機能的結果に依存する。例えば、内因的に発現されたｍｉＲＮＡをアンチセンス分子を用いて標的化する程度まで、対象ｍｉＲＮＡに特異的にハイブリダイズするのに適した一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計することが、一般的に妥当であるだろう。しかしながら、ＲＮＡ干渉を誘導することを求める程度までは、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を必要とする。これは、更なる切断を受ける長鎖ｄｓＲＮＡ分子又はｓｉＲＮＡとして設計されうる。なおさらに、本発明は、好ましくは、最終エフェクターである、好ましくは３０未満のヌクレオチド長、より好ましくは１５〜２５ヌクレオチド長及び最も好ましくは１９、２０、２１、２２又は２３ヌクレオチド長であるＲＮＡオリゴヌクレオチド（すなわち、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ分子）の生成が得られるように設計される。
本発明に従い安定化された球状物質は、有利には、低濃度で分散された状態に維持されうる。分子レベル（例えば、その組成及び分子量）における安定化剤の設計を調整するための能力に加えて、球状物質が、比較的低濃度で多種多様な液体キャリア（体液を含む）中で分散されたままでいる能力は、理論により制限されることを望まないが、固形腫瘍の深い浸透を球状物質に達成可能にさせる役割を担いうる。
本明細書において使用される表現「球状物質」は、液体キャリア全体に分散しえ、そして、そこに安定化剤が会合されうる表面を呈する、物質を包含することを意図する。
球状物質は、一般的に、約５００ｎｍ未満、約３５０ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約２５ｎｍ未満又は約１５ｎｍ未満であるサイズを有する。
一実施態様では、該球状物質は、約２、４、６、８、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００ｎｍである。
液体キャリア全体に分散される能力を有することによって、分散物が効果的適用を有することが可能になるように、球状物質が、液体キャリア中で十分に不溶性であることが理解される。
球状物質は、一次粒子の形態でありうるし、一次粒子の形態又は凝集体の形態でもありうる。
何らの疑義をも避けるために、本明細書における球状物質の「サイズ」への参照は、所定の粒子の最も大きな寸法に基づく粒子の平均サイズ（少なくとも約５０数％（ｎｕｍｂｅｒ ％）を示すことが意図される。球状物質自体のサイズは、本明細書中、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により決定される。
何らの疑義をも避けるために、球状物質が一次粒子の凝集体の形状である場合、そのような物質のサイズへの参照は、凝集体を形成する一次粒子ではなく、凝集体の最も大きな寸法への参照を意図される。
本出願の背景において医薬品実用性を有することは別として、球状物質の組成に何ら特段の制限はない。球状物質は、有機組成物又は無機組成物或いはそれらの組み合わせを有しうる。球状物質は、無機、有機又はそれらの組み合わせでありうる。
球状物質の例には、１つ以上の、金属、金属合金、金属塩、金属錯体、金属酸化物、無機酸化物、放射活性アイソトープ、ポリマー粒子、及び／又はそれらの組み合わせが挙げられる。
球状物質のより具体的な例には、金、銀、ホウ素、及びそれらの塩、錯体又は酸化物、炭酸カルシウム、硫酸バリウム、酸化鉄、酸化クロム、酸化コバルト、酸化マンガン、酸化ケイ素、鉄オキシ水酸化物、クロムオキシ水酸化物、コバルトオキシ水酸化物、マンガンオキシ水酸化物、二酸化クロム、他の遷移金属酸化物、ポリスチレン、ポリ（メチルメタクリレート）及びポリ（ブタジエン）等のポリマーが挙げられる。
本発明のいくつかの実施態様では、球状物質が磁性であることが好ましい。本発明に従い使用されうる磁性球状物質は、一般的に、約３５０ｎｍ未満のサイズのものである。当業者は、粒子の組成及び／又はサイズが、それらの磁性特性に影響しうることを理解する。磁性球状物質は、一般的に、強磁性、フェリ磁性又は超常磁性の特性を示す。
使用される磁性球状物質の具体的サイズは、一般的に、組成物の意図する用途により決定される。いくつかの適用には、磁性球状物質は、約３００ｎｍ未満、例えば、約１００ｎｍ未満、又は約５０ｎｍ未満のサイズであることが望ましくありうる。
本発明に従い使用されうる磁性球状物質のタイプに特段の限定はない。適切な磁性物質の例には、鉄、ニッケル、クロム、コバルト、それらの酸化物又はこれらのいずれかの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい酸化鉄磁性球状物質には、γ−イオン酸化物（すなわち、γ−Ｆｅ２Ｏ３（磁赤鉄鉱としても知られている。）及びマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）が挙げられる。
いくつかの適用では、超常磁性である磁性物質（すなわち、ナノ−超常磁性粒子）を使用することが望ましくありうる。本明細書中で使用される用語「超常磁性」は、以下の特性を有さない磁性粒子を意味することが意図される：（ｉ）飽和保磁力、（ｉｉ）残留磁気、又は（ｉｉｉ）適用する磁界の変化速度が準静的なものである場合のヒステレシスループ。
磁性物質は、好ましくは、一般式ＭＯ．Ｆｅ２Ｏ３〔ここで、Ｍは、二価の金属（例えば、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｂａ、Ｓｒ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｐｔ又はそれらの混合物）である〕のフェライト、或いは、一般式ＭＯ．６Ｆｅ２Ｏ３〔ここで、Ｍは、大きな二価のイオン、金属の鉄、コバルト又はニッケルである〕のマグネトプランバイト型酸化物から選択される。さらに、それらは、純粋なＦｅ、Ｎｉ、Ｃｒ若しくはＣｏ又はこれらの酸化物の粒子でありうるだろう。あるいは、それらは、これらのいずれかの混合物でありうるだろう。
一実施態様では、磁性球状物質は、好ましくは５０ｎｍ未満、例えば２と４０ｎｍとの間の、粒子サイズを有する、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）又は磁赤鉄鉱（γ−Ｆｅ２Ｏ３）等の酸化鉄であるか又はこれを含む。
本発明に従い使用される球状物質は、当該分野で公知の技術を用いて、都合よく調製されうる。
本発明に従い、球状物質は、安定化剤により分散された状態で維持される。この文脈における「維持される」により、安定化剤の非存在下では、さもないと、球状物質は、液体キャリアから、堆積物として、凝結又は沈殿するであろうことを意味する。換言すれば、安定化剤は、球状物質を分散された状態に維持するように機能する。
球状物質は、液体キャリア内で分散物の形態であり、球状物質は、安定化剤により分散された状態に維持されている。「安定化剤」により、球状物質と会合し、そして、それが、液体キャリア内で、凝結するかそうでなければ分散されなくなるのを防止するのを補助する剤が意味される。
本発明に従い使用される安定化剤は、（ａ）安定化剤を球状物質に固定し（ｂ）安定化剤の残部とは異なる、固定部位を含む。
「固定部位」により、安定化剤を球状物質に固定するように機能する、原子又は共有結合した原子群等の部分が意味される。
安定化剤を球状物質に「固定する」固定部位により、固定部位自体が、安定化剤を球状物質に直接つなぎ止めるか又は結合することが意味される。
したがって、固定部位は、安定化剤を球状物質に結合する。
安定化剤を球状物質に固定する方法に、何ら特段の制限は存在しない。例えば、それは、球状物質に共有結合した及び／又は静電力、水素結合、イオン電荷、ファンデルワールス力、又はこれらのいずれかの組み合わせを介して、球状物質に固定されうる。
安定化剤は、立体反発、電気立体反発（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔｅｒｉｃ ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ）及び／又は静電反発等の公知のメカニズムを介して、球状物質が、液体キャリア内で凝結するかそうでなければ分散されなくなる（すなわち、凝集される）ことを防止するように機能する。
理論により限定されることを望まないが、本発明に従う安定化剤の使用は、（ｉ）固形腫瘍の部位にインビボで球状物質を輸送すること及び／又は（ｉｉ）球状物質を固形腫瘍全体に亘り浸透させること及び／又は（ｉｉｉ）そうでなければ有効量の細胞毒素を集積しないであろう腫瘍内の細胞の亜集団によりアップテークすること、を促進すると考えられる。
１つ以上の安定化剤が、本発明に従い使用されうる。
固定部位が安定化剤の残部とは「異なる」ことにより、固定部位が、安定化剤の残部に対して、異なる構造又は分子組成を有することが意味される。換言すれば、安定化剤は、安定化する部分（すなわち、安定化する部位として機能する部分）及び固定部位（すなわち、安定化剤を球状物質につなぎ止めるか又は結合するように機能する部分）を有する。安定化する部分及び固定部位は異なる。
安定化する及び固定する機能を生じる異なる構造的特徴を有する安定化剤を提供することによって、両方の機能の実際の効果が向上されうることが見出された。理論により制限されることを望むものではないが、球状物質と安定化剤（固定部位により提供される）との間の強い会合は、専用の安定化部分とともに、非常に低濃度で多種多様な液体キャリアの全体に亘って、球状物質を分散された状態に維持することを可能にすると考えられる。そのような特性は、体液内への投与の後に、分散された状態で維持されるのに、球状物質を非常に適しているものとする。
特有の固定部位を有する安定化剤が、そのような特有の固定部位を有さない安定化剤とは、異なって機能しうることを、当業者は理解する。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の安定化剤は、球状物質の表面に吸着し、安定化剤として機能しうる。その場合、ＰＥＧ鎖の任意の部位（単数又は複数）（これは、安定化剤の残部とは異なる固定部位を有していない）が、均一でない表面安定化層を生じるランダムな様式で吸着する。
対して、安定化部位及び異なる固定部位の配置を有する安定化剤を提供することによって、より制御され均一な表面の安定化層が、有利に形成されうる。例えば、特有の固定部位の存在は、球状物質の表面上で、ブラシ安定化層（ｂｒｕｓｈ ｓｔａｂｉｌｉｓｉｎｇ ｌａｙｅｒ）を促進し、そこで、固定部位は、球状物質の表面に固定され、安定化剤の残部（すなわち、安定化部位）は、ブラシの表面から広がる剛毛と同様に、球状物質の表面から液体キャリア中に広がる（故に、名称「ブラシ」安定化層）。適切なケースとして、上で示唆したＰＥＧ安定化剤は、固定部位を提供するように、ＰＥＧ鎖末端の１つ以上のカルボン酸基により官能化されうるだろう。酸官能化固定部位（これは、安定化剤の残部とは異なる。）は、次いで、ＰＥＧ鎖を球状物質に固定又は結合しえ、それが、キャリア液体中に自由に広がるのを許容する。
適切な安定化剤は、非イオン性、アニオン性、カチオン性、又は双性イオン性でありうる。
一実施態様では、球状物質は、立体安定化剤により分散された状態に維持されており、ここで、該立体安定化剤は、立体安定化するポリマーセグメント及び固定部位を含み、ここで、該立体安定化するポリマーセグメントは、該固定部位とは異なり、ここで、該固定部位は、該安定化剤を該球状物質に結合する。
上で概説したのと同様にして、立体安定化するポリマーセグメントは、液体キャリア内で球状物質を安定化するように機能し、固定部位は、安定化剤を球状物質に固定するように機能する。立体的安定化及び固定機能を生じる異なる構造的特徴を有する安定化剤を提供することによって、両方の機能の実質的な効果が増強されうることが見出された。
適切な安定化剤の例には、ポリマー性の安定化セグメントを有するものが挙げられるが、それらに限定されない。
安定化セグメントは、液体キャリアに可溶性である。
一実施態様では、ポリマー性の安定化セグメントは、ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド、ポリジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリビニルピロリドン、及びこれらのコポリマーから選択されるポリマーを包含する。
別の実施態様では、固定部位は、１つ以上のカルボン酸基、１つ以上のリン酸基、１つ以上のホスホン酸基、１つ以上のホスフィン酸基、１つ以上のチオール基、１つ以上のチオカルボニルチオ基、１つ以上のスルホン酸基、１つ以上のエトキシシリル基、及びそれらの組み合わせを包含する。
一実施態様では、固定部位が、固定するポリマーセグメントであり、重合された残基１つ以上のエチレン系不飽和モノマーを含む少なくとも１つの立体的安定化及び固定するポリマーセグメントである。少なくとも１つのそのようなポリマーセグメントを採用することは、立体安定化剤の安定化特性を向上させると考えられる。
一実施態様では、固定部位は、固定するポリマーセグメントであり、少なくとも１つの立体安定化及び固定するポリマーセグメントは、リビング重合技術（ｌｉｖｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）により重合された１つ以上のエチレン系不飽和モノマーに由来する。少なくとも１つのそのようなポリマーセグメントを採用することは、立体安定化剤の安定化特性を向上させると考えられる。
「立体」安定化剤であることによって、液体キャリア全体に亘る球状物質の安定化が、立体反発力の結果として生じる。これを言えるので、立体安定化剤は、球状物質の安定化も助ける静電反発力を示しうる。したがって、本発明に従って使用される安定化剤の立体安定化機能は、球状物質を、様々な種類の液体キャリア（体液を含む）全体に亘って分散された状態に維持することを可能にするのに、重要な役割を果たす。
一実施態様では、本発明に従い使用される安定化剤は、固定部位の部分を形成せず、キャリア液体内で、カチオン性又はアニオン性の電荷を示すイオン性官能基を含む。そのようなイオン性官能基（単数又は複数）（例えば、アミン又はカルボン酸）を含む安定化剤は、使用される安定化剤の全ｗｔ％に対して、約２ｗｔ％から約５０ｗｔ％までの、又は約５ｗｔ％から約４０ｗｔ％までの範囲に亘る量で存在しうる。このタイプの安定化剤の使用は、電気立体的安定化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔｅｒｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ）を提供する。そのような安定化剤の存在は、驚くべきことに、球状物質の浸透を向上することが見出された。
一実施態様では、安定化剤は、末端（すなわち、ポリマーセグメント又は鎖の末端に）官能基を有する立体安定化するポリマーセグメントを含む。官能基は、イオン性官能基（例えば、カチオン（例えば、アミン）又はアニオン（カルボン酸）を提供しうるもの）でありうる。一実施態様では、イオン性官能基は、カチオンを提供する。
さらなる実施態様では、安定化剤は、アミン、カルボン酸及びアルコールから選択される末端官能基を有する立体安定化するポリマーセグメントを含む。
球状物質に対して、使用される安定化剤の量は、球状物質の性質（特に、そのサイズ）に依存して変化する。例えば、５ｎｍの球状物質１ｇは、その増大した表面積に起因して、１ミクロンの球状物質１ｇより多くの安定化剤を必要とする。当業者は、所定の球状物質について必要な安定化剤の量を決定しうる。
いずれの疑義も回避するために、本明細書中での「安定化剤」の特定の特徴への参照は、本発明に従い使用されることが意図される安定化剤のすべての形態を包含することが意図される（すなわち、安定化剤が、安定化剤の残部とは異なる固定部位を含む場合、又は、安定化剤が、立体安定化するポリマーセグメント及び固定部位を含む立体安定化剤であり、ここで、該立体安定化するポリマーセグメントが該固定部位とは異なる場合）。
一実施態様では、本発明に従い使用される安定化剤は、ポリマー性構造を含む。安定化剤の分子量に特段の制限は存在せず、安定化剤のこの特徴は、分散物が対象に投与されるべき態様に、部分的には決定づけられうる。安定化剤は、例えば、約１６０，０００までの、又は約１５０，０００までの、又は約１００，０００までの、又は約５０，０００までの、数平均分子量を有しうる。
一実施態様では、本発明に従い使用される安定化剤は、球状物質を安定化するために従来使用される安定化剤に比べて、比較的低い数平均分子量を有する。
本発明のいくつかの実施態様では、安定化剤の数平均分子量は、約３０，０００未満、又は約２０，０００未満、又は約１０，０００未満、又は約５，０００未満でさえあることが好ましくありうる。安定化剤の数平均分子量はまた、約１，０００から約３，０００までの範囲でありうる。
非常に低い数平均分子量（例えば、約５，０００未満、好ましくは約１，０００から約３，０００までの範囲の）を有する本発明に従い使用される安定化剤は、インビボで球状物質を安定化するのに特に効果的であることが見出された。
本明細書中で参照する分子量の値は、数平均分子量の値（Ｍｎ）である。適切である場合、分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて決定されるだろう。ＧＰＣは、疎水性ポリマーについてはポリスチレン標準を、親水性ポリマーについてはポリエチレンオキサイド標準を使用して、行われうる。
当業者は、ブロックコポリマーについての分子量の決定は、さらなる手順を必要としうることを理解する。例えば、第２のブロックが加えられる前に、第１のブロックの分子量を決定するのが有用でありうる。ブロックが、約３０００未満の分子量である場合、これは、エレクトロスプレー質量分析（ＥＭＳ）により決定されうる。より大きな分子量のブロックについては、疎水性ブロックについてはポリスチレン標準を、親水性ブロックについてはポリエチレンオキサイド標準を使用して、ＧＰＣが採用されうる。
全体のブロックコポリマーの分子量を決定することは、典型的には、２つのブロックの長さ及びその溶解度特性に依存する。低分子量のブロックコポリマーの分子量は、上で示唆したようなＥＭＳにより決定されうる。適切な溶媒及び標準が見出されうるより高い分子量のブロックコポリマーについては、ＧＰＣが使用されうる。例えば、両方のブロックが疎水性であり、例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解可能な場合、ＧＰＣは、ポリスチレン標準に対して行われうる。両方のブロックが親水性であり、例えば、ＴＨＦに溶解可能である場合、ポリスチレン標準よりむしろ、ポリエチレンオキサイド標準を使用することが有用でありうる。しかしながら、ブロックコポリマーのブロックが非常に類似しておらず、共通の溶解溶媒を準備できないことがありうる（ポリアクリルアミド−ｂ−ポリスチレンが、そのようなブロックコポリマーの例である。）。その場合、第１のブロックを調製しキャラクタライズし、次いで、第２のブロックを伸長し、第２のブロックの分子量を、モノマーがポリマーに変換した程度に基づいて、計算することが、一般的に必要である。
本発明に従い使用される安定化剤は、球状物質の安定化が、液体キャリア内の球状物質の低い濃度と高い濃度の両方で達成されうるという点で、非常に効果的な安定化特性を、有利に示しうる。安定化剤はまた、多種多様な液体キャリア（例えば、高いイオン強度を有するもの（例えば０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液、及び室温での飽和ＮａＣｌ溶液における高さまで）並びにまた広いｐＨ範囲を有するもの）の全体に亘る球状物質の安定な分散を提供しうる。そのような特性は、分散物をインビボ適用に特に適切にする。
理論により制限されることを望まないが、安定化剤により提供されうる高い効果的な安定化特性は、少なくとも一部は、安定化部位と分離しておりそれとは異なり、そして、安定化剤を球状物質にしっかりと固定する固定部位を含む安定化剤に由来すると考えられる。
安定化剤が球状物質に「固定され」、又はここで、固定部位は安定化剤を球状物質に「固定する」との参照により、液体キャリアが高いイオン強度を有する場合（例えば、飽和塩化ナトリウム水溶液）及び／又は液体キャリアが低いイオン強度を有する場合（例えば、純水）に、安定化剤が液体キャリア内で球状物質にしっかりと付着しており、液体キャリア中の遊離の安定化剤がなくても、そのように付着したままでありうることを意味する。
安定化剤を球状物質に固定することは、固定部位が（１）球状物質に共有結合される及び／又は（２）静電力、水素結合、イオン電荷、ファンデルワールス力、又はこれらの任意の組み合わせを介して、球状物質にしっかり固定される結果として、達成されうる。
安定化剤が特定の物質に固定される結果として、それが低い又は高い濃度で存在し及び／又は液体キャリアが低い又は高いイオン強度を有するにも関わらず、球状物質は、液体キャリア内で分散された状態で維持されうる。
したがって、本発明に従う液体キャリア中の球状物質の分散は、従来の安定化された球状物質が不安定であろう（例えば、凝結するであろう）条件下、有利に安定でありうる（すなわち、凝結しない）。
当業者は、球状物質に共有結合していない安定化剤が、球状物質に吸着及び球状物質から脱離する平衡状態で存在することによって、分散された状態に球状物質を、一般的に、安定化し、維持することを理解するだろう。したがって、安定化剤が所定の液体キャリア中に比較的低い濃度で存在する場合、平衡は、一般的に、安定化剤が球状物質から脱離する方にシフトし、これは、次いで、球状物質の凝結を生じる。
球状物質に共有結合された安定化剤により固定が生じる場合、もちろん、安定化剤の脱離はないだろう。他の手段により固定が生じる場合、本発明に従い使用される安定化剤は、やはり、球状物質にしっかりと付着され、したがって、液体キャリア内に低濃度で存在する場合でさえ、球状物質からの脱離を受けることはほとんどない。換言すれば、液体キャリア内に低濃度で存在する場合、本発明に従い使用される吸着された安定化剤の平衡は、安定化剤が球状物質に吸着し、それは、次いで、球状物質を分散された状態に維持するのを促すことを強く支持する。
本発明に従い使用される安定化剤の固定特性（これは、次いで、球状物質を要求される分散された状態に維持する能力も反映しうる。）を確認するために便利な試験は、立体的に安定化された球状物質を、適切な液体キャリア（典型的には、水）を用いて１％の固体に希釈し、この溶液を遠心分離し、それにより、固体はプラグを形成し、次いで、上澄の液体を除去して、固体プラグを単離することによって、実行されうる。次いで、固体プラグは、さらなる安定化剤を添加することなしに、１％の固体を再び形成するために、適切な液体キャリア（典型的には、水）と組み合わされる。次いで、得られた溶液に、１０重量％の塩化ナトリウムが得られるように塩化ナトリウムを添加する。球状物質がこの最終溶液に再分散されえ、少なくとも１時間分散された状態のままであると、立体安定化剤は、球状物質に固定されていると見なされる。
「立体安定化するポリマーセグメント」により、ポリマー性であり（すなわち、少なくとも１タイプのモノマーの重合により形成される。）、立体安定化剤の立体安定化機能を提供する、立体安定化剤のセグメント又は領域が意味される。便宜上、立体安定化するポリマーセグメントは、以後、ポリマーセグメント「Ａ」として示されうる。
示唆したように、立体安定化するポリマーセグメントは、立体反発力を提供することによって、液体キャリア全体に亘り、球状物質を安定化するように機能する。
ポリマー性であることによって、立体安定化セグメントは、重合されたモノマー残基を含むことが理解される。したがって、セグメントは、必要とされる立体安定化特性を生じる重合したモノマー残基を含む。立体安定化するポリマーセグメントを形成する重合したモノマー残基は、同じでもよいし、異なっていてもよい。
立体安定化するポリマーセグメントは、部分（例えば、本明細書中で規定される任意の置換基）で置換されうるか、又は、静電気的に安定化する特性を生じる重合されたモノマー残基を含みうる。
所望の安定化効果を提供するために、安定化部分は、少なくとも液体キャリアに溶解可能である。所定の液体キャリアにおける所定の安定化部分の溶解度は、安定化部分を別に単に調製し、選択した液体キャリアにおいて適切な溶解度試験を行うことによって、容易に決定されうる。
同様に、所望の立体安定化効果を提供するために、立体安定化するポリマーセグメントは、少なくとも液体キャリアに溶解可能である。所定の液体キャリアにおける所定の立体安定化するポリマーセグメントの溶解度は、ポリマーセグメントを別に単に調製し、選択した液体キャリアにおいて適切な溶解度試験を行うことによって、容易に決定されうる。
全体としての安定化剤は、所定のキャリア液体に溶解可能であってもなくてもよいが、それにもかかわらず、溶解可能な安定化部分を提示する。
当業者は、そのようなポリマーを形成するために重合されうるモノマーに関して、立体安定化するポリマーセグメントとして採用されうるポリマー性物質を理解する。例えば、適切なポリマー性物質には、ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキサイド、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド、ポリジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリビニルピロリドン及びそれらのコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、安定化ポリマーセグメントを形成するために使用されうる適切なモノマーには、アクリルアミド、エチレンオキサイド、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ビニルピロリドン及びそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
立体安定化剤の部分として使用される具体的な立体安定化するポリマーセグメントは、もちろん、液体キャリアの性質に依存する。例えば、水性液体キャリアが使用される場合、立体安定化するポリマーセグメントは、水性媒体に可溶性であるべきである。当業者は、選択した液体キャリアに適切な立体安定化するポリマーセグメントを選択しうる。
固定部位に依存せずに、具体的な立体安定化するポリマーセグメントを選択しうることによって、本発明に従い使用される立体安定化剤は、特定の液体キャリアに合うように有利に調整され設計され、それにより、立体安定化剤の安定化特性を最大化する。
立体安定化するポリマーセグメントを調製するために使用されうる技術である重合に関して、特段の制限は存在しない。リビング重合技術は、その点で特に有用であることが見出された。当業者は、「リビング重合」が、本質的に鎖の転移なしに、デッドポリマー鎖を生じる本質的にターミネーションなしに、鎖の伸長が伝播する、ラジカル付加重合の一形態であることを理解する。「デッドポリマー鎖」により、モノマーのさらなる付加を受けえないものを意味する。
リビング重合では、典型的には、重合のより後の段階で開始される最小の新たな鎖との重合の開始時に、すべてのポリマー鎖が開始される。この開始プロセス後、すべてのポリマー鎖は、実際には、同じ速度で伸長する。リビング重合の特徴及び特性には、一般的には、（ｉ）変換とともにポリマーの分子量が増大すること、（ｉｉ）ポリマー鎖長の狭い分布が存在すること（すなわち、それらは、同様の分子量を有する）、及び（ｉｉｉ）さらなるモノマーがポリマー鎖に付加してブロックコポリマー構造を作り出しうること、が挙げられる。したがって、リビング重合は、分子量に亘る優れた制御、非リビング重合法では達成できない得られるポリマーのポリマー鎖の構造及び多分散性を可能にする。
適切なリビング重合技術は、イオン重合及び制御ラジカル重合（ＣＲＰ）から選択されうる。ＣＲＰの例には、イニファータ重合、安定なフリーラジカルを介した重合（ＳＦＲＰ）、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、及び可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合が挙げられるが、これらに限定されない。
立体安定化するポリマーセグメントは、１つのタイプのモノマー又は２つ以上の異なるモノマーの組み合わせの重合により、形成されうる。したがって、立体安定化するポリマーセグメントは、ホモポリマーセグメント又はコポリマーセグメントでありうる。
安定化するポリマーセグメントが、その数平均分子量の点で立体安定化するポリマーセグメントを規定するよりもむしろ、立体安定化剤の部分のみを形成すると仮定すれば、それは、むしろ、セグメントを集団で形成する重合されたモノマーユニットの数を参照するのに有用でありうる。したがって、立体安定化するポリマーセグメントを集団で形成するそのようなユニットの数に特段の制限はないが、本発明のいくつかの実施態様では、立体安定化剤が比較的低い数平均分子量を有することが望ましくありうる。その場合には、立体安定化するポリマーセグメントが、セグメント全体を形成する、約１００未満、より好ましくは約５０未満、最も好ましくは約１０から約３０までの重合されたモノマー残基ユニットを有することが好ましい。
本発明に従い使用される立体安定化剤はまた、固定部位を含む。固定部位の機能は、示唆した。安定化剤が球状物質に適切に固定されえ、立体安定化剤とは異なるならば、固定部位の形態に関する特段の制限は存在しない。
固定部位は、立体安定化するセグメントに共有結合される。便宜上、固定部位は、「Ｂ」と示されうる。立体安定化するポリマーセグメント及び固定部位が、任意の適切な手段により共有結合されうる。例えば、立体安定化剤は、構造Ａ−Ｃ−Ｂ〔ここで、Ａは、立体安定化するポリマーセグメント、Ｂは、固定部位を示し、Ｃは、結合部分を示す。〕として又は含み記載されうる。あるいは、立体安定化するポリマーセグメント及び固定部位は、直接共有結合されうるので、安定化剤は、構造Ａ−Ｂとして又は含み単純化して記載され得る。その場合、Ａは、立体安定化するポリマーセグメントを示し、Ｂは、固定部位を示す。
使用される具体的な固定部位は、一般的には、それが固定されるべき球状物質の性質により決まる。当業者は、所定の球状物質の表面と結合するのに適切な固定部位を選択しうる。
立体安定化するセグメント及び固定部位を選択する場合、分散物の意図する適用に照らして、これらそれぞれの構成成分の特性を考慮することが望ましくありうる。例えば、立体安定化するセグメント及び固定部位の一方又は両方は、それが生体分解性及び／又は生体適合性であるように、選択されうる。
固定部位は、安定化剤を球状物質に共有結合するために、球状物質との共有結合を形成する１つ以上の部位として存在しうる。例えば、固定部位（固定された状態にある）は、安定化剤を球状物質に−Ｓ−結合を介して共有結合するチオール部分（−ＳＨ）に由来しうる。換言すれば、使用される安定化剤は、チオール部分を含むが、それは、粒子に−Ｓ−結合を介して共有結合される。したがって、本発明に従い「使用される」安定化剤への参照は、それが球状物質に固定される前の安定化剤の形態への参照であることが意図される。
固定部位は、ポリマーセグメント（すなわち、換言すれば、固定するポリマーセグメント）で有りうる。この形態では、球状物質への安定化剤の固定は、一般的には、共有結合によるものではなく、むしろ、静電力、水素結合、イオン電荷、ファンデルワースル力、又はそれらの任意の組み合わせによるものである。
「固定するポリマーセグメント」により、ポリマー性であり、そして、球状物質の表面に向かう親和性を有して、立体安定化剤を球状物質に固定するか結合するように機能する、立体安定化剤のセグメント又は領域が意味される。便宜上、固定するポリマーセグメントはまた、「Ｂ」として示されうる。
ポリマー性であることによって、固定セグメントが、重合されたモノマー残基を含むことが理解される。セグメントは、球状物質への必要な固定を生じる重合したモノマー残基を含む。固定するポリマーセグメントを形成する重合されたモノマー残基は、同じであっても異なっていてもよい。
固定するポリマーセグメントは、球状物質との結合相互作用のための複数の部位を提示しえ、この特性は、それに共有結合していないにもかかわらず、球状物質に安定化剤がしっかり固定されることを可能にすると考えられる。
一般的に、固定するポリマーセグメントは、各々が球状物質と結合するための部位を提供する、少なくとも２つの重合されたモノマー残基、好ましくは少なくとも３つの、より好ましくは少なくとも５つの、さらにより好ましくは７つの、最も好ましくは少なくとも１０個の、そのような重合されたモノマー残基を、有する。固定するポリマーセグメントを形成する重合されたモノマー残基のすべてが球状物質との結合相互作用を生じる必要は必ずしもないが、一般的に、重合されたモノマー残基のすべてが固定するポリマーセグメントを形成するわけではない場合でも大多数は、球状物質との結合相互作用を生じるのが好ましい。
したがって、固定するポリマーセグメントは、安定化剤を球状物質に集団的に固定する複数の部位を有するものとして記載されうる。所定の結合部位が、球状物質と比較的弱い相互作用を提供するのみである場合でさえ、セグメント内の複数のそのような部位の存在は、全体として、球状物質としっかり結合することを可能にする。
固定するポリマーセグメントはまた、球状物質との結合相互作用を生じてもよいし生じなくてもよい部分（例えば、本明細書中で規定されるような任意の置換基）で置換されうる。
用いられる具体的な固定するポリマーセグメントは、一般的には、それが結合されるべき球状物質の性質により、決定される。
球状物質との固定するポリマーセグメントの相互作用を記載する場合、セグメント及び球状物質の親水性及び疎水性の特性を参照するのが便利でありうる。したがって、一般的に、適切な結合相互作用は、セグメント及び球状物質が同様の親水性又は疎水性の特性を有する場合に、生じる。例えば、球状物質が、比較的親水性の表面（例えば、その表面が水で湿りうる。）を有する場合、良好な結合は、親水性特性を有する固定するポリマーセグメント（例えば、その単離された形態において、セグメントが水性媒体に溶解するであろう。）を用いて、達成されるべきである。
そのような例は、球状物質が、その表面に電荷を形成しうるタイプのものである場合に、気づかれうるだろう。その場合には、セグメントと球状物質との間のイオン結合を促進するために、セグメントが、電荷も形成しうるモノマーの重合された残基（例えば、イオン性モノマーの残基）を含むことが望ましくありうる。そのように荷電された種の形成を促進することは、安定化剤及び球状物質が属する液体キャリアのｐＨを調節することによって、促進されうるだろう。
用語「イオン性モノマー」により、モノマーが、溶液中でイオン化されてカチオン性又はアニオン性の基を形成しうる官能基を含むことが意味される。そのような官能基は、一般的には、プロトンを欠失するか受容することを介して、酸性又は塩基性の条件下、イオン化されうる。一般的には、官能基は、酸基又は塩基性基（すなわち、それぞれ、Ｈ原子を供与しうるか受容しうる基）である。例えば、カルボン酸官能基は、塩基性条件下でカルボキシレートアニオンを形成しうるし、アミン官能基は、酸性条件下で四級アンモニウムカチオンを形成しうる。官能基はまた、イオン交換プロセスを介して、イオン化されうる。
酸基を有する適切なイオン性モノマーの例には、メタクリル酸、アクリル酸、イタコン酸、ｐ−スチレンカルボン酸、ｐ−スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、ビニルホスホン酸、モノアクリルオキシエチルホスフェート、２−（メタクリロイルオキシ）エチルホスフェート、エタクリル酸、アルファ−クロロアクリル酸、クロトン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸及びマレイン酸が挙げられるが、これらに限定されない。塩基性基を有する適切なイオン性モノマーの例には、２−（ジメチルアミノ）エチル及びプロピルアクリレート及びメタクリレート、並びに対応する３−（ジエチルアミノ）エチル及びプロピルアクリレート及びメタクリレートが挙げられるが、これらに限定されない。
当業者は、所定の球状物質の表面と結合するのに適切な固定するポリマーセグメントを選択しうる。
立体安定化するポリマーセグメントから独立して、具体的な固定するポリマーセグメントを選択しうることにより、本発明に従い使用される立体安定化剤は、有利には、特定の球状物質に合うように調整して設計されて、それにより、立体安定化剤の固定特性を最大化しうる。例えば、固定するポリマーセグメントは、カルボン酸、ホスフィネート、ホスホネート及び／又はホスフェート官能基を含むことが望ましくありうる。固定するセグメントが結合する球状物質が、鉄（例えば、磁性酸化鉄球状物質）を含む場合、セグメントが、ホスフィネート、ホスホネート、及び／又はホスフェート官能基を含むことが望ましくありうる。そのようなセグメントは、一般的に、リン含有官能基を含むモノマーを用いて形成される。
当業者は、重合されてそのようなポリマーを形成しうるモノマーに関して、固定するポリマーセグメントとして採用されうるポリマー性物質の多様性を理解する。例えば、適切なポリマー性物質には、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレン、ポリイタコン酸、ポリ−ｐ−スチレンカルボン酸、ポリ−ｐ−スチレンスルホン酸、ポリビニルスルホン酸、ポリビニルホスホン酸、ポリモノアクリルオキシエチルホスフェート、ポリ−２−（メチルアクリロイルオキシ）エチルホスフェート、ポリエタクリル酸、ポリ−アルファ−クロロアクリル酸、ポリクロトン酸、ポリフマル酸、ポリシトラコン酸、ポリメサコン酸、ポリマレイン酸、ポリ−２−（ジメチルアミノ）エチル及びプロピルアクリレート及びメタクリレート、対応するポリ−３−（ジエチルアミノ）エチル及びプロピルアクリレート及びメタクリレート、疎水性アクリレート及びメタクリレートポリマー、ポリジメチルアミノエチルメタクリレート、並びにそれらのコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、固定するポリマーセグメントを形成するために使用されうる適切なモノマーには、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、ｐ−スチレンカルボン酸、ｐ−スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、ビニルホスホン酸、モノアクリルオキシエチルホスフェート、２−（メチルアクリロイルオキシ）エチルホスフェート、エタクリル酸、アルファ−クロロアクリル酸、クロトン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸、マレイン酸、２−（ジメチルアミノ）エチル及びプロピルアクリレート及びメタクリレート、対応する３−（ジエチルアミノ）エチル及びプロピルアクリレート及びメタクリレート、スチレン、疎水性アクリレート及びメタクリレートモノマー、ジメチルアミノエチルメタクリレート、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で記載するようなリビング重合技術は、固定するポリマーセグメントを調製するのに特に有用であることが見出された。
固定部位が固定するポリマーセグメントである場合、少なくとも１つの立体安定化する及び固定するポリマーセグメントが、リビング重合技術により重合された、１つ以上のエチレン系不飽和モノマーに由来しうる。セグメントの１つのみがこの様式に由来する場合、それは、好ましくは、固定するポリマーセグメントである。
固定するポリマーセグメントは、１つのタイプのモノマー又は２つ以上の異なるモノマーの組み合わせの重合により形成されうる。したがって、固定するポリマーセグメントは、ホモポリマー性セグメント又はコポリマー性セグメントでありうる。
固定するポリマーセグメントが、その数平均分子量の点で、固定するポリマーセグメントを規定するよりもむしろ、立体安定化剤の部分のみを形成しうると仮定すると、それは、それどころか、セグメントを集団的に形成する重合されたモノマー性ユニットの数を参照するのに有用でありうる。したがって、固定するポリマーセグメントを集団的に形成するそのようなユニットの数に特定の制限は存在しないが、本発明のいくつかの実施態様では、立体安定化剤は、比較的低い数平均分子量を有することが望ましくありうる。その場合には、固定するポリマーセグメントは、セグメント全体を形成する、約１００未満の、より好ましくは約４０未満の、さらにより好ましくは約３０未満の、なおより好ましくは約５から約２５までの、最も好ましくは約５から約１５までの、重合されたモノマー残基ユニットを有することが好ましい。
立体安定化する及び固定するポリマーセグメントを、又はそれらを調製するために使用されうるモノマーを選択する場合、分散物の意図する用途に照らして、それぞれのポリマーセグメントの特性を考慮することが望ましくありうる。例えば、ポリマーセグメントの一方又は両方が、それらが、生体分解性及び／又は生体適合性であるように、選択されうる。
本明細書中で記載するように安定化剤が機能する限り、安定化するポリマーセグメント及び固定するポリマーセグメントがどのように空間的に配置されるかには、特段の制限は存在しない。
立体安定化するポリマーセグメント及び固定するポリマーセグメントは、任意の適切な手段によって互いに結合されて、本発明に従い使用される立体安定化剤を形成しうる。例えば、立体安定化剤は、構造Ａ−Ｃ−Ｂ〔ここで、Ａは、立体安定化するポリマーセグメントを示し、Ｂは、固定するポリマーセグメントを示し、Ｃは、結合部分を示す。〕として又は含んで、記載されうる。あるいは、立体安定化するポリマーセグメント及び固定するポリマーセグメントは、共有結合を介して互いに直接結合してもよく、したがって、安定化剤は、Ａ−Ｂブロックコポリマーとして又は含んで、単純化して記載されうる。その場合には、Ａは、立体安定化するポリマーセグメントを示し、Ｂは、固定するポリマーセグメントを示す。
Ａ及びＢの各々が独立して、ホモポリマー又はコポリマー（例えば、ランダム、ブロック、テーパード等）でありうることが、上記説明から理解される。安定化剤は、１より多くの立体安定化するポリマーセグメント（Ａ）及び１より多くの固定するポリマーセグメント（Ｂ）を含みうる。例えば、安定化剤は、Ａ−Ｂ−Ａブロックコポリマーとして又は含んで、記載されうる。その場合には、各Ａは、立体安定化するポリマーセグメント（これらは、同じ又は異なりうる。）を示し、Ｂは、固定するポリマーセグメントを示す。安定化剤はまた、Ｂ−Ａ−Ｂブロックコポリマー〔ここで、各Ｂは、固定するポリマーセグメント（これらは、同じ又は異なりうる。）であり、Ａは、それが、液体キャリア中に伸長して「ループ」を形成し、その安定化の役割を発揮するような、十分な鎖長である立体安定化するポリマーセグメントを示す。〕として又は含んで、記載されうるだろう。
安定化剤はまた、スター及び櫛型のポリマー構造等のより複雑な構造を有しうる。その場合には、固定するポリマーセグメントＢは、複数の立体安定化するポリマーセグメントＡがそれに結合した、そのような構造の主のポリマー骨格を表しうるだろう。
液体キャリア中での、本発明に従い使用される立体安定化剤（Ａ−Ｂブロックコポリマー構造の形状の）と球状物質との相互作用は、正確な縮尺ではない単純化され概略的に図１３に示されうるだろう。
図１３を参照すると、Ａ−Ｂブロックコポリマーにより表される立体安定化剤は、固定するポリマーセグメント（Ｂ）を介して、球状物質（Ｐ）の表面に向かう親和性を示す。したがって、固定するポリマーセグメント（Ｂ）は、立体安定化剤を球状物質に固定する。固定するポリマーセグメント（Ｂ）は、セグメントと球状物質との間の結合相互作用についての複数の部位を提供する。立体安定化するポリマーセグメント（Ａ）（これは、セグメント（Ｂ）とは異なる。）は、液体キャリアに可溶性であり、液体キャリア全体に分散した球状物質を維持するように機能する。球状物質の表面は、実際には、それに固定された多くの立体安定化剤を有していること、及び、これらは、図１３の図からは明確性のために省略されていること、が理解される。
図１３のものと類似の図が、図１４に示されており、ここで、本発明に従い使用される立体安定化剤は、Ａ−Ｂ−Ａブロックコポリマーの形状である。
少なくとも１つの立体安定化する及び固定するポリマーセグメントは、イオン重合、イニファータ重合、ＳＦＲＰ、ＡＴＲＰ、及びＲＡＦＴ重合等のリビング重合技術により１つ以上のエチレン系不飽和モノマーに由来しうる。これらのリビング重合技術の中でも、ＲＡＦＴ重合が好ましい。
本発明に従い使用される安定化剤は、調製され、次いで球状物質を安定化するように使用されうる。あるいは、部分は、球状物質に固定され、その部分は、球状物質から安定化剤を伸長するために、モノマーの重合を促進するために使用されうる。
当業者は、本発明に従う使用のために選択される安定化剤は、安定化される球状物質の性質及び対象に投与すべき方法に依存しうることを理解する。例えば、球状物質が静脈内投与され、いくらかの時間、循環に維持することが必要とされる場合、安定化剤は、本明細書中で記載されるような立体安定化剤を必要としうる。
球状物質を経口で投与し、胃の高い酸の状態において安定を維持することが必要とされる場合、安定化剤はまた、本明細書中で記載されるような立体安定化剤（例えば、ポリアクリルアミドを含む立体安定化剤）を必要としうる。
球状物質が液体キャリア「全体に亘り分散される」ことにより、球状物質が、球状物質に比して、それ自体連続的液体媒体又は相として存在する液体キャリア全体に亘り、分散された相として存在することが意味される。換言すれば、組成物は、液体キャリア全体に亘る球状物質の懸濁物又は分散物を含むものとして記載されうるだろう。
本明細書中で使用される場合、液体キャリアとの関連で用語「液体」は、球状物質が全体に亘り分散され、少なくとも本発明の方法において意図される用途の温度で、液体状態であるビヒクルを意味することが意図される。典型的には、液体キャリアは、安定化剤の非存在下で、キャリア全体に亘り分散された球状物質がキャリアから凝集又は析出して、沈殿物を形成しうる場合でも、「液体」状態であると考えられる。換言すれば、球状物質は、ビヒクル中を比較的自由に動きうるし、その時、それは考えられる「液体」である。
液体キャリアは、１つ以上の異なる液体から形成されうる。適切な薬理学的に許容可能な液体キャリアは、Ｍａｒｔｉｎ， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， （１９９０）に記載されている。一般的に、液体キャリアは、水性液体キャリアである。水又は可溶性の生理食塩溶液及び水性のデキストロース及びグリセロールの溶液が、液体キャリア（特に、注射溶液用の）として好ましくは採用される。
分散物は、当業者に公知の１つ以上の薬理学的に許容可能な添加剤を含みうる。例えば、液体キャリアは、湿潤剤、脱泡剤、界面活性剤、緩衝剤、電解質、及び保存剤等の、１つ以上の添加剤を含みうる。
液体キャリア及びその中の任意の添加剤（もし存在すれば）の具体的な性質は、一部は、組成物の意図される適用に依存する。当業者は、分散物の意図される適用のための適切な液体キャリア及び添加剤（もし存在すれば）を選択しうる。
球状物質及び／又は（立体）安定化剤がまた、腫瘍へのより特異的な標的化に影響するリガンドに結合されうることも理解されるべきである。これは、必ずしも、すべての状況において適用可能ではないが、所定の腫瘍について適切な標的分子が存在する程度まで、これは、さらなる有用な特異性を提供しうる。
標的化療法の一般的な考えは新規ではないが、今日まで、標的化療法の成功は、強力な標的分子を必要とする基準を満たすだけに、限定されてきた。それらは、
（ｉ） 細胞表面の位置
（ｉｉ） 高い細胞表面分子密度
（ｉｉｉ） 分子の内在化の欠如、及び
（ｉｖ） 細胞表面からのかなりの抗原脱落の欠如
である。
そのような分子（特に、理想的には腫瘍特異的でもある抗原）の同定の点で、制限が存在する。しかしながら、所定の状況についてそのような標的が知られている程度までは、それらは、有用に開発されうる。
この目的で、「リガンド」への参照は、特異性（必ずしも排他的ではない特性であるが、これが好ましい）及び腫瘍分子に対する結合親和性を有する任意の分子への参照として理解されるべきである。リガンドの例には、免疫相互作用分子（ｉｍｍｕｎｏｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、ペプチド模倣剤、ランタニド（ｌａｎｔｈａｍｉｄｅ）金属（これは、ＲＮＡ種と相互作用する）、酵素基質（これは、細胞死に関連する酵素と相互作用する）及びプトレシン（これは、組織トランスグルタミナーゼと相互作用する）が挙げられる。一実施態様では、リガンドは、免疫相互作用分子である。好ましい免疫相互作用分子は、免疫グロブリン分子であるが、本発明は、他の免疫相互作用分子（例えば、抗体フラグメント、一本鎖抗体、ヒト化抗体を含む脱免疫化抗体、及びＴ細胞関連抗原結合分子（ＴＡＢＭ））まで及ぶ。最も好ましくは、免疫相互作用分子は、ポリクローナル又はモノクローナルの抗体等の抗体である。対象リガンドは、任意の他のタンパク質性又は非タンパク質性の分子又は細胞に、連結、結合、又は別の方法で会合されうることが理解されるべきである。
リガンドは、腫瘍分子「に指向」する。リガンドは、必ずしも、完全な排他性を示さなくてもよいが、これが好ましいことは理解されるべきである。例えば、抗体は、時々、他の抗原と交差反応することが知られている。抗原決定基又はエピトープは、免疫応答に指向しうる分子の部分を含む。抗原決定基又はエピトープは、Ｂ細胞エピトープでありうるし、又は、適切な場合、Ｔ細胞レセプター結合分子でありうる。
本発明はまた、リガンドが、１つ以上の腫瘍分子に指向するように設計されうる。したがって、本発明は、異なる標的に指向する（例えば、腫瘍性細胞の塊に送達される細胞毒素量を増大させるための手段として）２つ以上のリガンドを投与するように設計されうる。それはまた、２つの異なる毒素を同時に送達する便利な手段を提供する。
使用される場合、リガンドは、球状物質に直接結合されうるか、又は、立体安定化剤の部分を形成することによって球状物質に間接的に結合されうる。例えば、リガンドは、立体安定化剤に結合されうる。
当業者は、本発明に従い使用される分散された球状物質が、液体キャリア内で流体力学直径をしめすことを理解する。流体力学直径は、球状物質自体及び球状物質と会合した立体安定化剤に由来する距離又はサイズである。これは、球状物質自体（１０）が、（立体）安定化剤（２０）によりキャリア液体（示さず）内に分散されている図１５を参照して、より明確に説明されうる。したがって、分散された球状物質の流体力学直径（３０）は、球状物質と（立体）安定化剤との組み合わせにより達成される直径を示すと見られうる。分散された球状物質が対称的な形状を有さない場合、流体力学直径は、分散された球状物質により示される最も大きな流体力学直径のものと考えられる。
理論により制限されることは望まないが、分散された球状物質の流体力学直径は、腫瘍内の球状物質の深い浸透を促進する役割も果たしうると考えられる。
一実施態様では、分散された球状物質の流体力学直径は、約５００ｎｍ未満であり、約３５０ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約２５ｎｍ未満又は約１５ｎｍ未満である。
さらなる実施態様では、分散された球状物質の流体力学直径は、約：１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００ｎｍである。
いずれの疑義をも回避するために、本明細書中における分散された球状物質の「流体力学直径」への参照は、分散された球状物質の平均直径（少なくとも約５０数％（ｎｕｍｂｅｒ ％））を示すことが意図される。分散された球状物質の流体力学直径は、本明細書中、流体力学クロマトグラフィー（ＨＤＣ、ＰＬ−ＰＳＤＡ（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））により決定される。
本明細書中での「対象」への参照は、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ）、研究室の実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）及び捕獲性の野生動物（例えば、キツネ、カンガルー、シカ）を包含することが理解されるべきである。好ましくは、哺乳類はヒトである。
用語「治療」は、対象を完全に回復するまで治療することを必ずしも意味するものではないことが理解されるべきである。したがって、治療は、既存の状態の重篤度の減少、特定の状態の症状の寛解、或いは特定の状態を発症するリスクの予防又はそうでなければ減少を包含する。
「有効量」は、少なくとも部分的に、所望の応答を得るために、すなわち、発症を遅らせるか又は進行を阻害するか、又は全体で停止するために（特定の状態の発症又は進行が治療される）、必要な量を意味する。量は、治療されるべき個体の健康及び肉体的状態、治療されるべき個体の分類的な群、所望の保護の程度、組成物の処方、医学的状態の判断、及び他の関連因子、に依存して変化する。量は、慣用のトライアルを介して決定されうる比較的広い範囲内であることが予測される。
本発明の関連する局面では、治療を受ける対象は、治療的処置が必要な、任意のヒト又は動物でありうる。この点で、本明細書中での「治療」への参照は、その最も広い文脈で考えられるべきである。用語「治療」は、完全な回復まで哺乳類を治療することを必ずしも意味するものではない。したがって、治療は、特定の状態の症状の寛解、或いは特定の状態を発症するリスクの予防又はそうでなければ減少を包含する。「治療」はまた、既存の状態の重篤度を減少しうる。
医薬組成物の形状での球状物質及び細胞毒素の投与は、任意の便利な手段により、行われうる。医薬組成物は、具体的なケースに依存する量を投与した場合に、治療活性を示すことが意図される。変動は、例えば、ヒトであるか又は動物であるか、使用するために選択された具体的な剤、球状物質及び毒素、に依存する。広い用量の範囲が適用可能でありうる。用量レジメンは、最適な治療応答を提供するように、調節されうる。
投与経路には、呼吸器（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒａｌｌｙ）、気管内、鼻咽腔内（ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｌｙ）、静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋内、皮内、筋肉内、眼内、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌｌｙ）、大脳内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｅｒａｌｌｙ）、鼻腔内、注入、経口、直腸、ＩＶドリップパッチ及びインプラントが挙げられるが、これらに限定されない。粒子はまた、腫瘍に直接的に投与されうる。
本発明に従う組成物は、薬理学的に許容可能な液体キャリア全体に亘って分散された薬理学的に許容可能な球状物質を含む。「薬理学的に許容可能な」によって、球状物質、液体キャリア、又は組成物の他の構成成分（例えば、立体安定化剤）が、それ自体、対象への投与に適していることが意味される。換言すれば、対象に対する、球状物質、液体キャリア又は組成物の他の構成成分の投与は、許容不可能な毒性（アレルギー反応及び疾患状態を含む）を生じない。
指針のみとして、当業者は、「薬理学的に許容可能な」とは、動物、より詳細にはヒトに使用するために、連邦の又は州の政府の監督官庁により承認されているか、又は、米国局方又は他の一般に認識されている局方に列挙されている、物と考えうる。
これを言ったことで、当業者は、対象へ投与用の組成物の的確性、及び所定の球状物質又は液体キャリアが薬理学的に許容されると考えられるであろうか否かが、いくらかの程度まで、選択された投与の態様に依存することを理解する。したがって、投与の態様は、所定の組成物が対象への投与に適切か又は薬理学的に許容されるかを評価する場合に、考慮する必要がありうる。
薬学的形状は、好ましくは、注射可能な用途に適切であり、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が包含される。それは、製造及び保存の条件下で安定でなくてはならず、菌や真菌等の微生物の汚染作用に対して貯蔵されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び植物油を含む、溶媒又は分散媒体でありうる。例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散物の場合に要求される粒子サイズの維持により、及び界面活性剤（ｓｕｐｅｒｆａｃｔａｎｔ）の使用により、適切な流動性が維持されうる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によりもたらされうる。多くの場合、等張剤（例えば、糖又は塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注入可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅延する剤（例えば、アルミニウムモノステアレート及びゼラチン）の組成物における使用により、もたらされうる。
滅菌注射可能溶液は、活性化合物を必要な量で、必要に応じ、上で列挙した様々な他の成分とともに、適切な溶媒に導入し、次いで、滅菌ろ過することにより、調製される。一般的には、分散物は、様々な滅菌された活性成分を、基礎となる分散媒体及び上で列挙したものからの必要とされる他の成分を含む滅菌したビヒクル中に導入することにより調製される。滅菌注射可能溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉末を生じる、先に滅菌ろ過したそれらの溶液からの、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
一実施態様では、安定化された球状物質及び細胞毒素は、単一の処方物に処方されうる。代替の実施態様では、該安定化された球状物質及び細胞毒素は、２つの別々の処方物に処方される。
以下の非限定的実施例を参照して、本発明をさらに記載する。
ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート） １０ −ブロック−ポリ（アクリルアミド） ２０ マクロラフト剤を用いた、水性分散物中の酸化鉄ナノ粒子の立体安定化。
（ａ）部：酸性媒体中で安定な希釈した水性磁性流体の調製。
マグネタイトナノ粒子を、Ｍａｓｓａｒｔ （Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｌｉｑｕｉｄｓ ｉｎ ａｌｋａｌｉｎｅ ａｎｄ ａｃｉｄｉｃ ｍｅｄｉａ． ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ， １９８１． ＭＡＧ−１７（２）： ｐ． １２４７−１２４８）の方法に従って製造した。典型的な反応では、２Ｍ ＨＣｌ中１Ｍ ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ ８０ｍｌ及び２Ｍ ＨＣｌ中１Ｍ ＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏ ４０ｍｌを、２リットルのビーカー中で混合し、混合物を、ＭＱ水で１．２リットルに希釈した。次いで、２５０ｍｌのＮＨ４ＯＨ（２８％（ｗ／ｗ））を素早くビーカーに添加し、混合物を３０分間激しく攪拌した。ＮＨ４ＯＨを添加すると、混合物の色は、オレンジから黒へとすぐに変わり、これは、マグネタイトの形成を示唆している。次いで、マグネタイトを、硝酸鉄と９０℃で約１時間加熱することによって、酸性媒体中で磁赤鉄鉱に酸化した。懸濁物の色は、黒から赤褐色に変化した。次いで、磁赤鉄鉱粒子を磁気的にデカントし、アセトンで洗浄し、最後に、水で解膠させて、安定な分散物（５ｗｔ％）を得た。分散物のｐＨは、約１．５〜２であった。
（ｂ）部：２−｛［（ドデシルスルファニル）カルボノチオイル］スルファニル｝コハク酸を用いた、ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート）１０−ブロック−ポリ（アクリルアミド）２０マクロラフト剤の調製。
ジオキサン（１５ｇ）及び水（１５ｇ）中の、２−｛［（ドデシルスルファニル）カルボノチオイル］スルファニル｝コハク酸（０．８１ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（０．０９ｇ、０．３ｍｍｏｌ）、アクリルアミド（２．８７ｇ、４０．３ｍｍｏｌ）溶液を、１００ｍＬの丸底フラスコ中で調製した。これを、磁気的に攪拌し、１５分間窒素を注入した。次いで、フラスコを７０℃で４時間加熱した。この期間の終わりに、モノアクリルオキシエチルホスフェート（３．９８ｇ、２０ｍｍｏｌ）及び４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（０．０９ｇ、０．３ｍｍｏｌ）をフラスコに添加した。混合物を、脱酸素し、加熱を８０℃でさらに１２時間続けた。コポリマー溶液は、２３．６％の固体を有していた。次いで、コポリマー溶液を、ＭＱ水で、０．７ｗｔ％に希釈し、０．１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを５に調製した。
（ｃ）部：実施例１（ａ）部の水性磁性流体、及び実施例１（ｂ）部のマクロラフト剤からの、立体的に安定化された酸化鉄ナノ粒子の調製。
実施例１（ａ）部で調製したナノ粒子分散物（２７ｇ）を、ＭＱ水（２００ｇ）で希釈して、ナノ粒子の２ｗｔ％分散物を得た。次いで、０．１Ｍ水酸化ナトリウムを用いて、このナノ粒子分散物のｐＨを５まで上昇させた。次いで、酸化鉄分散物の２ｗｔ％分散物を、実施例１（ｂ）からのマクロラフトコポリマー溶液（１００ｇ）に添加した。混合物を、オーバーヘッドスターラーを用いて４５分間激しく攪拌し、その後、水酸化ナトリウム溶液を用いて、ｐＨをｐＨ７に調節した。次いで、混合物を、さらに２時間室温で激しく攪拌したままにした。次いで、ナノ粒子分散物を透析し、塩、残りの溶媒、必要でない低分子量の反応副生成物及び結合していないポリマーを除去した。分散物中のより大きな粒子は、超遠心分離により除去した。次いで、精製したナノ粒子分散物を、希釈して、水性磁性流体分散物中の固体充填を約７０ｗｔ％まで増大した。得られた水性磁性流体は、６０％硝酸アンモニウム溶液中で安定であることが見出された。
９５％ポリ（（モノアクリルオキシエチルホスフェート）１０−ブロック−ポリ（エチレンオキシド）１７マクロラフト剤及び５％ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート）１０−ブロック−ポリ（アクリルアミド）２５マクロラフト剤を用いた、水性分散物中の酸化鉄ナノ粒子の立体安定化
（ａ）部：２−｛［（ブチルスルファニル）カルボノチオイル］スルファニル｝プロパン酸を用いた、ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテルのエステル化
メトキシＰＥＧ（Ｍｎおよそ７９８）を加温し攪拌して、それを液化し均質化し、次いで、１９．９５ｇ（２５．０ｍｍｏｌ）を、２５０ｍＬの三首丸底フラスコ中に秤量し、次いで、固化させた。２−｛［（ブチルスルファニル）カルボノチオイル］スルファニル｝プロパン酸（６．９６ｇ、２９．３ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（３６０ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ）をフラスコに添加し、磁気スターラーバーを入れ、フラスコを窒素でパージした。乾燥ジクロロメタン（７５ｍＬ）を添加し、混合物を、固体がすべて溶解するまで攪拌した。次いで、フラスコを、氷浴で冷却し、次いで、乾燥ジクロロメタン（２５ｍＬ）中のＮ，Ｎ’−ジクロロヘキシルカルボジイミド（６．０３ｇ、２９．３ｍｍｏｌ）の溶液を、１時間かけて滴下した。反応系を氷浴中でさらに１０分間攪拌し、次いで、室温で２４時間攪拌した。得られた黄色のスラリーを、１：１のヘキサン−エーテル（１００ｍＬ）で希釈し、焼結ガラス漏斗を通して濾過した。フィルター残渣を、さらに少量の１：１のヘキサン−エーテルで、それが白くなるまで洗浄し、合わせた濾液をエバポレートして、曇ったざらざらしたくすんだオレンジの油を得た。粗生成物を、ジクロロメタン（７５ｍＬ）に溶解し、固体シュウ酸（４ｇ）とともに１時間攪拌し、次いで、ヘキサン（７０ｍＬ）で希釈し、沈殿する（綿状の白色沈殿を生成する）まで放置した。混合物を濾過しエバポレートし、粗オイルを、２：１のヘキサン−ジクロロメタン（１５０ｍＬ）に溶解し、アルミナ（４０ｇ）のプラグを通した。さらなる２：１のヘキサン−ジクロロメタンを用いた溶出を、溶出物が無色になるまで続けた。合わせた溶出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、エバポレートして、澄んだ薄オレンジの油（２４．６９ｇ、９７％）を得た。
（ｂ）部：実施例２（ａ）部のマクロラフトに基づく、ポリ（エチレンオキシド）１７−ブロック−ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート）１０マクロラフト剤の調製。
ジオキサン（４５ｇ）及び水（２２．５ｇ）中の、実施例２（ａ）部からのＲＡＦＴ−ＰＥＯ（３．６０ｇ、３．５ｍｍｏｌ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（０．２０ｇ、０．７ｍｍｏｌ）、モノアクリルオキシエチルホスフェート（６．８９ｇ、３５ｍｍｏｌ）の溶液を、２５０ｍＬの丸底フラスコ中に調製した。これを、磁気的に攪拌し、１５分間窒素を導入し、反応を７０℃で１２時間行った。コポリマー溶液は、１５．１％の固体を有していた。次いで、コポリマー溶液を、ＭＱ水で０．７ｗｔ％まで希釈し、０．１Ｍ ＮａＯＨを用いて、ｐＨを５に調節した。
（ｃ）部：２−｛［（ブチルスルファニル）カルボノチオイル］スルファニル｝プロパン酸を用いた、ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート）１０−ブロック−ポリ（アクリルアミド）２０マクロラフト剤の調製。
ジオキサン（４５ｇ）及び水（２２．５ｇ）中の、２−｛［（ブチルスルファニル）カルボノチオイル］スルファニル｝プロパン酸（３．２ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（０．１９ｇ、０．７ｍｍｏｌ）、アクリルアミド（１９．２７ｇ、２７１．１ｍｍｏｌ）の溶液を、２５０ｍＬの丸底フラスコ中に調製した。これを、磁気的に攪拌し、１５分間窒素を導入した。次いで、フラスコを７０℃に４時間置いた。ホモポリマー溶液は、３２．０％の固体を有していた。１５ｇの得られたホモポリマー溶液、モノアクリルオキシエチルホスフェート（４．５０ｇ、２２．９ｍｍｏｌ）及び４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（０．０４ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬの丸底フラスコに添加した。混合物を１５分間の窒素導入により脱酸素し、フラスコを、７０℃の油浴で１２時間攪拌した。次いで、コポリマー溶液（これは、４０．４％の固体を含んでいた。）を、ＭＱ水で１．２ｗｔ％まで希釈した。０．１Ｍ ＮａＯＨを用いて、希釈したコポリマー溶液のｐＨを５に調節した。
（ｄ）部：実施例１（ａ）部の水性磁性流体並びに実施例２（ｂ）部マクロラフト剤と実施例２（ｃ）部のマクロラフト剤との９５：５のブレンドからの、立体的に安定化された酸化鉄ナノ粒子の調製。
実施例１（ａ）部に従い調製したナノ粒子を、ＭＱ水で希釈して、ナノ粒子の２ｗｔ％の分散物を得た。次いで、この調製したナノ粒子分散物のｐＨを５まで上昇させた。５０ｇの０．７ｗｔ％の実施例２（ｂ）部の溶液及び５０ｇの１．２ｗｔ％の実施例２（ｃ）部の溶液からなるマクロラフトのブレンドを、一緒に混合し、０．１Ｍ ＮａＯＨを用いて、ｐＨを５に調節した。次いで、同じｐＨに維持された酸化鉄の２ｗｔ％分散物を、マクロラフトブレンドに添加した。混合物を室温で２時間激しく攪拌し、その後、ｐＨを７．０に調節した。次いで、混合物を、さらに３時間攪拌したままにした。このｐＨで、ナノ粒子が安定な状態でもあるために十分に０電荷のその点を超えつつ、コポリマーは部分的に中和されたままであった。次いで、分散物を透析して、塩、残りの溶媒、残りの溶媒、必要でない低分子量の反応副生成物及び結合していないポリマーを除去した。分散物中のより大きな粒子は、超遠心分離により除去した。次いで、精製したナノ粒子分散物を、蒸留して、水性磁性流体分散物中の固体充填を、約７０ｗｔ％まで増大させた。得られた水性磁性流体は、リン酸緩衝化生理食塩溶液中で安定であることが見出された。
（ｅ）部：実施例２（ｄ）部の酸化鉄粒子のための、安定化剤の改変
実施例２（ｄ）部により調製されたコーティングされたナノ粒子（７．８ｇ）中に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、１４．４ｍｇ）及び次いで１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、２０ｍｇ）を添加し、振盪することにより混合し、２時間室温で放置して反応させた。次いで、ジアミン溶液（１ｍｌの水中、９０ｍｇの２，２’−（エチレンジオキシ）ビス−（エチルアミン））を、反応混合物に添加し、さらに３．５時間放置して反応させた。次いで、溶液を、数量を変化させながら過量の水に対して透析して、ＥＤＡＣ及び反応副生成物を除去した。
実施例１（ａ）部の磁性流体及び実施例２（ｂ）部のポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート） １０ −ブロック−ポリ（エチレンオキシド） １７ マクロラフト剤を用いた、水性分散物中の酸化鉄ナノ粒子の立体安定化
実施例１（ａ）部に従い調製したナノ粒子分散物（８．０ｇ）を、５０ｇのＭＱ水で希釈して、ナノ粒子の０．５ｗｔ％分散物を得た。次いで、この調製したナノ粒子分散物のｐＨを５まで上昇させた。次いで、同じｐＨに維持した酸化鉄の０．５ｗｔ％分散物を実施例２（ｂ）部からの５０ｇのマクロラフト剤に添加した。混合物を室温で２時間激しく攪拌し、その後、ｐＨを７．０に調節した。次いで、混合物を、さらに３時間攪拌したままにした。このｐＨで、ナノ粒子が安定な状態でもあるために十分に０電荷のその点を超えつつ、コポリマーは部分的に中和されたままであった。次いで、分散物を透析し、塩、残りの溶媒、必要でない低分子量の反応副生成物及び結合していないポリマーを除去した。分散物の最終の固体は、０．７４％であった。
実施例２（ｃ）部のポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート） １０ −ブロック−ポリ（アクリルアミド） ２０ マクロラフト剤を用いた、実施例１（ａ）部の水性磁性流体の酸化鉄ナノ粒子の立体的安定化
実施例１（ａ）部で調製したナノ粒子分散物（６．１９ｇ）を、ＭＱ水（１００ｇ）で希釈して、ナノ粒子の１ｗｔ％分散物を得た。次いで、このナノ粒子分散物のｐＨを、０．１Ｍ水酸化ナトリウムを用いて、５まで上昇させた。次いで、酸化鉄分散物の２ｗｔ％分散物を実施例２（ｃ）部からのマクロラフトコポリマー溶液（５０ｇ）に添加した。混合物を、オーバーヘッドスターラーを用いて、２時間激しく攪拌し、その後、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨをｐＨ７に調節した。次いで、室温で、さらに１２時間、混合物を激しく攪拌させたままにした。次いで、ナノ粒子分散物を透析して、塩、残りの溶媒、必要でない低分子量の反応副生成物及び結合していないポリマーを除去した。最終分散物の固体含量は、０．７１％であった。
１００％アミン改変ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート） １０ −ブロック−ポリ（アクリルアミド） ２０ を用いた、実施例１（ａ）部の水性磁性流体からの水性分散物中の酸化鉄ナノ粒子の立体的安定化
（ａ）部：実施例２（ｃ）部のマクロラフト剤からの、アミン改変ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート）１０−ブロック−ポリ（アクリルアミド）２０マクロラフト剤の調製
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド９８％（０．６４ｇ）、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス−（エチルアミン）９８％（０．５４ｇ）を、１００ｍＬのガラス瓶中のｐＨ６．２５の実施例２（ｃ）部のポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート）１０−ブロック−ポリ（アクリルアミド）２０ブロックコポリマー３０．０ｇに添加した、瓶をパラフィルムで封止し、２時間、混合用ローラーに置いた。２時間後、混合物は、ｐＨ８．１２を有しており、一級アミンに対して反応性であるＮＨＳ活性化カルボキシル基を得た。次いで、１．２６ｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩を、混合物に添加し、これを、さらに１２時間ローラー上に放置した。過量のＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩を、透析により除去した。
（ｂ）部：実施例１（ａ）部の水性磁性流体及び実施例５（ａ）部のマクロラフト剤からの、立体的に安定化された酸化鉄ナノ粒子の調製
実施例１（ａ）部で調製されたナノ粒子分散物（８．３８ｇ）を、ＭＱ水（５０ｇ）で希釈して、ナノ粒子の０．５ｗｔ％分散物を得た。次いで、０．１Ｍ水酸化ナトリウムを用いて、このナノ粒子分散物のｐＨを５に上昇させた。次いで、酸化鉄ナノ粒子の０．５ｗｔ％分散物を、実施例５（ａ）部からのマクロラフトコポリマー溶液（２２．６ｇ）及び５０ｇのＭＱ水に添加した。混合物を、オーバーヘッドスターラーを用いて、２時間、激しく攪拌し、その後、水酸化ナトリウム溶液を用いて、ｐＨをｐＨ７に調節した。次いで、混合物を、室温でさらに１０時間、激しく攪拌したままにした。次いで、ナノ粒子分散物を、透析して、塩、残りの溶媒、必要でない低分子量の反応副生成物及び結合していないポリマーを除去した。透析した水性磁性流体分散物の固体含量は、０．３６％であった。
実施例２（ｃ）部の９５％ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート） １０ −ブロック−ポリ（アクリルアミド） ２０ マクロラフト剤及び実施例５（ａ）部の５％アミン改変ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート） １０ −ブロック−ポリ（アクリルアミド） ２０ を用いた、水性分散物中の酸化鉄ナノ粒子の立体的安定化
実施例１（ａ）部で調製したナノ粒子分散物（８．０９ｇ）を、ＭＱ水（５０ｇ）で希釈して、ナノ粒子の０．５ｗｔ％分散物を得た。次いで、このナノ粒子分散物のｐＨを、０．１Ｍ水酸化ナトリウムを用いて、５まで上昇させた。次いで、酸化鉄分散物の０．５ｗｔ％分散物を、実施例５（ａ）部からのｐＨ５．０であるマクロラフトコポリマー溶液（１．７ｇ）、実施例２（ｃ）部（１．０ｇ）及び５０ｇのＭＱ水に添加した。混合物を、オーバーヘッドスターラーを用いて、２時間、激しく攪拌し、その後、水酸化ナトリウム溶液を用いて、ｐＨをｐＨ７に調節した。次いで、混合物を、室温でさらに３時間、激しく攪拌させたままにした。次いで、ナノ粒子分散物を透析して、塩、残りの溶媒、必要でない低分子量の反応副生成物及び結合していないポリマーを除去した。透析した水性磁性流体分散物の固体含量は、０．５３％であった。
ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート） １０ −ブロック−ポリ（アクリルアミド） ６０ マクロラフト剤を用いた、水性分散物中の酸化鉄ナノ粒子の立体的安定化
（ａ）部：酸性媒体中で安定な希釈した水性磁性流体の調製。
マグネタイトナノ粒子を、Ｍａｓｓａｒｔ（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｌｉｑｕｉｄｓ ｉｎ ａｌｋａｌｉｎｅ ａｎｄ ａｃｉｄｉｃ ｍｅｄｉａ． ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ， １９８１． ＭＡＧ−１７（２）： ｐ． １２４７−１２４８）の方法に従い、調製した。三価鉄及び二価鉄の塩化物の水性混合物を、アンモニア溶液に添加した。得られた沈殿物を、遠心分離により単離し、次いで、硝酸鉄溶液を混合し加熱することによって、磁赤鉄鉱に酸化した。次いで、沈殿物を２ｍｏｌａｒの硝酸で洗浄し、次いで、最後に、水で解膠して、およそ５ｗｔ％固体の希釈水性磁性流体を形成した。
（ｂ）部：２−｛［（ブチルスルファニル）カルボノチオイル］スルファニル｝プロパン酸を用いた、ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート）１０−ブロック−ポリ（アクリルアミド）６０マクロラフト剤の調製。
ジオキサン（１０ｇ）及び水（１０ｇ）中の、２−｛［（ブチルスルファニル）カルボノチオイル］スルファニル｝プロパン酸（０．２６ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（０．０６ｇ、０．２ｍｍｏｌ）、アクリルアミド（４．７３ｇ、６６ｍｍｏｌ）の溶液を、１００ｍＬの丸底フラスコ中に調製した。これを、磁気的に攪拌し、１５分間窒素を導入した。次いで、フラスコを、７０℃で４時間、加熱した。この期間の終わりに、モノアクリルオキシエチルホスフェート（２．１７ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）及び４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（０．０６ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、フラスコに添加した。混合物を脱酸素し、加熱を８０℃でさらに１２時間継続した。コポリマー溶液は、２４％の固体を有していた。次いで、コポリマー溶液を、ＭＱ水で０．７ｗｔ％に希釈して、０．１Ｍ ＮａＯＨを用いて、ｐＨを５に調節した。
（ｃ）部：（ａ）部の水性磁性流体及び実施例７（ｂ）部のマクロラフト剤からの、立体的に安定化された酸化鉄ナノ粒子の調製。
実施例７（ａ）部で調製したナノ粒子分散物（４０ｇ）を、ＭＱ水（２００ｇ）で希釈して、ナノ粒子の１ｗｔ％分散物を得た。次いで、このナノ粒子分散物のｐＨを、０．１Ｍ水酸化ナトリウムを用いて、５まで上昇させた。次いで、酸化鉄分散物の１ｗｔ％分散物を、（ｂ）部からのマクロラフトコポリマー溶液（２００ｇ）に添加した。混合物を、オーバーヘッドスターラーを用いて、４５分間、激しく攪拌し、その後、水酸化ナトリウム溶液を用いて、ｐＨをｐＨ７に調整した。次いで、混合物を、室温でさらに２時間、激しく攪拌したままにした。次いで、ナノ粒子分散物を、透析して、塩、残りの溶媒、必要でない低分子量の反応副生成物及び結合していないポリマーを除去した。分散物中のより大きな粒子は、超遠心分離により除去した。次いで、精製したナノ粒子分散物を蒸留して、水性磁性流体分散物中の固体充填を、約７０ｗｔ％に増大させた。
９５％ポリ［２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］ １０ −ブロック−ポリ（エチレンオキシド） １７ マクロラフト剤及び５％ポリ（２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート） １０ −ブロック−ポリ（アクリルアミド） ２５ マクロラフト剤を用いた、ｓｉｇｍａ ｌｕｄｏｘ ａｓ ３０シリカ粒子の立体的安定化
（ａ）部：２−｛［ブチルスルファニル）カルボノチオイル］−スルファニル｝プロパン酸に基づく、ポリ［２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］１０−ブロック−ポリ（エチレンオキシド）１７マクロラフト剤の調製。
ジオキサン（１０ｇ）及び水（５ｇ）中の、実施例２（ａ）部からのＲＡＦＴ−ＰＥＯ（１．３８ｇ、１．４ｍｍｏｌ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（０．０８ｇ、０．３ｍｍｏｌ）、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（２．１３ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）の溶液を、１００ｍＬの丸底フラスコ中に調製した。これを磁気的に攪拌し、１５分間窒素を導入し、反応を７０℃で１２時間行った。コポリマー溶液は、１８．４％の固体を有していた。
（ｂ）部：２−｛［ブチルスルファニル）カルボノチオイル］−スルファニル｝プロパン酸に基づく、ポリ［２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］１０−ブロック−ポリ（エチレンオキシド）１７マクロラフト剤の選択的四級化。
実施例８（ａ）部（１６．５ｇ）を、ＭＱ水（１７ｇ）で希釈し、ヨウ化メチル（０．７ｇ）を添加した。混合物を室温で１時間攪拌し、その後、ロータリーエバポレーターを用いて、部分的に乾燥した。次いで、乾燥したサンプルを、真空オーブンに置いて、マクロラフト剤を乾燥した（これは１００％の固体を生じる）。
（ｃ）部：２−｛［ブチルスルファニル）カルボノチオイル］−スルファニル｝プロパン酸に基づく、ポリ（２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート）１０−ブロック−ポリ（アクリルアミド）２５マクロラフト剤の調製。
ジオキサン（１８．８ｇ）及び水（１０．５ｇ）中の、２−｛［（ブチルスルファニル）カルボノチオイル］スルファニル｝プロパン酸（０．６ｇ、２．６ｍｍｏｌ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（０．１１ｇ、０．４ｍｍｏｌ）、アクリルアミド（４．４５ｇ、６２．７ｍｍｏｌ）の溶液を、１００ｍＬの丸底フラスコ中に調製した。これを磁気的に攪拌し、１５分間窒素を導入した。次いで、フラスコを、７０℃の油浴中に４時間置いた。ホモポリマー溶液は、３２．７％の固体を有していた。得られたホモポリマー溶液、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（３．９４ｇ、２５．１ｍｍｏｌ）及び４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（０．０８８ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）をすべて、１００ｍＬの丸底フラスコに添加した。混合物を１５分間脱酸素し、７０℃の油浴中に１２時間置いた。コポリマー溶液の最終的な固体は、２６．９％であった。
（ｄ）部：２−｛［ブチルスルファニル）カルボノチオイル］−スルファニル｝プロパン酸に基づく、ポリ（２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート）１０−ブロック−ポリ（アクリルアミド）２５マクロラフト剤の選択的四級化。
実施例８（ｃ）部（１９．３ｇ）を、ＭＱ水（２０ｇ）で希釈し、ヨウ化メチル（０．７８ｇ）を添加した。混合物を、ロータリーエバポレーターを用いて部分的に乾燥させながら、室温で１時間攪拌した。次いで、部分的に乾燥したサンプルを、真空オーブンにおいて、マクロラフト剤を乾燥した（これは、１００％の固体を生じる）。
（ｅ）部：実施例８（ｂ）部及び実施例８（ｄ）部のマクロラフト剤の９５：５のブレンドを用いた、立体的に安定化されたＳｉｇｍａ Ｌｕｄｏｘ ＡＳ３０シリカ粒子の調製
Ｓｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈからのＬｕｄｏｘ ＡＳ３０（２．５ｇ）を、ＭＱ水（１００ｇ）で希釈して、ナノ粒子の２ｗｔ％分散物を得た。そして、ｐＨは９．６２である。実施例８（ｂ）部（０．９６ｇ）の及び実施例８（ｄ）部（０．０６５３ｇ）の混合物を、ＭＱ水（５０ｇ）に溶解し、ｐＨは７．５９であった。次いで、２ｗｔ％分散物を、マクロラフト剤の混合物中に注ぎ入れた。混合物を、室温で５時間、激しく攪拌した。次いで、分散物を、透析して、塩、残りの溶媒、必要でない低分子量の反応副生成物及び結合していないポリマーを除去した。透析したシリカゾル分散物の固体含量は、０．６９％であった。サンプルのｐＨを、水酸化ナトリウム溶液を用いて、６．７６に調節した。
（ｆ）部：実施例８（ｅ）部のシリカ粒子のための安定化剤の改変［ＥＰ３４１０７０Ａ］
実施例８（ｅ）部から調製された立体的に安定化されたシリカゾル粒子（６０ｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、３９．４ｍｇ）及び次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、５６．２ｍｇ）を添加し、振盪することにより混合し、室温で２時間反応させた。次いで、３７ｍｇの２，２’−（エチレンジオキシ）ビス−（エチルアミン）を、反応混合物に添加し、さらに１２時間反応させた。次いで、溶液を、数量を変化させながら過量の水に対して透析して、遊離のＥＤＡＣ及び反応副生成物を除去した。
９５％ポリ［２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］ １０ −ブロック−ポリ（エチレンオキシド） １７ マクロラフト剤及び５％ポリ（２−（ジメチルアミノ）エチル メタクリレート） １０ −ブロック−ポリ（アクリルアミド） ２５ マクロラフト剤を用いた、ｓｉｇｍａ ｌｕｄｏｘ ａｓ４０シリカゾルの立体的安定化
（ａ）部：立体的に安定化されたＳｉｇｍａ Ｌｕｄｏｘ ＡＳ３０シリカ粒子並びに実施例８（ｂ）部及び実施例８（ｄ）部のマクロラフト剤の９５：５のブレンドの調製
Ｓｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈからのＬｕｄｏｘ ＡＳ４０（５．０ｇ）を、ＭＱ水１００ｇで希釈して、ナノ粒子の２ｗｔ％分散物を得た。そして、ｐＨは９．９７である。実施例８（ｂ）部（１．７２ｇ）及び実施例８（ｄ）部（０．１３ｇ）から構成されるマクロラフト剤の混合物を、１００ｇのＭＱ水に溶解し、ｐＨは、７．９５であった。次いで、２ｗｔ％分散物を、マクロラフト剤の混合物中に注ぎ入れた。混合物を、室温で５時間、激しく攪拌した。次いで、分散物を、透析して、塩、残りの溶媒、必要でない低分子量の反応副生成物及び結合していないポリマーを除去した。透析されたシリカゾル分散物の固体含量は１．４５％である。サンプルのｐＨは、７．６５であった。
（ｂ）部：実施例９（ａ）部のシリカ粒子の安定化剤の改変
実施例９（ａ）部で調製した立体的に安定化されたシリカゾル粒子（３０ｇ）に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、１１．６ｍｇ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、１６．６ｍｇ）を添加し、振盪することによって混合し、室温で２時間反応させた。次いで、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス−（エチルアミン）（４５．１ｍｇ）を、反応混合物に添加し、さらに１２時間反応させた。次いで、溶液を、数量を変化させながら過量の水に対して透析して、遊離のＥＤＡＣ及び反応副生成物を除去した。
ポリ（２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート） １０ −ブロック−ポリ（アクリルアミド） ２５ マクロラフト剤を用いた、１３０ｎｍシリカ粒子の立体的安定化
（ａ）部：シリカ粒子を、Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌの方法を用いて調製した
（Ｃａｒｌｏｓ Ａ． Ｒ． Ｃｏｓｔａ， Ｃａｒｌｏｓ Ａ． Ｐ． Ｌｅｉｔｅ， ａｎｄ Ｆｅｒｎａｎｄｏ Ｇａｌｅｍｂｅｃｋ Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ， ２００３， １０７ （２０）， ４７４７−４７５５）により、水中０．１８％固体で１３０ｎｍ直径のシリカ粒子を得た。
（ｂ）部：実施例８（ｄ）部のマクロラフト剤を用いた、実施例１０（ａ）部の１３０ｎｍ直径のシリカ粒子の立体的安定化
実施例１０（ａ）部のシリカ粒子分散物（１１．１５ｇ）を、ＭＱ水（２０ｇ）で希釈して、ｐＨ９．２６を有するナノ粒子の０．１ｗｔ％分散物を得た。実施例８（ｄ）部のマクロラフト剤（０．０２３ｇ）を、２５ｇのＭＱ水（２５ｇ）に溶解して、ｐＨ５．８０の溶液を得た。次いで、シリカ分散物及びマクロラフト溶液をブレンドし、室温で５時間、激しく攪拌した。次いで、分散物を遠心分離して、塩、残りの溶媒、必要でない低分子量の反応副生成物及び結合していないポリマーを除去した。立体的に安定化されたシリカ分散物の固体含量は、０．８１％である。
「グローフローム（ｇｒｏｗ ｆｒｏｍ）」アプローチを使用した、実施例１０（ａ）部の１３０ｎｍ直径のシリカ粒子の立体的安定化。
６−（トリエトキシシリル）ヘキシル ２−（（（メチルチオ）カルボノチオイル）−２−フェニルアセテートを用いて、実施例１０（ａ）部のシリカ粒子を、ＲＡＦＴ官能化し、ポリメトキシ−ＰＥＧアクリレート（Ａｌｄｒｉｃｈ ４５４ｇ／ｍｏｌ）を含むポリマー鎖を、Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．（Ｋｏｈｊｉ Ｏｈｎｏ， Ｙｉｎｇ Ｍａ， Ｙｕｎ Ｈｕａｎｇ， Ｃｈｉｚｕｒｕ Ｍｏｒｉ， Ｙｏｓｈｉｋａｚｕ Ｙａｈａｔａ， Ｙｏｓｈｉｎｏｂｕ Ｔｓｕｊｉｉ， Ｔｈｏｍａｓ Ｍａｓｃｈｍｅｙｅｒ， Ｊｏｈｎ Ｍｏｒａｅｓ， ａｎｄ Ｓｅｂａｓｔｉｅｎ Ｐｅｒｒｉｅｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２０１１， ４４ （２２）， ｐｐ ８９４４−８９５３）の方法に従い、粒子の表面から伸長（ｇｒｏｗｎ ｆｒｏｍ）させた。各固定化された鎖について得られた分子量は、およそ５６，０００ｇ／ｍｏｌであった。最終粒子は、１０ｍｇ／ｍＬの固形含量で、水中で得て、粒子サイズは、ＤＬＳで測定した場合、２５８ｎｍであった。
９５％ポリ（エチレンオキシド） １７ マクロラフト剤及び５％ポリ（アクリルアミド） ２０ マクロラフト剤を用いた、水性分散物中の１０〜１５ｎｍの金ナノ粒子の立体的安定化。
（ａ）部：水性媒体中で安定な、１０〜１５ｎｍのクエン酸塩安定化金ナノ粒子の合成。
クエン酸塩安定化金ナノ粒子（１０〜１５ｎｍ）を、Ｆｒｅｎｓの方法（Ｆｒｅｎｓ， Ｇ． Ｎａｔ． Ｐｈｙｓ． Ｓｃｉ． １９７３， ２４１， ２０−２）を用いて、調製した。簡潔に言うと、すべてのガラス製品をまず、王水溶液（２５ｖｏｌ％濃度の硝酸及び７５ｖｏｌ％濃度の塩酸）で洗浄し、次いで、ミリＱ水で数回リンスし、乾燥した。テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸三水和物（０．０１ｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を含有する水溶液１００ｍｌを、５００ｍＬの三首丸底フラスコで還流した。クエン酸三ナトリウム二水和物（０．０２ｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）の２ｍｌ溶液をそれに添加した。溶液を激しく攪拌しながら沸騰するまで加熱した。沸騰及び激しい攪拌を、３０分間維持した。黄色からワインレッドへの色の進行性の変化が観察された。溶液を冷却して、透析して、過量のクエン酸アトリウムを取り除き、５℃で保存した。分散物中のナノ粒子濃度は、５０ｐｐｍであった。
（ｂ）部：２−｛［（ブチルスルファニル）カルボノチオイル］スルファニル｝プロパン酸を用いた、ポリ（アクリルアミド）２０マクロラフト剤の調製。
ジオキサン（７．５ｇ）及び水（７．５ｇ）中の、２−｛［（ブチルスルファニル）カルボノチオイル］スルファニル｝プロパン酸（０．７１ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（０．０４ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、アクリルアミド（４．２８ｇ、６０．２ｍｍｏｌ）の溶液を、１００ｍＬの丸底フラスコ中に調製した。これを磁気的に攪拌し、１５分間窒素を導入した。次いで、フラスコを、４時間連続して攪拌しながら、７０℃の油浴に置いた。ポリマー溶液は、２５．１７％の固体を有した。
（ｃ）部：実施例１２（ａ）部のクエン酸塩安定化金ナノ粒子並びに実施例２（ａ）部のマクロラフト剤及び実施例１２（ｂ）部のマクロラフト剤の９５：５のブレンドからの、立体的に安定化された１０〜１５ｎｍの金ナノ粒子の調製。
実施例１２（ａ）部の１００ｍｌの金ナノ粒子分散物（５０ｐｐｍ）を、２５０ｍｌの丸底フラスコに移した。次いで、０．０１２ｇの実施例２（ａ）部のマクロラフト剤及び０．１５ｇの実施例１２（ｂ）部のマクロラフト剤を含有する１０ｍｌ溶液を添加した。混合物を、室温で２時間、磁気スターラーバーで激しく攪拌し、次いで、透析して、塩、残りの溶媒、必要でない低分子量の反応副生成物及び結合していないポリマーを除去した。精製されたナノ粒子分散物は、５０ｐｐｍの濃度であり、５℃で冷蔵庫に保存した。得られた水性ナノ粒子分散物は、リン酸緩衝生理食塩溶液中で安定であることが見出された。
（ｄ）部：実施例１２（ｃ）部の金ナノ粒子のための安定化剤の改変。
実施例１２（ｃ）部から調製されたコーティングされたナノ粒子（１００ｍｌ）中に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、４ｍｇ）、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、４．１ｍｇ）を添加し、攪拌することにより混合し、室温で２時間反応させた。次いで、ジアミンの溶液（水２ｍｌ中、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス−（エチルアミン）２１ｍｇ）を、反応混合物に添加し、さらに３．５時間反応させた。次いで、溶液を、数量を変化させながら過量の水に対して透析して、遊離のＥＤＡＣ及び反応副生成物を除去した。
チオール改変ポリ（アクリルアミド） ２０ 用いた、水性媒体に分散された、３〜８ｎｍの金ナノ粒子の立体的安定化
（ａ）部：イソプロピルアミンを用いた、実施例１２（ｂ）部のポリ（アクリルアミド）２０マクロラフト剤のチオール改変。
ジオキサン（７．５ｇ）及び水（７．５ｇ）中の、実施例１２（ｂ）部のポリ（アクリルアミド）２０マクロラフト剤（１ｇ、０．６ｍｍｏｌ）、イソプロピルアミン（１．７７ｇ、３０ｍｍｏｌ）の溶液を、１００ｍＬの丸底フラスコ中に調製した。これを、磁気的に攪拌し、１５分間窒素を充填し、次いで、２５℃で２４時間反応させた。この期間の終わりに、ポリマーを、ジエチルエーテル（５０ｍｌ）で沈殿した。沈殿物を、濾過により、反応混合物から分離して、ロータリーエバポレーターを用いて真空下乾燥した。乾燥したチオール末端化されたポリ（アクリルアミド）２０に、１５分間窒素を導入し、２０℃で気密容器に保存した。
（ｂ）部：実施例１３（ａ）部のチオール改変ポリ（アクリルアミド）２０を用いた、水性分散物中で立体的に安定化された３〜８ｎｍの金ナノ粒子の調製。
ミリＱ水（２５０ｍＬ）を、５００ｍＬの三首丸底フラスコで還流した。次いで、テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸三水和物（０．０５７１ｇ、０．１４４４ｍｍｏｌ）を含有する水溶液２５ｍＬを添加し、溶液を、沸騰するまで加熱した。次いで、水（２５ｍＬ）中の、クエン酸三ナトリウム二水和物（０．５ｇ、１．７ｍｍｏｌ）及び実施例１３（ａ）部のチオール改変ポリ（アクリルアミド）２０（０．１２ｇ、０．０７７９ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、反応を、２５℃で２時間行った。この期間の終わりまでに、溶液の色は、黄色からワインレッドに変わった。テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸三水和物に対する立体安定化剤のモル比は、この場合、０．５である。金ナノ粒子を、５２，０００ｇで３０分間の遠心分離により、分散物から分離した。ナノ粒子を、ミリＱ水に、１９０ｐｐｍの濃度で、再分散した。ＴＥＭにより得られた金ナノ粒子のサイズは、３〜８ｎｍであった。
実施例１３（ａ）部のチオール改変ポリ（アクリルアミド） ２０ を用いた、水性媒体中に分散された８〜１０ｎｍの金ナノ粒子の立体的安定化
ミリＱ水（２５０ｍＬ）を、５００ｍＬの三首丸底フラスコで還流した。テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸三水和物（０．０６５２ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を含有する水溶液２５ｍＬを添加し、溶液を沸騰するまで加熱した。次いで、水（２５ ｍＬ）中の、クエン酸三ナトリウム二水和物（０．５ｇ、１．７ｍｍｏｌ）及び実施例１３（ａ）部のチオール改変ポリ（アクリルアミド）２０（０．０２２ｇ、０．０１４２ ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、２５℃で２時間反応させた。この期間の終わりまでに、溶液の色は、黄色からワインレッドに変わった。テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸三水和物に対する立体安定化剤のモル比は、この場合、０．０９である。金ナノ粒子は、５２，０００ｇで３０分間の遠心分離により、分散物から分離された。ナノ粒子を、３９０ｐｐｍの濃度で、ミリＱ水に再分散した。ＴＥＭにより得られた金ナノ粒子のサイズは、８〜１０ｎｍであった。
実施例１３（ａ）部のチオール改変ポリ（アクリルアミド） ２０ を用いた、水性媒体中に分散された３０〜４０ｎｍの金ナノ粒子の立体的安定化
（ａ）部：水性媒体中で安定な、３０〜４０ｎｍのクエン酸塩安定化金ナノ粒子の合成。
クエン酸塩安定化金ナノ粒子（３０〜４０ｎｍ）を、Ｆｒｅｎｓの方法（Ｆｒｅｎｓ， Ｇ． Ｎａｔ． Ｐｈｙｓ． Ｓｃｉ． １９７３， ２４１， ２０−２）を用いて、調製した。簡単に言えば、すべてのガラス製品を、まず、王水溶液（２５ｖｏｌ％濃度の硝酸及び７５ｖｏｌ％濃度の塩酸）で洗浄し、次いで、ミリＱ水で数回リンスし、乾燥した。テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸三水和物（０．０１ｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を含有する水溶液１００ｍｌを、５００ｍＬの三首丸底フラスコで還流した。次いで、クエン酸三ナトリウム二水和物（０．０１ｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）の溶液１ｍｌを添加した、溶液を、激しく攪拌しながら、沸騰するまで加熱した。沸騰及び激しい攪拌を、３０分間維持した。黄色からワインレッドへの色の進行性の変化が観察された。溶液を周囲温度まで冷却し、透析して、過量のクエン酸ナトリウムを除去し、５℃で保存した、分散物中のナノ粒子の濃度は、５０ｐｐｍであった。
（ｂ）部：実施例１５（ａ）部の水性金ナノ粒子分散物及び実施例１３（ａ）部のチオール改変ポリ（アクリルアミド）２０からの、立体的に安定化された３０〜４０ｎｍの金ナノ粒子の調製。
実施例１５（ａ）部の金ナノ粒子分散物（５０ｐｐｍ）１００ｍｌを、２５０ｍｌの丸底フラスコに入れた。次いで、チオール改変ポリ（アクリルアミド）２０（０．００６８ｇ、０．００４４ｍｍｏｌ）を含有する実施例１３（ａ）部の水溶液の溶液１０ｍｌを添加した。混合物を、磁気スターラーバーで、室温で２時間激しく攪拌し、次いで、透析して、塩、残りの溶媒、必要でない低分子量の反応副生成物及び結合していないポリマーを除去した。次いで、精製されたナノ粒子分散物を、希釈して、水性ナノ粒子分散物中の固体充填を１９２ｐｐｍまで増大させた。得られた水性ナノ粒子分散物は、リン酸緩衝生理食塩溶液中で安定であることが見出された。
ポリ（スチレン） ９ −ｂ−ポリ（アクリルアミド） １５ マクロラフト剤を使用した、水性分散物中のポリスチレンナノ粒子の合成
（ａ）部：２−｛［（ブチルスルファニル）カルボノチオイル］スルファニル｝プロパン酸を用いた、自己組織化ポリ（スチレン）９−ｂ−ポリ（アクリルアミド）１５マクロラフト剤の調製。
ジオキサン（６．６１ｇ）及び水（４．４１ｇ）中の、２−｛［（ブチルスルファニル）カルボノチオイル］スルファニル｝プロパン酸（０．８０ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（０．１０ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、アクリルアミド（３．７１ｇ、５２．０６ｍｍｏｌ）の溶液を、５０ｍＬの丸底フラスコ中に調製した。これを磁気的に攪拌し、１０分間窒素を導入した。次いで、フラスコを、７０℃で５時間加熱することにより、澄んだホモポリマー溶液が製造された。この期間の終わりに、スチレン（３．１６ｇ、３０．３ｍｍｏｌ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（０．１９ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）、ジオキサン（２１．１５ｇ）及び水（６．１４ｇ）を、フラスコに添加した。混合物を攪拌し、１０分間窒素で脱酸素した。次いで、フラスコを、７０℃の油浴に戻して、一定に攪拌しながら、一晩浸した。
（ｂ）部：実施例１６（ａ）部で調製した自己組織化マクロラフト剤を使用した、ポリスチレンナノ粒子の合成
磁気スターラー上の５０ｍＬの丸底フラスコ中の、実施例１６（ａ）部からのマクロラフト剤の澄んだ分散物（１．００ｇ）に、水酸化ナトリウム溶液（１．９４ｇの０．３％溶液、水（２２．１ｇ）で０．１５ｍｍｏｌ）を滴下した。この混合物に、スチレン（１．１０９ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を添加し、一晩攪拌した。４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（１５．５ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）及び水酸化ナトリウム溶液（１．０４ｇの３％溶液、０．７８ｍｍｏｌ）を添加した。フラスコを、２時間攪拌し、次いで、封止して、続いて、１０分間の窒素導入により脱酸素した。フラスコ全体を、８０℃に温度設定した油浴に浸して、一定の磁気攪拌下、その温度に５時間維持した。ラテックスは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ光散乱による平均直径１５ｎｍを有する粒子を含んでいた。ラテックスを、ミリＱ水に対して透析して、不純物を除去した。
実施例１６（ａ）部の自己組織化ポリ（スチレン） ９ −ｂ−ポリ（アクリルアミド） ２０ マクロラフト剤を用いた、水性分散物中のポリスチレンナノ粒子の合成
（ａ）部：実施例１６（ａ）部の自己組織化マクロラフト剤をさらに伸長させて、ポリ（スチレン）５２−ｂ−ポリ（アクリルアミド）２０マクロラフトを形成する。
磁気スターラー上の２５ｍＬの丸底フラスコ中の、実施例１６（ａ）部からのマクロラフト剤の澄んだ分散物（１．０２ｇ）に、水酸化ナトリウム溶液（０．４４ｇの３％溶液、０．３３ｍｍｏｌ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（１４．１ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及び水（１４．０ｇ）を添加し、攪拌して溶解した。この混合物に、スチレン（０．６１ｇ、５．８５ｍｍｏｌ）を添加し、一晩攪拌した。次いで、フラスコを封止し、続いて、１０分間の窒素導入により脱酸素した。フラスコ全体を、７０℃に温度設定した油浴に浸し、一定の磁気攪拌下、その温度に６時間維持した。澄んだ分散物を得た。
（ｂ）部：実施例１７（ａ）部で調製されたマクロラフト剤分散物を用いた、ポリスチレンナノ粒子の合成
磁気スターラー上の５０ｍＬの丸底フラスコ中の実施例１７（ａ）部からのマクロラフト剤の澄んだ溶液（６．０９ｇ）に、水酸化ナトリウム溶液（０．３６ｇの３％溶液、０．２７ｍｍｏｌ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（２６．６ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）、スチレン（０．４５ｇ、４．３７ｍｍｏｌ）及び水（８．３１ｇ）を添加した。フラスコを、５時間攪拌し、次いで、封止し、続いて、１０分間の窒素導入により脱酸素した。フラスコ全体を、７０℃に温度設定した油浴に浸し、一定の磁気攪拌下、その温度で一晩維持した。ラテックスは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ光散乱による４７ｎｍの平均直径を有する粒子を含んでいた。ラテックスを、ミリＱ水に対して透析して、不純物を除去した。
ポリ（アクリルアミド） ２０ マクロラフト剤を用いた、水性分散物中のポリスチレンナノ粒子の合成
（ａ）部：２−｛［（ブチルスルファニル）カルボノチオイル］スルファニル｝プロパン酸を用いた、ポリ（アクリルアミド）２０マクロラフト剤の調製。
ジオキサン（１５ｇ）及び水（７．５ｇ）中の、２−｛［（ブチルスルファニル）カルボノチオイル］スルファニル｝プロパン酸（０．７３ｇ、３．０８ｍｍｏｌ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（０．０７ｇ、０．３ｍｍｏｌ）、アクリルアミド（４．３０ｇ、６０．５ｍｍｏｌ）の溶液を、１００ｍＬの丸底フラスコ中に調製した。これを、磁気的に攪拌し、１５分間窒素を導入した。次いで、フラスコを７０℃で４時間加熱して、澄んだホモポリマー溶液を製造した。
（ｂ）部：実施例１８（ａ）部で調製したマクロラフト剤を用いた、ポリスチレンナノ粒子の合成
実施例１８（ａ）部からのマクロラフト剤の澄んだ溶液（１．０５ｇ）、水酸化ナトリウム（２．０７ｇの３％溶液、１．５５ｍｍｏｌ）及び水（１２．１６ｇ）を、磁気スターラー上で攪拌しながら、２５ｍＬの丸底フラスコ中に調製した。この溶液に、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（１３．６ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）、ジオキサン（１．１ｇ）及びスチレン（１．１２５ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２時間攪拌して、エマルジョン様の混合物を得た。フラスコを封止し、続いて、１０分間窒素導入することにより脱酸素した。フラスコ全体を、７０℃に温度設定した油浴に浸し、一定の磁気攪拌下、その温度で一晩維持した。ラテックスは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ光散乱による平均直径２００ｎｍを有する粒子を含んでいた。ラテックスを、ミリＱ水に対して透析して、不純物を除去した。
ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（平均分子量９０００〜１１，０００、ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ）由来のデキストランでコーティングした粒子を用いた、酸化鉄ナノ粒子の安定化。（実施例１９は、比較例である）
５００ｍｌの三首丸底フラスコ中、２５ｍｌの０．５Ｍ ＦｅＣｌ２／４Ｈ２Ｏ及び２５ｍｌの１Ｍ ＦｅＣｌ３／６Ｈ２Ｏを混合し、磁気的に攪拌した。得られた溶液を、１００ｍｌのＭＱ水を添加することによって希釈し、７０℃の油浴に置いた。デキストラン溶液（水中、５０ｍｌの１５％固体）を添加し、溶液を油浴に１０分間維持した。次いで、アンモニア溶液（３０ｍｌ、２８％）を添加し、混合物を、さらに４５分間７０℃に維持した。反応生成物を室温まで冷却し、ＭＱ水に対して透析して、過量のアンモニアを除去した。水を少なくとも３回変えた。より大きな凝集物を、磁性沈殿により除去した。容積は、水をロータリーエバポレーターで除去することにより、約１００ｍｌまで減少させた。最終分散物を、超音波処理装置を用いて、７０％ＡＭＰで１０分間、また、３０％ＡＭＰで３０分間、超音波処理した。
実施例２（ｂ）部の５０％ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート） １０ −ブロック−ポリ（エチレンオキシド） １７ マクロラフト剤及び５０％アミン改変ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート） １０ −ブロック−ポリ（アクリルアミド） ２０ マクロラフト剤を用いた、実施例１（ａ）部の酸化鉄ナノ粒子の立体的安定化
（ａ）部：実施例１（ａ）部の水性磁性流体並びに実施例２（ｂ）のマクロラフト剤及び実施例２（ｃ）部のマクロラフト剤の５０：５０のブレンドからの、立体的に安定化された酸化鉄ナノ粒子の調製。
実施例１（ａ）部に従い調製された水性磁性流体（８．１０ｇ）を、ＭＱ水（５０ｇ）で希釈して、ナノ粒子の０．５ｗｔ％分散物を得た。次いで、この調製されたナノ粒子分散物のｐＨを、５まで上昇させた。実施例２（ｂ）部のマクロラフト剤３．３ｗｔ％及び実施例２（ｃ）部のマクロラフト剤１．８ｗｔ％の５．１ｗｔ％固体５０ｇからなるマクロラフトのブレンドを、一緒に混合し、０．１Ｍ ＮａＯＨを用いて、ｐＨを５に調節した。次いで、同じｐＨに維持した酸化鉄の分散物を、マクロラフトブレンドに添加した。混合物を、室温で２時間激しく攪拌し、その後、ｐＨを７．０に調節した。次いで、混合物を、さらに１２時間攪拌したままにした。このｐＨで、ナノ粒子が安定な状態でもあるために十分に０電荷のその点を超えつつ、コポリマーは部分的に中和されたままであった。次いで、分散物を、透析して、塩、残りの溶媒、必要でない低分子量の反応副生成物及び結合していないポリマーを除去した。透析された水性磁性流体分散物の固体含量は、０．６％である。
（ｆ）部：実施例２０（ａ）部の酸化鉄粒子のための安定化剤の改変
実施例２０（ａ）部から調製したコーティングされたナノ粒子（７０ｇ）中に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、８９．３ｍｇ）、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、１２７ｍｇ）を添加し、振盪することによって混合し、室温で２時間反応させた。次いで、２９１ｍｇの２，２’−（エチレンジオキシ）ビス−（エチルアミン）を、反応混合物に添加し、さらに１２時間反応させた。次いで、溶液を、数量を変化させながら過量の水に対して透析して、遊離のＥＤＡＣ及び反応副生成物を除去した。
実施例２（ｂ）部の８０％ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート） １０ −ブロック−ポリ（エチレンオキシド） １７ マクロラフト剤及び２０％アミン改変ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート） １０ −ブロック−ポリ（アクリルアミド） ２０ マクロラフト剤を用いた、実施例１（ａ）部の酸化鉄ナノ粒子の立体的安定化
（ａ）部：実施例１（ａ）部の水性磁性流体並びに実施例２（ｂ）部のマクロラフト剤及び実施例２（ｃ）部のマクロラフト剤の８０：２０のブレンドからの、立体的に安定化された酸化鉄ナノ粒子の調製。
実施例１（ａ）部に従い調製した水性磁性流体（８．１０ｇ）を、ＭＱ水（５０ｇ）で希釈して、ナノ粒子の０．５ｗｔ％分散物を得た。次いで、この調製したナノ粒子分散物のｐＨを５まで上昇させた。実施例２（ｂ）部のマクロラフト剤５．２８ｗｔ％及び実施例２（ｃ）部マクロラフト剤０．７２ｗｔ％の６．０ｗｔ％固体で５０ｇからなるマクロラフトのブレンドを一緒に混合し、０．１Ｍ ＮａＯＨを用いて、ｐＨを５に調節した。次いで、同じｐＨに維持した酸化鉄の分散物を、マクロラフトブレンドに添加した。混合物を室温で２時間激しく攪拌し、その後、ｐＨを７．０に調節した。次いで、混合物を、さらに１２時間攪拌させたままにした。このｐＨで、ナノ粒子が安定な状態でもあるために十分に０電荷のその点を超えつつ、コポリマーは部分的に中和されたままであった。次いで、分散物を透析して、塩、残りの溶媒、必要でない低分子量の反応副生成物及び結合していないポリマーを除去した。透析された水性磁性流体分散物の固体含量は、０．７％である。
（ｂ）部：実施例２１（ａ）部の酸化鉄粒子のための安定化剤の改変
実施例２（ｅ）部から調製したコーティングされたナノ粒子（６０ｇ）中に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、３９．４ｍｇ）、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、５６．２ｍｇ）を添加し、振盪することによって混合し、室温で２時間反応させた。次いで、１３０ｍｇの２，２’−（エチレンジオキシ）ビス−（エチルアミン）を、反応混合物に添加し、さらに１２時間反応させた。次いで、溶液を、数量を変化させながら過量の水に対して透析して、遊離のＥＤＡＣ及び反応副生成物を除去した。
実施例２（ｂ）部の９０％ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート） １０ −ブロック−ポリ（エチレンオキシド） １７ マクロラフト剤及び１０％アミン改変ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート） １０ −ブロック−ポリ（アクリルアミド） ２０ マクロラフト剤を用いた、実施例１（ａ）部の酸化鉄ナノ粒子の立体的安定化
（ａ）部：実施例１（ａ）部の水性磁性流体並びに実施例２（ｂ）マクロラフト剤及び実施例２（ｃ）部のマクロラフト剤の９０：１０のブレンドからの、立体的に安定化された酸化鉄ナノ粒子の調製。
実施例１（ａ）部に従い調製された水性磁性流体（８．１０ｇ）を、ＭＱ水（５０ｇ）で希釈して、ナノ粒子の０．５ｗｔ％分散物を得た。次いで、この調製されたナノ粒子分散物のｐＨを、５まで上昇させた。実施例２（ｂ）部のマクロラフト剤６．４ｗｔ％及び実施例２（ｃ）部のマクロラフト剤０５．９ｗｔ％の６．３ｗｔ％固体で５０ｇからなるマクロラフトのブレンドを、一緒に混合し、ｐＨを、０．１Ｍ ＮａＯＨを用いて５に調節した。次いで、同じｐＨに維持した酸化鉄の分散物を、マクロラフトブレンドに添加した。混合物を室温で２時間激しく攪拌し、その後、ｐＨを７．０に調節した。次いで、混合物を、さらに１２時間攪拌させたままにした。このｐＨで、ナノ粒子が安定な状態でもあるために十分に０電荷のその点を超えつつ、コポリマーは部分的に中和されたままであった。次いで、分散物を透析して、塩、残りの溶媒、必要でない低分子量の反応副生成物及び結合していないポリマーを除去した。透析された水性磁性流体分散物の固体含量は、０．８７％である。
（ｂ）部：実施例２２（ａ部の酸化鉄粒子のための、安定化剤のアミン改変
実施例２（ａ）部により調製されたコーティングされたナノ粒子（６０ｇ）中に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、２４．７ｍｇ）、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、３４ｍｇ）を添加し、振盪することによって混合し、室温で２時間反応させた。次いで、１８．２ｍｇの２，２’−（エチレンジオキシ）ビス−（エチルアミン）を、反応混合物に添加し、さらに１２時間反応させた。次いで，溶液を数量を変化させながら過量の水に対して透析して、遊離のＥＤＡＣ及び反応副生成物を除去した。
ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓのデキストラン（ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈから、平均分子量３５，０００〜４５，０００）での酸化鉄ナノ粒子の安定化（実施例２３は、比較例である）
２５ｍｌの溶液中０．５Ｍ ＦｅＣｌ２／４Ｈ２Ｏ及び２５ｍｌの溶液中１Ｍ ＦｅＣｌ３／６Ｈ２Ｏを、５００ｍｌの三首丸底フラスコ中で、磁気的に攪拌した。溶液混合物を、１００ｍｌのミリＱ水を添加して希釈し、得られた溶液を、７０℃の油浴に置いた。１０分後、次いで、デキストラン溶液（１５％、５０ｍｌ）を添加し、その後、アンモニア溶液（２８％ ３０ｍｌ）を添加した。混合物を７０℃にさらに４５分間維持した。反応混合物を室温まで冷却して、ＭＱ水に対して透析して、過量のアンモニアを除去した。水を少なくとも３回変えた。より大きな凝集物を、磁性沈殿により除去した。分散物の容積は、ロータリーエバポレーターを使用することによって、約１００ｍｌまで減少させた。最終分散物を、超音波処理装置を用いて、７０％ＡＭＰで１０分間、その後、３０％ＡＭＰで３０分間、超音波処理した。
９８％ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート） １０ −ブロック−ポリ（エチレンオキシド） １７ マクロラフト剤及び２％アミン改変ポリ（モノアクリルオキシエチルホスフェート） １０ −ブロック−ポリ（アクリルアミド） ２０ マクロラフト剤を用いた、実施例１（ａ）部の酸化鉄ナノ粒子の立体的安定化
（ａ）部：実施例１（ａ）部の水性磁性流体並びに実施例２（ｂ）部のマクロラフト剤及び実施例２（ｃ）部びマクロラフト剤の９８：２のブレンドからの、立体的に安定化された酸化鉄ナノ粒子の調製。［ＥＰ３４１０６３］
実施例１（ａ）部に従い調製した水性磁性流体（８．１０ｇ）を、ＭＱ水（５０ｇ）で希釈して、ナノ粒子の０．５ｗｔ％分散物を得た。次いで、この調製された。ナノ粒子分散物のｐＨを５まで上昇させた。実施例２（ｂ）部のマクロラフト剤６．４ｗｔ％及び実施例２（ｃ）部マクロラフト剤０．０８ｗｔ％である６．４８ｗｔ％固体で５０ｇからなるマクロラフトのブレンドを、一緒に混合し、ｐＨを０．１Ｍ ＮａＯＨを用いて、５に調節した。次いで、同じｐＨに維持された酸化鉄の分散物を、マクロラフトブレンドに添加した。混合物を室温で２時間激しく攪拌し、その後、ｐＨを７．０に調節した。次いで、混合物をさらに１２時間攪拌させたままにした。このｐＨで、ナノ粒子が安定な状態でもあるために十分に０電荷のその点を超えつつ、コポリマーは部分的に中和されたままであった。次いで、分散物を透析して、塩、残りの溶媒、必要でない低分子量の反応副生成物及び結合していないポリマーを除去した。透析された水性磁性流体分散物の固体含量は、０．８％である。
（ｂ）部：実施例２４（ａ）部の酸化鉄粒子の安定化剤のアミン改変
実施例２４（ａ）部から調製されたコーティングされたナノ粒子（５５ｇ）中に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、５．１’ｍｇ）、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、６．８ｍｇ）を添加し、振盪することによって混合し、室温で２時間反応させた。次いで、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス−（エチルアミン）（１８．２ｍｇ）を、反応混合物に添加し、これを、さらに１２時間反応させた。次いで、溶液を、数量を変化させながら過量の水に対して透析して、遊離のＥＤＡＣ及び反応副生成物を除去した。
スフェロイドの調製のための一般的な方法
ヒトＤＬＤ−１結腸ガン細胞及びヒトＰＡ−１卵巣ガン細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ， ＵＳＡ）から得た。細胞を、完全培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）及び２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充）で、３７℃で加湿した５％ＣＯ２雰囲気で維持した。スフェロイドを、１．５×１０５細胞／ｍｌでアガロースコーティングされた９６ウェルイメージングプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にプレートして形成し、細胞を、７２時間、３７℃で加湿した５％ＣＯ２雰囲気で凝集させて、１ウェルあたり単一のスフェロイドを形成させた。
活性化合物及びナノ粒子の細胞毒性の評価
活性化合物及び／又はナノ粒子を、アッセイの直前に、細胞培地で必要に応じて希釈した。細胞毒性を、以下のようなＭＴＴアッセイを用いて決定した。１×１０５細胞を、フラットボトム９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、一晩付着させた。化合物＋／−ナノ粒子の溶液を、４−ｌｏｇレンジに及ぶ濃度で、三連でウェルに添加し、７２時間インキュベートした。ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）（１．０ｍＭ）を各ウェルに添加し、さらに４時間インキュベートした。各ウェルから培養培地を除去して、ＤＭＳＯ（１５０μＬ）を添加し、プレートを５秒間振盪し、Ｖｉｃｔｏｒ３Ｖ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）において、６００ｎｍの吸光度をすぐに測定した。ＩＣ５０値を、未処置のコントロールのウェルにおける吸光度の５０％まで吸光度が減少した薬物濃度として決定した。少なくとも３回独立した試験を行い、各化合物について、各試験において、三連のリーディングをして、行った。使用したすべての活性化合物についての細胞毒性値を、表２に列挙した。
（ａ）ナノ粒子単独、（ｂ）ナノ粒子及び活性化合物の共投与（ｃ）まずナノ粒子、次いで活性化合物の時間経過処置をもちいて、実施例５のガンスフェロイドを処置するための一般的な方法
細胞アッセイで使用する前に、すべてのナノ粒子は、０．２２μｍフィルターを通して濾過するか、又は、Ｔｏｍｙ ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｓｔｅａｍ ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｒ ＥＳ−３１５において、１２０℃、２ＫＰａで２０分間オートクレーブするかのいずれかによって、滅菌した。
（ａ） 実施例２５からの３日たったスフェロイドの懸濁物に、ナノ粒子不完全培地を含む溶液１００μｌを、各スフェロイドに添加して、２００μｌ全容量中、粒子の最終濃度１０ｐｐｍを得た。スフェロイドを、３７℃で５％ＣＯ２のインキュベーターに置き換えた。２４時間のインキュベーション後、さらに実験する前に、培地中のナノ粒子を、過量のリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄することによって除去した。
（ｂ） 実施例２５からの３日たったスフェロイドの懸濁物に、活性化合物及びナノ粒子不完全培地を含む溶液１００μｌを、各スフェロイドに添加して、粒子の最終濃度１０ｐｐｍを得た。使用した活性化合物の濃度は、表３に規定してある。スフェロイドを、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーターに置き換えた。２４時間のインキュベーション後、培地中の遊離の活性化合物及びナノ粒子を、過量のリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄することにより除去した。
（ｃ） 実施例２５からの３日たったスフェロイドの懸濁物に、完全培地中にナノ粒子を含む溶液１００μｌを、各スフェロイドに添加して、粒子の最終濃度１０ｐｐｍを得た。スフェロイドを、３７℃で５％ＣＯ２のインキュベーターに置き換えた。２４時間のインキュベーション後、スフェロイドに、表２に列挙した濃度の活性化合物を投与し、さらに２４時間、３７°Ｃ、５％ＣＯ２でインキュベートした。培地中の遊離の活性化合物及びナノ粒子を、さらなる実験の前に、過量のリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄することによって除去した。
ナノ粒子及び蛍光活性化合物で処置したスフェロイドを、共焦点顕微鏡によりイメージングする一般的な方法
実施例２５からのスフェロイドを、実施例２７ｂ及び２７ｃのように処置し、次いで、ガラス底の３５ｍｍディッシュ（Ｍａｔｔｅｋ）に移し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＵＰＬＡＰＯ １０ｘ／０．４０ ａｉｒ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｓを使用してＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点顕微鏡でイメージングした。スフェロイドの中央領域を通した単一の共焦点イメージを得た。励起及び発光のセッティングは、フルオロフォアに依存した：ドキソルビシン ｅｘ：５５９ｎｍ、ｅｍ：５７５〜６７５；ミトキサントロン ｅｘ：４０５ｎｍ、ｅｍ：５７５〜６７５
スフェロイドにおける活性化合物＋／−ナノ粒子の効果を測定するための一般的な方法（増殖アッセイ）
実施例２５からのスフェロイドを、実施例２７ｂ及び２７ｃのように処置した。次いで、スフェロイドを、広口径のトランスファーピペットを用いて、２４ウェルプレートに移し、各ウェルにおいて、培地を１ｍＬの新鮮培地に置き換えた。次いで、スフェロイドを、４８時間、３７℃で、５％ＣＯ２加湿環境においてインキュベートした（これにより、スフェロイドが、プレートに付着し、細胞が、スフェロイドから、プレート表面まで増殖する）。次いで、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２をウェルに添加し、３０分間、３７℃で、５％ＣＯ２加湿環境において、インキュベートした。明視野及びＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色された核の広視野蛍光イメージは、スフェロイドから増殖した細胞のものである（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣｅｌｌＲ）。増殖を定量するために、スフェロイドの縁から６０°の角度内の核の数をカウントした。次いで、これらの値を、比較用の活性化合物単独で処置されたスフェロイド又は未処置のコントロールのスフェロイドにノーマライズしたグラフでプロットした。
スフェロイド中に浸透可能な立体的に安定化されたナノ粒子
実施例２５からのスフェロイドを、実施例２７ａのように、実施例２からの粒子で処置し、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、その後、２．５％グルタルアルデヒド溶液で一次固定し、１％四酸化オスミウムで二次固定した。次いで、スフェロイドを洗浄し、エタノールのグラジエントで脱水し、Ｓｐｕｒｒ’ｓ Ｒｅｓｉｎで浸潤した。名目上の厚さ９５ｎｍを有する超薄切片をカットし、網状格子上に置き、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛により後染色した。スフェロイドセクションのＴＥＭイメージを、１２０ｋＶでＪＥＯＬ １４００ ＴＥＭを用いて、得た。
図１のイメージは、スフェロイドの中央領域から得たものであり、細胞の細胞質内のナノ粒子の集積を示している（矢印で示した暗く染色された領域）。四角により拡大された領域は、良好に分散された個々のナノ粒子を示している。
薬物拡散に対するナノ粒子の効果
実施例２５のように調製したＤＬＤ−１スフェロイドを、実施例２７ａにおけるプロトコールのように、実施例２、３及び５）からのナノ粒子を投与し、実施例２８に記載される条件下でイメージングした。ドキソルビシン単独は、およそ７０μｍスフェロイド中に拡散した。ドキソルビシン及びＮＰ３又は５の共投与は、ドキソルビシンのスフェロイド浸透を、およそ１００μｍまで増大した。対して、ＮＰ２及びドキソルビシンの共投与は、スフェロイド全体に亘るドキソルビシン拡散を生じた（図２Ａ）。ミトキサントロン単独でも、およそ７０μｍスフェロイド中に拡散した。ＮＰ３及びミトキサントロンの共投与は、ミトキサントロン拡散にほとんど影響を及ぼさなかった一方、ミトキサントロン及びＮＰ２又はＮＰ５の共投与は、スフェロイド中へのミトキサントロンの拡散を顕著に増大した（図２Ｂ）。
スフェロイド生存率に対するナノ粒子の効果
実施例２５のように調製したＤＬＤ−１スフェロイドに、実施例２７ａにおけるプロトコールのように、実施例１、２、４、８、９、１２、１３、１５、１６及び１８からのナノ粒子を投与した。スフェロイドにおけるナノ粒子単独の効果を、実施例２９のように評価した。試験したナノ粒子の大多数は、図３に示すようにほとんど細胞毒性効果を有さなかったことが見出された。
ドキソルビシンと共投与した場合のスフェロイドの生存率に対する、異なるコアタイプを有するナノ粒子の効果。
実施例２５のようにして調製したＤＬＤ−１スフェロイドに、実施例２７ｂにおけるプロトコールのように、実施例２、４、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７及び１８からのナノ粒子並びにドキソルビシンを投与した。効果を、実施例２９のようにして決定した。図４は、ナノ粒子ＮＰ２（鉄のコア）、ＮＰ１１（シリカのコア）、ＮＰ１２（金のコア）、及びＮＰ１８（ポリスチレンのコア）と、ドキソルビシンとの共投与が、ドキソルビシン処置単独よりも、スフェロイドからの細胞の増殖が減少したことによって示されるように、より効果的であったことを示している。ナノ粒子のコアの組成は、効果とは相関しない。
ドキソルビシンと共投与した場合のスフェロイドの生存率に対する、異なるコアサイズを有するナノ粒子の効果。
実施例２５のように調製したＤＬＤ−１スフェロイドに、実施例２７ｂにおけるプロトコールのように、実施例１、２、４、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７及び１８からのナノ粒子と、ドキソルビシンとを投与した。効果を、実施例２９のように決定した。１０ｎｍから２００ｎｍまでのコアサイズ範囲を有するいくつかの異なるナノ粒子は、ドキソルビシンと共投与した場合、ドキソルビシン単独よりも効果的であることが示された（図５）。ドキソルビシンと共投与された粒子ＮＰ１、ＮＰ２、ＮＰ１２及びＮＰ１８の共投与は、ドキソルビシン処置単独よりも、およそ５０％より効果的であったことが示された。
ドキソルビシンと共投与した場合のスフェロイド生存率に対する、官能化された安定化剤の末端基の効果。
実施例２５のように調製したＤＬＤ−１スフェロイドに、実施例２７ｂにおけるプロトコールのように、実施例２、３、４、５、２０、２１、２２及び２４に列挙したナノ粒子と、ドキソルビシンとを投与した。効果を、実施例２９のように決定した。アミン官能化末端が、ドキソルビシンと共投与されたスフェロイド生存率に影響を与えたことが見出された。ナノ粒子表面上のアミン官能化基の割合を変化させることにより、本発明者らは、５〜２０％の間のアミン官能化末端基を含む粒子が、ドキソルビシンと共投与する場合、最も効果的であったことを見出した。ドキソルビシンは、５％アミン官能化末端基を有する安定化剤を含むナノ粒子との共投与の場合が、最も効果があった。
スフェロイドにドキソルビシンと共投与される、５％アミン官能化末端基を用いて安定化される異なるコアのナノ粒子。
実施例２５のようにして調製したＤＬＤ−１スフェロイドに、実施例２７ｂにおけるプロトコールのように、実施例２、８、９及び１２に列挙されたナノ粒子と、ドキソルビシンとを投与した。効果を実施例２９のように決定した。５％アミン官能化末端基を用いて安定化されたナノ粒子は、異なるコアを用いて製造されており、すべてが、ドキソルビシン単独よりもより効果的であり、ドキソルビシンと共投与した場合に、同様のレベルの効果を有していたことが示された（図７）。
２つの異なるガン細胞株から製造されたスフェロイドの生存率に対する、ナノ粒子と共投与される活性化合物の効果。
ＤＬＤ−１及びＰＡ−１のスフェロイドを、実施例２５のようにして調製し、実施例２７ｂにおけるプロトコールのように、実施例２、３、４及び５に列挙されたナノ粒子と、活性化合物とを投与した。効果は、実施例２９のようにして決定した。ミトキサントロンを除いて、粒子及び活性化合物の大多数は、２つの細胞株の間で同様の効果を有していた。ミトキサントロンとナノ粒子との共投与は、ＤＬＤ−１結腸直腸ガン株に比べて、ＰＡ−１細胞卵巣ガン細胞株において、顕著により効果的であった。
２つの異なる細胞株における、ナノ粒子と活性化合物との共投与と、活性化合物の遅延した投与を伴うナノ粒子の投与との間の、比較実施例。
ＤＬＤ−１及びＰＡ−１のスフェロイドを、実施例２５のように調製し、実施例２７ｂ及び２７ｃにおけるプロトコールのように、実施例２、３、４及び５に列挙したナノ粒子と活性化合物とを投与した。効果は、実施例２９のように決定した。図９及び１０は、いくつかの粒子と活性の組み合わせ（例えば、５ＦＵ＋ＮＰ３）について、いずれの細胞株においても、いずれの処置の態様についても、効果に差異はないことを示している。しかしながら、一般的に、試験した２つの細胞株の間で、処置スケジュールと効果との間に相関関係はほとんどない。各ガンのタイプについて、どのナノ粒子／活性の組み合わせが最も効果的かを決めることは重要である。ミトキサントロンは、最も大きな効果のためには、ＰＡ−１細胞におけるナノ粒子の共投与を必要とすることに留意すべきである。
試験した各活性化合物についての、ナノ粒子と活性化合物との最も効果的な共投与の例。
ＤＬＤ−１及びＰＡ−１のスフェロイドを、実施例２５のように調製し、実施例２７ｂにおけるプロトコールのように、実施例２、５、１４、２０、２１及び２２に列挙したナノ粒子と、活性化合物とを投与した。効果は、実施例２９のように決定した。示した結果は、ＤＬＤ−１スフェロイド（図１１Ａ）及びＰＡ−１スフェロイド（図１１Ｂ）の両方において、各化合物と共投与された最も効果的なナノ粒子（単数又は複数）についてのものである。
シスプラチンによるスフェロイド浸透を可能にするための、実施例１及び２の酸化鉄ナノ粒子を用いた実施例２５のガンスフェロイドの処置。
実施例２５のように調製したＤＬＤ−１スフェロイドを、シスプラチン並びに実施例１及び２からの酸化鉄ナノ粒子を含む完全培地の溶液１００μｌを投与することにより、シスプラチン及び酸化鉄の両方の６ｐｐｍの最終濃度を生じた。酸化鉄粒子及びシスプラチンを含むスフェロイドを、インキュベーターに置き換え、３７℃で５％ＣＯ２雰囲気に維持した。４８時間のインキュベート後、培地中の遊離のシスプラチン及びナノ粒子を、過量のリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。原子吸光分析による分析は、４８時間のインキュベーション後、ＮＰ１ナノ粒子、ＮＰ２ナノ粒子を含む、そして酸化鉄粒子を含まないスフェロイドにおけるシスプラチンの濃度が、それぞれ、０．６０、０．６３及び０．２０ｐｐｂ（ナノ粒子が存在した場合のシスプラチン集積における３倍の増加）であることを示した。
比較例：固定されていない立体的に安定化された粒子との共投与と比較した、固定された立体的に安定化された粒子と共投与した場合のスフェロイド中へのドキソルビシン浸透。
実施例２５からのＤＬＤ−１スフェロイドを、ＮＰ２（実施例２）（これは、ホスフェート固定基を含む安定化剤でコーティングされた粒子である。）或いはＮＰ１９又はＮＰ２３（実施例１９及び２３）（これらは、実施例２７ｂのように固定部位を有さない安定化剤でコーティングされた粒子である。）のいずれかで投与した。次いで、スフェロイドを、共焦点顕微鏡（実施例２８のように）によりイメージングして、ドキソルビシン蛍光を可視化した。ドキソルビシン及びＮＰ２で処置されたスフェロイドは、ドキソルビシン単独で処置されたスフェロイドに及び固定されていない立体的に安定化された粒子ＮＰ１９及びＮＰ２３を共投与したドキソルビシンで処置されたスフェロイドに比較して、スフェロイドの中心で顕著に多くのドキソルビシン蛍光を有していた（図１２）。
患者の腫瘍についての最も効果的なナノ粒子と活性化合物を決定するために、可能性のある試験レジメ。
いずれのタイプ（単数又は複数）のナノ粒子及びいずれのタイプ（単数又は複数）の活性薬物、ナノ粒子と薬物の最適な組み合わせを同定することは、個々の患者について最も効果的であった（腫瘍の生検が最初に試験されるだろう。）。いくつかのコアの腫瘍生検は、患者からとりだされ、より小さなサンプルへと解体され（およそ１ｍｍ３）、選択されたナノ粒子／薬物の組み合わせが投与されるだろう。それぞれの投与されたサンプルは、未処置のサンプル及び腫瘍内変異性についての制御するための薬物のみと隣接されるだろう。２４時間後、サンプルは、ナノ粒子及び薬物の最も効果的な組成及び投与を決定するために、ナノ粒子／薬物による腫瘍処置の効果を測定するための増殖アッセイに供されるだろう。
当業者は、本明細書中に記載された発明が、具体的に記載された以外の変更物及び改変物が許容されることを理解する。本発明はすべてのそのような変更物及び改変物を包含することが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書中で、個々に又は集合的に、参照されるか示された、工程、特徴、組成物、化合物のすべて、及び当該工程又は特徴の任意の２つ以上の任意の及びすべての組み合わせを包含する。
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Claims (30)

  1. 対象における固形腫瘍を治療する方法であって、該方法は、該対象に有効量の球状物質及び細胞毒素を、該腫瘍への該球状物質及び毒素の分散を促進するのに十分な時間及び条件下で、共投与することを含み、ここで：
    （ｉ） 該球状物質液体キャリア中の分散物の形態で投与され、該球状物質は、安定化剤により分散された状態に維持されており、
    （ｉｉ） 該安定化剤は、（ａ）該安定化剤を該球状物質に固定し（ｂ）該安定化剤の残部とは異なる固定部位を含み、
    ここで、該球状物質及び毒素が、該固形腫瘍に浸透する、方法。
  2. 固形腫瘍の治療のための医薬の製造における、球状物質及び細胞毒素の使用であって、
    （ｉ） 該球状物質は、液体キャリア中の分散物の形態であり、該球状物質は、安定化剤により分散された状態に維持されており、
    （ｉｉ） 該安定化剤は、（ａ）該安定化剤を該球状物質に固定し（ｂ）該安定化剤の残部とは異なる固定部位を含み、
    ここで、該球状物質及び毒素は、該固形腫瘍に浸透する、使用。
  3. 前記安定化剤が、立体安定化するポリマーセグメント及び固定部位を含む立体安定化剤であり、前記立体安定化するポリマーセグメントが該固定部位とは異なり、該固定部位は該安定化剤を前記球状物質に固定する、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載の使用。
  4. 前記立体安定化するポリマーセグメントが、末端イオン性官能基を含む、請求項３に記載の方法又は使用。
  5. 前記イオン性官能基が、カチオンである、請求項４に記載の方法又は使用。
  6. 前記安定化剤の前記立体安定化するポリマーセグメントが、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（ジメチルアミノエチルメタクリレート）、ポリ（ビニルピロリドン）、及びそれらのコポリマーから選択されるポリマーを含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  7. 前記固定部位が、１つ以上のカルボン酸基、１つ以上のリン酸基、１つ以上のホスフィン酸基、１つ以上のチオール基、１つ以上のチオカルボニルチオ基、１つ以上のスルホン酸基、エトキシシリル基、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  8. 前記安定化剤が、立体安定化するポリマーセグメント及び固定するポリマーセグメントを含む立体安定化剤である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  9. 前記立体安定化するポリマーセグメント及び固定するポリマーセグメントの一方又は両方が、１つ以上のエチレン系不飽和モノマーの重合された残基を含む、請求項８に記載される方法又は使用。
  10. 前記安定化剤が約３０，０００未満の数平均分子量を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  11. 前記球状物質が、金属、金属合金、金属塩、金属錯体、金属酸化物、無機酸化物、放射性アイソトープ、ポリマー粒子、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  12. 前記球状物質が、約１０ｎｍから約３５０ｎｍまでのサイズの範囲である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  13. 前記球状物質が、約１０ｎｍから約１５ｎｍまでのサイズの範囲である酸化鉄である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  14. 前記球状物質が、約１０ｎｍから約１５ｎｍまでのサイズの範囲である金である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  15. 前記球状物質が、約１０ｎｍから約１５ｎｍまでのサイズの範囲である酸化ケイ素である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  16. 前記球状物質が、約３０ｎｍから約４０ｎｍまでのサイズの範囲である酸化ケイ素である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  17. 前記球状物質が、約１０ｎｍから約１５ｎｍまでのサイズの範囲のポリスチレンである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  18. 前記固形腫瘍が良性である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  19. 前記固形腫瘍が悪性である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  20. 前記悪性固形腫瘍が転移性である、請求項１９に記載の方法又は使用。
  21. 前記固形腫瘍が、中枢神経系腫瘍、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、小児腫瘍、扁平上皮ガン等の頭頸部ガン、乳及び前立腺のガン、肺ガン、腎細胞腺ガン等の腎ガン、食道胃ガン、肝細胞ガン、腺ガン及び膵島細胞腫瘍等の膵胆管新生物、結腸直腸ガン、子宮頸ガン、肛門ガン、子宮又は他の生殖器系のガン、尿管又は膀胱のもの等の尿路ガン、精巣胚細胞腫瘍又は卵巣胚細胞腫瘍等の胚細胞腫瘍、卵巣上皮ガン等の卵巣ガン、未知の原発性のガン腫、カポジ肉腫等のヒト免疫不全関連の悪性腫瘍、リンパ腫、白血病、悪性メラノーマ、肉腫、甲状腺のもの等の内分泌腫瘍、中皮腫又は他の胸膜若しくは腹膜の腫瘍、神経内分泌腫瘍或いはカルチノイド腫瘍である、請求項１８〜２０のいずか１項に記載の方法又は使用。
  22. 前記細胞毒素が、細胞分裂阻害剤又は細胞破壊剤のいずれかである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  23. 前記剤が、アクチノマイシンＤ、アドリアマイシン、三酸化ヒ素、アルパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトサール、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルチコステロイド、カリケアミシン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビナ（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎａ）、ゲムシタビン、ジェムザール、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン（Ｍｅｒｃａｐｔｏｍｕｒｉｎｅ）、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、プラチノール（Ｐｌａｔｉｎｏｌ）、プラチネックス（Ｐｌａｔｉｎｅｘ）、プロカルビジン（Ｐｒｏｃａｒｂｉｚｉｎｅ）、ラルチトレキセド（Ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｅｌ）、リキシン、ステロイド、ストレプトゾトシン、タキソール、タキソテール、チオグアニン、チオテパ、トムデックス、トポテカン、トレオスルファン、三水和物、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎａ）、ビノレルビン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｓｉｎ）、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｓｉｎ）、マホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソウレア、マイトマイシンＣ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、アムサクリン、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｄｉｌ）、メチルシクロヘキシルニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシパーオキシシクロホスホルアミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、コルヒチン、トリメトレキサート、テニポシド、及びジエチルスチルベストロールから選択される、請求項２２に記載の方法又は使用。
  24. 前記剤が、ＤＮＡ傷害剤（例えば、ヌクレオフォスミン、又は別の剤との相乗的プロセスの一部として細胞性傷害を誘導する剤）、触媒抗体、プロドラッグ、ＣＨＫ１／２インヒビター（例えば、ＣＢＰ−５０１又はＡＺＤ７７６２）、ヒストンデアセチラーゼインヒビター（例えば、ボリノスタット）、リガンド又はＢＨ３ミメティック（例えば、ＡＢＴ７３７）を含む腫瘍壊死因子関連アポトーシス、チロシンキナーゼインヒビター等の小分子インヒビター、メシル酸イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びモノクローナル抗体（例えば、リツキシマブ又はトラスツズマブ）から選択される、請求項２２に記載の方法又は使用。
  25. 前記剤が、ＲＮＡ干渉メカニズムとして機能する分子である、請求項２２に記載の方法又は使用。
  26. 前記分子が、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項２５に記載の方法又は使用。
  27. 前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、長鎖二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ／小分子ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ／ｓｔＲＮＡ）、空間的推移を媒介するｍｉＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ）、ストレス応答（ｓｒＲＮＡ）若しくは細胞周期（ｃｃＲＮＡｓ）、内因的に発現されるｍｉＲＮＡ若しくはｓｔＲＮＡ又は外因的に誘導されるｓｉＲＮＡをハイブリダイズし機能を防止するように設計されたＲＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項２７に記載の方法又は使用。
  28. 前記粒子又は安定化剤が、前記腫瘍に指向するリガンドに結合されている、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  29. 前記球状物質が、前記細胞毒素の前に投与される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  30. 前記球状物質及び細胞毒素が同時に投与される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法又は使用。
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