ES2823927B2 - Composición en tamaño micrométrico y su uso como agente coadyuvante de alcaloides vegetales - Google Patents

Composición en tamaño micrométrico y su uso como agente coadyuvante de alcaloides vegetales Download PDF

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Description

DESCRIPCIÓN
Composición en tamaño micrométrico y su uso como agente coadyuvante de alcaloides vegetales
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una composición en tamaño micrométrico que comprende al menos un óxido metálico combinado con un polímero como, por ejemplo, celulosa, y un estabilizante, tal como polietilenglicol (PEG), y a su uso para la elaboración de un agente que potencie el efecto de una molécula farmacológicamente activa, tal como un alcaloide vegetal, con la que se coadministra el material de la invención, para el tratamiento de enfermedades.
Estado de la técnica
Docetaxel se clasifica como un "alcaloide vegetal", "taxano" y "agente antimicrotubular", y destaca por poseer significativos efectos antineoplásicos y citotóxicos. Su síntesis se produce a partir de la corteza del árbol tejo del Pacífico (Taxus), al igual que otros taxanos.
Este alcaloide vegetal está aprobado para el tratamiento del cáncer de mama, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer avanzado de estómago y cáncer de próstata metastásico. En este sentido, el cáncer de próstata es uno de los cánceres más frecuente entre los hombres a nivel mundial. Se trata de un tumor heterogéneo con una lenta pero constante velocidad de crecimiento, que evoluciona desde un estadio localizado y con sensibilidad a andrógenos hasta un estadio avanzado en el que se pierde dicha sensibilidad.
El tratamiento depende del estadio de la enfermedad, si se descubre de forma temprana, puede ser tratado satisfactoriamente mediante diferentes procedimientos. Sin embargo, cuando las células tumorales se indiferencian y evolucionan hacia un fenotipo de metástasis, los tratamientos actuales ofrecen menos posibilidades de curación.
Los tumores se caracterizan por la división celular, que deja de ser controlada como en el tejido normal. Las células "normales" dejan de dividirse cuando entran en contacto con células similares, un mecanismo conocido como inhibición por contacto y que se pierde en las células tumorales. En las células tumorales se desequilibra el sistema de autorregulación que controla y limita la división celular. El proceso de división celular, ya sea en células normales o tumorales, se realiza a través del ciclo celular. Este ciclo va de la fase de reposo, pasando por las fases de crecimiento activo, hasta la mitosis (división).
La capacidad de la quimioterapia para destruir las células tumorales depende de su capacidad para detener la división celular. Usualmente, los fármacos actúan dañando el ARN o ADN que indica a la célula cómo realizar una copia de sí misma en la división. Si las células no pueden dividirse, mueren. Cuanto más rápido se dividan las células, habrá más probabilidades de que la quimioterapia destruya las células y el tumor reduzca su tamaño. Además, estos fármacos inducen al suicidio celular (muerte celular programada o apoptosis).
La quimioterapia es muy efectiva para destruir las células que se dividen rápidamente. Desafortunadamente, la quimioterapia no reconoce la diferencia entre las células tumorales y las células “normales” del organismo. Las células "normales" volverán a crecer y ser saludables, pero, mientras tanto, se presentan efectos secundarios. Las células "normales" afectadas con mayor frecuencia por la quimioterapia son las células sanguíneas, las que se encuentran en la boca, el estómago y el intestino, así como los folículos pilosos; lo que provoca recuentos sanguíneos bajos, afecciones bucales, náuseas, diarrea y/o pérdida del cabello.
En la actualidad se usa una multitud de medicamentos de quimioterapia en el tratamiento contra los tumores, ya sea por sí solos o en combinación con otros medicamentos o tratamientos. Estos medicamentos son muy diferentes en su composición química, la manera en que se administran, su utilidad en el tratamiento de formas específicas de ciertos tumores y sus efectos secundarios.
En medicina, se denomina tratamiento coadyuvante a aquel que contribuye o ayuda a la solución del problema o enfermedad, de manera suplementaria. Su administración potencia el efecto del tratamiento principal, permitiendo reducir las dosis del mismo, disminuyendo la tolerancia, la toxicidad y los efectos colaterales. En la actualidad, la mayoría de los fármacos coadyuvantes utilizados junto a quimioterapia, se utilizan para paliar los efectos secundarios que estos producen.
La presente invención se refiere a la reducción de estos efectos secundarios a través de la reducción de la dosis efectiva del alcaloide vegetal farmacológicamente activo utilizado entre otras patologías, en el tratamiento de tumores mediante el empleo de una composición en tamaño micrométrico que actúa como coadyuvante.
Además de una ventaja en el aumento de la eficacia de los tratamientos con alcaloides vegetales, la presente invención también reduce el coste del tratamiento, al contrario de lo que se propone con otras alternativas eficaces y menos tóxicas que se están desarrollando actualmente.
Se conoce la utilización de un compuesto que comprende polietilenglicol para el tratamiento cáncer colorrectal, ES2401269B1, pero el resto de los componentes difieren con el de la presente invención. En este sentido, el documento ES2677242B1 se refiere a la formación de compuestos nanoconjugados que presentan actividad antitumoral frente al cáncer de próstata avanzado, pero no tienen similitud con el material utilizado en la presente invención.
La presente invención resuelve de manera más eficaz que el estado de la técnica actual, distintas patologías tales como el cáncer de próstata, ya que la composición de la invención potencia el efecto de los fármacos actuando como coadyuvante junto a alcaloides vegetales farmacológicamente activos, entre los que destacan, entre otros, docetaxel, paclitaxel o cabazitaxel.
Algunas de las ventajas de la composición de la presente invención son las siguientes: a) facilidad en la preparación y reproducibilidad del procedimiento de síntesis; b) son generalmente seguros in vivo y poco tóxicos; y c) no provocan una respuesta inmune específica y, por tanto, pueden ser administrados repetidamente.
Descripción de la invención
El término "micrométrico" tal como se utiliza aquí, se refiere a un material cuyas partículas tienen las tres dimensiones en el orden de la microescala, donde la microescala es el intervalo de aproximadamente entre 1-100 pm.
La expresión “alcaloide vegetal farmacológicamente activo” tal como se utiliza aquí, se refiere a un metabolito secundario vegetal, nitrogenado, que proviene del proceso metabólico de uno o varios aminoácidos y que genera efectos fisiológicos de distintas clases.
La expresión “líquidos biológicos” se refiere a cualquier fluido orgánico cualesquiera que sean, preferiblemente, sangre o plasma sanguíneo.
La expresión “Solvente acuoso” en esta memoria significa agua o cualquier mezcla de agua con otro líquido miscible en agua.
Cualquier otro término empleado en la presente memoria tendrá el significado habitual del sector de la técnica al que se refiere la presente invención.
La presente invención se refiere a una composición en tamaño micrométrico que comprende:
- al menos un óxido metálico, preferentemente seleccionado entre óxidos de: magnesio, hierro, molibdeno, zinc, aluminio, selenio o mezcla de los mismos,
- al menos un polímero natural o sintético, o una combinación de ambos y
- al menos un estabilizante.
El polímero puede ser un polímero natural, preferentemente celulosa o agarosa.
El polímero puede ser un polímero sintético como poliestireno, polivinil alcohol (PVOH), o polifluoruro de vinilideno (PVDF).
El estabilizante se puede seleccionar entre polietilenglicol (PEG), polietileneimina (PEI), ácido poliacrílico e isopropilacrilamina.
Los óxidos metálicos pueden estar presentes en forma de micropartículas de diámetro comprendido entre 1 pm y 10 pm.
Las dimensiones de las partículas de la composición a la que se refiere la presente invención son entre 1-100 pm, ambos tamaños incluidos.
En una realización particular de la invención, la composición en tamaño micrométrico comprende una mezcla de óxidos metálicos, celulosa y polietilenglicol (PEG). Los óxidos metálicos preferidos son uno o varios compuestos seleccionados entre: óxido de magnesio (MgO), dióxido de selenio (SeO2), óxido de hierro (II) (FeO), trióxido de molibdeno (MoO3), óxido de Zinc (ZnO) y óxido de Aluminio (M2O3).
Un objeto adicional de la invención es el procedimiento de síntesis de la composición de la invención que comprende las siguientes etapas:
(a) disolver al menos un óxido metálico en un solvente para alcanzar una concentración de 4­ 5 g de cada óxido por cada 100 ml del solvente,
(b) añadir a la solución de la etapa (a) entre 300 y 400 mg de cada polímero por cada 100 ml de la solución de la etapa (a),
(c) añadir a la solución de la etapa (b) entre 40 y 50 mg de cada estabilizante por cada 100 ml de la solución de la etapa (b) y
(d) sonicar la solución.
Según una realización particular el procedimiento comprende:
(a) disolver al menos un óxido metálico en un solvente acuoso, preferentemente agua para alcanzar una concentración de 4-5 g de cada óxido por cada 100 ml del solvente acuoso, preferentemente agua, y agitar por un intervalo de tiempo entre 10-60 minutos, preferentemente 30 minutos,
(b) añadir a la solución de la etapa (a) entre 300 y 400 mg de cada polímero por cada 100 ml de la solución de la etapa (a) y continuar con la agitación durante un intervalo de tiempo entre 10-60 minutos, preferentemente 30 minutos,
(c) añadir a la solución de la etapa (b) entre 40 y 50 mg de cada estabilizante por cada 100 ml de la solución de la etapa (b) y continuar con la agitación durante un intervalo de tiempo entre 1-3 horas, preferentemente 2 horas y
(d) sonicar la solución en un baño de ultrasonidos a 4-8°C a una intensidad entre 180 y 220 W y presión ambiente durante 0,5-2 horas, preferentemente 1 hora.
El procedimiento comprende opcionalmente, la extracción del solvente utilizado mediante evaporación.
Se puede emplear como solventes de la composición en tamaño micrométrico algún tipo de disolvente inorgánico como el agua, o algún tipo de disolvente orgánico como el dimetilsulfóxido (DMSO) o una mezcla de ambos.
El solvente acuoso puede ser agua, más preferentemente agua de calidad miliQ de resistividad 18,2 MQ.cm.
La agitación en las etapas del procedimiento de síntesis se puede realizar en un intervalo comprendido entre 250 y 300 revoluciones por minuto.
La temperatura del procedimiento de síntesis está comprendida entre 1 °C y 45°C, preferentemente entre 4°C y 25°C.
Otro aspecto adicional de la presente invención se refiere a una composición en tamaño micrométrico para el uso en la potenciación de la acción de alcaloides vegetales farmacológicamente activos.
Dicho uso comprende las siguientes etapas:
(a) administrar un alcaloide vegetal farmacológicamente activo, o un precursor del mismo, a un ser vivo,
(b) administrar al ser vivo la composición de la invención.
Las etapas (a) y (b) pueden llevarse a cabo en cualquier orden, simultáneamente sin mezclar previamente el alcaloide y la composición, o mezclándolos.
En una realización preferente el ser vivo es un ser humano.
Cuando se coadministran en los pacientes o seres vivos la composición en tamaño micrométrico y el alcaloide vegetal farmacológicamente activo, existe normalmente un proceso patológico o un grupo celular con comportamiento anómalo. Este proceso patológico puede comprender, por ejemplo, un crecimiento no controlado de un grupo de células o una disfunción celular debida a la alteración de algún proceso metabólico.
La composición en tamaño micrométrico se disuelve en los líquidos biológicos presentes en el ser vivo, permitiendo una distribución homogénea en dicho medio y la liberación controlada de iones metálicos por el organismo. De este modo, la concentración de estos iones metálicos en el ser vivo se mantiene constante durante un periodo más largo, cubriendo prácticamente todo el periodo de actuación del alcaloide vegetal farmacológicamente activo coadministrado, potenciando así su efecto. Así, se evitan las altas concentraciones de la composición en tamaño micrométrico en el momento de inoculación y una disminución rápida de la concentración de las sustancias administradas.
La concentración final de la composición en tamaño micrométrico, en los líquidos biológicos del paciente, puede ser entre 0,5 y 50 pg/ml.
Como se ha dicho anteriormente, la composición de óxidos metálicos, polímeros y estabilizantes produce una liberación controlada de los óxidos metálicos, reduciendo fluctuaciones en la concentración del material activo y su consiguiente toxicidad. Por otro lado, los óxidos metálicos utilizados en la presente invención no son tóxicos ya que se administran a bajas dosis gracias a que esta presentación en forma de moléculas poliméricas, permite un suministro de manera repetida, lo que favorece el tratamiento farmacológico.
La composición de la presente invención se puede administrar tanto de forma sólida como líquida.
La administración se puede realizar de manera continua (como un flujo de entrada constante) o de manera semicontinua (periódicamente),
La administración se puede realizar preferentemente por vía tópica o parenteral.
Sin embargo, esta administración puede realizarse con cualquiera de los procedimientos que puedan ser utilizados para la administración del alcaloide vegetal biológicamente activo coadministrado.
El tratamiento farmacológico se puede realizar de manera continua, administrando periódicamente al ser vivo el alcaloide vegetal farmacológicamente activo y la composición al que se refiere la presente invención.
Los alcaloides vegetales farmacológicamente activos son solubles en algún tipo de disolvente orgánico o inorgánico. Preferentemente, se prefiere la suspensión de los alcaloides vegetales en disolventes acuosos.
La composición en tamaño micrométrico se puede usar como agente coadyuvante para potenciar el efecto de diversos alcaloides vegetales farmacológicamente activos, por ejemplo: docetaxel, paclitaxel o cabazitaxel, o un precursor de los mismos.
La composición al que se refiere la presente invención se puede utilizar como agente coadyuvante para tratar distintas patologías entre las que destacan las neoplasias seleccionadas entre: mama, estómago, pulmón y próstata preferentemente próstata.
Para demostrar la eficacia de la invención, se ha utilizado un alcaloide vegetal cuyo efecto final es la muerte celular a través de varios mecanismos, por lo que hemos utilizado una técnica de medición de procesos apoptóticos (actividad Caspasa 3), una técnica de medición de viabilidad celular y actividad mitocondrial (ensayo de reducción del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazolio, MTT) y otra técnica para medir el efecto que tiene la composición de la invención sobre la muerte en células tumorales (ensayo de la enzima Lactato Deshidrogenasa, LDH).
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Distribución del tamaño de partícula por difracción láser tras preparar una suspensión de la composición al 1% en agua destilada.
Figura 2. Evaluación de la muerte celular mediante el ensayo de LDH. Porcentajes de LDH liberada al medio de cultivo por las células LnCaP de cáncer de próstata humanas, tras incubarlas a distintos tiempos con la composición al que se refiere la presente invención (50 pg/ml). Los datos vienen expresados como media ± s.e.m. (n=6). Los datos de cada columna indican el porcentaje de muerte celular que se produce tras cada tratamiento correspondiente. Los controles corresponden a las células no expuestas al producto (tiempo de exposición=0).
Figura 3. Ensayo de LDH tras 72 horas de exposición. Las células LnCaP de cáncer de próstata humano se incubaron con distintas concentraciones (pg/ml) de la composición al que se refiere la presente invención. Los datos vienen expresados como media ± s.e.m. (n=6). Los datos de cada columna indican el porcentaje de muerte celular que se produce tras cada tratamiento correspondiente. Los controles corresponden a las células tratadas con agua de calidad miliQ como vehículo.
Figura 4.- Evaluación de la toxicidad del alcaloide vegetal docetaxel mediante el ensayo de LDH. Porcentajes de LDH liberada al medio de cultivo por las células LnCaP de cáncer de próstata humanas, tras incubarlas a distintos tiempos con docetaxel (10 nM). Los datos vienen expresados como media ± s.e.m. (n=6). *p<0,05, **p<0,01, comparados con respecto a las células control (tiempo de exposición=0). Los datos de cada columna indican el porcentaje de muerte celular que se produce tras cada tratamiento correspondiente.
Figura 5.- Estudio del efecto de la coadministración de la composición al que se refiere la presente invención sobre la muerte celular inducida por docetaxel (10 nM, 72h). La mortalidad de células LnCaP de cáncer de próstata humanas viene expresada en función del porcentaje de LDH liberada. Los datos vienen expresados como media ± s.e.m. (n=6). *p<0,05, respecto de las células tratadas sólo con docetaxel. Los datos de cada columna indican el porcentaje de muerte celular que se produce tras cada tratamiento correspondiente.
Figura 6. Evaluación de la citotoxicidad mediante el ensayo de MTT. Porcentajes de MTT transformado en formazán respecto al grupo control (tratado con agua de calidad miliQ como vehículo), por las células LnCaP de cáncer de próstata humanas, tras incubarlas a distintos tiempos con la composición al que se refiere la presente invención (50 pg/ml). Los datos vienen expresados como media ± s.e.m. (n=6). Los datos de cada columna indican el porcentaje de viabilidad celular o actividad mitocondrial con respecto al control (tiempo de exposición=0), el cual se considera con una viabilidad del 100%.
Figura 7. Ensayo de MTT tras 72 horas de exposición. Las células LnCaP de cáncer de próstata humano se incubaron con distintas concentraciones (pg/ml) de la composición al que se refiere la presente invención. Los datos vienen expresados como media ± s.e.m. (n=6). Los datos de cada columna indican el porcentaje de viabilidad celular o actividad mitocondrial con respecto al control (tratado con agua de calidad miliQ como vehiculo), el cual se considera con una viabilidad del 100%.
Figura 8. Evaluación de la toxicidad del alcaloide vegetal docetaxel mediante el ensayo de MTT. Porcentajes de MTT transformado en formazán respecto al grupo control (tiempo de exposición=0) por las células LnCaP de cáncer de próstata humanas, tras incubarlas a distintos tiempos con docetaxel (10 nM). Los datos vienen expresados como media ± s.e.m. (n=6). *p<0,05, **p<0,01, comparados con respecto a las células control. Los datos de cada columna indican el porcentaje de viabilidad celular o actividad mitocondrial con respecto al control, el cual se considera con una viabilidad del 100%.
Figura 9. Estudio del efecto de la coadministración de la composición al que se refiere la presente invención sobre la viabilidad celular tras el tratamiento con el alcaloide vegetal docetaxel (10 nM, 24h). La viabilidad de las células LnCaP de cáncer de próstata humanas viene expresada en función del porcentaje de MTT transformado en formazán respecto al grupo control (tratado con agua de calidad miliQ como vehiculo). Los datos vienen expresados como media ± s.e.m. (n=6). *p<0,05, **p<0,01, respecto de las células tratadas sólo con el alcaloide vegetal docetaxel.
Figura 10. Estudio de la activación de caspasa 3 tras tratamientos con el alcaloide vegetal docetaxel (10nM) y tras el tratamiento con el alcaloide vegetal docetaxel (10nM) la composición a la que se refiere la presente invención (50pg/ml) en cultivos de células LnCaP de cáncer de próstata humanas. Los controles corresponden a las células tratadas con agua de calidad miliQ como vehículo. Los datos se expresan como media ± s.e.m. (n=6). *p<0.05, comparados con el control.
Ejemplos de realización
A continuación, se presentan unos ejemplos de realización con carácter ilustrativo y no limitativo con el objeto de completar la descripción y de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención.
Preparación de la composición en tamaño micrométrico
Para preparar la composición al que se refiere la presente invención en fase acuosa, utilizando agua de calidad mili-Q, cantidades de 40-50 g de cada uno de los siguientes compuestos: óxido de magnesio (MgO), dióxido de selenio (SeO2), óxido de hierro (II) (FeO), trióxido de molibdeno (MoO3), óxido de Zinc (ZnO) y óxido de aluminio (ALO3); se disolvieron en 1 litro de agua. Después de 30 min de agitación vigorosa (entre 250-300 RPM), se añadieron 3-4 g de acetato de celulosa y continuó la agitación vigorosa durante otros 30 minutos. A continuación, se añadieron 400-500 mg de PEG y se continuó agitando vigorosamente durante 2 horas más. Por último, la solución se sometió a sonicación en un baño de ultrasonidos de 200W de potencia (Selecta) con agua con hielo (4-8°C) y presión ambiente, durante 1 hora.
En la Figura 1 se muestra el tamaño de las composiciones en tamaño micrométrico, medido mediante difracción de rayo láser (Mastersizer 3000, Malvern Instruments). Esta medición se realizó varias veces y tras repetidos procedimientos de síntesis se obtuvieron resultados similares, por lo que se demuestra que es un proceso estable y reproducible.
Cultivos de líneas celulares
Las células LnCaP (ATCC® CRL-1740™) son una línea celular bien caracterizada de Carcinoma de Próstata humano. Se cultivaron en medio RPMI-1640 con FBS al 10%, 2mM de glutamina, y antibióticos (penicilina 100 Ul/ml y estreptomicina 100 pg/ml), según el manual del banco de origen de la línea celular y publicaciones anteriores (Alonso V et al., Life Sci. 2009;85:421-30).
Estudios de Citotoxicidad. Determinación de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH).
Estas pruebas para evaluar la toxicidad de las composiciones de tamaño micrométrico se realizaron en el cultivo de células tumorales LnCaP, determinando la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) (Posadas I et al., Pharm Res. 2009;26:1181-91). Las Figuras 2, 3, 4 y 5 completan esta descripción de los estudios de citotoxicidad.
Para ello, las células fueron sembradas en placas de 24 pocillos y se expusieron a soluciones con diferentes concentraciones del material polimérico al que se refiere la presente invención y del alcaloide vegetal farmacológicamente activo para realizar curvas de toxicidad concentración-dependiente y tiempo-dependiente.
Los efectos tóxicos se evaluaron midiendo la ruptura de la membrana celular y la consiguiente liberación de la LDH al sobrenadante a través del kit CytoTox96® (Promega) y los resultados se pueden observar en las gráficas.
Las células se despegaron mecánicamente, se lavaron con PBS y fueron centrifugadas a 10000 rpm durante 10 minutos.
La absorbancia del lisado y del sobrenadante celular se midió utilizando un espectrofotómetro de microplacas a una longitud de onda de 490nm.
Los resultados obtenidos con esta técnica utilizada para evaluar muerte celular, muestran que nuestra composición en tamaño micrométrico, a las dosis y tiempos estudiados, no es tóxico para este tipo de células LnCaP de cáncer de próstata (Figs. 2 y 3). Por el contrario, docetaxel (10 nM) sí que produce un significativo efecto citotóxico tras la exposición de las células durante 48 y 72 horas (Fig. 4). Este efecto tras 72 horas de exposición, es incrementado significativamente cuando se coadministra el alcaloide vegetal docetaxel (10 nM) y la composición descrita en la presente invención a dosis de 10 y 50 gg/ml, comparados con la administración del alcaloide vegetal en solitario (Fig. 5).
Los resultados muestran que cuando se coadministra la composición en tamaño micrométrica junto con un alcaloide vegetal farmacológicamente activo, el efecto citotóxico es significativamente mayor que cuando se administra el alcaloide vegetal en solitario.
Estudios de Citotoxicidad. Ensayo de reducción del bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazolio (MTT).
Este ensayo es un método colorimétrico cuantitativo que se basa en la reducción del MTT, o sal de tetrazolio, por la acción de la succinato deshidrogenasa mitocondrial, generando cristales de formazán insolubles en medio acuoso, pero solubilizables mediante el uso de disolventes orgánicos. Este producto puede ser cuantificado espectrofotométricamente.
Para medir la actividad mitocondrial (marcador de la funcionalidad y viabilidad celular), 200 pl de una solución con sustrato MTT (Sigma) a una concentración de 5 mg/ml fue añadida a las células. Tras una incubación de 4 horas, se retiró el sobrenadante y los cristales insolubles de formazán formados se disolvieron en 200 pl de DMSO. La absorbancia se midió en un espectofotómetro a una A de 540 nm, empleando además una A de referencia de 690 nm. La viabilidad celular (actividad mitocondrial) se expresó como porcentaje de MTT transformado en formazán respecto al grupo control tratado con vehículo (agua de calidad miliQ) (Posadas I et al. Br J Pharmacol. 2007;150:577-85).
Los resultados obtenidos con esta técnica utilizada para evaluar viabilidad celular, muestran que la composición de tamaño micrométrico al que se refiere la presente invención a las dosis y tiempos estudiados, no son tóxicas para este tipo de células LnCaP de cáncer de próstata (Figs. 6 y 7). Por el contrario, docetaxel (10 nM) sí que reduce significativamente la viabilidad celular tras la exposición de las células durante un tiempo igual o superior a 24 horas (Fig. 8). Este efecto tras 24 horas de exposición, es incrementado significativamente cuando se coadministra el alcaloide vegetal docetaxel (10nM) y la composición descrita en la presente invención a dosis iguales o superiores a 0,5 pg/ml, comparados con la administración del alcaloide vegetal en solitario (Fig. 9).
Los resultados muestran que cuando se coadministra nuestra composición en tamaño micrométrico con un alcaloide vegetal, el efecto citotóxico es significativamente mayor que cuando se administra el alcaloide vegetal en solitario.
Estudio de apoptosis. Determinación de la actividad caspasa 3.
Las caspasas son proteínas capaces de hidrolizar otras proteínas en sitios específicos. Aprovechando esta característica, la actividad caspasa 3, que participa en las fases finales del proceso de apoptosis), se puede cuantificar gracias al diseño de secuencias peptídicas, específicamente reconocidas como sustrato, a las que se ha unido un fluoróforo o cromóforo que se activa al ser separado por la hidrólisis específica que ejerce esta enzima.
Se utilizó el sustrato fluorogénico Z-DEVD-AFC (Calbiochem), que es reconocido por la caspasa 3, ya que contiene la secuencia de reconocimiento Asp-Glu-Val-Asp (DEVD), y está unida al fluoróforo 7-amino-4-trifluorometil cumarina (AFC), que emite fluorescencia al hidrolizarse el péptido. La intensidad de fluorescencia generada por el fluoróforo activado es directamente proporcional a la actividad caspasa 3 presente en las células LnCaP utilizadas.
Siguiendo el protocolo habitual en el área, tras los tratamientos correspondientes, las células fueron lavadas con PBS y despegadas mediante tripsinización. El "pellet" resultante al centrifugar a 1200 rpm (150 xg), 5 minutos a 4°C, se resuspendió en un buffer de lisis (en mM: 100 HEPES, 5 DTT, 5 EGTA, 0,04% Nonidet P-40 y 20% glicerol, con un pH 7,4) y se incubó 60 minutos a 4°C, tras lo que se procedió a centrifugar las muestras a 4200 rpm (1800 xg) durante 15 minutos a 4°C. La concentración de proteína en los sobrenadantes se determinó mediante el método Bradford, siguiendo un protocolo estándar (Jordan J et al. J Neurochem.
2004;89:124-33).
Los extractos celulares (30 pg de proteína) se incubaron con un buffer de reacción (en mM: 25 HEPES, 10 DTT, 10% sucrosa y 0,1% de ácido 3-[(3-colamido propil)-dimetilamonio]-2-hidroxi-1-propanosulfónico ) que contiene 50 pM de sustrato fluorescente Z-DEVD-AFC, a 37°C durante 1 hora. La fluorescencia emitida se determinó en un espectrofotómetro a una A de excitación de 400 nm y una A de emisión de 505 nm (Jordan J et al. J Neurochem.
2004;89:124-33).
Los resultados obtenidos con esta técnica utilizada para evaluar la implicación de procesos de muerte celular programada o apoptóticos, muestran que este tipo de procesos está presente en la citotoxicidad producida por el alcaloide vegetal docetaxel a dosis de 10 nM durante 24 horas. Esta vía apoptótica, es incrementada significativamente cuando se coadministra el alcaloide vegetal docetaxel (10 nM) y la composición en tamaño micrométrico descrito en la presente invención a dosis de 50 pg/ml, comparados con la administración del alcaloide vegetal en solitario (Fig. 10).
Recogida y análisis de datos.
Cada valor obtenido corresponde a un mínimo de 6 experimentos (n=6). Todos los datos se presentan como media ± s.e.m. Las diferencias entre los grupos, para cada uno de los parámetros analizados, se analizaron con un test ANOVA no paramétrico (Kruskal-Wallis), seguido de una prueba ad-hoc (Dunnett). Una p menor o igual a 0,05 se consideró significativa. El software SPSS 13.0 (Chicago, IL) se utilizó para realizar todo el análisis estadístico.

Claims (20)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Una composición en tamaño micrométrico, que comprende:
    - al menos un óxido metálico,
    - al menos un polímero natural o sintético, o una combinación de ambos, y
    - al menos un estabilizante.
  2. 2. - Composición según la reivindicación 1, en la que el óxido metálico está seleccionado entre óxido de: magnesio, hierro, molibdeno, zinc, aluminio, selenio y mezcla de los mismos.
  3. 3. - Composición según la reivindicación 1, en la que el polímero está seleccionado entre: celulosa, agarosa, poliestireno, polivinil alcohol (PVOH), y polifluoruro de vinilideno (PVDF).
  4. 4. - Composición según la reivindicación 1, en la que el estabilizante se selecciona entre polietilenglicol (PEG), polietileneimina (PEI), ácido poliacrílico e isopropilacrilamina, preferentemente polietilenglicol.
  5. 5. - Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el óxido metálico está presente en forma de micropartículas de diámetro comprendido entre 1 pm y 10 pm.
  6. 6. - Composición según la reivindicación anterior, en la que las dimensiones de las partículas de la composición son entre 1-100 pm, ambos tamaños incluidos.
  7. 7. - Composición según la reivindicación anterior, en el que la composición en tamaño micrométrico comprende una mezcla de óxidos metálicos, celulosa y polietilenglicol (PEG), los óxidos metálicos son óxido de magnesio (MgO), dióxido de selenio (SeO2), óxido de hierro (II) (FeO), trióxido de molibdeno (MoOs), óxido de Zinc (ZnO) y óxido de aluminio (M2O3).
  8. 8. - Procedimiento de síntesis de la composición definida en una de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende las siguientes etapas:
    (a) disolver al menos un óxido metálico en un solvente para alcanzar una concentración de 4­ 5 g de cada óxido por cada 100 ml del solvente,
    (b) añadir a la solución de la etapa (a) entre 300 y 400 mg de cada polímero por cada 100 ml de la solución de la etapa (a),
    (c) añadir a la solución de la etapa (b) entre 40 y 50 mg de cada estabilizante por cada 100 ml de la solución de la etapa (b) y
    (d) sonicar la solución (c).
  9. 9. - Procedimiento según la reivindicación anterior, que además comprende, tras la etapa (d) extraer el solvente utilizado mediante evaporación.
  10. 10. - Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, en el que se emplea como solvente de la composición un solvente orgánico, inorgánico o una mezcla de ambos.
  11. 11.- Procedimiento de síntesis según la reivindicación anterior, en el que la temperatura de cualquiera de las etapas (a) (b) y (c) está comprendida entre 1°C y 45°C, preferentemente entre 4°C y 25°C.
  12. 12.- Composición en tamaño micrométrico definida en una de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la potenciación de la acción de alcaloides vegetales farmacológicamente activos.
  13. 13.- Composición según la reivindicación anterior, en la que el uso comprende las siguientes etapas:
    (a) administrar un alcaloide vegetal farmacológicamente activo, o un precursor del mismo, al ser vivo y
    (b) administrar al ser vivo la composición de la invención.
  14. 14.- Composición según la reivindicación anterior, en la que las etapas (a) y (b) se llevan a cabo en cualquier orden, o simultáneamente sin mezclar previamente el alcaloide y la composición, o mezclándolos.
  15. 15.- Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en la que el ser vivo es un ser humano.
  16. 16.- Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en la que la composición en tamaño micrométrico se administrar tanto de forma sólida como líquida.
  17. 17.- Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en la que la administración se realiza:
    - de manera continua, flujo de entrada constante o
    - de manera semicontinua, periódicamente.
  18. 18.- Composición según la reivindicación anterior, en la que la administración se realiza por vía tópica o parenteral.
  19. 19. - Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, en el que la composición en tamaño micrométrico se emplea como agente coadyuvante para potenciar el efecto de alcaloides vegetales farmacológicamente activos, seleccionados entre: docetaxel, paclitaxel, cabazitaxel, y un precursor de dichos alcaloides.
  20. 20. - Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, en el que la composición en tamaño micrométrico se emplea como agente coadyuvante para tratar patologías seleccionadas entre neoplasias de mama, estómago, pulmón y próstata preferentemente próstata.
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