JP2014510280A - グラフト結合複核金属錯体およびその細胞性微粒子センサーとしての使用 - Google Patents

グラフト結合複核金属錯体およびその細胞性微粒子センサーとしての使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、式(I)または式(II)
Figure 2014510280

(式中、Mは金属イオンを表す)を有する新規なグラフト結合複核金属錯体に関し、またそれを細胞性微粒子の検出および/また特徴づけの方法においてセンサーとして使用することに関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規なグラフト結合複核金属錯体、ならびにそれらを支持(または不均一)媒体中または溶液中の細胞性微粒子を検出および/または特徴づけるための方法においてセンサーとして使用することに関する。
用語「細胞性微粒子」または「細胞性微小胞」は、区別なく使用することができる。便宜上は用語「微粒子」または「細胞性微粒子」が下記の記述において使用されるものとする。
細胞性微粒子は、血管機能障害に関連した炎症または疾患を含めた様々な病理学的状態の中で細胞活性化の間に、またはアポトーシスの間に生体液中に放出される膜細胞性微小胞である。
これらの微粒子は、細胞膜の組織修復の後に細胞外空間中に放出され、こうして内部葉状器官上だけでなくそれらの細胞起源の他のアイデンティティマーカー上に普通に存在する外部葉状ホスファチジルセリン上に露出する。
細胞性微粒子は、ミクロン以下のサイズ(0.1〜1μm)である。それらは生体液中、とりわけ健康な個体の循環血液中に存在するが、高レベルでのそれらの存在は、様々な血栓性、炎症性、および代謝性障害と関連があり、また癌と関連がある。癌のほかにこれらの疾患は無数にあり、糖尿病およびその血管合併症から、アテローム性動脈硬化症を含めた炎症性疾患までの範囲にわたる。具体的にはそれは、血栓症、またさらには神経血管の虚血状態のリスクの増加を伴う心血管疾患に関係している。
したがって細胞性微粒子は、様々な疾患、具体的には血栓性、炎症性、および/または代謝性障害の発症のリスクを診断し評価することを可能にし、それによって治療の追跡調査およびその監視を可能にする早期マーカーと考えることができる。
神経血管の損傷および閉塞性心血管疾患は、癌の直後に病的状態および死亡の主要原因を構成する。欧州および米国ではこれらの病変が、社会的および経済的意味合いだけでなく公衆衛生の点でもかなりのコストを生ずる。
これらの閉塞性偶発事故は、その部位に形成される血栓か、または塞栓症の結果である。閉塞性血栓の形成は、局所的繊維素溶解のきずと関連があった。しかしながら、この病態生理学的意味合いにもかかわらず、現在ではリスク評価および予防を可能にする血管内腔中の繊維素溶解活性の評価に利用可能な信頼性のある方法は存在しない。
幾つかの研究の結果は、高濃度の細胞性微粒子がすぐれた予後値を保有することを示している。
検出の方法はすでに確立されている。幾つかの利用可能な技術にはフローサイトメトリーが含まれ、これは最も広く使用される。この方法は、キャリブレーションビーズを使用することによって細胞性微粒子の表現型の検査および部分的定量化をある程度可能にする。この方法は、ホスファチジルセリンと、細胞タンパク質であるアネキシンA5との親和性をうまく利用する。より一般的には、それらの膜上に露出した抗原決定基に向けられる抗体を使用する。
具体的には細胞性微粒子は、アネキシンA5により放出される蛍光を測定することによって、または蛍光化合物で標識した抗体を用いて検出することができる。
しかしながらこの方法の感度は、サイズが500nm未満の細胞性微粒子の同定を可能にしない。
アネキシンA5はまた、「捕獲/定量化」試験においても使用され、その場合、ホスファチジルセリンを露出した細胞性微粒子が、マイクロタイタープレートのウェルの表面に固定化されたアネキシンA5によって捕獲される(Hyphen Biomed会社によって開発された試験)。
しかしながらこの技術は、得られる要素の表現型および分布を可能にしない。さらにその実行は厄介であり、かつ複数の実験因子に左右される。アネキシンA5による細胞性微粒子の捕獲は、高度にカルシウムイオン依存性であり、かつ実験の変動(タンパク質分解、様々な配位子との相互作用など)に敏感である。
したがってこれら利用可能な検出技術は精度および感度に欠ける。さらにそれらはきわめて費用がかかることが多い。
したがって正確かつ標準化されたやり方で生体液中の細胞性微粒子の、具体的には表現型を検出し、定量化し、特徴づけることができることが望ましい。
用語「生体液」とは、例えば血液、血漿、髄液、気管支肺胞液、尿、滑液、母乳、唾液、涙、精液、腹水、羊水、および滲出液(胸膜または他の)を含めた任意の抽出可能な体液を意味するものと理解される。
ところで本発明者等は、細胞性微粒子を合成配位子によって捕獲する検出および/または特徴づけの方法を開発した。
本発明による方法は、どのようなサイズであろうと細胞性微粒子の検出および/または特徴づけを可能にする。さらに合成配位子の使用により、生物学的分子の使用に関連する不利点、例えば他の配位子、具体的には抗体、タンパク質分解、およびカルシウム感受性による干渉さえも避けることが可能になる。
したがって第一の態様によれば本発明は、微粒子の表面における外面化したホスファチジルセリンを認識し、かつそれと特異的に結合することができるグラフト結合複核金属錯体に関する。
この記述の下記の項において用語「グラフト結合複核金属錯体」または「センサー」は、以下本明細書で式(I)または(II)を有する化合物を定義するために区別なく使用されるものとする。
したがって本発明の目的は、式(I)または式(II)
Figure 2014510280
Figure 2014510280
を有する化合物に関する。
式中、
+iは金属イオンであり、iは1、2、または3であり、
Lは交換可能な配位子であり、
Xは、−(CH2m−NH−A基、または−CH2−NHC(O)−R−NH−A基である(ただし、Rは、置換または非置換の線状または分枝状いずれかのC2〜C10アルキル基、好ましくはC6〜C10アルキル基であり、またAは、Hまたは発蛍光団基である)であり、
m=1〜12、
n=1、2、または3、
iは金属の電荷であり、1、2、または3であり、
Yは、(CH2p−NH2(ただし、p=0〜12)である。
好ましくはMは、Zn、Cu、Mn、Co、Ni、およびFeから選択され、ZnまたはCuが好ましい。
水性溶液中では式(I)および(II)を有する化合物は、媒体のpHによっては平衡状態にあることができる。例えばX=CH3、n=1、M=CuまたはZnの場合、生理学的pHにおいて両方の種の存在を観察することができる。
これらは、その対イオンを、例えばトシル酸、硝酸、硫酸、スルホン酸、チオ硫酸、ハロゲン化物イオン、ヘキサフルオロリン酸、テトラフェニルホウ酸、テトラフルオロホウ酸陰イオンなどのなかから選択することができるカチオン化合物である。
用語「交換可能な配位子」とは、金属イオンと弱く相互作用し、溶媒分子などの周囲の溶液、例えば具体的にはH2Oの分子、またはアセトニトリルなどの別の溶媒、あるいはまたその溶媒中に溶解した分子との交換のために利用可能な分子を意味するものと理解される。
実際にはその溶液中に存在する分子は、所与の金属イオンに対する親和性を有することができ、交換可能な配位子に対する競合効果をもたらす。
この記述の下記の項において用語「配位子」とは、金属イオンとの錯体形成の前の式(I)または(II)を有する化合物の複核部分を指すものとし、また用語「複核金属錯体」または「センサー」は、その錯化配位子を指すものとする。
式(I)または(II)を有する化合物は、その配位子部分についてはC.Belle等の論文、Tetrahedron Letters,1994,35,7019〜7022に、また錯体形成に関してはK.Selmeczi等の論文、Chem.Eur.J.,2007,13,9093〜9106中に記載されている方法を適合させることによって調製することができる。最終の錯体の単離は、その得られる化合物の形態に基づいて、通常の技術(粉末、油の起こり得る沈殿、回収など)が適応される。
式(I)または(II)を有する化合物の調製方法は、具体的には
a)配位子前駆体を合成するステップ(この前駆体は、アミノ官能基(A=Hの場合)が、保護基によってビス(2−ピリジルメチル)アミンすなわちBPAと、2−[3,5−ビス(クロロメチル)−4−ヒドロキソベンジル]イソインドール−1,3−ジオンとから保護される)、
b)こうして得られた配位子の脱保護するステップ、次いで
c)金属イオンによりそれを錯化するステップ
を含むことができる。
アミン官能基の保護基としては、例えば、フタルイミド基、tert−ブチルオキシカルボニル(BOC)、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(FMOC)、アセチル、トシル、またはカルバミン酸が使用されるはずである。
BPAは市販されており、また2−[3,5−ビス(クロロメチル)−4−ヒドロキソベンジル]イソインドール−1,3−ジオンは、刊行物M.Johansson等の論文、Inorg.Chem.2003,42,7502〜7511中に記載されている。
アミン官能基がフタルイミド基によってBPAおよび2−[3,5−ビス(クロロメチル)−4−ヒドロキソベンジル]イソインドール−1,3−ジオンから保護される前駆体配位子の合成は、例えば実施例1および2で述べるように行うことができる。
「アーム」としても知られるX基および/またはY基は、それらが存在する場合、線図1において化合物(4)から出発する金属イオンの錯体形成に先立って配位子のフェノール単位上にグラフトすることができる。
本発明の一態様によれば複核金属錯体のフェノール単位上にグラフトされたアームは、例えばフィコエリスリン(PE)またはフルオレセイン、特にフルオレセインイソチオシアナート(FITC)などの発蛍光団基を含む。
式(I)または(II)を有する好ましい化合物は、式中、
MがZnまたはCuであり、
Xが−(CH2m−NH−A(ただし、m=1、AがH、n=1、p=0)であるか、または
Xが−(CH2m−NH−A(ただし、m=1、AがH、n=2、p=0)であるか、または
Xが−CH2−NHC(O)−R−NH−A(ただし、AがH、n=1、p=0)であるものである。
p=0の場合、ピリジン基はYによって置換されない。
別の態様によれば本発明はまた、式(I)または(II)を有する複核金属錯体の合成において中間体として使用することができる配位子に関する。
したがって本発明の目的はまた、以下本明細書で式(III)
Figure 2014510280
を有する化合物に関する。
式中、
Zは、NH2または−(CH2m−NH−A基、あるいは−CH2−NHC(O)−R−NH−A基(ただし、Rは、置換または非置換の線状または分枝状いずれかのC2〜C10アルキル基、好ましくはC6〜C10アルキル基であり、またAは、Hであるか、またはm=2の場合にはAがHと異なるという条件で発蛍光団基である)であり、
m=1〜12、
n=1、2、または3、
Yは、(CH2p−NH2(ただし、p=0〜12)である。
本発明の一態様によれば複核金属錯体のフェノール単位上にグラフトされたアームは、例えばフィコエリスリン(PE)またはフルオレセイン、具体的にはフルオレセインイソチオシアナート(FITC)などの発蛍光団基を含む。
式(III)を有する好ましい化合物は、式中、
Zが、−(CH2m−NH−A(ただし、m=1、AがH、n=1、p=0)であるか、または
Zが、−(CH2m−NH−A(ただし、m=1、AがH、n=2、p=0)であるか、または
Zが、−CH2−NHC(O)−R−NH−A(ただし、AがH、n=1、p=0)であるものである。
これらの化合物は、上記本明細書で示した方法のステップa)およびb)に従って調製することができる。
さらなる態様によれば本発明は、細胞性微粒子の検出および/または特徴づけの方法に関し、この方法は、上記本明細書で定義した式(I)または(II)
Figure 2014510280
Figure 2014510280
を有する化合物を、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くこと、および式(I)または(II)を有する前記化合物によって捕獲された微粒子を検出および/または特徴づけることを含む。
必要に応じて、ことによると生体液中、具体的には血漿中に存在する有機または無機リン酸塩を、例えばマグネシウム塩などのキレート剤、またはランタンでキレート化することもできる。
用語「細胞性微粒子の検出」とは、生体液中の前記微粒子の存在を定性的および/または定量的に決定することを意味するものと理解される。
用語「細胞性微粒子の特徴づけ」とは、前記細胞性微粒子の同定、とりわけ分類、具体的には表現型の分類、また具体的には微粒子上に存在する可能性のある生体分子の検出、酵素活性の検出、およびRNAの決定を意味するものと理解される。
好ましい態様によれば式(I)または(II)を有する化合物は、第一ステップにおいて固体支持体上に固定化される。
非限定的な例を挙げると、このような支持体は、マイクロタイタープレート、シート、錐体、筒、ウェル、ビーズ、粒子、およびまたストリップからなる群から選択することができる。
したがって本発明は、細胞性微粒子の検出および/または特徴づけの方法に関し、この方法は、
i)上記本明細書で定義した式(I)または(II)を有する化合物を固体支持体の表面に固定化するステップ、
ii)細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
iii)式(I)または(II)を有する前記化合物上に細胞性微粒子を捕獲するステップ、および
iv)捕獲された細胞性微粒子を検出および/または特徴づけるステップ
を含む。
好ましい実施形態によればその表面を予め活性化させた固体支持体、例えばマイクロタイタープレートなどが使用される。
この変形態様によれば細胞性微粒子の検出および/または特徴づけの前記方法は、
i)固体支持体を活性化するステップ、
ii)上記本明細書で定義した式(I)または(II)を有する化合物を、活性化させた支持体の表面に固定化するステップ、
iii)細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
iv)式(I)または(II)を有する前記化合物上に細胞性微粒子を捕獲するステップ、および
v)捕獲された細胞性微粒子を検出および/または特徴づけるステップ
を含む。
支持体の活性化は、例えばポリグルタルアルデヒドを使用するなどの通常の方法によって行うことができる。そのポリマー構造が、支持体上への安定なポリグルタルアルデヒドの吸着を可能にする。グルタルアルデヒドは、共有結合を形成することによってアミノ基(すなわち−NH2)と反応する反応部位を有する。この活性化のステップは、固体支持体上に固定化されたグルタルアルデヒドの少なくとも1個の反応部位と、配位子の−NH2官能基との間の共有結合の形成を含む。例えばN−ヒドロキシコハク酸イミドを活性化剤として使用することができる。
固定化のステップの間に式(I)または(II)を有する化合物は、共有結合を形成することによって活性化された支持体と結合する。
Xアームの末端に位置するアミノ基(すなわち−NH2)は、活性化された支持体の表面でアルデヒド基と反応することによってイミン結合の形成を可能にする。
細胞性微粒子の捕獲は、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液を、式(I)または(II)を有する化合物と一緒にインキュベートすることによって、例えばHEPES(4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸)緩衝液中に懸濁させた状態に置き、次いで周囲温度でそのセンサーと一緒にインキュベートすることによって達成することができる。
次いで捕獲された微粒子を、例えば特異的標識抗体を使用した検出技術(分光または蛍光分析)、酵素標識(色素生成分析)、または定量PCRすなわちQ−PCRなどの増幅技術を使用することによって明らかにすることができる。
例えば、下記の特異的標識抗体と、色素生成試験と、Q−PCR技術とを使用することができる。
a)特異的標識抗体は、
i)CD(「Cluster of Differentiation」)と呼ばれる細胞性微粒子を放出する原細胞の特異的抗原に向けられる抗体、例えば単核細胞の場合のCD14抗体または内皮細胞の場合のCD105(エンドグリン)、または
ii)活性な生物学的分子に向けられる抗体、例えば組織因子(TF、凝固活性化因子)に向けられる抗体、あるいは組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)に向けられる抗体のどちらかである。これらの分子は所与の細胞型のみに限定されず、それらが微粒子上に存在するかどうかを病態生理学的観点から知ることが重要である。
これら抗体は、例えばペルオキシダーゼなどの酵素で標識し、次いで適切な基質を使用した分光光度分析によって検出することができる。これらの抗体はまた、蛍光色素で標識し、蛍光発光によって検出することもできる。
b)色素生成試験は、合成基質の使用による酵素の活性の検出を可能にする。例えば、プラスミノーゲン活性化因子(tPA)または(uPA)は、プラスミノーゲンをプラスミン(血栓溶解および繊維素溶解酵素)に変換し、色素生成基質を用いてこのプラスミンを検出することができる。したがって、捕獲された微粒子に、プラスミノーゲンと、プラスミンに敏感な合成の色素生成基質とを加えることによってtPAおよびuPAの活性を検出することができる。この技術は微粒子の表面に見出される酵素活性度により分子の検出を可能にする。
c)Q−PCR技術は、捕獲された微粒子内に存在するmRNAおよびマイクロRNAを特異的プライマーによって検出することができる。RNAを、Q−PCRの第一サイクルの温度の間の温度勾配によって微粒子をバーストすることによって放出させ、次いでそれと一緒に支持体上に接触した状態に置かれたプライマーと、ポリメラーゼの作用とを使用して特異的に増幅する。
上記本明細書で述べた検出方法の変形態様によれば、上記本明細書で定義した式(III)を有する化合物すなわち配位子の固定化は、上記本明細書で定義した固体支持体上で行われ、その支持体−配位子全体を金属イオンの存在下で、式(I)または(II)を有する錯体がその場で形成されるようなやり方でインキュベートする。
この変形態様では、例えば式(III)を有する配位子を約20℃〜25℃の周囲温度で約2時間インキュベートすることによって固体支持体上に固定化し、次いで過剰な配位子を除去し、金属イオンをその支持体−配位子全体と一緒に同じ温度で約2時間インキュベートすることによって固定化することができる。
次にこの検出方法は、続いて上記本明細書で述べたステップ、すなわち
i)式(I)または(II)を有する前記化合物を、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
ii)式(I)または(II)を有する前記化合物上に細胞性微粒子を捕獲するステップ、および
iii)捕獲された細胞性微粒子を検出および/または特徴づけるステップ
を含む。
本発明の別の態様によれば式(I)または(II)を有する化合物は溶液の状態で使用される。
その時は、式(I)または(II)を有し、式中、Xが−(CH2m−NH−Aまたは−CH2−NHC(O)−R−NH−A(ただし、Rは置換または非置換、線状または分枝いずれかのC2〜C10アルキル基、好ましくはC6〜C10アルキル基であり、Aは発蛍光団基である)である化合物が好ましくは使用されることになる。
例えば、捕獲された微粒子は、場合により発蛍光団基で標識された特異的抗体を使用して蛍光発光を測定することによって検出することができる。
さらなる態様によれば本発明はまた、様々な疾患、具体的には血栓性、炎症性、および/または代謝性障害、あるいは心臓血管または神経血管の疾患および事象、あるいは糖尿病、癌、アルツハイマー病などの疾患または他の病状の発症のリスクの評価および/またはその治療の検証および監視を可能にする細胞性微粒子の検出および/または特徴づけの方法に関する。
様々な疾患の発症のリスクの評価および/またはその治療の検証および監視を可能にする細胞性微粒子の検出および/または特徴づけのこの方法は、有利には、
i)上記本明細書で定義した式(I)または(II)
Figure 2014510280
Figure 2014510280
を有する化合物を、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
ii)式(I)または(II)を有する前記化合物によって捕獲された微粒子を検出および/または特徴づけるステップ、および
iii)前のステップにおいて行った測定の結果を、生体液の対照試料に対して行った類似の測定の結果と比較するステップ
を含む。
本発明はまた、様々な疾患、具体的には血栓性、炎症性、および/または代謝性障害、あるいは心臓血管または神経血管の疾患および事象、あるいは糖尿病、癌、アルツハイマー病などの疾患または他の病状の診断、およびそれら疾患または他の病状の発症のリスクの評価の方法に関し、この方法は、
i)上記本明細書で定義した式(I)または(II)を有する化合物を、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
ii)式(I)または(II)を有する前記化合物によって捕獲された微粒子を検出および/または特徴づけるステップ、および
iii)前のステップにおいて行った測定の結果を、生体液の対照試料に対して行った類似の測定の結果と比較するステップ
を含む。
式(I)または(II)を有する化合物を細胞性微粒子と接触させた状態に置くステップの条件、ならびに前記細胞性微粒子の捕獲、検出、および/または特徴づけのステップの条件は、上記本明細書で定義したとおりである。
有利にはこの対照生体液は、試験されるものと同一だが、健康と考えられる個体由来の生体液である。別法では対照生体液は、試験される生体液と同じ個体から得られるが、以前の試料由来のものである。
本発明による細胞性微粒子の検出および/または特徴づけの方法の潜在的用途は、例えば、心筋梗塞または発作、あるいは糖尿病、癌、アルツハイマー病などの疾患または他の疾患を引き起こす恐れのある血栓症のリスクの早期診断、ならびにその治療の検証および監視である。
(原文記載なし)
本発明を下記の実施例により例示するが、それらに少しも限定されない。
実施例1:式(III)を有する配位子4−(アミノメチル)−2,6−ビス[[ビス(2−ピリジルメチル)アミノ]メチル]フェノール(HBPMP−NH2)の調製
Figure 2014510280
1)2−{4−ヒドロキシ−3,5−ビス[[ビス(2−ピリジルメチル)アミノ]メチル]ベンジル}イソインドール−1,3−ジオン(3)
化合物1は、刊行物M.Johansson等の論文、Inorg.Chem.,2003,42,7502〜7512中に記載されている。
不活性アルゴン雰囲気内で、氷浴中に浸漬した500mLの3つ口フラスコ中へ120mLの乾燥テトラヒドロフラン(THF)に溶かした6.5g(1当量)のジクロロロ前駆体(1)を導入する。その添加漏斗中に60mLの乾燥THFを入れ、その中に6.9g(2当量)のBPA(化合物2)および10mLのトリエチルアミン(4当量)を溶解した。この添加は、0℃で1滴ずつ行われる。
添加の終わりにその得られた褐色懸濁液を周囲温度で24時間放置して撹拌されるに任せる。濾過し、THFで洗い落とした後、濾液を回収し、それを蒸発させる。
得られた固体を、1%H2O、10mLのMeOH、150mLのEtOAc、および200mLのシクロヘキサンの混合物によって不活性化させた中性アルミナカラム(高さ11cm、直径4.5cm)上で精製する。溶離溶媒は、EtOAc+シクロヘキサン 1/2(v/v)、EtOAc+シクロヘキサン 1/1(v/v)、EtOAc、および1〜2%MeOHを含むEtOAcである。
蒸発の後、7.85g(66%)の純粋生成物3を白色固体の形態で回収する。
1H NMR(300MHz,CD3CN,δppm):11.15(s,1H,OH);8.43(d,4H,Py−N−CH);7.83(m,4H,Pht);7.59(td,4H,Py);7.41(d,4H,Py−C−CH);7.20(s,2H,Ar−H);7.15(m,4H,Py−N−CH−CH);4.46(s,2H,Pht−CH2);3.84(s,8H,Py−CH2);3,77(s,4H,Ar−CH2−N)。
13C NMR(75MHz,CD3CN,δppm):168.3(C=O);159.4(Py−C);155.9(C−OH);149.0(Py−N−CH);136.8(Py);134.1(Py);132.5(CO−C);129.8(Py−C−CH);126.6(Ar−C−CH2);124,6(Ar−C−CH2);123.5(Pht−CH);123.3(Pht−CH);122.2(Ar−CH);60.1(Ar−CH2−Pht);54.8(Py−CH2);41.6(Ar−CH2−N)。
ESI(エレクトロスプレーイオン化)質量スペクトル(m/z)=676(M+H)+
2)4−(アミノメチル)−2,6−ビス[[ビス(2−ピリジルメチル)アミノ]メチル]フェノール(4)
凝縮器を備えた500mLフラスコ中へ、6.5gの保護された生成物(3)(1当量)および250mLの無水エタノールを導入する。10mLの無水エタノールに溶かした20.5mLのヒドラジン一水和物(4当量)を1滴ずつ加え、次いでその反応媒体を還流下で加熱し、2時間、次いで周囲温度で一晩放置して撹拌されるに任せる。
得られた白色懸濁液を濾過し、エタノールで洗い流し、濾液を蒸発させる。残渣を150mLの2N水酸化ナトリウム溶液中に溶解し、2時間放置して撹拌されるに任せる。反応媒体を4N HCl溶液でpH 7まで再度中和する。その溶液をジクロロメタンで3回抽出し、次いでNa2SO4上で乾燥し、蒸発させる。
5g(95%)の化合物4が、白色固体の形態で得られる。
1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):8.55(d,4H,Py−N−CH);7.57(t,4H,Py);7.45(d,4H,Py−N−C−CH);7.16(s,2H,Ar−H);7.10(t,4H,Py);5.29(s,1H,OH);3.98(s,2H,NH2−CH2);3.84(d,8H,Py−CH2);3.77(s,4H,Ar−CH2−N);2.89(s,2H,NH2)。
13C NMR(75MHz,CDCl3,δppm):159.6(Py−C);155.3(C−OH);148.8(Py−N−CH);136.6(Py−N−C−CH−CH);130.0(Ar−C−CH2−NH2);129.0(Ar−CH);124.1(Ar−C−CH2−N);123.1(Pyr−C−CH);122.0(Py−N−CH−CH);59.8(Py−CH2);54.7(Ar−CH2−N);45.1(NH2−CH2)。
ESI質量スペクトル(m/z)=568(M+Na)+,546(M+H)+
実施例2:錯体[μ−[4−(アミノメチル)−2,6−ビス[[ビス(2−ピリジルメチル)アミノ]メチル]−フェノラト]]−μ―ヒドロオキソ二亜鉛二過塩素酸塩(5)([(Zn2)(BPMP−NH2)(μ−OH)]・(ClO42)の調製
Figure 2014510280
25mLフラスコ中へ、8mLのアセトニトリルおよび0.155g(2.1当量)のトリエチルアミン中に溶解した配位子4(0.4g、1当量)を導入する。
6mLのアセトニトリル中に溶解した0.57g(2.1当量)の過塩素酸亜鉛六水和物をこの中に1滴ずつ加える。過塩素酸塩の添加が完了したらその混合物を周囲温度に放置して撹拌されるに任せる。この溶液を約5mLの体積になるように部分的に蒸発させ、次いでかなりの曇りが観察されるまでエチルエーテルをその中に加え、その後−20℃に一晩放置する。
沈殿が得られ、これを濾過し、エチルエーテルで洗い流し、乾燥する。その濾液を再び同じ処理にかけ、最終的には黄白色粉末の形態で280mg(43%)の化合物5の回収が可能になる。
1H NMR(300MHz,CD3CN,δppm):8.98(d,4H,Py−H);8.05(t,4H,Py−H);7.65(t,4H,Py−H);7.53(d,4H,Py−H);7.09(s,2H,Ar−H);4.01(s,8H,Py−CH2);3.91(d,2H,NH2−CH2);3.84(s,4H,Ar−CH2−N)。
13C NMR(75MHz,CD3CN,δppm):163.4(Ar−CO);156.5(Py);149.5(Py);142.5(Py);133.8(Ar−C−CH2−NH2);126.0(Py);125.9(Ar);125.3(Ar);123.2(Py−N−CH−CH);61.0(NH2−CH2);59.0(Ar−CH2−N);58.1(Py−CH2)。
ESI質量スペクトル(ESI,m/z)=791(M−ClO4+
実施例3:式(III)を有する配位子6−アミノ−N−(3,5−ビス((ビス(2−ピリジルメチル)アミノ)メチル)−4−ヒドロキシベンジル)ヘキサンアミド(8)(HBPMP−C6NH2)の調製
Figure 2014510280
化合物6は、刊行物M.B.Doughty等の論文、1993、J.Med.Chem.36,272〜279中に記載されている。
1)6−tert−ブチル−N−(3,5−ビス((ビス(2−ピリジルメチル)アミノ)メチル)−4−ヒドロキシベンジルアミノ)−6−オキソヘキシルカルバマート(7)
オーブン中で乾燥され、添加漏斗およびアルゴンバルーンを備え、氷浴中に置かれた250mLの3つ口フラスコ中へ、835mg(1.2当量)の6−tert−ブトキシカルボニル−ヘキサン酸および40mLの乾燥ジクロロメタンを導入する。1.37g(1.2当量)のHATU(2−(7−アザ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート)を6mLのDMF(ジメチルホルムアミド)および1.5mL(3当量)のトリエチルアミン(NEt3)に加えてから、それを30分間放置して撹拌されるに任せる(これまでどおり氷浴中で)。40mLの乾燥ジクロロメタン中に溶解した1.52g(1当量)の配位子4をその中に1滴ずつ加える。これを0℃で1時間、次いで周囲温度で一晩および一日放置して撹拌されるに任せる。
ジクロロメタンおよびDMFを真空下で蒸発させた後、4.6gの濃厚な油が得られ、これを中性アルミナのカラム(高さ5.5cm、直径4.5cm)上でのクロマトグラフィーによって精製する。カラムは、10mLのMeOHを含む2滴の蒸留水の溶液、300mLのEtOAc、および150mLのシクロヘキサンによって不活性にする。溶離溶媒は、EtOAc+シクロヘキサン、EtOAc、EtOAc+1〜5%のMeOHである。
蒸発後、1.9gの白色粘着性の生成物を回収する。これを水に溶解し、削り取り、デカントし、ジクロロメタンで抽出する。Na2SO4上で乾燥し、濾過し、蒸発させた後、1.7g(80%)の化合物7がベージュ色固体の形態で回収される。
1H NMR(300MHz,CDCl3,TMS,δppm):11.12(s,1H,OH);8.53(m,4H,Py);7.60(m,7H,Py);7.48(m,5H,Py);7.27(m,2H,Ar);5.79(s,1H,NH);4.32(d,2H,Ar−CH2−NH);4.13(d,4H,Ar−CH2−N);3.86(s,10H,Py−CH2);2.16(t,2H,CH2);1.86(d,5H,CH2);1.64(t,3H,CH2);1.42(s,9H,tBu)。
13C NMR(75MHz,CDCl3,TMS,δppm):172.8(CH2−C=O−NH);159.4(O−C=O);155.8(Ar−C−OH);149.2(Py−N−CH);136.9(Py);129.3(Ar−CH);128.3(O−C−(CH33);124.6(Ar−C−CH2−NH);123.3(Py−C−CH);122.3(Py−N−CH−CH);60.1(Py−CH2);55.0(Ar−CH2);43.7(O−CO−NH−CH2);36.9(NH−CO−CH2−CH2);30.1(CH2);28.8(CH3);26.7(CH2);25.6(CH2)。
ESI質量スペクトル(m/z)=781(M+Na)+,759(M+H)+
2)6−アミノ−N−(3,5−ビス((ビス(2−ピリジルメチル)アミノ)メチル)−4−ヒドロキシベンジル)−ヘキサンアミド(8)
凝縮器を備えた250mLフラスコ中へ1.69g(1当量)の保護された生成物(7)および200mLの乾燥ジクロロメタンを導入する。混合物を氷浴で冷却し、次いで10mLの乾燥ジクロロジメタンに溶かした9mLのトリフルオロ酢酸(46当量)を1滴ずつ加える。反応媒体を周囲温度で一晩放置して撹拌させる。
得られた溶液を2N水酸化ナトリウム溶液、次いで飽和NaHCO3溶液でpH 9まで中和する。この混合物をジクロロメタンで3回抽出し、次いでNa2SO4上で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粉末が得られ、これを高温アセトニトリル中に溶解する。熱濾過の後、その溶液を蒸発させ、1.2g(82%)の化合物8が黄白色固体の形態で得られる。
1H NMR(300MHz,CDCl3,TMS,δppm):8.51(d,4H,Py);7.56(t,4H,Py);7.37(d,4H,Py);7.13(t,4H,Py);7.04(s,2H,Ar);4.24(d,2H,Ar−CH2−NH);3.83(s,8H,Py−CH2);3.70(s,4H,Ar−CH2−N);2.90(t,2H,CH2);2.24(t,2H,CH2);1.75(t,2H,CH2);1.66(t,2H,CH2);1.26(t,2H,CH2)。
13C NMR(75MHz,CDCl3,TMS,δppm):172.9(−C=O);158.6(Py−N−CH);155.0(Ar−C−OH);148.8(Py);136.7(Py);129.4(Ar−CH);128.8(Ar−CH);122.2(Py);123.3(Py);;123.3(Py);59.9(Py−CH2);54.7(Ar−CH2);42.9(Ar−CH2−NH−);39.7(−CH2−NH2);35.6(CH2);27.6(CH3);25.3(CH2);24.8(CH2)。
ESI質量スペクトル(m/z)=681(M+Na)+,659(M+H)+,330(M+2H)2+
実施例4:錯体[μ−[6−アミノ−N−(3,5−ビス((ビス(2−ピリジルメチル)アミノ)メチル)−4−ヒドロキシベンジル)ヘキサンアミド]]−μ−ヒドロオキソ二亜鉛二過塩素酸塩(9)([(Zn2)(BPMP−C6NH2)(μ−OH)]・(ClO42)の調製
Figure 2014510280
100mLのフラスコ中へ、10mLのアセトニトリルに溶解した0.4g(1当量)の配位子8(全て溶解させるために暫時の加熱を伴う)および0.13g(2.1当量)のトリエチルアミンを導入する。
4mLのアセトニトリル中に溶解した0.9g(2.1当量)の過塩素酸亜鉛六水和物をその中に1滴ずつ加える。過塩素酸塩の添加が完了したらその混合物を周囲温度に2時間放置して撹拌されるに任せる。この溶液を約5mLの体積になるように部分的に蒸発させ、次いでかなりの曇りが観察されるまでエチルエーテルをその中に加え、その後−20℃に一晩放置する。
沈殿が得られ、これを濾過し、エチルエーテルで洗い流し、乾燥する。その濾液を再び同じ処理にかけ、最終的に黄白色粉末の形態で270mg(43%)の化合物9の回収が可能になる。
1H NMR(300MHz,DMSO,δppm):8.96(d,4H,Py−H);8.80(s,1H,OH),Py−H);8.11(t,4H,Py−H);7.68(t,4H,Py−H);7.59(d,4H,Py−H);6.83(s,2H,Ar−H);6.64(s,1H,NH−CO);4.01(s,8H,Py−CH2);3.91(d,2H,NH2−CH2);3.84(s,4H,Ar−CH2−N);4.11(m,12H,CH2−N);2.12(m,2H,−CH2);1.52(m,4H,−CH2);1.29(m,4H,−CH2)。
13C NMR(75MHz,DMSO,δppm):171.4(−C=O);155.0(Py−N−C);154.9(Ar−C−OH);147.5(Py−CH);140.8(Py);140.2(Ar−C−CH2−NH2);130.8(Ar−CH);129.8(Ar−CH);126.0(Ar−C);126.3(Ar−C);124.6(Py−CH);123.7(CH);122.9(C);121.1(CH);58.8(Ar−CH2−NH−CO);57.7(Ar−CH2−N);56.7(Py−CH2);41.1(CH2);35.4(CH2);29.7(CH2);26.0(CH2);25.4(CH2)。
ESI質量スペクトル(m/z)=905(M−ClO4+,403(M−2ClO42+
実施例5:実施例4からの錯体のマイクロタイタープレート上への固定化による細胞性微粒子の比色アッセイ(感度研究)
a)試薬:
i)グルタルアルデヒド(25%)
ii)エタノールアミン(16.5M)
iii)pH 9.5の1M重炭酸塩緩衝液(Na Bic)(NaH2CO3の溶液(pH 8.3)をNa2CO3の溶液(pH 11.6)で滴定することによってのみ作られる)
iv)pH 7.4の10mM HEPES緩衝液(0.15M NaCl)
v)(hBPMP/亜鉛)−C6NH2(150μM)
b)プロトコル
i)グルタルアルデヒドの重合:
0.1M Na Bic中で50mLの2.5%グルタルアルデヒド溶液を調製し、次いでその混合物を密封したバイアル中に37℃で2時間のあいだ置く。
ii)ポリ塩化ビニルの表面へのポリグルタルアルデヒドの吸着。96ウェルを有するマイクロタイタープレートを使用する。各ウェル中に100μLの2.5%グルタルアルデヒドを付着させ、22℃で2時間放置する。ポリグルタルアルデヒドを除去し、表面を水で3回洗い流す。
iii)錯体[(Zn2)(BPMP−C6NH2)(μ−OH)]・(ClO42の固定化。0.1M HEPES(pH 8.2)に溶かした錯体をポリ塩化ビニルプレートの表面に+22℃で24時間固定化させる。この溶液と一緒に表面を22℃で2時間インキュベートすることによって遊離アルデヒド基を0.3Mエタノールアミンで飽和させ、次いで水で洗浄し、次にpH 7.4の10mM HEPES(0.15M NaCl)中で3回洗浄することによってエタノールアミンを除去する。これらプレートを4℃で保管する。
iv)微粒子を含有する緩衝液(10mM HEPES(0.9%NaCl))を12時間インキュベートし、次いでプレートを緩衝液で洗い流す。この微粒子は、R.Lacroix等の論文、Blood,2007,110,2432〜2439中に記載されているようにTNF−αによるHMEC1ヒト微小血管内皮細胞の細胞培養物の活性化から得られる。
c)検出
検出は光度分析によって行う。その検討される微粒子に特異的な抗CD105抗体と一緒に3時間インキュベートを行い、その後、10mM HEPES+40mg/mLのBSAで洗い流す。
続いて、ペルオキシダーゼと結合した二次抗体と一緒にインキュベーションを行い、その後、10mM HEPES+40mg/mLのBSAで洗い流す。
検出は、ペルオキシダーゼと結合した二次抗体を使用する場合は、1mg/mLのABTS(2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)を用いて行う。
読取りは、分光光度計により行う。
結果を図1に示し、これはタンパク質の量を基準にした微粒子の希釈物の分光分析による検出を表す。
得られるシグナルは、ペルオキシダーゼによる基質の分解反応の初期速度(Vi)に相当するmOD/分で表される。
微粒子の量を基準にして得られるこのシグナルは、特異的用量−応答を示す。
実施例6:マイクロタイタープレート上での免疫化学的方法による実施例2および4からのZn錯体の特異性の検討
Na Bic(0.1M、pH 9.5)で希釈した2.5%グルタルアルデヒドの溶液をマイクロタイタープレートの各ウェル中に置き、22℃で4時間放置する。グルタルアルデヒドを除去し、水で数回洗い流した後、試験される錯体、すなわち[(Zn2)(BPMP−NH2)(μ−OH)]・(ClO42(実施例2)または[(Zn2)(BPMP−C6NH2)(μ−OH)]・(ClO42(実施例4)を、500nmの濃度(滴定によって決まる濃度)でインキュベートした。次いでその錯体を、10mM HEPES溶液で洗い流すことによって除去した。最後に、遊離アルデヒド基を0.3Mエタノールアミンの溶液で飽和させ、続いて10mM HEPES緩衝液で数回洗い流した。
続いて、微粒子(HMEC1細胞の細胞培養物の活性化から得られた)を含有する緩衝液(10mM HEPES、0.9% NaCl)を1時間インキュベートし、次いで緩衝液で洗い流すことによって除去した。
間接免疫化学法(1μg/mLの一次抗CD105抗体と、160ng/mLのペルオキシダーゼと結合した二次抗体と、1mg/mLのABTS)を使用して、微粒子上の内皮抗原CD105の存在を分析した。
読取りは、405nmで分光光度計により行う。
結果を図2に示し、これはタンパク質の量を基準にした微粒子の希釈物の分光分析による検出を表す。
得られるシグナルは、ペルオキシダーゼによる基質の分解反応の初期速度(Vi)に相当するmOD/分で表され、実施例2からの錯体についてはダークグレーで、また実施例4からの錯体についてはライトグレーで示す。
測定媒体中の試薬の存在(+記号)または不在(−記号)を、横軸の下方に示す。
得られたシグナルは、本発明による錯体が免疫化学的顕色(revelation)過程で微粒子を特異的に認識することを示す。
さらにこの方法は、微粒子の不在下で測定されるきわめて低いシグナルによって示されるようにきわめて低いバックグラウンドノイズを生じさせるに過ぎないように見える。
実施例7:錯体[μ−[4−(アミノメチル)−2,6−ビス[[(ビス(2−ピリジルメチル)アミノ]メチル]−フェノラト]]−μ−ヒドロオキソ二銅二過塩素酸塩(10)([(Cu2)(BPMP−NH2)(μ−OH)]・(ClO42)の調製
Figure 2014510280
25mLのフラスコ中へ、10mLのアセトニトリルおよび77μL(2当量)のトリエチルアミン中に溶解した配位子4(0.146g、1当量)を導入する。
3mLのアセトニトリル中に溶解した0.21g(2当量)の過塩素酸銅(II)六水和物をこの中に1滴ずつ加える。銅塩の添加が完了したらその混合物を周囲温度に30分間放置して撹拌されるに任せる。この溶液を約5mLの体積になるように部分的に蒸発させ、次いでかなりの曇りが観察されるまでテトラヒドロフランをその中に加え、その後−20℃に3日間放置する。
沈殿が得られ、これを濾過し、次いでエチルエーテルで洗い流す。回収された固体を再びアセトニトリル中に溶解し、前述と同様に−20℃においてテトラヒドロフランで再沈殿させる。濾過し、洗い流し、乾燥した後、緑色粉末の形態で118mg(36%)の化合物10が回収される。
ESI質量スペクトル(m/z)=806(z=1)[M−ClO4 -+H2O],353.5(z=2)[M−2ClO4 -+2H2O];UV/vis(DMSO/水(pH=7)30/70);λmax(ε)≒340(sh),425(sh),700(191M-1cm-1)。
実施例8:錯体[μ−[6−アミノ−N−(3,5−ビス((ビス(2−ピリジルメチル)アミノ)メチル)−4−ヒドロキシベンジル)−ヘキサンアミド]]−μ−ヒドロオキソ二銅二過塩素酸塩(11)([(Cu2)(BPMP−C6NH2)(μ−OH)]・(ClO42)の調製
Figure 2014510280
25mLのフラスコ中へ、12mLのアセトニトリル中に溶解した配位子8(0.350g、1当量)および0.118g(2.2当量)のトリエチルアミンを導入する。
8mLのアセトニトリル中に溶解した0.43g(2.1当量)の過塩素酸銅(II)六水和物をこの中に1滴ずつ加える。銅塩の添加が完了したらその混合物を周囲温度に1時間放置して撹拌されるに任せる。この溶液を約5mLの体積になるように部分的に蒸発させ、次いでかなりの曇りが観察されるまでテトラヒドロフランをその中に加え、その後−20℃で放置する。
濃厚な油が析出してくる。上澄みを取り除き、5mLのエチルエーテルを加え、その油をガラス棒で削り取る。緑色粉末が沈殿する。これを濾過し、エチルエーテルで洗い流し、乾燥する。濾液を−20℃に戻し、油の第二画分が析出する。これを前に述べたと同様に処理する。これにより最終的に緑色粉末の形態で246mg(46%)の化合物11の回収が可能になる。
ESI質量スペクトル(m/z)=400(z=2)[M−2ClO4];UV/vis(DMSO/水(pH=7)30/70);λmax(ε)≒350(sh),450(316),700(202M-1cm-1)。
実施例9:式(III)を有する配位子(6−アミノ−N−(3,5−ビス((ビス(2−ピリジルメチル)アミノ)メチル)−4−ヒドロキシベンジル)−ヘキサンアミド(12)(HBPEP−C6NH2))の調製
配位子12を、配位子8の場合と似たやり方で化合物1から4ステップ(ビス(2−ピリジルエチル)アミンを縮合させる)で調製する。この調製については刊行物M.A.Halcrow等の論文、2003,Dalton Trans,4224〜4225に記載されている。
Figure 2014510280
1H NMR(300,CDCl3,δppm):8.42(d,4H,Py−H);7.52(td,4H,Py−H);7.07(m,8H,Py−H);6.93(s,2H,Ar−H);6.85(t、1H,NH−CO);4.22(d,2H,Ar−CH2−NH−);3.80(s,4H,Ar−CH2−N);2.99(m,16H,Py−CH2−CH2−N);2.79(m,2H,NH2−CH2);2.16(t,2H,CO−CH2);1.58(m,4H,−CH2);1.32(m,2H,−CH2)。
13C NMR(75MHz,CDCl3,δppm):172.9(−C=O);159.6(Py−N−C);155.3(Ar−C−OH);149.0(Py−N−CH);136.4(Py−C);128.6(Ar−C−CH2−NH);128.4(Ar−CH);123.4(Py−N−CH−CH);122.8(Ar−C−CH2−N);121.3(Py−CH2−CH2);54.7(Ar−CH2−NH);53.3(Py−CH2−CH2);42.9(Ar−CH2−NH);40.0(NH2−CH2);35.7(CO−CH2);34.8(Py−CH2−CH2);28.3(NH2−CH2−CH2);25.5(CH2);24.8(CH2)。
ESI質量スペクトル(m/z)=715[M+H+]。
実施例10:錯体[μ−[6−アミノ−N−(3,5−ビス((ビス(2−ピリジルエチル)アミノ)メチル)−4−ヒドロキシベンジル)−ヘキサンアミド]]−μ−ヒドロオキソ二亜鉛二過塩素酸塩(13)([(Zn2)(BPEP−C6NH2)(μ−OH)]・(ClO42)の調製
Figure 2014510280
50mLのフラスコ中へ、15mLのアセトニトリルおよび280μL(2.5当量)のトリエチルアミン中に溶解した配位子12(551mg、0.77mmol、1当量)を導入する。8mLのアセトニトリル中に溶解した724mgの過塩素酸亜鉛六水和物(2.5当量)をこの中に1滴ずつ加える。亜鉛塩の添加が完了したらその混合物を周囲温度に5時間放置して撹拌されるに任せる。この溶液を約5mLの体積になるように部分的に蒸発させ、次いでかなりの曇りが観察されるまでテトラヒドロフランをその中に加え、その後−20℃に一晩放置する。
糊状沈殿物が得られ、これを濾過し、エチルエーテルで洗い流し、乾燥する。エチルエーテルの存在下においてガラス棒で削り取って固体を回収し、次いで溶液を除去する。この操作をあと3回繰り返す。乾燥後、これにより最終的に黄白色固体の形態で218mg(27%)の化合物13の回収が可能になる。
1H NMR(400MHz,CD3CN+DMSO,δppm):8.48(d,4H,Py−H);7.99(m,4H,Py−H);7.45(m,8H,P−Hy);7.40(s,1H,NH−CO);6.86(s,2H,Ar−H);4.05(s,2H,Ar−CH2−NH−);3.62(t,4H,Ar−CH2−N);3.05(m,8H,Py−CH2−CH2−N);2.79(m,10H,NH2−CH2,Py−CH2);2.09(t,2H,CO−CH2);1.56(m,4H,−CH2);1.30(m,2H,−CH2)。
13C NMR(100MHz,CD3CN+DMSO,δppm):173.1(−C=O);161.6(Py−N−C);158.3(Ar−C−OH);149.7(Py−N−CH);141.8(Py−C);132.0(Ar−C−CH2−NH2);132.0(Ar−CH);126.3(Py−N−CH−CH);124.7(Py−N−C−CH);123.1(Ar−C−CH2−N);47.3(Py−CH2−CH2);36.2(Py−CH2);32.7(CO−CH2);27.5(NH2−CH2);26.5(CO−CH2−CH2);25.6(CH2)。
ESI質量スペクトル(m/z)=961(z=1)[M−ClO4],431(z=2)[M−2ClO4]。
実施例11:プラスミンの生成を測定することによる実施例4および10からのZn錯体ならびに実施例8からのCu錯体による微粒子検出−顕色システムの感度の検討
この測定の原理は、HMEC1細胞培養物の活性化に由来する微粒子によるプラスミンの生成の結果起こる繊維素溶解活性の測定に基づく。これらの微粒子は、それらの表面にウロキナーゼ(またはプラスミノーゲンアクチベーター酵素)を有し、それがプラスミノーゲンのプラスミン(フィブリンを溶解する)への変換を可能にする。
プラスミンの生成は、プラスミンによる色素生成基質、すなわちメチルマロニル−ヒドロキシプロピル−アルギニル−パラニトロアニリド(CBS)の切断によって検出される(分光光度測定)。
a)プロトコル
i)マイクロタイタープレートの調製
96ウェルのPVC U底プレートを使用する。下記組成のアッセイ緩衝液を準備する。
Figure 2014510280
1ウェル当たり150μLのアッセイ緩衝液を使用して周囲温度で30分間インキュベーションを行う。
ii)全プレート用の4μMプラスミノーゲンの調製
103.5μMプラスミノーゲンの原液48.3μLを使用し、その中に1201.7μLのアッセイ緩衝液を加える。
iii)全プレート用の3mM CBS0065の調製
7.5mM CBS0065の原液を使用し、その中に750μLのアッセイ緩衝液を加える。
b)検出
ウェルを空にするためにアッセイ緩衝液を含有するプレートを逆さまにし、次いでペーパータオルで乾燥する。
4μMプラスミノーゲン溶液を3mM CBS0065溶液と混合し、続いて微粒子(HMEC1細胞培養物の活性化により得られる)を含有する25μLの緩衝液(10mM HEPES(0.9% NaCl))を37℃で1時間インキュベートする。その後、12.5μLのCBS0065および12.5μLのプラスミノーゲン(それぞれ2μMおよび1.5mMの最終濃度)を加え、プレートを密封する。
読取りは、分光光度計によって405nmおよび490nmで37℃において18時間行う。
結果を図3に示し、これは繊維素溶解活性を検定することによるプラスミン生成の検出を表す。
得られるシグナルは、mOD/分で表される。
これら結果は、本発明による金属錯体による微粒子の固定化がそれらの機能アッセイを可能にすることを示す。また、ピリジン基に結合した「アーム」の長さおよび金属イオンの種類に応じたそれら結果の変動を観察することができる。

Claims (21)

  1. 式(I)または式(II)
    Figure 2014510280
    Figure 2014510280
    を有し、
    式中、
    +iが金属イオンであり、iが1、2、または3であり、
    Lが交換可能な配位子であり、
    Xが、−(CH2m−NH−A基、または−CH2−NHC(O)−R−NH−A基(ただし、Rは、置換または非置換の線状または分枝状いずれかのC2〜C10アルキル基、好ましくはC6〜C10アルキル基であり、またAは、Hまたは発蛍光団基である)であり、
    m=1〜12、
    n=1、2、または3、
    Yが、(CH2p−NH2(ただし、p=0〜12)である、
    化合物。
  2. Mが、Zn、Cu、Mn、Co、Ni、およびFeから選択されることを特徴とする、請求項1に記載の式(I)または式(II)を有する化合物。
  3. 式(I)または式(II)を有し、
    式中、
    MがZnまたはCuであり、
    Xが、−(CH2m−NH−A(ただし、m=1、A=H、n=1、p=0)であるか、または
    Xが、−(CH2m−NH−A(ただし、m=1、A=H、n=2、p=0)であるか、または
    Xが、−CH2−NHC(O)−R−NH−A(ただし、A=H、n=1、p=0)である、式(I)または式(II)を有する請求項1または2に記載の化合物。
  4. Xが、−(CH2m−NH−Aまたは−CH2−NHC(O)−R−NH−A(ただし、Rは置換または非置換の線状または分枝状いずれかのC2〜C10アルキル基、好ましくはC6〜C10アルキル基であり、またAは、発蛍光団基である)である、請求項1または2に記載の式(I)または式(II)を有する化合物。
  5. 式(III)
    Figure 2014510280
    を有し、
    式中、
    Zが、NH2または−(CH2m−NH−A基、あるいは−CH2−NHC(O)−R−NH−A基(ただし、Rは、置換または非置換の線状または分枝状いずれかのC2〜C10アルキル基、好ましくはC6〜C10アルキル基であり、またAは、Hであるか、またはm=2の場合にはAがHと異なるという条件で発蛍光団基である)であり、
    m=1〜12、
    n=1、2、または3、
    Yが、(CH2p−NH2(ただし、p=0〜12)である、
    化合物。
  6. Zが、−(CH2m−NH−A(ただし、m=1、A=H、n=1、p=0)であるか、または
    Zが、−(CH2m−NH−A(ただし、m=1、A=H、n=2、p=0)であるか、または
    Zが、−CH2−NHC(O)−R−NH−A(ただし、A=H、n=1、p=0)である、請求項5に記載の式(III)を有する化合物。
  7. 請求項1〜4のいずれか一項に記載の式(I)または(II)
    Figure 2014510280
    Figure 2014510280
    を有する化合物を、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くこと、および式(I)または(II)を有する前記化合物によって捕獲された前記微粒子を検出および/または特徴づけることを含むことを特徴とする、細胞性微粒子の検出および/または特徴づけの方法。
  8. 式(I)を有する前記化合物が、第一のステップにおいて固体支持体上に固定化されることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
  9. i)前記固体支持体の表面に式(I)または(II)を有する化合物を固定化するステップ、
    ii)細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
    iii)式(I)または(II)を有する前記化合物上に前記細胞性微粒子を捕獲するステップ、および
    iv)前記捕獲された細胞性微粒子を検出および/または特徴づけるステップ
    を含むことを特徴とする、請求項8に記載の方法。
  10. 前記固体支持体が、式(I)または(II)を有する前記化合物の固定化に先立って活性化されることを特徴とする、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
  11. i)固体支持体を活性化するステップ、
    ii)本特許請求の範囲で上記に記載の式(I)または(II)を有する化合物を、前記活性化された支持体の表面に固定化するステップ、
    iii)細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
    iv)式(I)または(II)を有する前記化合物上に前記細胞性微粒子を捕獲するステップ、および
    v)前記捕獲された細胞性微粒子を検出および/または特徴づけるステップ
    を含むことを特徴とする、請求項10に記載の方法。
  12. i)式(III)
    Figure 2014510280
    を有し、
    式中、
    Zが、NH2または−(CH2m−NH−A基、あるいは−CH2−NHC(O)−R−NH−A基(ただし、Rは、置換または非置換の線状または分枝状いずれかのC2〜C10アルキル基、好ましくはC6〜C10アルキル基であり、またAはHであるか、またはm=2の場合にはAがHと異なるという条件で発蛍光団基である)であり、
    m=1〜12、
    n=1、2、または3、
    Yが、(CH2p−NH2(ただし、p=0〜12)である、
    化合物を固体支持体上に固定化するするステップ、
    ii)前記支持体−配位子全体を前記金属イオンの存在下で、式(I)または(II)を有する前記複核金属錯体がその場で形成されるようなやり方でインキュベートするステップ、
    iii)式(I)または(II)を有する前記化合物を、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
    iv)式(I)または(II)を有する前記化合物上に前記細胞性微粒子を捕獲するステップ、および
    v)前記捕獲された細胞性微粒子を検出および/または特徴づけるステップ
    を含むことを特徴とする、請求項7に記載の方法。
  13. 前記固体支持体が、マイクロタイタープレート、シート、錐体、筒、ウェル、ビーズ、粒子、およびまたストリップであることを特徴とする、請求項7〜12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 式(I)または(II)を有する前記化合物が溶液の状態で使用されることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
  15. Xが−(CH2m−NH−Aまたは−CH2−NHC(O)−R−NH−A(ただし、Rは置換または非置換の線状または分枝状いずれかのC2〜C10アルキル基、好ましくはC6〜C10アルキル基であり、またAは発蛍光団基である)である式(I)または(II)を有する化合物が使用されることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
  16. i)請求項7に記載の式(I)または(II)を有する化合物を、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
    ii)式(I)または(II)を有する前記化合物によって捕獲された細胞性微粒子を検出および/または特徴づけるステップ、および
    iii)前のステップにおいて行った測定の結果を、生体液の対照試料に対して行った類似の測定の結果と比較するステップ
    を含む、様々な疾患の発症のリスクの評価および/またはその治療の検証および監視を可能にする請求項7〜15のいずれか一項に記載の細胞性微粒子の検出および/または特徴づけの方法。
  17. 様々な疾患の診断、および発症のリスクの評価および/またはその治療の検証および監視を可能にする方法であって、
    i)請求項7に記載の式(I)または(II)を有する化合物を、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
    ii)式(I)または(II)を有する前記化合物によって捕獲された細胞性微粒子を検出および/または特徴づけるステップ、および
    iii)前のステップにおいて行った測定の結果を、生体液の対照試料に対して行った類似の測定の結果と比較するステップ
    を含む、方法。
  18. 前記対照生体液が、試験されるものと同一だが、健康と考えられる個体から得られる生体液であるか、あるいは前記対照生体液が、試験される生体液と同じ個体に由来するが、以前の試料から得られることを特徴とする、請求項16または17に記載の方法。
  19. 前記病状が、血栓性、炎症性、および/または代謝性障害、あるいは心臓血管または神経血管の疾患および事象、あるいは糖尿病、癌、およびアルツハイマー病から選択されることを特徴とする、請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記捕獲された微粒子が、分光分析によってまたは蛍光測定を用いて検出することができる特異的標識抗体を使用することによって明らかにされることを特徴とする、請求項7〜19のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記抗体が、酵素で標識され、次いで適切な基質を使用した色素生成分析によって検出されることを特徴とする、請求項20に記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20170079083A1 (en) * 2014-05-05 2017-03-16 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Method and Devices for Unidirectional Device-to-Device Communication
ES2828252T3 (es) * 2014-05-09 2021-05-25 Deutsche Telekom Ag Mejora o habilitación de la cobertura por radio para un equipo de usuario con respecto a una red de comunicación móvil
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FR3094092B1 (fr) * 2019-03-19 2021-04-09 Univ Bordeaux Capture de microvesicules a visee diagnostique
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009092386A2 (en) * 2008-01-25 2009-07-30 Hansabiomed Oü A new method to measure and characterize microvesicles in the human body fluids

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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JPN5014005078; KWON TAE-HYUK: 'PHOSPHORESCENT THYMIDINE TRIPHOSPHATE SENSOR BASED ON A DONOR-ACCEPTOR ENSEMBLE SYSTEM USING INTERMO' CHEMISTRY-A EUROPEAN JOURNAL V14 N31, 2008, P9613-9619 *

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