JP2014510280A - グラフト結合複核金属錯体およびその細胞性微粒子センサーとしての使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）
（式中、Ｍは金属イオンを表す）を有する新規なグラフト結合複核金属錯体に関し、またそれを細胞性微粒子の検出および／また特徴づけの方法においてセンサーとして使用することに関する。
【選択図】なし
（式中、Ｍは金属イオンを表す）を有する新規なグラフト結合複核金属錯体に関し、またそれを細胞性微粒子の検出および／また特徴づけの方法においてセンサーとして使用することに関する。
【選択図】なし
Description
本発明は、新規なグラフト結合複核金属錯体、ならびにそれらを支持（または不均一）媒体中または溶液中の細胞性微粒子を検出および／または特徴づけるための方法においてセンサーとして使用することに関する。
用語「細胞性微粒子」または「細胞性微小胞」は、区別なく使用することができる。便宜上は用語「微粒子」または「細胞性微粒子」が下記の記述において使用されるものとする。
細胞性微粒子は、血管機能障害に関連した炎症または疾患を含めた様々な病理学的状態の中で細胞活性化の間に、またはアポトーシスの間に生体液中に放出される膜細胞性微小胞である。
これらの微粒子は、細胞膜の組織修復の後に細胞外空間中に放出され、こうして内部葉状器官上だけでなくそれらの細胞起源の他のアイデンティティマーカー上に普通に存在する外部葉状ホスファチジルセリン上に露出する。
細胞性微粒子は、ミクロン以下のサイズ（０．１〜１μｍ）である。それらは生体液中、とりわけ健康な個体の循環血液中に存在するが、高レベルでのそれらの存在は、様々な血栓性、炎症性、および代謝性障害と関連があり、また癌と関連がある。癌のほかにこれらの疾患は無数にあり、糖尿病およびその血管合併症から、アテローム性動脈硬化症を含めた炎症性疾患までの範囲にわたる。具体的にはそれは、血栓症、またさらには神経血管の虚血状態のリスクの増加を伴う心血管疾患に関係している。
したがって細胞性微粒子は、様々な疾患、具体的には血栓性、炎症性、および／または代謝性障害の発症のリスクを診断し評価することを可能にし、それによって治療の追跡調査およびその監視を可能にする早期マーカーと考えることができる。
神経血管の損傷および閉塞性心血管疾患は、癌の直後に病的状態および死亡の主要原因を構成する。欧州および米国ではこれらの病変が、社会的および経済的意味合いだけでなく公衆衛生の点でもかなりのコストを生ずる。
これらの閉塞性偶発事故は、その部位に形成される血栓か、または塞栓症の結果である。閉塞性血栓の形成は、局所的繊維素溶解のきずと関連があった。しかしながら、この病態生理学的意味合いにもかかわらず、現在ではリスク評価および予防を可能にする血管内腔中の繊維素溶解活性の評価に利用可能な信頼性のある方法は存在しない。
幾つかの研究の結果は、高濃度の細胞性微粒子がすぐれた予後値を保有することを示している。
検出の方法はすでに確立されている。幾つかの利用可能な技術にはフローサイトメトリーが含まれ、これは最も広く使用される。この方法は、キャリブレーションビーズを使用することによって細胞性微粒子の表現型の検査および部分的定量化をある程度可能にする。この方法は、ホスファチジルセリンと、細胞タンパク質であるアネキシンＡ５との親和性をうまく利用する。より一般的には、それらの膜上に露出した抗原決定基に向けられる抗体を使用する。
具体的には細胞性微粒子は、アネキシンＡ５により放出される蛍光を測定することによって、または蛍光化合物で標識した抗体を用いて検出することができる。
しかしながらこの方法の感度は、サイズが５００ｎｍ未満の細胞性微粒子の同定を可能にしない。
アネキシンＡ５はまた、「捕獲／定量化」試験においても使用され、その場合、ホスファチジルセリンを露出した細胞性微粒子が、マイクロタイタープレートのウェルの表面に固定化されたアネキシンＡ５によって捕獲される（Ｈｙｐｈｅｎ Ｂｉｏｍｅｄ会社によって開発された試験）。
しかしながらこの技術は、得られる要素の表現型および分布を可能にしない。さらにその実行は厄介であり、かつ複数の実験因子に左右される。アネキシンＡ５による細胞性微粒子の捕獲は、高度にカルシウムイオン依存性であり、かつ実験の変動（タンパク質分解、様々な配位子との相互作用など）に敏感である。
したがってこれら利用可能な検出技術は精度および感度に欠ける。さらにそれらはきわめて費用がかかることが多い。
したがって正確かつ標準化されたやり方で生体液中の細胞性微粒子の、具体的には表現型を検出し、定量化し、特徴づけることができることが望ましい。
用語「生体液」とは、例えば血液、血漿、髄液、気管支肺胞液、尿、滑液、母乳、唾液、涙、精液、腹水、羊水、および滲出液（胸膜または他の）を含めた任意の抽出可能な体液を意味するものと理解される。
ところで本発明者等は、細胞性微粒子を合成配位子によって捕獲する検出および／または特徴づけの方法を開発した。
本発明による方法は、どのようなサイズであろうと細胞性微粒子の検出および／または特徴づけを可能にする。さらに合成配位子の使用により、生物学的分子の使用に関連する不利点、例えば他の配位子、具体的には抗体、タンパク質分解、およびカルシウム感受性による干渉さえも避けることが可能になる。
したがって第一の態様によれば本発明は、微粒子の表面における外面化したホスファチジルセリンを認識し、かつそれと特異的に結合することができるグラフト結合複核金属錯体に関する。
この記述の下記の項において用語「グラフト結合複核金属錯体」または「センサー」は、以下本明細書で式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物を定義するために区別なく使用されるものとする。
したがって本発明の目的は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）
を有する化合物に関する。
式中、
Ｍ+iは金属イオンであり、ｉは１、２、または３であり、
Ｌは交換可能な配位子であり、
Ｘは、−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ基、または−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ−ＮＨ−Ａ基である（ただし、Ｒは、置換または非置換の線状または分枝状いずれかのＣ2〜Ｃ10アルキル基、好ましくはＣ6〜Ｃ10アルキル基であり、またＡは、Ｈまたは発蛍光団基である）であり、
ｍ＝１〜１２、
ｎ＝１、２、または３、
ｉは金属の電荷であり、１、２、または３であり、
Ｙは、（ＣＨ2）p−ＮＨ2（ただし、ｐ＝０〜１２）である。
式中、
Ｍ+iは金属イオンであり、ｉは１、２、または３であり、
Ｌは交換可能な配位子であり、
Ｘは、−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ基、または−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ−ＮＨ−Ａ基である（ただし、Ｒは、置換または非置換の線状または分枝状いずれかのＣ2〜Ｃ10アルキル基、好ましくはＣ6〜Ｃ10アルキル基であり、またＡは、Ｈまたは発蛍光団基である）であり、
ｍ＝１〜１２、
ｎ＝１、２、または３、
ｉは金属の電荷であり、１、２、または３であり、
Ｙは、（ＣＨ2）p−ＮＨ2（ただし、ｐ＝０〜１２）である。
好ましくはＭは、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、およびＦｅから選択され、ＺｎまたはＣｕが好ましい。
水性溶液中では式（Ｉ）および（ＩＩ）を有する化合物は、媒体のｐＨによっては平衡状態にあることができる。例えばＸ＝ＣＨ3、ｎ＝１、Ｍ＝ＣｕまたはＺｎの場合、生理学的ｐＨにおいて両方の種の存在を観察することができる。
これらは、その対イオンを、例えばトシル酸、硝酸、硫酸、スルホン酸、チオ硫酸、ハロゲン化物イオン、ヘキサフルオロリン酸、テトラフェニルホウ酸、テトラフルオロホウ酸陰イオンなどのなかから選択することができるカチオン化合物である。
用語「交換可能な配位子」とは、金属イオンと弱く相互作用し、溶媒分子などの周囲の溶液、例えば具体的にはＨ2Ｏの分子、またはアセトニトリルなどの別の溶媒、あるいはまたその溶媒中に溶解した分子との交換のために利用可能な分子を意味するものと理解される。
実際にはその溶液中に存在する分子は、所与の金属イオンに対する親和性を有することができ、交換可能な配位子に対する競合効果をもたらす。
この記述の下記の項において用語「配位子」とは、金属イオンとの錯体形成の前の式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物の複核部分を指すものとし、また用語「複核金属錯体」または「センサー」は、その錯化配位子を指すものとする。
式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物は、その配位子部分についてはＣ．Ｂｅｌｌｅ等の論文、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９４，３５，７０１９〜７０２２に、また錯体形成に関してはＫ．Ｓｅｌｍｅｃｚｉ等の論文、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，２００７，１３，９０９３〜９１０６中に記載されている方法を適合させることによって調製することができる。最終の錯体の単離は、その得られる化合物の形態に基づいて、通常の技術（粉末、油の起こり得る沈殿、回収など）が適応される。
式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物の調製方法は、具体的には
ａ）配位子前駆体を合成するステップ（この前駆体は、アミノ官能基（Ａ＝Ｈの場合）が、保護基によってビス（２−ピリジルメチル）アミンすなわちＢＰＡと、２−［３，５−ビス（クロロメチル）−４−ヒドロキソベンジル］イソインドール−１，３−ジオンとから保護される）、
ｂ）こうして得られた配位子の脱保護するステップ、次いで
ｃ）金属イオンによりそれを錯化するステップ
を含むことができる。
ａ）配位子前駆体を合成するステップ（この前駆体は、アミノ官能基（Ａ＝Ｈの場合）が、保護基によってビス（２−ピリジルメチル）アミンすなわちＢＰＡと、２−［３，５−ビス（クロロメチル）−４−ヒドロキソベンジル］イソインドール−１，３−ジオンとから保護される）、
ｂ）こうして得られた配位子の脱保護するステップ、次いで
ｃ）金属イオンによりそれを錯化するステップ
を含むことができる。
アミン官能基の保護基としては、例えば、フタルイミド基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、アセチル、トシル、またはカルバミン酸が使用されるはずである。
ＢＰＡは市販されており、また２−［３，５−ビス（クロロメチル）−４−ヒドロキソベンジル］イソインドール−１，３−ジオンは、刊行物Ｍ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ等の論文、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００３，４２，７５０２〜７５１１中に記載されている。
アミン官能基がフタルイミド基によってＢＰＡおよび２−［３，５−ビス（クロロメチル）−４−ヒドロキソベンジル］イソインドール−１，３−ジオンから保護される前駆体配位子の合成は、例えば実施例１および２で述べるように行うことができる。
「アーム」としても知られるＸ基および／またはＹ基は、それらが存在する場合、線図１において化合物（４）から出発する金属イオンの錯体形成に先立って配位子のフェノール単位上にグラフトすることができる。
本発明の一態様によれば複核金属錯体のフェノール単位上にグラフトされたアームは、例えばフィコエリスリン（ＰＥ）またはフルオレセイン、特にフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）などの発蛍光団基を含む。
式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する好ましい化合物は、式中、
ＭがＺｎまたはＣｕであり、
Ｘが−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ（ただし、ｍ＝１、ＡがＨ、ｎ＝１、ｐ＝０）であるか、または
Ｘが−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ（ただし、ｍ＝１、ＡがＨ、ｎ＝２、ｐ＝０）であるか、または
Ｘが−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ−ＮＨ−Ａ（ただし、ＡがＨ、ｎ＝１、ｐ＝０）であるものである。
ｐ＝０の場合、ピリジン基はＹによって置換されない。
ＭがＺｎまたはＣｕであり、
Ｘが−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ（ただし、ｍ＝１、ＡがＨ、ｎ＝１、ｐ＝０）であるか、または
Ｘが−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ（ただし、ｍ＝１、ＡがＨ、ｎ＝２、ｐ＝０）であるか、または
Ｘが−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ−ＮＨ−Ａ（ただし、ＡがＨ、ｎ＝１、ｐ＝０）であるものである。
ｐ＝０の場合、ピリジン基はＹによって置換されない。
別の態様によれば本発明はまた、式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する複核金属錯体の合成において中間体として使用することができる配位子に関する。
したがって本発明の目的はまた、以下本明細書で式（ＩＩＩ）
を有する化合物に関する。
式中、
Ｚは、ＮＨ2または−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ基、あるいは−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ−ＮＨ−Ａ基（ただし、Ｒは、置換または非置換の線状または分枝状いずれかのＣ2〜Ｃ10アルキル基、好ましくはＣ6〜Ｃ10アルキル基であり、またＡは、Ｈであるか、またはｍ＝２の場合にはＡがＨと異なるという条件で発蛍光団基である）であり、
ｍ＝１〜１２、
ｎ＝１、２、または３、
Ｙは、（ＣＨ2）p−ＮＨ2（ただし、ｐ＝０〜１２）である。
式中、
Ｚは、ＮＨ2または−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ基、あるいは−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ−ＮＨ−Ａ基（ただし、Ｒは、置換または非置換の線状または分枝状いずれかのＣ2〜Ｃ10アルキル基、好ましくはＣ6〜Ｃ10アルキル基であり、またＡは、Ｈであるか、またはｍ＝２の場合にはＡがＨと異なるという条件で発蛍光団基である）であり、
ｍ＝１〜１２、
ｎ＝１、２、または３、
Ｙは、（ＣＨ2）p−ＮＨ2（ただし、ｐ＝０〜１２）である。
本発明の一態様によれば複核金属錯体のフェノール単位上にグラフトされたアームは、例えばフィコエリスリン（ＰＥ）またはフルオレセイン、具体的にはフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）などの発蛍光団基を含む。
式（ＩＩＩ）を有する好ましい化合物は、式中、
Ｚが、−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ（ただし、ｍ＝１、ＡがＨ、ｎ＝１、ｐ＝０）であるか、または
Ｚが、−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ（ただし、ｍ＝１、ＡがＨ、ｎ＝２、ｐ＝０）であるか、または
Ｚが、−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ−ＮＨ−Ａ（ただし、ＡがＨ、ｎ＝１、ｐ＝０）であるものである。
Ｚが、−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ（ただし、ｍ＝１、ＡがＨ、ｎ＝１、ｐ＝０）であるか、または
Ｚが、−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ（ただし、ｍ＝１、ＡがＨ、ｎ＝２、ｐ＝０）であるか、または
Ｚが、−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ−ＮＨ−Ａ（ただし、ＡがＨ、ｎ＝１、ｐ＝０）であるものである。
これらの化合物は、上記本明細書で示した方法のステップａ）およびｂ）に従って調製することができる。
さらなる態様によれば本発明は、細胞性微粒子の検出および／または特徴づけの方法に関し、この方法は、上記本明細書で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）
を有する化合物を、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くこと、および式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物によって捕獲された微粒子を検出および／または特徴づけることを含む。
必要に応じて、ことによると生体液中、具体的には血漿中に存在する有機または無機リン酸塩を、例えばマグネシウム塩などのキレート剤、またはランタンでキレート化することもできる。
用語「細胞性微粒子の検出」とは、生体液中の前記微粒子の存在を定性的および／または定量的に決定することを意味するものと理解される。
用語「細胞性微粒子の特徴づけ」とは、前記細胞性微粒子の同定、とりわけ分類、具体的には表現型の分類、また具体的には微粒子上に存在する可能性のある生体分子の検出、酵素活性の検出、およびＲＮＡの決定を意味するものと理解される。
好ましい態様によれば式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物は、第一ステップにおいて固体支持体上に固定化される。
非限定的な例を挙げると、このような支持体は、マイクロタイタープレート、シート、錐体、筒、ウェル、ビーズ、粒子、およびまたストリップからなる群から選択することができる。
したがって本発明は、細胞性微粒子の検出および／または特徴づけの方法に関し、この方法は、
ｉ）上記本明細書で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物を固体支持体の表面に固定化するステップ、
ｉｉ）細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
ｉｉｉ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物上に細胞性微粒子を捕獲するステップ、および
ｉｖ）捕獲された細胞性微粒子を検出および／または特徴づけるステップ
を含む。
ｉ）上記本明細書で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物を固体支持体の表面に固定化するステップ、
ｉｉ）細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
ｉｉｉ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物上に細胞性微粒子を捕獲するステップ、および
ｉｖ）捕獲された細胞性微粒子を検出および／または特徴づけるステップ
を含む。
好ましい実施形態によればその表面を予め活性化させた固体支持体、例えばマイクロタイタープレートなどが使用される。
この変形態様によれば細胞性微粒子の検出および／または特徴づけの前記方法は、
ｉ）固体支持体を活性化するステップ、
ｉｉ）上記本明細書で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物を、活性化させた支持体の表面に固定化するステップ、
ｉｉｉ）細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
ｉｖ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物上に細胞性微粒子を捕獲するステップ、および
ｖ）捕獲された細胞性微粒子を検出および／または特徴づけるステップ
を含む。
ｉ）固体支持体を活性化するステップ、
ｉｉ）上記本明細書で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物を、活性化させた支持体の表面に固定化するステップ、
ｉｉｉ）細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
ｉｖ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物上に細胞性微粒子を捕獲するステップ、および
ｖ）捕獲された細胞性微粒子を検出および／または特徴づけるステップ
を含む。
支持体の活性化は、例えばポリグルタルアルデヒドを使用するなどの通常の方法によって行うことができる。そのポリマー構造が、支持体上への安定なポリグルタルアルデヒドの吸着を可能にする。グルタルアルデヒドは、共有結合を形成することによってアミノ基（すなわち−ＮＨ2）と反応する反応部位を有する。この活性化のステップは、固体支持体上に固定化されたグルタルアルデヒドの少なくとも１個の反応部位と、配位子の−ＮＨ2官能基との間の共有結合の形成を含む。例えばＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを活性化剤として使用することができる。
固定化のステップの間に式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物は、共有結合を形成することによって活性化された支持体と結合する。
Ｘアームの末端に位置するアミノ基（すなわち−ＮＨ2）は、活性化された支持体の表面でアルデヒド基と反応することによってイミン結合の形成を可能にする。
細胞性微粒子の捕獲は、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液を、式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物と一緒にインキュベートすることによって、例えばＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）緩衝液中に懸濁させた状態に置き、次いで周囲温度でそのセンサーと一緒にインキュベートすることによって達成することができる。
次いで捕獲された微粒子を、例えば特異的標識抗体を使用した検出技術（分光または蛍光分析）、酵素標識（色素生成分析）、または定量ＰＣＲすなわちＱ−ＰＣＲなどの増幅技術を使用することによって明らかにすることができる。
例えば、下記の特異的標識抗体と、色素生成試験と、Ｑ−ＰＣＲ技術とを使用することができる。
ａ）特異的標識抗体は、
ｉ）ＣＤ（「Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」）と呼ばれる細胞性微粒子を放出する原細胞の特異的抗原に向けられる抗体、例えば単核細胞の場合のＣＤ１４抗体または内皮細胞の場合のＣＤ１０５（エンドグリン）、または
ｉｉ）活性な生物学的分子に向けられる抗体、例えば組織因子（ＴＦ、凝固活性化因子）に向けられる抗体、あるいは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）に向けられる抗体のどちらかである。これらの分子は所与の細胞型のみに限定されず、それらが微粒子上に存在するかどうかを病態生理学的観点から知ることが重要である。
ａ）特異的標識抗体は、
ｉ）ＣＤ（「Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」）と呼ばれる細胞性微粒子を放出する原細胞の特異的抗原に向けられる抗体、例えば単核細胞の場合のＣＤ１４抗体または内皮細胞の場合のＣＤ１０５（エンドグリン）、または
ｉｉ）活性な生物学的分子に向けられる抗体、例えば組織因子（ＴＦ、凝固活性化因子）に向けられる抗体、あるいは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）に向けられる抗体のどちらかである。これらの分子は所与の細胞型のみに限定されず、それらが微粒子上に存在するかどうかを病態生理学的観点から知ることが重要である。
これら抗体は、例えばペルオキシダーゼなどの酵素で標識し、次いで適切な基質を使用した分光光度分析によって検出することができる。これらの抗体はまた、蛍光色素で標識し、蛍光発光によって検出することもできる。
ｂ）色素生成試験は、合成基質の使用による酵素の活性の検出を可能にする。例えば、プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）または（ｕＰＡ）は、プラスミノーゲンをプラスミン（血栓溶解および繊維素溶解酵素）に変換し、色素生成基質を用いてこのプラスミンを検出することができる。したがって、捕獲された微粒子に、プラスミノーゲンと、プラスミンに敏感な合成の色素生成基質とを加えることによってｔＰＡおよびｕＰＡの活性を検出することができる。この技術は微粒子の表面に見出される酵素活性度により分子の検出を可能にする。
ｃ）Ｑ−ＰＣＲ技術は、捕獲された微粒子内に存在するｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを特異的プライマーによって検出することができる。ＲＮＡを、Ｑ−ＰＣＲの第一サイクルの温度の間の温度勾配によって微粒子をバーストすることによって放出させ、次いでそれと一緒に支持体上に接触した状態に置かれたプライマーと、ポリメラーゼの作用とを使用して特異的に増幅する。
上記本明細書で述べた検出方法の変形態様によれば、上記本明細書で定義した式（ＩＩＩ）を有する化合物すなわち配位子の固定化は、上記本明細書で定義した固体支持体上で行われ、その支持体−配位子全体を金属イオンの存在下で、式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する錯体がその場で形成されるようなやり方でインキュベートする。
この変形態様では、例えば式（ＩＩＩ）を有する配位子を約２０℃〜２５℃の周囲温度で約２時間インキュベートすることによって固体支持体上に固定化し、次いで過剰な配位子を除去し、金属イオンをその支持体−配位子全体と一緒に同じ温度で約２時間インキュベートすることによって固定化することができる。
次にこの検出方法は、続いて上記本明細書で述べたステップ、すなわち
ｉ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物を、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
ｉｉ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物上に細胞性微粒子を捕獲するステップ、および
ｉｉｉ）捕獲された細胞性微粒子を検出および／または特徴づけるステップ
を含む。
ｉ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物を、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
ｉｉ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物上に細胞性微粒子を捕獲するステップ、および
ｉｉｉ）捕獲された細胞性微粒子を検出および／または特徴づけるステップ
を含む。
本発明の別の態様によれば式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物は溶液の状態で使用される。
その時は、式（Ｉ）または（ＩＩ）を有し、式中、Ｘが−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａまたは−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ−ＮＨ−Ａ（ただし、Ｒは置換または非置換、線状または分枝いずれかのＣ2〜Ｃ10アルキル基、好ましくはＣ6〜Ｃ10アルキル基であり、Ａは発蛍光団基である）である化合物が好ましくは使用されることになる。
例えば、捕獲された微粒子は、場合により発蛍光団基で標識された特異的抗体を使用して蛍光発光を測定することによって検出することができる。
さらなる態様によれば本発明はまた、様々な疾患、具体的には血栓性、炎症性、および／または代謝性障害、あるいは心臓血管または神経血管の疾患および事象、あるいは糖尿病、癌、アルツハイマー病などの疾患または他の病状の発症のリスクの評価および／またはその治療の検証および監視を可能にする細胞性微粒子の検出および／または特徴づけの方法に関する。
様々な疾患の発症のリスクの評価および／またはその治療の検証および監視を可能にする細胞性微粒子の検出および／または特徴づけのこの方法は、有利には、
ｉ）上記本明細書で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）
を有する化合物を、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
ｉｉ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物によって捕獲された微粒子を検出および／または特徴づけるステップ、および
ｉｉｉ）前のステップにおいて行った測定の結果を、生体液の対照試料に対して行った類似の測定の結果と比較するステップ
を含む。
ｉ）上記本明細書で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）
ｉｉ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物によって捕獲された微粒子を検出および／または特徴づけるステップ、および
ｉｉｉ）前のステップにおいて行った測定の結果を、生体液の対照試料に対して行った類似の測定の結果と比較するステップ
を含む。
本発明はまた、様々な疾患、具体的には血栓性、炎症性、および／または代謝性障害、あるいは心臓血管または神経血管の疾患および事象、あるいは糖尿病、癌、アルツハイマー病などの疾患または他の病状の診断、およびそれら疾患または他の病状の発症のリスクの評価の方法に関し、この方法は、
ｉ）上記本明細書で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物を、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
ｉｉ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物によって捕獲された微粒子を検出および／または特徴づけるステップ、および
ｉｉｉ）前のステップにおいて行った測定の結果を、生体液の対照試料に対して行った類似の測定の結果と比較するステップ
を含む。
ｉ）上記本明細書で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物を、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
ｉｉ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物によって捕獲された微粒子を検出および／または特徴づけるステップ、および
ｉｉｉ）前のステップにおいて行った測定の結果を、生体液の対照試料に対して行った類似の測定の結果と比較するステップ
を含む。
式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物を細胞性微粒子と接触させた状態に置くステップの条件、ならびに前記細胞性微粒子の捕獲、検出、および／または特徴づけのステップの条件は、上記本明細書で定義したとおりである。
有利にはこの対照生体液は、試験されるものと同一だが、健康と考えられる個体由来の生体液である。別法では対照生体液は、試験される生体液と同じ個体から得られるが、以前の試料由来のものである。
本発明による細胞性微粒子の検出および／または特徴づけの方法の潜在的用途は、例えば、心筋梗塞または発作、あるいは糖尿病、癌、アルツハイマー病などの疾患または他の疾患を引き起こす恐れのある血栓症のリスクの早期診断、ならびにその治療の検証および監視である。
（原文記載なし）
本発明を下記の実施例により例示するが、それらに少しも限定されない。
実施例１：式（ＩＩＩ）を有する配位子４−（アミノメチル）−２，６−ビス［［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］メチル］フェノール（ＨＢＰＭＰ−ＮＨ2）の調製
１）２−｛４−ヒドロキシ−３，５−ビス［［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］メチル］ベンジル｝イソインドール−１，３−ジオン（３）
化合物１は、刊行物Ｍ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ等の論文、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００３，４２，７５０２〜７５１２中に記載されている。
化合物１は、刊行物Ｍ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ等の論文、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００３，４２，７５０２〜７５１２中に記載されている。
不活性アルゴン雰囲気内で、氷浴中に浸漬した５００ｍＬの３つ口フラスコ中へ１２０ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶かした６．５ｇ（１当量）のジクロロロ前駆体（１）を導入する。その添加漏斗中に６０ｍＬの乾燥ＴＨＦを入れ、その中に６．９ｇ（２当量）のＢＰＡ（化合物２）および１０ｍＬのトリエチルアミン（４当量）を溶解した。この添加は、０℃で１滴ずつ行われる。
添加の終わりにその得られた褐色懸濁液を周囲温度で２４時間放置して撹拌されるに任せる。濾過し、ＴＨＦで洗い落とした後、濾液を回収し、それを蒸発させる。
得られた固体を、１％Ｈ2Ｏ、１０ｍＬのＭｅＯＨ、１５０ｍＬのＥｔＯＡｃ、および２００ｍＬのシクロヘキサンの混合物によって不活性化させた中性アルミナカラム（高さ１１ｃｍ、直径４．５ｃｍ）上で精製する。溶離溶媒は、ＥｔＯＡｃ＋シクロヘキサン １／２（ｖ／ｖ）、ＥｔＯＡｃ＋シクロヘキサン １／１（ｖ／ｖ）、ＥｔＯＡｃ、および１〜２％ＭｅＯＨを含むＥｔＯＡｃである。
蒸発の後、７．８５ｇ（６６％）の純粋生成物３を白色固体の形態で回収する。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ3ＣＮ，δｐｐｍ）：１１．１５（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）；８．４３（ｄ，４Ｈ，Ｐｙ−Ｎ−ＣＨ）；７．８３（ｍ，４Ｈ，Ｐｈｔ）；７．５９（ｔｄ，４Ｈ，Ｐｙ）；７．４１（ｄ，４Ｈ，Ｐｙ−Ｃ−ＣＨ）；７．２０（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）；７．１５（ｍ，４Ｈ，Ｐｙ−Ｎ−ＣＨ−ＣＨ）；４．４６（ｓ，２Ｈ，Ｐｈｔ−ＣＨ2）；３．８４（ｓ，８Ｈ，Ｐｙ−ＣＨ2）；３，７７（ｓ，４Ｈ，Ａｒ−ＣＨ2−Ｎ）。
13Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ3ＣＮ，δｐｐｍ）：１６８．３（Ｃ＝Ｏ）；１５９．４（Ｐｙ−Ｃ）；１５５．９（Ｃ−ＯＨ）；１４９．０（Ｐｙ−Ｎ−ＣＨ）；１３６．８（Ｐｙ）；１３４．１（Ｐｙ）；１３２．５（ＣＯ−Ｃ）；１２９．８（Ｐｙ−Ｃ−ＣＨ）；１２６．６（Ａｒ−Ｃ−ＣＨ2）；１２４，６（Ａｒ−Ｃ−ＣＨ2）；１２３．５（Ｐｈｔ−ＣＨ）；１２３．３（Ｐｈｔ−ＣＨ）；１２２．２（Ａｒ−ＣＨ）；６０．１（Ａｒ−ＣＨ2−Ｐｈｔ）；５４．８（Ｐｙ−ＣＨ2）；４１．６（Ａｒ−ＣＨ2−Ｎ）。
ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）質量スペクトル（ｍ／ｚ）＝６７６（Ｍ＋Ｈ）+。
２）４−（アミノメチル）−２，６−ビス［［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］メチル］フェノール（４）
凝縮器を備えた５００ｍＬフラスコ中へ、６．５ｇの保護された生成物（３）（１当量）および２５０ｍＬの無水エタノールを導入する。１０ｍＬの無水エタノールに溶かした２０．５ｍＬのヒドラジン一水和物（４当量）を１滴ずつ加え、次いでその反応媒体を還流下で加熱し、２時間、次いで周囲温度で一晩放置して撹拌されるに任せる。
凝縮器を備えた５００ｍＬフラスコ中へ、６．５ｇの保護された生成物（３）（１当量）および２５０ｍＬの無水エタノールを導入する。１０ｍＬの無水エタノールに溶かした２０．５ｍＬのヒドラジン一水和物（４当量）を１滴ずつ加え、次いでその反応媒体を還流下で加熱し、２時間、次いで周囲温度で一晩放置して撹拌されるに任せる。
得られた白色懸濁液を濾過し、エタノールで洗い流し、濾液を蒸発させる。残渣を１５０ｍＬの２Ｎ水酸化ナトリウム溶液中に溶解し、２時間放置して撹拌されるに任せる。反応媒体を４Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨ ７まで再度中和する。その溶液をジクロロメタンで３回抽出し、次いでＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、蒸発させる。
５ｇ（９５％）の化合物４が、白色固体の形態で得られる。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，δｐｐｍ）：８．５５（ｄ，４Ｈ，Ｐｙ−Ｎ−ＣＨ）；７．５７（ｔ，４Ｈ，Ｐｙ）；７．４５（ｄ，４Ｈ，Ｐｙ−Ｎ−Ｃ−ＣＨ）；７．１６（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）；７．１０（ｔ，４Ｈ，Ｐｙ）；５．２９（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）；３．９８（ｓ，２Ｈ，ＮＨ2−ＣＨ2）；３．８４（ｄ，８Ｈ，Ｐｙ−ＣＨ2）；３．７７（ｓ，４Ｈ，Ａｒ−ＣＨ2−Ｎ）；２．８９（ｓ，２Ｈ，ＮＨ2）。
13Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，δｐｐｍ）：１５９．６（Ｐｙ−Ｃ）；１５５．３（Ｃ−ＯＨ）；１４８．８（Ｐｙ−Ｎ−ＣＨ）；１３６．６（Ｐｙ−Ｎ−Ｃ−ＣＨ−ＣＨ）；１３０．０（Ａｒ−Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ2）；１２９．０（Ａｒ−ＣＨ）；１２４．１（Ａｒ−Ｃ−ＣＨ2−Ｎ）；１２３．１（Ｐｙｒ−Ｃ−ＣＨ）；１２２．０（Ｐｙ−Ｎ−ＣＨ−ＣＨ）；５９．８（Ｐｙ−ＣＨ2）；５４．７（Ａｒ−ＣＨ2−Ｎ）；４５．１（ＮＨ2−ＣＨ2）。
ＥＳＩ質量スペクトル（ｍ／ｚ）＝５６８（Ｍ＋Ｎａ）+，５４６（Ｍ＋Ｈ）+。
実施例２：錯体［μ−［４−（アミノメチル）−２，６−ビス［［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］メチル］−フェノラト］］−μ―ヒドロオキソ二亜鉛二過塩素酸塩（５）（［（Ｚｎ2）（ＢＰＭＰ−ＮＨ2）（μ−ＯＨ）］・（ＣｌＯ4）2）の調製
２５ｍＬフラスコ中へ、８ｍＬのアセトニトリルおよび０．１５５ｇ（２．１当量）のトリエチルアミン中に溶解した配位子４（０．４ｇ、１当量）を導入する。
６ｍＬのアセトニトリル中に溶解した０．５７ｇ（２．１当量）の過塩素酸亜鉛六水和物をこの中に１滴ずつ加える。過塩素酸塩の添加が完了したらその混合物を周囲温度に放置して撹拌されるに任せる。この溶液を約５ｍＬの体積になるように部分的に蒸発させ、次いでかなりの曇りが観察されるまでエチルエーテルをその中に加え、その後−２０℃に一晩放置する。
沈殿が得られ、これを濾過し、エチルエーテルで洗い流し、乾燥する。その濾液を再び同じ処理にかけ、最終的には黄白色粉末の形態で２８０ｍｇ（４３％）の化合物５の回収が可能になる。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ3ＣＮ，δｐｐｍ）：８．９８（ｄ，４Ｈ，Ｐｙ−Ｈ）；８．０５（ｔ，４Ｈ，Ｐｙ−Ｈ）；７．６５（ｔ，４Ｈ，Ｐｙ−Ｈ）；７．５３（ｄ，４Ｈ，Ｐｙ−Ｈ）；７．０９（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）；４．０１（ｓ，８Ｈ，Ｐｙ−ＣＨ2）；３．９１（ｄ，２Ｈ，ＮＨ2−ＣＨ2）；３．８４（ｓ，４Ｈ，Ａｒ−ＣＨ2−Ｎ）。
13Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ3ＣＮ，δｐｐｍ）：１６３．４（Ａｒ−ＣＯ）；１５６．５（Ｐｙ）；１４９．５（Ｐｙ）；１４２．５（Ｐｙ）；１３３．８（Ａｒ−Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ2）；１２６．０（Ｐｙ）；１２５．９（Ａｒ）；１２５．３（Ａｒ）；１２３．２（Ｐｙ−Ｎ−ＣＨ−ＣＨ）；６１．０（ＮＨ2−ＣＨ2）；５９．０（Ａｒ−ＣＨ2−Ｎ）；５８．１（Ｐｙ−ＣＨ2）。
ＥＳＩ質量スペクトル（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝７９１（Ｍ−ＣｌＯ4）+。
実施例３：式（ＩＩＩ）を有する配位子６−アミノ−Ｎ−（３，５−ビス（（ビス（２−ピリジルメチル）アミノ）メチル）−４−ヒドロキシベンジル）ヘキサンアミド（８）（ＨＢＰＭＰ−Ｃ6ＮＨ2）の調製
化合物６は、刊行物Ｍ．Ｂ．Ｄｏｕｇｈｔｙ等の論文、１９９３、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，２７２〜２７９中に記載されている。
１）６−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ−（３，５−ビス（（ビス（２−ピリジルメチル）アミノ）メチル）−４−ヒドロキシベンジルアミノ）−６−オキソヘキシルカルバマート（７）
オーブン中で乾燥され、添加漏斗およびアルゴンバルーンを備え、氷浴中に置かれた２５０ｍＬの３つ口フラスコ中へ、８３５ｍｇ（１．２当量）の６−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ヘキサン酸および４０ｍＬの乾燥ジクロロメタンを導入する。１．３７ｇ（１．２当量）のＨＡＴＵ（２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）を６ｍＬのＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）および１．５ｍＬ（３当量）のトリエチルアミン（ＮＥｔ3）に加えてから、それを３０分間放置して撹拌されるに任せる（これまでどおり氷浴中で）。４０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中に溶解した１．５２ｇ（１当量）の配位子４をその中に１滴ずつ加える。これを０℃で１時間、次いで周囲温度で一晩および一日放置して撹拌されるに任せる。
オーブン中で乾燥され、添加漏斗およびアルゴンバルーンを備え、氷浴中に置かれた２５０ｍＬの３つ口フラスコ中へ、８３５ｍｇ（１．２当量）の６−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ヘキサン酸および４０ｍＬの乾燥ジクロロメタンを導入する。１．３７ｇ（１．２当量）のＨＡＴＵ（２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）を６ｍＬのＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）および１．５ｍＬ（３当量）のトリエチルアミン（ＮＥｔ3）に加えてから、それを３０分間放置して撹拌されるに任せる（これまでどおり氷浴中で）。４０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中に溶解した１．５２ｇ（１当量）の配位子４をその中に１滴ずつ加える。これを０℃で１時間、次いで周囲温度で一晩および一日放置して撹拌されるに任せる。
ジクロロメタンおよびＤＭＦを真空下で蒸発させた後、４．６ｇの濃厚な油が得られ、これを中性アルミナのカラム（高さ５．５ｃｍ、直径４．５ｃｍ）上でのクロマトグラフィーによって精製する。カラムは、１０ｍＬのＭｅＯＨを含む２滴の蒸留水の溶液、３００ｍＬのＥｔＯＡｃ、および１５０ｍＬのシクロヘキサンによって不活性にする。溶離溶媒は、ＥｔＯＡｃ＋シクロヘキサン、ＥｔＯＡｃ、ＥｔＯＡｃ＋１〜５％のＭｅＯＨである。
蒸発後、１．９ｇの白色粘着性の生成物を回収する。これを水に溶解し、削り取り、デカントし、ジクロロメタンで抽出する。Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、濾過し、蒸発させた後、１．７ｇ（８０％）の化合物７がベージュ色固体の形態で回収される。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，δｐｐｍ）：１１．１２（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）；８．５３（ｍ，４Ｈ，Ｐｙ）；７．６０（ｍ，７Ｈ，Ｐｙ）；７．４８（ｍ，５Ｈ，Ｐｙ）；７．２７（ｍ，２Ｈ，Ａｒ）；５．７９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；４．３２（ｄ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ2−ＮＨ）；４．１３（ｄ，４Ｈ，Ａｒ−ＣＨ2−Ｎ）；３．８６（ｓ，１０Ｈ，Ｐｙ−ＣＨ2）；２．１６（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2）；１．８６（ｄ，５Ｈ，ＣＨ2）；１．６４（ｔ，３Ｈ，ＣＨ2）；１．４２（ｓ，９Ｈ，ｔＢｕ）。
13Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，δｐｐｍ）：１７２．８（ＣＨ2−Ｃ＝Ｏ−ＮＨ）；１５９．４（Ｏ−Ｃ＝Ｏ）；１５５．８（Ａｒ−Ｃ−ＯＨ）；１４９．２（Ｐｙ−Ｎ−ＣＨ）；１３６．９（Ｐｙ）；１２９．３（Ａｒ−ＣＨ）；１２８．３（Ｏ−Ｃ−（ＣＨ3）3）；１２４．６（Ａｒ−Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ）；１２３．３（Ｐｙ−Ｃ−ＣＨ）；１２２．３（Ｐｙ−Ｎ−ＣＨ−ＣＨ）；６０．１（Ｐｙ−ＣＨ2）；５５．０（Ａｒ−ＣＨ2）；４３．７（Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ2）；３６．９（ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2）；３０．１（ＣＨ2）；２８．８（ＣＨ3）；２６．７（ＣＨ2）；２５．６（ＣＨ2）。
ＥＳＩ質量スペクトル（ｍ／ｚ）＝７８１（Ｍ＋Ｎａ）+，７５９（Ｍ＋Ｈ）+。
２）６−アミノ−Ｎ−（３，５−ビス（（ビス（２−ピリジルメチル）アミノ）メチル）−４−ヒドロキシベンジル）−ヘキサンアミド（８）
凝縮器を備えた２５０ｍＬフラスコ中へ１．６９ｇ（１当量）の保護された生成物（７）および２００ｍＬの乾燥ジクロロメタンを導入する。混合物を氷浴で冷却し、次いで１０ｍＬの乾燥ジクロロジメタンに溶かした９ｍＬのトリフルオロ酢酸（４６当量）を１滴ずつ加える。反応媒体を周囲温度で一晩放置して撹拌させる。
凝縮器を備えた２５０ｍＬフラスコ中へ１．６９ｇ（１当量）の保護された生成物（７）および２００ｍＬの乾燥ジクロロメタンを導入する。混合物を氷浴で冷却し、次いで１０ｍＬの乾燥ジクロロジメタンに溶かした９ｍＬのトリフルオロ酢酸（４６当量）を１滴ずつ加える。反応媒体を周囲温度で一晩放置して撹拌させる。
得られた溶液を２Ｎ水酸化ナトリウム溶液、次いで飽和ＮａＨＣＯ3溶液でｐＨ ９まで中和する。この混合物をジクロロメタンで３回抽出し、次いでＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、濾過し、蒸発させる。粉末が得られ、これを高温アセトニトリル中に溶解する。熱濾過の後、その溶液を蒸発させ、１．２ｇ（８２％）の化合物８が黄白色固体の形態で得られる。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，δｐｐｍ）：８．５１（ｄ，４Ｈ，Ｐｙ）；７．５６（ｔ，４Ｈ，Ｐｙ）；７．３７（ｄ，４Ｈ，Ｐｙ）；７．１３（ｔ，４Ｈ，Ｐｙ）；７．０４（ｓ，２Ｈ，Ａｒ）；４．２４（ｄ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ2−ＮＨ）；３．８３（ｓ，８Ｈ，Ｐｙ−ＣＨ2）；３．７０（ｓ，４Ｈ，Ａｒ−ＣＨ2−Ｎ）；２．９０（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2）；２．２４（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2）；１．７５（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2）；１．６６（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2）；１．２６（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2）。
13Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，ＴＭＳ，δｐｐｍ）：１７２．９（−Ｃ＝Ｏ）；１５８．６（Ｐｙ−Ｎ−ＣＨ）；１５５．０（Ａｒ−Ｃ−ＯＨ）；１４８．８（Ｐｙ）；１３６．７（Ｐｙ）；１２９．４（Ａｒ−ＣＨ）；１２８．８（Ａｒ−ＣＨ）；１２２．２（Ｐｙ）；１２３．３（Ｐｙ）；；１２３．３（Ｐｙ）；５９．９（Ｐｙ−ＣＨ2）；５４．７（Ａｒ−ＣＨ2）；４２．９（Ａｒ−ＣＨ2−ＮＨ−）；３９．７（−ＣＨ2−ＮＨ2）；３５．６（ＣＨ2）；２７．６（ＣＨ3）；２５．３（ＣＨ2）；２４．８（ＣＨ2）。
ＥＳＩ質量スペクトル（ｍ／ｚ）＝６８１（Ｍ＋Ｎａ）+，６５９（Ｍ＋Ｈ）+，３３０（Ｍ＋２Ｈ）2+。
実施例４：錯体［μ−［６−アミノ−Ｎ−（３，５−ビス（（ビス（２−ピリジルメチル）アミノ）メチル）−４−ヒドロキシベンジル）ヘキサンアミド］］−μ−ヒドロオキソ二亜鉛二過塩素酸塩（９）（［（Ｚｎ2）（ＢＰＭＰ−Ｃ6ＮＨ2）（μ−ＯＨ）］・（ＣｌＯ4）2）の調製
１００ｍＬのフラスコ中へ、１０ｍＬのアセトニトリルに溶解した０．４ｇ（１当量）の配位子８（全て溶解させるために暫時の加熱を伴う）および０．１３ｇ（２．１当量）のトリエチルアミンを導入する。
４ｍＬのアセトニトリル中に溶解した０．９ｇ（２．１当量）の過塩素酸亜鉛六水和物をその中に１滴ずつ加える。過塩素酸塩の添加が完了したらその混合物を周囲温度に２時間放置して撹拌されるに任せる。この溶液を約５ｍＬの体積になるように部分的に蒸発させ、次いでかなりの曇りが観察されるまでエチルエーテルをその中に加え、その後−２０℃に一晩放置する。
沈殿が得られ、これを濾過し、エチルエーテルで洗い流し、乾燥する。その濾液を再び同じ処理にかけ、最終的に黄白色粉末の形態で２７０ｍｇ（４３％）の化合物９の回収が可能になる。
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，δｐｐｍ）：８．９６（ｄ，４Ｈ，Ｐｙ−Ｈ）；８．８０（ｓ，１Ｈ，ＯＨ），Ｐｙ−Ｈ）；８．１１（ｔ，４Ｈ，Ｐｙ−Ｈ）；７．６８（ｔ，４Ｈ，Ｐｙ−Ｈ）；７．５９（ｄ，４Ｈ，Ｐｙ−Ｈ）；６．８３（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）；６．６４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＯ）；４．０１（ｓ，８Ｈ，Ｐｙ−ＣＨ2）；３．９１（ｄ，２Ｈ，ＮＨ2−ＣＨ2）；３．８４（ｓ，４Ｈ，Ａｒ−ＣＨ2−Ｎ）；４．１１（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ2−Ｎ）；２．１２（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ2）；１．５２（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ2）；１．２９（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ2）。
13Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，δｐｐｍ）：１７１．４（−Ｃ＝Ｏ）；１５５．０（Ｐｙ−Ｎ−Ｃ）；１５４．９（Ａｒ−Ｃ−ＯＨ）；１４７．５（Ｐｙ−ＣＨ）；１４０．８（Ｐｙ）；１４０．２（Ａｒ−Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ2）；１３０．８（Ａｒ−ＣＨ）；１２９．８（Ａｒ−ＣＨ）；１２６．０（Ａｒ−Ｃ）；１２６．３（Ａｒ−Ｃ）；１２４．６（Ｐｙ−ＣＨ）；１２３．７（ＣＨ）；１２２．９（Ｃ）；１２１．１（ＣＨ）；５８．８（Ａｒ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ）；５７．７（Ａｒ−ＣＨ2−Ｎ）；５６．７（Ｐｙ−ＣＨ2）；４１．１（ＣＨ2）；３５．４（ＣＨ2）；２９．７（ＣＨ2）；２６．０（ＣＨ2）；２５．４（ＣＨ2）。
ＥＳＩ質量スペクトル（ｍ／ｚ）＝９０５（Ｍ−ＣｌＯ4）+，４０３（Ｍ−２ＣｌＯ4）2+。
実施例５：実施例４からの錯体のマイクロタイタープレート上への固定化による細胞性微粒子の比色アッセイ（感度研究）
ａ）試薬：
ｉ）グルタルアルデヒド（２５％）
ｉｉ）エタノールアミン（１６．５Ｍ）
ｉｉｉ）ｐＨ ９．５の１Ｍ重炭酸塩緩衝液（Ｎａ Ｂｉｃ）（ＮａＨ2ＣＯ3の溶液（ｐＨ ８．３）をＮａ2ＣＯ3の溶液（ｐＨ １１．６）で滴定することによってのみ作られる）
ｉｖ）ｐＨ ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）
ｖ）（ｈＢＰＭＰ／亜鉛）−Ｃ6ＮＨ2（１５０μＭ）
ａ）試薬：
ｉ）グルタルアルデヒド（２５％）
ｉｉ）エタノールアミン（１６．５Ｍ）
ｉｉｉ）ｐＨ ９．５の１Ｍ重炭酸塩緩衝液（Ｎａ Ｂｉｃ）（ＮａＨ2ＣＯ3の溶液（ｐＨ ８．３）をＮａ2ＣＯ3の溶液（ｐＨ １１．６）で滴定することによってのみ作られる）
ｉｖ）ｐＨ ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）
ｖ）（ｈＢＰＭＰ／亜鉛）−Ｃ6ＮＨ2（１５０μＭ）
ｂ）プロトコル
ｉ）グルタルアルデヒドの重合：
０．１Ｍ Ｎａ Ｂｉｃ中で５０ｍＬの２．５％グルタルアルデヒド溶液を調製し、次いでその混合物を密封したバイアル中に３７℃で２時間のあいだ置く。
ｉｉ）ポリ塩化ビニルの表面へのポリグルタルアルデヒドの吸着。９６ウェルを有するマイクロタイタープレートを使用する。各ウェル中に１００μＬの２．５％グルタルアルデヒドを付着させ、２２℃で２時間放置する。ポリグルタルアルデヒドを除去し、表面を水で３回洗い流す。
ｉｉｉ）錯体［（Ｚｎ2）（ＢＰＭＰ−Ｃ6ＮＨ2）（μ−ＯＨ）］・（ＣｌＯ4）2の固定化。０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８．２）に溶かした錯体をポリ塩化ビニルプレートの表面に＋２２℃で２４時間固定化させる。この溶液と一緒に表面を２２℃で２時間インキュベートすることによって遊離アルデヒド基を０．３Ｍエタノールアミンで飽和させ、次いで水で洗浄し、次にｐＨ ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）中で３回洗浄することによってエタノールアミンを除去する。これらプレートを４℃で保管する。
ｉｖ）微粒子を含有する緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（０．９％ＮａＣｌ））を１２時間インキュベートし、次いでプレートを緩衝液で洗い流す。この微粒子は、Ｒ．Ｌａｃｒｏｉｘ等の論文、Ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０，２４３２〜２４３９中に記載されているようにＴＮＦ−αによるＨＭＥＣ１ヒト微小血管内皮細胞の細胞培養物の活性化から得られる。
ｉ）グルタルアルデヒドの重合：
０．１Ｍ Ｎａ Ｂｉｃ中で５０ｍＬの２．５％グルタルアルデヒド溶液を調製し、次いでその混合物を密封したバイアル中に３７℃で２時間のあいだ置く。
ｉｉ）ポリ塩化ビニルの表面へのポリグルタルアルデヒドの吸着。９６ウェルを有するマイクロタイタープレートを使用する。各ウェル中に１００μＬの２．５％グルタルアルデヒドを付着させ、２２℃で２時間放置する。ポリグルタルアルデヒドを除去し、表面を水で３回洗い流す。
ｉｉｉ）錯体［（Ｚｎ2）（ＢＰＭＰ−Ｃ6ＮＨ2）（μ−ＯＨ）］・（ＣｌＯ4）2の固定化。０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８．２）に溶かした錯体をポリ塩化ビニルプレートの表面に＋２２℃で２４時間固定化させる。この溶液と一緒に表面を２２℃で２時間インキュベートすることによって遊離アルデヒド基を０．３Ｍエタノールアミンで飽和させ、次いで水で洗浄し、次にｐＨ ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）中で３回洗浄することによってエタノールアミンを除去する。これらプレートを４℃で保管する。
ｉｖ）微粒子を含有する緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（０．９％ＮａＣｌ））を１２時間インキュベートし、次いでプレートを緩衝液で洗い流す。この微粒子は、Ｒ．Ｌａｃｒｏｉｘ等の論文、Ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０，２４３２〜２４３９中に記載されているようにＴＮＦ−αによるＨＭＥＣ１ヒト微小血管内皮細胞の細胞培養物の活性化から得られる。
ｃ）検出
検出は光度分析によって行う。その検討される微粒子に特異的な抗ＣＤ１０５抗体と一緒に３時間インキュベートを行い、その後、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋４０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで洗い流す。
検出は光度分析によって行う。その検討される微粒子に特異的な抗ＣＤ１０５抗体と一緒に３時間インキュベートを行い、その後、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋４０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで洗い流す。
続いて、ペルオキシダーゼと結合した二次抗体と一緒にインキュベーションを行い、その後、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋４０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで洗い流す。
検出は、ペルオキシダーゼと結合した二次抗体を使用する場合は、１ｍｇ／ｍＬのＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）を用いて行う。
読取りは、分光光度計により行う。
結果を図１に示し、これはタンパク質の量を基準にした微粒子の希釈物の分光分析による検出を表す。
得られるシグナルは、ペルオキシダーゼによる基質の分解反応の初期速度（Ｖｉ）に相当するｍＯＤ／分で表される。
微粒子の量を基準にして得られるこのシグナルは、特異的用量−応答を示す。
実施例６：マイクロタイタープレート上での免疫化学的方法による実施例２および４からのＺｎ錯体の特異性の検討
Ｎａ Ｂｉｃ（０．１Ｍ、ｐＨ ９．５）で希釈した２．５％グルタルアルデヒドの溶液をマイクロタイタープレートの各ウェル中に置き、２２℃で４時間放置する。グルタルアルデヒドを除去し、水で数回洗い流した後、試験される錯体、すなわち［（Ｚｎ2）（ＢＰＭＰ−ＮＨ2）（μ−ＯＨ）］・（ＣｌＯ4）2（実施例２）または［（Ｚｎ2）（ＢＰＭＰ−Ｃ6ＮＨ2）（μ−ＯＨ）］・（ＣｌＯ4）2（実施例４）を、５００ｎｍの濃度（滴定によって決まる濃度）でインキュベートした。次いでその錯体を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ溶液で洗い流すことによって除去した。最後に、遊離アルデヒド基を０．３Ｍエタノールアミンの溶液で飽和させ、続いて１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で数回洗い流した。
Ｎａ Ｂｉｃ（０．１Ｍ、ｐＨ ９．５）で希釈した２．５％グルタルアルデヒドの溶液をマイクロタイタープレートの各ウェル中に置き、２２℃で４時間放置する。グルタルアルデヒドを除去し、水で数回洗い流した後、試験される錯体、すなわち［（Ｚｎ2）（ＢＰＭＰ−ＮＨ2）（μ−ＯＨ）］・（ＣｌＯ4）2（実施例２）または［（Ｚｎ2）（ＢＰＭＰ−Ｃ6ＮＨ2）（μ−ＯＨ）］・（ＣｌＯ4）2（実施例４）を、５００ｎｍの濃度（滴定によって決まる濃度）でインキュベートした。次いでその錯体を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ溶液で洗い流すことによって除去した。最後に、遊離アルデヒド基を０．３Ｍエタノールアミンの溶液で飽和させ、続いて１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液で数回洗い流した。
続いて、微粒子（ＨＭＥＣ１細胞の細胞培養物の活性化から得られた）を含有する緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．９％ ＮａＣｌ）を１時間インキュベートし、次いで緩衝液で洗い流すことによって除去した。
間接免疫化学法（１μｇ／ｍＬの一次抗ＣＤ１０５抗体と、１６０ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼと結合した二次抗体と、１ｍｇ／ｍＬのＡＢＴＳ）を使用して、微粒子上の内皮抗原ＣＤ１０５の存在を分析した。
読取りは、４０５ｎｍで分光光度計により行う。
結果を図２に示し、これはタンパク質の量を基準にした微粒子の希釈物の分光分析による検出を表す。
得られるシグナルは、ペルオキシダーゼによる基質の分解反応の初期速度（Ｖｉ）に相当するｍＯＤ／分で表され、実施例２からの錯体についてはダークグレーで、また実施例４からの錯体についてはライトグレーで示す。
測定媒体中の試薬の存在（＋記号）または不在（−記号）を、横軸の下方に示す。
得られたシグナルは、本発明による錯体が免疫化学的顕色（ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ）過程で微粒子を特異的に認識することを示す。
さらにこの方法は、微粒子の不在下で測定されるきわめて低いシグナルによって示されるようにきわめて低いバックグラウンドノイズを生じさせるに過ぎないように見える。
実施例７：錯体［μ−［４−（アミノメチル）−２，６−ビス［［（ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］メチル］−フェノラト］］−μ−ヒドロオキソ二銅二過塩素酸塩（１０）（［（Ｃｕ2）（ＢＰＭＰ−ＮＨ2）（μ−ＯＨ）］・（ＣｌＯ4）2）の調製
２５ｍＬのフラスコ中へ、１０ｍＬのアセトニトリルおよび７７μＬ（２当量）のトリエチルアミン中に溶解した配位子４（０．１４６ｇ、１当量）を導入する。
３ｍＬのアセトニトリル中に溶解した０．２１ｇ（２当量）の過塩素酸銅（ＩＩ）六水和物をこの中に１滴ずつ加える。銅塩の添加が完了したらその混合物を周囲温度に３０分間放置して撹拌されるに任せる。この溶液を約５ｍＬの体積になるように部分的に蒸発させ、次いでかなりの曇りが観察されるまでテトラヒドロフランをその中に加え、その後−２０℃に３日間放置する。
沈殿が得られ、これを濾過し、次いでエチルエーテルで洗い流す。回収された固体を再びアセトニトリル中に溶解し、前述と同様に−２０℃においてテトラヒドロフランで再沈殿させる。濾過し、洗い流し、乾燥した後、緑色粉末の形態で１１８ｍｇ（３６％）の化合物１０が回収される。
ＥＳＩ質量スペクトル（ｍ／ｚ）＝８０６（ｚ＝１）［Ｍ−ＣｌＯ4 -＋Ｈ2Ｏ］，３５３．５（ｚ＝２）［Ｍ−２ＣｌＯ4 -＋２Ｈ2Ｏ］；ＵＶ／ｖｉｓ（ＤＭＳＯ／水（ｐＨ＝７）３０／７０）；λmax（ε）≒３４０（ｓｈ），４２５（ｓｈ），７００（１９１Ｍ-1ｃｍ-1）。
実施例８：錯体［μ−［６−アミノ−Ｎ−（３，５−ビス（（ビス（２−ピリジルメチル）アミノ）メチル）−４−ヒドロキシベンジル）−ヘキサンアミド］］−μ−ヒドロオキソ二銅二過塩素酸塩（１１）（［（Ｃｕ2）（ＢＰＭＰ−Ｃ6ＮＨ2）（μ−ＯＨ）］・（ＣｌＯ4）2）の調製
２５ｍＬのフラスコ中へ、１２ｍＬのアセトニトリル中に溶解した配位子８（０．３５０ｇ、１当量）および０．１１８ｇ（２．２当量）のトリエチルアミンを導入する。
８ｍＬのアセトニトリル中に溶解した０．４３ｇ（２．１当量）の過塩素酸銅（ＩＩ）六水和物をこの中に１滴ずつ加える。銅塩の添加が完了したらその混合物を周囲温度に１時間放置して撹拌されるに任せる。この溶液を約５ｍＬの体積になるように部分的に蒸発させ、次いでかなりの曇りが観察されるまでテトラヒドロフランをその中に加え、その後−２０℃で放置する。
濃厚な油が析出してくる。上澄みを取り除き、５ｍＬのエチルエーテルを加え、その油をガラス棒で削り取る。緑色粉末が沈殿する。これを濾過し、エチルエーテルで洗い流し、乾燥する。濾液を−２０℃に戻し、油の第二画分が析出する。これを前に述べたと同様に処理する。これにより最終的に緑色粉末の形態で２４６ｍｇ（４６％）の化合物１１の回収が可能になる。
ＥＳＩ質量スペクトル（ｍ／ｚ）＝４００（ｚ＝２）［Ｍ−２ＣｌＯ4］；ＵＶ／ｖｉｓ（ＤＭＳＯ／水（ｐＨ＝７）３０／７０）；λmax（ε）≒３５０（ｓｈ），４５０（３１６），７００（２０２Ｍ-1ｃｍ-1）。
実施例９：式（ＩＩＩ）を有する配位子（６−アミノ−Ｎ−（３，５−ビス（（ビス（２−ピリジルメチル）アミノ）メチル）−４−ヒドロキシベンジル）−ヘキサンアミド（１２）（ＨＢＰＥＰ−Ｃ6ＮＨ2））の調製
配位子１２を、配位子８の場合と似たやり方で化合物１から４ステップ（ビス（２−ピリジルエチル）アミンを縮合させる）で調製する。この調製については刊行物Ｍ．Ａ．Ｈａｌｃｒｏｗ等の論文、２００３，Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ，４２２４〜４２２５に記載されている。
配位子１２を、配位子８の場合と似たやり方で化合物１から４ステップ（ビス（２−ピリジルエチル）アミンを縮合させる）で調製する。この調製については刊行物Ｍ．Ａ．Ｈａｌｃｒｏｗ等の論文、２００３，Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ，４２２４〜４２２５に記載されている。
1Ｈ ＮＭＲ（３００，ＣＤＣｌ3，δｐｐｍ）：８．４２（ｄ，４Ｈ，Ｐｙ−Ｈ）；７．５２（ｔｄ，４Ｈ，Ｐｙ−Ｈ）；７．０７（ｍ，８Ｈ，Ｐｙ−Ｈ）；６．９３（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）；６．８５（ｔ、１Ｈ，ＮＨ−ＣＯ）；４．２２（ｄ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ2−ＮＨ−）；３．８０（ｓ，４Ｈ，Ａｒ−ＣＨ2−Ｎ）；２．９９（ｍ，１６Ｈ，Ｐｙ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ）；２．７９（ｍ，２Ｈ，ＮＨ2−ＣＨ2）；２．１６（ｔ，２Ｈ，ＣＯ−ＣＨ2）；１．５８（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ2）；１．３２（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ2）。
13Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，δｐｐｍ）：１７２．９（−Ｃ＝Ｏ）；１５９．６（Ｐｙ−Ｎ−Ｃ）；１５５．３（Ａｒ−Ｃ−ＯＨ）；１４９．０（Ｐｙ−Ｎ−ＣＨ）；１３６．４（Ｐｙ−Ｃ）；１２８．６（Ａｒ−Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ）；１２８．４（Ａｒ−ＣＨ）；１２３．４（Ｐｙ−Ｎ−ＣＨ−ＣＨ）；１２２．８（Ａｒ−Ｃ−ＣＨ2−Ｎ）；１２１．３（Ｐｙ−ＣＨ2−ＣＨ2）；５４．７（Ａｒ−ＣＨ2−ＮＨ）；５３．３（Ｐｙ−ＣＨ2−ＣＨ2）；４２．９（Ａｒ−ＣＨ2−ＮＨ）；４０．０（ＮＨ2−ＣＨ2）；３５．７（ＣＯ−ＣＨ2）；３４．８（Ｐｙ−ＣＨ2−ＣＨ2）；２８．３（ＮＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2）；２５．５（ＣＨ2）；２４．８（ＣＨ2）。
ＥＳＩ質量スペクトル（ｍ／ｚ）＝７１５［Ｍ＋Ｈ+］。
実施例１０：錯体［μ−［６−アミノ−Ｎ−（３，５−ビス（（ビス（２−ピリジルエチル）アミノ）メチル）−４−ヒドロキシベンジル）−ヘキサンアミド］］−μ−ヒドロオキソ二亜鉛二過塩素酸塩（１３）（［（Ｚｎ2）（ＢＰＥＰ−Ｃ6ＮＨ2）（μ−ＯＨ）］・（ＣｌＯ4）2）の調製
５０ｍＬのフラスコ中へ、１５ｍＬのアセトニトリルおよび２８０μＬ（２．５当量）のトリエチルアミン中に溶解した配位子１２（５５１ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ、１当量）を導入する。８ｍＬのアセトニトリル中に溶解した７２４ｍｇの過塩素酸亜鉛六水和物（２．５当量）をこの中に１滴ずつ加える。亜鉛塩の添加が完了したらその混合物を周囲温度に５時間放置して撹拌されるに任せる。この溶液を約５ｍＬの体積になるように部分的に蒸発させ、次いでかなりの曇りが観察されるまでテトラヒドロフランをその中に加え、その後−２０℃に一晩放置する。
糊状沈殿物が得られ、これを濾過し、エチルエーテルで洗い流し、乾燥する。エチルエーテルの存在下においてガラス棒で削り取って固体を回収し、次いで溶液を除去する。この操作をあと３回繰り返す。乾燥後、これにより最終的に黄白色固体の形態で２１８ｍｇ（２７％）の化合物１３の回収が可能になる。
1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＣＮ＋ＤＭＳＯ，δｐｐｍ）：８．４８（ｄ，４Ｈ，Ｐｙ−Ｈ）；７．９９（ｍ，４Ｈ，Ｐｙ−Ｈ）；７．４５（ｍ，８Ｈ，Ｐ−Ｈｙ）；７．４０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＯ）；６．８６（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）；４．０５（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ2−ＮＨ−）；３．６２（ｔ，４Ｈ，Ａｒ−ＣＨ2−Ｎ）；３．０５（ｍ，８Ｈ，Ｐｙ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ）；２．７９（ｍ，１０Ｈ，ＮＨ2−ＣＨ2，Ｐｙ−ＣＨ2）；２．０９（ｔ，２Ｈ，ＣＯ−ＣＨ2）；１．５６（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ2）；１．３０（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ2）。
13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ3ＣＮ＋ＤＭＳＯ，δｐｐｍ）：１７３．１（−Ｃ＝Ｏ）；１６１．６（Ｐｙ−Ｎ−Ｃ）；１５８．３（Ａｒ−Ｃ−ＯＨ）；１４９．７（Ｐｙ−Ｎ−ＣＨ）；１４１．８（Ｐｙ−Ｃ）；１３２．０（Ａｒ−Ｃ−ＣＨ2−ＮＨ2）；１３２．０（Ａｒ−ＣＨ）；１２６．３（Ｐｙ−Ｎ−ＣＨ−ＣＨ）；１２４．７（Ｐｙ−Ｎ−Ｃ−ＣＨ）；１２３．１（Ａｒ−Ｃ−ＣＨ2−Ｎ）；４７．３（Ｐｙ−ＣＨ2−ＣＨ2）；３６．２（Ｐｙ−ＣＨ2）；３２．７（ＣＯ−ＣＨ2）；２７．５（ＮＨ2−ＣＨ2）；２６．５（ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2）；２５．６（ＣＨ2）。
ＥＳＩ質量スペクトル（ｍ／ｚ）＝９６１（ｚ＝１）［Ｍ−ＣｌＯ4］，４３１（ｚ＝２）［Ｍ−２ＣｌＯ4］。
実施例１１：プラスミンの生成を測定することによる実施例４および１０からのＺｎ錯体ならびに実施例８からのＣｕ錯体による微粒子検出−顕色システムの感度の検討
この測定の原理は、ＨＭＥＣ１細胞培養物の活性化に由来する微粒子によるプラスミンの生成の結果起こる繊維素溶解活性の測定に基づく。これらの微粒子は、それらの表面にウロキナーゼ（またはプラスミノーゲンアクチベーター酵素）を有し、それがプラスミノーゲンのプラスミン（フィブリンを溶解する）への変換を可能にする。
この測定の原理は、ＨＭＥＣ１細胞培養物の活性化に由来する微粒子によるプラスミンの生成の結果起こる繊維素溶解活性の測定に基づく。これらの微粒子は、それらの表面にウロキナーゼ（またはプラスミノーゲンアクチベーター酵素）を有し、それがプラスミノーゲンのプラスミン（フィブリンを溶解する）への変換を可能にする。
プラスミンの生成は、プラスミンによる色素生成基質、すなわちメチルマロニル−ヒドロキシプロピル−アルギニル−パラニトロアニリド（ＣＢＳ）の切断によって検出される（分光光度測定）。
ａ）プロトコル
ｉ）マイクロタイタープレートの調製
９６ウェルのＰＶＣ Ｕ底プレートを使用する。下記組成のアッセイ緩衝液を準備する。
ｉ）マイクロタイタープレートの調製
９６ウェルのＰＶＣ Ｕ底プレートを使用する。下記組成のアッセイ緩衝液を準備する。
１ウェル当たり１５０μＬのアッセイ緩衝液を使用して周囲温度で３０分間インキュベーションを行う。
ｉｉ）全プレート用の４μＭプラスミノーゲンの調製
１０３．５μＭプラスミノーゲンの原液４８．３μＬを使用し、その中に１２０１．７μＬのアッセイ緩衝液を加える。
ｉｉｉ）全プレート用の３ｍＭ ＣＢＳ００６５の調製
７．５ｍＭ ＣＢＳ００６５の原液を使用し、その中に７５０μＬのアッセイ緩衝液を加える。
ｉｉ）全プレート用の４μＭプラスミノーゲンの調製
１０３．５μＭプラスミノーゲンの原液４８．３μＬを使用し、その中に１２０１．７μＬのアッセイ緩衝液を加える。
ｉｉｉ）全プレート用の３ｍＭ ＣＢＳ００６５の調製
７．５ｍＭ ＣＢＳ００６５の原液を使用し、その中に７５０μＬのアッセイ緩衝液を加える。
ｂ）検出
ウェルを空にするためにアッセイ緩衝液を含有するプレートを逆さまにし、次いでペーパータオルで乾燥する。
ウェルを空にするためにアッセイ緩衝液を含有するプレートを逆さまにし、次いでペーパータオルで乾燥する。
４μＭプラスミノーゲン溶液を３ｍＭ ＣＢＳ００６５溶液と混合し、続いて微粒子（ＨＭＥＣ１細胞培養物の活性化により得られる）を含有する２５μＬの緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（０．９％ ＮａＣｌ））を３７℃で１時間インキュベートする。その後、１２．５μＬのＣＢＳ００６５および１２．５μＬのプラスミノーゲン（それぞれ２μＭおよび１．５ｍＭの最終濃度）を加え、プレートを密封する。
読取りは、分光光度計によって４０５ｎｍおよび４９０ｎｍで３７℃において１８時間行う。
結果を図３に示し、これは繊維素溶解活性を検定することによるプラスミン生成の検出を表す。
得られるシグナルは、ｍＯＤ／分で表される。
結果を図３に示し、これは繊維素溶解活性を検定することによるプラスミン生成の検出を表す。
得られるシグナルは、ｍＯＤ／分で表される。
これら結果は、本発明による金属錯体による微粒子の固定化がそれらの機能アッセイを可能にすることを示す。また、ピリジン基に結合した「アーム」の長さおよび金属イオンの種類に応じたそれら結果の変動を観察することができる。
Claims (21)
- 式（Ｉ）または式（ＩＩ）
式中、
Ｍ+iが金属イオンであり、ｉが１、２、または３であり、
Ｌが交換可能な配位子であり、
Ｘが、−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ基、または−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ−ＮＨ−Ａ基（ただし、Ｒは、置換または非置換の線状または分枝状いずれかのＣ2〜Ｃ10アルキル基、好ましくはＣ6〜Ｃ10アルキル基であり、またＡは、Ｈまたは発蛍光団基である）であり、
ｍ＝１〜１２、
ｎ＝１、２、または３、
Ｙが、（ＣＨ2）p−ＮＨ2（ただし、ｐ＝０〜１２）である、
化合物。 - Ｍが、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、およびＦｅから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の式（Ｉ）または式（ＩＩ）を有する化合物。
- 式（Ｉ）または式（ＩＩ）を有し、
式中、
ＭがＺｎまたはＣｕであり、
Ｘが、−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ（ただし、ｍ＝１、Ａ＝Ｈ、ｎ＝１、ｐ＝０）であるか、または
Ｘが、−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ（ただし、ｍ＝１、Ａ＝Ｈ、ｎ＝２、ｐ＝０）であるか、または
Ｘが、−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ−ＮＨ−Ａ（ただし、Ａ＝Ｈ、ｎ＝１、ｐ＝０）である、式（Ｉ）または式（ＩＩ）を有する請求項１または２に記載の化合物。 - Ｘが、−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａまたは−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ−ＮＨ−Ａ（ただし、Ｒは置換または非置換の線状または分枝状いずれかのＣ2〜Ｃ10アルキル基、好ましくはＣ6〜Ｃ10アルキル基であり、またＡは、発蛍光団基である）である、請求項１または２に記載の式（Ｉ）または式（ＩＩ）を有する化合物。
- 式（ＩＩＩ）
式中、
Ｚが、ＮＨ2または−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ基、あるいは−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ−ＮＨ−Ａ基（ただし、Ｒは、置換または非置換の線状または分枝状いずれかのＣ2〜Ｃ10アルキル基、好ましくはＣ6〜Ｃ10アルキル基であり、またＡは、Ｈであるか、またはｍ＝２の場合にはＡがＨと異なるという条件で発蛍光団基である）であり、
ｍ＝１〜１２、
ｎ＝１、２、または３、
Ｙが、（ＣＨ2）p−ＮＨ2（ただし、ｐ＝０〜１２）である、
化合物。 - Ｚが、−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ（ただし、ｍ＝１、Ａ＝Ｈ、ｎ＝１、ｐ＝０）であるか、または
Ｚが、−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ（ただし、ｍ＝１、Ａ＝Ｈ、ｎ＝２、ｐ＝０）であるか、または
Ｚが、−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ−ＮＨ−Ａ（ただし、Ａ＝Ｈ、ｎ＝１、ｐ＝０）である、請求項５に記載の式（ＩＩＩ）を有する化合物。 - 請求項１〜４のいずれか一項に記載の式（Ｉ）または（ＩＩ）
- 式（Ｉ）を有する前記化合物が、第一のステップにおいて固体支持体上に固定化されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
- ｉ）前記固体支持体の表面に式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物を固定化するステップ、
ｉｉ）細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
ｉｉｉ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物上に前記細胞性微粒子を捕獲するステップ、および
ｉｖ）前記捕獲された細胞性微粒子を検出および／または特徴づけるステップ
を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。 - 前記固体支持体が、式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物の固定化に先立って活性化されることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
- ｉ）固体支持体を活性化するステップ、
ｉｉ）本特許請求の範囲で上記に記載の式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物を、前記活性化された支持体の表面に固定化するステップ、
ｉｉｉ）細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
ｉｖ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物上に前記細胞性微粒子を捕獲するステップ、および
ｖ）前記捕獲された細胞性微粒子を検出および／または特徴づけるステップ
を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。 - ｉ）式（ＩＩＩ）
式中、
Ｚが、ＮＨ2または−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａ基、あるいは−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ−ＮＨ−Ａ基（ただし、Ｒは、置換または非置換の線状または分枝状いずれかのＣ2〜Ｃ10アルキル基、好ましくはＣ6〜Ｃ10アルキル基であり、またＡはＨであるか、またはｍ＝２の場合にはＡがＨと異なるという条件で発蛍光団基である）であり、
ｍ＝１〜１２、
ｎ＝１、２、または３、
Ｙが、（ＣＨ2）p−ＮＨ2（ただし、ｐ＝０〜１２）である、
化合物を固体支持体上に固定化するするステップ、
ｉｉ）前記支持体−配位子全体を前記金属イオンの存在下で、式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記複核金属錯体がその場で形成されるようなやり方でインキュベートするステップ、
ｉｉｉ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物を、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
ｉｖ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物上に前記細胞性微粒子を捕獲するステップ、および
ｖ）前記捕獲された細胞性微粒子を検出および／または特徴づけるステップ
を含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。 - 前記固体支持体が、マイクロタイタープレート、シート、錐体、筒、ウェル、ビーズ、粒子、およびまたストリップであることを特徴とする、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
- 式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物が溶液の状態で使用されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
- Ｘが−（ＣＨ2）m−ＮＨ−Ａまたは−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ−ＮＨ−Ａ（ただし、Ｒは置換または非置換の線状または分枝状いずれかのＣ2〜Ｃ10アルキル基、好ましくはＣ6〜Ｃ10アルキル基であり、またＡは発蛍光団基である）である式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物が使用されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
- ｉ）請求項７に記載の式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物を、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
ｉｉ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物によって捕獲された細胞性微粒子を検出および／または特徴づけるステップ、および
ｉｉｉ）前のステップにおいて行った測定の結果を、生体液の対照試料に対して行った類似の測定の結果と比較するステップ
を含む、様々な疾患の発症のリスクの評価および／またはその治療の検証および監視を可能にする請求項７〜１５のいずれか一項に記載の細胞性微粒子の検出および／または特徴づけの方法。 - 様々な疾患の診断、および発症のリスクの評価および／またはその治療の検証および監視を可能にする方法であって、
ｉ）請求項７に記載の式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する化合物を、細胞性微粒子を含有している可能性の高い生体液の試料と接触させた状態に置くステップ、
ｉｉ）式（Ｉ）または（ＩＩ）を有する前記化合物によって捕獲された細胞性微粒子を検出および／または特徴づけるステップ、および
ｉｉｉ）前のステップにおいて行った測定の結果を、生体液の対照試料に対して行った類似の測定の結果と比較するステップ
を含む、方法。 - 前記対照生体液が、試験されるものと同一だが、健康と考えられる個体から得られる生体液であるか、あるいは前記対照生体液が、試験される生体液と同じ個体に由来するが、以前の試料から得られることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の方法。
- 前記病状が、血栓性、炎症性、および／または代謝性障害、あるいは心臓血管または神経血管の疾患および事象、あるいは糖尿病、癌、およびアルツハイマー病から選択されることを特徴とする、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕獲された微粒子が、分光分析によってまたは蛍光測定を用いて検出することができる特異的標識抗体を使用することによって明らかにされることを特徴とする、請求項７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、酵素で標識され、次いで適切な基質を使用した色素生成分析によって検出されることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
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