JP2014223057A - 細胞培養基材及びパターン化された培養細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞培養表面に対する位置選択的な物理的処理又は化学的処理を施すことなく製造でき、細胞培養表面の下層に設けられる下層基板が備える凹凸パターンの作用によって生じる細胞培養表面の力学的性質の位置特異性に基づいて、パターン化された培養細胞を培養できる細胞培養基材と、当該細胞培養基材を用いるパターン化された培養細胞の培養方法とを提供すること。【解決手段】表面に凹凸パターンを有する下層基板と、下層基板上に積層された、細胞培養表面を有する上層膜とを備え、上層膜が凹凸パターン中の凹部を覆っており、下層基板と上層膜とが凹凸パターン中の凸部のみで接している、細胞培養基材を用いる。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞培養基材と、当該細胞培養基材を用いるパターン化された培養細胞の培養方法に関する。

従来から、種々の細胞の培養が行われており、細胞培養の技術は、細胞の生化学的現象や性質の解明、有用な物質の生産等の目的で利用されている。さらに、培養細胞を用いて、人工的に合成された薬剤の生理活性や毒性を調べる試みがなされている。

細胞培養技術の一例として、培養細胞を基材上の微小な部分にのみに選択的に配列させてパターン化された培養細胞を得る技術が知られている。このような技術について、人工臓器等の生体適合性材料やバイオセンサの製造、バイオリアクター等への応用が期待されている。

パターン化された培養細胞を形成する方法としては、例えば、回路状に神経細胞を増殖させる等の目的で、静電荷パターンを形成させた電荷保持媒体を細胞培養に用いる方法（特許文献１）や、細胞接着阻害性又は細胞接着性の親水性高分子をフォトリソグラフィー法によりパターニングした表面を有する培養基材を用いて細胞を培養する方法（特許文献２）が提案されている。

特開平２−２４５１８１号公報 特開平３−００７５７６号公報

しかし、特許文献１及び２に記載されるように、細胞培養基材が有する細胞を培養するための細胞培養表面に、位置選択的な物理的処理や化学的処理を施す方法は非常に煩雑である。また、特許文献２に記載の方法では、親水性高分子のパターニングに用いる材料の組成によっては、細胞培養表面に細胞毒性を有する物質が残留することにより、良好に細胞培養を行えないおそれがある。

本発明は、上記の課題を鑑みてなされたものであって、細胞培養表面に対する位置選択的な物理的処理又は化学的処理を施すことなく製造でき、細胞培養表面の下層に設けられる下層基板が備える凹凸パターンの作用によって生じる細胞培養表面の力学的性質の位置特異性に基づいて、パターン化された培養細胞を培養できる細胞培養基材と、当該細胞培養基材を用いるパターン化された培養細胞の培養方法とを提供することを目的とする。

本発明者らは、表面に凹凸パターンを有する下層基板と、下層基板上に積層された、細胞培養表面を有する上層膜とを備え、上層膜が凹凸パターン中の凹部を覆っており、下層基板と上層膜とが凹凸パターン中の凸部のみで接している、細胞培養基材を用いることで上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の第一の態様は、表面に凹凸パターンを有する下層基板と、下層基板上に積層された、細胞培養表面を有する上層膜とを備え、上層膜が凹凸パターン中の凹部を覆っており、下層基板と上層膜とが凹凸パターン中の凸部のみで接している、細胞培養基材に関する。

本発明の第二の態様は、第一の態様に係る細胞培養基材を用い、上層膜の細胞培養表面上に細胞を播種した後に細胞を培養する、パターン化された培養細胞の培養方法に関する。

本発明によれば、細胞培養表面に対する位置選択的な物理的処理又は化学的処理を施すことなく製造でき、細胞培養表面の下層に設けられる下層基板が備える凹凸パターンの作用によって生じる細胞培養表面の力学的性質の位置特異性に基づいて、パターン化された培養細胞を培養できる細胞培養基材と、当該細胞培養基材を用いるパターン化された培養細胞の培養方法とを提供することができる。

本発明に係る細胞培養基材の断面の模式図である。

≪細胞培養基材≫
以下、本発明に係る細胞培養基材を、細胞培養基材の断面の模式図である図１を参照して説明する。本発明に係る細胞培養基材１０は、表面に凹凸パターン１２を有する下層基板１１と、下層基板１１上に積層された、細胞培養表面１６を有する上層膜１５とを備える。上層膜１５は、下層基板１１が備える凹凸パターン１２中の凹部１３を覆っており、下層基板１１と上層膜１５とは、凹凸パターン中１２の凸部１４のみで接している。

細胞培養表面１６を有する上層膜１５における、下層基板１１上の凹部１３に相当する箇所と、凸部１４に相当する箇所とでは、培地の自重等によって生じる微小な変形の度合いが異なる。凹部１３は気体で満たされているのに対して、凸部１４は固体で形成されているためである。細胞培養表面１６上での位置の違いによるこのような力学的性質の差異によって、本発明に係る細胞培養基材１０を用いると、細胞培養表面１６上で、下層基板１１の凸部１４に相当する箇所では良好に細胞が増殖する一方で、凹部１３に相当する箇所では細胞の増殖が良好に進行しない。このため、本発明に係る細胞培養基材１０を用いて細胞を培養すると、下層基板１１が備える凹凸パターン１２を平面視した場合の凸部１４の形状と同様の形状であるパターン化された培養細胞を得ることができる。

以下、細胞培養基材１０を構成する下層基板１１と、上層膜１５と、細胞培養基材１０の製造方法とについて順に説明する。

〔下層基板〕
下層基板１１は、所望する形状の凹凸パターン１２を備えるものであって、細胞を培養する際や、滅菌処理のような前処理によって変形しないものであれば特に限定されない。下層基板は、その表面に凹凸パターン１２を備えるが、下層基板１１は全体が同一の材料から構成されていても、それぞれ異なる材料からなる、凹凸パターン１２と、凹凸パターン１２を支持するための基材とから構成されていてもよい。

凹凸パターン１２を形成する方法は特に限定されない。凹凸パターン１２を形成する方法としては、例えば、凹凸パターン１２を支持するための基材の表面に形成された感光性組成物層を選択的に露光した後、露光された感光性組成物層から凹部１３に相当する箇所を現像液により除去するフォトリソグラフィー法、基板表面に形成されたインプリント材料の層に凹凸のパターンを備える押し型を押し付けた後にインプリント材料を硬化させるインプリント法、基板表面に凸部１４に相当する箇所を被覆するマスクを設けた後に、エッチングのような化学的処理により基板表面に凹部１３を形成する方法、サンドブラストや種々の工作機械によって基板表面を研削加工する方法、所定の形状のパターンの凸部１４を構成する材料を基板の表面に貼り付ける方法等が挙げられる。フォトリソグラフィー法やインプリント法には、従来から種々の目的で使用されている感光性樹脂組成物や、感光性ＳＯＧ（スピンオングラス）材料を特に制限なく用いることができる。

凹凸パターン１２の形成に使用される好適な感光性樹脂組成物の一例としては、（ａ）多官能エポキシ樹脂、（ｂ）カチオン重合開始剤、及び（ｃ）溶剤を含有する感光性樹脂組成物が挙げられる。以下、この好適な感光性樹脂組成物に含まれる成分について説明する。

＜（ａ）多官能エポキシ樹脂＞
（ａ）多官能エポキシ樹脂は、特に限定されず、従来から種々の用途で用いられている多官能エポキシ樹脂から適宜選択することができる。（ａ）多官能エポキシ樹脂のエポキシ当量は、１０００以下が好ましく、５００以下がより好ましい。このような範囲のエポキシ当量の（ａ）多官能エポキシ樹脂含む感光性樹脂組成物を用いると、高硬度の凹凸パターン１２を形成しやすい。

（ａ）多官能エポキシ樹脂の好適な例としては、多官能フェノール・ノボラック型エポキシ樹脂、多官能オルソクレゾールノボラック型エポキシ樹脂、多官能トリフェニル型ノボラック型エポキシ樹脂、及び多官能ビスフェノールＡノボラック型エポキシ樹脂等が挙げられる。これらの中では、多官能ビスフェノールＡノボラック型エポキシ樹脂が好ましい。（ａ）多官能エポキシ樹脂の官能性は２官能以上であり、４官能以上が好ましい。

また、ビスフェノールＡ型エポキシ樹脂やビスフェノールＦ型エポキシ樹脂のような種々のビスフェノール類から誘導される２官能エポキシ樹脂も好ましく使用される。ビスフェノール類から誘導される２官能エポキシ樹脂の数平均分子量は、８００〜７０００が好ましく、１０００〜５０００がより好ましく、１０００〜３０００がさらに好ましい。

＜（ｂ）カチオン重合開始剤＞
カチオン重合開始剤は、紫外線、遠紫外線、ＫｒＦ、ＡｒＦ等のエキシマレーザー、Ｘ線、及び電子線等の放射線の照射を受けてカチオンを生じるものであり、そのカチオンが重合開始剤となりうる化合物である。

（ｂ）カチオン重合開始剤としては、例えば、ヨードニウム塩やスルホニウム塩のようなオニウム塩型のカチオン重合開始剤を用いることができる。オニウム塩型のカチオン重合開始剤を構成する、オニウムイオンの対イオンとなるアニオンは、フッ素化アルキルフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、又はヘキサフルオロアンチモン酸アニオン（ＳｂＦ_６ ⁻）が好ましい。

フッ素化アルキルフルオロリン酸アニオンの好ましい具体例としては、［（ＣＦ_３ＣＦ_２）_２ＰＦ_４］⁻、［（ＣＦ_３ＣＦ_２）_３ＰＦ_３］⁻、［（（ＣＦ_３）_２ＣＦ）_２ＰＦ_４］⁻、［（（ＣＦ_３）_２ＣＦ）_３ＰＦ_３］⁻、［（ＣＦ_３ＣＦ_２ＣＦ_２）_２ＰＦ_４］⁻、［（ＣＦ_３ＣＦ_２ＣＦ_２）_３ＰＦ_３］⁻、［（（ＣＦ_３）_２ＣＦＣＦ_２）_２ＰＦ_４］⁻、［（（ＣＦ_３）_２ＣＦＣＦ_２）_３ＰＦ_３］⁻、［（ＣＦ_３ＣＦ_２ＣＦ_２ＣＦ_２）_２ＰＦ_４］⁻、又は［（ＣＦ_３ＣＦ_２ＣＦ_２）_３ＰＦ_３］⁻が挙げられる。これらのうち、［（ＣＦ_３ＣＦ_２）_３ＰＦ_３］⁻、［（ＣＦ_３ＣＦ_２ＣＦ_２）_３ＰＦ_３］⁻、［（（ＣＦ_３）_２ＣＦ）_３ＰＦ_３］⁻、［（（ＣＦ_３）_２ＣＦ）_２ＰＦ_４］⁻、［（（ＣＦ_３）_２ＣＦＣＦ_２）_３ＰＦ_３］⁻、又は［（（ＣＦ_３）_２ＣＦＣＦ_２）_２ＰＦ_４］⁻が特に好ましい。

オニウム塩型の（ｂ）カチオン重合開始剤を構成するオニウムイオンの好ましい具体例としては、トリフェニルスルホニウム、トリ−ｐ−トリルスルホニウム、ジフェニル［４−（フェニルチオ）フェニル］スルホニウム、ビス［４−（ジフェニルスルホニオ）フェニル］スルフィド、ビス〔４−｛ビス［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］スルホニオ｝フェニル〕スルフィド、ビス｛４−［ビス（４−フルオロフェニル）スルホニオ］フェニル｝スルフィド、４−（４−ベンゾイル−２−クロロフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウム、４−（４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウム、７−イソプロピル−９−オキソ−１０−チア−９，１０−ジヒドロアントラセン−２−イルジ−ｐ−トリルスルホニウム、７−イソプロピル−９−オキソ−１０−チア−９，１０−ジヒドロアントラセン−２−イルジフェニルスルホニウム、２−［（ジフェニル）スルホニオ］チオキサントン、４−［４−（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾイル）フェニルチオ］フェニルジ−ｐ−トリルスルホニウム、４−（４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウム、ジフェニルフェナシルスルホニウム、４−ヒドロキシフェニルメチルベンジルスルホニウム、２−ナフチルメチル（１−エトキシカルボニル）エチルスルホニウム、４−ヒドロキシフェニルメチルフェナシルスルホニウム、オクタデシルメチルフェナシルスルホニウム、ジフェニルヨードニウム、ジ−ｐ−トリルヨードニウム、ビス（４−ドデシルフェニル）ヨードニウム、ビス（４−メトキシフェニル）ヨードニウム、（４−オクチルオキシフェニル）フェニルヨードニウム、ビス（４−デシルオキシ）フェニルヨードニウム、４−（２−ヒドロキシテトラデシルオキシ）フェニルフェニルヨードニウム、４−イソプロピルフェニル（ｐ−トリル）ヨードニウム、又は４−イソブチルフェニル（ｐ−トリル）ヨードニウムが挙げられる。

以上説明したオニウム塩型の（ｂ）カチオン重合開始剤の中では、ジフェニル［４−（フェニルチオ）フェニル］スルホニウムと、トリフルオロトリスフルオロアルキルリン酸イオン又はヘキサフルオロリン酸イオンとからなるオニウム塩、が特に好ましく用いられる。

また、オニウム塩型の（ｂ）カチオン重開始剤としては、４−（４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−ヒドロキシエチルオキシフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−｛４−（３−クロロベンゾイル）フェニルチオ｝フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−メチルフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−ヒドロキシエチルフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−｛４−（４−ヒドロキシエチルオキシベンゾイル）フェニルチオ｝フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−｛４−（４−ヒドロキシエチルオキシベンゾイル）フェニルチオ｝フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−｛４−（４−ヒドロキシエチルオキシベンゾイル）フェニルチオ｝フェニルビス（４−ヒドロキシエチルオキシフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−メトキシエトキシフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−｛４−（３−メトキシベンゾイル）フェニルチオ｝フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−｛４−（３−メトキシカルボニルベンゾイル）フェニルチオ｝フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−｛４−（２−ヒドロキシメチルベンゾイル）フェニルチオ｝フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−｛４−（４−メチルベンゾイル）フェニルチオ｝フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−｛４−（４−メトキシベンゾイル）フェニルチオ｝フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−｛４−（４−フルオロベンゾイル）フェニルチオ｝フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、及び４−｛４−（２−メトキシカルボニルベンゾイル）フェニルチオ｝フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート等のオニウムヘキサフルオロアンチモン酸塩も好ましい。

感光性樹脂組成物中の（ｂ）ラジカル重合開始剤の含有量は特に限定されないが、（ａ）多官能エポキシ樹脂１００質量部に対し、０．０１〜２０質量部が好ましく、０．５〜５質量部がより好ましい。

＜（ｃ）溶剤＞
感光性樹脂組成物に含まれる溶剤は、均一な感光性樹脂組成物を調製可能であり、露光による効果を阻害しないものであれば特に限定されない。溶剤の沸点は、５０℃〜２００℃が好ましい。

（ｃ）溶剤の具体例としては、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２−ヘプタノン、乳酸エチル、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノメチルエーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、エチレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジメチルエーテル、メチルセロソルブ、エチルセロソルブ、ジブチルエーテル、メチル−３−メトキシプロピオネート、プロピレングリコールモノプロピルエーテル、ブチルセロソルブ、ジエチレングリコールジエチルエーテル、ヘキシレングリコール、シクロヘキサノン、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ピルビン酸エチル、及びエチルセロソルブアセテート等が挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。

（ｃ）溶剤の使用量は特に限定されないが、感光性樹脂組成物の固形分濃度が、５〜３０質量％となる範囲が好ましい。

＜（ｄ）（メタ）アクリルモノマー＞
感光性樹脂組成物は、２以上のエチレン性不飽和結合を有する（ｄ）（メタ）アクリルモノマーを含んでいてもよい。感光性樹脂組成物が、２以上のエチレン性不飽和結合を有する（ｄ）（メタ）アクリルモノマーを含む場合、感光性樹脂組成物を用いて形成される凹凸パターン１２でのクラックの発生が抑制される。

（ｄ）（メタ）アクリルモノマーの好適な例としては、ジペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）アクリレート、ジメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、エチレンオキシド変性トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、プロピレンオキシド変性トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、エチレンオキシド及びプロピレンオキシド変性トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、及びポリ（エチレン−プロピレン）グリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。

感光性樹脂組成物中の（ｄ）（メタ）アクリルモノマーの含有量は、感光性樹脂組成物中の固形分の質量に対して、３〜１５質量％が好ましく、５〜１２質量％がより好ましい。

＜（ｅ）その他成分＞
感光性樹脂組成物は、（ａ）多官能エポキシ樹脂、（ｂ）ラジカル重合開始剤、及び（ｃ）溶剤の他に、従来から感光性樹脂組成物に使用されている種々の添加剤を含んでいてもよい。このような添加剤としては、付加的樹脂、増感剤、可塑剤、安定剤、着色剤、カップリング剤、レベリング剤等が挙げられる。

以上説明した、（ａ）多官能エポキシ樹脂、（ｂ）ラジカル重合開始剤、及び（ｃ）溶剤と、必要に応じて（ｄ）（メタ）アクリルモノマーや（ｅ）その他の成分とを均一に混合して、感光性樹脂組成物が得られる。

以上例示される方法により形成される凹凸パターン１２の形状は、特に限定されない。凹凸パターンの形状の具体例としては、凸部１４であるラインと凹部１３であるスペースとが交互に配置されたラインアンドスペースパターンや、正方形、長方形、円形、楕円形のような形状の凸部１４が規則的又は不規則に配置されたパターンや、凸部１４の内部に、正方形、長方形、円形、楕円形のような形状の凹部１３が規則的又は不規則に配置されたホールパターンが挙げられる。

凹凸パターン１２を構成する凹部１３及び凸部１４のサイズ（面積や幅）は、凹部１３及び凸部１４のサイズが培養対象の細胞のサイズよりも十分に大きくなるように、培養対象の細胞のサイズを勘案して適宜決定される。凹部１３のサイズや凸部１４のサイズが培養対象の細胞のサイズよりも過小であると、細胞培養表面１６の凹部１３に相当する箇所と凸部１４に相当する箇所とに、細胞がまたがって載った状態で細胞の増殖が進行する。そうすると、細胞培養表面１６の凹部１３に相当する箇所と凸部１４に相当する箇所とで、細胞の増殖速度に差が生じにくい。

凹凸パターン１２中の凹部１３の深さは、特に限定されないが、０．１〜１００μｍが好ましく、１〜５０μｍがより好ましい。凹凸パターン１２中の凹部１３の深さがこのような範囲であると、細胞培養基材１０を用いて細胞を培養する際に、所望する形状のパターン化された培養細胞を得やすい。

〔上層膜〕
上層膜１５は、細胞培養に適した表面である細胞培養表面１６を有する膜であれば特に限定されない。上層膜１５は、単層膜であっても積層膜であってもよい。製造が容易で安価であることから、上層膜１５は単層膜であるのが好ましい。細胞培養表面１６の材質としては、無機材料及び有機材料のいずれも使用することができる。無機材料の好適な例としては、ガラス、セラミック、金属等が挙げられる。有機材料の好適な例としては、ポリアセタール、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエステル（ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリアリレート等）、ＦＲ−ＡＳ樹脂、ＦＲ−ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリフェニレンサルファイド、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリエーテルエーテルケトン、フッ素系樹脂、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリアミドビスマレイミド、ポリエーテルイミド、シリコーン樹脂、ＢＴ樹脂、ポリメチルペンテン、超高分子量ポリエチレン、ＦＲ−ポリプロピレン、（メタ）アクリル樹脂（ポリメチルメタクリレート等）、ポリスチレン、ノボラック樹脂、及びこれらの誘導体のような高分子材料が挙げられる。高分子材料の誘導体としては、フッ素、塩素、臭素等によりハロゲン化された高分子材料、オゾン処理や酸素プラズマ処理のようなプラズマ処理等により水酸基を導入された高分子材料、公知のニトロ化やスルホン化方法に従ってニトロ基やスルホン酸基を導入された高分子材料等が挙げられる。上記の好ましい材質の中では、ポリスチレン、ガラス、ポリメチルメタクリレート、ノボラック樹脂、ポリエーテルイミド、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、及びこれらの誘導体がより好ましい。このため、上層膜１５は、これらの材料から構成される単層膜であるのが好ましい。

上層膜１５の厚さは、本発明の目的を阻害しない範囲で特に限定されない。上層膜の厚さは、５〜１０００ｎｍが好ましく、１０〜９５０ｎｍがより好ましく、１４〜７５０ｎｍが特に好ましい。このような膜厚の上層膜１５を備える細胞培養基材１０を用いると、細胞培養表面１６における細胞の増殖速度について、凸部１４に相当する箇所と、凹部１３に相当する箇所とで差をつけやすい。

〔細胞培養基材の製造方法〕
細胞培養基材１０の製造方法は、細胞培養基材１０が所定の構成を備えるように、下層基板１１と、上層膜１５とを積層できる方法であれば特に限定されない。例えば、上層膜１５がポリスチレンやポリメチルメタクリレートのような樹脂材料からなる場合、シリコン基板やガラス基板上に所望の膜厚の上層膜１５を形成した後に、水、メタノール、エタノールのような液体中で、上層膜１５を基板から剥離させ、剥離した上層膜１５を下層基板１１が備える凹凸パターン１２上にすくいとることで、下層基板１１と上層膜１５とを積層することができる。

上層膜１５が樹脂材料からなる場合、所定量の樹脂溶液をシリコン基板やガラス基板上に塗布した後に、樹脂溶液に含まれる溶媒を除去することで、基板表面に上層膜１５を形成することができる。

細胞培養基材１０を作成した後は、細胞培養表面１６に対する細胞の接着性の改良のような目的で、細胞培養表面１６に対して種々の処理を施してもよい。このような処理としては、オゾン処理、過酸化水素による処理、プラズマ処理、及び紫外線処理や、アルブミン、コラーゲン、フィブロネクチン、及びポリリジンのようなタンパク質によりコート等が挙げられる。

このようにして形成される細胞培養基材を用いて細胞を培養すると、下層基板が備える凹凸パターンの形状に応じて、パターン化された培養細胞を得ることができる。このため、本発明に係る細胞培養基材は、種々の細胞を用いてパターン化された培養細胞を作成する際に好適に使用される。

≪パターン化された培養細胞の培養方法≫
以上説明した、特定の構成を備える細胞培養基材が備える細胞培養表面に、培養対象となる細胞を播種した後、播種された細胞を培養することでパターン化された培養細胞が形成される。パターン化された培養細胞を培養する方法は、細胞培養基材として前述の細胞培養基材を用いることの他は、従来の細胞培養基材を用いる細胞培養方法と同様の方法で行うことができる。培養対象の細胞は、前述の細胞培養基材上で培養可能であれば特に限定されない。

細胞を細胞培養表面に播種する方法は、細胞培養表面上に所望する量の細胞を播種することができれば特に限定されない。細胞培養表面上に細胞を播種する方法の典型例としては、培養対象の細胞を培地や緩衝液に懸濁させた懸濁液を、所定数の細胞が細胞培養表面に供給されるように、細胞培養表面上に滴下又は流入させる方法が挙げられる。

このようにして細胞培養表面に細胞を播種した後、細胞培養表面に培地を供給して細胞の培養を行う。培地の種類は特に限定されず、培養対象の細胞の種類に応じて、従来から使用される種々の培地から適宜選択される。

培地としては、血清を含有するものを用いるのも好ましい。この場合、細胞培養表面上の下層基板が有する凸部に相当する箇所において、細胞の増殖を促進させやすい。

培地が血清を含有する場合、血清の種類は、従来から細胞培養用の培地に使用されている血清の中から適宜選択される。好適な血清の例としては、ウシ由来血清、ウマ由来血清、及びニワトリ由来血清等が挙げられる。これらの血清の中では、血清を含有する培地の調製や入手が容易であることから、ウシ由来血清が好ましい。ウシ由来血清としては、胎児血清、新生児血清、子牛血清等が好適に使用される。

培地が血清を含有する場合、培地中の血清の濃度は細胞が良好に培養される限り特に限定されない。培地中の血清の濃度は、培養される細胞の種類に応じて適宜決定される。培地中の血清の濃度は、典型的には、１〜２０質量％が好ましい。

培養を行う際の、温度、照度、雰囲気等の条件は、細胞の種類に応じて適宜選択される。培養時間は、細胞の増殖を確認しながら適宜設定すればよい。

このようにして、前述の特定の構成を備える細胞培養基材を用いて細胞を培養することで、パターン化された培養細胞を形成することができる。

［実施例１〜３］
（細胞培養基材の調製）
平滑な表面を備えるシリコン基板（１０ｍｍ×１０ｍｍ）をピラニア溶液（体積比：硫酸／過酸化水素＝７／３）中で９０℃、１時間処理した。処理後のシリコン基板上にポリスチレンのトルエン溶液を塗布して、シリコン基板上に厚さ４００ｎｍのポリスチレン薄膜を形成した。ポリスチレンとしては、数平均分子量が２３５，０００であり、分散度が１．０５であるものを使用した。ポリスチレン薄膜を備えるシリコン基板を水中に浸漬させ、シリコン基板からポリスチレン薄膜を剥離させた。剥離したポリスチレン薄膜を、矩形のラインとスペースとからなるラインアンドスペースパターンを備えるシリコン基板（９５ｍｍ×９５ｍｍ）の、パターンが形成された面上にすくいとった。各実施例について、シリコン基板が備えるパターン中の、凸部（ライン）及び凹部（スペース）の幅は、表１に記載される通りである。シリコン基板が備えるパターン中の凹部１３の深さは、２．４μｍであった。

シリコン基板（１０ｍｍ×１０ｍｍ×０．７ｍｍ）上のパターンは、多官能エポキシ樹脂を含むカチオン重合系ネガ型のレジスト（ＴＭＭＲ−Ｓ２０００ＬＶ、東京応化工業株式会社製）をフォトレジスト材料として用い、以下の方法に従って形成された。
まず、シリコン基板の被処理面に、上記フォトレジスト組成物をスピンコート法により塗布し、厚さ２．４μｍのフォトレジスト膜を形成させた。このフォトレジスト膜に対して、平行光露光機（伯東株式会社製、型番ＭＡＴ−２５０１）を使用して、幅３０〜５０μｍ、長さ９４００μｍのラインパターンを露光（ｇ、ｈ、ｉ線、露光量１１０ｍＪ／ｃｍ^２）した。次いで、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテートを用いて１分間現像し、さらに、プロピレングリコールモノメチルエーテルを使用して１５秒間リンスした。その結果、上記シリコン基板の被処理面には、幅３０〜５０μｍ、長さ９４００μｍのパターンが形成された。

ポリスチレン薄膜が付着したシリコン基板を室温で２４時間真空乾燥して、シリコン基板のパターンを備える面上にポリスチレン薄膜が積層されており、ポリスチレン薄膜が基板表面のパターン中の凹部を覆っており、基板表面のパターンとポリスチレン薄膜とがパターン中の凸部のみで接している細胞培養基材を得た。

［実施例４〜９］
実施例１〜３で得た細胞培養基材を用いて、培養温度３７℃、５％ＣＯ_２環境下で、細胞培養試験を行った。培養対象の細胞としては、マウス繊維芽細胞Ｌ９２９を用いた。培地としては、ＲＰＭＩ １６４０培地（無血清）を用いた。細胞培養基材をウェル付のディッシュのウェル内に載置した後、１つの細胞培養基材につき５００００個の細胞を、細胞培養表面に播種した。その後、ウェル内に、ディスポーザブルピペットで培地を注入して、表２に記載の時間、細胞を培養した。所定の時間細胞を培養した後、細胞培養基材中の細胞培養表面を顕微鏡により観察し、細胞培養表面上の下層基板が有する凸部に相当する箇所の細胞数（Ｎ_ｂｕｍｐ、個／ｍｍ^２）と、凹部に相当する箇所の細胞数と（Ｎ_ｄｅｎｔ、個／ｍｍ^２）を計測した。Ｎ_ｂｕｍｐ及びＮ_ｄｅｎｔから、培養後細胞数比率（Ｎ_ｂｕｍｐ／Ｎ_ｄｅｎｔ）の値を求めた。培養後細胞数比率の値が大きいほど、凸部相当箇所での細胞増殖の選択性が高いことを意味する。Ｎ_ｂｕｍｐ及びＮ_ｄｅｎｔから求められた培養後細胞数比率（Ｎ_ｂｕｍｐ／Ｎ_ｄｅｎｔ）の値を表２に記す。

実施例４〜９によれば、表面に凹凸パターンを有する下層基板と、下層基板上に積層された、細胞培養表面を有する上層膜とを備え、上層膜が凹凸パターン中の凹部を覆っており、下層基板と上層膜とが凹凸パターン中の凸部のみで接している、細胞培養基材を用いて細胞を培養することにより、細胞培養表面上の下層基板の凸部に相当する箇所と、凹部に相当する箇所とで、細胞の増殖数に著しい差を生じさせることができ、凹凸パターンの凸の形状と同様の形状のパターン化された培養細胞が得られることが分かる。

［実施例１０〜１６］
ポリスチレン薄膜の膜厚を、４００ｎｍから、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、８００ｎｍ又は１０００ｎｍに変更することの他は、実施例１〜３と同様にして細胞培養基材を調製した。実施例１０〜１６のそれぞれについて、細胞培養基材の調製に用いたシリコン基板が備えるパターン中の、凸部（ライン）及び凹部（スペース）の幅は、表３に記載される通りである。

［実施例１７〜２９］
実施例１〜３の細胞培養基材に変えて、実施例１０〜１６の細胞培養基材を用いることの他は、表４に記載の条件で、実施例４〜９と同様に細胞培養試験を行った。所定の時間細胞を培養した後、実施例４〜９と同様にして、培養後細胞数比率（Ｎ_ｂｕｍｐ／Ｎ_ｄｅｎｔ）の値を求めた。培養後細胞数比率（Ｎ_ｂｕｍｐ／Ｎ_ｄｅｎｔ）の値を表４に記す。

実施例１７〜２９によれば、上層膜の膜厚が４００ｎｍから５０ｎｍ、１００ｎｍ、又は２００ｎｍに低下した場合や、４００ｎｍから８００ｎｍ又は１０００ｎｍに増した場合でも、細胞培養表面上の下層基板の凸部に相当する箇所と、凹部に相当する箇所とで、細胞の増殖数に差を生じさせることができ、凹凸パターンの凸の形状と同様の形状のパターン化された培養細胞が得られることが分かる。

［実施例３０〜３７］
ＲＰＭＩ １６４０培地（無血清）に変えて、ＲＰＭＩ １６４０培地（１０質量％、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有）を用いることと、表５に記載の種類の細胞培養基材を用いることとの他は、表５に記載の条件で実施例４〜９と同様に細胞培養試験を行った。所定の時間細胞を培養した後、実施例４〜９と同様にして、培養後細胞数比率（Ｎ_ｂｕｍｐ／Ｎ_ｄｅｎｔ）の値を求めた。培養後細胞数比率（Ｎ_ｂｕｍｐ／Ｎ_ｄｅｎｔ）の値を表５に記す。

実施例３０〜３７によれば、血清を含まない培地に変えて、血清を含有する培地を用いる場合であっても、表面に凹凸パターンを有する下層基板と、下層基板上に積層された、細胞培養表面を有する上層膜とを備え、上層膜が凹凸パターン中の凹部を覆っており、下層基板と上層膜とが凹凸パターン中の凸部のみで接している、細胞培養基材を用いて細胞を培養することにより、細胞培養表面上の下層基板の凸部に相当する箇所と、凹部に相当する箇所とで、細胞の増殖数に著しい差を生じさせることができ、凹凸パターンの凸の形状と同様の形状のパターン化された培養細胞が得られることが分かる。
また、実施例１９及び実施例５と、実施例３０及び３１とについて、細胞培養表面上の下層基板が有する凸部に相当する箇所での４時間培養後の細胞数（Ｎ_ｂｕｍｐ、個／ｍｍ^２）を比較したところ、実施例３０及び３１のほうがＮ_ｂｕｍｐの値が１．２倍程度大きいことが分かった。
これによれば、血清を含有する培地を用いることにより、細胞培養表面上の下層基板が有する凸部に相当する箇所での細胞の増殖を促進できることが分かる。

１０ 細胞培養基材
１１ 下層基板
１２ 凹凸パターン
１３ 凹部
１４ 凸部
１５ 上層膜
１６ 細胞培養表面

Claims (3)

1. 表面に凹凸パターンを有する下層基板と、前記下層基板上に積層された、細胞培養表面を有する上層膜とを備え、前記上層膜が前記凹凸パターン中の凹部を覆っており、前記下層基板と前記上層膜とが前記凹凸パターン中の凸部のみで接している、細胞培養基材。
2. 請求項１に記載の細胞培養基材を用い、前記上層膜の前記細胞培養表面上に細胞を播種した後に前記細胞を培養する、パターン化された培養細胞の培養方法。
3. 前記細胞の培養を血清を含有する培地中で行う、請求項２に記載のパターン化された培養細胞の培養方法。

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