JP2014134657A - 走査型レーザ顕微鏡および顕微鏡観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】外乱光のような過大光から光検出部を保護してその劣化を防止する。
【解決手段】光源２１から発せられたレーザ光を標本上で２次元的に走査させるスキャナ２７と、スキャナ２７によりレーザ光が走査された標本Ｓからの蛍光を含む光を検出し、検出した光の輝度に相当する光強度信号を出力するＰＭＴ３３と、ＰＭＴ３３からの光強度信号をレーザ光の走査位置に対応付けて標本Ｓの画像を生成する画像生成部６１と、ＰＭＴ３３により検出された光の光量が所定の強度閾値を超えたか否かを判定する信号強度判定部６３と、標本Ｓへのレーザ光の照射がＯＦＦされた状態で信号強度判定部６３により光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたと判定された場合に、ＰＭＴ３３による光の検出を停止する制御部６５とを備える走査型レーザ顕微鏡１００を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、走査型レーザ顕微鏡および顕微鏡観察方法に関するものである。

従来、標本の輝度情報を取得するための光検出器として光電子増倍管（以下、単に「ＰＭＴ」という。）を備えた走査型レーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。ＰＭＴなどの受光素子に過大な光が入射すると劣化または損傷する虞があるため、これを防止するための保護回路により、強い入射光に起因してＰＭＴからの出力が一定値以上となった場合にＰＭＴの動作を停止させることが知られている。

特開２００５−３５２１００号公報

室内灯やモニタからの光のような過大な外乱光は光量が予測不能でＰＭＴに与える影響が大きいため、ＰＭＴからの出力が一定値以上となった場合はＰＭＴの動作を瞬時に停止させたいが、観察サンプルからの光は多少過大であってもその明るさのままで観察したいという要望がある。

しかしながら、従来の走査型レーザ顕微鏡では、過大な光（以下、「過大光」という。）が外乱光によるものなのか観察サンプルからの光によるものなのかを判別することができず、過大光の種類に応じた対応を取ることができないという不都合がある。また、ＰＭＴの保護回路が作動した後、タイマで一定時間経過後にＰＭＴの動作が自動復帰する方式では、過大な光が外乱光（室内灯やモニタの光）に起因する場合に保護回路の作動とＰＭＴの動作の復帰が繰り返されてしまうことになり、ＰＭＴを劣化させてしまうという問題がある。

本発明は、外乱光のような過大光から光検出器を保護してその劣化を防止することができる走査型レーザ顕微鏡および顕微鏡観察方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、光源から発せられたレーザ光を標本上で２次元的に走査させる走査部と、前記標本からの戻り光を含む光を検出し、検出した光の輝度に相当する光強度信号を出力する光検出部と、該光検出部からの前記光強度信号をレーザ光の走査位置に対応付けて前記標本の画像を生成する画像生成部と、前記光検出部により出力された前記光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたか否かを判定する信号強度判定部と、前記標本へのレーザ光の照射がＯＦＦされた状態で前記信号強度判定部により前記光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたと判定された場合に、前記光検出部による前記光の検出を停止する制御部とを備える走査型レーザ顕微鏡を提供する。

本発明によれば、光源からのレーザ光が走査部により標本上で２次元的に走査され、標本からの戻り光が受光素子により検出されて光検出部により光強度信号が出力され、その光強度信号に基づいて画像生成部により標本の画像が生成される。したがって、画像上で標本を観察することができる。

ここで、標本へのレーザ光の照射がＯＦＦされている状態で光検出部により光が検出されると、その光は室内灯やモニタからの光のような外乱光であると考えられる。
本発明は、標本へのレーザ光の照射がＯＦＦされた状態で光検出部から出力される光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたと信号強度判定部により判定された場合に、受光制御部により光検出部による光の検出を停止することで、外乱光と認められる光量の最小値を強度閾値として設定しておけば、光検出部が過大な外乱光を検出し続けるのを防ぐことができる。これにより、外乱光のような過大な光から光検出部を保護してその劣化を防止することができる。

上記発明においては、前記制御部が、前記標本へのレーザ光の照射がＯＮされた状態で前記光検出部により得られた前記光強度信号の強度が前記信号強度判定部により前記所定の強度閾値を超えたと判定された場合に、前記標本へのレーザ光の照射をＯＦＦし、前記信号強度判定部の判定結果に基づいて前記検出部による前記光の検出を制御することとしてもよい。

このように構成することで、制御部により、標本を観察中にレーザ光を走査しながら光検出部に過大な光が入射したか否かが分かる。そして、光検出部に過大な光が入射した場合は、標本へのレーザ光の照射をＯＦＦして光検出部によって得られた光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたか否かを判定することで、標本を観察しながら外乱光のような過大な光から光検出部を保護することができる。

上記発明においては、前記標本へのレーザ光の照射がＯＮされた状態で前記信号強度判定部により強度が前記所定の強度閾値を超えたと判定された光強度信号が、所定の画素数閾値を超える数の連続する複数の前記画素に亘って出力されたか否かを判定する領域判定部を備え、前記制御部が、前記領域判定部により、前記所定の強度閾値を超える強度の光強度信号が前記所定の画素数閾値を超える数の連続する複数の画素に亘って出力されたと判定された場合に、前記標本へのレーザ光の照射をＯＦＦし、前記信号強度判定部の判定結果に基づいて前記検出部による前記光の検出を制御することとしてもよい。

光検出部に標本からの戻り光（本来観察したい光）や外乱光が過大な強度で入射した場合は、画像を生成する際にある程度多くの連続する複数の画素に亘って強度閾値を超える光強度信号が得られる傾向がある。一方、標本上の微小な薬剤やゴミ等によって瞬間的に強度閾値を超える光強度信号が出力されても、瞬間的な光強度信号は１画素、２画素程度において出力されるに過ぎず、多くの数の連続する複数の画素に亘らない傾向がある。

そのため、標本を観察中に光検出部により過大な光が検出されると、領域判定部により、標本へのレーザ光の照射がＯＮされた状態で所定の強度閾値を超える強度の光強度信号が所定の画素数閾値を超える数の連続する複数の画素に亘って出力されたかどうかが判定されることで、微小なゴミ等による瞬間的な強度信号の影響が除去される。

したがって、このような場合に、制御部により、標本へのレーザ光の照射をＯＦＦして信号強度判定部により光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたか否かを判定させ、その判定結果に応じて光検出部による光の検出を制御することで、標本の観察中に過大な光の有無を精度よく判定して光検出部を保護することができる。

本発明は、光源から発せられたレーザ光を標本上で２次元的に走査する走査工程と、前記標本からの光を含む光の輝度を光検出部により検出して光強度信号に光電変換させる光検出工程と、前記光検出部により得られた前記光強度信号をレーザ光の走査位置に対応する画素ごとに積算して前記標本の画像を生成する画像生成工程と、前記光検出部により得られた前記光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたか否かを判定する過大光判定工程とを含み、前記光検出工程が、前記標本へのレーザ光の照射がＯＦＦされた状態で前記過大光判定工程により前記光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたと判定された場合に、前記光検出部による前記光の輝度の検出を停止する顕微鏡観察方法を提供する。

本発明によれば、走査工程により光源からのレーザ光が標本上で２次元的に走査され、光検出工程により標本からの光の輝度が光検出部によって検出されて光強度信号に光電変換され、画像生成工程によりその光強度信号に基づいて標本の画像が生成される。したがって、画像上で標本を観察することができる。

この場合において、過大光判定工程により、標本へのレーザ光の照射がＯＦＦされた状態で光検出部により得られる光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたと判定された場合に、光検出工程が光検出部による光の検出を停止する。

ここで、標本へのレーザ光の照射がＯＦＦされている状態で光検出部により光が検出されると、その光は標本から発せられる光のような観察光かあるいは室内灯やモニタからの光のような過大な外乱光であると考えられる。したがって、外乱光と認められる光量の最小値を強度閾値として設定しておけば、光検出部により過大な外乱光を検出し続けてしまうことを防ぐことができる。これにより、外乱光のような過大な光から光検出部を保護してその劣化を防止することができる。

上記発明においては、前記過大光判定工程が、前記標本へのレーザ光の照射がＯＮされた状態で、前記光検出部により得られた前記光強度信号の強度が前記所定の強度閾値を超えたか否かを判定する第１判定工程と、該第１判定工程により前記光強度信号の強度が前記所定の強度閾値を超えたと判定された場合に前記標本へのレーザ光の照射をＯＦＦする照射停止工程と、該照射停止工程により前記標本へのレーザ光の照射がＯＦＦされた状態で、前記光検出部により得られた前記光強度信号の強度が前記所定の強度閾値を超えたか否かを判定する第２判定工程とを含むこととしてもよい。

このように構成することで、第１判定工程により、走査工程によるレーザ光の走査中に光検出部に過大な光が入射したか否かが分かる。そして、光検出部に過大な光が入射した場合は、照射停止工程により標本へのレーザ光の照射をＯＦＦして、第２判定工程により光検出部によって得られた光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたか否かを判定することで、標本を観察しながら過大な光から光検出部を保護することができる。

上記発明においては、前記過大光判定工程が、前記標本へのレーザ光の照射がＯＮされた状態で前記光検出部により得られた前記光強度信号の強度が前記所定の強度閾値を超えたか否かを判定する第１判定工程と、該第１判定工程により、強度が前記所定の強度閾値を超えたと判定された光強度信号が、所定の画素数閾値を超える数の連続する複数の前記画素に亘って出力されたか否かを判定する領域判定工程と、該領域判定工程により、前記所定の強度閾値を超える強度の光強度信号が前記所定の画素数閾値を超える数の画素に亘って出力されたと判定された場合に、前記標本へのレーザ光の照射をＯＦＦする照射停止工程と、該照射停止工程により前記標本へのレーザ光の照射がＯＦＦされた状態で、前記光検出部により得られた前記光強度信号の強度が前記所定の強度閾値を超えたか否かを判定する第２判定工程とを含むこととしてもよい。

このように構成することで、第１判定工程により、走査工程によるレーザ光の走査中に光検出部に過大な光が入射したか否かが分かる。ここで、光検出部に標本からの戻り光（本来観察したい光）や外乱光が過大な強度で入射した場合は、画像を生成する際にある程度多くの連続する複数の画素に亘って強度閾値を超える光強度信号が得られる傾向があり、一方、標本上の微小な薬剤やゴミ等によって瞬間的に強度閾値を超える光強度信号が出力されても、瞬間的な光強度信号は多くの数の連続する複数の画素に亘らない傾向がある。

したがって、領域判定工程により、所定の強度閾値を超える強度の光強度信号が所定の画素数閾値を超える数の連続する複数の画素に亘って出力されたと判定されると、その過大な光は微小なゴミ等による瞬間的なノイズではないことが分かる。このような場合に、照射停止工程により標本へのレーザ光の照射をＯＦＦして第２判定工程により光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたか否かを判定することで、光検出工程によりその判定結果に応じて光検出部による光の輝度の検出を停止することができる。これにより、標本の観察中に過大な光の有無を精度よく判定して光検出部を保護することができる。

上記発明においては、前記過大光判定工程が、前記走査工程によりレーザ光の走査線を次の走査ラインの開始位置に移動させるために前記標本へのレーザ光の照射がＯＦＦされている間に、前記光強度信号の強度が前記所定の強度閾値を超えたか否かを判定することとしてもよい。

このように構成することで、走査工程によるレーザ光の走査を中断せずに光が過大な光か否かを判定することができる。したがって、過大光が外乱光ではなかった場合に標本の画像を最後まで生成することができる。

上記発明においては、前記過大光判定工程が、前記標本へのレーザ光の照射がＯＮされた状態で、前記光検出部により得られた前記光強度信号の強度が前記所定の強度閾値を超えたか否かを判定する第１判定工程と、該第１判定工程により、強度が前記所定の強度閾値を超えたと判定された光強度信号が、所定の画素数閾値を超える数の連続する複数の前記画素に亘って出力されたか否かを判定する領域判定工程と、該領域判定工程により、前記所定の強度閾値を超える強度の光強度信号が前記所定の画素数閾値を超える数の画素に亘って出力されたと判定された場合に、前記走査工程によりレーザ光の走査線を次の走査ラインの開始位置に移動させるために前記標本へのレーザ光の照射がＯＦＦされている間に、前記光強度信号の強度が前記所定の強度閾値を超えたか否かを判定する第２判定工程とを含むこととしてもよい。
または、第１判定工程を省略し、前記走査工程によりレーザ光の走査線を次の走査ラインの開始位置に移動させるために前記標本へのレーザ光の照射がＯＦＦされている間に、前記光強度信号の強度が前記所定の強度閾値を超えたか否かを判定する第２判定工程とを含むこととしてもよい。

このように構成することで、過大光が外乱光ではなかった場合に標本の画像を無駄にすることなく、標本を観察しながら光が過大光か否かを精度よく判定することができる。

本発明によれば、外乱光のような過大光から受光素子を保護してその劣化を防止することができるという効果を奏する。

本発明の第１実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を示す概略構成図である。 本発明の第１実施形態に係る顕微鏡観察方法により光が過大光か否かを判定する工程を説明するフローチャートである。 本発明の第１実施形態の第１変形例に係る顕微鏡観察方法により光が過大光か否かを判定する工程を説明するフローチャートである。 本発明の第１実施形態の第２変形例に係る顕微鏡観察方法により光が過大光か否かを判定する工程を説明するフローチャートである。 レーザ光の走査線と帰線期間を示す図である。 本発明の第１実施形態の第３変形例に係る顕微鏡観察方法により光が過大光か否かを判定する工程を説明するフローチャートである。 本発明の第２実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡を示す概略構成図である。 本発明の第２実施形態に係る顕微鏡観察方法により光が過大光か否かを判定する工程を説明するフローチャートである。 本発明の第２実施形態の第１変形例に係る顕微鏡観察方法により光が過大光か否かを判定する工程を説明するフローチャートである。 本発明の第２実施形態の第２変形例に係る顕微鏡観察方法により光が過大光か否かを判定する工程を説明するフローチャートである。

〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡および顕微鏡観察方法について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００は、図１に示すように、標本Ｓを載置するステージ１１を有する顕微鏡本体部１と、標本Ｓを観察するための走査型観察部３と、標本Ｓを光刺激するための刺激光走査部５と、走査型観察部３と刺激光走査部５の光路を合成するダイクロイックミラー７と、これら顕微鏡本体部１、走査型観察部３および刺激光走査部５を制御するＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）９とを備えている。

顕微鏡本体部１は、ステージ１１の他、レーザ光をステージ１１上の標本Ｓに照射する一方、標本Ｓからの蛍光や反射光（戻り光）等を集光する対物レンズ１３と、走査型観察部３や刺激光走査部５からのレーザ光を対物レンズ１３に向けて反射する一方、対物レンズ１３により集光された蛍光や反射光を走査型観察部３や刺激光走査部５に向けて反射する反射ミラー１５とを備えている。
ステージ１１は、図示しない昇降機構により、対物レンズ１３の光軸方向に移動可能に設けられている。

走査型観察部３は、観察用のレーザ光を発生する光源２１と、光源２１から発せられたレーザ光を遮断可能なシャッタ２３と、シャッタ２３を通過したレーザ光の強度調整等を行うＡＯＴＦ（Ａｃｏｕｓｔｏ−Ｏｐｔｉｃ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ：音響光学素子）２５と、ＡＯＴＦ２５からのレーザ光を反射する励起ダイクロイックミラー２６と、励起ダイクロイックミラー２６により反射されたレーザ光を標本Ｓ上で２次元的に走査させるＸＹスキャナ（走査部）２７とを備えている。

シャッタ２３は、図示しない駆動機構により、レーザ光の光路に挿脱可能に設けられており、光路に挿入されるとレーザ光を遮断し、光路から外されるとレーザ光を通過させることができるようになっている。
励起ダイクロイックミラー２６は、光源２１からのレーザ光を反射する一方、標本Ｓから対物レンズ１３、反射ミラー１５、ダイクロイックミラー７およびスキャナ２７を介してレーザ光の光路を戻る蛍光を透過させることができるようになっている。

スキャナ２７は、例えば、互いに近接配置された一対のガルバノミラー（図示略）を備えている。これら一対のガルバノミラーは、それぞれレーザ光の光軸に交差する揺動軸回りに揺動可能に設けられている。

このスキャナ２７は、一対のガルバノミラーの揺動角度を変えながらレーザ光を反射することにより、レーザ光を偏向することができるようになっている。スキャナ２７により反射されたレーザ光はダイクロイックミラー７に入射するようになっている。また、スキャナ２７は、各ガルバノミラーの揺動角度に対応するレーザ光の走査位置に関する走査位置情報をＰＣ９に送るようになっている。

また、走査型観察部３には、励起ダイクロイックミラー２６を透過した標本Ｓからの蛍光を反射する反射ミラー２９と、反射ミラー２９により反射された蛍光から不要な光をカットする吸収フィルタ３１と、吸収フィルタ３１を通過した蛍光の輝度を検出するＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ、光検出部）３３とが備えられている。

ＰＭＴ３３は、入射した光の輝度を検出して光強度信号に光電変換し、得られた光強度信号をＰＣ９に送るようになっている。ＰＭＴ３３に入射する光としては、標本Ｓからの蛍光の他、例えば、標本Ｓからの蛍光以外の光や外部からの光等が含まれるものとする。

刺激光走査部５は、光刺激用のレーザ光を発生する光源４１と、光源４１から発せられたレーザ光を遮断可能なシャッタ４３と、シャッタ４３を通過したレーザ光の強度調整等を行うＡＯＴＦ（音響光学素子）４５と、ＡＯＴＦ４５からのレーザ光を偏向する２次元ガルバノスキャナ４９と、２次元ガルバノスキャナ４９により偏向されたレーザ光をダイクロイックミラー７に向けて反射する反射ミラー５１とを備えている。

シャッタ４３は、走査型観察部３のシャッタ２３と同様に、図示しない駆動機構によりレーザ光の光路に挿脱可能に設けられており、光路に挿入されるとレーザ光を遮断し、光路から外されるとレーザ光を通過させることができるようになっている。

２次元ガルバノスキャナ４９は、スキャナ２７と同様の構成を有しており、光源４１から発せられたレーザ光を標本Ｓ上で２次元的に走査させることができるようになっている。

ダイクロイックミラー７は、走査型観察部３のスキャナ２７からのレーザ光を顕微鏡本体部１に向けて反射する一方、標本Ｓから戻る蛍光を走査型観察部３に向けて反射するようになっている。また、ダイクロイックミラー７は、刺激光走査部５の反射ミラー５１からのレーザ光を透過させて顕微鏡本体部１に入射させるようになっている。

ＰＣ９は、ＰＭＴ３３から出力された光強度信号をスキャナ２７から送られてくる走査位置情報に対応する画素ごとに積算して標本Ｓの画像を生成する画像生成部６１と、ＰＭＴ３３から出力された光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたか否かを判定する信号強度判定部６３と、上記駆動機構によるシャッタ２３，４３の挿脱やスキャナ２７によるレーザ光の走査、ＰＭＴ３３による光の検出等を制御する制御部（受光制御部）６５とを備えている。

画像生成部６１は、生成した画像を上記モニタに表示させるようになっている。
信号強度判定部６３は、ＰＭＴ３３から送られてくる光強度信号に対する所定の強度閾値を予め記憶しておくことができるようになっている。所定の強度閾値は、例えば、室内灯やモニタからの光のような過大な外乱光と認められる光量の最小値であることが望ましい。

また、信号強度判定部６３は、ＰＭＴ３３からの光強度信号と記憶しておいた所定の強度閾値とを比較し、光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたか否か、すなわち、光が過大な光（以下、「過大光」という）か否かを判定するようになっている。信号強度判定部６３の判定結果は制御部６５に送られるようになっている。

制御部６５は、例えば、走査型観察部３や刺激光走査部５の各駆動機構を駆動させて、レーザ光の光路にシャッタ２３，４３を挿入したり、光路からシャッタ２３，４３を外したりすることができるようになっている。また、制御部６５は、ＰＭＴ３３に印加する電圧（ＨＶ）のＯＮ／ＯＦＦやＨＶの値の増減を行うようになっている。

この制御部６５は、標本Ｓへのレーザ光の照射がＯＦＦされた状態でＰＭＴ３３から出力された光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたと信号強度判定部６３により判定された場合に、ＰＭＴ３３に印加するＨＶをＯＦＦするようになっている。さらに、制御部６５は、その場合に上記モニタに警告を表示するようになっている。

次に、本実施形態に係る顕微鏡観察方法は、光源２１から発せられたレーザ光を標本Ｓ上で２次元的に走査する走査工程と、標本Ｓからの蛍光を含む光の輝度をＰＭＴ３３により検出して光強度信号に光電変換させる光検出工程と、ＰＭＴ３３により得られた光強度信号をレーザ光の走査位置に対応する画素ごとに積算して標本Ｓの画像を生成する画像生成工程と、ＰＭＴ３３により得られた光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたか否かを判定する過大光判定工程（ステップＳＡ２、図２参照）とを含み、光検出工程が、標本Ｓへのレーザ光の照射がＯＦＦされた状態で過大光判定工程により光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたと判定された場合に、ＰＭＴ３３による光の検出を停止するようになっている。

このように構成された走査型レーザ顕微鏡１００および顕微鏡観察方法の作用について説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００および顕微鏡観察方法により標本Ｓを検査するには、ステージ１１に標本Ｓを載置し、ＰＣ９により走査型観察部３または刺激光走査部５を制御して行う。

走査型観察部３により標本Ｓを観察する場合は、制御部６５によりレーザ光の光路からシャッタ２３を外し、光源２１から観察用のレーザ光を発生させる。光源２１から発せられたレーザ光は、シャッタ２３を通過しＡＯＴＦ２５により強度が調整されて励起ダイクロイックミラー２６により反射された後、スキャナ２７により偏向されてダイクロイックミラー７により顕微鏡本体部１に向けて反射される。

顕微鏡本体部１に入射したレーザ光は、反射ミラー１５により反射されて、対物レンズ１３により標本Ｓに照射される。これにより、スキャナ２７の各ガルバノミラーの揺動角度に応じて、観察用のレーザ光が標本Ｓ上で２次元的に走査される（走査工程）。

観察用のレーザ光が走査されることにより標本Ｓにおいて蛍光が発生すると、その蛍光は対物レンズ１３により集光されて反射ミラー１５を介してレーザ光の光路を戻り、ダイクロイックミラー７により走査型観察部３に向けて反射される。そして、蛍光はスキャナ２７を介して励起ダイクロイックミラー２６を透過し、反射ミラー２９により反射されて吸収フィルタ３１により不要な光がカットされた後、ＰＭＴ３３によりその輝度が検出される（光検出工程）。

ＰＭＴ３３においては、検出した蛍光を含む光の輝度が光強度信号に光電変換され、得られた光強度信号がＰＣ９に送られる。ＰＣ９では、ＰＭＴ３３から送られてきた光強度信号が画像生成部６１によりレーザ光の走査位置に対応する画素毎に積算されて標本Ｓの２次元的な画像が構築される（画像生成工程）。積算された積算値は画像生成部６１により記憶される。また、構築された標本Ｓの画像は上記モニタに表示される。これにより、画像上で標本Ｓを観察することができる。

次に、刺激光走査部５により標本Ｓを光刺激する場合は、制御部６５によりレーザ光の光路からシャッタ４３を外し、光源４１から刺激用のレーザ光を発生させる。光源４１から発せられたレーザ光は、シャッタ４３を通過してＡＯＴＦ４５により強度が調整された後、２次元ガルバノスキャナ４９により偏向されて反射ミラー５１により反射され、ダイクロイックミラー７を透過して顕微鏡本体部１に入射する。

顕微鏡本体部１に入射したレーザ光は、反射ミラー１５により反射されて対物レンズ１３により標本Ｓに照射される。これにより、対物レンズ１３の焦点位置において刺激用のレーザ光によって標本Ｓに光刺激を与えることができる。光刺激の位置は２次元ガルバノスキャナ４９により調節される。

ここで、標本Ｓへのレーザ光の照射がＯＦＦされている状態でＰＭＴ３３により光が検出されると、その光は室内灯やモニタからの光のような外乱光であると考えられる。

本実施形態においては、過大な外乱光からＰＭＴ３３を守るために、ＰＣ９により、光が過大光か否かを判定し、その判定結果に応じて標本Ｓの検査を中止あるいは続行する。具体的には、図２のフローチャートに示されるように、まず、標本Ｓの検査を一旦中断し、制御部６５により、走査型観察部３のレーザ光の光路および刺激光走査部５のレーザ光の光路にシャッタ２３，４３をそれぞれ挿入する。これにより、光源２１からの観察用のレーザ光および光源４１からの刺激用のレーザ光を遮断する（ステップＳＡ１）。

そして、標本Ｓへのレーザ光の照射がＯＦＦされた状態で、信号強度判定部６３により、ＰＭＴ３３からＰＣ９に送られてきた光強度信号と予め記憶しておいた所定の強度閾値とが比較され、光強度信号が所定の強度閾値を超えたか否かが判定される（過大光判定工程、ステップＳＡ２）。

信号強度判定部６３により光強度信号が所定の強度閾値を超えたと判定された場合は、異常すなわちＰＭＴ３３に過大光が入射していると考えられ、制御部６５により、ＰＭＴ３３に印加するＨＶがＯＦＦされる（ステップＳＡ３）。これにより、ＰＭＴ３３による光の検出が停止され、標本Ｓの検査が中止される。また、制御部６５によりモニタに警告が表示される。

一方、信号強度判定部６３により光強度信号が所定の強度閾値以下と判定された場合は（ステップＳＡ２「Ｎｏ」）、正常すなわちＰＭＴ３３に過大光は入射していないと考えられ、制御部６５によりレーザ光の光路からシャッタ２３，４３が外される。これにより、標本Ｓへのレーザ光の照射がＯＮされ（ステップＳＡ４）、標本Ｓの検査が続行される。

以上説明したように、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００および顕微鏡観察方法によれば、標本Ｓへのレーザ光の照射がＯＦＦされた状態でＰＭＴ３３から出力される光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えた場合にＰＭＴ３３による光の検出を停止することで、ＰＭＴ３３が過大な外乱光を検出し続けるのを防ぐことができる。これにより、外乱光のような過大光からＰＭＴ３３を保護してその劣化を防止し、ＰＭＴ３３の長寿命化を図ることができる。

本実施形態は、以下のように変形することができる。
本実施形態においては、標本Ｓの検査時と同じ高いＨＶをＰＭＴ３３に印加した状態で光が過大光か否かを判定することとしたが（図２のステップＳＡ２参照。）、第１変形例としては、ＰＭＴ３３へのＨＶの印加をＯＦＦまたは低減した状態で光が過大光か否かを判定することとしてもよい。

以下、本変形例について、図３のフローチャートを参照して説明する。
まず、制御部６５により、レーザ光の光路にシャッタ２３，４３を挿入して光源２１，４１からのレーザ光を遮断するとともに（ステップＳＢ１）、ＰＭＴ３３に印加しているＨＶを一旦ＯＦＦする（ステップＳＢ２）。

次いで、制御部６５によりＰＭＴ３３へのＨＶの印加をＯＮし、ＨＶを低い値から徐々に上昇させていきながら（ステップＳＢ３）、信号強度判定部６３により、ＰＭＴ３３からＰＣ９に送られてきた光強度信号が所定の強度閾値を超えたか否かを判定する（ステップＳＢ４）。

信号強度判定部６３により、ＰＭＴ３３から出力された光強度信号が所定の強度閾値を超えたと判定された場合は、上記本実施形態と同様に、制御部６５によりＰＭＴ３３へのＨＶの印加をＯＦＦする（ステップＳＢ５）。これにより、ＰＭＴ３３による光の検出を停止して検査を中止する。また、制御部６５により上記モニタに警告を表示する。

一方、信号強度判定部６３により、ＰＭＴ３３から出力された光強度信号が所定の強度閾値以下と判定された場合は（ステップＳＢ４「Ｎｏ」）、制御部６５により、ＰＭＴ３３に印加しているＨＶが所定の規定値（上限）に達したか否かを判断する（ステップＳＢ６）。

ＰＭＴ３３に印加するＨＶが上限に達していない場合は、印加するＨＶを増大して（ステップＳＢ７)、ステップＳＢ４に戻る。一方、ＰＭＴ３３に印加する電圧が上限に達している場合は、外乱光はないものと考えられる。したがって、制御部６５により、レーザ光の光路からシャッタ２３，４３を外して標本Ｓへのレーザ光の照射をＯＮするとともに（ステップＳＢ８）、ＰＭＴ３３に印加するＨＶの値を標本Ｓの検査時の値に戻す（ステップＳＢ９）。そして、標本Ｓの検査を続行する。

本変形例によれば、ＰＭＴ３３に印加するＨＶをＯＦＦまたは低減した状態で光が過大光か否かを判定することで、光が外乱光のような過大光であっても、その判定中にＰＭＴ３３がダメージを受けるのを防ぐことができる。
本変形例においては、ステップＳＢ２においてＰＭＴ３３へのＨＶの印加を一旦ＯＦＦすることとしたが、ＨＶの印加を必ずしもＯＦＦする必要はなく、ＨＶを低い値に低減することとしてもよい。

また、第２変形例としては、走査型観察部３による標本Ｓの検査中に光が過大光か否かの判定を組み込むこととしてもよい。
具体的には、図４のフローチャートに示されるように、まず、制御部６５により、光が過大光か否かの判定を行っていないことを示すフラグ＝１を設定し（ステップＳＣ１）、スキャナ２７によるレーザ光の走査を開始する（ステップＳＣ２）。

次いで、信号強度判定部６３により、ＰＭＴ３３からＰＣ９に送られてきた光強度信号が所定の強度閾値を超えたか否かを判定する（ステップＳＣ３）。光強度信号が所定の強度閾値を超えたと判定された場合は、フラグ＝１が設定されているので（ステップＳＣ４「ＹＥＳ」）、制御部６５により、スキャナ２７によるレーザ光の走査を一旦中断する（ステップＳＣ５）。

次いで、制御部６５により、レーザ光の光路にシャッタ２３，４３を挿入し、光源２１，４１からのレーザ光を遮断する（ステップＳＣ６）。そして、制御部６５により、スキャナ２７の走査位置を同じフレームの初期位置に戻して最初から走査を開始する（ステップＳＣ７）。この状態で、信号強度判定部６３により、ＰＭＴ３３からＰＣ９に送られてきた光強度信号が所定の強度閾値を超えたか否かを判定する（ステップＳＣ８）。

信号強度判定部６３により光強度信号が所定の強度閾値以下と判断された場合は、ＰＭＴ３３に入射している光は過大な外乱光ではないと判断できる。したがって、制御部６５により、スキャナ２７による走査が終了したか否かを判断する（ステップＳＣ９）。

スキャナ２７による走査が終了していなければ（ステップＳＣ９「ＮＯ」）、ステップＳＣ８に戻る。一方、スキャナ２７による走査が終了していれば、制御部６５によりフラグ＝１に代えてフラグ＝０を設定する（ステップＳＣ１０）。そして、制御部６５により、レーザ光の光路からシャッタ２３，４３を外して標本Ｓへのレーザ光の照射をＯＮし（ステップＳＣ１１）、ステップＳＣ２に戻る。この場合は、その後に過大光が生じたとしても１フレームが終了するまで標本Ｓの検査を続ける。

ステップＳＣ８において、信号強度判定部６３により光強度信号が所定の強度閾値を超えたと判定された場合は、異常すなわち光は外乱光と判断できる。したがって、制御部６５によりＰＭＴ３３に印加するＨＶをＯＦＦするとともに（ステップＳＣ１２）、スキャナ２７による走査を停止する（ステップＳＣ１３）。これにより、ＰＭＴ３３による光の検出を停止し、標本Ｓの検査を中止する。また、制御部６５により上記モニタに警告を表示する。

ステップＳＣ３において信号強度判定部６３により光強度信号が所定の強度閾値以下と判定された場合や、ステップＳＣ４において制御部６５によりフラグ＝１でないと判断された場合は、制御部６５により、スキャナ２７による走査が終了したか否かを判断する（ステップＳＣ１４）。そして、走査は終了していないと判断した場合はステップＳＣ３に戻り、走査は終了していると判断した場合は、１フレーム分の画像の取り込みが完了しているので、ステップＳＣ１に戻り次のフレームに移る。

また、本実施形態においては、シャッタ２３，４３により標本Ｓへのレーザ光の照射をＯＦＦして標本Ｓの検査を中断した状態で光が過大光か否かを判定することとしたが、第３変形例としては、図５に示すように、ＡＯＴＦ２５により標本Ｓへのレーザ光の照射をＯＦＦして、レーザ光の走査線を次の走査ラインの開始位置に移動させる期間（この期間を「帰線期間」という。）に、光が過大光か否かを判定することとしてもよい。帰線期間では、観察用のレーザ光がＯＦＦされる。

本変形例においては、図６のフローチャートに示されるように、過大光判定工程（ステップＳＤ２、図６参照）が、走査工程（ステップＳＤ１）の帰線期間に、ＰＭＴ３３から出力された光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたか否かを判定することとすればよい。

具体的には、制御部６５によりスキャナ２７が帰線期間か否かを判断する（ステップＳＤ１）。帰線期間ではない場合は帰線期間になるまで待機する。一方、帰線期間の場合は、信号強度判定部６３により、ＰＭＴ３３からＰＣ９に送られてきた光強度信号が所定の強度閾値を超えたか否かを判断する（ステップＳＤ２）。このとき、刺激光走査部５により光刺激が行われている場合は、シャッタ４３を光路に挿入して刺激レーザ光を遮断する。

信号強度判定部６３により光強度信号が所定の強度閾値を超えたと判定された場合は、制御部６５によりＰＭＴ３３に印加するＨＶをＯＦＦする（ステップＳＤ３）。これにより、ＰＭＴ３３による光の検出を停止し、標本Ｓの検査を中止する。また、制御部６５により、上記モニタに警告を表示する。一方、信号強度判定部６３により光強度信号が所定の強度閾値以下と判定された場合は（ステップＳＤ２「Ｎｏ」）、標本Ｓの検査を続行する。

このようにすることで、走査工程によるレーザ光の走査を中断せずに光が過大光か否かを判定することができる。したがって、過大光が外乱光ではなかった場合に標本Ｓの画像を最後まで生成することができる。

〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡および顕微鏡観察方法について説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡２００は、図７に示すように、ＰＣ９が、画像の複数画素に亘る過大光をＰＭＴ３３が検出したか否かを判定する領域判定部１６７を備える点で第１実施形態と異なる。

また、本実施形態に係る顕微鏡観察方法は、過大光判定工程が、図８のフローチャートに示されるように、標本Ｓへのレーザ光の照射がＯＮされた状態で、ＰＭＴ３３により得られた光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたか否かを判定する第１判定工程（ステップＳＥ２）と、第１判定工程により光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたと判定された場合に標本Ｓへのレーザ光の照射をＯＦＦする照射停止工程（ステップＳＥ５）と、照射停止工程により標本Ｓへのレーザ光の照射がＯＦＦされた状態で、ＰＭＴ３３により得られた光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたか否かを判定する第２判定工程（ステップＳＥ６）とを含む点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１００および顕微鏡観察方法と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

領域判定部１６７は、標本Ｓへのレーザ光の照射がＯＮされた状態で、信号強度判定部６３により所定の強度閾値を超えたと判定された強度の光強度信号が、所定の画素数閾値を超える数の連続する複数の画素に亘って出力されたか否かを判定するようになっている。

すなわち、領域判定部１６７は、画像を形成する各画素に対する輝度の光強度信号が所定の強度閾値を超えた場合であって、且つ、その画素が相互に連続している場合に、その所定の強度閾値を超えた光強度信号に対応する画素をカウントするようになっている（画素数カウント：ＣＮＴ）。そして、領域判定部１６７は、カウントした画素数が、予め定めた所定の画素数閾値を超えた場合に、所定の強度閾値を超える光強度信号が連続する複数の画素に亘って出力されたと判定するようになっている。領域判定部１６７による判定結果は制御部６５に送られるようになっている。

このように構成された走査型レーザ顕微鏡２００および顕微鏡観察方法の作用について説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡２００および顕微鏡観察方法により光が過大光か否かを判定する場合は、図８のフローチャートに示されるように、標本Ｓの検査中において、まず、領域判定部１６７により画素数カウントがリセットされる（ＣＮＴ＝０、ステップＳＥ１）。

次いで、信号強度判定部６３により、標本Ｓへのレーザ光の照射がＯＮされた状態でＰＭＴ３３からＰＣ９に送られてきた光強度信号が所定の強度閾値を超えたか否かが判定される（ステップＳＥ２）。光強度信号が所定の強度閾値以下と判定された場合はステップＳＥ１に戻る。一方、光強度信号が所定の強度閾値を超えたと判定された場合は、領域判定部１６７により画素数カウントがアップされる（ＣＮＴ＝ｎ＋１、ステップＳＥ３）。

次いで、領域判定部１６７により、画素数カウントが所定の画素数閾値を超えたか否かが判定される（ステップＳＥ４）。画素数カウントが所定の画素数閾値以下と判定された場合はステップＳＥ２に戻る。一方、画素数カウントが所定の画素数閾値を超えたと判定された場合は、制御部６５により、レーザ光の光路にシャッタ２３，４３が挿入され、光源２１，４１からのレーザ光が遮断される（ステップＳＥ５）。

そして、信号強度判定部６３により、標本Ｓへのレーザ光の照射がＯＦＦされた状態でＰＭＴ３３からＰＣ９に送られてきた光強度信号が所定の強度閾値を超えたか否かが判定される（ステップＳＥ６）。光強度信号が所定の強度閾値以下と判定された場合は、制御部６５により、レーザ光の光路からシャッタ２３，４３が外されて、標本Ｓへのレーザ光の照射がＯＮされる（ステップＳＥ７）。そして、ステップＳＥ１に戻る。

一方、信号強度判定部６３により光強度信号が所定の強度閾値を超えたと判定された場合は（ステップＳＥ６「Ｙｅｓ」）、制御部６５により、ＰＭＴ３３に印加するＨＶがＯＦＦされる（ステップＳＥ８）。これにより、ＰＭＴ３３による光の検出が停止し、標本Ｓの検査が中止される。また、制御部６５によりモニタに警告が表示される。

ここで、ＰＭＴ３３に標本からの戻り光（本来観察したい光）や外乱光が過大な強度で入射した場合は、画像を生成する際にある程度多くの連続する複数の画素に亘って強度閾値を超える光強度信号が得られる傾向がある。一方、標本Ｓ上の微小な薬剤やゴミ等によって瞬間的に強度閾値を超える光強度信号が出力されても、瞬間的な光強度信号は１画素、２画素程度において出力されるに過ぎず、多くの数の連続する複数の画素に亘らない傾向がある。

したがって、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡および顕微鏡観察方法によれば、領域判定部１６７により、所定の強度閾値を超える強度の光強度信号が所定の画素数閾値を超える数の連続する複数の画素に亘って出力されたと判定されると、その光は微小なゴミ等による瞬間的なノイズではないことが分かる。このような場合に、標本Ｓへのレーザ光の照射をＯＦＦして信号強度判定部６３により光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたか否かを判定させることで、制御部６５によりその判定結果に応じてＰＭＴ３３による光の検出を停止することができる。これにより、標本の観察中に過大光の有無およびその種類を精度よく判定してＰＭＴ３３を効果的に保護することができる。

本実施形態は以下のように変形することができる。
本実施形態は、標本Ｓの検査時と同じ高いＨＶをＰＭＴ３３に印加した状態で光が過大光か否かを判定することとしたが（図８のステップＳＥ６参照。）、第１変形例としては、第１実施形態の第１変形例と同様に、ＰＭＴ３３へのＨＶの印加をＯＦＦまたは低減した状態で光が過大光か否かを判定することとしてもよい。

この場合、図９のフローチャートに示されるように、ステップＳＥ５においてシャッタ２３，４３により光源２１，４１からのレーザ光が遮断されたら、その後は第１実施形態の第１変形例と同様に、ステップＳＢ２〜ステップＳＢ９を行うこととすればよい。本変形例においては、ステップＳＢ９において、制御部６５により、ＰＭＴ３３に印加するＨＶの値を標本Ｓの検査時の値に戻したら、ステップＳＥ１に戻ることとすればよい。

また、本実施形態においては、シャッタ２３，４３により標本Ｓへのレーザ光の照射をＯＦＦして標本Ｓの検査を中断した状態で光が過大光か否かを判定することとしたが、第１実施形態の第３変形例と同様に、スキャナ２７の帰線期間中に光が過大光か否かを判定することとしてもよい。

本変形例においては、図１０のフローチャートに示されるように、過大光判定工程が、照射停止工程を含まず、また、第２判定工程（ステップＳＤ２´）が、領域判定工程（ステップＳＥ４）により、所定の強度閾値を超える強度の光強度信号が所定の画素数閾値を超える数の画素に亘って出力されたと判定された場合に、光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたか否かを走査工程（ステップＳＤ１）における帰線期間中に判定することとすればよい。

具体的には、ステップＳＥ４において、領域判定部１６７により、画素数カウントが所定の画素数閾値を超えたと判定されたら、その後は第１実施形態の第３変形例と同様にステップＳＤ１〜ステップＳＤ３を行うこととすればよい。本変形例においては、ステップＳＤ２において、信号強度判定部６３により、光強度信号が所定の強度閾値以下と判定された場合はステップＳＥ１に戻ることとすればよい。

このようにすることで、走査工程によるレーザ光の走査を中断せずに光が過大光か否かを判定することができる。したがって、過大光が外乱光ではなかった場合に標本Ｓの画像を最後まで生成することができる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。

また、例えば、シャッタ２３，４３により標本Ｓへのレーザ光の照射をＯＮ／ＯＦＦすることとしたが、例えば、シャッタ２３，４３を採用せずに、ＡＯＴＦ２５，４５を制御して、ＡＯＴＦ２５，４５通過時にレーザ光をＯＦＦしてもよい。
また、ＡＯＴＦ２５，４５に代えて、ＡＯＭ（Ａｃｏｕｓｔｏ−Ｏｐｔｉｃ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）を採用することとしてもよい。また、光源２１，４１（レーザ光源）自身をオンオフ制御してもよい。

２１ 光源
２７ スキャナ（走査部）
３３ ＰＭＴ（光検出部）
６１ 画像生成部
６３ 信号強度判定部
６５ 制御部（受光制御部）
１００，２００ 走査型レーザ顕微鏡
１６７ 領域判定部
ＳＡ２、ＳＤ２ 過大光判定工程
ＳＤ１ 走査工程
ＳＤ２´ 第２判定工程
ＳＥ２ 第１判定工程
ＳＥ４ 領域判定工程
ＳＥ５ 照射停止工程
ＳＥ６ 第２判定工程

Claims (8)

1. 光源から発せられたレーザ光を標本上で２次元的に走査させる走査部と、
   前記標本からの戻り光を含む光を検出し、検出した光の輝度に相当する光強度信号を出力する光検出部と、
   該光検出部からの前記光強度信号をレーザ光の走査位置に対応付けて前記標本の画像を生成する画像生成部と、
   前記光検出部により出力された前記光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたか否かを判定する信号強度判定部と、
   前記標本へのレーザ光の照射がＯＦＦされた状態で前記信号強度判定部により前記光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたと判定された場合に、前記光検出部による前記光の検出を停止する制御部とを備える走査型レーザ顕微鏡。
2. 前記制御部が、前記標本へのレーザ光の照射がＯＮされた状態で前記光検出部により得られた前記光強度信号の強度が前記信号強度判定部により前記所定の強度閾値を超えたと判定された場合に、前記標本へのレーザ光の照射をＯＦＦし、前記信号強度判定部の判定結果に基づいて前記検出部による前記光の検出を制御する請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
3. 前記標本へのレーザ光の照射がＯＮされた状態で前記信号強度判定部により強度が前記所定の強度閾値を超えたと判定された光強度信号が、所定の画素数閾値を超える数の連続する複数の前記画素に亘って出力されたか否かを判定する領域判定部を備え、
   前記制御部が、前記領域判定部により、前記所定の強度閾値を超える強度の光強度信号が前記所定の画素数閾値を超える数の連続する複数の画素に亘って出力されたと判定された場合に、前記標本へのレーザ光の照射をＯＦＦし、前記信号強度判定部の判定結果に基づいて前記検出部による前記光の検出を制御する請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
4. 光源から発せられたレーザ光を標本上で２次元的に走査する走査工程と、
   前記標本からの光を含む光の輝度を光検出部により検出して光強度信号に光電変換させる光検出工程と、
   前記光検出部により得られた前記光強度信号をレーザ光の走査位置に対応付けて前記標本の画像を生成する画像生成工程と、
   前記光検出部により得られた前記光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたか否かを判定する過大光判定工程とを含み、
   前記光検出工程が、前記標本へのレーザ光の照射がＯＦＦされた状態で前記過大光判定工程により前記光強度信号の強度が所定の強度閾値を超えたと判定された場合に、前記光検出部による前記光の輝度の検出を停止する顕微鏡観察方法。
5. 前記過大光判定工程が、前記標本へのレーザ光の照射がＯＮされた状態で、前記光検出部により得られた前記光強度信号の強度が前記所定の強度閾値を超えたか否かを判定する第１判定工程と、
   該第１判定工程により前記光強度信号の強度が前記所定の強度閾値を超えたと判定された場合に前記標本へのレーザ光の照射をＯＦＦする照射停止工程と、
   該照射停止工程により前記標本へのレーザ光の照射がＯＦＦされた状態で、前記光検出部により得られた前記光強度信号の強度が前記所定の強度閾値を超えたか否かを判定する第２判定工程とを含む請求項４に記載の顕微鏡観察方法。
6. 前記過大光判定工程が、前記標本へのレーザ光の照射がＯＮされた状態で前記光検出部により得られた前記光強度信号の強度が前記所定の強度閾値を超えたか否かを判定する第１判定工程と、
   該第１判定工程により、強度が前記所定の強度閾値を超えたと判定された光強度信号が、所定の画素数閾値を超える数の連続する複数の前記画素に亘って出力されたか否かを判定する領域判定工程と、
   該領域判定工程により、前記所定の強度閾値を超える強度の光強度信号が前記所定の画素数閾値を超える数の画素に亘って出力されたと判定された場合に、前記標本へのレーザ光の照射をＯＦＦする照射停止工程と、
   該照射停止工程により前記標本へのレーザ光の照射がＯＦＦされた状態で、前記光検出部により得られた前記光強度信号の強度が前記所定の強度閾値を超えたか否かを判定する第２判定工程とを含む請求項４に記載の顕微鏡観察方法。
7. 前記過大光判定工程が、前記走査工程によりレーザ光の走査線を次の走査ラインの開始位置に移動させるために前記標本へのレーザ光の照射がＯＦＦされている間に、前記光強度信号の強度が前記所定の強度閾値を超えたか否かを判定する請求項４に記載の顕微鏡観察方法。
8. 前記過大光判定工程が、前記標本へのレーザ光の照射がＯＮされた状態で、前記光検出部により得られた前記光強度信号の強度が前記所定の強度閾値を超えたか否かを判定する第１判定工程と、
   該第１判定工程により、強度が前記所定の強度閾値を超えたと判定された光強度信号が、所定の画素数閾値を超える数の連続する複数の前記画素に亘って出力されたか否かを判定する領域判定工程と、
   該領域判定工程により、前記所定の強度閾値を超える強度の光強度信号が前記所定の画素数閾値を超える数の画素に亘って出力されたと判定された場合に、前記走査工程によりレーザ光の走査線を次の走査ラインの開始位置に移動させるために前記標本へのレーザ光の照射がＯＦＦされている間に、前記光強度信号の強度が前記所定の強度閾値を超えたか否かを判定する第２判定工程とを含む請求項４に記載の顕微鏡観察方法。

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