JP2014132030A - 免疫原性組成物およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、抗原および樹状細胞ターゲッティング成分を含む免疫原性組成物を提供する。荷電基が樹状細胞リガンドに共有結合しており、樹状細胞ターゲッティング成分と静電気的に会合している。
【選択図】なし
Description
リポペプチドの合成
分枝状および線状リポペプチドの合成を、PEG-S RAM樹脂(Rapp Polymere、Tubingen、Germany;置換因子0.27mmol/g)上で行った。分枝状リポペプチドR4(S2Pam2Cys)(構築物1)およびE4(S2Pam2Cys)(構築物2;模式図を参照されたい)の合成には、最初にFmoc-リジン(Mtt)-OH(Novabiochem、Laufelfingen、Switzerland)を4倍過剰で、等モルのO-ベンゾトリアゾール-N,N,N,N’,N’-テトラメチル(tetamethyl)-ウロニウム-ヘキサフルオロリン酸(HBTU; Novabiochem、Darmstadt、Germany)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(hydoxybenzotriazole)(HOBt)および1.5倍モル過剰のジイソプロピルエチルアミン(DIPEA; Sigma、Castle Hill、Australia)を用いて、樹脂にカップリングさせた。アシル化は、40分間行った。α-アミノ上のFmoc保護基を次に除去し、これらのFmoc基の除去の後に、2つの一次アミノ基が分岐点の役目をするために曝露されるように、Fmoc-リジン-(Fmoc)-OHをカップリングさせた。それに続く別の1ラウンドの8倍過剰Fmoc-リジン(Fmoc)-OHのカップリングは、4つの分岐点を与え、それらに、4つのアルギニン(R)またはグルタミン酸(E)残基が16倍過剰でカップリングされた。
5匹の8〜12週齢BALB/c雌マウスの群に、特に明記しない限り0日目および28日目に再び、尾の基部の皮下に25μgのオボアルブミン(OVA; Sigma Aldrich、USA)またはニワトリ卵白リゾチーム(HEL; Sigma Aldrich、USA)のいずれかを生理食塩水で、またはCFAに乳濁させて、または生理食塩水中の異なる量のR4(S2Pam2Cys)もしくはE4(S2Pam2Cys)と混合して接種した。血清は、特に明記しない限り一次接種の約4週後および二次接種の2週後に採取された血液から調製された。
平底ウェルポリビニルプレート(Thermo、USA)を、加湿雰囲気下の室温で18〜20時間、0.1w/v%アジ化ナトリウムを含むPBS中のOVAまたはHEL(5μg/ml)(Chem Supply、Australia)のいずれかでコーティングした。抗原を除去し、10mg/mlウシ血清アルブミンを含有するPBS(BSA10PBS)を1時間加え、その後0.05v/v%Tween-20を含有するPBS(Sigma Aldrich、Milwaukee、USA)(PBST)で洗浄した。免疫化したマウスから得られた血清の連続希釈をウェルに加え、室温で一晩インキュベートした。PBSTによる洗浄の後、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗マウスIgG抗体(Dako、Glostrup、Denmark)を、酵素基質(0.004%過酸化水素[Ajax Chemicals、Australia]を含む50mMクエン酸[M&B、England]中の0.2mM 2,2’-アジノ-ビス3-エチルベンズチアゾリン-スルホン酸[Sigma Aldrich、Milwaukee、USA])と一緒に用いて結合抗体を検出した。酵素基質反応によって誘導される発色を15分間進行させ、50mMフッ化ナトリウム(BDH Chemicals、Australia)の添加によって停止した。Labsystems Multiscan Multisoftマイクロプレートリーダー(Pathtech Diagnostics、Australia)を用いて、405nm(450nmで波長補正)における吸光度読取値を判定した。抗体力価は、0.2の光学濃度を達成するのに必要とされた血清の最も高い希釈の逆数で表す。
特異的CD8+T細胞媒介サイトカイン産生の検出のために、マウスに第3の用量のOVA(25μg)を生理食塩水で、またはCFAに乳濁させて、または異なる量のR4(S2Pam2Cys)と混合して投与した。7日後、脾臓を接種マウスから得、圧力で金属篩を通して単一細胞懸濁液を得た。次に、組換えIL-2(10U/ml; Roche、Mannheim、Germany)の存在下で、OVA258〜265ペプチドSIINFEKL(2μg/ml)の有り無しで、同系照射(2200ラド、60Co源)を受けたナイーブな脾細胞(5×105)と一緒に脾細胞(1×106)を培養した。Cytofix/Cytoperm Plus Kit(Becton Dickinson、USA)からのBD GolgiPlugの形のブレフェルジンA(1μg/ml)も、この培養に含まれた。6時間後に、リンパ球をFAC洗浄液で洗浄し、4℃で30分間、PerCPコンジュゲートラット抗マウスCD8抗体(クローン53-6.7; Becton Dickinson、USA)で染色した。次に、製造業者の指示によりCytofix/Cytoperm溶液(Cytofix/Cytoperm Plus Kit、Becton Dickinson、USA)を用いて4℃で20分間、固定および透過化処理を実施した。キットによって供給されたPerm/Wash溶液で細胞を一度洗浄し、4℃で30分間、FITCコンジュゲートラット抗マウスIFN-γ抗体(クローンXMG1.2; Becton Dickinson、USA)で染色し、その後フローサイトメトリーによって分析した。FlowJoソフトウェア(Treestar Inc、USA)を用いてデータ分析を実施した。生きている生存細胞をそれらの前方および側方拡散特性に基づいてゲーティングし、合計1×105 CD8+細胞を計数した。
OVA(1nmole)を、平底96ウェルプレート中の100μl PBSの総容量で、分枝状R4(S2Pam2Cys)または線状Pam2Cys-SK4リポペプチドの漸増量と混合した。次に各ウェル中の溶液の混濁度を、Labsystems Multiscan Multisoftマイクロプレートリーダーで450nmでのその光学濃度を測定することによって決定した。
序論
タンパク質抗原、特に組換えタンパク質はしばしば免疫原性でないことがあり、それらの免疫原性を増強するために、アジュバントを用いた製剤化が必要であるが、それらがヒトでの使用のために認可される前にアジュバント毒性に対する懸念およびそれらの作用機構が解決される必要がある。したがって、樹状細胞などの抗原提示細胞を直接標的にし、同時に活性化することによってタンパク質抗原の送達を促進することができる、新規系の開発が有利であることが判明し得る。
リポペプチドR4(S2Pam2Cys)は、4つのN末端アルギニン残基(各アルギニンは+2電荷を有する)の存在のために、+8の総電荷を有する。R4(S2Pam2Cys)が静電的相互作用を通してタンパク質免疫原性を増強することができるかを判断するために、11の総負電荷を有するオボアルブミン(OVA)をモデルタンパク質抗原として用いた。
これらの知見は、正または負に荷電した分岐状リポペプチドを、逆荷電のタンパク質の免疫原性を増強するために用いることができることを示す。これは、OVA特異的応答を誘導することができるが、HEL特異的応答を増大することができないR4(S2Pam2Cys)を用いることにより、特に鮮明にされる。このリポペプチドの正電荷および調べたタンパク質のそれらを考慮すると、観察される効果は、おそらくPam2Cys部分と抗原との間の静電的相互作用、またはそこでの欠落に起因する。この仮説を確認するさらなる研究は、同じかまたは反対に荷電したタンパク質抗原、ならびに中性電荷を有する分枝状リポペプチドの組入れを用いるクロマトグラフィーの分析法およびさらなるインビボ試験を通して達成することができる。
モデル抗原オボアルブミン(OVA)と複合体を形成する分枝状R4(S2Pam2Cys)および線状Pam2Cys-SK4リポペプチドの能力を測定するために、各リポペプチドおよびOVAの漸増量を含む溶液の吸光度を、450nmでの光学濃度を測定することによって決定した(図3)。したがって、OVAとの複合体を形成させる各リポペプチドの能力は、2つの化合物間の結合を示すことになる。
(参考文献)
Claims (20)
- 抗原および樹状細胞ターゲッティング成分を含む免疫原性組成物であって、抗原は正荷電領域を含み、樹状細胞ターゲッティング成分は樹状細胞リガンドに共有結合している負荷電基を含み、抗原の正荷電領域は樹状細胞ターゲッティング成分と静電気的に会合している、免疫原性組成物。
- 抗原が総正電荷を有する、請求項2に記載の免疫原性組成物。
- 負荷電基が少なくとも1つの負荷電アミノ酸を含む、請求項1または請求項2に記載の免疫原性組成物。
- 負荷電基が分枝状または線状のペプチドである、請求項1から3のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- ペプチドが少なくとも1つのアスパラギン酸またはグルタミン酸残基を含む、請求項4に記載の免疫原性組成物。
- ペプチドが、少なくとも4つのアスパラギン酸残基および/または少なくとも4つのグルタミン酸残基を含む、請求項4または請求項5に記載の免疫原性組成物。
- 抗原が核酸でない、請求項1から6のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 静電的相互作用だけによって抗原が樹状細胞ターゲッティング成分と会合している、請求項1から7のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 樹状細胞リガンドがTLRリガンドである、請求項1から8のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- TLRリガンドが脂質またはペプチドグリカンまたはリポタンパク質またはリポ多糖を含む、請求項9に記載の免疫原性組成物。
- TLRリガンドがパルミトイル、ミリストイル、ステアロイル、ラウロイル、オクタノイルまたはデカノイルを含む、請求項9または請求項10に記載の免疫原性組成物。
- TLRリガンドがPam2Cys、Pam3Cys、Ste2Cys、Lau2CysおよびOct2Cysからなる群から選択される、請求項9から11のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- TLRリガンドがTLR-1、TLR-2またはTLR-6のいずれかに結合する、請求項9から12のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- TLRリガンドがTLR-2に結合する、請求項9から13のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
- 請求項1から14のいずれか一項に記載の免疫原生組成物であって、
前記負荷電基が、少なくとも4個の正荷電アミノ酸残基を含む分枝状ペプチドを含み、
前記分枝状ペプチドが、
式中、各Xが、独立してアスパラギン酸またはグルタミン酸残基である、免疫原性組成物。 - 前記負荷電基が、以下の構造
- 前記負荷電基が、以下の構造
- 前記樹状細胞ターゲッティング成分が、以下の構造
- 前記樹状細胞ターゲティング成分が、以下の構造
- 対象に免疫応答を起こすために使用するための請求項1から19のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
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JPN6013048989; J Immunol, vol.169, p.4905-4912 (2002) * |
JPN6013048990; J Hepatol, vol.48, (2008) p.S236 634 * |
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