JP2014108073A

JP2014108073A - 組み換えヒト膵臓リパーゼの調製方法

Info

Publication number: JP2014108073A
Application number: JP2012263442A
Authority: JP
Inventors: Atsuko Ogawa; 温子小川; Kyoko Aikawa; 京子相川; Chihiro Tomita; 千尋富田; Rina Naradate; 里奈楢舘; Tomoko Higami; 智子樋上
Original assignee: Ochanomizu University
Current assignee: Ochanomizu University
Priority date: 2012-11-30
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2014-06-12
Anticipated expiration: 2032-11-30
Also published as: JP6086378B2

Abstract

【課題】天然ブタ膵リパーゼに近い比活性をもつ組換えヒト膵臓リパーゼ（ｒｅｃＨＰＬ）を大量に調製する方法を提供すること。
【解決手段】（ａ）ＨＰＬｃＤＮＡに、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIをＣ末側に付加した発現プラスミドを構築する工程；（ｂ）構築した発現プラスミドを大腸菌に導入した後に培養して、大腸菌内にＨＰＬを発現させる工程；（ｃ）前記大腸菌を破砕した大腸菌溶解物から、ストレプタクチンを担持したセファロースを用いてＨＰＬをワンステップで精製する工程；及び（ｄ）精製したＨＰＬを、Ｃａ^２＋添加し尿素濃度を段階的に低下させるグリセロール段階透析法を用いて活性化するリフォールディング工程；の各工程を順次備えるｒｅｃＨＰＬの調製方法とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、組換えヒト膵臓リパーゼ（ｒｅｃＨＰＬ）の調製方法、より詳しくは、Ｃ末側にＳｔｒｅｐ−ｔａｇIIを付加して精製したＨＰＬを、段階透析法を利用してリフォールディングするｒｅｃＨＰＬの調製方法に関する。

ヒト膵リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３．）は、膵腺房細胞で合成され膵液中に分泌される分子量約４万８千の糖タンパク質である。膵リパーゼはトリグリセリドのα位脂肪酸エステルを加水分解し、ジグリセリド成分と遊離の脂肪酸へ分解する。

ヒト膵リパーゼの大量発現法としては、昆虫細胞ｓｆ６を用いて発現させる方法（例えば、非特許文献１参照）、チャイニーズハムスター由来細胞Ｖ７９を用いて発現させる方法（例えば、非特許文献２参照）、酵母を用いて発現させる方法（例えば、非特許文献３参照）が知られている。しかし、これらの方法はいずれもコストが非常にかかる上、発現に６〜１０日間を要する。また、いずれの方法においても、リパーゼにヒト型ではない糖鎖が修飾される場合があるため、ヒトがこれらリパーゼを摂取するとアレルギーが引き起こされたり、生体内での安定性が変わる可能性があり、安全性に乏しいと言える。このため、より短期間で発現でき、かつ糖鎖の修飾が起こらない、大腸菌を用いた大量発現方法の開発が求められている。

他方、大腸菌を用いてリパーゼを発現させる方法としては、ジオバチルス属の耐熱性Ｔ１リパーゼをＧＳＴタグを組み込んだ融合タンパクとして発現させる方法（例えば、特許文献１参照）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の成熟リパーゼ（ＳＡＬ３）を、Ｎ末端側にＨｉｓ_６タグを組み込んだ融合タンパクとして発現させる方法（例えば、非特許文献４参照）、Candida antarctica由来のリパーゼを、Ｎ末端側にＦＬＡＧタグ、あるいはＣ末端側にＨｉｓ_６タグを組み込んだ融合タンパクとしてそれぞれ発現させる方法（例えば、非特許文献５参照）、Ralstonia sp.M1由来のリパーゼを、Ｈｉｓ_６タグを組み込んだ融合タンパクとして発現させる方法（例えば、非特許文献６参照）が知られている。また、デンプン結合性タンパク質（ＳＢＰ）タグを使用する、大腸菌で発現した組換えリパーゼの精製方法（例えば、特許文献２参照）も知られている。これらタグ付きリパーゼにはいずれも酵素活性がみられているが、大量発現系の確立には至っておらず、また、微生物由来のリパーゼとは構造の異なるヒト型リパーゼを大腸菌で発現させる方法については一切考慮されていない。

特開２００６−０４２８２０号公報特開２０１０−２６３８９２号公報

Thirstrup, K. et al., FEBS Lett. 19;327(1): p79-84, 1993 Canalias, F. et al., Clin. Chem. 40(7 Pt 1): p1251-7, 1994 Yang, Y. et al., Protein Expr. Purif. 13(1): p36-40, 1998 Horchani, H. et al., J. Mol. Catal. B. Enzym., 61: p194-201, 2009 Blank, K. et al., J. Biotechnol., 125(4): p474-483, 2006 Quyen, D. T. et al., Protein Expr. Purif. 39(1): p97-106, 2005

本発明の課題は、高活性をもつＨＰＬの安価かつ大量調製を可能にするため方法を提供することにある。

ＨＰＬを大腸菌で発現させる報告はまだ無く、昆虫細胞や哺乳類細胞での発現例が報告されていた。大腸菌を用いてのＨＰＬの大量調製を可能にするため、われわれはヒト膵リパーゼのｃＤＮＡをクローニングし、ＨＰＬをＨｉｓ−ｔａｇ標識体として大腸菌で発現させ、その精製を試みた。しかし他のタンパク質には有効な、Ｎｉ^２＋やＣｏ^２＋を含むキレートカラム法では、Ｈｉｓ−ｔａｇ標識膵リパーゼは精製できなかった。リパーゼタンパク質の疎水性領域がＨｉｓ−ｔａｇ標識膵リパーゼの精製を妨害しているのではないかと考え、親水性タンパク質であるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をＮ末端側に融合したＨＰＬを発現させた。その結果、グルタチオンカラムを用いて該タンパク質を精製に成功し、１Ｌの培養液から約１ｍｇのＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬが得られた。しかし、ＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬはリフォールディングを行っても、脂質分解活性が発現しなかった。そこでさらに標識タグを検討した結果、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIによる標識法により、１Ｌの培養液から１８ｍｇの精製ｒｅｃＨＰＬを得ることに成功し、検討した中で最も収率の高い精製を達成できた。さらにリフォールディング条件を検討し、天然物の約半分の比活性を持つｒｅｃＨＰＬを得た。本発明は、以上の知見に基づき完成するに至ったものである

すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を備えることを特徴とする組換えヒト膵臓リパーゼ（ｒｅｃＨＰＬ）の調製方法。
（ａ）ＨＰＬｃＤＮＡに、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIをＣ末側に付加した発現プラスミドを構築する工程；
（ｂ）構築した発現プラスミドを大腸菌に導入した後に培養して、大腸菌内にＨＰＬを発現させる工程；
（ｃ）前記大腸菌を破砕した大腸菌溶解物から、ストレプタクチンを担持した吸着体を用いてＨＰＬをワンステップで精製する工程；
（ｄ）精製したＨＰＬを、尿素濃度を段階的に低下させるグリセロール添加段階透析法を用いて活性化するリフォールディング工程；
（２）ストレプタクチンを担持した吸着体が、ストレプタクチンを担持したセファロースであることを特徴とする上記（１）記載のｒｅｃＨＰＬの調製方法。
（３）グリセロール添加段階透析法が、グリセロールに加えてＣａ^２＋を添加する段階透析法であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載のｒｅｃＨＰＬの調製方法。
（４）尿素濃度を８Ｍから０Ｍに段階的に低下させることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のｒｅｃＨＰＬの調製方法。
（５）１０％グリセロールを用いることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載のｒｅｃＨＰＬの調製方法。
（６）２．５〜５ｍＭＣａ^２＋を用いることを特徴とする上記（３）〜（５）のいずれか記載のｒｅｃＨＰＬの調製方法。
（７）グリセロール添加段階透析法が、酸化剤／還元剤としてシスチン／システインを用いる段階透析法であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載のｒｅｃＨＰＬの調製方法。

本発明によると、天然ブタ膵リパーゼに近い比活性をもつｒｅｃＨＰＬを大量に調製することができる。また、昆虫細胞や酵母を用いてＨＰＬを発現させるには、６〜１０日間を要する。これに対し大腸菌を用いた本発明では、発現に要する時間は１日、段階透析法によるリフォールディングに２日の、計３日間でＨＰＬの発現が可能である。

プラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）−ｒｅｃＨＰＬ（制限酵素認識配列あり）のベクターマップである。ｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６が溶解している大腸菌画分を、ウエスタンブロット法を用いて染色した結果を示す図である。可溶化したｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６をアフィニティカラムを用いて精製した際に得られた溶出曲線をグラフにしたものである。可溶化したｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６と、図３のグラフのピークの画分３つを濃縮したものとに対し、銀染色を行った結果を示す図である。プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１−ＨＰＬのベクターマップである。可溶化したＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬをアフィニティカラムを用いて精製した際に得られた溶出曲線をグラフにしたものである。可溶化したＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬと、図６で示されたピーク画分とに対し、銀染色及びウエスタンブロット法を行った結果を示す図である。天然ブタリパーゼ（ＰＰＬ）、ＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬ及びｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIに対し、ｐＨ−ｓｔａｔ法を用いて酵素活性を調べた結果を示す図である。プラスミドｐＡＳＫ−ＩＢＡ３Ｐｌｕｓ−ＨＰＬのベクターマップである。粗精製したｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法及びウエスタンブロット法を用いて染色した結果を示す図である。可溶化したｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIを、アフィニティカラムを用いて精製した際に得られた溶出曲線をグラフにしたものである。可溶化したＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬと、図１１で示されたピーク画分とに対し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法及びウエスタンブロット法を行った結果を示す図である。カルシムイオン濃度の違いによる、ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの酵素活性の差異を示した図である。各添加剤存在下での、ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの酵素活性を示した図である。ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIをＨＰＬＣにかけた際の、溶出画分のクロマトグラフである。図１５のピークの画分２つに対し、ｐＨ−ｓｔａｔ法を用いて酵素活性を調べた結果を示す図である。ＣＤスペクトルによるｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの二次構造解析を示した図である。

本発明のｒｅｃＨＰＬの調製方法としては、（ａ）ＨＰＬｃＤＮＡに、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIをＣ末側に付加した発現プラスミドを構築する工程；（ｂ）構築した発現プラスミドを大腸菌に導入した後に培養して、大腸菌内にＨＰＬを発現させる工程；（ｃ）前記大腸菌を破砕した大腸菌溶解物から、ストレプタクチンを担持した吸着体を用いてＨＰＬをワンステップで精製する工程；及び（ｄ）精製したＨＰＬを、尿素濃度を段階的に低下させるグリセロール添加段階透析法を用いて活性化するリフォールディング工程；の各工程を備える方法であれば特に制限されず、上記大腸菌としては、一般的にタンパク質の発現に用いられる菌株であれば特に制限されず、例えば、ＨＳＴ０８、ＨＳＴ０４、ＨＳＴ０２、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＣＪ２３６、ＢＭＨ７１−１８、ＭＶ１１８４、ＴＨ２、ＨＳＴ１６ＣＲ、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）などを挙げることができる。

上記工程（ａ）におけるＨＰＬｃＤＮＡは、公知のヒトＲＮＡ塩基配列もしくはヒトｃＤＮＡ塩基配列、市販のヒトｃＤＮＡテンプレート等を鋳型として用いることにより得ることができる。ＲＮＡを鋳型として用いてＨＰＬｃＤＮＡを得る場合には、ｃＤＮＡ配列に特異的なプライマーを用いる方法や、６塩基から８塩基程度からなるランダムプライマーを用いてｃＤＮＡ合成を開始させる等の方法が挙げられる。また、ｃＤＮＡを鋳型として用いてＨＰＬｃＤＮＡを得る場合には、ＰＣＲ法を用い、該塩基配列がコードする遺伝子を増幅すればよい。

上記工程（ａ）において、ＨＰＬｃＤＮＡに８残基のアミノ酸（Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys；配列番号１）からなるＳｔｒｅｐ−ｔａｇIIをＣ末側に付加した発現プラスミドを構築する方法としては、ｐＥＴＳｙｓｔｅｍｓ（Novagen社製）、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒＳｙｓｔｅｍｓ（Promega社製）等の一般的な大腸菌用発現プラスミドに、ＨＰＬｃＤＮＡ配列及び上記８残基のアミノ酸を発現させる塩基配列を組み込むことで構築することもできるが、ストレプトアビジンを遺伝子工学的に改変したストレプタクチン（Strep-Tactin）に結合するＳｔｒｅｐ−ｔａｇIIを融合させた組換え体タンパク質を大腸菌内で発現させるための市販のベクター、例えば、ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３Ｐｌｕｓ（IBA社製）を用いることもできる。

Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIをＣ末側に付加したＨＰＬのアミノ酸配列を配列番号２に、塩基配列を配列番号３に示す。

上記工程（ｂ）において、構築した発現プラスミドの大腸菌への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（transvection）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（scrape loading）、弾丸導入（ballistic introduction）、感染等により行うことができる。

上記工程（ｂ）における発現プラスミドを導入した大腸菌の培養条件としては、大腸菌を培養する培地、培養時間などの培養条件も、それぞれの大腸菌の生育に適したものであれば特に制限されず、例えば、上記培地としては、ＬＢ培地、ＳＯＢ培地、ＳＯＣ培地等を挙げることができる。培養温度は４〜３７℃、好ましくは２５〜３７℃が挙げられる。培養ｐＨはｐＨ６．５〜７．４、好ましくはｐＨ７．２が挙げられる。培養期間は、培養液のＯＤ_５５０値が０．４〜１を満たすことができればよい。また、ＨＰＬの発現を誘導するために、用いたプラスミドに対応する発現誘導物質を適宜添加することが好ましい。発現誘導物質の例としては、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）、無水テトラサイクリン（ＡＨＴ）等が挙げられ、添加濃度は特に制限されない。

上記工程（Ｃ）において、大腸菌を破砕して大腸菌溶解物を調製する方法としては、培養終了後、大腸菌を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機などの適当な手段により大腸菌を破砕し、無細胞抽出液を得た後、該無細胞抽出液を遠心分離することにより上清を得る方法を例示することができる。このようにして得られた大腸菌溶解物は、ストレプタクチンを担持した吸着体が充填されたカラムやバッチに送通され、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIをＣ末側に付加したＨＰＬが吸着され、デスチオビオチンを含む溶離液を用いることにより、ＨＰＬをワンステップで精製することができる。ここで、ＨＰＬをワンステップで精製するとは、前記大腸菌溶解物を、１種類のストレプタクチンを担持した吸着体に１度だけ適用することによって、充分な純度及び濃度のＨＰＬ溶解液が得られるということを意味する。

上記ストレプタクチンを担持した吸着体としては、一般的なアフィニティクロマトグラフィーに用いられる吸着体（担体）であればよく、具体的には、アガロース糖鎖を架橋したアガロース系担体、デキストラン糖鎖を架橋したデキストラン系担体、アクリルアミドを架橋したアクリルアミド系担体等を例示することができる。いずれの担体においても、担体濃度、粒子径の大きさ、架橋された担体の割合がＨＰＬの分子量に見合った条件であれば特に制限されず、例えば、アガロース系担体としてはセファロース、スーパーロース等、デキストラン系担体としてはセファデックス、スーパーデックス等、アクリルアミド系担体としてはセファクリル等を挙げることができるが、取り扱いの簡便性からセファロースが好ましく、また、ストレプタクチンセファロースは市販品を用いることができる。

上記工程（ｄ）における「グリセロール添加段階透析法」に用いる透析膜としては、ＨＰＬの分子量に適したものであれば特に指定されない。膜の材質としては、再生セルロース（セロファン）、アセチルセルロース、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール、テフロン、ポリエステル系ポリマーアロイ、ポリスルホン、ポリアミドなどを挙げることができるが、再生セルロースが好ましい。透析装置は、公知の手法に基づいた装置を用いることができる。

上記工程（ｄ）における「グリセロール添加段階透析法」とは、段階透析に用いる透析溶液にグリセロールを添加し、透析を行う方法をいう。透析溶液に添加するグリセロールの濃度は、５〜２０％、好ましくは１０％を挙げることができる。

上記工程（ｄ）における「グリセロール添加段階透析法」においては、尿素濃度を１０〜５Ｍ、好ましくは８Ｍから０Ｍに段階的に低下させることが好ましい。この、尿素濃度が異なる各段階ごとの透析時間は、透析装置の規模に適したものであれば特に限定されない。

上記工程（ｄ）、すなわち、精製したＨＰＬを、尿素濃度を段階的に低下させるグリセロール添加段階透析法を用いて活性化するリフォールディング工程においては、透析液のＣａ^２＋濃度は制限されないが、Ｃａ^２＋を添加することが好ましく、添加するＣａ^２＋濃度は０〜１０ｍＭ、好ましくは２．５〜１０ｍＭ、さらに好ましくは２．５〜５．０ｍＭ、中でも２．５ｍＭを挙げることができる。Ｃａ^２＋を添加するために用いる化合物としては塩化カルシウム２水和物、酢酸カルシウムなどを挙げることができる。

上記工程（ｄ）において、精製したＨＰＬをグリセロール添加段階透析法を用いて活性化する際、酸化剤／還元剤としては、シスチン／システインや、酸化型グルタチオン／還元型グルタチオンを添加することが好ましいが、価格が安価であることから、シスチン／システインが望ましい。例えば、シスチン／システインの添加濃度としては、シスチンの濃度は０．１〜１ｍＭ、システインの濃度は１〜０．１ｍＭを挙げることができるが、０．１ｍＭシスチン／１ｍＭシステインが好ましい。

以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

［ＨＰＬのクローニング］
（１）ＨＰＬｃＤＮＡのＰＣＲ法による増幅
効率良くＨＰＬｃＤＮＡを増幅するため、まずは制限酵素認識配列がないＤＮＡを合成し、次に制限酵素認識配列を付加することとし、ＨＰＬの塩基配列（配列番号４）に基づいて、プライマー１（配列番号５）、プライマー２（配列番号６）、プライマー３（配列番号７）、プライマー４（配列番号８）を作製した。
ヒト膵臓ｃＤＮＡテンプレート（Clontech社製）を鋳型とし、プライマー１及びプライマー２を用い、ＰＣＲ法により配列番号４の塩基配列がコードする遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応はPTC-200 Peltier Thermal Cycler（MJ Research社製）を用い、９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分を３０サイクル行った。得られたＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動法を用いて精製した。

（２）インサートｃＤＮＡの作成
得られたＨＰＬｃＤＮＡを増幅するため、ライゲーション効率の良いＴＯＰＯＴＡクローニングを行った。まず、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen社製）を用い、ＨＰＬｃＤＮＡの３’末にアデニンを付加した。得られた生成物とｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（Promega社製）をライゲーションし、プラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ−ＨＰＬ）を得た。得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ社製）に形質転換させ、大量培養を行った後に、アルカリ法、エタノール沈殿法を行い、プラスミドを精製した。

得られたプラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ−ＨＰＬ）をテンプレートとして用い、プライマー３と４でＰＣＲを行うことで、制限酵素認識配列がついたＨＰＬｃＤＮＡインサートを合成した。ＰＣＲ反応はPTC-200 Peltier Thermal Cycler(MJ Research社製)を用い、９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分を３０サイクル行った。得られたインサートをアガロースゲル電気泳動法にて精製した後、もう一度ＴＯＰＯＴＡクローニングを行い、インサートを大量に調製した。

（３）制限酵素処理とライゲーション
制限酵素認識配列をつけたｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ−ＨＰＬを制限酵素ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）及びＮｄｅＩ（タカラバイオ社製）で切断し、インサートを得た。ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミド（Novagen社製）も同様にＢａｍＨＩとＮｄｅＩを用いて切断し、ベクターを作成した。得られたインサートとプラスミドをライゲーションし、プラスミド（ｐＥＴ−２２ｂ（＋）−ＨＰＬ）を得た。得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ社製）に形質転換させ、大量培養を行った後に、QIAGEN Plasmid Midi Kit（QIAGEN社製)を用いてプラスミドを抽出、精製した。
得られたｐＥＴ−２２ｂ（＋）−ＨＰＬは、オートシークエンサー（3100-Avant Genetic Analyzer、Applied Biosystems社製）を用いて塩基配列を確認した。

［ｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６の作製］
（１）Ｈｉｓ_６タグを付けたｒｅｃＨＰＬ発現ベクターの調製
リパーゼはＮ末ドメインに活性部位があり、Ｎ末端側にＨｉｓ_６タグ（６つのヒスチジンから成る）をつけると活性が下がることが知られている（Di Lorenzo, M., et al., Appl Environ Microbiol, 71: p8974-7, 2005）。ｐＥＴ２２ｂ（＋）はインサートのＣ末端側にＨｉｓ_６タグが付加されるように設計されているが、終止コドンが存在するとヒスチジンが発現されない。そのため、部位特異的変異を行い、ＨＰＬｃＤＮＡの終止コドンをセリンに変えた。
プライマー５（配列番号９）、プライマー６（配列番号１０）を作製し、QuikChange ^TMSite-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社製）を用い、付属の説明書に従ってｐＥＴ−２２ｂ（＋）−ＨＰＬ（制限酵素認識配列あり）に変異を起こした。ＰＣＲ反応はPTC-200 Peltier Thermal Cycler（MJ Research社製）を用い、９５℃で３０秒、５５℃で１分、６８℃で７分を１２サイクル行った。
得られたＰＣＲ産物を用いて、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られた大腸菌の大量培養を行った後、アルカリ法を行い、プラスミド（ｐＥＴ−２２ｂ（＋）−ｒｅｃＨＰＬ（制限酵素認識配列あり））を精製した。得られたプラスミドは、オートシークエンサー（3100-Avant Genetic Analyzer、Applied Biosystems社製）を用いて塩基配列確認を確認した。作製したベクターマップを図１に示す。

（２）ｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６の発現
得られたｐＥＴ−２２ｂ（＋）−ｒｅｃＨＰＬを、大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）に導入し、目的タンパク質の発現を行った。
ｐＥＴ−２２ｂ（＋）−ｒｅｃＨＰＬを、大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）（Novagen社製）に導入した。得られた大腸菌をＬＢプレートに捲き、３７℃で一晩培養後、コロニーを採り、ＬＢ液体培地に植え、さらに培養した。ＯＤ_５５０＝０．４〜１に達するまで培養した後、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）（和光純薬製）を加えてさらに培養した。培地を遠心しペレットを回収した後、洗浄バッファー（５０ｍＭＴＢＳ、２ｍＭベンズアミジン、０．２５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、ｐＨ８．０）で洗浄し、遠心した。得られたペレットを洗浄バッファーに溶解し、超音波破砕機（SONI FIER250、BRANSON社製）を用いて超音波破砕を行った。得られたライセートを再び遠心し、ペレットを回収した。

得られたペレット内にはｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６が封入体として存在しているため、可溶化を行った。
大量培養し回収した大腸菌に超音波破砕を行い、得られたペレットに、０．５％（ｖ/ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／洗浄バッファーを加えて可溶化し、遠心で上清を除去した。得られたペレットを洗浄バッファーで洗浄し、尿酸バッファー（８Ｍ尿酸、５０ｍＭリン酸バッファー、３００ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭベンズアミド、０．２５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、ｐＨ８．０）を加え可溶化後、遠心してｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６が溶解している上清を得た。

得られたｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６溶解画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法及びウエスタンブロット法を用いてＰＶＤＦ膜に転写し、抗ヒトリパーゼ抗体ＩｇＧｓ（THE BINDING SITE LTD社製）を用いて染色し、ｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６の発現を確認した。（図２）
図２において、「＋Ｈ」はｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６、「−Ｈ」は上記方法と同様にしてタグの付いていないｒｅｃＨＰＬを、それぞれ発現させた大腸菌の抽出物を示している。また、「Ｏ」は、形質転換を行っていない大腸菌の抽出物を示している。抗ヒトリパーゼ抗体により、ｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６及びｒｅｃＨＰＬが、形質転換を行った大腸菌それぞれに発現していることが示された。

（３）ｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６の精製
可溶化したｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６は、尿素またはジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いてリフォールディングした（Role of arginine in protein refolding, solubilization, and purification. Biotechnol Prog, 20(5): p1301-1308, 2004）。
可溶化したｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６溶液に、ＤＴＴ（終濃度１０ｍＭ）を加え、３７℃、３０分間反応させ、ジスルフィド結合を切断した。その後、塩酸グアニジンまたは尿素濃度を段階的に希釈しながら４℃で透析することにより、ｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６のリフォールディングを行った。尿素を用いる場合には、尿素濃度を８Ｍ、４Ｍ、２Ｍ、１Ｍ、０．５Ｍ、０Ｍと、段階的に希釈した。また、尿素濃度が１Ｍ及び０．５Ｍの際には、リフォールディング促進剤として、４００ｍＭＬ-アルギニン塩酸塩及び、酸化剤／還元剤として０．１ｍＭシスチン／１ｍＭシステインを加えた。尿素濃度が０Ｍである最後の透析は、３回行った。

リフォールディングしたｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６にTALON Metal Affinity Resin（Clontech社製）を加え、バッチ法により吸着させた。溶出液には、イミダゾール濃度が１、５、１０、５０、１００ｍＭであるイミダゾール溶液（４５ｍＭリン酸バッファー、２７０ｍＭ塩化ナトリウム、８Ｍ尿素）を用い、段階溶出した。各画分の一部（１００又は２００μＬ）をマイクロプレート（９６穴UVstarプレート、Greiner bio one社製）に分取し、マイクロプレートリーダー（Model 680、Bio-Rad社製）を用い、各溶出画分の２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。

得られた溶出画分の吸光度をグラフにしたものが図３である。図３は、縦軸が吸光度、横軸がフラクションナンバーを示している。ここで得られた３つのピークに該たる画分を透析し、イミダゾールを除いた。その後濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法及び銀染色を行ったのが図４である。
図３における「ｐｅａｋ１〜３」の溶出画分の銀染色を行ったのが、図４の「ｐｅａｋ１〜３」である。図４を見ると、図３のピーク３部分の溶出画分より、ｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６相当分子量のバンドが検出されている。しかし、メジャーバンドが他にも多く見られており、均一性、ｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６の収率共に、満足な結果を得ることは出来なかった。

［ＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬの作製］
（１）ＧＳＴタグを付けたｒｅｃＨＰＬ発現ベクターの調製
ｐＥＴ−２２ｂ（＋）−ＨＰＬを鋳型とし、プライマー７（配列番号１１）、プライマー８（配列番号１２）を用いてＰＣＲを行った。反応にはサーマルサイクラー（ZYMOREACTORII、ATTO社製）を用い、９４℃で１５秒、６５℃で３０秒、６８℃で１分を２５サイクル行った。得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動法を用いて精製した後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用いて精製した。

精製したＰＣＲ産物を、TArget CloneTM-Plus-（TOYOBO社製）を用いたＴＡクローニング法により、サブクローニングした。得られた生成物と上記キット中のｐＴＡ２（TOYOBO社製）をライゲーションし、プラスミド（ｐＴＡ２−ＨＰＬ）を得た。得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ社製）に形質転換させ、大量培養を行った後に、QIAprep Spin Miniprep Kit （QIAGEN社製）を用いプラスミドｐＴＡ２−ＨＰＬを抽出、精製した。

ｐＴＡ２−ＨＰＬを制限酵素ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）及びＮｄｅＩ（タカラバイオ社製）で切断し、インサートを得た。ｐＧＥＸ−６Ｐ−１プラスミド（GE Healthcare社製）も同様にＢａｍＨＩとＮｄｅＩを用いて切断し、ベクターを作成した。得られたインサートとベクターをライゲーションし、プラスミド（ｐＧＥＸ−６Ｐ−１−ＨＰＬ）を得た。
得られたｐＧＥＸ−６Ｐ−１−ＨＰＬは、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）を用いたＰＣＲにより増幅した後、BigDye XTerminator精製キット（Applied Biosystems社製）を用いて精製し、ＤＮＡシーケンサーABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）で解析し、塩基配列を調べた。さらに、得られた結果を遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX（ゼネッティックス社製)で分析した。作製したベクターマップを図５に示す。

（２）ＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬの発現
得られたｐＧＥＸ−６Ｐ−１−ＨＰＬを、大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ社製）に導入し、目的タンパク質の発現を行った。大腸菌への導入、タンパクの発現及び回収は、ｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６と同様に行った。
得られたペレット内にはＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬが封入体として存在しているため、可溶化を行った。可溶化剤にはＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いた。これは、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いた可溶化では、タンパク質の高次構造を保ったまま可溶化することが可能であり、リフォールディングを行う必要がなくなるためである。
大量培養し回収した大腸菌に超音波破砕を行い、得られたペレットに、可溶化バッファー（１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭＴＢＳ（ｐＨ７．５））を加え可溶化後、遠心してＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬが溶解している上清を得た。
得られたＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬ溶解画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法及びウエスタンブロット法を用いてＰＶＤＦ膜に転写し、ウサギ抗ＧＳＴ抗体（発明者が作製）及び抗ヒトリパーゼ抗体ＩｇＧｓ（THE BINDING SITE LTD社製）を用いて染色し、ＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬの発現を確認した。

（３）ＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬの精製
可溶化したＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬにＧＳＨセファロースを加え、バッチ法により吸着させた。溶出液には還元型ＧＳＨ溶液（１０ｍＭ還元型ＧＳＨ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を用い、溶出した。紫外可視分光光度計Ubest-55（日本分光社製）を用い、各溶出画分の２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度の高かった溶出画分を精製水に対して透析した。

得られた溶出画分の吸光度をグラフにしたものが図６である。図６は、縦軸が吸光度、横軸がフラクションナンバーを示している。得られたＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬ精製画分は、銀染色法及びウエスタンブロット法を用いて、精製を確認した。（図７）
図６より、ＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬが含まれるとみられる溶出画分のピークはごく低く、ＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬの収量が低いことが示された。また、図７において、「抽」は可溶化したＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬ画分、「溶出」は図６におけるピークの画分をそれぞれ、銀染色、抗ヒトリパーゼ抗体ＩｇＧｓによる染色、及び抗ＧＳＴ抗体による染色を行った結果を示している。いずれの染色方法においてもＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬ相当分子量のバンドが検出されたが、溶出画分の各バンドはいずれも薄く、ＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬの収率では満足な結果を得ることは出来なかった。

（４）ＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬの酵素活性
ｒｅｃＨＰＬの活性測定は、自動電位差滴定装置AT-510（京都電子工業社製）を用い、ｐＨ−ｓｔａｔ法により測定した。
基質にはトリブチリン（和光純薬工業社製）を用いた。トリブチリンをエマルジョン溶液（１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４ｍＭタウロデオキシコール酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム）にて希釈し、終濃度を０．１１Ｍとした。この溶液を攪拌しているところに、予め３７℃で１５分間インキュベートしておいた酵素溶液（０．１３ｍｇ／ｍＬｒｅｃＨＰＬ、１ｍｇ／ｍＬコリパーゼ１μＬ含エマルジョン溶液）を加えた。３７℃の下、ｐＨ７．５３±０．０３を維持するように、０．０１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いて滴定した。酵素溶液を加えた５分後から１５分後までの１０分間における水酸化ナトリウム滴定速度、すなわち脂肪酸遊離速度を求め、１Ｕ＝単位時間当たりの遊離脂肪酸量（μｍｏｌ／ｍｉｎ）として、リパーゼの比活性を求めた。
脂肪酸遊離速度（μｍｏｌ／ｍｉｎ）＝水酸化ナトリウム濃度（μＭ）×水酸化ナトリウム滴定速度（Ｌ／ｍｉｎ）
比活性（Ｕ／ｍｇ）＝脂肪酸遊離速度（μｍｏｌ／ｍｉｎ）÷リパーゼ量（ｍｇ）

ｐＨ−ｓｔａｔ法により酵素活性を調べた際の、水酸化ナトリウム溶液の滴定量を示したのが図８である。図８において、縦軸はｐＨ（左軸）及び水酸化ナトリウム溶液の滴下量（右軸）、横軸は経過時間を示している。グラフ上方のｐＨ以外のデータは、各リパーゼ存在下での水酸化ナトリウム溶液の滴下量を示している。対照として用いたブタ膵臓リパーゼ（ＰＰＬ）の測定結果を見ると、ｐＨが一定に保たれているにもかかわらず水酸化ナトリウム溶液の滴定量は一定の割合で増加しており、これは、ＰＰＬに酵素活性があることを示している。これに対し、ＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬでは、酵素溶液を加えた５分後から１５分後までの１０分間において水酸化ナトリウム溶液の滴定は起こっておらず、これは、ＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬには酵素活性が見られなかったことを示している。

［ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの作製］
（１）Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIタグを付けたｒｅｃＨＰＬ発現ベクターの調製
ｐＧＥＸ−６Ｐ−１−ＨＰＬを鋳型とし、プライマー９（配列番号１３）、プライマー１０（配列番号１４）を用いてＰＣＲを行った。反応にはサーマルサイクラー（ZYMOREACTORII、ATTO社製）を用い、９４℃で２分、９８℃で１０秒、６８℃で６分を３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物にＤｐｎ I（BIO-RAD社製）を加えて反応させ、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１−ＨＰＬを分解した。
得られたＤｐｎ I消化物をLigation high Ver2（TOYOBO社製）を用いてライゲーションして環状プラスミド（ＥｃｏＲＩサイトを導入するため、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１−ＨＰＬの９３番目のＴ→Ａに変異させたベクター）を得た。得られたプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９（タカラバイオ社製）に形質転換させ、大量培養を行った後に精製し、塩基配列分析を行った。

得られた上記環状プラスミドをテンプレートとして用い、プライマー１１（配列番号１５）とプライマー１２（配列番号１６）でＰＣＲを行うことで、両端にＥｃｏＲＩサイトを付加したＨＰＬｃＤＮＡインサートを合成した。ＰＣＲにはIBA Primer D'Signer1.1（IBA社製）を用い、ＫＯＤポリメラーゼに対してTOYOBO社推奨のプロトコルに従って行った。得られたＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩで制限酵素消化した後、アガロースゲル電気泳動を用いて精製し、インサートを得た。ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３Ｐｌｕｓ（IBA社製）は、ＥｃｏＲＩで制限酵素消化した後、アガロースゲル電気泳動を用いて精製し、ベクターを得た。得られたインサートとプラスミドをライゲーションし、プラスミド（ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３Ｐｌｕｓ−ＨＰＬ）を得た。作製したベクターマップを図９に示す。

（２）ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの発現
得られたｐＡＳＫ−ＩＢＡ３Ｐｌｕｓ−ＨＰＬを、大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ社製）に導入し、ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３Ｐｌｕｓ−ＨＰＬを大量発現させた。大腸菌への導入、プラスミドの発現及び回収は、ｐＴＡ２−ＨＰＬと同様に行った。
得られたｐＡＳＫ−ＩＢＡ３Ｐｌｕｓ−ＨＰＬを大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ社製）に導入し、目的タンパク質ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの発現誘導を行った。大腸菌への導入、タンパクの発現及び回収はｐＧＥＸ−６Ｐ−１−ＨＰＬでの発現誘導時と同様に行ったが、タンパク質の発現誘導には無水テトラサイクリン（ＡＨＴ）を用いた。

得られたペレット内にはｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIが封入体として存在しているため、可溶化を行った。大量培養し回収した大腸菌に超音波破砕を行い、得られたペレットを、まず０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に懸濁し、振盪後遠心することを繰り返し、膜タンパク質を除去した。次に、洗浄後のペレットに可溶化バッファー（８Ｍ尿素、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル）を加え、４℃で振盪後遠心し、ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIが可溶化した上清を得た。
得られた上清は、０．４ＭＬ−アルギニンバッファーを用いて透析を行い、尿素を除いた。この上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、及びウエスタンブロット法を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。膜は、抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇII抗体（IBA社製）及び抗ヒトリパーゼ抗体ＩｇＧｓ（THE BINDING SITE LTD社製）を用いて染色し、ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの発現を確認した。（図１０）

図１０において、「＋」と「−」はそれぞれ、ＡＨＴの添加の有無を示している。ＣＢＢ染色、抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇII抗体、抗ヒトリパーゼ抗体ＩｇＧｓのいずれの染色においても、ＡＨＴの添加によりｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの発現が誘導されていることが示された。

（３）ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの精製
可溶化したｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIにストレプタクチンセファロース（IBA社製）を加え、振とう吸着を行った。溶出液にはデスチオビオチン溶液（２．５ｍＭデスチオビオチン、０．４ＭＬ−アルギニン）を用い、溶出した。吸光度の測定にはマイクロプレートリーダー（Model 680、Bio-Rad社製）を用い、各溶出画分の２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度の高かった溶出画分を回収した。
得られた溶出画分の吸光度をグラフにしたものが図１１である。図１１は、縦軸が吸光度、横軸が溶出体積を示している。得られたｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇII精製画分に対し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法を行い、精製を確認した。（図１２）

図１１より、デスチオビオチン溶液により、ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIが含まれるとみられる画分が溶出されていることが示された。
また、図１２において、「抽」は可溶化したｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇII画分、「溶出」は図１１におけるピークの画分をそれぞれ、ＣＢＢ染色、抗ヒトリパーゼ抗体ＩｇＧｓによる染色、及び抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇII抗体による染色を行った結果を示している。いずれの染色方法においても抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇII抗体相当分子量のバンドが検出され、ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIが精製されたことが示された。

（４）ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIのリフォールディング条件の検討
得られたｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇII精製画分を０．１ｍｇ／ｍＬに希釈し、８Ｍ尿素溶液となるように調製した。ＤＴＴを終濃度が１０ｍＭになるように加え、３７℃で振とうすることで変性させ、ジスルフィド結合を切断した。
リフォールディングは透析によって、段階的に尿素を取り除く段階透析法で行った。透析は、尿素を含むリフォールディング溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）に対して行い、尿素濃度を６Ｍ、４Ｍ、２Ｍ、１Ｍ、０．５Ｍ、０Ｍと段階的に下げて行った。それぞれの段階における透析時間は３時間とした。尿素濃度が１Ｍ、０．５Ｍの際には０．１ｍＭシスチン／１ｍＭシステインを加え、ジスルフィド結合の形成を促進した。

リフォールディング条件の検討として、まず、カルシウムイオン（Ｃａ^２＋）の影響を検討した。尿素濃度が６Ｍから０Ｍのリフォールディング溶液すべてに対し、Ｃａ^２＋が０ｍＭ、２．５ｍＭ、５．０ｍＭとなるよう塩化カルシウム２水和物（和光純薬社製）を添加した。対照として、マグネシウムイオン（Ｍｇ^２＋）濃度が２．５ｍＭとなるよう塩化マグネシウム６水和物（和光純薬社製）を添加したリフォールディング溶液、またはＬ−アルギニン濃度が０．４Ｍとなるよう添加したリフォールディング溶液を用いた。透析後、得られたｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの比活性を測定した。比活性は、ＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬと同様、自動電位差滴定装置AT-510（京都電子工業社製）を用いたｐＨ−ｓｔａｔ法により測定した。この結果を図１３に示す。

図１３において、縦軸は比活性（ｋＵ／ｍｇ）を表している。図１３より、Ｃａ^２＋濃度が５．０ｍＭの時最も高い比活性が得られたが、２．５ｍＭの時との差異はあまりなかった。また、Ｃａ^２＋濃度が５．０ｍＭ以上の条件も検討したが、５．０ｍＭ時と同様の比活性しか得られなかった。

次に、透析の際、リフォールディングを促進させる添加物として知られている、ＰＥＧ３４００、グリシン、Ｌ−アルギニン、スクロース、グリセロール、グリセロールとＣａ^２＋をそれぞれ添加し、得られたｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIに対して比活性の測定を行った。
添加物は、尿素濃度が６Ｍから０Ｍのリフォールディング溶液すべてに添加した。添加物の添加濃度はそれぞれ、０．５％ＰＥＧ３４００、１Ｍグリシン、０．４ＭＬ−アルギニン、０．７５Ｍスクロース、１０％グリセロール、１０％グリセロールかつ２．５ｍＭＣａ^２＋、とした。透析後、得られたｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの比活性を測定した。比活性は、前述の同様、Ｃａ^２＋濃度の検討と同様、ｐＨ−ｓｔａｔ法により測定した。この結果を図１４に示す。

図１４において、縦軸はリフォールディング溶液に何も添加しなかった際の酵素活性を１とした相対酵素活性を表している。これより、段階透析法の添加剤としては１０％グリセロールかつ２．５ｍＭＣａ^２＋を用いるのが最適であることが示された。

（５）ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの酵素活性
最適条件でリフォールディングを行ったｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの酵素活性を測定した。測定には前述の方法と同様に、自動電位差滴定装置AT-510（京都電子工業社製）を用い、ｐＨ−ｓｔａｔ法により測定した。

ｐＨ−ｓｔａｔ法により酵素活性を調べた際の、水酸化ナトリウム溶液の滴定量を示したのが図８である。図８において、縦軸はｐＨ（左軸）及び水酸化ナトリウム溶液の滴下量（右軸）、横軸は経過時間を示している。グラフ上方のｐＨ以外のデータは、各リパーゼ存在下での水酸化ナトリウム溶液の滴下量を示している。ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIでは、ｐＨが一定に保たれているにもかかわらず水酸化ナトリウム溶液の滴定量は一定の割合で増加しており、これは、ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIにＰＰＬと同様に酵素活性があることを示している。

（６）ＨＰＬＣを用いたｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの分離
最適条件でリフォールディングを行い活性化させたｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIを、サンプルとして用い、ＨＰＬＣ法による再精製を試みた。対照として、活性化させたｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIを１００℃で５分間ボイルした、変性処理ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIを用いた。
カラムは、Protein KW 802.5とProtein KW 804（共にshodex社製）を連結させ使用した。バッファーは、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを用いた。カラム温度３７℃、流速１ｍＬ／ｍｉｎで平衡化を行った後に分析を行った。検出は、２８０ｎｍにおける吸光度の測定により行った。得られたピークに対し、それぞれ酵素活性を測定した。測定には前述の方法と同様に、自動電位差滴定装置AT-510（京都電子工業社製）を用い、ｐＨ−ｓｔａｔ法により測定した。

図１５は、ＨＰＬＣ法により得られた溶出画分のクロマトグラムである。縦軸が吸光度、横軸が溶出時間を示している。得られた２つのピークに対し、酵素活性を調べたのが図１６である。図１６において、縦軸はｐＨ（左軸）及び水酸化ナトリウム滴下量（右軸）、横軸は経過時間を示している。図内のクロマトグラムのうち、「活性ｒｅｃＨＰＬ」は、最適条件でリフォールディングを行い活性化させたｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIをカラムに０．９２ｍｇ／ｍＬの濃度で流した時のもの、「活性ｒｅｃＨＰＬ（２）」は、最適条件でリフォールディングを行い活性化させたｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIをカラムに０．１８ｍｇ／ｍＬの濃度で流した時のもの、「変性ｒｅｃＨＰＬ」は、変性処理ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIをカラムに流した時のものである。
図１６において、ピーク１の画分では、ｐＨが一定に保たれているにもかかわらず水酸化ナトリウム溶液の滴定量は一定の割合で増加しており、これは、ピーク１に含まれるｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIに酵素活性があることを示している。これに対し、ピーク２では水酸化ナトリウム溶液の滴定は起こっておらず、これは、ピーク２に含まれるｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIには酵素活性が見られないことを示している。すなわち、段階透析法を用い最適条件でリフォールディングを行い活性化させたｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIのうち、それらの約半量にしか酵素活性がないこと、ならびにそれらはＨＰＬＣ法により分離可能であることが示された。

（７）ＣＤスペクトルによるｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの二次構造解析
ＨＰＬＣ法を用いて精製を行った活性化ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの二次構造を解析した。
解析には、光路長０．２ｍｍの２つ口石英セルを用い、円二色性分散計J-820（Jasco）（日本分光社製）で測定を行った。１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）をバッファーとして使用した。測定条件は、タンパク濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、スキャン範囲１９０−２５０ｎｍ、走査速度１０ｎｍ／ｍｉｎ、積算回数４で行った。

得られたスペクトルを図１７に示す。対照として、酵素活性を持つＰＰＬのスペクトルデータ（B.A. van Kuiken et al.,Biochimica. et Biophysics. Acta 1214, p148-160, 1994）を付記した。両者のスペクトラムはほぼ一致した。

［各ＨＰＬにおける収量及び酵素活性の比較］
ｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６、ＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬ、ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの収量と比活性を比較した（表１）。比活性の測定には、ＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬはアフィニティカラムにより精製した画分、ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIは段階透析法を用い最適条件でリフォールディングを行い活性化させた画分をそれぞれ用いた。

ｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６、ＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬ、ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇII及びｎａｔｉｖｅＰＰＬ（１）（Elastin Products Company, Inc.社製、品番：LC298 (HIGH PURITY)、ロット番号：１２３）の比活性は、前述の方法と同様、自動電位差滴定装置AT-510（京都電子工業社製）を用い、基質にトリブチリン（和光純薬工業社製）を用いたｐＨ−ｓｔａｔ法により測定した。対照として、ｎａｔｉｖｅＰＰＬ（２）（Kaambre, T. et al., Biochim. Biophys. Acta., 1431, p97-106, 1999）、ｎａｔｉｖｅＰＰＬ（３）（Bourbon-Freie A. et al., J. Biol. Chem., 284(21), p14157-14164, 2009）、ｎａｔｉｖｅＨＰＬ（Carriere F, et al., Gastroenterology 119, p949, 2000）、昆虫細胞を用いて発現させたＨＰＬ（Lowe, M. E., Biochim. Biophys. Acta 1302, p177-183, 1996）、酵母を用いて発現させたＨＰＬ（Yang Y, et al., Protein Exp. Purif., 113, p36-40, 1998）のデータも掲載した。これら引用データにおける比活性はすべて、基質にトリブチリンを用い、ｐＨ−ｓｔａｔ法で測定している。

本発明において作製したｒｅｃＨＰＬ−Ｈｉｓ_６は、発現には成功したが精製物として得ることはできなかった。ＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬは、収量は低いものの精製には成功したが、酵素活性を持つＧＳＴ−ｒｅｃＨＰＬを得ることはできなかった。これに対し、ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIは、他の発現法を上回る収率を示した。また、ｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIの比活性は、天然リパーゼや他の発現法で得られたヒトリパーゼに若干劣るが、これは、今回の測定に用いたｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIがＨＰＬＣ法を用いた再精製を行っていない活性化画分だからであるといえる。
これより、本発明にて発現させたｒｅｃＨＰＬ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIは、品質面において他の発現法に遜色のないことが示された。

本発明によると、ＨＰＬが既存の方法に比べて迅速、安価、かつ簡便に生産できる上、生産されるＨＰＬは既存の方法で生産されたものよりも安全性が高いといえる。これより、食品業界、革加工業界、製薬業界において有用である。

Claims

以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を備えることを特徴とする組換えヒト膵臓リパーゼ（ｒｅｃＨＰＬ）の調製方法。
（ａ）ＨＰＬｃＤＮＡに、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇIIをＣ末側に付加した発現プラスミドを構築する工程；
（ｂ）構築した発現プラスミドを大腸菌に導入した後に培養して、大腸菌内にＨＰＬを発現させる工程；
（ｃ）前記大腸菌を破砕した大腸菌溶解物から、ストレプタクチンを担持した吸着体を用いてＨＰＬをワンステップで精製する工程；
（ｄ）精製したＨＰＬを、尿素濃度を段階的に低下させるグリセロール添加段階透析法を用いて活性化するリフォールディング工程；
ストレプタクチンを担持した吸着体が、ストレプタクチンを担持したセファロースであることを特徴とする請求項１記載のｒｅｃＨＰＬの調製方法。
グリセロール添加段階透析法が、グリセロールに加えてＣａ^２＋を添加する段階透析法であることを特徴とする請求項１又は２記載のｒｅｃＨＰＬの調製方法。
尿素濃度を８Ｍから０Ｍに段階的に低下させることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のｒｅｃＨＰＬの調製方法。
１０％グリセロールを用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のｒｅｃＨＰＬの調製方法。
２．５〜５ｍＭＣａ^２＋を用いることを特徴とする請求項３〜５のいずれか記載のｒｅｃＨＰＬの調製方法。
グリセロール添加段階透析法が、酸化剤／還元剤としてシスチン／システインを用いる段階透析法であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のｒｅｃＨＰＬの調製方法。