JP2014092465A - 分光測定システム及び分光測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】複数の試料溶液の吸収特性の同時定量測定を簡単且つ迅速に行う分光測定システ提供する。
【解決手段】複数のウェルが配置された試料プレート１２ａ、試料プレート１２ａの一方に配置された蓄光シート１１、試料プレート１２ａの他方に配置され、ウェルを撮像する撮像装置１５を含む測定ユニット１と、測定ユニット１を制御するコントローラ２を備える。コントローラ２は、撮像装置１５を駆動・制御して、反応前の複数の試料溶液から参照画像を、反応後の複数の試料溶液から測定画像を撮像する画像撮像手段４１３、参照画像及び測定画像の輝度を、各ウェル領域毎に積算する各ウェル内輝度積算手段４１６、参照画像及び測定画像の各ウェル領域内輝度から各ウェルの吸光度を計算する吸光度計算手段４１９を含む。
【選択図】図１

Description

本発明は、分光測定システム及び分光測定方法に係り、特に複数の試料溶液の吸収特性の同時定量測定を可能とする分光測定システム及び分光測定方法に関する。

様々な遺伝子組み換え作物が開発され、組み換え遺伝子の存在を検出する検査方法の開発が求められている。又、食品に含まれるアレルギー原因蛋白質の検出方法の開発、或いは医療分野における特定蛋白質の検出方法の開発も求められている。このため、試料中の特定の蛋白質を検出するＥＬＩＳＡ法等が提案されている（特許文献１参照）。しかし、複数の条件下で、反応系の体積を減少させたＥＬＩＳＡを一括して実施し、各条件下での検査結果を取得するのには、時間がかかり、且つデータのバラツキが大きく、信頼性及び再現性が低いという不都合があった。斯かる事情を鑑み、蛍光測定に関しては、標的生体分子の周りに存在する反応生成物の濃度を高速に測定可能で、且つデータのバラツキが小さく、信頼性及び再現性の高い分光測定システム及び分光測定方法が提案されている（特許文献２参照）。しかしながら、特許文献２に記載された分光測定システムによる蛍光測定では、それぞれ固体状の担体の流れを阻害する堰止部を有し、標的生体分子を含む溶液を流す複数の反応用流路を予め規定された位置に設けたマイクロ流路チップをアレイ状に配置し、反応用流路の観察画像を通常感度のＣＣＤカメラで撮像している。特許文献２のＣＣＤカメラは、画素により定められる大きさをそれぞれ有し、複数の反応用流路の位置に対応して位置が規定された複数の検出領域において、反応用流路の観察画像を取得する。この際、特許文献２においては、（ａ）観察画像から堰止部に補足されている標的生体分子の周りに存在する反応生成物から得られた各検出領域の蛍光検出画像から、大きさと位置の等しい検出領域の背景画像を引いて、各検出領域に含まれる画素毎の差分画像を算出し、（ｂ）差分画像中の各検出領域の閾値レベル以上の値を有する画素を積算して積算輝度を求め、差分画像中の各検出領域の閾値レベル以上の検出画素数が規定数よりも多い場合に、この検出画素数を出力し、（ｃ）検出画素数が規定数よりも少なければ、検出画素数をゼロと判定し、（ｄ）積算輝度と検出画素数から画素当たりの明度を算出し、（ｅ）画素当たりの明度の時間変化を算出し、この時間変化から、反応生成物の濃度を求めるという複雑な手法を採用している。

又、細胞バイオアッセイやＥＬＩＳＡ測定などの分光分野で多用される比色法では、対象試料の特性により吸収測定と蛍光測定が使い分けられる。吸収測定と蛍光測定を併用できる分光測定システムもあるが、原理的に異なる検出器をその都度替えているだけである。これらの吸収測定と蛍光測定では、試料間の比較のために複数種の試料溶液を測定するのが通常である。しかし、従来の分光測定システムでは、複数の試料溶液を収めるウェルが形成されたマルチプレートに入った複数種の試料溶液を、１ウェルづつ、逐次吸収測定や蛍光測定をするので、合計の測定時間は、ウェル数分の積算時間となる。このため、従来の分光測定システムは、特に、吸収測定に関しては、厳密な意味で複数の試料溶液の同時測定ではない。

特開２００４−２５０３８５号公報 特開２０１０−００８１０７号公報

以上の問題点を鑑み、本発明は、複数の試料溶液の吸収特性の同時定量測定を、簡単且つ迅速に行うことができる分光測定システム及び分光測定方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明の第１の態様は、（ａ）分光測定用の試料溶液を収納する複数のウェルが配置された試料プレート、この試料プレートの一方の面側に配置され、複数のウェルのそれぞれに対して蛍光を出射する蓄光シート、試料プレートの他方の面側に配置され、蓄光シートが映りこむように複数のウェルの観察画像を同時に撮像する撮像装置を含む測定ユニットと、（ｂ）撮像装置が撮像した観察画像を記憶する画像記憶装置、輝度比を記憶する輝度比記憶装置、ウェル領域内の輝度を記憶するウェル内輝度記憶装置、ウェル領域外の輝度を記憶する領域外輝度記憶装置、撮像装置を駆動・制御して、反応前の複数の試料溶液から参照画像を同時に、反応後の複数の試料溶液から測定画像を同時に、それぞれ撮像して画像記憶装置に格納する画像撮像手段、参照画像の各ウェル領域内輝度及び測定画像の各ウェル領域内輝度を、それぞれ各ウェル領域毎に積算して、積算された参照画像の各ウェル領域内輝度及び測定画像の各ウェル領域内輝度をウェル内輝度記憶装置にそれぞれ逐次格納する各ウェル内輝度積算手段、参照画像のウェル領域外の輝度と測定画像のウェル領域外の輝度をそれぞれ積算し、領域外輝度記憶装置に格納するウェル領域外輝度積算手段、領域外輝度記憶装置から参照画像のウェル領域外の輝度と測定画像のウェル領域外の輝度とを読み出し、輝度比を計算し、計算結果を輝度比記憶装置に格納する輝度比計算手段、輝度比記憶装置に格納された輝度比を輝度補正値として用い、ウェル内輝度記憶装置に格納された参照画像の各ウェル領域内輝度から測定画像の各ウェル領域内輝度を減算して、各ウェルの吸光度を計算する吸光度計算手段を含むコントローラとを備える分光測定システムであることを要旨とする。

本発明の第２の態様は、分光測定用の試料溶液を収納する複数のウェルが配置された試料プレート、この試料プレートの一方の面側に配置され、複数のウェルのそれぞれに対して蛍光を出射する蓄光シート、試料プレートの他方の面側に配置され、蓄光シートが映りこむように複数のウェルの観察画像を同時に撮像する撮像装置を含む測定ユニットとこの測定ユニットを駆動制御するコントローラとを備える分光測定システムを用いた分光測定方法に関する。則ち、本発明の第２の態様に係る分光測定方法においては、(a)コントローラの画像撮像手段が、撮像装置を駆動・制御して、反応前の複数の試料溶液から参照画像を同時に撮像してコントローラの画像記憶装置に格納するステップと、(b)コントローラの各ウェル内輝度積算手段が、参照画像の各ウェル領域内輝度を各ウェル領域毎に積算して、積算された参照画像の各ウェル領域内輝度をコントローラのウェル内輝度記憶装置に格納するステップと、(c)コントローラのウェル領域外輝度積算手段が、参照画像のウェル領域外の輝度を積算し、コントローラの領域外輝度記憶装置に格納するステップと、(d)画像撮像手段が、撮像装置を駆動・制御して、反応後の複数の試料溶液から測定画像を同時に撮像して画像記憶装置に格納するステップと、(e)各ウェル内輝度積算手段が、測定画像の各ウェル領域内輝度を各ウェル領域毎に積算して、積算された測定画像の各ウェル領域内輝度をウェル内輝度記憶装置に格納するステップと、(f)ウェル領域外輝度積算手段が、測定画像のウェル領域外の輝度を積算し、領域外輝度記憶装置に格納するステップと、(g) コントローラの輝度比計算手段が、領域外輝度記憶装置から参照画像のウェル領域外の輝度と測定画像のウェル領域外の輝度とを読み出し、輝度比を計算し、計算結果をコントローラの輝度比記憶装置に格納するステップと、(h)コントローラの吸光度計算手段が、輝度比記憶装置に格納された輝度比を輝度補正値として用い、ウェル内輝度記憶装置に格納された参照画像の各ウェル領域内輝度から測定画像の各ウェル領域内輝度を減算して、各ウェルの吸光度を計算するステップとを含むことを要旨とする。なお、本発明の第２の態様で述べた分光測定方法を実現するためのプログラムは、コンピュータ読取り可能な記録媒体に保存し、この記録媒体をコントローラを構成するコンピュータシステムによって読み込ませることにより、本発明の分光測定方法を実行することができる。

本発明によれば、複数の試料溶液の吸収特性の同時定量測定を、簡単且つ迅速に行うことができる分光測定システム及び分光測定方法を提供することができる。

本発明の第１の実施形態に係る分光測定システムの要部の概略構成を説明する模式的なブロック図である。 第１の実施形態に係る分光測定方法の主要な手順を概略的に説明するフローチャートである。 第１の実施形態に係る分光測定方法の主要な手順を、試料プレートの模式的な平面図に着目して概略的に説明する図である。 図４（ａ）は、第１の実施形態に係る分光測定システムの蓄光シートとしては好適なＣａＡｌ₂ Ｏ₄ ：Ｅｕ系蓄光性蛍光体発光スペクトルで、図４（ｂ）は、Ｓｒ_0.5 Ｃａ_0.5 Ａｌ₂ Ｏ₄ ：Ｅｕ，Ｄｙ蓄光性蛍光体の発光スペクトルを示す図である。 本発明の第１の実施形態の変形例に係る分光測定システムを、試料プレートとしての流路チップの構造に着目し、測定ユニットの要部の概略構成を説明する模式的な図である。 第１の実施形態の変形例に係る分光測定方法の主要な手順を、試料プレート（流路チップ）の模式的な平面図に着目して概略的に説明する図である。 本発明の第２の実施形態に係る分光測定システムのコントローラを構成する演算制御回路（ＣＰＵ）の要部の論理的なハードウェア構成を説明するブロック図である。 第２の実施形態に係る分光測定方法の主要な手順を概略的に説明するフローチャートである。

次に、図面を参照して、本発明の第１及び第２の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号を付している。但し、図面は模式的なものであり、厚みと平面寸法との関係、各層の厚みの比率等は現実のものとは異なることに留意すべきである。したがって、具体的な厚みや寸法は以下の説明を参酌して判断すべきものである。又、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。又、図１では、撮像装置１５が、蓄光シート１１の発光波長に対し透明な試料プレート１２ａの下から蓄光シート１１を撮像する倒立配置の構成の場合を例示しているが、撮像装置１５が透明な試料プレート１２ａの上から蓄光シート１１を撮像する正立配置の構成の場合についても同様に実施可能であり、図示は例示であり、上下又は左右等の方位は任意に選択可能であることは勿論である。更に、以下に示す第１及び第２の実施の形態は、本発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、本発明の技術的思想は、構成部品の材質、形状、構造、配置等を下記のものに特定するものでない。本発明の技術的思想は、特許請求の範囲に記載された技術的範囲内において、種々の変更を加えることができる。

（第１の実施形態）
本発明の第１の実施形態に係る分光測定システムは、図１に示すように、測定ユニット１及びこの測定ユニット１を駆動制御し、更に測定ユニット１の測定データに対し演算処理を実行するコントローラ２を有する。測定ユニット１は、分光測定用の試料溶液を収納する複数のウェルの配置された透明な試料プレート１２ａと、試料プレート１２ａの下部の周囲を保持する固定ホルダ１３と、試料プレート１２ａにマトリクス状に配列された複数のウェルの全体を含む領域の上方に配置され、試料プレート１２ａの複数のウェルのそれぞれに対して蛍光を出射する蓄光シート１１と、蓄光シート１１を光源として、蓄光シート１１からの蛍光が複数のウェルをそれぞれ透過したことによる複数のウェルの観察画像を同時に撮像する撮像装置１５と、試料プレート１２ａと撮像装置１５の間に設けられ、試料プレート１２ａを透過した光、及びウェルに収納された試料溶液が発光した光のうち所望の波長の光を選択する波長フィルタ１４、固定ホルダ１３を含めて試料プレート１２ａの下部の全面を照明する照明装置１８と、を有している。なお、試料プレート１２ａ、固定ホルダ１３、蓄光シート１１、撮像装置１５、波長フィルタ１４及び照明装置１８は、図示を省略した暗室の内部に収納されている。

第１の実施形態に係る分光測定システムの撮像装置１５としては、例えば、モノクロ高感度カメラが使用可能である。又、蓄光シート１１としては、例えば、図４（ａ）に示すような、発光ピーク波長が約４４２ｎｍのＣａＡｌ₂ Ｏ₄ ：Ｅｕ系蓄光性蛍光体や、図１４（ｂ）に示すような、発光ピーク波長が約５００ｎｍのＳｒ_0.5 Ｃａ_0.5 Ａｌ₂ Ｏ₄ ：Ｅｕ，Ｄｙ蓄光性蛍光体等種々のブロードな発光スペクトルを示し、約０．３ｍＣｄ／ｍ² 程度の輝度を有し、励起の停止後３０分〜数時間以上、輝度変化が少なく発光を維持する残光特性を示す蓄光性蛍光体を用いた蓄光性蛍光シートが採用可能である。蓄光シート１１に用いる蓄光性蛍光シートの厚みとしては０．１ｍｍ〜１０ｍｍ程度、より好ましくは０．５ｍｍ〜２．０ｍｍ程度の厚みが望ましい。図１に示すように、蛍光波長に対し透明な試料プレート１２ａの背景として、蓄光シート１１が映りこむように撮像装置１５と反対側に蓄光シート１１を設置される。試料プレート１２ａの素材は、蓄光シート１１の発光波長に対し透明性に優れた素材であれば特に限定はされない。

図１に示すコントローラ２は、演算制御回路（ＣＰＵ）４０ａと、検出された最適露光時間を記憶する露光時間記憶装置２２１と、撮像された観察画像を記憶する画像記憶装置２１７と、抽出されたマーカー座標を記憶するマーカー座標記憶装置２１８と、計算された輝度比Ｒを記憶する輝度比記憶装置２２２と、積算されたウェル領域内の輝度を記憶するウェル内輝度記憶装置２１９と、積算されたウェル領域外の輝度を記憶する領域外輝度記憶装置２２０と、計算したマスク座標を記憶するマスク座標記憶装置２２３と、入出力インターフェース２１０及び２１１と、入力装置２１２と、出力装置２１３と表示装置２１４とを有する。入出力インターフェース２１０は、演算制御回路（ＣＰＵ）４０ａと測定ユニット１の撮像装置１５との間、或いは、演算制御回路（ＣＰＵ）４０ａと測定ユニット１の照明装置１８との間の情報（データ）のやりとりを仲介するハードウェアインターフェースである。一方、入出力インターフェース２１１は、演算制御回路（ＣＰＵ）４０ａと入力装置２１２、出力装置２１３、表示装置２１４とのそれぞれ間の情報（データ）のやりとりを仲介するハードウェアインターフェースである。

コントローラ２を構成する演算制御回路（ＣＰＵ）４０ａは、照明装置１８のオン・オフを制御する照明制御手段４１１ａと、撮像装置１５の最適露光時間を検出し、検出した最適露光時間を露光時間記憶装置２２１に格納する最適露光時間検出手段４１２と、撮像装置１５を駆動・制御して、マーカー座標検出用画像、参照画像、測定画像を撮像して画像記憶装置２１７に格納する画像撮像手段４１３と、画像記憶装置２１７から画像を読み出してマーカー座標を抽出しマーカー座標記憶装置２１８に格納するマーカー座標抽出手段４１４と、マーカー座標をマーカー座標記憶装置２１８から読み出して、マスク座標を相対座標として外挿計算し、マスク座標記憶装置２２３に格納するマスク座標計算手段４１５と、参照画像の各ウェル領域内輝度及び測定画像の各ウェル領域内輝度を、それぞれ各ウェル領域毎に積算して、積算された参照画像の各ウェル領域内輝度（Ｗr）_ij （ｉ＝１〜ｍ、ｊ＝１〜ｎ：ｉ，ｊは２以上の正の整数）及び測定画像の各ウェル領域内輝度（Ｗs）_ijをウェル内輝度記憶装置２１９にそれぞれ逐次格納する各ウェル内輝度積算手段４１６と、参照画像のウェル領域外の輝度Ｉ_refと測定画像のウェル領域外の輝度Ｉ_splをそれぞれ積算し、領域外輝度記憶装置２２０に格納するウェル領域外輝度積算手段４１７と、領域外輝度記憶装置２２０から参照画像のウェル領域外の輝度Ｉ_refと測定画像のウェル領域外の輝度Ｉ_splとを読み出し、輝度比Ｒ＝Ｉ_ref／Ｉ_splを計算し、計算結果を輝度比記憶装置２２２に格納する輝度比計算手段４１８と、輝度比記憶装置２２２に格納された輝度比Ｒ、ウェル内輝度記憶装置２１９に格納された参照画像の各ウェル領域内輝度（Ｗr）_ij 及び測定画像の各ウェル領域内輝度（Ｗs）_ijを用いて、吸光度Ａ_ijを計算する吸光度計算手段４１９と、を含んでいる。

第１の実施形態に係る分光測定システムにおいては、蓄光シート１１が参照画像の測定時と測定画像の測定時に蓄光量が異なることに依存する補正を行うために、輝度比計算手段４１８が各画像の解析領域以外の輝度積算値の平均の比を輝度比Ｒ＝Ｉ_ref／Ｉ_splとして計算し、輝度比Ｒを輝度補正値として、吸光度Ａ_ijの計算に用いる。則ち、吸光度計算手段４１９は、輝度比計算手段４１８が計算した輝度比Ｒを用いて、以下の式（１）から、吸光度Ａ_ijを、各ウェル領域内のそれぞれについて計算する。
Ａ_ij ＝（（Ｗr）_ij −Ｒ＊（Ｗs）_ij）／（Ｗr）_ij ……（１）
図１は、論理的な構成を示すブロック図であるので、画像記憶装置２１７や、マーカー座標記憶装置２１８や、ウェル内輝度記憶装置２１９や、領域外輝度記憶装置２２０や、露光時間記憶装置２２１や、輝度比記憶装置２２２や、マスク座標記憶装置２２３は仮想メモリとして存在し得、物理的にはレジスタやキャッシュメモリの形態で、演算制御回路（ＣＰＵ）４０ａの内部に内蔵されていても、演算制御回路（ＣＰＵ）４０ａの外部に接続されていても構わない。又、画像記憶装置２１７、マーカー座標記憶装置２１８、輝度比記憶装置２２２等の記憶装置は、物理的に同一のＳＲＡＭ等の記憶装置の一部の領域として存在してもよく、別個の独立したハードウェアとして存在してもよい。測定ユニット１において、照明装置１８には、キセノンランプ、発光ダイオード、スーパールミネッセントダイオード、半導体レーザ等が使用可能である。

図１に示す第１の実施形態に係る分光測定システムにおいて、試料プレート１２ａ中に発色試料がなければ、撮像装置１５が高感度なので（透明な）試料プレート１２ａを通して背景の明るい蓄光シート１１が撮像され、これが参照画像となる。一方、発色試料があると、高感度な撮像装置１５で撮像すれば、白色の蓄光シート１１の前に発色波長の影が映りこむ。この時、撮像装置１５のレンズ前に、測定対象の波長だけを選択できる波長フィルタ１４があれば、測定波長の影がついた測定画像が得られる。例えば、ウェルに収納された試料溶液がＷＳＴ−８アッセイであれば測定波長として４５０ｎｍ、ＭＴＳアッセイであれば４６２ｎｍ、ニュートラルレッドであれば５４０ｎｍ又は６９０ｎｍ、ＭＴＴアッセイであれば５７０ｎｍを選択すればよい。この画像を先ほどの参照画像から差し引けば目的の全試料の吸収画像が得られる。第１の実施形態に係る分光測定システムにおいて、蓄光シート１１の光強度は微弱であるが、試料溶液の吸収強度自体も微弱なのでコントラストのバランスが丁度よい。仮に、背景にＬＥＤなどの光源を使用すると、光源が明るすぎて試料溶液の吸収自体が埋もれてしまう。

次に、図３に示した１２×８＝９６個のウェルが配置された、蛍光波長に対し透明な試料プレート１２ａの模式的な平面図を参照しながら、本発明の第１の実施形態に係る分光測定方法の具体的な手順の内容を、図２に示すフローチャートの流れに従がって、順に説明する。なお、以下に述べる分光測定方法は、一例であり、ウェルの配置は９６個に限定されるものではなく、通常のマルチプレートで慣用されている６個、２４個、４８個、３４８個等のウェル配置等でも構わず、許請求の範囲に記載した趣旨の範囲内であれば、この変形例を含めて、種々のウェル配置を用いた、他の種々の手順による分光測定方法により、実現可能であることは勿論である。

（ａ）まず、ステップＳ１０１で、図１のコントローラ２を構成する演算制御回路（ＣＰＵ）４０ａの照明制御手段４１１ａが、照明装置１８を稼働（オン）させ、未反応（反応前）の試料溶液（サンプル）が導入された状態（参照状態）の、蛍光波長に対し透明な試料プレート１２ａの底部を照明する。次に、ステップＳ１０２で、演算制御回路４０ａの最適露光時間検出手段４１２が撮像装置１５の参照画像のマーカー検出用の最適露光時間を検出し、検出した参照画像のマーカー検出用の最適露光時間を露光時間記憶装置２２１に格納する。次に、ステップＳ１０３で、演算制御回路４０ａの画像撮像手段４１３が、参照画像のマーカー検出用の最適露光時間を用いて撮像装置１５を駆動・制御して、図３（ａ）に示すような、参照画像のマーカー座標検出用画像を撮像して画像記憶装置２１７に格納する。次に、ステップＳ１０４で、演算制御回路４０ａのマーカー座標抽出手段４１４が、画像記憶装置２１７から参照画像のマーカー座標検出用画像を読み出して、図３（ｂ）に示すように、画像認識により参照画像の６個のマーカー位置Ｍ₁，Ｍ₂，Ｍ₃，…Ｍ₆を検出する。図３（ｂ）の左上の角を原点（０，０）、右上の角の座標を（１３９２，０）、左下の角の座標を（０，１０３９）、右下の角の座標を（１３９２，１０３９）として、６個の参照画像のマーカー座標をそれぞれ抽出し、抽出した６個の参照画像のマーカー座標をマーカー座標記憶装置２１８に格納する。次に、ステップＳ１０５で、演算制御回路４０ａのマスク座標計算手段４１５が、参照画像のマーカー座標をマーカー座標記憶装置２１８から読み出して、６個のマーカー座標を基準として参照画像のマスク座標を相対座標として外挿計算する。図３（ｃ）に示すように、各ウェルの解析領域ＤＡ_ijのサイズは予め定めておき、各ウェルの解析領域ＤＡ_ij（ｉ＝１〜１２、ｊ＝１〜８）の原点の座標Ｄ_00(ij)を、６個のマーカー座標を基準として外挿計算する。そして、計算した参照画像のマスク座標をマスク座標記憶装置２２３に格納する。

（ｂ）前述のステップＳ１０３で、参照画像のマーカー座標検出用画像が撮像されたら、ステップＳ１１１で、演算制御回路の照明制御手段４１１ａが照明装置１８を消灯（オフ）させる。次に、ステップＳ１１２で、演算制御回路４０ａの最適露光時間検出手段４１２が撮像装置１５の参照画像撮像用の最適露光時間を検出し、検出した参照画像撮像用の最適露光時間を露光時間記憶装置２２１に格納する。次に、ステップＳ１１３で、演算制御回路４０ａの画像撮像手段４１３が、参照画像撮像用の最適露光時間を用いて撮像装置１５を駆動・制御して、複数（９６個）のウェルのそれぞれに未反応（反応前）の試料溶液（サンプル）が導入された状態の試料プレート１２ａの底部を参照画像として撮像し、撮像された参照画像を画像記憶装置２１７に格納する。

（ｃ）次に、ステップＳ１１４で、演算制御回路４０ａの各ウェル内輝度積算手段４１６が、画像記憶装置２１７から参照画像を読み出し、マスク座標記憶装置２２３から読み出した参照画像のマスク座標を用いて、図３（ｄ）に示すように、９６個の解析領域ＤＡ_ijの画像をそれぞれ切り出す。そして、参照画像の各ウェルの解析領域ＤＡ_ij内の輝度を、９６個のウェルについてそれぞれ積算し、積算された参照画像の各ウェル領域内輝度（Ｗr）_ij を、ウェル内輝度記憶装置２１９にそれぞれ逐次格納する。更に、ステップＳ１１５で、演算制御回路４０ａのウェル領域外輝度積算手段４１７が、画像記憶装置２１７から参照画像を読み出し、マスク座標記憶装置２２３から読み出した参照画像のマスク座標を用いて、参照画像のウェル領域外の輝度Ｉ_refを積算し、積算した参照画像のウェル領域外の輝度Ｉ_refを領域外輝度記憶装置２２０に格納する。

（ｄ）前述のステップＳ１１３で、参照画像が撮像された後、試料プレート１２ａの複数（９６個）のウェルのそれぞれに導入されている分光測定用の試料溶液に、所定の反応処理を施す。この場合、ステップＳ１１３の終了後、直ちに試料溶液に所定の反応処理を施す必要は必ずしもなく、事情に応じて、一定の時間経過後に反応処理を施してもよい。反応処理が施された後、ステップＳ２０１で、演算制御回路４０ａの照明制御手段４１１ａが、照明装置１８を稼働（オン）させ、９６個のウェルのそれぞれに反応処理後の試料溶液が導入された状態の試料プレート１２ａの底部を照明する。複数（９６個）のウェルのそれぞれに収納された試料溶液（サンプル）は、試薬反応で発色（又は蛍光発光）するので、ステップＳ２０２で、演算制御回路４０ａの最適露光時間検出手段４１２が撮像装置１５の測定画像のマーカー検出用の最適露光時間を検出し、検出した測定画像のマーカー検出用の最適露光時間を露光時間記憶装置２２１に格納する。次に、ステップＳ２０３で、演算制御回路４０ａの画像撮像手段４１３が、測定画像のマーカー検出用の最適露光時間を用いて撮像装置１５を駆動・制御して、測定画像のマーカー座標検出用画像を撮像して画像記憶装置２１７に格納する。次に、ステップＳ２０４で、演算制御回路４０ａのマーカー座標抽出手段４１４が、画像記憶装置２１７から測定画像のマーカー座標検出用画像を読み出して、測定画像のマーカー座標を抽出し、抽出した測定画像のマーカー座標をマーカー座標記憶装置２１８に格納する。次に、ステップＳ２０５で、演算制御回路４０ａのマスク座標計算手段４１５が、測定画像のマーカー座標をマーカー座標記憶装置２１８から読み出して、測定画像のマスク座標を相対座標として外挿計算し、計算した測定画像のマスク座標をマスク座標記憶装置２２３に格納する。

（ｅ）前述のステップＳ２０３で、測定画像のマーカー座標検出用画像が撮像されたら、ステップＳ２１１で、演算制御回路の照明制御手段４１１ａが照明装置１８を消灯（オフ）させる。次に、ステップＳ２１２で、演算制御回路４０ａの最適露光時間検出手段４１２が撮像装置１５の測定画像撮像用の最適露光時間を検出し、検出した測定画像撮像用の最適露光時間を露光時間記憶装置２２１に格納する。複数（９６個）のウェルのそれぞれに収納された試料溶液（サンプル）は、試薬反応で発色（又は蛍光発光）しているので、ステップＳ２１３で、演算制御回路４０ａの画像撮像手段４１３が、測定画像撮像用の最適露光時間を用いて撮像装置１５を駆動・制御して、９６個のウェルのそれぞれに反応処理後の試料溶液が導入された状態の試料プレート１２ａの底部を、分光測定用の測定画像として撮像して、撮像した測定画像を画像記憶装置２１７に格納する。

（ｆ）次に、ステップＳ２１４で、演算制御回路４０ａの各ウェル内輝度積算手段４１６が、画像記憶装置２１７から測定画像を読み出し、マスク座標記憶装置２２３から読み出した測定画像のマスク座標を用いて、図３（ｄ）に示すように、９６個の解析領域ＤＡ_ijの画像をそれぞれ切り出す。そして、測定画像の各ウェルの解析領域ＤＡ_ij内の輝度を、９６個のウェルについてそれぞれ積算し、積算された測定画像の各ウェル領域内輝度（Ｗs）_ijを、ウェル内輝度記憶装置２１９にそれぞれ逐次格納する。更に、ステップＳ２１５で、演算制御回路４０ａのウェル領域外輝度積算手段４１７が、画像記憶装置２１７から測定画像を読み出し、マスク座標記憶装置２２３から読み出した測定画像のマスク座標を用いて、測定画像のウェル領域外の輝度Ｉ_splを積算し、積算した測定画像のウェル領域外の輝度Ｉ_splを領域外輝度記憶装置２２０に格納する。

（ｇ）次に、ステップＳ２３１で、演算制御回路４０ａの輝度比計算手段４１８が、領域外輝度記憶装置２２０から参照画像のウェル領域外の輝度Ｉ_refと測定画像のウェル領域外の輝度Ｉ_splとを読み出し、輝度比Ｒ＝Ｉ_ref／Ｉ_splを計算し、計算結果を輝度比記憶装置２２２に格納する。更に、ステップＳ２３２で、演算制御回路４０ａの吸光度計算手段４１９が、輝度比記憶装置２２２に格納された輝度比Ｒ、ウェル内輝度記憶装置２１９に格納された参照画像の各ウェル領域内輝度（Ｗr）_ij 及び測定画像の各ウェル領域内輝度（Ｗs）_ijを用いて、各ウェル領域毎の吸光度Ａ_ijを、上述した式（１）を用いて、各ウェルの解析領域ＤＡ_ij毎に、それぞれ計算して、各ウェル領域の吸光度Ａ_ijの同時定量測定をする。吸光度計算手段４１９における、各ウェルの解析領域ＤＡ_ij（ｉ＝１〜１２、ｊ＝１〜８）毎の計算は、演算制御回路４０ａの処理速度が速ければ、シリアルな逐次計算でもよい。しかし、ウェル数が多い場合、より高速に実行するには、パイプライン処理等の並列処理で、９６個の解析領域ＤＡ_ijに対し、同時に計算すればよい。

以上のように、第１の実施形態に係る分光測定システム及び分光測定方法によれば、複数のウェルの観察画像を同時に一括撮像することができるので、複数の試料溶液の吸収特性の同時定量測定を、簡単且つ迅速に行うことができる。特に、同時定量測定が可能であるので、マルチプレートのウェル数が、２４個→４８個→９６個→３４８個と増大するほど、分光測定時間の短縮の効果が従来技術に比して顕著となる。更に、複数の解析領域ＤＡ_ij（ｉ＝１〜ｍ、ｊ＝１〜ｎ：ｉ，ｊは２以上の正の整数）に対し並列処理を施すことにより、より高速に、同時定量測定、同時演算が実行できるので、マルチプレートのウェル数が増大すればするほど、より顕著な効果を奏することが可能である。

（第１の実施形態の変形例）
既に述べたとおり、蓄光シート１１の発光波長に対し透明な試料プレート１２ｂを用いる限り、本発明においては、試料プレートの形状や構造は種々のものが採用可能である。則ち、第１の実施形態に係る分光測定システム及び分光測定方法において例示したマルチプレートの他に、図５に示すような、特殊形状の流路チップなども使用可能である。

則ち、図５（ｂ）に断面構造を示すように、第１の実施形態の変形例に係る分光測定システムに用いる試料プレート１２ｂは、透明なベース本体（下部壁）４４３の上面に透明な上部プレート（上部壁）４４５を一体的に接合した構成であって、上部プレート４４５に注入口４０５及び排出口４０７が形成してあり、且つ上部プレート４４５の上面には、注入口４０５、排出口４０７に対応して試料溶液保持カップ４４７及び試料溶液保持カップ４４４がそれぞれ備えられている。ベース本体４４３には、注入口４０５と排出口４０７とを連通した流路(接続路)Ｓ_ijが形成してあり、この接続路（流路）Ｓ_ijの途中には、注入口４０５から注入された試料溶液の流れは許容するが、試料溶液中の細胞４４９を堰き止めるためのせき止め部４２１を構成する堰部４２３が備えられている。則ち、流路Ｓ_ij中に堰止部４２１を備えたことにより、流路Ｓ_ijは、注入口４０５に連通した上流側の培養室４２５と排出口４０７に連通した下流側の液溜室４２７とに区画してある。第１の実施形態の変形例では、多くの細胞が培養可能なように、培養室４２５の容積は液溜室４２７の容積より大きく構成してある。堰止部４２１における堰部４２３の上面には、培養室４２５と液溜室４２７とを連通した複数の微細連通路４２９を備えている。この微細連通路４２９は、試料溶液の流れは許容するが、試料溶液内の細胞４４９を堰き止める作用をなすものであって、例えば深さは２０μｍ以下であり、幅は２００μｍ以下に形成してある。したがって、注入口４０５から細胞４４９を含む試料溶液を注入すると、試料溶液中の細胞４４９が堰き止められて、培養室４２５内に定着又は浮遊した状態となるものである。この際、培養室４２５及び液溜室４２７内の試料溶液の液面４３１はせき止め部４２１よりも常に高く保持されるものである。

図６（ａ）には、試料プレート１２ｂとして流路チップを６枚用いる吸収測定の具体例を示した。各流路チップにはそれぞれ８×２の筒があるが、図５（ａ）に示すように、いずれも横に並ぶ２つづつが基板内で繋がり複数の流路Ｓ_ij-1，Ｓ_ij，Ｓ_ij+1，……になっている。則ち各流路チップには８つのウェルがあるので、図６（ａ）に示した試料プレート１２ｂ全体では８×６＝４８個のウェルがある。図６（ｄ）では、横行を上から、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈと番地を付し、縦列を左から、１，２，３，４，５，６と番地を付している。

次に、図６に示した流路チップ模式的な平面図を参照しながら、本発明の第１の実施形態の変形例に係る分光測定方法の具体的な手順の内容を、図２に示すフローチャートの流れに従がって、順に説明する。
（ａ）まず、図２に示したステップＳ１０１で、図１のコントローラ２を構成する演算制御回路（ＣＰＵ）４０ａの照明制御手段４１１ａが、照明装置１８を稼働（オン）させ、ステップＳ１０２で、最適露光時間検出手段４１２が撮像装置１５の参照画像のマーカー検出用の最適露光時間を検出し、ステップＳ１０３で、画像撮像手段４１３が、参照画像のマーカー検出用の最適露光時間を用いて撮像装置１５を駆動・制御して、図６（ａ）に示すような、参照画像のマーカー座標検出用画像を撮像して画像記憶装置２１７に格納する。次に、ステップＳ１０４で、マーカー座標抽出手段４１４が、画像記憶装置２１７から参照画像のマーカー座標検出用画像を読み出して、図６（ｂ）に示すように、画像認識により参照画像の６個のマーカー位置Ｍ₁，Ｍ₂，Ｍ₃，…Ｍ₆を検出する。図６（ｂ）の左上の角を原点（０，０）、右上の角の座標を（１３９２，０）、左下の角の座標を（０，１０３９）、右下の角の座標を（１３９２，１０３９）として、６個の参照画像のマーカー座標をそれぞれ抽出し、抽出した６個の参照画像のマーカー座標をマーカー座標記憶装置２１８に格納する。次に、ステップＳ１０５で、マスク座標計算手段４１５が、参照画像のマーカー座標をマーカー座標記憶装置２１８から読み出して、６個のマーカー座標を基準として参照画像のマスク座標を相対座標として外挿計算する。図６（ｃ）に示すように、各ウェルの解析領域ＤＡ_ijのサイズは予め定めておき、各ウェルの解析領域ＤＡ_ij（ｉ＝１〜１２、ｊ＝１〜８）の原点の座標Ｄ_00(ij)を、６個のマーカー座標を基準として外挿計算する。そして、計算した参照画像のマスク座標をマスク座標記憶装置２２３に格納する。

（ｂ）前述のステップＳ１０３で、参照画像のマーカー座標検出用画像が撮像されたら、図２に示したステップＳ１１１で、照明制御手段４１１ａが照明装置１８を消灯（オフ）させる。次に、ステップＳ１１２で、最適露光時間検出手段４１２が撮像装置１５の参照画像撮像用の最適露光時間を検出し、検出した参照画像撮像用の最適露光時間を露光時間記憶装置２２１に格納する。次に、ステップＳ１１３で、画像撮像手段４１３が、参照画像撮像用の最適露光時間を用いて撮像装置１５を駆動・制御して、６×８＝４８個のウェルのそれぞれに未反応の試料溶液（サンプル）が導入された状態の試料プレート１２ｂの底部を参照画像として撮像し、撮像された参照画像を画像記憶装置２１７に格納する。
（ｃ）次に、ステップＳ１１４で、各ウェル内輝度積算手段４１６が、画像記憶装置２１７から参照画像を読み出し、マスク座標記憶装置２２３から読み出した参照画像のマスク座標を用いて、図６（ｄ）に示すように、４８個の解析領域ＤＡ_ijの画像をそれぞれ切り出す。そして、参照画像の各ウェルの解析領域ＤＡ_ij内の輝度を、４８個のウェルについてそれぞれ積算し、積算された参照画像の各ウェル領域内輝度（Ｗr）_ij を、ウェル内輝度記憶装置２１９にそれぞれ逐次格納する。更に、ステップＳ１１５で、ウェル領域外輝度積算手段４１７が、画像記憶装置２１７から参照画像を読み出し、マスク座標記憶装置２２３から読み出した参照画像のマスク座標を用いて、参照画像のウェル領域外の輝度Ｉ_refを積算し、積算した参照画像のウェル領域外の輝度Ｉ_refを領域外輝度記憶装置２２０に格納する。

（ｄ）前述のステップＳ１１３で、参照画像が撮像された後、試料プレート１２ｂの複数（４８個）のウェルのそれぞれに導入されている分光測定用の試料溶液に、所定の反応処理を施す。前述したとおり、ステップＳ１１３の終了後、直ちに試料溶液に所定の反応処理を施す必要は必ずしもない。反応処理が施された後、図２に示したステップＳ２０１で、照明制御手段４１１ａが、照明装置１８を稼働（オン）させ、４８個のウェルのそれぞれに反応処理後の試料溶液が導入された状態の試料プレート１２ｂの底部を照明する。次に、ステップＳ２０２で、最適露光時間検出手段４１２が撮像装置１５の測定画像のマーカー検出用の最適露光時間を検出し、検出した測定画像のマーカー検出用の最適露光時間を露光時間記憶装置２２１に格納する。次に、ステップＳ２０３で、画像撮像手段４１３が、測定画像のマーカー検出用の最適露光時間を用いて撮像装置１５を駆動・制御して、測定画像のマーカー座標検出用画像を撮像して画像記憶装置２１７に格納する。次に、ステップＳ２０４で、マーカー座標抽出手段４１４が、画像記憶装置２１７から測定画像のマーカー座標検出用画像を読み出して、測定画像のマーカー座標を抽出し、抽出した測定画像のマーカー座標をマーカー座標記憶装置２１８に格納する。次に、ステップＳ２０５で、マスク座標計算手段４１５が、測定画像のマーカー座標をマーカー座標記憶装置２１８から読み出して、測定画像のマスク座標を相対座標として外挿計算し、計算した測定画像のマスク座標をマスク座標記憶装置２２３に格納する。

（ｅ）前述のステップＳ２０３で、測定画像のマーカー座標検出用画像が撮像されたら、図２に示したステップＳ２１１で、照明制御手段４１１ａが照明装置１８を消灯（オフ）させる。次に、ステップＳ２１２で、最適露光時間検出手段４１２が撮像装置１５の測定画像撮像用の最適露光時間を検出し、検出した測定画像撮像用の最適露光時間を露光時間記憶装置２２１に格納する。次に、ステップＳ２１３で、画像撮像手段４１３が、測定画像撮像用の最適露光時間を用いて撮像装置１５を駆動・制御して、４８個のウェルのそれぞれに反応処理後の試料溶液が導入された状態の試料プレート１２ｂの底部を、分光測定用の測定画像として撮像して、撮像した測定画像を画像記憶装置２１７に格納する。
（ｆ）次に、ステップＳ２１４で、各ウェル内輝度積算手段４１６が、画像記憶装置２１７から測定画像を読み出し、マスク座標記憶装置２２３から読み出した測定画像のマスク座標を用いて、図６（ｄ）に示すように、４８個の解析領域ＤＡ_ijの画像をそれぞれ切り出す。そして、測定画像の各ウェルの解析領域ＤＡ_ij内の輝度を、４８個のウェルについてそれぞれ積算し、積算された測定画像の各ウェル領域内輝度（Ｗs）_ijを、ウェル内輝度記憶装置２１９にそれぞれ逐次格納する。更に、ステップＳ２１５で、ウェル領域外輝度積算手段４１７が、画像記憶装置２１７から測定画像を読み出し、マスク座標記憶装置２２３から読み出した測定画像のマスク座標を用いて、測定画像のウェル領域外の輝度Ｉ_splを積算し、積算した測定画像のウェル領域外の輝度Ｉ_splを領域外輝度記憶装置２２０に格納する。

（ｇ）次に、ステップＳ２３１で、輝度比計算手段４１８が、領域外輝度記憶装置２２０から参照画像のウェル領域外の輝度Ｉ_refと測定画像のウェル領域外の輝度Ｉ_splとを読み出し、輝度比Ｒ＝Ｉ_ref／Ｉ_splを計算し、計算結果を輝度比記憶装置２２２に格納する。更に、ステップＳ２３２で、吸光度計算手段４１９が、輝度比記憶装置２２２に格納された輝度比Ｒ、ウェル内輝度記憶装置２１９に格納された参照画像の各ウェル領域内輝度（Ｗr）_ij 及び測定画像の各ウェル領域内輝度（Ｗs）_ijを用いて、各ウェル領域毎の吸光度Ａ_ijを、上述した式（１）を用いて、各ウェルの解析領域ＤＡ_ij毎に、それぞれ計算して、各ウェル領域の吸光度Ａ_ijの同時定量測定をする。
以上のように、第１の実施形態の変形例に係る分光測定システム及び分光測定方法によれば、図５に示すような特殊形状の流路チップの場合であっても、流路チップに収納された複数の試料溶液の吸収特性の同時定量測定を、簡単且つ迅速に行うことができる。

（第２の実施形態）
本発明の第２の実施形態に係る分光測定システムは、図１に示した第１の実施形態に係る分光測定システムと基本的に同様であり、重複した説明を省略する。但し、図示を省略しているが、暗室の内部には、図１に示した試料プレート１２ａ、固定ホルダ１３、蓄光シート１１、撮像装置１５、波長フィルタ１４及び照明装置１８に加え、蛍光の励起光源が収納されている。励起光源には、照明装置１８と同様に、キセノンランプ、発光ダイオード、スーパールミネッセントダイオード、半導体レーザ等が使用可能である。特に、紫外域から赤外域（１８５ｎｍ〜２０００ｎｍ）までの連続スペクトルを有するキセノンランプ等を励起光源として、用いる場合、波長フィルタ等を通すことにより波長を調整した励起光を使用することが可能である。試料プレート１２ａの素材は、蓄光シート１１の発光波長に対し透明性に優れた素材であれば特に限定はされないが、蛍光検出を行う場合は、例えば低自家蛍光ポリスチレン、紫外線透過ガラス、環状ポリオレフィン、及びシクロオレフィン等の、自家蛍光が低い素材が好ましい。

又、第２の実施形態に係る分光測定システムは、図１に示した第１の実施形態に係る分光測定システムとは、コントローラ２を構成する演算制御回路（ＣＰＵ）４０ｂの内部構成が若干異なり、図７に示すように、励起光源のオン・オフを制御する励起光源制御手段４１１ｂと、輝度比記憶装置２２２に格納された輝度比Ｒ、ウェル内輝度記憶装置２１９に格納された参照画像の各ウェル領域内輝度（Ｗr）_ij 及び測定画像の各ウェル領域内輝度（Ｗs）_ijを用いて、蛍光の発光強度Ｆ_ijを計算する蛍光強度計算手段４２０を更に含んでいる。
第２の実施形態に係る分光測定システムにおいては、蓄光シート１１が参照画像の測定時と測定画像の測定時に蓄光量が異なることに依存する補正を行うために、輝度比計算手段４１８が各画像の解析領域以外の輝度積算値の平均の比を輝度比Ｒ＝Ｉ_ref／Ｉ_splとして計算し、輝度比Ｒを輝度補正値として、吸光度Ａ_ij及び蛍光の発光強度Ｆ_ijの計算に用いる。則ち、吸光度計算手段４１９は、輝度比計算手段４１８が計算した輝度比Ｒを用いて、前述の式（１）から、吸光度Ａ_ijを、各ウェル領域内のそれぞれについて計算し、蛍光強度計算手段４２０が、蛍光の発光強度Ｆ_ijを以下の式（２）を用いて、各ウェル領域内のそれぞれについて計算する。
Ｆ_ij ＝（Ｗs）_ij −（Ｗr）_ij／Ｒ ……（２）
第２の実施形態に係る分光測定システムによれば、撮像装置１５として、モノクロ高感度カメラを使用することにより、吸光度Ａ_ijの測定及び蛍光の発光強度Ｆ_ijの測定が併用でき、且つ試料プレート１２ａの各ウェル全体の同時測定が可能となる。式（２）に示す蛍光測定と式（１）に示した吸収測定の違いは、式（２）と式（１）を比較すれば分かるように、蛍光強度計算手段４２０における解析時の測定画像と参照画像の差し引きの順と、吸光度計算手段４１９における解析時の測定画像と参照画像の差し引きの順が逆になるだけである。

次に、図３に示した１２×８＝９６個のウェルが配置された試料プレート１２ａの模式的な平面図を参照しながら、本発明の第２の実施形態に係る分光測定方法の具体的な手順の内容を、図８に示すフローチャートの流れに従がって、順に説明する。なお、以下に述べる分光測定方法は、第１の実施形態に係る分光測定方法と同様に一例であり、ウェルの配置は９６個に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載した趣旨の範囲内であれば、この変形例を含めて、これ以外の種々の分光測定方法により、実現可能であることは勿論である。

（ａ）図８のステップＳ１０１〜ステップＳ１０５までは、第１の実施形態に係る分光測定方法と同様であり、重複した記載を省略するが、未反応の試料溶液（サンプル）が各ウェルにそれぞれ導入された状態（参照状態）の試料プレート１２ａを用いて、ステップＳ１０４で参照画像のマーカー座標がそれぞれ抽出され、ステップＳ１０５で参照画像のマスク座標が計算される。図８のステップＳ１０３で、参照画像のマーカー座標検出用画像が撮像されたら、ステップＳ１２１で、演算制御回路の照明制御手段４１１ａが照明装置１８を消灯（オフ）し、更に励起光源制御手段４１１ｂが励起光源を点灯させることにより、試料プレート１２ａの各ウェルのそれぞれの未反応の試料溶液を励起する。次に、ステップＳ１２２で、演算制御回路４０ｂの最適露光時間検出手段４１２が撮像装置１５の参照画像撮像用の最適露光時間を検出し、検出した参照画像撮像用の最適露光時間を露光時間記憶装置２２１に格納する。次に、ステップＳ１２３で、演算制御回路４０ｂの画像撮像手段４１３が、参照画像撮像用の最適露光時間を用いて撮像装置１５を駆動・制御して、複数（９６個）のウェルのそれぞれに未反応（反応前）の試料溶液が導入された状態の試料プレート１２ａの底部を参照画像として撮像し、撮像された参照画像を画像記憶装置２１７に格納する。

（ｂ）次に、ステップＳ１２４で、演算制御回路４０ｂの各ウェル内輝度積算手段４１６が、画像記憶装置２１７から参照画像を読み出し、マスク座標記憶装置２２３から読み出した参照画像のマスク座標を用いて、図３（ｄ）に示したのと同様に、９６個の解析領域ＤＡ_ijの画像をそれぞれ切り出す。そして、参照画像の各ウェルの解析領域ＤＡ_ij内の輝度を、９６個のウェルについてそれぞれ積算し、積算された参照画像の各ウェル領域内輝度（Ｗr）_ij を、ウェル内輝度記憶装置２１９にそれぞれ逐次格納する。更に、ステップＳ１２５で、演算制御回路４０ｂのウェル領域外輝度積算手段４１７が、画像記憶装置２１７から参照画像を読み出し、マスク座標記憶装置２２３から読み出した参照画像のマスク座標を用いて、参照画像のウェル領域外の輝度Ｉ_refを積算し、積算した参照画像のウェル領域外の輝度Ｉ_refを領域外輝度記憶装置２２０に格納する。

（ｃ）図８のステップＳ１２３で、参照画像が撮像された後、試料プレート１２ａの複数（９６個）のウェルのそれぞれに導入されていた分光測定用の試料溶液に所定の反応処理を施す。ステップＳ２０１で、照明制御手段４１１ａが照明装置１８を稼働（オン）させるステップからステップＳ２０５のマスク座標計算手段４１５が測定画像のマスク座標を計算するまでの手順は、第１の実施形態に係る分光測定方法と同様であり、重複した記載を省略する。図８のステップＳ２０３で、測定画像のマーカー座標検出用画像が撮像されたら、ステップＳ２２１で、照明制御手段４１１ａが照明装置１８を消灯（オフ）し、更に励起光源制御手段４１１ｂが励起光源を点灯させることにより、試料プレート１２ａの各ウェルのそれぞれの反応処理後の試料溶液を励起する。次に、ステップＳ２２２で、最適露光時間検出手段４１２が撮像装置１５の測定画像撮像用の最適露光時間を検出し、検出した測定画像撮像用の最適露光時間を露光時間記憶装置２２１に格納する。次に、ステップＳ２２３で、画像撮像手段４１３が、測定画像撮像用の最適露光時間を用いて撮像装置１５を駆動・制御して、９６個のウェルのそれぞれに反応処理後の試料溶液が導入された状態の試料プレート１２ａの底部を、分光測定用の測定画像として撮像して、撮像した測定画像を画像記憶装置２１７に格納する。

（ｄ）次に、ステップＳ２２４で、各ウェル内輝度積算手段４１６が、画像記憶装置２１７から測定画像を読み出し、マスク座標記憶装置２２３から読み出した測定画像のマスク座標を用いて、図３（ｄ）に示したのと同様に、９６個の解析領域ＤＡ_ijの画像をそれぞれ切り出す。そして、測定画像の各ウェルの解析領域ＤＡ_ij内の輝度を、９６個のウェルについてそれぞれ積算し、積算された測定画像の各ウェル領域内輝度（Ｗs）_ijを、ウェル内輝度記憶装置２１９にそれぞれ逐次格納する。更に、ステップＳ２２５で、ウェル領域外輝度積算手段４１７が、画像記憶装置２１７から測定画像を読み出し、マスク座標記憶装置２２３から読み出した測定画像のマスク座標を用いて、測定画像のウェル領域外の輝度Ｉ_splを積算し、積算した測定画像のウェル領域外の輝度Ｉ_splを領域外輝度記憶装置２２０に格納する。

（ｅ）次に、ステップＳ２３１で、輝度比計算手段４１８が、領域外輝度記憶装置２２０から参照画像のウェル領域外の輝度Ｉ_refと測定画像のウェル領域外の輝度Ｉ_splとを読み出し、輝度比Ｒ＝Ｉ_ref／Ｉ_splを計算し、計算結果を輝度比記憶装置２２２に格納する。更に、ステップＳ２３２で、吸光度計算手段４１９が、輝度比記憶装置２２２に格納された輝度比Ｒ、ウェル内輝度記憶装置２１９に格納された参照画像の各ウェル領域内輝度（Ｗr）_ij 及び測定画像の各ウェル領域内輝度（Ｗs）_ijを用いて、各ウェル領域の吸光度Ａ_ijを、上述した式（１）を用いて、各ウェルの解析領域ＤＡ_ij毎に、それぞれ計算して、各ウェル領域の吸光度Ａ_ijの同時定量測定をする。又は、ステップＳ２３１からステップＳ２３３に進み、 蛍光強度計算手段４２０が、輝度比記憶装置２２２に格納された輝度比Ｒ、ウェル内輝度記憶装置２１９に格納された参照画像の各ウェル領域内輝度（Ｗr）_ij 及び測定画像の各ウェル領域内輝度（Ｗs）_ijを用いて、各ウェル領域の蛍光の発光強度Ｆ_ijを、上述した式（２）を用いて、各ウェルの解析領域ＤＡ_ij毎に、それぞれ計算して、各ウェル領域の蛍光の発光強度Ｆ_ijの同時定量測定をする。なお、ステップＳ２３２とステップＳ２３３とを時系列的にシーケンシャルで順次実行してもよく、或いは、パイプライン処理等による並列処理によりステップＳ２３２とステップＳ２３３とを同時に実行しても構わない。シーケンシャルで順次実行する場合は、ステップＳ２３２をステップＳ２３３の後に処理しても、その順序は構わない。

以上のように、第２の実施形態に係る分光測定システム及び分光測定方法によれば、必要に応じて、蛍光測定と吸収測定のいずれか一方の選択や、蛍光測定と吸収測定とを併用することが可能で、しかも、複数サンプルの同時定量測定を行うことができるので、分光測定の利便性が拡大され、応用範囲も広がる。

（その他の実施の形態）
上記のように、本発明は第１及び第２の実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面は本発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。
例えば、第１及び第２の実施の形態の説明においては、分光測定用の試料溶液があたかも複数のウェルのすべてに収納されているかのように読めるかもしれないが、例示的な説明に過ぎず、分光測定として実際に目的とする蛋白質溶液等が、試料プレートに配置されたすべてのウェルに必ずしも収納されている必要はなく、一部のウェルに水等のダミーの溶液が収納されていてもよい。ダミーの溶液が収納されている場合であっても、目的とする実際の試料溶液が複数のウェルに収納されている限り、複数のウェルの吸収特性の同時定量測定が実行可能であるので、分光測定時間を短縮するという本発明の効果を奏することが可能である。
このように、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を含むことは勿論である。したがって、本発明の技術的範囲は上記の説明から妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものである。

１…測定ユニット，２…コントローラ，１１…蓄光シート，１２ａ，１２ｂ…試料プレート，１３…固定ホルダ，１４…波長フィルタ，１５…撮像装置，１８…照明装置，４０ａ，４０ｂ…演算制御回路，２１７…画像記憶装置，２１８…マーカー座標記憶装置、２１９…ウェル内輝度記憶装置，２２０…領域外輝度記憶装置，２２１…露光時間記憶装置，２２２…輝度比記憶装置，２２３…マスク座標記憶装置，４１１ａ…照明制御手段，４１１ｂ…励起光源制御手段，４１２…最適露光時間検出手段，４１３…画像撮像手段，４１４…マーカー座標抽出手段，４１５…マスク座標計算手段，４１６…各ウェル内輝度積算手段，４１７…ウェル領域外輝度積算手段，４１８…輝度比計算手段，４１９…吸光度計算手段，４２０…蛍光強度計算手段

Claims (2)

1. 分光測定用の試料溶液を収納する複数のウェルが配置された試料プレート、該試料プレートの一方の面側に配置され、前記複数のウェルのそれぞれに対して蛍光を出射する蓄光シート、前記試料プレートの他方の面側に配置され、前記蓄光シートが映りこむように前記複数のウェルの観察画像を同時に撮像する撮像装置を含む測定ユニットと、
   前記撮像装置が撮像した観察画像を記憶する画像記憶装置、輝度比を記憶する輝度比記憶装置、ウェル領域内の輝度を記憶するウェル内輝度記憶装置、ウェル領域外の輝度を記憶する前記領域外輝度記憶装置、前記撮像装置を駆動・制御して、反応前の複数の試料溶液から参照画像を同時に、反応後の前記複数の試料溶液から測定画像を同時に、それぞれ撮像して前記画像記憶装置に格納する画像撮像手段、前記参照画像の各ウェル領域内輝度及び前記測定画像の各ウェル領域内輝度を、それぞれ各ウェル領域毎に積算して、積算された前記参照画像の各ウェル領域内輝度及び前記測定画像の各ウェル領域内輝度を前記ウェル内輝度記憶装置にそれぞれ逐次格納する各ウェル内輝度積算手段、前記参照画像のウェル領域外の輝度と前記測定画像のウェル領域外の輝度をそれぞれ積算し、前記領域外輝度記憶装置に格納するウェル領域外輝度積算手段、前記領域外輝度記憶装置から前記参照画像のウェル領域外の輝度と前記測定画像のウェル領域外の輝度とを読み出し、輝度比を計算し、計算結果を前記輝度比記憶装置に格納する輝度比計算手段、前記輝度比記憶装置に格納された輝度比を輝度補正値として用い、前記ウェル内輝度記憶装置に格納された前記参照画像の各ウェル領域内輝度から前記測定画像の各ウェル領域内輝度を減算して、各ウェルの吸光度を計算する吸光度計算手段を含むコントローラと、
   を備えることを特徴とする分光測定システム。
2. 分光測定用の試料溶液を収納する複数のウェルが配置された試料プレート、該試料プレートの一方の面側に配置され、前記複数のウェルのそれぞれに対して蛍光を出射する蓄光シート、前記試料プレートの他方の面側に配置され、前記蓄光シートが映りこむように前記複数のウェルの観察画像を同時に撮像する撮像装置を含む測定ユニットとこの測定ユニットを駆動制御するコントローラとを備える分光測定システムを用いた分光測定方法であって、
   前記コントローラの画像撮像手段が、前記撮像装置を駆動・制御して、反応前の複数の試料溶液から参照画像を同時に撮像して前記コントローラの画像記憶装置に格納するステップと、
   前記コントローラの各ウェル内輝度積算手段が、前記参照画像の各ウェル領域内輝度を各ウェル領域毎に積算して、積算された前記参照画像の各ウェル領域内輝度を前記コントローラのウェル内輝度記憶装置に格納するステップと、
   前記コントローラのウェル領域外輝度積算手段が、前記参照画像のウェル領域外の輝度を積算し、前記コントローラの領域外輝度記憶装置に格納するステップと、
   前記画像撮像手段が、前記撮像装置を駆動・制御して、反応後の前記複数の試料溶液から測定画像を同時に撮像して前記画像記憶装置に格納するステップと、
   前記各ウェル内輝度積算手段が、前記測定画像の各ウェル領域内輝度を各ウェル領域毎に積算して、積算された前記測定画像の各ウェル領域内輝度を前記ウェル内輝度記憶装置に格納するステップと、
   前記ウェル領域外輝度積算手段が、前記測定画像のウェル領域外の輝度を積算し、前記領域外輝度記憶装置に格納するステップと、
   前記コントローラの輝度比計算手段が、前記領域外輝度記憶装置から前記参照画像のウェル領域外の輝度と前記測定画像のウェル領域外の輝度とを読み出し、輝度比を計算し、計算結果を前記コントローラの輝度比記憶装置に格納するステップと、
   前記コントローラの吸光度計算手段が、前記輝度比記憶装置に格納された輝度比を輝度補正値として用い、前記ウェル内輝度記憶装置に格納された前記参照画像の各ウェル領域内輝度から前記測定画像の各ウェル領域内輝度を減算して、各ウェルの吸光度を計算するステップと、
   を含むことを特徴とする分光測定方法。

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