JP2014045729A - 一塩基多型に基づくアトピー性皮膚炎の検査方法 - Google Patents

Abstract

【課題】アトピー性皮膚炎を検査する方法を提供する。
【解決手段】IL1RL1/IL18R1/IL18RAP遺伝子、MHC領域、OR10A3/NLRP10遺伝子、GLB1遺伝
子、CCDC80遺伝子、CARD11遺伝子、ZNF365遺伝子、およびCYP24A1/PFDN4遺伝子から選択
される領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてアトピー性皮膚炎の発症リスクおよび／または発症の有無を検査する。
【選択図】なし

Description

本発明はアトピー性皮膚炎の発症リスクや発症の有無を判定するための検査方法及び該検査方法に用いられる試薬に関する。

アトピー性皮膚炎（atopic dermatitis；ＡＤ）は、皮膚のバリア機能の障害、皮膚の
炎症性過敏症、および抗菌免疫防御の欠陥を伴う、ありふれた慢性再発性皮膚疾患である。

アトピー性皮膚炎は、遺伝要因および環境要因の相互作用によって起こる（非特許文献１、２）。例えば、フィラグリン（Filaggrin；ＦＬＧ）の機能欠損がアトピー性皮膚炎
の主要な素因であることはよく知られている（非特許文献３、４）。

また、近年実施されたヨーロッパ人および中国人のＧＷＡＳならびにそれらのメタ解析により、ＦＬＧ以外にも、ゲノムワイド水準で有意にアトピー性皮膚炎と関連する６つの感受性遺伝子座（susceptible loci）：Ｃ１１ｏｒｆ３０、ＴＭＥＭ２３２／ＳＬＣ２５Ａ４６、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ／ＺＧＰＡＴ、ＯＶＯＬ１、ＡＣＴＬ９、およびＫＩＦ３Ａ／ＩＬ１３、が見出されている（非特許文献５〜７）。

Bieber, T. N. Engl. J. Med. 358, 1483-1494 (2008). Boguniewicz, M. & Leung, D.Y. J. Allergy Clin. Immunol. 125, 4-13 (2010). Palmer, C.N. et al. Nat. Genet. 38, 441-446 (2006). Irvine, A.D., McLean, W.H. & Leung, D.Y. N. Engl. J. Med. 365, 1315-1327 (2011). Esparza-Gordillo, J. et al. Nat. Genet. 41, 596-601 (2009). Sun, L.G. et al. Nat. Genet. 43, 690-694 (2011). Paternoster, L. et al. Nat. Genet. 44, 187-192 (2011).

本発明は、アトピー性皮膚炎の発症リスクや発症の有無を正確に検査する方法、及び該方法に用いられる検査試薬を提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、IL1RL1/IL18R1/IL18RAP遺伝
子、MHC領域、OR10A3/NLRP10遺伝子、GLB1遺伝子、CCDC80遺伝子、CARD11遺伝子、ZNF365遺伝子、およびCYP24A1/PFDN4遺伝子に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）がアトピー性皮膚
炎（ＡＤ）と関連することを同定した。そして、これらの多型を調べることによりアトピー性皮膚炎の発症リスクや発症の推定を正確に実施できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の態様を含む。
[１]
以下の（１）〜（８）から選択される領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果
に基づいてアトピー性皮膚炎を検査することを特徴とする、アトピー性皮膚炎の発症リスクおよび／または発症の有無の判定方法。
（１）CCDC80遺伝子
（２）OR10A3/NLRP10遺伝子
（３）CYP24A1/PFDN4遺伝子
（４）GLB1遺伝子
（５）CARD11遺伝子
（６）ZNF365遺伝子
（７）IL1RL1/IL18R1/IL18RAP遺伝子
（８）MHC領域
[２]
前記一塩基多型が、配列番号１〜８から選ばれる塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、[１]に記載の方法。
[３]
下記（１）または（２）の配列を有するアトピー性皮膚炎検査用プローブ。
（１）配列番号１〜８から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列。
（２）配列番号１〜８から選ばれる塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列。
[４]
下記（１）または（２）の領域を増幅することのできるアトピー性皮膚炎検査用プライマー。
（１）配列番号１〜８から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域。
（２）配列番号１〜８から選ばれる塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む領域。

本発明によれば、これまで予測が困難であったアトピー性皮膚炎の発症リスク（罹患リスク）を正確かつ簡便に予測することができる。また、本発明によれば、アトピー性皮膚炎の発症を正確かつ簡便に判定することができる。したがって、本発明は、アトピー性皮膚炎の予防や早期治療に貢献するものである。

ＧＷＡＳにおける606,164個のＳＮＰｓのマンハッタンプロット。縦軸はＳＮＰｓの-log₁₀Ｐ値を示す。ＧＷＡＳにおけるゲノムワイドな有意性の閾値（Ｐ＜５×１０^−８）および検証試験におけるＳＮＰｓの選択基準（Ｐ＜１×１０^−４）をそれぞれ実線で示す。 実施例で見出された８つのＡＤ関連領域のプロット。縦軸はＳＮＰｓの-log₁₀Ｐ値を示す。（ａ）6p21.3領域、（ｂ）2q12領域、（ｃ）11p15.4領域、（ｄ）3p21.33領域、（ｅ）3q13.2領域、（ｆ）7p22領域、（ｇ）10q21.2領域、（ｈ）20q13領域。

＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、ヒトのIL1RL1/IL18R1/IL18RAP遺伝子、MHC領域、OR10A3/NLRP10遺伝
子、GLB1遺伝子、CCDC80遺伝子、CARD11遺伝子、ZNF365遺伝子、およびCYP24A1/PFDN4遺
伝子から選択される領域に存在するＳＮＰを分析し、該分析結果に基づいてアトピー性皮膚炎を検査することを特徴とする、アトピー性皮膚炎の発症リスクおよび／または発症の有無の判定方法である。すなわち、本発明において、「検査」とはアトピー性皮膚炎の発
症リスクの検査及びアトピー性皮膚炎の発症の有無の検査を含む。本発明の方法においては、ＳＮＰの分析結果を、アトピー性皮膚炎の発症リスクおよび／または発症の有無と関連付ける。

本発明の方法は、いずれの人種の被検者に対しても用いることができる。本発明の方法は、例えば、日本人等のアジア人の被検者に用いることができる。

IL1RL1/IL18R1/IL18RAP遺伝子は、第２染色体長腕１２領域（2q12領域）に位置する。IL1RL1/IL18R1/IL18RAP遺伝子に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs13015714が挙げられる。ここで、rs番号はNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。rs13015714は、2q12領域のIL1RL1遺伝子、IL18R1遺伝子、およびIL18RAP遺伝子が含まれる連鎖不平
衡ブロックに位置する。よって、特に、当該連鎖不平衡ブロックに存在するＳＮＰを解析することによってアトピー性皮膚炎を検査することができる。IL1RL1遺伝子としては、GenBank Accession No. NC_000002.11の塩基番号102927962〜102968497の領域が挙げられる。IL18R1遺伝子としては、GenBank Accession No. NC_000002.11の塩基番号102979097〜103015218の領域が挙げられる。IL18RAP遺伝子としては、GenBank Accession No. NC_000002.11の塩基番号103035254〜103069025の領域が挙げられる。

rs13015714はGenBank Accession No. NT_022171.14の5041450番目の塩基におけるチミ
ン（Ｔ）／グアニン（Ｇ）の多型を意味し、この塩基がＧである場合はアトピー性皮膚炎の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＧＧ＞ＧＴ＞ＴＴの順でアトピー性皮膚炎の可能性または発症リスクが高い。

MHC領域（HLA領域ともいう）は、第６染色体短腕２１．３領域（6p21.3領域）に位置する。MHC領域に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs176095が挙げられる。rs176095
は、6p21.3領域のMHC class III領域に位置する。rs176095は、具体的には、MHC class III領域のGPSM3遺伝子が含まれる連鎖不平衡ブロックに位置する。よって、特に、当該連
鎖不平衡ブロックに存在するＳＮＰを解析することによってアトピー性皮膚炎を検査することができる。GPSM3遺伝子としては、GenBank Accession No. NC_000006.11の塩基番号32158543〜32163300の領域の相補配列が挙げられる。

rs176095はGenBank Accession No. NT_007592.14の23016569番目の塩基におけるチミン（Ｔ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＴである場合はアトピー性皮膚炎の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＴＴ＞ＴＣ＞ＣＣの順でアトピー性皮膚炎の可能性または発症リスクが高い。

OR10A3/NLRP10遺伝子は、第１１染色体短腕１５．４領域（11p15.4領域）に位置する。OR10A3/NLRP10遺伝子に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs878860が挙げられる。rs878860は、11p15.4領域のOR10A3遺伝子およびNLRP10遺伝子が含まれる連鎖不平衡ブロックに位置する。よって、特に、当該連鎖不平衡ブロックに存在するＳＮＰを解析することによってアトピー性皮膚炎を検査することができる。OR10A3遺伝子としては、GenBank Accession No. NC_000011.9の塩基番号7960123〜7961067の領域の相補配列が挙げられる。NLRP10遺伝子としては、GenBank Accession No. NC_000011.9の塩基番号7981156〜7985059の領域の相補配列が挙げられる。

rs878860はGenBank Accession No. NT_009237.17の6755600番目の塩基におけるアデニ
ン（Ａ）／グアニン（Ｇ）の多型を意味し、この塩基がＧである場合はアトピー性皮膚炎の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＧＧ＞ＧＡ＞ＡＡの順でアトピー性皮膚炎の可能性または発症リスクが高い。

GLB1遺伝子は、第３染色体短腕２１．３３領域（3p21.33領域）に位置する。GLB1遺伝
子に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs6780220が挙げられる。rs6780220は、3p21.33領域のGLB1遺伝子が含まれる連鎖不平衡ブロックに位置する。よって、特に、当該連
鎖不平衡ブロックに存在するＳＮＰを解析することによってアトピー性皮膚炎を検査することができる。GLB1遺伝子としては、GenBank Accession No. NC_000003.11の塩基番号33038100〜33138694の領域の相補配列が挙げられる。

rs6780220はGenBank Accession No. NT_022517.17の33027204番目の塩基におけるチミ
ン（Ｔ）／グアニン（Ｇ）の多型を意味し、この塩基がＧである場合はアトピー性皮膚炎の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＧＧ＞ＧＴ＞ＴＴの順でアトピー性皮膚炎の可能性または発症リスクが高い。

CCDC80遺伝子は、第３染色体長腕１３．２領域（3q13.2領域）に位置する。CCDC80遺伝子に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs12634229が挙げられる。rs12634229は、3q13.2領域のCCDC80遺伝子が含まれる連鎖不平衡ブロックに位置する。よって、特に、当該連鎖不平衡ブロックに存在するＳＮＰを解析することによってアトピー性皮膚炎を検査することができる。CCDC80遺伝子としては、GenBank Accession No. NC_000003.11の塩基番号112323407〜112359977の領域の相補配列が挙げられる。

rs12634229はGenBank Accession No. NT_005612.15の18871454番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／グアニン（Ｇ）の多型を意味し、この塩基がＧである場合はアトピー性皮膚炎の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＧＧ＞ＧＡ＞ＡＡの順でアトピー性皮膚炎の可能性または発症リスクが高い。

CARD11遺伝子は、第７染色体短腕２２領域（7p22領域）に位置する。CARD11遺伝子に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs4722404が挙げられる。rs4722404は、7p22領域のCARD11遺伝子が含まれる連鎖不平衡ブロックに位置する。よって、特に、当該連鎖不平衡ブロックに存在するＳＮＰを解析することによってアトピー性皮膚炎を検査することができる。CARD11遺伝子としては、GenBank Accession No. NC_000007.13の塩基番号2945709
〜3083509の領域の相補配列が挙げられる。

rs4722404はGenBank Accession No. NT_007819.16の2617748番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／グアニン（Ｇ）の多型を意味し、この塩基がＧである場合はアトピー性皮膚炎の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＧＧ＞ＧＡ＞ＡＡの順でアトピー性皮膚炎の可能性または発症リスクが高い。

ZNF365遺伝子は、第１０染色体長腕２１．２領域（10q21.2領域）に位置する。ZNF365
遺伝子に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs10995251が挙げられる。rs10995251は、10q21.2領域のZNF365遺伝子が含まれる連鎖不平衡ブロックに位置する。よって、特に
、当該連鎖不平衡ブロックに存在するＳＮＰを解析することによってアトピー性皮膚炎を検査することができる。ZNF365遺伝子としては、GenBank Accession No. NC_000010.10の塩基番号64133916〜64431771の領域が挙げられる。

rs10995251はGenBank Accession No. NT_008583.16の12949621番目の塩基におけるチミン（Ｔ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＣである場合はアトピー性皮膚炎の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＣＣ＞ＣＴ＞ＴＴの順でアトピー性皮膚炎の可能性または発症リスクが高い。

CYP24A1/PFDN4遺伝子は、第２０染色体長腕１３領域（20q13領域）に位置する。CYP24A
1/PFDN4遺伝子に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs16999165が挙げられる。rs16999165は、20q13領域のCYP24A1遺伝子およびPFDN4遺伝子が含まれる連鎖不平衡ブロックに位置する。よって、特に、当該連鎖不平衡ブロックに存在するＳＮＰを解析することによってアトピー性皮膚炎を検査することができる。CYP24A1遺伝子としては、GenBank Accession No. NC_000020.10の塩基番号52769988〜52790516の領域の相補配列が挙げられる。PFDN4遺伝子としては、GenBank Accession No. NC_000020.10の塩基番号52824502〜52836492の領域が挙げられる。

rs16999165はGenBank Accession No. NT_011362.9の17860129番目の塩基におけるチミ
ン（Ｔ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＴである場合はアトピー性皮膚炎の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＴＴ＞ＴＣ＞ＣＣの順でアトピー性皮膚炎の可能性または発症リスクが高い。

なお、上記８個のＳＮＰについて、ＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、配列番号１〜８に示した。６１番目の塩基が多型を有する。

本発明においては、上記塩基に相当する塩基を解析する。「上記塩基に相当する塩基」とは、上記領域における該当塩基を意味する。すなわち、「上記塩基に相当する塩基を解析する」ことには、仮に人種の違いなどによって上記配列がＳＮＰ以外の位置で若干変化したとしても、上記領域における該当塩基を解析することが含まれる。

また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ^２＞０．５、好ましくはｒ^２＞０．８、さらに好ましくはｒ^２＞０．９の関係を満たす塩基をいう。ｒ^２は連鎖不平衡係数である。上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基は、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等を
用いて同定することができる。また、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基は、複数人、例えば２０〜４０人程度、から採取したＤＮＡをシークエンサーにて配列解析し、連鎖不平衡にあるＳＮＰを探索することにより同定することもできる。上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基は、遺伝子型を考慮して解析した場合は、リスクアレルのホモ接合体 ＞ リスクアレルと非リスクアレルのへテロ接合体 ＞ 非リスクアレルのホモ接合体の順でアトピー性皮膚炎の可能性または発症リスクが高い。

上記ＳＮＰの塩基の種類を調べ、得られた結果を上記のような基準に基づいてアトピー性皮膚炎と関連付けることにより、アトピー性皮膚炎を検査することができる。上記ＳＮＰは単独で解析されてもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つを含む複数のＳＮＰｓをまとめて解析（ハプロタイプ解析）してもよい。例えば、上記ＳＮＰの複数をまとめて解析してもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つと、アトピー性皮膚炎と関連する既知のＳＮＰｓ（非特許文献５〜７等）や当該既知のＳＮＰｓと連鎖不平衡にあるＳＮＰｓとを組み合わせて解析してもよい。アトピー性皮膚炎と関連する複数のＳＮＰｓをまとめて解析すれば、アトピー性皮膚炎の検査の精度が向上する。なお、いずれのＳＮＰも、二本鎖ＤＮＡのどちらの鎖を解析してもよい。例えば、IL1RL1遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。

ＳＮＰの解析に用いる試料は、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されない。ＳＮＰの解析に用いる試料としては、例えば、血液、尿等の体液、口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。ＳＮＰの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。

ＳＮＰの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。

シークエンス解析は通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、あらかじめＳＮＰ部位を含む断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。

また、ＳＮＰの解析は、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、３’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書）、ＩＣＡＮ法（特開２００２−２
３３３７９号公報）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。

また、ＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的のＳＮＰを含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。

さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。

また、ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってＳＮＰがいずれの塩基であるかを調べることもできる。

このようにしてＳＮＰがいずれの塩基であるかを決定することで、アトピー性皮膚炎を検査するためのデータを得ることができる。

＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、アトピー性皮膚炎を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、上記ＳＮＰ部位を含み、ハイブリダイズの有無によってＳＮＰ部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１〜８から選ばれる塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブや、当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。なお、「当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基」及びその前後の領域の塩基配列は、例えば、National Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）から取得できる。プローブの長さは好ましくは、１５〜３５
塩基であり、より好ましくは２０〜３５塩基である。

また、プライマーとしては、上記ＳＮＰ部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマー、又は上記ＳＮＰ部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１〜８から選ばれる塩基配列の６１番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーや、当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましく、２０〜３５塩基がさらに好ましい。

上記ＳＮＰ部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは３０〜１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは３０〜１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。

なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。

[アトピー性皮膚炎（ＡＤ）と関連するＳＮＰｓの同定]
ＡＤ感受性を決定する遺伝的変異を同定するために、日本人被検者を用いてゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を行った。ＧＷＡＳとは、疾患等の表現型に関わる遺伝的変異を探索する遺伝統計学的手法である。例えば、ヒトゲノム全体を網羅するような数十万〜１００万ヶ所のＳＮＰｓを用いて、ある疾患の患者（ケース）とその疾患にかかっていない被験者（コントロール）との間で、多型の頻度に差があるかどうかを統計的に検定することで、疾患と関連する遺伝的変異を見出すことができる。

＜被検者＞
本実施例に用いた被検者の特徴を表１に示す。全ての被検者は日本人である。

ＧＷＡＳに用いたＡＤ被検者（ケース（case））1,472名は、数ヶ所の医療機関で採用
されBBJ（the BioBank Japan project）に登録されたＡＤ患者からなる。検証試験（validation study）に用いたＡＤ被検者1,856名は、数ヶ所の医療機関で採用されBBJに登録されたＡＤ患者940名と、別途数ヶ所の医療機関で採用されたＡＤ患者916名からなる。ＡＤ被検者は、いずれも、Hanifin & Rajkaの診断基準（Hanifin, J.M. & Rajka, R.G. Acta Derm. (Stockholm) 92(Suppl.), 44-47 (1980).）に基づいて医師によりＡＤと診断され
た。

ＧＷＡＳに用いた対照被検者（コントロール（control））7,971名は、BBJに登録され
たＡＤ以外の疾患（脳動脈瘤（cerebral aneurysm）、食道癌（esophageal cancer）、子宮体癌（endometrial cancer）、慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease）、および緑内障（glaucoma）のいずれか）の患者6,042名、大阪御堂筋ロータリークラブで採用された健康なボランティア1,023名、およびファルマ・スニップ・コンソー
シアム（Pharma SNP Consortium）で採用された健康被検者906名からなる。検証試験に用いた対照被検者7,021名は、BBJに登録されたＡＤ以外の疾患（てんかん（epilepsy）、尿路結石（urolithiasis）、ネフローゼ症候群（nephrotic syndrome）、およびバセドウ病（Graves' disease）のいずれか）の患者5,547名と、数ヶ所の医療機関で採用された健康なボランティア1,474名からなる。なお、ＡＤ患者および気管支喘息患者は対照被検者か
ら除外した。

本研究は東京大学医科学研究所および理化学研究所横浜研究所の倫理委員会によって承認され、全ての被検者からインフォームドコンセントを得た。

＜ＧＷＡＳ＞
ＡＤ被検者1,472名および対照被検者7,971名の遺伝子型を、Illumina HumanOmniExpress BeadChip（Illumina）を用いて解析した。クオリティコントロールのため、近縁ペアの
被検者（closely related paired samples）、コール率（call rate）が０．９８未満の
常染色体上にないＳＮＰｓ（non-autosomal SNPs）、マイナーアレル頻度が０．０１未満のＳＮＰｓ、およびHardy-Weinberg平衡検定でのＰ値がカットオフ値未満（Ｐ＜１０^−６）のＳＮＰｓを除外し、コール率が０．９９以上のＳＮＰｓを関連解析に用いた。クオリティコントロールを通過した606,164個のＳＮＰｓについて、コクラン・アーミテージ傾
向検定（Cochran-Armitage trend test）によりＡＤとの関連を評価した。なお、genomic
inflation factorは1.03であり、集団の偏りによる偽陽性の関連が得られる可能性は低
いと示唆された。

ＧＷＡＳの結果、2q12領域、6p21.3領域、および11p15.4領域に存在する計３６個のＳ
ＮＰｓが、ゲノムワイドな有意性（genome-wide significance）の閾値として設定されたＰ＜５×１０^−８を満たし、ＡＤとの有意な関連を示した（図１）。

また、ヨーロッパ人および中国人のＧＷＡＳならびにそれらのメタ解析により、７つのＡＤ感受性領域が報告されている（非特許文献５〜７）。本実施例のＧＷＡＳの結果、これら７つの領域の全てについて、ＡＤとの関連が見られた（表２）。

ＲＡＦ；リスクアレル頻度（Risk Allele Frequency）
ＯＲ；オッズ比（Odds Ratio）
ａ：「Reported」は、報告されているＳＮＰおよび元のＧＷＡＳにおける関連データ（＊）を示す。「Current」は、報告されているＳＮＰと最大のＬＤを示すＳＮＰ、および本
実施例のＧＷＡＳで各領域においてＡＤと最も強い関連を示したＳＮＰを示す。
ｂ：非特許文献５の最初のＧＷＡＳ（GWA set 1）におけるＲＡＦ。

＜検証試験（validation study）＞
ＧＷＡＳで見出された上記３領域（2q12領域、6p21.3領域、および11p15.4領域）とＡ
Ｄとの関連の検証、およびさらなるＡＤ感受性領域の同定のため、ＡＤ被検者1,856名お
よび対照被検者7,021名を用いて検証試験を行った。遺伝子型の解析は、表１に記載の通
り、TaqMan assay（Life Technologies）、multiplex-PCR based Invader assay（Third Wave Technologies）、またはIllumina HumanOmniExpress BeadChip（Illumina）により
行った。

まず、ＧＷＡＳで見出された上記３領域（2q12領域、6p21.3領域、および11p15.4領域
）の計１０個のタグＳＮＰｓ（ｒ^２＜０．８０）の遺伝子型を解析した。その結果、これら３領域とＡＤとの関連が再度確認された。

次いで、ＧＷＡＳでＰ＜１×１０^−４を示したＳＮＰｓを調査し、既知の７つのＡＤ感受性領域と上記３領域のものを除いた計８７個のタグＳＮＰｓ（ｒ^２＜０．８０）の遺伝子型を解析した。その結果、計１１個のＳＮＰｓが、ボンフェローニ補正後の有意性の閾値であるＰ＜５．７５×１０^−４（＝０．０５／８７）を満たし、ＡＤとの有意な関連を示した。

Mantel-Haenszel法によりＧＷＡＳと検証試験の結果を組み合わせたところ、計８つの
領域が、ゲノムワイドな水準で有意にＡＤと関連することが見出された（表３、図２）。また、Breslow-Day検定によれば、Ｐ＞０．０５であり、有意な不均一性は認められなか
った（表３）。

Ｒｉｓｋ；リスクアレル（Risk Allele）
ＲＡＦ；リスクアレル頻度（Risk Allele Frequency）
ＯＲ；オッズ比（Odds Ratio）
ＣＩ；信頼区間（Confidence Interval）
ａ：各ステージにおけるコクラン・アーミテージ傾向検定のＰ値。
ｂ：ＯＲおよびＣＩは非感受性アレル（non-susceptible allele）を対照として算出した。
ｃ：統合解析（combined analysis）の結果は、Mantel-Haenszel法により算出した。
ｄ：Breslow-Day検定の結果。

2q12領域のＡＤ関連領域には、IL1RL1遺伝子、IL18R1遺伝子、およびIL18RAP遺伝子が
含まれており、これらはIL-1（インターロイキン−１）ファミリーサイトカインの受容体をコードする。IL-1ファミリーサイトカインには、IL-1、IL-18、IL-33等が含まれる。IL-33は、ＡＤの傷害された細胞で分泌され、Ｔ_Ｈ２タイプの免疫応答とＡＤの発症を促進
することが知られている。IL1RL1タンパク質は、IL-33受容体のサブユニットであり、タ
イプ２ヘルパーＴ細胞（Ｔ_Ｈ２）およびマスト細胞で発現する。2q12領域のIL-1受容体遺伝子クラスタ領域および9p21.4領域のIL-33遺伝子領域は、近年実施されたＧＷＡＳによ
り、気管支喘息（bronchial asthma）の感受性領域として見出されている（Moffatt, M.F. et al. N. Engl. J. Med. 363, 1211-1221 (2010)、Torgerson, D.G. et al. Nat. Genet. 43, 887-892 (2011)）。

本実施例では、MHC class III領域のrs176095が、ＡＤと最も強く関連するＳＮＰとし
て見出された（表３）。MHC（主要組織適合遺伝子複合体（major histocompatibility complex）；HLAともいう）は、多くの自己免疫疾患に関与しており、自己免疫は、ＡＤ患者における慢性炎症との関連が疑われている。また、ＡＤの重症患者の血清検体中には、ケラチノサイトに対するIgE抗体および内皮細胞に対するIgE抗体が認められる。しかしながら、これまで、MHC領域がゲノムワイドな水準で有意にＡＤと関連するとは知られていな
かった。

11p15.4のＡＤ関連領域には、OR10A3遺伝子およびNLRP10遺伝子が含まれる。OR10A3遺
伝子は、嗅覚受容体ファミリーをコードする遺伝子である。NLRP10遺伝子は、NALPタンパク質をコードする遺伝子であるが、同タンパク質はロイシンリッチな繰り返し領域を欠く。かゆみはＡＤの主要な症状である。そのため、掻くことにより表皮のケラチノサイトが傷害され、ＡＤ患者は微生物に特に感受性となる。NLRPタンパク質は、微生物シグナルおよび危険シグナルのセンシングに関わる。NLRP10タンパク質は、カスパーゼ１依存的なIL-1βの分泌を抑制すること、およびASC（Apoptosis-associated Speck-like protein containing a Caspase recruitment domain）を介したNFκBの活性化を抑制することにより
、抗炎症作用を示す。

3p21.33のＡＤ関連領域には４つの遺伝子が含まれるが、同領域におけるＡＤと最も強
く関連するＳＮＰであるrs6780220はGLB1遺伝子に位置していた。GLB1遺伝子は、β−ガ
ラクトシダーゼをコードする遺伝子である。同領域は、CCR4遺伝子に隣接している。CCR4遺伝子は、CCL22およびCCL17（TARC）に対するＴ_Ｈ２関連ケモカイン受容体をコードする遺伝子である。ケラチノサイト由来のTSLP（thymic stromal lymphopoietin）は、樹状細胞のTARC産生を誘導する。CCR4タンパク質は、炎症の際に、Ｔ細胞の皮膚特異的な補充に関与する。

3q13.2のＡＤ関連領域には、CCDC80遺伝子が含まれる。CCDC80タンパク質は、C/EBPα
の誘導、およびペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（peroxisome proliferator-activated receptor；PPAR）γの誘導に関与する。C/EBPαおよびC/EBPβは、基底ケラチノサイトで共発現しており、ケラチノサイトが基底層から出て末端分化するとともに発現が増大する。PPARγは、免疫細胞を抑制し、PPARγアゴニストは、ＡＤのモデルマウスにおいて
、皮膚でのTSLPの発現と、樹状細胞の成熟および移動を、顕著に抑制する。

7p22のＡＤ関連領域には、CARD11遺伝子が含まれる。CARD11遺伝子は、CARMA1タンパク質をコードする。CARMA1タンパク質は、Ｔ細胞受容体（T cell receptor；TCR）およびＢ細胞受容体（B cell receptor；BCR）のシグナル伝達を介したリンパ球の活性化に必須の足場タンパク質（scaffold protein）である。CARMA1タンパク質は、Ｔ細胞の分化に必須であり、JunBおよびGATA3転写制御因子の制御ならびにそれに続くＴ_Ｈ２細胞特異的サイ
トカインの産生に重要である。また、Carma-1変異のホモ接合体のマウスでは、IgEの過剰産生を伴うＡＤの段階的な進行が認められる。

10q21.2のＡＤ関連領域には３つの遺伝子が含まれるが、同領域におけるＡＤと最も強
く関連するＳＮＰであるrs10995251はZNF365遺伝子に位置していた。同領域は、中国人被検者を用いたＧＷＡＳにより、ＡＤとの関連が示唆されている（非特許文献６）。本実施例では、同領域がゲノムワイドな水準で有意にＡＤと関連することが認められた。また、同領域は、EGR2遺伝子を含んでいる。EGR2遺伝子は、Ｔ細胞の増殖の抑制および炎症の抑制に関与する遺伝子の発現を活性化する、Ｔ細胞アネルギーに関連した転写因子をコードする。

20q13のＡＤ関連領域には、CYP24A1遺伝子およびPFDN4遺伝子が含まれる。PFDN4遺伝子は、分子シャペロン複合体であるプレフォールディン（prefoldin）のサブユニットをコ
ードする。CYP24A1遺伝子は、ミトコンドリアのチトクロムp450スーパーファミリーの酵
素をコードする。同酵素は、側鎖の水酸化により、ビタミンＤ３の活性型である１，５−ジヒドロキシビタミンＤ３の分解を開始する。ビタミンＤは、自然免疫機能および適応免疫機能の制御因子であり、ビタミンＤの欠乏とＡＤの重症化の関連についての報告がある。

本実施例では、IL1RL1領域やHLA領域とＡＤとの関連を見出し（表３）、また、KIF3A/IL13領域やC11orf30領域とＡＤとの関連を再現的に確認した（表２）。IL1RL1領域、HLA領域、IL13領域、およびC11orf30領域は、近年実施されたＧＷＡＳにより、気管支喘息（bronchial asthma）の感受性領域として見出されている（Moffatt, M.F. et al. N. Engl. J. Med. 363, 1211-1221 (2010)、Torgerson, D.G. et al. Nat. Genet. 43, 887-892 (2011)、Hirota, T. et al. Nat. Genet. 43, 893-896 (2011)、Ferreira, M.A. et al. Lancet 378, 1006-1014 (2011)）。また、C11orf30領域は、近年実施されたＧＷＡＳにより、アレルギー性鼻炎（allergic rhinitis）の感受性領域として見出されている（Ramasamy, A. et al. J. Allergy Clin. Immunol. 128, 996-1005 (2011)）。これらの知見から
、ＡＤは、気管支喘息やアレルギー性鼻炎と共通の感受性領域を有し、また、同領域は、種々のアレルギー疾患に共通の遺伝因子を含んでいると示唆される。

以上の通り、全ゲノムレベルでのケース−コントロール（Case-Control）関連解析により、ゲノムワイド水準を満たしてＡＤと関連する８つの領域が見出された。当該領域に存在するＳＮＰｓはアトピー性皮膚炎の検査に有用であり、アトピー性皮膚炎の予防および／または治療に貢献するものである。

Claims (4)

1. 以下の（１）〜（８）から選択される領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてアトピー性皮膚炎を検査することを特徴とする、アトピー性皮膚炎の発症リスクおよび／または発症の有無の判定方法。
   （１）CCDC80遺伝子
   （２）OR10A3/NLRP10遺伝子
   （３）CYP24A1/PFDN4遺伝子
   （４）GLB1遺伝子
   （５）CARD11遺伝子
   （６）ZNF365遺伝子
   （７）IL1RL1/IL18R1/IL18RAP遺伝子
   （８）MHC領域
2. 前記一塩基多型が、配列番号１〜８から選ばれる塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、請求項１に記載の方法。
3. 下記（１）または（２）の配列を有するアトピー性皮膚炎検査用プローブ。
   （１）配列番号１〜８から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列。
   （２）配列番号１〜８から選ばれる塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列。
4. 下記（１）または（２）の領域を増幅することのできるアトピー性皮膚炎検査用プライマー。
   （１）配列番号１〜８から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域。
   （２）配列番号１〜８から選ばれる塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む領域。