JP2014008041A - 胞子への物質導入方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】対象となる胞子に対して5℃〜70℃の温度下で、1秒〜60分間、10MPa〜400MPaで加圧する加圧処理工程と、上記胞子と、上記胞子に導入する物質とを混合する物質混合工程と、を備え、上記物質混合工程は、上記加圧処理工程の前であっても後であってもよい、胞子への物質導入方法。
【選択図】なし
Description
上記胞子と、上記胞子に導入する物質とを混合する物質混合工程と、
を備え、上記物質混合工程は、上記加圧処理工程の前であっても後であってもよい、胞子への物質導入方法を提供する。
B.subtilis(IAM 12118)の胞子を0.1〜400MPa、40℃、15分間の条件で加圧処理した後に蛍光染色法で胞子数を求めた際の結果を表1に示す。すなわち、106CFU/mlの濃度になるようB.subtilis(IAM 12118)の胞子を1/15M リン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁し、ポリエチレン製の袋に無菌的に密封充填した。胞子の懸濁液が充填されたポリエチレン製の袋を、図1に示す加圧加熱装置(光高圧機器(株)製)に入れて加圧処理した。加圧処理が施された胞子の懸濁液を無菌的に反応容器に移した。続いて、150μg/mlの濃度となるよう6−Carboxyfluorescein diacetate:CFDA(Sigma−Aldrich社製)溶液を上記反応容器に添加し、25℃で10分間反応させて発芽した胞子を染色した。染色した胞子の懸濁液をφ13mm、孔径0.2μmのポリカーボネート製メンブランフィルター(アドバンテック東洋(株)製)でろ過した。1000倍の倍率でメンブラン上の蛍光染色された胞子を落射型蛍光顕微鏡(オリンパス(株)製)で観察した。観察した視野の中から20視野を無作為に選んで蛍光染色された胞子を計数した。蛍光染色法における胞子数は以下の式に従って算出した。
蛍光染色された胞子数(cells/mL)=(1視野当たりの蛍光染色された胞子数の平均値)×(メンブランフィルターのろ過面積)/(1視野当たりの面積)/(染色した胞子の懸濁液のろ過量)・・・[1]
また、蛍光染色法で使用した胞子の懸濁液について培養法でも胞子数を求め、蛍光染色法の結果と比較した。培養法は以下の方法により行った。すなわち、胞子の懸濁液を70℃で、20分間加熱した後、適宜希釈して標準寒天培地(日水製薬(株)製)を用いて混釈平板で35℃、48時間の条件で培養し、形成されたコロニーを計数した。培養法における胞子数は以下の式に従って算出した。
胞子数(CFU/mL)=(コロニー数の平均値)×(希釈倍率)・・・[2]
B.subtilis(IAM 12118)の胞子を100MPa、10〜70℃、15分間の条件で加圧処理したこと以外は検討1と同様の方法で染色された胞子を計数した。併せて、検討1と同様の培養法によって胞子数を求めた。これらの結果を表2に示す。なお、蛍光染色法及び培養法による胞子数は、上述した式[1]及び式[2]によって算出した。
B.subtilis(IAM 12118)の胞子を100MPa、40℃、1〜60分間の条件で加圧処理したこと以外は検討1と同様の方法で染色された胞子を計数した。併せて、検討1と同様の培養法によって胞子数を求めた。これらの結果を表3に示す。なお、蛍光染色法及び培養法による胞子数は、上述した式[1]及び式[2]によって算出した。
胞子として、様々な属種の胞子を用いたこと、及び100MPa、40℃、15分間の条件で加圧処理したこと以外は、検討1と同様の方法で染色された胞子を計数した。併せて、検討1と同様の培養法によって胞子数を求めた。これらの結果を表4に示す。なお、蛍光染色法及び培養法による胞子数は、上述した式[1]及び式[2]によって算出した。
食材から分離した胞子(16sRDNAによる遺伝子同定結果:Bacillus pumilus)を約106CFU/mlの濃度になるように1/15M リン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁し、L−Alaを添加せずに、又は、10mMとなるよう添加した後に、50MPa、40℃、5分間の条件で加圧処理した。その後、蛍光染色法によって、染色された胞子を計数した。また、上記胞子の懸濁液にL−Alaを10mMとなるよう添加して大気圧下(0.1MPa)で40℃、15分間の条件で処理した。併せて、検討1と同様の培養法で胞子数を求めた。その後、蛍光染色法によって、染色された胞子を計数した。これらの結果を表5に示した。なお、蛍光染色法及び培養法による胞子数は、上述した式[1]及び式[2]によって算出した。
Claims (5)
- 対象となる胞子に対して5℃〜70℃の温度下で、1秒〜60分間、10MPa〜400MPaで加圧する加圧処理工程と、
前記胞子と、前記胞子に導入する物質とを混合する物質混合工程と、
を備え、前記物質混合工程は、前記加圧処理工程の前であっても後であってもよい、胞子への物質導入方法。 - 前記物質が、色素、タンパク質、オリゴヌクレオチド、プラスミド、放射性同位体を含む化合物、又は、イオンである、請求項1に記載の物質導入方法。
- 前記胞子に対する発芽誘導物質の存在下で、前記加圧処理工程を行う、請求項1又は2に記載の物質導入方法。
- 前記加圧処理工程の後に、前記胞子を大気圧下、5℃〜70℃の温度下で、1〜60分間保持する大気圧処理工程を更に備える、請求項1〜3のいずれか一項に記載の物質導入方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の物質導入方法によって、マーカーとなる前記物質を対象となる胞子に導入する工程を備える、発芽活性のある胞子の測定方法。
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