JP2014002318A

JP2014002318A - 光音響顕微鏡

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Publication number: JP2014002318A
Application number: JP2012138981A
Authority: JP
Inventors: Hisashi Oide; 寿大出
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2012-06-20
Filing date: 2012-06-20
Publication date: 2014-01-09
Anticipated expiration: 2032-06-20
Also published as: WO2013190843A1; US9335253B2; US20150085296A1; JP5885600B2

Abstract

【課題】高速走査が可能で、測定精度の高い光音響波の画像を短時間で取得でき、観察深度の変更にも容易に対処できる光音響顕微鏡を提供する。
【解決手段】観察対象物の吸収波長域の励起光を標本Ｓの内部に集光させる対物レンズ１０と、励起光とは異なる波長の検出光の点光源像を対物レンズ１０の瞳９の中心部に結像させて、対物レンズ１０により標本Ｓに検出光を照射させる検出光用光学系２７と、対物レンズ１０に入射する励起光及び検出光を偏向して標本Ｓを走査する光走査部５ａ，５ｂと、標本Ｓによる検出光の反射光を検出する光検出部（２２〜２４，２８）とを備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、光音響顕微鏡に関するものである。

光音響波とは、物質に吸収波長域の光を照射した際に生じる熱弾性過程において発生する弾性波の一種である。そのため、光音響波は、吸収特性をイメージングする手法として注目されている。また、光音響波は、超音波の一種で、光に比べて散乱の影響を受けにくい特徴を有していることから、生体内部のイメージング手段として適用されている。

光音響波を検出信号としてイメージングに適用する光音響顕微鏡は、観察対象物の吸収波長域に合わせたパルス光を励起光として用い、対物レンズにより集光させたスポットを標本内で走査して、各スポットで発生した光音響波をトランスデューサ等で検出する手法が用いられている。かかる光音響顕微鏡によると、スポットを走査した際に、集光位置に吸収物質が存在すると光音響波が発生するので、その光音響波を検出することにより、標本内の吸収特性をイメージングすることができる。

このような光音響顕微鏡として、空間分解能の向上を図ったものが知られている（例えば、特許文献１参照）。この光音響顕微鏡では、図３に要部の構成を模式的に示すように、レーザパルス光源（図示せず）からの励起光Ｌが、集光レンズ１０１、ピンホール１０２、対物レンズ１０３、補正レンズ１０４、三角プリズム１０５、シリコンオイル１０６、三角プリズム１０７及び超音波レンズ１０８を経て標本Ｓの内部に集光される。なお、三角プリズム１０５及び１０７は、シリコンオイル１０６を介して結合されている。また、標本Ｓは、液浸用バス１０９内において液体１１０に浸漬されている。そして、標本Ｓから発生される光音響波Ｕは、超音波レンズ１０８により集波されて三角プリズム１０７へ入射され、三角プリズム１０７とシリコンオイル１０６との接合面で反射されて超音波トランスデューサ１１１により検出される。

つまり、図３に示した光音響顕微鏡では、三角プリズム１０５及び１０７を用いて、励起用光学系と超音波導波系とを同軸に配置し、更に励起光の集光スポットと超音波検出スポットとが同じ位置に収束するように、集光用の対物レンズ１０３と超音波検出用の超音波レンズ１０８とを、それらの焦点位置が共役な関係となるように配置している。これにより、例えば、励起光として、波長６３０ｎｍのレーザパルス光を用い、対物レンズ１０３として、ＮＡ（開口数）：０．１を用いて、標本Ｓに回折限界が約３．８μｍの励起光を集光させた場合に、約５μｍの光音響波の横分解能を実現することが可能となる。

ところが、図３に示す構成の光音響顕微鏡は、超音波トランスデューサ１１１を用いて光音響波Ｕを検出することから、標本Ｓと超音波トランスデューサ１１１との間の光音響波Ｕの導波路に空気が介在すると、光音響波Ｕが伝播されなくなる。そのため、図３の光音響顕微鏡では、標本Ｓ及び超音波レンズ１０８を液体１１０に浸漬させる必要があるとともに、導波路に配置される素子間に水やオイル等の液体を充填する必要がある。その結果、標本Ｓが制約されたり、信号検出系の構成が複雑化したりすることになる。

一方、他の光音響顕微鏡として、励起光の照射により標本内部で発生した光音響波が標本表面に伝播すると、標本表面に振動が生じるのを利用して、光音響波を非接触で検出するものも提案されている。かかる光音響顕微鏡では、標本の表面又は標本に滴下されたオイル等の液体の表面に励起光とは別の検出光を集光し、該検出光が標本表面の振動により変調されるのを検出する。変調光の検出法には、光干渉断層法（ＯＣＴ：Optical Coherence Tomography)（非特許文献１）や、光ヘテロダイン法（非特許文献２）が知られている。かかる光音響顕微鏡によると、光音響波を直接検出するのではなく、変調光に変換して検出するので、標本に対する制約も大幅に緩和できるとともに、信号検出系も容易に構成することが可能となる。

特表２０１１−５１９２８１号公報

Guy Rousseau, Alain Blouin, and Jean-Pierre Monchalin,「Non-contact photoacoustic tomography and ultrasonography for tissue imaging」Opt. Lett., 36(20), 3975 (2011) Yi Wang, Chunhui Li, and Ruikang K. Wang, Biomed.「Noncontact photoacoustic imaging achieved by using a low-coherence interferometer as the acoustic detector」Opt. Express, 3(1), 16 (2012)

しかしながら、従来提案されている非接触方式の光音響顕微鏡は、イメージングの際に標本が載置されたステージを移動して標本を走査している。そのため、画像取得に時間がかかるとともに、ステージ移動の際に標本の表面に振動が発生して、測定精度が低下することが懸念される。更に、標本に滴下された液体の表面に検出光を集光させるようにしているため、観察深度を変更した場合に、検出光の集光調整に手間がかかることが懸念される。

したがって、かかる観点に鑑みてなされた本発明の目的は、高速走査が可能で、測定精度の高い光音響波の画像を短時間で取得でき、観察深度の変更にも容易に対処できる光音響顕微鏡を提供することにある。

上記目的を達成する光音響顕微鏡の発明は、
観察対象物の吸収波長域の励起光を標本内部に集光させる対物レンズと、
前記励起光とは異なる波長の検出光の点光源像を前記対物レンズの瞳中心部に結像させて、前記対物レンズにより前記標本に前記検出光を照射させる検出光用光学系と、
前記対物レンズに入射する前記励起光及び前記検出光を偏向して前記標本を走査する光走査部と、
前記標本による前記検出光の反射光を検出する光検出部と、
を備えることを特徴とするものである。

本発明の一実施の形態においては、前記光検出部は、前記反射光を光干渉断層法により検出する、ことを特徴とするものである。

本発明の他の実施の形態においては、前記光検出部は、前記反射光を光ヘテロダイン法により検出する、ことを特徴とするものである。

本発明によると、高速走査が可能で、測定精度の高い光音響波の画像を短時間で取得でき、観察深度の変更にも容易に対処できる光音響顕微鏡を提供することができる。

第１実施の形態に係る光音響顕微鏡の要部の構成を模式的に示す図である。第２実施の形態に係る光音響顕微鏡の要部の構成を模式的に示す図である。従来の光音響顕微鏡の要部の構成を模式的に示す図である。

以下、本発明の実施の形態について、図を参照して説明する。

（第１実施の形態）
図１は、本発明の第１実施の形態に係る光音響顕微鏡の要部の構成を模式的に示す図である。本実施の形態に係る光音響顕微鏡は、励起光として、レーザパルス光源１から射出されるパルス光を用いる。励起光は、例えば、標本Ｓが生体で、生体内の血管をイメージングする場合は、ヘモグロビンの吸収波長域の光が用いられる。なお、観察対象は血管に限定されるものではなく、励起光は観察対象に応じた吸収波長域の光が用いられる。また、標本Ｓ内に複数の吸収体が存在する場合は、観察対象の特徴的な吸収スペクトルのピークの波長の光を用いるのが望ましい。レーザパルス光源１からの励起光は、コリメータレンズ２により平行光として射出される。

また、検出光は、低コヒーレント光源であるＳＬＤ（Super Luminescent Diode）２１から射出される、励起光とは異なる波長の光（例えば、連続波）が用いられる。そして、本実施の形態に係る光音響顕微鏡では、励起光の照射により標本Ｓから発生する光音響波によって変調される検出光の反射光（以下、この反射光を反射検出光とも言う）を、光干渉断層法（ＯＣＴ）により検出する。

図１において、コリメータレンズ２により平行光とされた励起光（パルス光）は、ビームスプリッタ３、第１リレー光学系４、ガルバノミラー５ａ、第１瞳（開口絞り）６、ガルバノミラー５ｂ、第２リレー光学系７、反射ミラー８及び第２瞳（開口絞り）９を経て、対物レンズ１０により液滴１１を経て標本Ｓ内に集光される。ここで、ガルバノミラー５ａ，５ｂは、光走査部を構成するもので、標本Ｓへの照射光を、対物レンズ１０の光軸と直交する平面内で二次元方向に走査する。なお、図１では、図面を簡略化するため、ガルバノミラー５ａ，５ｂを同一平面内で揺動可能に示している。また、第２瞳９は、対物レンズ１０の像側焦点位置にあり、第１瞳６は、ガルバノミラー５ａ，５ｂの光路の中間に位置し、第２瞳９と共役な位置にある。

一方、ＳＬＤ２１から射出される光は、サーキュレータ２２を経て２×２ファイバカプラ２３により参照光と検出光とに分離される。２×２ファイバカプラ２３で分離される参照光は、参照光用光学系２４を経て反射ミラー２５で反射され、再び参照光用光学系２４を経て２×２ファイバカプラ２３に入射される。

また、２×２ファイバカプラ２３で分離される検出光は、コリメータレンズ２６で平行光に変換された後、検出光用光学系を構成する集光レンズ２７を経て、ビームスプリッタ３に入射されて励起光と同軸に合成される。そして、検出光は、励起光と共通の光学系である、第１リレー光学系４、ガルバノミラー５ａ、第１瞳６、ガルバノミラー５ｂ、第２リレー光学系７、反射ミラー８及び第２瞳９を経て、対物レンズ１０により標本Ｓに照射される。

ここで、集光レンズ２７は、対物レンズ１０の第１瞳６及び第２瞳９の中央部に検出光の点光源像を結像させるように配置が調整される。これにより、対物レンズ１０は、テレセントリック光学系として、検出光をほぼ平行光として標本Ｓに照射する。したがって、ガルバノミラー５ａ，５ｂを揺動させて、励起光及び検出光を偏向させると、標本Ｓは、励起光及び検出光により同軸で二次元走査されるので、励起光によって生じる光音響波が伝播しやすい領域に、検出光を照射することが可能となる。

標本Ｓの内部に励起光が集光されると、観察対象の有無により光音響波が発生して標本Ｓの表面が振動する。これにより、励起光と同時に照射された検出光は、変調されて反射される。標本Ｓにより変調された反射検出光は、往路とは逆の経路を辿って２×２ファイバカプラ２３に入射されてＯＣＴにより検出される。つまり、反射検出光は、２×２ファイバカプラ２３で参照光と干渉され、その干渉光が直接又はサーキュレータ２２を経て光検出器２８で受光される。これにより、標本Ｓの表面の変位が、干渉信号の強度変化として検出される。したがって、サーキュレータ２２、２×２ファイバカプラ２３、参照光用光学系２４、反射ミラー２５及び光検出器２８は、光検出部を構成する。

光検出器２８の出力は、画像処理部３１に供給される。また、レーザパルス光源１、ガルバノミラー５ａ，５ｂ及び画像処理部３１は、プロセッサ３２により同期して制御される。これにより、画像処理部３１において光音響波による画像データが生成されて表示部３３に表示される。

本実施の形態に係る光音響顕微鏡によれば、ガルバノミラー５ａ，５ｂにより励起光を偏向すると、励起光と検出光との光軸をほぼ一致させながら、平行光である検出光も同時に偏向して標本Ｓを走査することができる。したがって、励起光の照射により発生した光音響波が標本Ｓの表面に伝播した際に生じる表面振動によって変調された反射検出光を、効率的に検出することが可能となる。しかも、励起光及び検出光は、ガルバノミラー５ａ，５ｂにより走査されるので、高速走査が可能であるとともに、走査中に、ステージ走査の場合のような振動等が標本Ｓに生じない。したがって、標本Ｓで変調された反射検出光を安定的に高精度で検出することができ、高Ｓ／Ｎの画像を短時間で取得することが可能となる。

また、標本Ｓの観察深さを変更する場合は、対物レンズ１０及び／又は標本Ｓが載置されたステージ（図示せず）を対物レンズ１０の光軸方向に移動させて、励起光の集光位置を変更することができる。そして、変更した集光位置で、同様にガルバノミラー５ａ，５ｂにより励起光及び検出光を偏向して、対物レンズ１０の光軸と直交する平面内で標本Ｓを二次元方向に走査することにより、深さの異なる画像を迅速に取得することが可能となる。

ここで、対物レンズ１０を光軸方向に移動させて集光位置を変更する場合は、対物レンズ１０の第２瞳９の位置も光軸方向に移動する。したがって、この場合は、対物レンズ１０の移動に合わせて、集光レンズ２７を光軸方向に移動させる必要がある。しかし、この場合、検出光を標本Ｓ上の液滴１１の表面に集光させる必要はなく、検出光が対物レンズ１０からほぼ平行光で射出されるように、検出光の点光源像を移動後の第２瞳９の中央部に結像させればよいので、集光レンズ２７の調整が容易になる。これにより、対物レンズ１０の移動後も、検出光をほぼ平行光として、励起光と同軸で、つまり励起光の主光線上で標本Ｓに照射させることが可能となる。このように、対物レンズ１０を移動させて観察深さを変更する場合にも容易に対処でき、所望の観察深さにおいて標本Ｓの変位を高精度かつ安定的に検出することが可能となる。

また、本実施の形態に係る光音響顕微鏡では、標本Ｓにより変調された反射検出光を、低コヒーレント光源であるＳＬＤ２１を用いた干渉計測であるＯＣＴによって検出するので、特定の反射面からの信号を選択的に検出することが可能となる。したがって、標本Ｓ内に存在する界面からの反射光成分が存在する場合でも、標本Ｓの表面からの反射光成分のみを検出することができるので、反射検出光を高感度で検出することが可能となる。

なお、図１に示したように、標本Ｓの表面には、液滴１１を形成しておくことが望ましい。つまり、標本Ｓに表面粗さや局所的な凹凸、段差等が存在する場合、散乱の影響により検出される反射検出光が低下したり、走査位置毎に検出される反射検出光に強度差が生じたりして、安定的な信号を検出することが困難となる。これに対し、標本Ｓの表面に液滴１１を形成すれば、標本Ｓの表面形状によらず、液滴１１の表面は滑らかな略平面となる。しかも、液滴１１は、光音響波を伝播するので、標本Ｓの表面に伝播した光音響波による表面振動は、液滴１１内を伝播して同様に液滴１１の表面で振動することになる。したがって、液滴１１の表面での反射検出光を検出することにより、検出光の変調成分を検出することが可能となる。この際、液滴１１の表面では、表面散乱の影響を抑えることが可能であり、安定的な検出が可能となる。なお、液滴１１の材料は、水に限らず、光音響波を伝播し、滑らから表面を形成するような液体やゲル等を用いることが可能である。

また、対物レンズ１０の瞳位置へ結像させる検出光の開口数を調整することで、対物レンズ１０から射出される検出光の平行光の光束径を調整することが可能である。例えば、開口数を大きくすると、対物レンズ１０から射出される平行光の光束径は大きくなり、開口数を小さくすると、光束径は小さくなる。したがって、例えば、標本Ｓの被検面の形状に合わせて、検出光の光束径を容易に最適化することが可能となる。

（第２実施の形態）
図２は、本発明の第２実施の形態に係る光音響顕微鏡の要部の構成を模式的に示す図である。本実施の形態に係る光音響顕微鏡は、第１実施の形態に係る光音響顕微鏡と光検出部の構成が異なるものである。すなわち、第１実施の形態では、標本Ｓにより変調された反射検出光をＯＣＴにより検出したが、本実施の形態では、標本Ｓにより変調された反射検出光を光ヘテロダイン法により検出する。その他の構成は、第１実施の形態と同様であるので、図１と同様の作用をなす構成要素には同一参照符号を付して説明を省略する。

本実施の形態に係る光音響顕微鏡は、検出光として、ＬＤ（Laser Diode）５１から射出される、励起光とは異なる波長の光（例えば、連続波）が用いられる。ＬＤ５１から射出される光は、ファイバ５２を経てコリメータレンズ５３に入射されて平行光とされた後、偏光ビームスプリッタ５４により互いに直交する直線偏光の参照光と検出光とに偏光分離される。偏光ビームスプリッタ５４で分離された参照光は、集光レンズ５５により集光されてファイバ５６を経て光ヘテロダイン検出部５７に入射される。

一方、偏光ビームスプリッタ５４で分離された直線偏光の検出光は、１／４波長板５８により円偏光に変換された後、検出光用光学系を構成する集光レンズ５９を経てビームスプリッタ３に入射されて励起光と同軸上に合成される。そして、第１実施の形態の場合と同様にして、検出光は、励起光と共通の光学系である、第１リレー光学系４、ガルバノミラー５ａ、第１瞳６、ガルバノミラー５ｂ、第２リレー光学系７、反射ミラー８及び第２瞳９を経て、対物レンズ１０により標本Ｓに照射される。なお、集光レンズ５９は、対物レンズ１０の光軸上の位置に応じて、対物レンズ１０の第１瞳６及び第２瞳９の中央部に検出光の点光源像を結像させるように配置が調整される。

また、標本Ｓで変調されてビームスプリッタ３から射出される反射検出光は、往路とは逆の経路を辿って集光レンズ５９を経て１／４波長板５８に入射される。そして、１／４波長板５８を透過することにより、反射検出光は、往路とは偏光方向が直交する直線偏光に変換されて偏光ビームスプリッタ５４で反射される。偏光ビームスプリッタ５４で反射される反射検出光は、集光レンズ６０により集光されてファイバ６１を経て光ヘテロダイン検出部５７に入射される。

光ヘテロダイン検出部５７は、入射する参照光と反射検出光とによる光ヘテロダイン干渉を計測して、標本Ｓの表面の変位に伴う周波数変調成分を干渉信号の強度の変化として検出する。したがって、本実施の形態において、偏光ビームスプリッタ５４、集光レンズ５５、ファイバ５６、光ヘテロダイン検出部５７、１／４波長板５８、集光レンズ６０及びファイバ６１は、光検出部を構成する。

光ヘテロダイン検出部５７の出力は、第１実施の形態の場合と同様に、画像処理部３１に供給される。また、レーザパルス光源１、ガルバノミラー５ａ，５ｂ及び画像処理部３１は、プロセッサ３２により同期して制御される。これにより、画像処理部３１において光音響波による画像データが生成されて表示部３３に表示される。

本実施の形態に係る光音響顕微鏡においても、第１実施の形態に係る光音響顕微鏡と同様の効果が得られる。特に、本実施の形態では、標本Ｓにより変調された反射検出光を光ヘテロダイン法により検出するので、光ヘテロダイン検出部５７において変調前の検出光と変調後の反射検出光とを重ね合わせることで、僅かな周波数の差を検出することができる。したがって、標本Ｓからの反射検出光を、より高感度で検出することが可能となる。

なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、励起光は、レーザパルス光源１からファイバを経てコリメータレンズ２に導入するようにしてもよい。

１レーザパルス光源
２コリメータレンズ
３ビームスプリッタ
４，７リレー光学系
５ａ，５ｂガルバノミラー
６，９瞳（開口絞り）
８反射ミラー
１０対物レンズ
１１液滴
２１ＳＬＤ
２２サーキュレータ
２３２×２ファイバカプラ
２４参照光用光学系
２５反射ミラー
２６コリメータレンズ
２８光検出器
３１画像処理部
３２プロセッサ
３３表示部
５１ＬＤ
５２，５６，６１ファイバ
５３コリメータレンズ
５４偏光ビームスプリッタ
５５集光レンズ
５７光ヘテロダイン検出部
５８１／４波長板
５９，６０集光レンズ
Ｓ標本

Claims

観察対象物の吸収波長域の励起光を標本内部に集光させる対物レンズと、
前記励起光とは異なる波長の検出光の点光源像を前記対物レンズの瞳中心部に結像させて、前記対物レンズにより前記標本に前記検出光を照射させる検出光用光学系と、
前記対物レンズに入射する前記励起光及び前記検出光を偏向して前記標本を走査する光走査部と、
前記標本による前記検出光の反射光を検出する光検出部と、
を備えることを特徴とする光音響顕微鏡。
前記光検出部は、前記反射光を光干渉断層法により検出する、ことを特徴とする請求項１に記載の光音響顕微鏡。
前記光検出部は、前記反射光を光ヘテロダイン法により検出する、ことを特徴とする請求項１に記載の光音響顕微鏡。