JP2013544510A - 細胞において外来性ｒｎａを特異的に切断するための組成物および方法 - Google Patents

細胞において外来性ｒｎａを特異的に切断するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

内在性シグナルＲＮＡ配列が存在する場合にのみ対象外来性ＲＮＡを切断し、それにより、内在性シグナルＲＮＡ配列が存在する場合にのみ対象ポリヌクレオチドの発現を活性化するための組成物が提供される。前記組成物の製造方法、および例えば特定の標的細胞集団においてのみ毒素の発現を選択的に活性化することによる、種々の症状および障害の処置および診断におけるその使用が提供される。
【選択図】なし

Description

本発明は、内在性シグナルＲＮＡ配列が存在する場合にのみ対象外来性ＲＮＡを切断し、それにより、内在性シグナルＲＮＡ配列が存在する場合にのみ対象ポリヌクレオチドの発現を活性化するための組成物に関する。本発明はさらに、特定の標的細胞集団においてのみ毒素の発現を選択的に活性化することにより具現化される、種々の症状および障害の処置および診断における前記組成物の使用に関する。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的遺伝子のある特定の領域に相同なセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡから構成されるｄｓＲＮＡがその標的遺伝子転写物の相同領域の切断を果たし、それにより、その遺伝子の発現を阻害するという現象である。哺乳動物では、アポトーシスによる細胞死を引き起こし得るインターフェロン応答の誘導を避けるには、このｄｓＲＮＡは３１塩基対よりも短くなければならない。ＲＮＡｉ技術は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を用いて転写後遺伝子発現を調節する天然の機構に基づくものである［１］。ｍｉＲＮＡは、推定ＲＮＡステム−ループ構造を形成する７０〜９０ヌクレオチドの前駆体に由来すると思われる約２１ヌクレオチド長の極めて小さなＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、線虫、ミバエ、ヒトおよび植物などの多様な生物で発現される。
哺乳動物では、ｍｉＲＮＡは一般にＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写され、生じた一次転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）は、ドロシャ（Ｄｒｏｓｈａ）−ＤＧＣＲ８複合体により切断される局部的ステム−ループ構造を含む。この切断の産物は、１以上の（クラスターの場合）前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）である。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、通常７０〜９０ヌクレオチド長であり、強固なステム−ループ構造を持ち、通常、３′末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを含む［２］。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、エクスポーチン−５によって細胞質に輸送される。細胞質では、ＲＮアーゼＩＩＩファミリーのエンドリボヌクレアーゼである酵素ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）が、このｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステムをｄｓＲＮＡとして認識して切断し、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの３′末端および５′末端から２１ｂｐのｄｓＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ二本鎖）を遊離させる。この二本鎖の２本の鎖はダイサー−ＴＲＢＰ複合体によって互いから分離され、熱力学的に弱い５′末端を有する鎖がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＮＡ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＲＩＳＣ）に組み込まれる［３］。この鎖は成熟ｍｉＲＮＡである。ＲＩＳＣに組み込まれない反対の鎖はｍｉＲＮＡ＊鎖と呼ばれ、これは分解される［１］。成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣをｍＲＮＡ内の標的部位へと導く。この標的部位に成熟ｍｉＲＮＡと完全に近い相補性があれば、そのｍＲＮＡはその標的部位の３′末端から約１０ヌクレオチド上流に位置する位置で切断される［３］。切断後、ＲＩＳＣ−成熟ｍｉＲＮＡ鎖複合体は、次回の活性に再利用される［４］。この標的部位の、成熟ｍｉＲＮＡに対する相補性が低ければ、ｍＲＮＡは標的部位で切断されず、ｍＲＮＡの翻訳が抑制される。これまでにヒトでは約５３０のｍｉＲＮＡが確認されているが、脊椎動物ゲノムは最大１，０００のユニークなｍｉＲＮＡをコードしていると推測され、これらは遺伝子の少なくとも３０％の発現を調節していると思われる［５］。図１参照。
哺乳動物細胞においてＲＩＳＣ−成熟ｍｉＲＮＡ鎖複合体により切断されたｍＲＮＡの２つの部分はノーザン分析によって容易に検出することができる［６］。約２３ヌクレオチド長の２つのＲＮＡ転写物は、その５′末端に約１９ヌクレオチド長の相補的領域を持ち、哺乳動物細胞において互いにハイブリダイズし、標的特異的ＲＮＡ干渉を指示する能力を有する［７］。ＲＮＡ干渉および／またはＤＮＡメチル化などの標的特異的核酸改変を媒介するために必要な二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ分子の配列および構造的特徴は、例えば、米国特許第７，０７８，１９６号および米国特許第７，０５５，７０４号に開示されている。その３′末端の一方に２０ヌクレオチド長のｓｓＲＮＡをさらに含む、５２ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡは、平滑末端の場合にのみダイサーの基質となる［８］。哺乳動物では、Ｒｉｓｃはダイサーと結合する［９］。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ Ｕ６プロモーターは低分子ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）を転写するための極めて強力なプロモーターであるが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ ＣＭＶプロモーターは、タンパク質コード遺伝子を転写するための強力なプロモーターである。
哺乳動物細胞では、ｍＲＮＡの５′末端にキャップ（７−メチルグアノシンキャップ）を付加すると、そのｍＲＮＡの翻訳が３５〜５０倍増加する。さらに、ｍＲＮＡの３′末端にポリ（Ａ）テールを付加すると、そのｍＲＮＡの翻訳が１１４〜１５５倍増加する［１０］。哺乳動物細胞においてポリ（Ａ）テールは機能的ｍＲＮＡの半減期を２．６倍延長し、キャップは機能的ｍＲＮＡの半減期を１．７倍延長する［１０］。ヒトＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ（Ｈ２ａｃ）遺伝子は、ヒストンＨ２Ａファミリーのメンバーをコードする。この遺伝子からの転写物はポリ（Ａ）テールを欠くが、代わりに、３′−ＵＴＲにおいて保存されたステム−ループ構造を形成する回文型終結エレメント（５′−ＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣ−３′）を含み、ｍＲＮＡのプロセシングおよび安定性に重要な役割を果たす［１１］。
リボソーム不活性化タンパク質（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＲＩＰ）は、植物または微生物起源のタンパク質毒素である。ＲＩＰは、リボソームを不活性化することによってタンパク質合成を阻害する。最近の研究では、ＲＩＰはアポトーシスによる細胞死も誘導し得ることが示唆されている。ＩＩ型ＲＩＰは、ジスルフィド結合により結合された有毒なＡ鎖とレクチン様サブユニット（Ｂ鎖）を含む。Ｂ鎖は触媒的には不活性であるが、Ａ−Ｂタンパク質複合体のサイトゾルへの流入を媒介する働きをする。リシン、アブリンおよびジフテリア毒素は、極めて強力なＩＩ型ＲＩＰである。１分子のリシンまたはアブリンがサイトゾルに達するだけで細胞を死滅させ得ることが報告されている［１２、１３］。さらに、１分子のジフテリア毒素フラグメントＡが細胞に導入されるだけで細胞を死滅させ得る［１４］。
ＷＨＯ（世界保健機関）によれば、２００６年で、世界のＨＩＶ保有人口は約３９５０万人であった。ＨＩＶを含む多くのウイルスは、休眠期または潜伏期を示し、その間はタンパク質合成はほとんど、または全く起こらない。ウイルス感染は、このような期間には免疫系の監視を本質的に逃れている。現行の抗ウイルス治療レジメンは、潜伏ウイルスの細胞貯蔵庫を除去するということには主として有効でない［１５］。ウイルスは、それらのゲノム中の癌遺伝子のために発癌性となり得る。レトロウイルスもまた、遺伝子を末端切断する位置、または遺伝子を強力なウイルスシス作用調節エレメントの制御下に置く位置に組み込まれることにより発癌性となり得る。
アメリカ癌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ）によれば、２００７年には世界で７６０万人が癌のために死に至った。癌治療の性質および基本的アプローチは絶えず変化している。放射線療法、手術および血管新生の阻害などの癌治療のいくつかのアプローチは、多数の小転移に対しては有効でない。細胞分裂の阻害および分裂細胞の破壊などの癌治療の他のアプローチは特異性がなく、従って、患者を死に至らせることさえある有害な副作用を生じるおそれがある。腫瘍組織の分化誘導、癌遺伝子の阻害、癌細胞に独特な膜受容体タンパク質に対するリガンドを含むウイルス、免疫系の操作および免疫毒素療法などの癌治療のさらなるアプローチは、治療指数が狭く、通常、十分に有効でない。腫瘍抑制遺伝子を使用する、また癌細胞において独自に活性化されているプロモーター下で毒素を使用する癌治療のさらに他のアプローチも、治療指数が狭く、有害な副作用を生じる可能性が大きく、通常、十分に有効でない。
癌を生じる多くのウイルスは、潜伏感染を生じ得る。ＫＳＨＶ（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）はカポジ肉腫を生じ；ＳＶ４０（サル空胞化ウイルス４０）は腫瘍を生じる可能性があるが、ほとんどの場合では潜伏感染として持続し；ＥＢＶ（エプスタイン−バーウイルス）はバーキットリンパ腫、鼻咽頭癌およびＥＢＶ関連胃癌を生じる。
平均して、各腫瘍は約９０のタンパク質コード遺伝子に突然変異を含む［１６］。各腫瘍は１つの創始細胞に起源する［３８］。これらの突然変異遺伝子の少なくとも１つがｍＲＮＡへと転写される可能性が最も高い。従って、特定の腫瘍の各細胞または特定のウイルスに感染した各細胞は、突然変異細胞または感染細胞に独特でありかつ同じ生物の他の正常細胞には存在しない特定のＲＮＡ配列（シグナル配列）を含むＲＮＡ分子を含んでいる可能性が高い。このシグナル配列はウイルス起源または突然変異遺伝子起源のものであり得、特定の腫瘍に独特なものである。
特定の腫瘍に独特な特定の配列を同定するために種々の方法が開発されている。これらの方法には、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ、Ｔｉｌｌｉｎｇ法（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅｓ）および癌ゲノムの大規模シーケンシングが含まれる。さらに、このシグナル配列の同定は、２００５年１２月１３日に着手され、癌の原因となる遺伝子突然変異を全て一覧化した癌ゲノムアトラス（ＮＩＨにより実施）のためにいっそう簡単になると思われる。
特定のシグナル配列を含む細胞だけを選択的に死滅させるための組成物が提案されている。Ｉｎｔｒｏｎｎ Ｃｏｍｐａｎｙにより開発された１つのアプローチは、不活性毒素とシグナル配列の間のトランススプライシングにより活性化される不活性毒素を構築することである［１７、１８および１９］。しかしながら、このアプローチには固有の問題がある。第１の問題は、トランススプライシング事象は極めてまれにしか起こらないので、シグナル配列を含むＲＮＡ分子が細胞内に極めて高いコピー数で存在しなければならないということである。第２の問題は、癌では突然変異は短い領域に散在しているので、ほとんどの場合でこのアプローチは癌起源のシグナル配列には適さないということである。第３の問題は、トランススプライシング事象はランダムにも起こり得るので、有害な副作用を引き起こすおそれがあるということである。第４の問題は、シグナル配列を含むＲＮＡ分子は極めて特異的な部位にイントロンを含まなければならないということである。２００４年バイオテクノロジー部門でワールドテクノロジー賞を受賞した別のアプローチは低分子ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ヘアピンＤＮＡおよび制限酵素の使用を示唆したが、このアプローチは細胞抽出物では極めて独特な条件下でしか機能せず、生細胞では生理学的条件下では機能しない［２０］。例えば、ＷＯ０７／０００６８に開示されているものなどの他のアプローチは、ｍｉＲＮＡ配列標的を含む遺伝子ベクター、および対応するｍｉＲＮＡを含む細胞において導入遺伝子の発現を妨げるまたは低減するためのその使用を対象とする。また、例えば、ＷＯ２０１０／０５５４１３には、導入遺伝子に機能的に連結された調節配列（この調節配列は造血系細胞において前記導入遺伝子の発現を妨げるまたは低減する）を含む末梢器官細胞における導入遺伝子の一時的発現に適合した遺伝子ベクターが開示される。
従って、シグナル配列を含む細胞のみを選択的に死滅させることができる新たな組成物を開発する必要があり、これらの組成物は、先行技術（ｐｒｉｏｒ ａｒｅ）で使用される組成物に比べて強力で信頼性があり、かつ、特異的であるべきである。これらの組成物の開発は極めて複雑な多段階のプロセスであるので、シグナル配列が存在する場合にのみ細胞において対象遺伝子を活性化するための、かつ、シグナル配列が存在する場合にのみ対象外来性ＲＮＡを切断するための組成物を開発する必要もある。
本発明は、細胞内の内在性シグナルＲＮＡの存在に応答して対象外来性ＲＮＡを選択的に切断するための組成物および方法を提供する。対象外来性ＲＮＡは前記組成物によりコードされている。前記内在性シグナルＲＮＡは、１８〜２５ヌクレオチド長の配列である所定シグナル配列を含むＲＮＡ分子である。内在性シグナル配列の存在下での外来性ＲＮＡの特異的切断に続いて、対象ポリヌクレオチドの転写が活性化され得る。活性化されるポリヌクレオチドは毒素をコードしてもよく、それにより、標的細胞集団を選択的に死滅させる手段が提供される。
本発明の組成物は、
（ａ）所定シグナル配列に対して十分な相補性がある特定の配列を含むＲＮＡ配列である対象外来性ＲＮＡ；
（ｂ）所定シグナル配列の５′末端または３′末端で内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得る機能的ＲＮＡ；および
（ｃ）形成されるＲＮＡ二本鎖が１４〜３１ヌクレオチド長となり、かつ、それが０〜５ヌクレオチドの３′または５′オーバーハングを含むように（その結果、このＲＮＡ二本鎖はダイサーの基質となる）、所定シグナル配列末端に所定シグナル配列を含む切断されたシグナルＲＮＡ部分と結合し得るＲＮＡ分子であるキャリアＲＮＡ
を含む、またはコードする。
従って、内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に前記組成物を導入した後には、その機能的ＲＮＡは所定シグナル配列の５′末端または３′末端で内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし、次に、キャリアＲＮＡは、所定シグナル配列末端に所定シグナル配列を含む切断されたシグナルＲＮＡとハイブリダイズし、ダイサーおよびＲｉｓｃによる所定シグナル配列のプロセシングを指示し、次に、Ｒｉｓｃ−シグナル配列複合体が特定の標的／切断部位での対象外来性ＲＮＡの切断を指示する。
ダイサーまたはＲｉｓｃプロセシングは、付加的タンパク質を必要とする可能性がある。本発明の別の実施形態では、キャリアＲＮＡはまた、第２の外来性ＲＮＡ分子から生成されてもよい。所定シグナル配列は、限定されるものではないが、ウイルスＲＮＡ配列、および新生細胞に独特な配列から選択され得る。機能的ＲＮＡは、限定されるものではないが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、投げ輪型ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、リボザイムなどから選択され得る。本発明の別の実施形態では、本発明の組成物はまた、所定シグナル配列の、第１の機能的ＲＮＡにより切断された側とは反対の末端で内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得る付加的機能的ＲＮＡを含み得るか、またはコードしてもよい。特定の実施形態では、前記組成物によりコードされるキャリアＲＮＡは、ポリメラーゼＩに基づくプロモーターまたはポリメラーゼＩＩＩに基づくプロモーターにより駆動され得る。
本発明の一実施形態では、前記対象外来性ＲＮＡは、
（ａ）対象外来性タンパク質をコードする配列；および
（ｂ）前記対象外来性タンパク質の発現を阻害し得る阻害配列
を、前記特定の標的／切断部位が前記阻害配列と前記対象外来性タンパク質をコードする配列の間に位置し、これにより、前記組成物を内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に導入した後に、前記対象外来性ＲＮＡが転写され、前記特定の標的／切断部位で切断され、その結果、前記阻害配列が前記対象外来性タンパク質をコードする配列から分離され、対象外来性タンパク質が発現され得るように、さらに含んでよい。
前記対象外来性タンパク質は、限定されるものではないが、タンパク質毒素であるリシン、アブリン、ジフテリア毒素、タンパク質毒素を含む融合タンパク質など、またはそれらの組合せから選択され得る。これらのうちいずれか１分子で、これらの分子のいずれかが発現される細胞を死滅させるのに十分であり得る。阻害配列は特定の標的／切断部位の下流に位置しても上流に位置してもよい。特定の標的／切断部位の上流に位置する阻害配列は、限定されるものではないが、複数の開始コドン（これらの各開始コドンはＫｏｚａｋコンセンサス配列内に位置する）、または他の任意の翻訳開始モチーフ（これらの各開始コドンと対象タンパク質をコードする配列は同じリーディングフレームにはない）であり得る。よって、これらの開始コドンは、切断の前には対象タンパク質の発現の抑制をもたらす。
他の実施形態では、所定シグナル配列は内在性シグナルＲＮＡの５′末端または３′末端に位置してよく、前記組成物は必ずしも機能的ＲＮＡをコードしなくてもよい。
いくつかの実施形態によれば、組成物の成分は同じポリヌクレオチド分子によってコードされていても異なるポリヌクレオチド分子によってコードされていてもよい。いくつかの実施形態では、組成物の１以上の成分は同じＲＮＡ分子であり得る。
さらなる特定の実施形態では、本発明は、細胞内に内在性シグナルＲＮＡが存在する場合にのみ対象外来性タンパク質を発現するための組成物を提供し、前記対象外来性タンパク質は前記組成物からコードされ、前記内在性シグナルＲＮＡは、所定シグナル配列を含むＲＮＡ分子であり、前記所定シグナル配列は、少なくとも１８ヌクレオチド長の所定配列であり、かつ、前記組成物は、
（ａ）所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を直接的または間接的に果たし得る機能的ＲＮＡをコードする１以上のポリヌクレオチド配列（前記所定切断部位は所定シグナル配列の３′末端である）；および
（ｂ）本質的に
（１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある第１の配列（前記エッジ配列は、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド上流に位置し、かつ、シグナルＲＮＡ内の上流に延び、前記第１の配列は１以上の開始コドンを含み、各開始コドンは５′−ＡＵＧ−３′から本質的になる）；および
（２）前記第１の配列の上流にあり、０〜５ヌクレオチド長の所定配列である第２の配列；および
（３）前記第１の配列の下流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
からなる対象外来性ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列
を含む１以上のポリヌクレオチド分子を含み；かつ
前記対象外来性ＲＮＡ分子は、前記対象外来性ＲＮＡ分子の５′末端から少なくとも２１ヌクレオチド下流に対象外来性タンパク質をコードする配列を含み；これにより、前記組成物を内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に導入した後に、前記機能的ＲＮＡが、所定シグナル配列の３′末端での内在性シグナルＲＮＡの切断を直接的または間接的に果たし、それにより、前記対象内在性ＲＮＡ分子が、切断された内在性シグナルＲＮＡのエッジ配列とハイブリダイズし、所定シグナル配列に、対象外来性ＲＮＡ分子を切断し得るダイサープロセシングを指示し、それにより、各開始コドンが対象外来性タンパク質をコードする配列から分離され、対象外来性タンパク質が発現され得る。
別の実施形態では、前記エッジ配列は２５〜３０ヌクレオチド長であってよく、所定切断部位から２ヌクレオチド上流に位置し、かつ、内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延びてよく、前記第２の配列は０ヌクレオチド長である。本発明のさらに別の実施形態では、各開始コドンは、各開始コドンと対象外来性タンパク質をコードする配列が同じリーディングフレームにないように、前記対象外来性ＲＮＡ分子の５′末端から０〜２１ヌクレオチド下流に位置してよい。本発明のさらなる実施形態では、前記開始コドンのうち少なくとも１つは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列または他の任意の翻訳開始モチーフ／エレメント内に位置してよい。前記機能的ＲＮＡは、限定されるものではないが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および／またはリボザイムから選択され得る。前記対象外来性タンパク質は、例えば、限定されるものではないが、ジフテリア毒素Ａ鎖、ＲＩＰタンパク質および他の任意のタンパク質毒素であり得る。
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、例えば、限定されるものではないが、遺伝子発現の調節、標的化細胞死、例えば増殖性障害（癌など）、感染性疾患などを含む疾患または症状の治療、疾患または症状の診断、トランスジェニック生物の形成、自殺遺伝子療法などのような種々の方法および適用に使用可能である。
いくつかの実施形態によれば、対象外来性ＲＮＡの特定の標的部位での特異的切断を指示するための１以上のポリヌクレオチドを含む組成物が提供され、前記切断は細胞内に内在性シグナルＲＮＡが存在する場合にのみ起こり、前記内在性シグナルＲＮＡは、シグナル配列を含むＲＮＡ分子であり、前記シグナル配列は、１８〜２５ヌクレオチド長の任意の所定配列であり、これにより、前記組成物を前記内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に導入することで、特定の配列内に位置する特定の標的部位での前記対象外来性ＲＮＡの切断が指示され、前記特定の配列は所定シグナル配列とハイブリダイズするために十分な相補性がある。
いくつかの実施形態では、前記１以上のポリヌクレオチドは、前記対象外来性ＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチド配列；所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を媒介し得る機能的ＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチド配列；およびキャリアＲＮＡをコードする第３のポリヌクレオチド配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、前記キャリアＲＮＡは、少なくとも約１８ヌクレオチド長のＲＮＡ分子であって、かつ、前記ＲＮＡ分子は、エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド下流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の下流に延びる）；前記第１の配列の下流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；前記第１の配列の上流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列から本質的になり；かつ、前記所定切断部位は前記所定シグナル配列の５′末端である。いくつかの実施形態では、前記エッジ配列は２３〜２８ヌクレオチド長であり、かつ、所定切断部位から始まり約２３〜２８ヌクレオチド下流までに位置し、前記第２の配列は２ヌクレオチド長であり、前記第３の配列は０ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、前記キャリアＲＮＡは、少なくとも約１８ヌクレオチド長のＲＮＡ分子であって、かつ、前記ＲＮＡ分子は、エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド上流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延びる）；前記第１の配列の上流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；前記第１の配列の下流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列から本質的になり；かつ、前記所定切断部位は前記所定シグナル配列の３′末端である。いくつかの実施形態では、前記エッジ配列は２５〜３０ヌクレオチド長であり、かつ、所定切断部位から２ヌクレオチド上流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延び、前記第２の配列は０ヌクレオチド長であり、前記第３の配列は０ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、前記キャリアＲＮＡは、少なくとも約１８ヌクレオチド長のキャリア配列を含むポリヌクレオチド配列からプロセシングされてもよく、前記キャリア配列は、エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド下流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の下流に延びる）；前記第１の配列の下流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；前記第１の配列の上流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列から本質的になり；前記ポリヌクレオチド配列は、細胞内において、前記キャリア配列の３′末端であるキャリア切断部位で切断され；前記キャリア切断部位での切断は、前記組成物の第４のポリヌクレオチド配列によりコードされている機能的核酸によって果たされ；かつ、前記所定切断部位は前記所定シグナル配列の５′末端である。
さらなる実施形態では、前記キャリアＲＮＡは、少なくとも約１８ヌクレオチド長のキャリア配列を含むポリヌクレオチド配列からプロセシングされてもよく、前記キャリア配列は、エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド上流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延びる）；前記第１の配列の上流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；前記第１の配列の下流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列から本質的になり；前記ポリヌクレオチド配列は、細胞内において、前記キャリア配列の５′末端であるキャリア切断部位で切断され；前記キャリア切断部位での切断は、前記組成物の第４のポリヌクレオチド配列によりコードされている機能的核酸によって果たされ；かつ、前記所定切断部位は前記所定シグナル配列の３′末端である。
いくつかの実施形態によれば、前記内在性シグナルＲＮＡは、細胞ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡまたはその双方である。さらなる実施形態では、前記所定シグナル配列は、新生細胞、ウイルス感染細胞またはその双方に独特なものである。
いくつかの実施形態によれば、十分な相補性は少なくとも３０％の相補性である。さらなる実施形態では、十分な相補性は少なくとも９０％である。
いくつかの実施形態によれば、前記１以上のポリヌクレオチドは、１以上のＤＮＡ分子、１以上のＲＮＡ分子またはそれらの組合せを含み得る。
いくつかの実施形態では、前記機能的ＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、投げ輪型ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびリボザイムからなる群から選択され得る。
さらなる実施形態によれば、前記対象外来性ＲＮＡは、対象外来性タンパク質をコードする配列と、前記対象外来性タンパク質の発現を阻害し得る阻害配列とをさらに含んでよく；前記特定の標的部位は、前記阻害配列と前記対象外来性タンパク質をコードする配列の間に位置し、これにより、前記組成物を内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に導入した後に、前記対象外来性ＲＮＡが転写され、前記特定の標的部位で切断され、それにより、前記阻害配列が前記対象外来性タンパク質をコードする配列から分離され、対象外来性タンパク質が発現され得る。
いくつかの実施形態では、前記対象外来性タンパク質は毒素である。いくつかの実施形態では、前記対象外来性タンパク質は、リシン、リシンＡ鎖、アブリン、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素Ａ鎖およびそれらの改変形態からなる群から選択される。さらなる実施形態では、前記対象外来性タンパク質は、アルファトキシン、サポリン、トウモロコシＲＩＰ（ｍａｉｚｅ ＲＩＰ）、オオムギＲＩＰ、コムギＲＩＰ、トウモロコシＲＩＰ（ｃｏｒｎ ＲＩＰ）、ライムギＲＩＰ、アマＲＩＰ、志賀毒素、志賀毒素様ＲＩＰ、モモルジン、チミジンキナーゼ、ブタクサ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、シュードモナス外毒素、シュードモナス外毒素Ａ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼおよびそれらの改変形態からなる群から選択される。
さらなる実施形態によれば、前記対象外来性ＲＮＡ配列内の阻害配列は、特定の標的部位の上流に位置する。いくつかの実施形態では、前記阻害配列は１以上の開始コドンを含み、各開始コドンと前記対象外来性タンパク質をコードする配列は同じリーディングフレームになく、かつ、前記阻害配列は前記対象外来性タンパク質の翻訳効率を直接的または間接的に低減する。いくつかの実施形態では、前記１以上の開始コドンは、５′−ＡＵＧ−３′から本質的になる。
さらなる実施形態では、前記対象外来性ＲＮＡは、前記開始コドンと前記対象外来性タンパク質をコードする配列の最初のコドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）の間に位置する終止コドンをさらに含んでよく、前記終止コドンと開始コドンは同じリーディングフレームにある。前記終止コドンは、５′−ＵＡＡ−３′、５′−ＵＡＧ−３′および５′−ＵＧＡ−３′からなる群から選択され得る。
さらなる実施形態によれば、前記阻害配列は、前記開始コドンの下流にヌクレオチド配列をさらに含んでよく、前記ヌクレオチド配列と前記開始コドンは同じリーディングフレームにあり、かつ、前記ヌクレオチド配列は、細胞内局在のための選別シグナルをコードしている。前記細胞内局在は、ミトコンドリア、核、エンドソーム、リソソーム、ペルオキシソームおよび小胞体（ＥＲ）からなる群から選択され得る。
さらなる実施形態によれば、前記阻害配列は、前記開始コドンの下流にヌクレオチド配列をさらに含んでよく、前記ヌクレオチド配列と前記開始コドンは同じリーディングフレームにあり、かつ、前記ヌクレオチド配列は、タンパク質分解シグナルをコードしている。
さらなる実施形態によれば、前記阻害配列は、前記開始コドンの下流にヌクレオチド配列をさらに含んでよく、前記ヌクレオチド配列と前記開始コドンは同じリーディングフレームにあり；前記ヌクレオチド配列と前記対象外来性タンパク質をコードする配列は同じリーディングフレームにあり；かつ、前記ヌクレオチド配列はアミノ酸配列をコードし；これにより、前記アミノ酸配列が前記対象外来性タンパク質に融合されると、前記対象外来性タンパク質の生物学的機能が阻害される。
さらなる実施形態によれば、前記対象ＲＮＡは、前記開始コドンの下流に終止コドンをさらに含んでよく、前記終止コドンと前記開始コドンは同じリーディングフレームにあり、かつ、前記対象外来性ＲＮＡは、前記終止コドンの下流にイントロンをさらに含み、これにより、前記対象外来性ＲＮＡは、ナンセンス依存分解（ＮＭＤ）の標的となる。
さらなる実施形態では、前記阻害配列は、前記対象外来性タンパク質をコードする配列の下流に位置してよく、かつ、前記阻害配列は、細胞内局在のためのＲＮＡ局在化シグナルまたは内在性ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、前記阻害配列は、前記対象外来性タンパク質をコードする配列の上流に位置してよく、前記阻害配列は、折畳み自由エネルギーが−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である二次構造を形成することができ、これにより、前記二次構造が、読み取りリボソームが前記対象外来性タンパク質の最初のコドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）に達しないよう遮断するために十分なものとなる。
いくつかの実施形態では、前記対象外来性ＲＮＡは、前記特定の切断部位の下流であって、かつ、前記対象外来性タンパク質をコードする配列の上流に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列をさらに含んでよく、前記ＩＲＥＳ配列は、完全な対象外来性ＲＮＡ内よりも切断された対象外来性ＲＮＡ内でより機能的となる。
いくつかの実施形態では、前記対象外来性ＲＮＡは、前記対象外来性タンパク質をコードする配列からすぐ上流にヌクレオチド配列を含んでよく、前記ヌクレオチド配列は、切断された対象外来性ＲＮＡにおける前記対象外来性タンパク質の翻訳効率を高める内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記対象ＲＮＡは、前記対象外来性タンパク質をコードする配列からすぐ下流に位置する細胞質ポリアデニル化エレメントを含むヌクレオチド配列をさらに含んでよく、前記細胞質ポリアデニル化エレメントは、切断された対象外来性ＲＮＡにおける前記対象外来性タンパク質の翻訳効率を高める。
いくつかの実施形態によれば、前記組成物は、付加的ＲＮＡ分子をコードする付加的ポリヌクレオチド配列をさらに含んでよく、前記付加的ＲＮＡ分子はその３′末端に、前記特定の標的部位の上流であって、かつ、前記対象外来性タンパク質をコードする配列の下流に位置する配列に結合し得るヌクレオチド配列を含み、前記付加的ＲＮＡ分子は、切断された対象外来性ＲＮＡにおける前記対象外来性タンパク質の翻訳効率を直接的または間接的に高める。
いくつかの実施形態によれば、前記組成物は、阻害配列の上流に位置する位置での前記対象外来性ＲＮＡの切断を果たし得る切断成分をコードする付加的ポリヌクレオチド配列をさらに含んでよく、前記切断成分は、ａ）前記対象外来性ＲＮＡ内に位置し、エンドヌクレアーゼ認識部位、内在性ｍｉＲＮＡ結合部位、シス作用リボザイムおよびｍｉＲＮＡ配列からなる群から選択され、前記対象外来性ＲＮＡにおける前記対象外来性タンパク質の翻訳効率を直接的または間接的に低減する核酸配列；およびｂ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、投げ輪型ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびリボザイムからなる群から選択され、前記対象外来性ＲＮＡにおける前記対象外来性タンパク質の翻訳効率を直接的にまたは間接的低減する阻害ＲＮＡからなる群から選択される。
さらなる実施形態では、前記特定の配列は複数の特定の配列であり、前記特定の標的部位は複数の特定の標的部位である。
いくつかの実施形態では、前記対象外来性ＲＮＡと前記機能的ＲＮＡを同じまたは異なるポリヌクレオチド分子上に位置させることができる。いくつかの実施形態では、前記対象外来性ＲＮＡ、機能的ＲＮＡおよび機能的核酸を１以上のポリヌクレオチド分子上に位置させることができる。
さらなる実施形態によれば、前記組成物の１以上のポリヌクレオチドは、細胞ゲノムに組み込まれてよい。
いくつかの実施形態では、前記細胞は、ヒト細胞、動物細胞、培養細胞および植物細胞からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、前記細胞は生物体内に存在してよい。
いくつかの実施形態によれば、細胞において対象外来性タンパク質の特異的発現を指示するための１以上のポリヌクレオチドを含む組成物がさらに提供され、前記対象外来性タンパク質は、細胞に内在性シグナルＲＮＡが存在する場合にのみ発現され、前記内在性シグナルＲＮＡはシグナル配列を含むＲＮＡ分子であり、前記シグナル配列は１８〜２５ヌクレオチド長の任意の所定配列であり、これにより、前記組成物を、前記内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に導入することで、特定の配列内に位置する特定の標的部位での対象外来性ＲＮＡの切断が指示され、前記特定の配列は所定シグナル配列とハイブリダイズするために十分な相補性があり、細胞において前記対象外来性ＲＮＡが切断された後にのみ、前記切断された対象外来性ＲＮＡによりコードされている対象外来性タンパク質がその細胞において発現され得る。いくつかの実施形態では、前記１以上のポリヌクレオチドは、前記対象外来性ＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチド配列；所定切断部位での前記内在性シグナルＲＮＡの切断を媒介し得る機能的ＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチド配列；およびキャリアＲＮＡをコードする第３のポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態によれば、内在性シグナルＲＮＡを含む特異的細胞集団を死滅させる方法が提供され、前記方法は、前記細胞に、対象外来性ＲＮＡの、特定の配列内に位置する特定の標的部位での特異的切断を指示するための１以上のポリヌクレオチドを含む組成物を導入することを含み、前記特定の配列は前記内在性シグナルＲＮＡとハイブリダイズするために十分な相補性があり、前記内在性シグナルＲＮＡはシグナル配列を含むＲＮＡ分子であり、前記シグナル配列は１８〜２５ヌクレオチド長の任意の所定配列であり；かつ、前記細胞において対象外来性ＲＮＡが切断されると、前記細胞集団を死滅させ得る対象外来性タンパク質の発現が可能となる。前記１以上のポリヌクレオチドは、前記対象外来性ＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチド配列；所定切断部位での前記内在性シグナルＲＮＡの切断を媒介し得る機能的ＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチド配列；およびキャリアＲＮＡをコードする第３のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記内在性シグナルＲＮＡは細胞ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡまたはその双方である。前記細胞集団は、ヒト細胞、動物細胞、培養細胞および植物細胞からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は新生細胞集団である。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は生物体内に存在する。
本発明の目的および利点は以下の記載から明らかとなる。
以下の図は例として示すものであり、これに限定されない。
細胞におけるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の生合成および活性に関するモデルの一般スキーム。 いくつかの実施形態に従う、細胞内の内在性シグナルＲＮＡの存在に応答して対象外来性ＲＮＡを切断するための一例を示す概略図である。この例示的実施形態では、組成物は、２７ヌクレオチドのキャリアＲＮＡ；内在性シグナルＲＮＡの所定シグナル配列に相補的な特定の配列を含む対象外来性ＲＮＡ；および所定シグナル配列の５′末端での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得るｓｈＲＮＡである機能的ＲＮＡをコードする。 いくつかの実施形態に従う、細胞内の内在性シグナルＲＮＡの存在に応答して対象外来性ＲＮＡを切断するための一例を示す概略図である。この例では、本発明の組成物は、２７ヌクレオチドのキャリアＲＮＡ；内在性シグナルＲＮＡの所定シグナル配列に相補的な特定の配列を含む対象外来性ＲＮＡ；および所定シグナル配列の３′末端での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得るｓｈＲＮＡである機能的ＲＮＡをコードする。 いくつかの実施形態に従う、細胞内の内在性シグナルＲＮＡの存在に応答して対象外来性ＲＮＡを切断するための一例を示す概略図である。この例では、本発明の組成物は、内在性シグナルＲＮＡの所定シグナル配列に相補的な特定の配列を含む対象外来性ＲＮＡ、所定シグナル配列の５′末端での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得るｓｈＲＮＡである機能的ＲＮＡ、２７ヌクレオチド長のキャリア配列、およびキャリア配列の３′末端でのキャリアＲＮＡの切断を果たし得るシス作用リボザイムである機能的核酸をコードする。 いくつかの実施形態に従う、細胞内の内在性シグナルＲＮＡの存在に応答して対象外来性ＲＮＡを切断するための一例を示す概略図である。この例では、本発明の組成物は、内在性シグナルＲＮＡの所定シグナル配列に相補的な特定の配列を含む対象外来性ＲＮＡ、所定シグナル配列の３′末端での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得るｓｈＲＮＡである機能的ＲＮＡ、２７ヌクレオチド長のキャリア配列、およびキャリア配列の５′末端でのキャリアＲＮＡの切断を果たし得るシス作用リボザイムである機能的核酸をコードする。 図６Ａはいくつかの実施形態に従う、所定シグナル配列の５′末端での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得る阻害ＲＮＡの一例を示す概略図である。 図６Ｂはいくつかの実施形態に従う、所定シグナル配列の３′末端での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得る阻害ＲＮＡの一例を示す概略図である。 図７Ａはいくつかの実施形態に従う、キャリア配列の３′末端での前記キャリアＲＮＡの切断を果たし得る阻害ＲＮＡの一例を示す概略図である。 図７Ｂはいくつかの実施形態に従う、キャリア配列の５′末端でのキャリアＲＮＡの切断を果たし得る阻害ＲＮＡの一例を示す概略図である。 図８Ａはいくつかの実施形態に従う、ダイサーの基質となり得るＲＮＡ二本鎖である阻害ＲＮＡの一例を示す概略図である。 図８Ｂはいくつかの実施形態に従う、ダイサーの基質となり得るＲＮＡ二本鎖である阻害ＲＮＡの一例を示す概略図である。 図９Ａはいくつかの実施形態に従う、所定切断部位またはキャリア切断部位でのそれぞれ内在性シグナルＲＮＡまたはキャリアＲＮＡの切断を果たし得るハンマーヘッド型リボザイム（配列番号８９）の一例を示す概略図である。 図９Ｂはいくつかの実施形態に従う、所定切断部位またはキャリア切断部位でのそれぞれ内在性シグナルＲＮＡまたはキャリアＲＮＡの切断を果たし得るヘアピン型リボザイムの一例を示す概略図である。例示的ヘアピン型リボザイムは、標的ＲＮＡに相補的な配列、テトラヌクレオチドＡＡＧＡ（配列番号１１４）および標的ＲＮＡに相補的な付加的配列（リボザイムの５′末端にある）とそれに続く配列番号９０から構成される。 いくつかの実施形態に従う、キャリア配列の３′末端でのキャリアＲＮＡの切断を果たし得る極めて有効なシス作用ハンマーヘッドリボザイム、すなわちスノルボザイム（ｓｎｏｒｂｏｚｙｍｅ）（配列番号９１）［２２］である機能的核酸の一例を示す概略図である。 いくつかの実施形態に従う、キャリア配列の５′末端でのキャリアＲＮＡ（配列番号９３）の切断を果たし得る極めて有効なシス作用ハンマーヘッドリボザイムＮ１１７（配列番号９２）［２３］である機能的核酸の一例を示す概略図である。 図１２Ａはいくつかの実施形態に従う、エンドヌクレアーゼ認識部位または内在性ｍｉＲＮＡ結合部位である機能的核酸の一例を示す概略図であり、この場合、キャリア配列の３′末端での機能的核酸はキャリアＲＮＡの切断を果たし得る。 図１２Ｂはいくつかの実施形態に従う、エンドヌクレアーゼ認識部位または内在性ｍｉＲＮＡ結合部位である機能的核酸の一例を示す概略図であり、この場合、機能的核酸はキャリア配列の５′末端でのキャリアＲＮＡの切断を果たし得る。 図１２Ｃはいくつかの実施形態に従う、ｍｉＲＮＡ配列である機能的核酸の一例を示す概略図であり、この場合、ｍｉＲＮＡ配列はキャリア配列の３′末端でのキャリアＲＮＡの切断を果たし得る。 図１２Ｄはいくつかの実施形態に従う、ｍｉＲＮＡ配列である機能的核酸の一例を示す概略図であり、この場合、ｍｉＲＮＡ配列はキャリア配列の５′末端でのキャリアＲＮＡの切断を果たし（ａｆｆｅｃｔｉｎｇ）得る。 図１３Ａはいくつかの実施形態に従う、キャリア配列とともにステムループ構造を形成し得る機能的核酸の一例を示す概略図であり、この場合、ステムループ構造はキャリア配列での３′末端でのキャリアＲＮＡの切断を果たし得る。 図１３Ｂはいくつかの実施形態に従う、キャリア配列とともにステムループ構造を形成し得る機能的核酸の一例を示す概略図であり、この場合、ステムループ構造はキャリア配列の５′末端でのキャリアＲＮＡの切断を果たし得る。 図１４Ａはいくつかの実施形態に従う、ステムループ構造を有する機能的核酸の一例を示す概略図であり、この場合、ループはキャリア配列を含み、ステムループ構造がドロシャおよびダイサーによりプロセシングされると、キャリア配列がステムループ構造から分離されるが、このようにして形成されたｓｉＲＮＡ二本鎖が機能的ＲＮＡであり、これが次に所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得る。 図１４Ｂはいくつかの実施形態に従う、ステムループ構造を有する機能的核酸の一例を示す概略図であり、この場合、ループはキャリア配列を含み、ステムループ構造の発現はポリメラーゼＩまたはＩＩＩに基づくプロモーターにより駆動され、ステムループ構造がダイサーによりプロセシングされると、キャリア配列がステムループ構造から分離されるが、このようにして形成されたｓｉＲＮＡ二本鎖が機能的ＲＮＡであり、これが次に所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得る。 図１５Ａはいくつかの実施形態に従う、機能的ＲＮＡと同じＲＮＡ二本鎖内に位置するキャリア配列の一例を示す概略図であり、この場合、二本鎖領域はキャリア配列の下流に位置し、この二本鎖領域がダイサーによりプロセシングされると、キャリア配列がＲＮＡ二本鎖から分離されるが、このようにして形成されたｓｉＲＮＡ二本鎖が機能的ＲＮＡであり、所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得る。 図１５Ｂはいくつかの実施形態に従う、機能的ＲＮＡと同じＲＮＡ二本鎖に位置するキャリア配列の一例を示す概略図であり、この場合、二本鎖領域はキャリア配列の上流に位置し、この二本鎖領域がダイサーによりプロセシングされると、キャリア配列がＲＮＡ二本鎖から分離されるが、このようにして形成されたｓｉＲＮＡ二本鎖が機能的ＲＮＡであり、所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得る。 図１６Ａはいくつかの実施形態に従う、機能的ＲＮＡと同じＲＮＡ二本鎖に位置するキャリアＲＮＡの一例を示す概略図であり、この場合、二本鎖領域はキャリアＲＮＡの５′末端に位置し、この二本鎖領域がダイサーによりプロセシングされると、キャリアＲＮＡの３′末端に位置する配列がＲＮＡ二本鎖から分離されるが、このようにして形成されたｓｉＲＮＡ二本鎖が機能的ＲＮＡであり、所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得る。 図１６Ｂはいくつかの実施形態に従う、機能的ＲＮＡと同じＲＮＡ二本鎖に位置するキャリアＲＮＡの一例を示す概略図であり、この場合、二本鎖領域はキャリアＲＮＡの３′末端に位置し、この二本鎖領域がダイサーによりプロセシングされると、キャリアＲＮＡの５′末端に位置する配列がＲＮＡ二本鎖から分離されるが、このようにして形成されたｓｉＲＮＡ二本鎖が機能的ＲＮＡであり、所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得る。 図１７Ａはいくつかの実施形態に従う、機能的ＲＮＡと同じＲＮＡ二本鎖に位置するキャリア配列の一例を示す概略図であり、この場合、二本鎖領域はキャリア配列の上流に位置し、この二本鎖領域がダイサーによりプロセシングされると、形成されるｓｉＲＮＡ二本鎖は機能的ＲＮＡであり、所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得る。 図１７Ｂはいくつかの実施形態に従う、機能的ＲＮＡと同じＲＮＡ二本鎖に位置するキャリア配列の一例を示す概略図であり、この場合、二本鎖領域はキャリア配列の下流に位置し、この二本鎖領域がダイサーによりプロセシングされると、形成されるｓｉＲＮＡ二本鎖は機能的ＲＮＡであり、所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得る。 図１８Ａはいくつかの実施形態に従う、機能的ＲＮＡと同じＲＮＡ二本鎖に位置するキャリア配列の一例を示す概略図であり、この場合、二本鎖領域がキャリア配列の上流に位置し、この二本鎖領域がダイサーによりプロセシングされると、形成されるｓｉＲＮＡ二本鎖は機能的核酸であり、キャリア切断部位でのキャリアＲＮＡの切断を果たし得る。 図１８Ｂはいくつかの実施形態に従う、機能的核酸と同じＲＮＡ二本鎖に位置するキャリア配列の一例を示す概略図であり、この場合、二本鎖領域はキャリア配列の下流に位置し、この二本鎖領域がダイサーによりプロセシングされると、形成されるｓｉＲＮＡ二本鎖は機能的核酸であり、キャリア切断部位でのキャリアＲＮＡの切断を果たし得る。 図１９Ａはいくつかの実施形態に従う、機能的核酸および機能的ＲＮＡと同じＲＮＡ二本鎖に位置するキャリア配列の一例を示す概略図であり、この場合、二本鎖領はキャリア配列の上流に位置し、この二本鎖領域がダイサーによりプロセシングされると、形成されるｓｉＲＮＡ二本鎖は機能的核酸と機能的ＲＮＡである。 図１９Ｂはいくつかの実施形態に従う、機能的核酸および機能的ＲＮＡと同じＲＮＡ二本鎖に位置するキャリア配列の一例を示す概略図であり、この場合、二本鎖領域はキャリア配列の下流に位置し、この二本鎖領域がダイサーによりプロセシングされると、形成されるｓｉＲＮＡ二本鎖は機能的核酸と機能的ＲＮＡである。 図２０Ａいくつかの実施形態に従う、キャリア配列の下流に３つの連続するキャリア配列を含むキャリアＲＮＡの一例を示す概略図であり、この場合、機能的核酸は、キャリア配列の３′末端でのキャリアＲＮＡの切断を果たし得る。 図２０Ｂはいくつかの実施形態に従う、キャリア配列の上流に３つの連続するキャリア配列を含むキャリアＲＮＡの一例を示す概略図であり、この場合、機能的核酸は、キャリア配列の５′末端でのキャリアＲＮＡの切断を果たし得る。 図２１Ａはいくつかの実施形態に従う、所定シグナル配列の５′末端を切断する機能的ＲＮＡに加えて、所定シグナル配列の３′末端を切断する付加的機能的ＲＮＡをさらに転写する組成物のポリヌクレオチド分子の一例を示す概略図である。 図２１Ｂはいくつかの実施形態に従う、所定シグナル配列の３′末端を切断する機能的ＲＮＡに加えて、所定シグナル配列の５′末端を切断する付加的機能的ＲＮＡをさらに転写する組成物のポリヌクレオチド分子の一例を示す概略図である 図２２Ａはいくつかの実施形態に従う、その切断により活性化される対象外来性ＲＮＡの概略構造の一例を示す概略図であり、この場合、特定の配列は阻害配列の下流であって、かつ、前記対象外来性タンパク質をコードする配列からに上流に位置する。 図２２Ｂはいくつかの実施形態に従う、その切断により活性化される対象外来性ＲＮＡの概略構造の一例を示す概略図であり、この場合、特定の配列は阻害配列の上流であって、かつ、前記対象外来性タンパク質をコードする配列の下流に位置する。 図２３Ａはいくつかの実施形態に従う、対象外来性ＲＮＡの特定の標的／切断部位の上流に位置し、かつ、対象外来性タンパク質をコードする配列と同じリーディングフレームにないＡＵＧを含む阻害配列の一例を示す概略図である。 図２３Ｂはいくつかの実施形態に従う、対象外来性ＲＮＡの特定の標的／切断部位の上流に位置し、かつ、対象外来性タンパク質をコードする配列と同じリーディングフレームにないＫｏｚａｋコンセンサス配列（５′−ＡＣＣＡＵＧＧ−３′−配列番号２５）を含む阻害配列の一例を示す概略図である。 図２３Ｃはいくつかの実施形態に従う、対象外来性ＲＮＡの特定の標的／切断部位の上流に位置し、かつ、対象外来性タンパク質をコードする配列と同じリーディングフレームにない２つのＫｏｚａｋコンセンサス配列を含む阻害配列の一例を示す概略図である。 図２４Ａはいくつかの実施形態に従う、対象外来性ＲＮＡの特定の標的／切断部位の上流に位置し、かつ、同じリーディングフレームにあるＡＵＧと下流終止コドンを含む阻害配列の一例を示す概略図である。 図２４Ｂはいくつかの実施形態に従う、対象外来性ＲＮＡの特定の標的／切断部位の上流に位置し、かつ、ＡＵＧと細胞内局在のための下流選別シグナルまたはタンパク質分解シグナルを含む阻害配列の一例を示す概略図である。 図２４Ｃはいくつかの実施形態に従う、対象外来性ＲＮＡの特定の標的／切断部位の上流に位置し、かつ、ＡＵＧと、対象下流タンパク質の生物学的機能を阻害し得るアミノ酸をコードする下流配列とを含む阻害配列の一例を示す概略図である。 図２４Ｄはいくつかの実施形態に従う、対象外来性ＲＮＡの特定の標的／切断部位の上流に位置し、かつ、ＡＵＧと、ＡＵＧと同じリーディングフレームにある下流終止コドンと、下流イントロンとを含む阻害配列の一例を示す概略図であり、この場合、対象外来性ＲＮＡはナンセンス依存分解（ＮＭＤ）の標的となる。 図２５Ａはいくつかの実施形態に従う、対象外来性ＲＮＡの特定の標的／切断部位の上流に位置し、かつ、翻訳レプレッサーの結合部位を含む阻害配列の一例を示す概略図である。 図２５Ｂはいくつかの実施形態に従う、対象外来性ＲＮＡの特定の標的／切断部位の上流に位置し、かつ、細胞内局在のためのＲＮＡ局在化シグナルを含む阻害配列の一例を示す概略図である。 図２５Ｃはいくつかの実施形態に従う、対象外来性ＲＮＡの特定の標的／切断部位の上流に位置し、かつ、ＡＵリッチエレメントまたはエンドヌクレアーゼ認識部位であるＲＮＡ不安定化エレメントを含む阻害配列の一例を示す概略図である。 図２５Ｄはいくつかの実施形態に従う、対象外来性ＲＮＡの特定の標的／切断部位の上流に位置し、かつ、二次構造を含む阻害配列の一例を示す概略図である。 いくつかの実施形態に従う、対象外来性ＲＮＡの、その切断による活性化の一例を示す概略図であり、この場合、阻害配列は翻訳を遮断する二次構造を作り出し、その切断がＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）を作り出す。 図２７Ａはいくつかの実施形態に従う、５′末端で切断された対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を高め得る付加的構造の一例を示す概略図であり、付加的構造はＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）である。 図２７Ｂはいくつかの実施形態に従う、５′末端で切断された対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を高め得る付加的構造の一例を示す概略図であり、付加的構造はステムループ構造である。 図２７Ｃはいくつかの実施形態に従う、５′末端で切断された対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を高め得る付加的構造の一例を示す概略図であり、付加的構造は細胞質ポリアデニル化エレメントである。 図２７Ｄはいくつかの実施形態に従う、５′末端で切断された対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を高め得る付加的構造の一例を示す概略図であり、付加的構造は、互いに結合することができ、かつ、これにより、特に対象外来性ＲＮＡが特定の標的／切断部位で切断された際に、対象外来性ＲＮＡに強制的に環状構造を形成させることができるヌクレオチド配列である。 図２８Ａはいくつかの実施形態に従う、５′末端で切断された対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を高め得る付加的構造の一例を示す概略図であり、この場合、付加的構造は本発明の組成物からコードされるポリペプチドであり、このポリペプチドは、対象外来性ＲＮＡのポリＡテールおよび本発明の対象外来性ＲＮＡ内の配列と結合することができ、かつ、これにより、特に対象外来性ＲＮＡが特定の標的／切断部位で切断された際に、対象外来性ＲＮＡに強制的に環状構造を形成させることができる。 図２８Ｂはいくつかの実施形態に従う、完全な対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を低減し得る付加的構造の一例を示す概略図であり、この場合、付加的構造は、完全な対象外来性ＲＮＡからキャップ構造を除去するシス作用リボザイムである。 図２９Ａはいくつかの実施形態に従う、特定の標的／切断部位の下流に位置し、かつ、イントロンを含む阻害配列の一例を示す概略図であり、この場合、対象外来性ＲＮＡはナンセンス依存分解（ＮＭＤ）の標的となる。 図２９Ｂはいくつかの実施形態に従う、特定の標的／切断部位の下流に位置し、かつ、翻訳レプレッサーの結合部位を含む阻害配列の一例を示す概略図である。 図２９Ｃはいくつかの実施形態に従う、特定の標的／切断部位の下流に位置し、かつ、細胞内局在のためのＲＮＡ局在化シグナルを含む阻害配列の一例を示す概略図である。 図２９Ｄはいくつかの実施形態に従う、特定の標的／切断部位の下流に位置し、かつ、ＡＵリッチエレメントまたはエンドヌクレアーゼ認識部位であるＲＮＡ不安定化エレメントを含む阻害配列の一例を示す概略図である。 図２９Ｅはいくつかの実施形態に従う、特定の標的／切断部位の下流に位置し、かつ、二次構造を含む阻害配列の一例を示す概略図である。 図３０Ａはいくつかの実施形態に従う、対象外来性タンパク質をコードする配列の下流に位置する阻害配列の一例を示す概略図であり、この場合、阻害配列は翻訳を遮断し得る二次構造を作り出す。 図３０Ｂはいくつかの実施形態に従う、３′末端で切断された対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を高め得る付加的構造の一例を示す概略図であり、この場合、付加的構造はＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）である。 図３０Ｃはいくつかの実施形態に従う、３′末端で切断された対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を高め得る付加的構造の一例を示す概略図であり、この場合、付加的構造はステムループ構造である。 図３０Ｄはいくつかの実施形態に従う、３′末端で切断された対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を高め得る付加的構造の一例を示す概略図であり、この場合、付加的構造は細胞質ポリアデニル化エレメントである。 図３１Ａはいくつかの実施形態に従う、３′末端で切断された対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を高め得る付加的構造の一例を示す概略図であり、この場合、付加的構造は、互いに結合することができ、かつ、その結果として、対象外来性ＲＮＡが特定の標的／切断部位で切断された際に、特に対象外来性ＲＮＡに強制的に環状構造を形成させることができるヌクレオチド配列である。 図３１Ｂはいくつかの実施形態に従う、３′末端で切断された対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を高め得る付加的構造の一例を示す概略図であり、この場合、付加的構造は、組成物からコードされるポリペプチドであり、このポリペプチドは、ＣＡＰと、かつ、対象外来性ＲＮＡ内の配列と結合することができ、かつ、その結果として、特に対象外来性ＲＮＡが特定の標的／切断部位で切断された際に、対象外来性ＲＮＡを強制的に環状構造を形成させることができる 図３１Ｃはいくつかの実施形態に従う、３′末端で切断された対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を高め得る付加的構造の一例を示す概略図であり、この場合、付加的構造は、組成物からコードされる付加的ＲＮＡ分子であり、かつ、対象外来性ＲＮＡと結合することができ、その結果として、特に対象外来性ＲＮＡが特定の標的／切断部位で切断された際に、それにポリＡテールを提供することができる。 図３１Ｄはいくつかの実施形態に従う、完全な対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を低減し得る付加的構造の一例を示す概略図であり、この場合、付加的構造は、完全な対象外来性ＲＮＡからポリＡを除去するシス作用リボザイムである。 図３２Ａはいくつかの実施形態に従う、２つの特定の配列を含む対象外来性ＲＮＡの構造の一例を示す概略図であり、この場合、阻害配列はそれらの特定の標的／切断部位の上流に位置する。 図３２Ｂはいくつかの実施形態に従う、２つの特定の配列を含む対象外来性ＲＮＡの構造の一例を示す概略図であり、この場合、阻害配列はそれらの特定の標的／切断部位の下流に位置する。 図３２Ｃはいくつかの実施形態に従う、所定シグナル配列に相補的な２つの配列と２つの阻害配列（一方は対象外来性ＲＮＡの５′末端にあり、他方は３′末端にある）の間に対象外来性タンパク質をコードする配列を含む対象外来性ＲＮＡの一例を示す概略図である。 いくつかの実施形態に従う、細胞内の内在性シグナルＲＮＡの存在に応答して対象外来性タンパク質を発現させるための一例を示す概略図である。この組成物は、所定シグナル配列と所定シグナル配列の上流にある配列に１００％相補的な２７ヌクレオチドの第１の配列を５′末端に含む対象外来性ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド分子を含み、前記第１の配列はまた、対象外来性タンパク質をコードする下流配列と同じリーディングフレームにない５′−ＡＵＧ−３′配列も含み、この組成物はさらに、所定シグナル配列の３′末端での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得るｓｈＲＮＡである機能的ＲＮＡをコードする。 いくつかの実施形態に従い、細胞内の内在性シグナルＲＮＡの存在に応答して対象外来性タンパク質を発現させるための一例を示す概略図である。この組成物は、所定シグナル配の３′末端での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得るｍｉＲＮＡと、所定シグナル配列および所定シグナル配列の上流の配列に相補的な２７ヌクレオチドの第１の配列とを５′末端に含む対象外来性ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド分子を含み、前記第１の配列はまた対象外来性タンパク質をコードする下流配列と同じリーディングフレームにない５′−ＡＵＧ−３′配列も含み、この場合、５′−ＡＵＧ−３′はＫｏｚａｋコンセンサス配列内に位置する。 いくつかの実施形態に従い、細胞内の内在性シグナルＲＮＡの存在に応答して対象外来性タンパク質を発現させるための一例を示す概略図である。この組成物は、ｓｉＲＮＡの第１鎖を５′末端に含む対象外来性ＲＮＡ分子をコードし、これにより、組成物はさらにポリメラーゼＩまたはＩＩＩに基づくプロモーターによりｓｉＲＮＡの第２鎖を転写する。対象外来性ＲＮＡ分子の第１の配列は２７ヌクレオチド長であり、かつ、所定シグナル配列および所定シグナル配列の上流の配列に相補的であり、前記第１の配列はまた、対象外来性タンパク質をコードする下流配列と同じリーディングフレームにない５′−ＡＵＧ−３′配列も含み、この場合、５′−ＡＵＧ−３′はＫｏｚａｋコンセンサス配列内に位置する。 図３６Ａはいくつかの実施形態に従う、対象外来性ＲＮＡからキャップ構造を除去するシス作用リボザイムを５′末端に含む、対象外来性ＲＮＡの一例を示す概略図である。この除去により、完全な対象外来性ＲＮＡ分子における対象外来性タンパク質の翻訳効率が低減される。 図３６Ｂは互いに結合することができ、かつ、これにより、対象外来性ＲＮＡに、特に切断された対象ＲＮＡにおける対象タンパク質の翻訳効率を高める環状構造を強制的に形成させることができる２つのヌクレオチド配列を含む例示的対象外来性ＲＮＡを示す概略図である。 図３７Ａはいくつかの実施形態に従う、細胞に内在性シグナルＲＮＡが存在する場合に対象外来性ＲＮＡを切断するための一例を示す概略図である。この組成物は、２７ヌクレオチドのキャリアＲＮＡと、所定シグナル配列に相補的な特定の配列を含む対象外来性ＲＮＡとをコードする。 図３７Ｂはいくつかの実施形態に従う、細胞に内在性シグナルＲＮＡが存在する場合に対象外来性ＲＮＡを切断するための一例を示す概略図である。この組成物は、所定シグナル配列に相補的な特定の配列を含む対象外来性ＲＮＡ；２７ヌクレオチド長のキャリア配列；およびキャリア配列の３′末端でのキャリアＲＮＡ配列の切断を果たし得るシス作用リボザイムである機能的核酸をコードする。 図３８Ａはいくつかの実施形態に従う、細胞に内在性シグナルＲＮＡが存在する場合に対象外来性ＲＮＡを切断するための一例を示す概略図である。本発明の組成物は、２７ヌクレオチドのキャリアＲＮＡと、所定シグナル配列に相補的な特定の配列を含む対象外来性ＲＮＡとをコードする。 図３８Ｂはいくつかの実施形態に従う、細胞に内在性シグナルＲＮＡが存在する場合に対象外来性ＲＮＡを切断するための一例を示す概略図である。この組成物は、所定シグナル配列に１００％相補的な特定の配列を含む対象外来性ＲＮＡ、２７ヌクレオチド長のキャリア配列、およびキャリア配列の５′末端でのキャリアＲＮＡ配列の切断を果たし得るシス作用リボザイムである機能的核酸をコードする。 図３９Ａはいくつかの実施形態に従う、特定の標的／切断部位の下流に位置するその阻害配列を有する対象外来性ＲＮＡの一例を示す概略図であり、前記阻害配列は、細胞内局在のためのＲＮＡ局在化シグナルの機能を阻害し得る。 図３９Ｂはいくつかの実施形態に従う、特定の標的／切断部位の上流に位置するその阻害配列を有する対象外来性ＲＮＡの一例を示す概略図であり、前記阻害配列は、細胞内局在のためのＲＮＡ局在化シグナルの機能を阻害し得る。 図３９Ｃはいくつかの実施形態に従う、特定の標的／切断部位の上流に位置するその阻害配列を有し、かつ、ＡＵＧと、対象外来性タンパク質からコードされる対象外来性タンパク質の細胞内局在のための選別シグナルの機能を阻害し得るアミノ酸をコードする下流配列とを含む対象外来性ＲＮＡの一例を示す概略図である。 図３９Ｄはいくつかの実施形態に従う、特定の配列の下流に位置する阻害配列の一例を示す概略図であり、この場合、対象外来性ＲＮＡは、前記対象外来性タンパク質をコードする配列の最初のコドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）の下流に終止コドンを含まず、かつ、阻害配列は、上流にコードされているペプチド配列の切断を阻害し得るアミノ酸配列をコードし、前記ペプチド配列は哺乳動物細胞中のプロテアーゼにより切断され得る。 いくつかの実施形態に従い、本発明の組成物を用いて特異的患者の癌細胞を死滅させるための一例を示す概略図である。 いくつかの実施形態に従い、内在性シグナルＲＮＡとしてＬＭＰ１ ｍＲＮＡを使用することにより、本発明の組成物を用いて、ＥＢＶが潜伏感染しているバーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、胃癌および鼻咽頭癌の癌細胞を死滅させるための一例を示す概略図である。 いくつかの実施形態に従い、本発明の組成物を用いてＨＩＶ−１感染細胞を死滅させるための一例を示す概略図である。 いくつかの実施形態に従い、本発明の組成物を用いてＨＳＶ−１感染細胞を死滅させるための一例を示す概略図である。 いくつかの実施形態に従い、本発明の組成物を用いて特定の患者の癌細胞を死滅させるための一例を示す概略図である。
以下の発明の詳細な説明において、前記、その、直前の、以前のおよび前者のなどの引用語が使用される場合、それは前述のその用語を指す（例えば、「前記核酸配列」という場合には、前述の核酸配列を指し、前述のヌクレオチド配列を指さない）。さらに、以下の発明の詳細な説明では、他の実施形態に挙げられている各実施形態は、それらとともに独立したユニットとして定義される。
以下は、本明細書を通じて使用され、種々の実施形態に従って次のような意味を持つと理解すべき用語である。
本明細書に示される場合、「ポリヌクレオチド分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「ヌクレオチド」配列という用語は、本明細書において互換的に使用できる。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）のポリマー、および独立したフラグメントの形態のまたはより大きな構築物の成分としてのそれらの改変形態、直鎖または分岐した一本鎖、二本鎖、三本鎖、またはそれらのハイブリッドを指す。この用語はまた、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを包含する。これらのポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡのセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み得る。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、例えば、限定されるものではないが、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、組換えＤＮＡもしくはそれらのハイブリッド、または例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどのＲＮＡ分子であり得る。よって、本明細書において、「ポリヌクレオチド分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「ヌクレオチド」配列という用語は、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子の双方を指すものとする。これらの用語はさらに、天然塩基、糖類、および共有ヌクレオシド間結合から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに各天然部分と同様に機能する非天然部分を有するオリゴヌクレオチドも含まれる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマーを指して互換的に使用される。これらの用語は、１以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的化学類似体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに当てはまる。
本明細書に示される場合、「相補性」という用語は、核酸鎖間の塩基対の形成を指す。当技術分野で公知のように、核酸の各鎖は他方の鎖と相補的であり、それらの鎖間の塩基対は２または３個の水素結合により非共有結合的に結合されている。水素結合により結合されている相対する相補的核酸鎖上の２つのヌクレオチドは塩基対と呼ばれる。ワトソン−クリックの塩基対形成によれば、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と塩基対を形成し、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と塩基対を形成する。ＲＮＡでは、チミンはウラシル（Ｕ）に置き換わる。２つの核酸鎖間の相補性の程度は、それらの鎖間で塩基対を形成するヌクレオチドの数（またはパーセンテージ）によって変動し得る。例えば、「１００％の相補性」は、各鎖の全てのヌクレオチドが相補鎖と塩基対を形成することを示す。例えば、「９５％の相補性」は、各鎖の９５％のヌクレオチドが相補鎖と塩基対を形成することを示す。十分な相補性とは、約３０％〜約１００％の任意の相補性パーセンテージを含み得る。
本明細書において「構築物」という用語は、１以上の核酸配列（これらの核酸配列は、コード配列（すなわち、最終産物をコードする配列）、調節配列、非コード配列、またはそれらの任意の組合せを含み得る）を含み得る人工的に組み立てられたまたは単離された核酸分子を指す。構築物という用語には、限定されるものではないが、例えばベクターが包含される。
「発現ベクター」とは、外来性細胞において異種核酸フラグメント（例えば、ＤＮＡなど）を組み込み、発現させる能力を有するベクターを指す。言い換えれば、発現ベクターは、転写され得る核酸配列／フラグメント（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなど）を含む。多くの原核生物および真核生物の発現ベクターが知られ、かつ／または市販されている。適当な発現ベクターの選択は当業者の知識の範囲内である。
本明細書において「上流」および「下流」という用語は、例えば、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列などのヌクレオチド配列における相対的な位置を指す。周知のように、ヌクレオチド配列は５′末端と３′末端を有する（ヌクレオチド骨格の糖（デオキシリボースまたはリボース）環状の炭素に関してこのように呼ばれる）。従って、ヌクレオチド配列上の位置に関して、下流とはその配列の３′末端方向の領域を指す。上流とは、その鎖の５′末端方向の領域を指す。
本明細書において「プロモーターエレメント」、「プロモーター」または「プロモーター配列」という用語は、一般にコード配列５′末端に位置し（すなわち、前にある、上流に位置する）、コード配列の発現を活性化するスイッチとして機能するヌクレオチド配列を指す。コード配列が活性化される場合、これを転写されるという。転写は一般に、コード配列からのＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡなど）の合成を含む。従って、プロモーターは、転写調節エレメントとして働き、また、コード配列をｍＲＮＡへと転写する転写開始部位となる。プロモーターは、天然源に完全に由来してもよいし、あるいは天然に見られる違うプロモーターに由来する違うエレメントから構成されてもよく、あるいはさらには合成ヌクレオチドセグメントを含んでもよい。当業者には、プロモーターが異なれば、異なる組織もしくは細胞種、または異なる発達段階における、あるいは異なる環境条件に応答して、または様々な発現レベルで遺伝子の発現が指示されることが理解される。ほとんどの細胞種でほとんどの時点で遺伝子を発現させるプロモーターは一般に「構成プロモーター」と呼ばれる。特定の組織において遺伝子発現を制御するプロモーターは、「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。
本明細書に示される場合、「対象ＲＮＡ」、「対象外来性ＲＮＡ」、および「ＲＯＩ」という用語は互換的に使用できる。これらの用語は、標的細胞に導入され、標的細胞内でＲＮＡ分子をコードし得るヌクレオチド配列を指す。
本明細書に示される場合、「対象タンパク質」、「対象外来性タンパク質」、および「ＰＯＩ」という用語は互換的に使用できる。これらの用語は、対象外来性ＲＮＡから翻訳されるペプチド配列を指す。いくつかの実施形態では、このペプチド配列は、１以上の独立したタンパク質または融合タンパク質であり得る。
本明細書に示される場合、「シグナルＲＮＡ」および「内在性シグナルＲＮＡ」という用語は互換的に使用できる。これらの用語は、所定シグナル配列を含む細胞内ＲＮＡ分子／配列を指す。内在性シグナルＲＮＡ分子は、細胞のゲノムにより、および／または細胞内に留まっている外来ゲノムから、例えば細胞内に留まっているウイルスなどからコードされ得る。いくつかの実施形態では、内在性シグナルＲＮＡは成熟ｍＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、内在性シグナルＲＮＡはウイルスＲＮＡである。シグナルＲＮＡは、対象外来性ＲＮＡが細胞に導入される前に標的細胞内に存在している。
本明細書に示される場合、「所定シグナル配列」および「シグナル配列」という用語は互換的に使用できる。
本明細書に示される場合、「所定切断部位」および「付加的切断部位」という用語は、内在性シグナルＲＮＡの配列内の切断部位を指す。
本明細書に示される場合、「特定の標的部位」、「特定の切断部位」および「特定の標的／切断部位」という用語は互換的に使用できる。これらの用語は、対象外来性ＲＮＡの配列内の１以上の切断部位を指す。
本明細書において「発現」という用語は、標的細胞における所望の最終産物分子の産生を指す。最終産物分子は例えば、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子など）；ペプチドまたはタンパク質など；またはそれらの組合せであり得る。
本明細書に示される場合、「オープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）」という用語は、開始コドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）と終止コドンを含むコード領域を指す。
本明細書に示される場合、「Ｋｏｚａｋ配列」という用語は当技術分野で周知であり、リボソームにより翻訳開始部位として認識されるｍＲＮＡ分子上の配列を指す。「Ｋｏｚａｋコンセンサス配列」、「Ｋｏｚａｋコンセンサス」または「Ｋｏｚａｋ配列」という用語は、真核生物のｍＲＮＡ上に存在し、コンセンサス（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ（配列番号２４）を有する配列であり、ここで、Ｒは、開始コドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）をであり、この後に別の「Ｇ」が続く。いくつかの実施形態では、Ｋｏｚａｋ配列は配列ＲＮＮＡＵＧＧを有し、ここで、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＵのいずれかのヌクレオチドである（配列番号１１２）。
本明細書において、「導入する」および「トランスフェクション」という用語は互換的に使用でき、標的細胞への、より具体的には、標的細胞の膜に囲まれた空間の内部への例えば核酸、ポリヌクレオチド分子、ベクターなどの分子の導入を指す。これらの分子は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１）（その内容は参照により本明細書に組み入れられる）により教示されているような、当業者に公知の任意の手段によって標的細胞に「導入」することができる。分子を細胞に「導入する」手段は、例えば、限定されるものではないが、熱ショック、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＰＥＩトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、トランスフェクション試薬、ウイルスを介した導入などまたはそれらの組合せが挙げられる。細胞のトランスフェクションは、例えば、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞などのいずれの起源のいずれの細胞種に対しても行える。これらの細胞は、例えば、限定されるものではないが、単離された細胞、組織培養細胞、細胞株、生物体内に存在する細胞などであり得る。
細胞／細胞集団に関して「死滅させる」という用語は、その細胞／細胞集団の死を招くいずれのタイプの操作も含むものとする。
本明細書に示される場合、「疾患を治療する」または「症状を治療する」という用語は、疾病と関連している症状を改善する、重篤度を軽減する、もしくは疾患を治癒させる、または疾患の発生を予防するために効果的な少なくとも１種類の試薬（例えば、１以上のポリヌクレオチド分子、１以上の発現ベクター、１以上の物質／成分などであり得る）を含む組成物を投与することを指す。投与はいずれの投与経路であってもよい。
「検出」、「診断」という用語は、疾患、症状、障害、病的状態または正常状態の検出方法；疾患、症状、障害、病的状態の分類；疾患、症状、障害、病的状態の重篤度の判定；疾患、症状、障害、病的状態の進行の監視；転帰および／またはその回復の見込みの予測を指す。
１．いくつかの実施形態に従う本発明の組成物の構造
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内の内在性シグナルＲＮＡの存在に応答して対象外来性ＲＮＡの切断を指示するための組成物が提供される。前記対象外来性ＲＮＡは本組成物からコードされる。前記内在性シグナルＲＮＡは所定シグナル配列を含むＲＮＡ分子であり、この場合、前記所定シグナル配列は１８〜２５ヌクレオチド長のランダム配列である。
本発明の一実施形態では、本組成物は、
（ａ）対象外来性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列（この場合、前記対象外来性ＲＮＡは、標的特異的ＲＮＡ干渉を指示するために所定シグナル配列と十分な相補性がある特定の配列を含むＲＮＡ配列である）；
（ｂ）所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの直接的または間接的切断を果たし得る機能的ＲＮＡをコードする１以上のポリヌクレオチド配列（この場合、前記所定切断部位は所定シグナル配列の５′末端である）；および
（ｃ）少なくとも約１８ヌクレオチド長であって、かつ、
（１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド下流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の下流に延びる）；
（２）前記第１の配列の下流にある第２の配列（この場合、前記第２の配列は０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である）；および
（３）前記第１の配列の上流にある第３の配列（この場合、前記第３の配列は０〜７０００ヌクレオチド長である）
から本質的になるＲＮＡ分子であるキャリアＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列
を含む１以上のポリヌクレオチド分子を含む。
よって、前記内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に本組成物を導入した後に、前記機能的ＲＮＡは、所定シグナル配列の５′末端での内在性シグナルＲＮＡの直接的または間接的切断を果たし、次に、前記キャリアＲＮＡは、切断された内在性シグナルＲＮＡのエッジ配列とハイブリダイズし、所定シグナル配列のプロセシングを指示し、次に、プロセシングされた所定シグナル配列は、特定の配列内に位置する特定の標的／切断部位での対象外来性ＲＮＡの切断を指示する。例えば、図２参照。
いくつかの実施形態では、本組成物は、
（ａ）対象外来性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列（この場合、前記対象外来性ＲＮＡは、標的特異的ＲＮＡ干渉を指示するために所定シグナル配列と十分な相補性がある特定の配列を含むＲＮＡ配列である）；
（ｂ）所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの直接的または間接的切断を果たし得る機能的ＲＮＡをコードする１以上のポリヌクレオチド配列（この場合、前記所定切断部位は所定シグナル配列の３′末端である）；および
（ｃ）少なくとも約１８ヌクレオチド長であって、かつ、
（１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド上流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延びる）；
（２）前記第１の配列の上流にある第２の配列（この場合、前記第２の配列は０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である）；および
（３）前記第１の配列の下流にある第３の配列（この場合、前記第３の配列は０〜７０００ヌクレオチド長である）
から本質的になるＲＮＡ分子であるキャリアＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列
を含む１以上のポリヌクレオチド分子を含む。
よって、前記内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に本組成物を導入した後に、前記機能的ＲＮＡは、所定シグナル配列の３′末端での内在性シグナルＲＮＡの直接的または間接的切断を果たし、次に、前記キャリアＲＮＡは、切断された内在性シグナルＲＮＡのエッジ配列とハイブリダイズし、所定シグナル配列のプロセシングを指示し、次に、プロセシングされたシグナル配列は、特定の配列内に位置する特定の標的／切断部位での対象外来性ＲＮＡの切断を指示する。例えば、図３参照。
本発明のさらなる実施形態では、本組成物は、
（ａ）対象外来性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列（この場合、前記対象外来性ＲＮＡは、標的特異的ＲＮＡ干渉を指示するために所定シグナル配列と十分な相補性がある特定の配列を含むＲＮＡ配列である）；
（ｂ）所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの直接的または間接的切断を果たし得る機能的ＲＮＡをコードする１以上のポリヌクレオチド配列（この場合、前記所定切断部位は所定シグナル配列の５′末端である）；および
（ｃ）少なくとも約１８ヌクレオチド長であって、かつ、
（１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド下流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の下流に延びる）；
（２）前記第１の配列の下流にある第２の配列（この場合、前記第２の配列は０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である）；および
（３）前記第１の配列の上流にある第３の配列（この場合、前記第３の配列は０〜７０００ヌクレオチド長である）
から本質的になるキャリア配列を含むＲＮＡキャリア配列をコードするポリヌクレオチド配列；および
（ｄ）キャリア切断部位でのキャリアＲＮＡ配列の直接的または間接的に切断を果たし得る機能的核酸をコードする１以上のポリヌクレオチド配列（この場合、前記キャリア切断部位はキャリア配列の３′末端である）
を含む１以上のポリヌクレオチド分子を含む。
よって、前記内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に本組成物を導入した後に、前記機能的ＲＮＡは、所定シグナル配列の５′末端での内在性シグナルＲＮＡの直接的または間接的切断に果たし、かつ、前記機能的核酸は、前記キャリア配列の３′末端でのキャリアＲＮＡの直接的または間接的切断を果たす。切断されたキャリアＲＮＡ配列は切断された内在性シグナルＲＮＡのエッジ配列とハイブリダイズし、前記所定シグナル配列のプロセシングを指示する。次に、プロセシングされたシグナル配列は、特定の配列内に位置する特定の標的／切断部位での対象外来性ＲＮＡの切断を指示することができる。例えば、図４参照。
いくつかの実施形態では、本組成物は、
（ａ）対象外来性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列（この場合、前記対象外来性ＲＮＡは、標的特異的ＲＮＡ干渉を指示するために所定シグナル配列と十分な相補性がある特定の配列を含むＲＮＡ配列である）；
（ｂ）所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの直接的または間接的切断を果たし得る機能的ＲＮＡをコードする１以上のポリヌクレオチド配列（この場合、前記所定切断部位は所定シグナル配列の５′末端である）；および
（ｃ）少なくとも約１８ヌクレオチド長であって、かつ、
（１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド上流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延びる）；
（２）前記第１の配列の上流にある第２の配列（この場合、前記第２の配列は０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である）；および
（３）前記第１の配列の下流にある第３の配列（この場合、前記第３の配列は０〜７０００ヌクレオチド長である）
から本質的になるキャリア配列を含むＲＮＡキャリア配列をコードするポリヌクレオチド配列；および
（ｄ）キャリア切断部位でのキャリアＲＮＡ配列の直接的または間接的に切断を果たし得る機能的核酸をコードする１以上のポリヌクレオチド配列（この場合、前記キャリア切断部位はキャリア配列の５′末端である）
を含む１以上のポリヌクレオチド分子を含む。
よって、前記内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に本組成物を導入した後に、前記機能的ＲＮＡは、所定シグナル配列の３′末端での内在性シグナルＲＮＡの直接的または間接的切断を果たし、かつ、前記機能的Ａは、所定シグナル配列の３′末端での内在性シグナルＲＮＡの直接的または間接的切断を果たし、かつ、前記機能的核酸は、キャリア配列の５′末端でのキャリアＲＮＡの直接的または間接的切断を果たす。次に、切断されたキャリアＲＮＡ配列は切断された内在性シグナルＲＮＡのエッジ配列とハイブリダイズし、前記所定シグナル配列のプロセシングを指示する。次に、プロセシングされた所定シグナル配列は、特定の配列内に位置する特定の標的／切断部位での対象外来性ＲＮＡの切断を指示することができる。例えば、図５参照。
いくつかの実施形態によれば、所定シグナル配列は、特定の標的細胞内にそれが存在することにより選択され、それにより、選択された細胞内で対象外来性ＲＮＡの切断を標的とするための機構を提供し得る。特定の標的細胞は、いずれのタイプの細胞であってもよい。例えば、特定の標的細胞は、限定されるものではないが、良性または悪性新生物などの細胞であってもよい。平均的に各腫瘍は、９０のタンパク質コード遺伝子に突然変異を含む［１６］。各腫瘍は単一の創始細胞に起源し［３８］、従って、これらの突然変異遺伝子の少なくとも１つがｍＲＮＡへ転写される可能性が最も高い。特異的細胞は、限定されるものではないが、ウイルス感染細胞も含み得る。特異性は、機能的ＲＮＡ、キャリアＲＮＡおよび／または対象外来性ＲＮＡ中の特定の配列をコードする配列の改変のより果たすことができる。
特異的ｍｉＲＮＡを発現する細胞における目的遺伝子の活性化を対象とする同時係属中の出願では、所定シグナル配列は内在性ｍｉＲＮＡを含み得る。
いくつかの実施形態によれば、本発明の所定シグナル配列は、細胞内でＲＮＡ分子の切断を指示または果たすことができる内在性細胞ｍｉＲＮＡ分子または他の任意のタイプの内在性ＲＮＡ分子（例えば、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、ｓｔＲＮＡなど）は含まない。
いくつかの実施形態では、所定シグナル配列は、本発明の組成物の１以上の成分の不在下で切断を誘導／果たすことができない。
特定の腫瘍に独特な特定の配列を同定するために種々の方法が開発されている。これらの方法には、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ、Ｔｉｌｌｉｎｇ法（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅｓ）および癌ゲノムの大規模シーケンシングが含まれる。さらに、この所定シグナル配列の同定は、２００５年１２月１３日に着手され、癌の原因となる遺伝子突然変異を全て一覧化した癌ゲノムアトラス（ＮＩＨプロジェクト）のためにいっそう簡単になると思われる。
哺乳動物細胞において、ポリ（Ａ）テールを除去しても機能的ｍＲＮＡの半減期は２．６分の１になるに過ぎず、キャップを除去しても機能的ｍＲＮＡ半減期は１．７分の１になるに過ぎないことが報告されている［１０］。また、細胞内でＲＩＳＣ−ＲＮＡ複合体によって切断されたｍＲＮＡの２つの部分はノーザン分析により容易に検出できることも報告されている［６］。
いくつかの実施形態によれば、実施形態のキャリアＲＮＡ／配列は、所定シグナル配列を含む切断された内在性シグナルＲＮＡ部分とハイブリダイズ可能である。細胞において、５′末端に約１９ヌクレオチド長の相補的領域を有する約２３ヌクレオチド長の２つのＲＮＡ転写物は互いにハイブリダイズし、標的特異的ＲＮＡ干渉を指示可能であることが報告されている［７］。
さらなる実施形態によれば、キャリアＲＮＡと、所定シグナル配列を含む切断された内在性シグナルＲＮＡ部分とを含む二本鎖は、ダイサーの、そしてその後Ｒｉｓｃの、基質となり得る。その３′末端の一方に２０ヌクレオチド長のｓｓＲＮＡをさらに含む５２ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡは、平滑末端においてダイサーの基質となることが報告されている［８］。また、哺乳動物細胞において、Ｒｉｓｃはダイサーと連結しているという報告もある［９］。
２．機能的ＲＮＡおよび機能的核酸の構造
この節では、本発明の組成物の機能的ＲＮＡと機能的核酸の構造の種々の実施形態を記載する。これは例えば図２、３、４、５に示されている。
本発明の別の実施形態では、前述（第１節）の実施形態に記載されている機能的ＲＮＡは、
（ｉ）例えばＲＮＡ干渉によって所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を指示するために阻害ＲＮＡの標的配列と十分な相補性がある１８〜２５ヌクレオチド長の配列を含む阻害ＲＮＡ（この場合、標的配列は、内在性シグナルＲＮＡ内のある領域に位置する１８〜２５ヌクレオチド長の配列であり、前記領域は所定切断部位の約２５ヌクレオチド下流から所定切断部位の約２５ヌクレオチド上流までに位置する）；または
（ｉ）の領域に結合して所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たすことができるリボザイム
である。
一実施形態では、前記実施形態に記載の（ｉ）の領域は、所定切断部位の約１１ヌクレオチド下流から所定切断部位の約１２ヌクレオチド上流までに位置してよい。一実施形態では、（ｉ）の領域は、所定切断部位の約１０ヌクレオチド下流から所定切断部位の約１１ヌクレオチド上流までに位置する。例えば、図６Ａ、６Ｂ参照。
本発明の別の実施形態では、前記（第１節）の機能的核酸は、
（ｉ）例えばＲＮＡ干渉によってキャリア切断部位でのキャリアＲＮＡ配列の切断を指示するために阻害ＲＮＡの標的配列と十分な相補性がある１８〜２５ヌクレオチド長の配列を含む阻害ＲＮＡ（これにより、標的配列は、キャリアＲＮＡ内のある領域に位置する１８〜２５ヌクレオチド長の配列であり、前記領域はキャリア切断部位の約２５ヌクレオチド下流からキャリア切断部位の約２５ヌクレオチド上流までに位置する）；または
（ｉｉ）（ｉ）の領域に結合してキャリア切断部位でのキャリアＲＮＡの切断を果たすことができるリボザイム
である。一実施形態では、前記実施形態に記載の（ｉ）の領域は、キャリア切断部位の約１１ヌクレオチド下流からキャリア切断部位の約１２ヌクレオチド上流までに位置する。別の実施形態では、（ｉ）の領域は、キャリア切断部位の約１０ヌクレオチド下流からキャリア切断部位の約１１ヌクレオチド上流までに位置する。例えば、７Ａ、７Ｂ参照。
いくつかの実施形態によれば、前記（ｉ）の阻害ＲＮＡは、例えば、限定されるものではないが、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）および／または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得る。いくつかの実施形態では、（ｉ）の阻害ＲＮＡは、例えば、限定されるものではないが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、投げ輪型ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および／またはｓｉＲＮＡ発現ドメインであり得る。
さらなる実施形態によれば、（ｉ）の阻害ＲＮＡは、
（ａ）その５′末端または３′末端に核酸配列（この場合、この核酸配列は標的特異的ＲＮＡ干渉を指示するために（ｉ）の標的配列と十分な相補性がある）を含む第１のＲＮＡ分子；および
（ｂ）前記核酸配列に結合し得るヌクレオチド配列を含む第２のＲＮＡ分子（この場合、このヌクレオチド配列は１８〜２５ヌクレオチド長であり、かつ、このヌクレオチド配列は前記第２のＲＮＡ分子の５′末端または３′末端に位置する）
を含む。
よって、前記第１および第２のＲＮＡ分子は、第１および第２のＲＮＡ分子のそれぞれが他方とハイブリダイズした際に形成される二本鎖の活性末端に０〜５ヌクレオチドの３′−オーバーハングまたは５′−オーバーハングを形成し、これにより、形成された二本鎖の活性末端は、核酸配列とヌクレオチド配列を含む末端となる。
別の実施形態では、前記実施形態に記載の第１のＲＮＡ分子は約２５〜３０ヌクレオチド長であり、第２のＲＮＡ分子は約２５〜３０ヌクレオチド長であり、この場合、第１および第２のＲＮＡ分子は、第１および第２のＲＮＡ分子のそれぞれが他方とハイブリダイズした際に形成される二本鎖の活性末端に２ヌクレオチドの３′−オーバーハングを形成し、この二本鎖はダイサーの基質となり得る。例えば、図８Ａ、８Ｂ参照。
いくつかの実施形態では、前記の（ｉｉ）のリボザイムは、例えば、限定されるものではないが、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイムおよび／またはテトラへヒメナ型リボザイムであり得る。
さらなる実施形態では、（ｉｉ）のリボザイムは、（ｉ）の領域の３′末端から２６ヌクレオチド上流に位置し、かつ、（ｉ）の領域内の上流に延びる配列に相補的な７ヌクレオチド長の第１の配列を３′末端に含むハンマーヘッド型リボザイム［２１］であり、さらに、このハンマーヘッド型リボザイムは、（ｉ）の領域の３′末端から１８ヌクレオチド上流に位置し、かつ、（ｉ）の領域内の上流に延びる配列に相補的な７ヌクレオチド長の第２の配列を５′末端に含む［２１］。例えば、図９Ａ参照。
別の実施形態では、（ｉｉ）のリボザイムは、１６ヌクレオチド長の核酸配列を５′末端に含むヘアピン型リボザイム［２１］であり、この場合、この核酸配列は、（ｉ）の領域の５′末端から２８ヌクレオチド下流に位置し、かつ、（ｉ）の領域内の下流に延びる配列に相補的な８ヌクレオチド長の配列を５′末端に含み、かつ、この核酸配列は、（ｉ）の領域３′末端から２６ヌクレオチド上流に位置し、かつ、（ｉ）の領域内の上流に延びる配列に相補的な４ヌクレオチド長の配列を３′末端に含む［２１］。例えば、図９Ｂ参照。
いくつかの実施形態によれば、理論または機構に縛られるものではないが、リボザイムの使用は、ＲＮＡ干渉経路の細胞成分を保持／使い尽くしたり、その結果として薄めたりすることはない。
別の実施形態では、第１節の実施形態に記載の機能的核酸は、キャリアＲＮＡ配列内に位置し、キャリア切断部位でのキャリアＲＮＡの切断を果たすシス作用リボザイムである。いくつかの実施形態では、このシス作用リボザイムは、例えば、限定されるものではないが、極めて有効なシス作用ハンマーヘッドリボザイム、すなわち、スノルボザイム［２２］および／またはＮ１１７［２３］であり得る。例えば、図１０、１１参照。
いくつかの実施形態によれば、理論または機構に縛られるものではないが、シス作用リボザイムを使用することで、それを含むキャリア配列はそれ自体切断可能となり［２２］、好ましい結果をもたらし得る。
別の実施形態では、第１節の実施形態に記載の機能的核酸は、エンドヌクレアーゼ認識部位または内在性ｍｉＲＮＡ結合部位であり、この場合、機能的核酸はキャリアＲＮＡ内に位置し、キャリア切断部位でのキャリアＲＮＡの直接的または間接的切断を果たし得る。例えば、図１２Ａ、１２Ｂ参照。
３．ステムループ構造を有する機能的核酸の構造
第１節の実施形態に記載の機能的核酸は、例えば、限定されるものではないが、ステムループ構造またはｍｉＲＮＡ構造であり得、これにより、機能的核酸はキャリア切断部位でのキャリア配列の切断を指示する。この節では、ステムループ構造またはｍｉＲＮＡ構造を有するこの機能的核酸の構造の実施形態を記載する。
いくつかの実施形態では、第１節の実施形態に記載の機能的核酸は、キャリアＲＮＡ配列に位置するｍｉＲＮＡ配列であり、これにより、細胞に本組成物を導入した後には、ｍｉＲＮＡ配列がプロセシングされ、その結果、ｍｉＲＮＡ配列のプロセシングはキャリア切断部位でのキャリアＲＮＡの直接的または間接的切断を果たすことができ、このｍｉＲＮＡ配列のプロセシングはドロシャプロセシングを含む。一実施形態では、前記実施形態に記載のｍｉＲＮＡ配列は、天然ｍｉＲＮＡに相当する配列、またはそれと実質的に同一の配列を含む。例えば、図１２Ｃ、１２Ｄ参照。
別の実施形態では、第１節に記載の機能的核酸は、キャリアＲＮＡ配列内のキャリア配列の５′末端のすぐ上流に位置するヌクレオチド配列を有し、この場合、第３の配列は０ヌクレオチド長であり、前記ヌクレオチド配列はキャリア配列に結合することができ、これにより、前記キャリア配列とヌクレオチド配列は、ドロシャの基質となるステムループ構造を形成することができる。細胞に本組成物を導入した後には、このステムループ構造はプロセシングされ、このステムループ構造のプロセシングは、キャリア配列の３′末端でのキャリアＲＮＡの直接的または間接的切断を果たす（ａｆｆｅｃｔｉｎｇ）ことができる。別の実施形態では、前記実施形態に記載のステムループ構造は、最大約１５０ヌクレオチド長であり、プロセシングされたステムループ構造はダイサーの基質とならない。例えば、図１３Ａ参照。
別の実施形態では、第１節に記載の機能的核酸は、キャリアＲＮＡ内のキャリア配列の３′末端のすぐ下流に位置するヌクレオチド配列を有し、この場合、第３の配列は０ヌクレオチド長であり、前記ヌクレオチド配列はキャリア配列に結合することができる。前記キャリア配列とヌクレオチド配列は、ドロシャの基質となるステムループ構造を形成することができる。細胞に本組成物を導入した後には、このステムループ構造はプロセシングされ、このステムループ構造のプロセシングは、キャリア配列の５′末端でのキャリアＲＮＡの直接的または間接的切断を果たすことができる。別の実施形態では、前記実施形態に記載のステムループ構造は最大約１５０ヌクレオチド長を有し、プロセシングされたステムループ構造はダイサーの基質とならない。例えば、図１３Ｂ参照。
いくつかの実施形態によれば、理論または機構に縛られるものではないが、このキャリア配列はドロシャにより独立に切断され得るので、ｍｉＲＮＡ配列またはステムループ構造の使用は、結果の増強をもたらし得る。別の実施形態では、第１節の実施形態に記載の機能的核酸は、
（ｉ）キャリアＲＮＡ内のキャリア配列の５′末端のすぐ上流に位置する第１のヌクレオチド配列（この場合、第３の配列は０〜５０ヌクレオチド長である）；および
（ｉｉ）キャリア配列の３′末端のすぐ下流に位置する第２のヌクレオチド配列（この場合、第２のヌクレオチド配列は第１のヌクレオチド配列と結合することができ、第２のヌクレオチド配列と第１のヌクレオチド配列とキャリア配列はステムループ構造を形成することができる）
を含む。
これにより、細胞に本組成物を導入した後には、ステムループ構造がプロセシングされ、このステムループ構造のプロセシングは、キャリア切断部位でのキャリアＲＮＡの直接的または間接的切断を果たすことができ、このステムループ構造のプロセシングは、１以上のＲＮＡ二本鎖を形成することができる。ステムループ構造のプロセシングは例えばダイサープロセシングを含んでよく、ＲＮＡ二本鎖はｓｉＲＮＡ二本鎖および／またはｍｉＲＮＡ二本鎖であり得る。
さらなる実施形態では、前記実施形態に記載の機能的ＲＮＡは、標的特異的ＲＮＡ干渉を指示するために標的配列と十分な相補性がある１８〜２５ヌクレオチド長の核酸配列であり、この場合、前記標的配列は、内在性シグナルＲＮＡ内のある領域に位置する１８〜２５ヌクレオチド長の配列である。前記領域は、所定切断部位の約２５ヌクレオチド下流から所定切断部位の約２５ヌクレオチド上流までに位置し、この場合、前記核酸配列は第１のヌクレオチド配列内または第２のヌクレオチド配列内に位置する。細胞に本組成物を導入した後には、１以上のＲＮＡ二本鎖からの少なくとも１つのＲＮＡ二本鎖が前記核酸配列を含み、前記核酸配列を含むＲＮＡ二本鎖が、ＲＮＡ干渉により、所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を指示する。例えば、図１４Ａ参照。
別の実施形態では、前記実施形態に記載の第１のヌクレオチド配列または第２のヌクレオチド配列が前記核酸配列であり、この場合、キャリアＲＮＡ配列は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とキャリア配列から本質的になる。第１のヌクレオチド配列は１８〜２５ヌクレオチド長であり、第２のヌクレオチド配列は１８〜２５ヌクレオチド長である。ステムループ構造は、２ヌクレオチドの３′−オーバーハングを形成し、ダイサーの基質となり得、この場合、キャリアＲＮＡポリヌクレオチド配列の発現は、ポリメラーゼＩに基づくプロモーターまたはポリメラーゼＩＩＩに基づくプロモーターにより駆動される。例えば、図１４Ｂ参照。
いくつかの実施形態では、前記２つの実施形態のいずれかに記載の領域は、所定切断部位の約１１ヌクレオチド下流から所定切断部位の約１２ヌクレオチド上流までに位置する。別の実施形態では、前記実施形態に記載の領域は、所定切断部位の約１０ヌクレオチド下流から所定切断部位の約１１ヌクレオチド上流までに位置する。
いくつかの実施形態によれば、理論または機構に縛られるものではないが、同じＲＮＡ分子内に位置する機能的ＲＮＡとキャリア配列を使用する場合には、転写単位の必要性はほとんどなくなり、有利な結果が得られる。この機能的ＲＮＡとキャリア配列が近接していることのさらなる利点は、それらが細胞内の同じ場所で同時に一定の比率で合成されるということである。
４．同じＲＮＡ二本鎖に位置するキャリア配列／ＲＮＡと機能的ＲＮＡ／核酸の構造
この節では、キャリアＲＮＡおよび／またはキャリア配列が機能的ＲＮＡまたは機能的核酸とともに同じＲＮＡ二本鎖に位置する場合の、第１節に記載の本発明の組成物の構造の種々の実施形態を記載する。
本発明の別の実施形態では、第１節の実施形態に記載の機能的核酸は、
（ｉ）キャリアＲＮＡ内のキャリア配列の３′末端のすぐ下流に位置するヌクレオチド配列（この場合、キャリアＲＮＡはキャリア配列とヌクレオチド配列からから本質的になる）；および（ｉｉ）前記ヌクレオチド配列に結合し得る１以上のＲＮＡ分子を含むことができ、この場合、このヌクレオチド配列と少なくとも１つのＲＮＡ分子はその二本鎖の一方の末端に０〜５ヌクレオチドの３′−オーバーハングまたは５′−オーバーハングを形成するが、前記ヌクレオチド配列と少なくとも１つのＲＮＡ分子のそれぞれが他方とハイブリダイズした際に形成される。細胞に本組成物を導入した後には、前記ヌクレオチド配列と１以上のＲＮＡ分子は互いにハイブリダイズし、ヌクレオチド配列がプロセシングされ、その結果、このヌクレオチド配列のプロセシングは、キャリア切断部位でのキャリアＲＮＡの直接的または間接的切断を果たすことができ、このヌクレオチド配列のプロセシングは、１以上のＲＮＡ二本鎖を形成することができる。ヌクレオチド配列のプロセシングは例えばダイサープロセシングを含んでもよく、ＲＮＡ二本鎖はｓｉＲＮＡ二本鎖および／またはｍｉＲＮＡ二本鎖であり得る。
本発明の別の実施形態では、第１節の実施形態に記載の機能的核酸は、
（ｉ）キャリアＲＮＡ内のキャリア配列の５′末端のすぐ上流に位置するヌクレオチド配列（この場合、キャリアＲＮＡはキャリア配列とヌクレオチド配列からから本質的になる）；および（ｉｉ）前記ヌクレオチド配列に結合し得る１以上のＲＮＡ分子を含むことができ、この場合、このヌクレオチド配列と、１以上のＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つのＲＮＡ分子とは、前記ヌクレオチド配列と１つのＲＮＡ分子のそれぞれが他方とハイブリダイズした際に形成される二本鎖の一方の末端に０〜５ヌクレオチドの３′−オーバーハングまたは５′−オーバーハングを形成する。細胞に本組成物を導入した後には、前記ヌクレオチド配列と１以上のＲＮＡ分子が他方とハイブリダイズし、前記ヌクレオチド配列がプロセシングされる。このヌクレオチド配列のプロセシングは、キャリア切断部位でのキャリアＲＮＡの直接的または間接的切断を果たすことができ、このヌクレオチド配列のプロセシングは、１以上のＲＮＡ二本鎖を形成することができ、この場合、ヌクレオチド配列のプロセシングは例えばダイサープロセシングを含んでもよく、ＲＮＡ二本鎖はｓｉＲＮＡ二本鎖および／またはｍｉＲＮＡ二本鎖であり得る。
いくつかの実施形態では、前記２つの実施形態のいずれかに記載の機能的ＲＮＡは、標的特異的ＲＮＡ干渉を指示するために標的配列と十分な相補性がある１８〜２５ヌクレオチド長の核酸配列である。標的配列は、内在性シグナルＲＮＡ内のある領域に位置する１８〜２５ヌクレオチド長の配列であり、この場合、前記領域は所定切断部位の約２５ヌクレオチド下流から所定切断部位の約２５ヌクレオチド上流までに位置し、前記核酸配列は前記ヌクレオチド配列内または１以上のＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つのＲＮＡ分子内に位置する。細胞に本組成物を導入した後には、１以上のＲＮＡ二本鎖のうちの少なくとも１つのＲＮＡ二本鎖が前記核酸配列を含み、前記核酸配列を含むＲＮＡ二本鎖が、例えばＲＮＡ干渉により、所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を指示する。
一実施形態では、前記実施形態に記載の領域は、所定切断部位の約１１ヌクレオチド下流から所定切断部位の約１２ヌクレオチド上流までに位置する。別の実施形態では、前記２つの実施形態のいずれかに記載の１以上のＲＮＡ分子は、前記核酸配列から本質的になる１つのＲＮＡ分子であり、この場合、前記ヌクレオチド配列は１８〜２５ヌクレオチド長であり、前記１つのＲＮＡ分子は１８〜２５ヌクレオチド長である。前記ヌクレオチド配列と１つのＲＮＡ分子は、ヌクレオチド配列と１つのＲＮＡ分子のそれぞれが他方とハイブリダイズした際に形成される二本鎖の一方の末端に２ヌクレオチドの３′−オーバーハングを形成し、このキャリアＲＮＡと１つのＲＮＡ分子の発現はポリメラーゼＩまたはＩＩＩに基づくプロモーターにより駆動される。例えば、図１５Ａおよび１５Ｂ参照。
いくつかの実施形態によれば、理論または機構に縛られるものではないが、機能的ＲＮＡとキャリア配列が同じＲＮＡ二本鎖に位置する場合、キャリア配列は機能的ＲＮＡを内在性シグナルＲＮＡの所定シグナル配列に近接させることができ、さらに、ＲＮＡ干渉経路の成分（例えば、ダイサーおよびＲｉｓｃ）も所定シグナル配列に近接させることができる。
本発明の別の実施形態では、第１節の実施形態に記載の機能的ＲＮＡは、
（ｉ）キャリアＲＮＡの５′末端に位置するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記ヌクレオチド配列に結合し得る１以上のＲＮＡ分子を含み、この場合、前記ヌクレオチド配列と少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ヌクレオチド配列と少なくとも１つのＲＮＡ分子のそれぞれが他方とハイブリダイズした際に形成される二本鎖の一方の末端に０〜５ヌクレオチドの３′−オーバーハングまたは５′−オーバーハングを形成する。前記ヌクレオチド配列または少なくとも１つのＲＮＡ分子は、標的特異的ＲＮＡ干渉を指示するために標的配列と十分な相補性がある１８〜２５ヌクレオチド長の核酸配列を含み、この場合、標的配列は、内在性シグナルＲＮＡ内のある領域に位置する１８〜２５ヌクレオチド長の配列であり、前記領域は所定切断部位の約２５ヌクレオチド下流から所定切断部位の約２５ヌクレオチド上流に位置する。細胞に本組成物を導入した後には、前記ヌクレオチド配列と１以上のＲＮＡ分子は他方とハイブリダイズし、前記ヌクレオチド配列はプロセシングされ、その結果、このヌクレオチド配列のプロセシングは、１以上のＲＮＡ二本鎖を形成することができる。このヌクレオチド配列のプロセシングはダイサープロセシングを含んでもよく、ＲＮＡ二本鎖はｓｉＲＮＡ二本鎖および／またはｍｉＲＮＡ二本鎖であってよく、この場合、１以上のＲＮＡ二本鎖のうちの少なくとも１つのＲＮＡ二本鎖が前記核酸配列を含み、前記核酸配列を含むＲＮＡ二本鎖が、ＲＮＡ干渉により、所定切断部位の内在性シグナルＲＮＡの切断を指示する。
本発明の別の実施形態では、第１節の実施形態に記載の機能的ＲＮＡは、
（ｉ）キャリアＲＮＡの３′末端に位置するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記ヌクレオチド配列に結合し得る１以上のＲＮＡ分子を含むことができ；この場合、前記ヌクレオチド配列と少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ヌクレオチド配列と１つのＲＮＡ分子のそれぞれが他方とハイブリダイズした際に形成される二本鎖の一方の末端に０〜５ヌクレオチドの３′−オーバーハングまたは５′−オーバーハングを形成する。前記ヌクレオチド配列または１以上のＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つのＲＮＡ分子は、標的特異的ＲＮＡ干渉を指示するために標的配列と十分な相補性がある１８〜２５ヌクレオチド長の核酸配列を含み、この場合、前記標的配列は、内在性シグナルＲＮＡ内のある領域に位置する１８〜２５ヌクレオチド長の配列であり、前記領域は所定切断部位の約２５ヌクレオチド下流から所定切断部位の約２５ヌクレオチド上流までに位置する。細胞に本組成物を導入した後には、前記ヌクレオチド配列と１以上のＲＮＡ分子は互いにハイブリダイズし、前記ヌクレオチド配列はプロセシングされ、その結果、このヌクレオチド配列のプロセシングは、１以上のＲＮＡ二本鎖を形成することができる。このヌクレオチド配列のプロセシングは例えばダイサープロセシングを含んでもよく、ＲＮＡ二本鎖はｓｉＲＮＡ二本鎖および／またはｍｉＲＮＡ二本鎖であってよく、この場合、１以上のＲＮＡ二本鎖のうち少なくとも１つのＲＮＡ二本鎖が前記核酸配列を含み、前記核酸配列を含むＲＮＡ二本鎖が、ＲＮＡ干渉により、所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を指示する。
さらなる実施形態では、前記２つの実施形態のいずれかに記載の領域は、所定切断部位の約１１ヌクレオチド下流から所定切断部位の約１２ヌクレオチド上流までに位置する。別の実施形態では、前記３つの実施形態のいずれかに記載の１以上のＲＮＡ分子は１つのＲＮＡ分子であり、この場合、このヌクレオチド配列または１つのＲＮＡ分子は前記核酸配列から本質的になる。前記ヌクレオチド配列は１８〜２５ヌクレオチド長であり、前記１つのＲＮＡ分子は１８〜２５ヌクレオチド長であり、この場合、このヌクレオチド配列とＲＮＡ分子は、ヌクレオチド配列と１つのＲＮＡ分子のそれぞれが他方とハイブリダイズした際に形成される二本鎖の一方の末端に２ヌクレオチドの３′−オーバーハングを形成する。いくつかの実施形態では、キャリアＲＮＡと１つのＲＮＡ分子の発現は、ポリメラーゼＩまたはＩＩＩに基づくプロモーターにより駆動される。例えば、図１６Ａおよび１６Ｂ参照。
いくつかの実施形態によれば、理論または機構に縛られるものではないが、機能的ＲＮＡとキャリアＲＮＡが同じＲＮＡ二本鎖に位置する場合、キャリアＲＮＡは機能的ＲＮＡを内在性シグナルＲＮＡの所定シグナル配列に近接させることができ、これにより、ＲＮＡ干渉経路の成分（例えば、ダイサーおよびＲｉｓｃ）も所定シグナル配列に近接させることができる。
本発明の別の実施形態では、第１節の実施形態に記載の機能的ＲＮＡは、
（ｉ）キャリアＲＮＡの５′末端に位置するヌクレオチド配列；および（ｉｉ）前記ヌクレオチド配列に結合し得る１以上のＲＮＡ分子を含むことができ；この場合、前記ヌクレオチド配列と少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ヌクレオチド配列とＲＮＡ分子のそれぞれが互いにハイブリダイズした際に形成される二本鎖の一方の末端に０〜５ヌクレオチドの３′−オーバーハングまたは５′−オーバーハングを形成する。前記ヌクレオチド配列または少なくとも１つのＲＮＡ分子は、１８〜２５ヌクレオチド長の核酸配列を含むことができ、この場合、この核酸配列は、標的特異的ＲＮＡ干渉を指示するために標的配列と十分な相補性がある。前記標的配列は、内在性シグナルＲＮＡ内のある領域に位置する１８〜２５ヌクレオチド長の配列であり、この場合、前記領域は所定切断部位の約２５ヌクレオチド下流から所定切断部位の約２５ヌクレオチド上流までに位置する。細胞に本組成物を導入した後には、前記ヌクレオチド配列とＲＮＡ分子は互いにハイブリダイズし、前記ヌクレオチド配列はプロセシングされ、その結果、このヌクレオチド配列のプロセシングは、１以上のＲＮＡ二本鎖を形成することができる。このヌクレオチド配列のプロセシングは例えばダイサープロセシングを含んでもよく、ＲＮＡ二本鎖はｓｉＲＮＡ二本鎖および／またはｍｉＲＮＡ二本鎖であってよく、この場合、１以上のＲＮＡ二本鎖のうちの少なくとも１つのＲＮＡ二本鎖が前記核酸配列を含み、前記核酸配列を含むＲＮＡ二本鎖が、ＲＮＡ干渉により、所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を指示する。
本発明の別の実施形態では、第１節の実施形態に記載の機能的ＲＮＡは、
（ｉ）キャリアＲＮＡ配列の３′末端に位置するヌクレオチド配列；および
（ｉｉ）ヌクレオチド配列に結合し得る１以上のＲＮＡ分子
を含むことができ；この場合、前記ヌクレオチド配列と少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ヌクレオチド配列と１つのＲＮＡ分子のそれぞれが互いにハイブリダイズした際に形成される二本鎖の一方の末端に０〜５ヌクレオチドの３′−オーバーハングまたは５′−オーバーハングを形成する。前記ヌクレオチド配列または少なくとも１つのＲＮＡ分子は、１８〜２５ヌクレオチド長の核酸配列を含むことができ、この場合、前記核酸配列は、標的特異的ＲＮＡ干渉を指示するために標的配列と十分な相補性がある。前記標的配列は、内在性シグナルＲＮＡ内のある領域に位置する１８〜２５ヌクレオチド長の配列であり、この場合、前記領域は所定切断部位の約２５ヌクレオチド下流から所定切断部位の約２５ヌクレオチド上流に位置する。細胞に本組成物を導入した後には、前記ヌクレオチド配列と１以上のＲＮＡ分子は互いにハイブリダイズし、前記ヌクレオチド配列はプロセシングされ、その結果、このヌクレオチド配列のプロセシングは、１以上のＲＮＡ二本鎖を形成することができる。このヌクレオチド配列のプロセシングは例えばダイサープロセシングを含んでもよく、ＲＮＡ二本鎖はｓｉＲＮＡ二本鎖および／またはｍｉＲＮＡ二本鎖であってよく、この場合、１以上のＲＮＡ二本鎖のうちの少なくとも１つのＲＮＡ二本鎖は前記核酸配列を含むことができ、前記核酸配列を含むＲＮＡ二本鎖は、ＲＮＡ干渉により、所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を指示することができる。
別の実施形態では、前記２つの実施形態のいずれかに記載の領域は、所定切断部位の約１１ヌクレオチド下流から所定切断部位の約１２ヌクレオチド上流までに位置することができる。別の実施形態では、前記３つの実施形態のいずれかに記載の１以上のＲＮＡ分子は１つのＲＮＡ分子であり、この場合、前記ヌクレオチド配列または１つのＲＮＡ分子は前記核酸配列から本質的になる。前記ヌクレオチド配列は１８〜２５ヌクレオチド長であってよく、前記１つのＲＮＡ分子は１８〜２５ヌクレオチド長である。前記ヌクレオチド配列と１つのＲＮＡ分子は、ヌクレオチド配列と１つのＲＮＡ分子のそれぞれが互いにハイブリダイズした際に形成される二本鎖の一方の末端に２ヌクレオチドの３′−オーバーハングを形成する。キャリアＲＮＡと１つのＲＮＡ分子の発現は、ポリメラーゼＩまたはＩＩＩに基づくプロモーターにより駆動される。例えば、図１７Ａおよび１７Ｂ参照。
いくつかの実施形態では、第１節の実施形態に記載の機能的核酸は、
（ｉ）キャリアＲＮＡ配列の５′末端に位置するヌクレオチド配列；および
（ｉｉ）前記ヌクレオチド配列に結合し得る１以上のＲＮＡ分子
を含むことができ；この場合、前記ヌクレオチド配列と、１以上のＲＮＡ分子のうちの１つのＲＮＡ分子は、ヌクレオチド配列と１つのＲＮＡ分子のそれぞれが他方とハイブリダイズした際に形成される二本鎖の一方の末端に０〜５ヌクレオチドの３′−オーバーハングまたは５′−オーバーハングを形成する。この場合、前記ヌクレオチド配列または１以上のＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つのＲＮＡ分子は、１８〜２５ヌクレオチド長の核酸配列を含み、この場合、前記核酸配列は、標的特異的ＲＮＡ干渉を指示するために標的配列と十分な相補性があり、この場合、前記標的配列は、キャリアＲＮＡ内のある領域に位置する１８〜２５ヌクレオチド長の配列であり、前記領域はキャリア切断部位の約２５ヌクレオチド下流からキャリア切断部位の約２５ヌクレオチド上流までに位置する。これにより、細胞に本組成物を導入した後には、前記ヌクレオチド配列と１以上のＲＮＡ分子は他方とハイブリダイズし、前記ヌクレオチド配列はプロセシングされ、その結果、このヌクレオチド配列のプロセシングは、１以上のＲＮＡ二本鎖を形成することができる。このヌクレオチド配列のプロセシングは例えばダイサープロセシングを含んでもよく、ＲＮＡ二本鎖はｓｉＲＮＡ二本鎖および／またはｍｉＲＮＡ二本鎖であってよく、この場合、１以上のＲＮＡ二本鎖のうちの少なくとも１つのＲＮＡ二本鎖が前記核酸配列を含み、前記核酸配列を含むＲＮＡ二本鎖は、ＲＮＡ干渉により、キャリア切断部位でのキャリアＲＮＡの切断を指示する。
本発明の別の実施形態では、第１節の実施形態に記載の機能的核酸は、
（ｉ）キャリアＲＮＡ配列の３′末端に位置するヌクレオチド配列；および
（ｉｉ）前記ヌクレオチド配列に結合し得る１以上のＲＮＡ分子
を含むことができ、この場合、前記ヌクレオチド配列と、１以上のＲＮＡ分子のうちの１つのＲＮＡ分子は、ヌクレオチド配列と１つのＲＮＡ分子のそれぞれが他方とハイブリダイズした際に形成される二本鎖の一方の末端に０〜５ヌクレオチドの３′−オーバーハングまたは５′−オーバーハングを形成する。
この場合、前記ヌクレオチド配列または１以上のＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つのＲＮＡ分子は、１８〜２５ヌクレオチド長の核酸配列を含み、前記核酸配列は、標的特異的ＲＮＡ干渉を指示するために標的配列と十分な相補性があり、この場合、前記標的配列は、キャリアＲＮＡ配列内のある領域に位置する１８〜２５ヌクレオチド長の配列であり、前記領域はキャリア切断部位の約２５ヌクレオチド下流からキャリア切断部位の約２５ヌクレオチド上流までに位置する。細胞に本組成物を導入した後には、前記ヌクレオチド配列と１以上のＲＮＡ分子は互いにハイブリダイズし、前記ヌクレオチド配列はプロセシングされ、その結果、このヌクレオチド配列のプロセシングは、１以上のＲＮＡ二本鎖を形成することができる。このヌクレオチド配列のプロセシングは例えばダイサープロセシングを含んでもよく、ＲＮＡ二本鎖はｓｉＲＮＡ二本鎖および／またはｍｉＲＮＡ二本鎖を含んでよく、この場合、１以上のＲＮＡ二本鎖のうちの少なくとも１つのＲＮＡ二本鎖は前記核酸配列を含み、前記核酸配列を含むＲＮＡ二本鎖は、ＲＮＡ干渉により、キャリア切断部位でのキャリアＲＮＡの切断を指示する。
別の実施形態では、前記２つの実施形態のいずれかに記載の領域は、キャリア切断部位の約１１ヌクレオチド下流からキャリア切断部位の約１２ヌクレオチド上流までに位置することができる。別の実施形態では、前記３つの実施形態のいずれかに記載の１以上のＲＮＡ分子は１つのＲＮＡ分子であり、この場合、前記ヌクレオチド配列または１つのＲＮＡ分子は前記核酸配列から本質的になる。前記ヌクレオチド配列は１８〜２５ヌクレオチド長であり、この場合、前記１つのＲＮＡ分子は１８〜２５ヌクレオチド長であり、前記ヌクレオチド配列と１つのＲＮＡ分子は、ヌクレオチド配列と１つのＲＮＡ分子のそれぞれが他方とハイブリダイズした際に形成される二本鎖の一方の末端に２ヌクレオチドの３′−オーバーハングを形成する。キャリアＲＮＡと１つのＲＮＡ分子の発現は、ポリメラーゼＩまたはＩＩＩに基づくプロモーターにより駆動され得る。例えば、図１８Ａおよび１８Ｂ参照。
別の実施形態では、前記機能的ＲＮＡは、標的特異的ＲＮＡ干渉を指示するために特定の標的配列と十分な相補性がある１８〜２５ヌクレオチド長の特定のヌクレオチド配列である。前記特定の標的配列は、内在性シグナルＲＮＡ内の特定の領域に位置する１８〜２５ヌクレオチド長の配列であり、この場合、前記特定の領域は所定切断部位の約２５ヌクレオチド下流から所定切断部位の約２５ヌクレオチド上流に位置する。前記特定のヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列内または前記１以上のＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つのＲＮＡ分子内に位置する。細胞に本組成物を導入した後には、前記１以上のＲＮＡ二本鎖のうちの少なくとも１つのＲＮＡ二本鎖は前記特定のヌクレオチド配列を含み、これにより、前記特定のヌクレオチド配列を含むＲＮＡ二本鎖は、ＲＮＡ干渉により、所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を指示する。例えば、図１９Ａおよび１９Ｂ参照。
５．少なくとも３つの連続するキャリア配列を含むキャリアＲＮＡ配列の構造
この節では、第１節に記載のキャリアＲＮＡの構造を記載し、この場合、キャリアＲＮＡは少なくとも３つの連続するキャリア配列を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、第１節の実施形態に記載のキャリアＲＮＡは、記載のキャリア配列のすぐ下流に少なくとも２つの連続するキャリア配列をさらに含んでよい。例えば、図２０Ａ参照。
さらなる実施形態では、第１節の実施形態に記載のキャリアＲＮＡは、本明細書に記載のキャリア配列すぐ下流に１００の連続するキャリア配列をさらに含んでよく（同一であっても異なっていてもよい）、この場合、エッジ配列は２３〜２８ヌクレオチド長であって、所定切断部位から約２３〜２８ヌクレオチド下流までに位置し、第２の配列は２ヌクレオチド長であり、第３の配列は０ヌクレオチド長であり、前記ポリヌクレオチド配列、すなわち、キャリアＲＮＡの発現は、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターにより駆動される。
さらなる実施形態では、第１節の実施形態に記載のキャリアＲＮＡは、キャリア配列のすぐ上流に少なくとも２つの連続するキャリア配列をさらに含んでよい。例えば、図２０Ｂ参照。
別の実施形態では、第１節の実施形態に記載のキャリアＲＮＡは、キャリア配列のすぐ上流に、同一であっても異なっていてもよい１００の連続するキャリア配列をさらに含んでよく、この場合、エッジ配列は２５〜３０ヌクレオチド長であって、所定切断部位の２ヌクレオチド上流に位置し、かつ、内在性シグナルＲＮＡ内の上流に伸び、第２の配列は０ヌクレオチド長であり、第３の配列は０ヌクレオチド長であり、この場合、前記ポリヌクレオチド配列、すなわち、キャリアＲＮＡの発現は、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターにより駆動される。
いくつかの実施形態によれば、理論または機構に縛られるものではないが、機能的核酸が例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、投げ輪型ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および／またはトランス作用リボザイムである場合に有利な結果が得られ、これは、このような機能的核酸を用いれば、１つのキャリアＲＮＡ、また、１つの機能的核酸から多くのキャリア配列が生成できるからである。
６．切断されない反対側で所定シグナル配列を切断し得る付加的機能的ＲＮＡをさらに転写し得るポリヌクレオチド分子の構造
この節では、ポリヌクレオチド分子が所定シグナル配列の、切断されない反対側の末端での内在性シグナルＲＮＡの切断を果たし得る付加的機能的ＲＮＡもさらに一緒に転写する場合の、第１節の実施形態に記載のポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子）の構造の実施形態を記載する。
本発明のいくつかの実施形態では、第１節のいくつかの実施形態に記載のポリヌクレオチド分子は、付加的切断部位での内在性シグナルＲＮＡの直接的または間接的切断を果たし得る付加的機能的ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、この場合、付加的切断部位は、所定シグナル配列の３′末端の０〜１０００ヌクレオチド下流に位置することができる。一実施形態では、付加的切断部位は、所定シグナル配列の３′末端の０〜５ヌクレオチド下流に位置することができる。例えば、図２１Ａ参照。
さらなる実施形態では、第１節のいくつかの実施形態に記載のポリヌクレオチド分子は、付加的切断部位で内在性シグナルＲＮＡの直接的または間接的切断を果たし得る付加的機能的ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでよく、この場合、付加的切断部位は、所定シグナル配列の５′末端の０〜１０００ヌクレオチド上流に位置することができる。一実施形態では、付加的切断部位は、所定シグナル配列の５′末端の０〜５ヌクレオチド上流に位置することができる。例えば、図２１Ｂ参照。
いくつかの実施形態によれば、理論または機構に縛られるものではないが、前記４つの実施形態は、これらの実施形態において、所定シグナル配列はその両末端で切断可能であるので、このキャリアＲＮＡ／配列を用いれば、それが例えばダイサーおよび／またはＲｉｓｃなどの内在性酵素の良好な基質となり得ることから有利であり得る。
７．対象外来性ＲＮＡの構造
本発明のいくつかの実施形態では、第１節の実施形態に記載の対象外来性ＲＮＡは、
対象外来性タンパク質をコードする配列；および
前記対象外来性タンパク質の発現を阻害し得る阻害配列
をさらに含んでよく；
これにより、特定の標的／切断部位は、前記阻害配列と前記対象外来性タンパク質をコードする配列の間に位置する。内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に本組成物を導入した後には、対象外来性ＲＮＡが転写され、特定の標的／切断部位で切断され、これにより、阻害配列が対象外来性タンパク質をコードする配列から分離され、対象外来性タンパク質が発現され得る。例えば、図２２Ａおよび２２Ｂ参照。従って、対象外来性ＲＮＡの切断は、その細胞内での活性対象外来性タンパク質の発現をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、対象外来性ＲＮＡ分子は、キャリアＲＮＡ配列および／または機能的ＲＮＡ配列をさらに含んでよい。
当技術分野で公知のように、キャップまたはポリＡテールを持たないｍＲＮＡは、なおタンパク質を翻訳することができる。哺乳動物細胞では、キャップを付加すると、ｍＲＮＡの翻訳は３５〜５０倍増え、ポリ（Ａ）テールを付加すると、ｍＲＮＡの翻訳は１１４〜１５５倍増える［１０］。哺乳動物細胞においてポリ（Ａ）テールは、機能的ｍＲＮＡの半減期を２．６倍延長するだけであり、キャップは機能的ｍＲＮＡの半減期を１．７倍延長するだけである［１０］。
タンパク質には、１個の細胞に１個のタンパク質という濃度でも生物学的に活性を持つものがある。リシンまたはアブリンは１個のタンパク質がサイトゾルに達するとその細胞
を死滅させることができるという報告がある［１２、１３］。さらに、ジフテリア毒素フラグメントＡの１個のタンパク質が細胞に導入されると、細胞を死滅させることができる［１４］。本発明の対象外来性タンパク質は、いずれのタンパク質またはペプチドであってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、対象外来性タンパク質はいずれのタイプの毒素（例えば、リシン、アブリン、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）、ボツリヌスボツリヌス毒素）；酵素；リポーター遺伝子；構造遺伝子などであってもよい。いくつかの実施形態では、対象外来性タンパク質は、２つのタンパク質の融合産物であるポリペプチドであってもよく、この融合産物はその間に切断部位を有しており、細胞内でその２つのタンパク質の分離を可能とする。例えば、対象外来性タンパク質はリシンとＤＴＡの融合タンパク質であってもよく、これにより、この融合タンパク質が例えば特異的プロテアーゼにより切断されると、その結果、細胞内で独立したＤＴＡタンパク質とリシンタンパク質が形成される。いくつかの実施形態では、対象外来性タンパク質は、本組成物により発現され得る２つの独立したタンパク質を含んでもよい。例えば、対象外来性ＲＮＡは、例えばリシンとＤＴＡなどの、２つの独立した対象外来性タンパク質をコードしてもよい。
７．１．特定の標的／切断部位の上流に位置する阻害配列を有する対象外来性ＲＮＡの構造
７．１．１．特定の標的／切断部位の上流に位置する阻害配列の構造
第７節の実施形態に記載される対象外来性ＲＮＡ内の阻害配列は、特定の標的／切断部位の上流に位置しても下流に位置してもよい。この節では、いくつかの実施形態に従う、対象外来性ＲＮＡにおいて特定の標的／切断部位の上流に位置する阻害配列の構造を記載する。例えば、図２２Ａ参照。
本発明のいくつかの実施形態では、特定の標的／切断部位の上流に位置する、第７節の実施形態に記載の阻害配列は、例えば、限定されるものではないが、開始コドンを含んでよく、これにより、前記開始コドンと対象外来性タンパク質をコードする配列は同じリーディングフレームでなくなり、その結果、前記開始コドンは、下流にコードされている対象タンパク質にフレームシフト突然変異を生じさせる。例えば、図２３Ａ。一実施形態では、前記開始コドンは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列内に位置する。さらに、翻訳イニシエーターとして機能する能力を維持している改変型のＫｏｚａｋコンセンサス配列も使用可能である。いくつかの実施形態では、いずれの翻訳イニシエーターエレメントも使用可能である。例えば、図２３Ｂ参照。
例えば、ヒトにおけるＫｏｚａｋコンセンサス配列は５′−ＡＣＣＡＵＧＧ−３′（配列番号２５）であり、開始コドンは５′−ＡＵＧ−３′である。
本発明の別の実施形態では、特定の標的／切断部位の上流に位置する、第７節に記載の阻害配列は複数の開始コドンを含み、これにより、各開始コドンと対象外来性タンパク質をコードする配列は同じリーディングフレームでなくなり、その結果、前記開始コドンは、下流にコードされている対象外来性タンパク質にフレームシフト突然変異を生じさせる。さらに、各開始コドンは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、または翻訳イニシエーターとして機能する能力を維持している改変型Ｋｏｚａｋコンセンサス配列内に位置する。例えば、図２３Ｃ参照。
いくつかの実施形態では、前記開始コドンは、１以上のＴＩＳＵモチーフ内に位置してもよいし、または１以上のＴＩＳＵモチーフを含んでもよい。ＴＩＳＵ（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ ｏｆ Ｓｈｏｒｔ ５′ＵＴＲ）モチーフは、非常に短い５′ＵＴＲを有するｍＲＮＡからの効率的かつ正確な翻訳を指示するその独特な能力において、Ｋｏｚａｋコンセンサスとは区別される［３９］。本発明の他の実施形態では、特定の標的／切断部位の上流に位置する、第７節の特定の実施形態に記載の阻害配列は開始コドンを含み、対象外来性ＲＮＡは、その開始コドンと前記対象外来性タンパク質をコードする配列の最初のコドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）との間に位置する終止コドンをさらに含み、その結果、前記終止コドンと前記開始コドンは同じリーディングフレームとなる。このような構造は、対象タンパク質をコードする下流配列の翻訳効率を低減する上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）を作り出す。例えば、図２４Ａ参照。いくつかの実施形態では、終止コドンは、例えば、５′−ＵＡＡ−３′または５′−ＵＡＧ−３′または５′−ＵＧＡ−３′であり得る。
いくつかの実施形態では、上流ＯＲＦの下流の、ｍｉＲＮＡの標的配列の上流または下流にある位置（切断部位）に、強いステムおよびループが位置してもよい。このようなステムおよびループの作出は、終止コドンに到達しているにもかかわらず、リボソームの小サブユニットがｍＲＮＡから離れず、ｍＲＮＡの読み取りが続く状況において役立ち得る。リボソームの小サブユニットは、強いＲＮＡ二次構造を開くことはできない。さらに、これらのステムおよびループが標的配列の下流に位置する場合、それらは、例えばＸＲＮ１エキソリボヌクレアーゼ（ｅｘｏｒｉｎｏｎｕｃｌｅａｓｅ）によって遂行され得る切断されたｍＲＮＡの分解を遮断することもできる。
本発明の別の実施形態では、特定の標的／切断部位の上流に位置する、第７節の特定の実施形態に記載の阻害配列は、開始コドンと、その開始コドンの下流に細胞内局在のための選別／局在化／標的化シグナルをコードするヌクレオチド配列を含み、これにより、前記ヌクレオチド配列と前記開始コドンは同じリーディングフレームとなり、その結果、対象タンパク質の細胞内局在がその生物学的機能を阻害する。細胞内局在のための選別／局在化シグナルには、限定されるものではないが、ミトコンドリア、核、エンドソーム、リソソーム、ペルオキシソーム、ＥＲ、または任意の細胞内局在もしくはオルガネラに対する選別局在化シグナルが含まれる。細胞内局在のための選別シグナルは、例えば、限定されるものではないが、ペルオキシソーム標的化シグナル２［（Ｒ／Ｋ）（Ｌ／Ｖ／Ｉ）Ｘ５（Ｑ／Ｈ）（Ｌ／Ａ）］（配列番号２６）またはＨ２Ｎ−−−−ＲＬＲＶＬＳＧＨＬ（配列番号２７）（ヒトアルキルジヒドロキシアセトンホスフェートシンターゼのもの）から選択され得る［３０］。例えば、図２４Ｂ参照。
本発明の別の実施形態では、特定の標的／切断部位の上流に位置する、第７節の特定の実施形態に記載の阻害配列は、開始コドンと、その開始コドンの下流にタンパク質分解シグナルをコードするヌクレオチド配列を含み、これにより、前記ヌクレオチド配列と前記開始コドンは同じリーディングフレームとなる。タンパク質分解シグナルには、限定されるものではないが、ユビキチン分解シグナルが含まれる。例えば、図２４Ｂ参照。
本発明の他の実施形態では、特定の標的／切断部位の上流に位置する、第７節に記載の阻害配列は、開始コドンと、その開始コドンの下流に、開始コドンと、また、前記対象外来性タンパク質をコードする配列と同じリーディングフレームにあるヌクレオチド配列を含むように設計されており、その結果、前記ヌクレオチド配列によりコードされているアミノ酸配列が目的タンパク質と融合された際に、対象タンパク質の生物学的機能が阻害される。例えば、図２４Ｃ参照。
本発明の別の実施形態では、特定の標的／切断部位の上流に位置する、第７節に記載の阻害配列は開始コドンを含み、対象外来性ＲＮＡはその開始コドンの下流に終止コドンを含み、その結果、前記終止コドンと前記開始コドンは同じリーディングフレームとなる。さらに、対象外来性ＲＮＡは、終止コドンの下流にイントロンをさらに含んでよく、その結果、前記対象外来性ＲＮＡは、対象外来性ＲＮＡを分解するナンセンス依存分解（ＮＭＤ）の標的となる。例えば、図２４Ｄ参照。
本発明の別の実施形態では、特定の標的／切断部位の上流に位置する、第７節に記載の阻害配列は、翻訳レプレッサータンパク質に結合し得る配列を含み、この場合、前記翻訳レプレッサータンパク質は内在性翻訳レプレッサータンパク質であるか、または本組成物からコードされ、前記翻訳レプレッサータンパク質は、対象外来性ＲＮＡ内の対象タンパク質の翻訳効率を直接的または間接的に低減する［２６］。翻訳レプレッサータンパク質に結合し得る配列には、例えば、限定されるものではないが、ｓｍａｕｇレプレッサータンパク質（５′−ＵＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＣＵＣＵＧＧＣＡＧＣＵＵＵＵＧＣＡＧＣＧ−３′）（配列番号２８）と結合する配列が含まれる［２７］。例えば、図２５Ａ参照。
本発明の他の実施形態では、特定の標的／切断部位の上流に位置する、第７節に記載の阻害配列は、細胞内局在（共翻訳移入を含む）のためのＲＮＡ局在化シグナルまたは内在性ｍｉＲＮＡ結合部位を含み、この場合、本発明の対象外来性ＲＮＡの細胞内局在は対象タンパク質の翻訳を阻害し、かつ、対象外来性ＲＮＡの半減期を短縮する。ＲＮＡ局在化シグナルは、例えば、限定されるものではないが、有髄末梢神経、ミトコンドリア、ミエリンコンパートメント、ラメラの先端または核周辺細胞質のＲＮＡ局在化シグナルであり得る［２４］。例えば、有髄末梢神経のＲＮＡ局在化シグナルは、５′−ＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＡＵＧ−３′（配列番号２９）または５′−ＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣ−３′（配列番号３０）である［２９］。例えば、図２５Ｂ参照。
本発明の別の実施形態では、特定の標的／切断部位の上流に位置する、第７節に記載の阻害配列は、対象外来性ＲＮＡの分解を刺激するＲＮＡ不安定化エレメントを含み、この場合、ＲＮＡ不安定化エレメントはＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）またはエンドヌクレアーゼ認識部位である。ＡＵリッチエレメントは、例えば、限定されるものではないが、少なくとも約３５ヌクレオチド長のＡＵリッチエレメントであり得る。ＡＵリッチエレメントは、例えば、限定されるものではないが、５′−ＡＵＵＵＡ−３′（配列番号３１）、５′−ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）−３′（配列番号３２）または５′−ＡＵＵＵ−３′（配列番号３３）であり得る［２８］。例えば、図２５Ｃ参照。
本発明の別の実施形態では、特定の標的／切断部位の上流に位置する、第７節に記載の阻害配列は、下流対象外来性タンパク質の翻訳効率を低減する二次構造を形成し得る配列を含む。本発明の一実施形態では、理論または機構に縛られるものではないが、前記実施形態に記載される二次構造の折畳みの自由エネルギーは、−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（例えば、−５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、−８０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であり得、従って、この二次構造は読み取りリボソームが前記下流対象外来性タンパク質の最初のコドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）に達しないよう遮断するために十分なものである。例えば、図２５Ｄ参照。
本発明のさらなる実施形態では、特定の標的／切断部位の上流に位置する、第７節に記載の阻害配列は、二次構造のために、特定の標的／切断部位のすぐ下流に位置するヌクレオチド配列に結合し得る、特定の標的／切断部位のすぐ上流にある配列を含み、この場合、この二次構造は、下流対象外来性タンパク質の翻訳効率を直接的または間接的に低減する。
いくつかの実施形態では、前記実施形態に記載される二次構造の折畳みの自由エネルギーは、−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（例えば、−５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、−８０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であり得、従って、この二次構造は読み取りリボソームが対象タンパク質の最初のコドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）に達しないよう遮断するために十分なものである。別の実施形態では、前記特定の標的／切断部位は、前記実施形態に記載される二次構造の一本鎖領域内またはループ領域内に位置し、この場合、一本鎖領域またはループ領域は、限定されるものではないが、少なくとも約１５ヌクレオチド長の領域を含む。別の実施形態では、前記実施形態に記載の対象外来性ＲＮＡは、特定の標的／切断部位の下流であって、かつ、対象タンパク質をコードする配列の上流に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含み、その結果、ＩＲＥＳ配列は完全な対象外来性ＲＮＡ内よりも切断された対象外来性ＲＮＡ内でより機能的となる。他の実施形態では、ＩＲＥＳ配列の少なくとも一部は、特定の標的／切断部位のすぐ下流に位置するヌクレオチド配列内に位置する。例えば、図２６参照。
いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳ配列には、例えば、限定されるものではないが、ピコルナウイルスＩＲＥＳ、口蹄疫ウイルスＩＲＥＳ、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ、Ａ型肝炎ＡウイルスＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルスＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳ、ブタ水疱病ウイルスＩＲＥＳ、カブモザイクウイルスＩＲＥＳ、ヒト線維芽細胞増殖因子２ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ペスチウイルスＩＲＥＳ、リーシュマニアＲＮＡウイルスＩＲＥＳ、モロニーマウス白血病ウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルス１４ ＩＲＥＳ、アフトウイルスＩＲＥＳ、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ショウジョウバエ・アンテナペディアｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒト線維芽細胞増殖因子２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｇ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、トマトウイルスＩＲＥＳ、血管内皮増殖因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コクサッキーＢ群ウイルスＩＲＥＳ、ｃ−ｍｙｃ原癌遺伝子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトＭＹＴ２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒト１型パレコウイルスＩＲＥＳ、ヒト２型パレコウイルスＩＲＥＳ、真核生物翻訳開始因子４ＧＩ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、チャバネアオカメムシ（Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ）腸管ウイルスＩＲＥＳ、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルスＩＲＥＳ、ウシエンテロウイルスＩＲＥＳ、コネキシン４３ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ホメオドメインタンパク質Ｇｔｘ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ＡＭＬ１転写因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ＮＦ−κＢ抑制因子ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｘ連鎖アポトーシス阻害剤ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コオロギ麻痺ウイルスＲＮＡ ＩＲＥＳ、ｐ５８（ＰＩＴＳＬＲＥ）タンパク質キナーゼｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、オルニチン脱炭酸酵素ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、コネキシン−３２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ウシウイルス性下痢症ウイルスＩＲＥＳ、インスリン様増殖因子Ｉ受容体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒト１型免疫不全ウイルスｇａｇ遺伝子ＩＲＥＳ、ブタコレラウイルスＩＲＥＳ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスＩＲＥＳ、ランダムなオリゴヌクレオチドのライブラリーから選択される短いＩＲＥＳ、ジェンブラナ病ウイルスＩＲＥＳ、アポトーシスタンパク質活性化因子１ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ムギクビレアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉ）ウイルスＩＲＥＳ、陽イオンアミノ酸輸送体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ヒトインスリン様増殖因子ＩＩリーダー２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ジアルジアウイルスＩＲＥＳ、Ｓｍａｄ５ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ブタテシオウイルス−１タルファンＩＲＥＳ、ショウジョウバエヘアレスｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、ｈＳＮＭ１ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、Ｃｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、エプスタイン−バーウイルスＩＲＥＳ、ハイビスカス退緑斑ウイルスＩＲＥＳ、ラット下垂体バソプレシンＶ１ｂ受容体ｍＲＮＡ ＩＲＥＳおよび／またはヒトｈｓｐ７０ ｍＲＮＡ ＩＲＥＳが含まれる。
７．１．２．５′末端において特定の標的／切断部位で切断された対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を高め得る付加的構造
この節では、第７節の実施形態に記載される本発明の組成物の構造のさらなる実施形態を記載するが、この場合、この付加的構造は切断された対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を高めることができ、切断された対象外来性ＲＮＡは、５′末端において特定の標的／切断部位で切断されている。
いくつかの実施形態では、第７節に記載の対象外来性ＲＮＡは、例えば、前記対象外来性タンパク質をコードする配列のすぐ上流に独特な内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含む配列を含んでよく、この場合、この独特なＩＲＥＳ配列は、切断された対象外来性ＲＮＡにおける対象タンパク質の翻訳効率を高める。例えば、図２７Ａ参照。
本発明の別の実施形態では、第７節に記載の対象外来性ＲＮＡは、対象タンパク質をコードする配列のすぐ下流に独特なヌクレオチド配列を含んでよく、この場合、この独特なヌクレオチド配列は独特なステムループ構造を含み、この独特なステムループ構造は、直接的または間接的に、対象タンパク質の翻訳効率を高め、かつ、切断された対象外来性ＲＮＡの半減期を延長する。独特なステムループ構造は、例えば、限定されるものではないが、ヒトヒストン遺伝子３′−ＵＴＲの保存されているステムループ構造またはその機能的誘導体であり得る。ヒトヒストン遺伝子３′−ＵＴＲの保存されているステムループ構造は、５′−ＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣ−３′（配列番号３４）である。例えば、図２７Ｂ参照。
本発明の別の実施形態では、第７節の特定の実施形態に記載の対象外来性ＲＮＡは、対象タンパク質をコードする配列からすぐ下流に独特なヌクレオチド配列を含んでよく、この場合、この独特なヌクレオチド配列は、直接的または間接的に、対象タンパク質の翻訳効率を高め、かつ、切断された対象外来性ＲＮＡの半減期を延長する細胞質ポリアデニル化エレメントを含む。この細胞質ポリアデニル化エレメントは、例えば、限定されるものではないが、５′−ＵＵＵＵＡＵ−３′（配列番号３５）、５′−ＵＵＵＵＵＡＵ−３′（配列番号３６）、５′−ＵＵＵＵＡＡＵ−３′（配列番号３７）、５′−ＵＵＵＵＵＵＡＵＵ−３′（配列番号３８）、５′−ＵＵＵＵＡＵＵ−３′（配列番号３９）または５′−ＵＵＵＵＵＡＵＡＡＡＧ−３′（配列番号４０）であり得る［２５］。いくつかの実施形態では、本発明の組成物はまた、例えば、任意の細胞でｈＣＰＥＢを発現させるための、ヒト細胞質ポリアデニル化エレメント結合タンパク質（ｈＣＰＥＢ）をコードするポリヌクレオチド配列、および／またはそのホモログも含み得る。例えば、図２７Ｃ参照。
本発明の別の実施形態では、第７節に記載の対象外来性ＲＮＡは、特定の標的／切断部位の下流であって、かつ、対象外来性タンパク質をコードする配列の上流に位置する独特なヌクレオチド配列を含み、この場合、この独特なヌクレオチド配列は対象タンパク質をコードする配列の下流に位置する配列と結合することができる。理論または機構に縛られるものではないが、このような実施形態では、切断された対象外来性ＲＮＡは、切断された対象外来性ＲＮＡにおける対象タンパク質の翻訳効率を高める環状構造を作り出し得る。例えば、図２７Ｄ参照。
本発明の別の実施形態では、第７節に記載の対象外来性ＲＮＡは、特定の標的／切断部位の下流であって、かつ、対象タンパク質をコードする配列の上流に位置する独特なヌクレオチド配列を含む。この独特なヌクレオチド配列は、切断された対象外来性ＲＮＡのポリ（Ａ）テールと直接的または間接的に結合し得る独特なポリペプチドに結合することができ、この独特なポリペプチドは本発明の組成物からコードされていてもよい。理論または機構に縛られるものではないが、このような実施形態では、独特なポリペプチドと切断された対象外来性ＲＮＡは、切断された対象外来性ＲＮＡにおける対象タンパク質の翻訳効率を高める環状構造を作り出し得る。例えば、図２８Ａ。
７．１．３．完全な対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を低減し得る付加的構造
この節では、第７節に記載される本発明の組成物の付加的構造のさらなる実施形態を記載するが、この場合、これらの付加的構造は、切断される前の本発明の対象外来性ＲＮＡ（すなわち、完全な対象外来性ＲＮＡ）の翻訳効率を低減し得る。
いくつかの実施形態では、第７節に記載の組成物は、阻害配列の上流に位置する位置での、本発明の対象外来性ＲＮＡの直接的または間接的切断を果たし得る特定の切断成分をさらに含んでよく、この阻害配列は、特定の標的／切断部位の上流に位置する。いくつかの実施形態では、この特定の切断成分は、
（ａ）対象外来性ＲＮＡ内に位置する特定の核酸配列（この場合、この特定の核酸配列は、例えば、限定されるものではないが、エンドヌクレアーゼ認識部位、内在性ｍｉＲＮＡ結合部位、シス作用リボザイムおよび／またはｍｉＲＮＡ配列であり得る）；または
（ｂ）本発明の組成物からコードされる特定の阻害ＲＮＡ（この場合、この特定の阻害ＲＮＡは、例えば、限定されるものではないが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、投げ輪型ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および／またはリボザイムであり得る）
を含み得る。
理論または機構に縛られるものではないが、このような実施形態では、特定の切断成分は、完全な対象外来性ＲＮＡにおける対象タンパク質の翻訳効率を低減するために、本発明の完全な対象外来性ＲＮＡからキャップ構造を除去し得る。例えば、図２８Ｂ参照。
いくつかの実施形態では、ｖｐｇ認識配列を導入してもよく、その結果、切断時に、５′切断末端がｖｐｇ認識配列を含む。このｖｐｇ認識配列にはＶＰＧタンパク質が結合することができ、それにより、ＣＡＰに取って代わることができる。ｖｐｇタンパク質は本発明の組成物によりコードされていてもよいし、または阻害配列の第１のＯＲＦによりコードされていてもよい。
いくつかの実施形態によれば、理論または機構に縛られるものではないが、シス作用リボザイムの使用は、それを含む対象外来性ＲＮＡがそれ自体切断可能となるので有利であり得る［２２］。シス作用リボザイムは、例えば、限定されるものではないが、シス作用ハンマーヘッドリボザイム、すなわち、スノルボザイム［２２］またはＮ１１７［２３］であり得る。
７．２．特定の標的／切断部位の下流に位置するその阻害配列を有する対象外来性ＲＮＡの構造
７．２．１．特定の標的／切断部位の下流に位置する阻害配列の構造
第７節の実施形態に記載の対象外来性ＲＮＡ内の阻害配列は、特定の標的／切断部位の上流または下流に位置することができる。いくつかの実施形態では、阻害配列は、対象外来性ＲＮＡ内の特定の標的／切断部位の下流に位置することができる。例えば、図２２Ｂ参照。
本発明の別の実施形態では、第７節に記載される特定の標的／切断部位の下流に位置する阻害配列は、例えば、限定されるものではないが、イントロンであり得る。この場合、対象外来性ＲＮＡは、対象外来性ＲＮＡを分解するナンセンス依存分解（ＮＭＤ）の標的となる［３１］。例えば、図２９Ａ参照。
本発明の他の実施形態では、特定の標的／切断部位の下流に位置する、第７節に記載の阻害配列は、翻訳レプレッサータンパク質に結合し得る配列を含み、この場合、この翻訳レプレッサータンパク質は内在性翻訳レプレッサータンパク質であるか、または本組成物からコードされ、この翻訳レプレッサータンパク質は、対象外来性ＲＮＡ内の対象タンパク質の翻訳効率を直接的または間接的に低減する［２６］。翻訳レプレッサータンパク質に結合し得る配列は、例えば、ｓｍａｕｇレプレッサータンパク質の結合配列（５′−ＵＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＣＵＣＵＧＧＣＡＧＣＵＵＵＵＧＣＡＧＣＧ−３′）（配列番号２８）であり得る［２７］。例えば、図２９Ｂ参照。
本発明の別の実施形態では、特定の標的／切断部位の下流に位置する、第７節に記載の阻害配列は、細胞内局在（共翻訳移入を含む）のためのＲＮＡ局在化シグナルまたは内在性ｍｉＲＮＡ結合部位を含み、この場合、本発明の対象外来性ＲＮＡの細胞内局在は、対象外来性タンパク質の翻訳を阻害し、かつ、対象外来性ＲＮＡの半減期を短縮する。ＲＮＡ局在化シグナルは、例えば、限定されるものではないが、有髄末梢神経、ミトコンドリア、ミエリンコンパートメント、ラメラの先端または核周辺細胞質のＲＮＡ局在化シグナルであり得る［２４］。ＲＮＡ局在化シグナルは、例えば、有髄末梢神経のＲＮＡ局在化シグナル５′−ＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＡＵＧ−３′（配列番号２９）または５′−ＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣ−３′（配列番号３０）であり得る［２９］。例えば、図２９Ｃ参照。
本発明の別の実施形態では、特定の標的／切断部位の下流に位置する、第７節に記載の阻害配列は、例えば、対象外来性ＲＮＡの分解を刺激するＲＮＡ不安定化エレメントであってよく、この場合、ＲＮＡ不安定化エレメントはＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）またはエンドヌクレアーゼ認識部位である。ＡＵリッチエレメントは、例えば、少なくとも約３５ヌクレオチド長のＡＵリッチエレメントであり得る。ＡＵリッチエレメントは、例えば、５′−ＡＵＵＵＡ−３′（配列番号３１）、５′−ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）−３′（配列番号３２）または５′−ＡＵＵＵ−３′（配列番号３３）であり得る［２８］。例えば、図２９Ｄ参照。
本発明の別の実施形態では、理論または機構に縛られるものではないが、特定の標的／切断部位の下流に位置する、第７節に記載の阻害配列は、上流対象タンパク質の翻訳効率を低減する二次構造を形成し得る配列を含む。例えば、図２９Ｅ参照。
本発明の別の実施形態では、特定の標的／切断部位の下流に位置する、第７節に記載の阻害配列は、二次構造を形成するために、特定の標的／切断部位のすぐ上流に位置するヌクレオチド配列に結合し得る、特定の標的／切断部位のすぐ下流にある配列を含み、この場合、この二次構造は、上流対象タンパク質の翻訳効率を直接的または間接的に低減する。いくつかの実施形態では、前記実施形態に記載される二次構造の折畳みの自由エネルギーは、−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（例えば、−５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、−８０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であり得、従って、この二次構造は読み取りリボソームが前記下流対象外来性タンパク質の終止コドンに達しないよう遮断するために十分なものである。別の実施形態では、前記特定の標的／切断部位は、前記実施形態に記載される二次構造の一本鎖領域内またはループ領域内に位置し、この場合、一本鎖領域またはループ領域は、例えば、限定されるものではないが、少なくとも約１５ヌクレオチド長の領域を含む。例えば、図３０Ａ参照。
７．２．２．３′末端において特定の標的／切断部位で切断された対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を高め得る付加的構造
この節では、第７節の種々の実施形態に記載される本発明の組成物の付加的構造のさらなる実施形態を記載するが、この場合、これらの付加的構造は切断された対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を高めることができ、切断された対象外来性ＲＮＡは、３′末端の特定の標的／切断部位で切断されている。
いくつかの実施形態によれば、第７節に記載の本発明の対象外来性ＲＮＡは、対象タンパク質をコードする配列のすぐ上流に独特な内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含む配列を含んでよく、この場合、この独特なＩＲＥＳ配列は、切断された対象外来性ＲＮＡにおける対象タンパク質の翻訳効率を高める。例えば、図３０Ｂ参照。
本発明の別の実施形態では、第７節に記載の対象外来性ＲＮＡは、対象タンパク質をコードする配列のすぐ下流に独特なヌクレオチド配列を含んでよく、この場合、この独特なヌクレオチド配列は独特なステムループ構造を含み、この独特なステムループ構造は、直接的または間接的に、対象タンパク質の翻訳効率を高め、かつ、切断された対象外来性ＲＮＡの半減期を延長する。独特なステムループ構造は、限定されるものではないが、ヒトヒストン遺伝子３′−ＵＴＲの保存されているステムループ構造またはその機能的誘導体などの構造を含み得る。例えば、ヒトヒストン遺伝子３′−ＵＴＲの保存されているステムループ構造は、５′−ＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣ−３′（配列番号３４）である。例えば、図３０Ｃ参照。
別の実施形態では、第７節に記載の対象外来性ＲＮＡは、対象タンパク質をコードする配列のすぐ下流に独特なヌクレオチド配列を含んでよく、この場合、この独特なヌクレオチド配列は、直接的または間接的に、対象タンパク質の翻訳効率を高め、かつ、切断された対象外来性ＲＮＡの半減期を延長することができる細胞質ポリアデニル化エレメントを含む。この細胞質ポリアデニル化エレメントは、限定されるものではないが、５′−ＵＵＵＵＡＵ−３′（配列番号３５）、５′−ＵＵＵＵＵＡＵ−３′（配列番号３６）、５′−ＵＵＵＵＡＡＵ−３′（配列番号３７）、５′−ＵＵＵＵＵＵＡＵＵ−３′（配列番号３８）、５′−ＵＵＵＵＡＵＵ−３′（配列番号３９）または５′−ＵＵＵＵＵＡＵＡＡＡＧ−３′（配列番号４０）などのエレメントから選択され得る［２５］。本発明の組成物はまた、例えば、任意の細胞でｈＣＰＥＢを発現させるための、ヒト細胞質ポリアデニル化エレメント結合タンパク質（ｈＣＰＥＢ）をコードするポリヌクレオチド配列、またはそのホモログも含み得る。例えば、図３０Ｄ参照。
本発明のさらなる実施形態では、第７節に記載の対象外来性ＲＮＡは、特定の標的／切断部位の上流であって、かつ、対象タンパク質をコードする配列の下流に位置する独特なヌクレオチド配列を含んでよく、この場合、この独特なヌクレオチド配列は、対象タンパク質をコードする配列の上流に位置する配列に結合し得る。このような実施形態では、理論または機構に縛られるものではないが、切断された対象外来性ＲＮＡは、切断された対象外来性ＲＮＡにおける対象タンパク質の翻訳効率を高め得る環状構造を作り出し得る。例えば、図３１Ａ参照。
本発明の別の実施形態では、第７節に記載の対象外来性ＲＮＡは、特定の標的／切断部位の上流であって、かつ、対象タンパク質をコードする配列の下流に位置する独特なヌクレオチド配列を含んでよく、この独特なヌクレオチド配列は、切断された対象外来性ＲＮＡのキャップ構造と直接的または間接的に結合し得る独特なポリペプチドに結合することができ、この独特なポリペプチドは本発明の組成物からコードされる。この実施形態では、理論または機構に縛られるものではないが、この独特なポリペプチドと切断された対象外来性ＲＮＡは、切断された対象外来性ＲＮＡにおける対象タンパク質の翻訳効率を高め得る環状構造を作り出し得る。例えば、図３１Ｂ参照。
別の実施形態では、第７節に記載の本発明の組成物は、特定の標的／切断部位の上流であって、かつ、対象タンパク質をコードする配列の下流に位置する配列に結合し得るヌクレオチド配列を３′末端に含む付加的ＲＮＡ分子をコードし得る付加的ポリヌクレオチド配列を含んでよく、この場合、この付加的ポリヌクレオチド配列の発現は、ポリメラーゼＩＩに基づくプロモーターにより駆動される。このような実施形態では、理論または機構に縛られるものではないが、付加的ＲＮＡ分子は切断された対象外来性ＲＮＡに結合することができ、切断された対象外来性ＲＮＡにおける対象外来性タンパク質の翻訳効率を高め得るポリＡを提供する。例えば、図３１Ｃ参照。
７．２．３．完全な対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を低減し得る付加的構造
この節では、第７節の実施形態に記載される本発明の組成物の付加的構造のさらなる実施形態を記載するが、これらの付加的構造は、切断される前の本発明の対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を低減する。
本発明のいくつかの実施形態では、第７節に記載の組成物は、阻害配列の下流の位置する位置での、本発明の実施形態の対象外来性ＲＮＡの直接的または間接的切断を果たし得る特定の切断成分を含んでよく、この阻害配列は特定の標的／切断部位の下流に位置する。この特定の切断成分は、
（ａ）対象外来性ＲＮＡ内に位置する特定の核酸配列（この場合、この特定の核酸配列は、例えば、エンドヌクレアーゼ認識部位、内在性ｍｉＲＮＡ結合部位、シス作用リボザイム、ｍｉＲＮＡ配列などであり得る）；または
（ｂ）本発明の組成物からコードされる特定の阻害ＲＮＡ（この場合、この特定の阻害ＲＮＡは、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、投げ輪型ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはリボザイムであり得る）
である。
この実施形態では、理論または機構に縛られるものではないが、この特定の切断成分は、本発明の完全な対象外来性ＲＮＡからポリＡを除去することができ、従って、完全な対象外来性ＲＮＡにおける対象タンパク質の翻訳効率を低減し得る。例えば、図３１Ｄ参照。
いくつかの実施形態では、理論または機構に縛られるものではないが、シス作用リボザイムの使用は、それを含む対象外来性ＲＮＡがそれ自体切断可能となるので有利であり得る［２２］。シス作用リボザイムは、例えば、シス作用ハンマーヘッドリボザイム、すなわち、スノルボザイム［２２］またはＮ１１７［２３］であり得る。
８．本発明の例示的実施形態の詳細な説明
以下に詳細に示すように、いくつかの実施形態によれば、対象外来性タンパク質は、Ｒｉｓｃ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ））機構の関与無く、細胞内の内在性シグナルＲＮＡの存在に応答して発現され得る。
いくつかの特定の実施形態によれば、細胞内の内在性シグナルＲＮＡの存在に応答して対象外来性タンパク質を発現するための、下記組成物が提供され、前記対象外来性タンパク質は本組成物からコードされ、内在性シグナルＲＮＡは所定シグナル配列を含むＲＮＡ分子であり、前記所定シグナル配列は少なくとも１８ヌクレオチド長の所定の配列であり、本組成物は、１以上のポリヌクレオチド分子、例えば、
（ａ）所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの直接的または間接的切断を果たし得る機能的ＲＮＡをコードする１以上のポリヌクレオチド配列（この場合、前記所定切断部位は所定シグナル配列の３′末端である）；および
（ｂ）対象外来性ＲＮＡ分子、すなわち、
（１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある第１の配列（前記エッジ配列は、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド上流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延び、この場合、前記第１の配列は１以上の開始コドンを含み、各開始コドンは５′−ＡＵＧ−３′から本質的になる）；および
（２）前記第１の配列の上流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；
（３）前記第１の配列の下流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
から本質的になるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列
を含むＤＮＡ分子を含んでよく、
この場合、前記対象外来性ＲＮＡ分子は、対象外来性ＲＮＡ分子の５′末端の少なくとも２１ヌクレオチド下流に、対象外来性タンパク質をコードする配列を含み；内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に本組成物を導入した後には、機能的ＲＮＡは所定シグナル配列の３′末端での内在性シグナルＲＮＡの直接的または間接的切断を果たす。これにより、前記対象外来性ＲＮＡ分子は切断された内在性シグナルＲＮＡのエッジ配列とハイブリダイズし、所定シグナル配列に、対象外来性ＲＮＡ分子を切断し得るダイサープロセシングを指示し、それにより、各開始コドンが対象外来性タンパク質をコードする配列から分離され、対象外来性タンパク質が発現され得る。例えば、図３３参照。
本発明のいくつかの実施形態では、前記エッジ配列は２５〜３０ヌクレオチド長であり、所定切断部位の２ヌクレオチド上流に位置し、かつ、内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延び、この場合、例えば図３３に示されているものなど、第２の配列は０ヌクレオチド長である。
本発明の別の実施形態では、開始コドンのうちの少なくとも１つが、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、例えば図３４に示されているＫｏｚａｋコンセンサス配列５′−ＡＣＣＡＵＧＧ−３′（配列番号２５）内に位置する。
本発明のさらなる実施形態では、各開始コドンは対象外来性ＲＮＡ分子の５′末端の０〜２１ヌクレオチド下流に位置し、この場合、各開始コドンと前記対象外来性タンパク質をコードする配列は同じリーディングフレームにない。本発明のさらなる実施形態では、上記開始コドンのうちの少なくとも１つは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列５′−ＡＣＣＡＵＧＧ−３′（配列番号２５）内に位置する。
いくつかの実施形態では、機能的ＲＮＡは、例えば、限定されるものではないが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、投げ輪型ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボザイム、またはそれらの組合せであり得る。
いくつかの例示的実施形態では、機能的ＲＮＡは、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であってよく、この場合、ｍｉＲＮＡと対象外来性ＲＮＡ分子は同じＲＮＡ分子に位置しても異なるＲＮＡ分子に位置してもよい。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、例えば図３４に示されているように、対象外来性ＲＮＡ分子の第２の配列の上流に位置し得る。
いくつかの実施形態によれば、理論または機構に縛られるものではないが、前記実施形態は、このような実施形態では対象外来性ＲＮＡ分子からキャップ構造が除去されてもよく、また、この実施形態では本組成物はＲＮＡ分子を１つだけコードするので、有利であり得る。
別の例示的実施形態では、機能的ＲＮＡは、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であってよく、この場合、ｓｉＲＮＡの一方のＲＮＡ鎖が対象外来性ＲＮＡ分子の５′末端に位置し、ｓｉＲＮＡの他方の鎖が本組成物から例えばポリメラーゼＩまたはポリメラーゼＩＩＩに基づくプロモーターにより転写され、この場合、細胞に本組成物を導入した後には、ｓｉＲＮＡ鎖の双方がハイブリダイズし、例えばダイサーにより、対象外来性ＲＮＡ分子から分離される。これは例えば図３５に示されている。
いくつかの実施形態によれば、理論または機構に縛られるものではないが、前記実施形態は、このような実施形態では機能的ＲＮＡと対象外来性ＲＮＡ分子が同じＲＮＡ二本鎖に位置し、従って、対象外来性ＲＮＡ分子が機能的ＲＮＡを内在性シグナルＲＮＡの所定シグナル配列と近接させ、これにより、ＲＮＡ干渉経路の成分（例えば、ダイサー）も所定シグナル配列と近接させるので有利であり得る。もう１つの利点としては、ダイサーにより対象外来性ＲＮＡ分子からキャップ構造が除去されるということを含む。
本発明の別の実施形態では、対象外来性ＲＮＡ分子は、対象タンパク質をコードする配列の上流であって、かつ、各開始コドンの下流に位置するヌクレオチド配列をさらに含んでよく、この場合、このヌクレオチド配列は、所定シグナル配列と、または対象外来性ＲＮＡ分子の５′末端に位置する配列と十分な相補性があり、標的特異的ＲＮＡ干渉を指示することができる。例えば、ダイサープロセシングの後に起こるＲｉｓｃプロセシングを使用して、より多くの対象外来性ＲＮＡ分子分子を活性化させることができる。
本発明の別の実施形態では、本組成物は、第２の配列の上流の対象外来性ＲＮＡ分子の直接的または間接的切断を果たし得る機能的核酸をコードする１以上のポリヌクレオチド配列をさらに含み、この場合、前記機能的核酸は、
（ａ）対象外来性ＲＮＡ分子内に位置する特異的核酸配列（この場合、前記特異的核酸配列は、エンドヌクレアーゼ認識部位、内在性ｍｉＲＮＡ結合部位、シス作用リボザイムまたはｍｉＲＮＡ配列である）；または
（ｂ）ＤＮＡ分子からコードされる阻害ＲＮＡ（この場合、前記阻害ＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、投げ輪型ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはリボザイムである）
である。
この実施形態では、機能的核酸は、非切断（完全な）対象外来性ＲＮＡからの対象外来性タンパク質の翻訳効率を低減するために、完全な対象外来性ＲＮＡからキャップ構造を除去し得る。例えば、図３６Ａ参照。
別の実施形態では、上記の第３の配列は、対象タンパク質をコードする配列の上流にヌクレオチド配列を含み、この場合、前記ヌクレオチド配列は、対象タンパク質をコードする配列の下流に位置する配列に結合し得る。この実施形態では、切断された対象外来性ＲＮＡ分子は、切断された対象外来性ＲＮＡ分子における対象タンパク質の翻訳効率を高め得る環状構造を作り出す。例えば、図３６Ｂ参照。
本発明の別の実施形態では、上記のポリヌクレオチド分子はともに、付加的切断部位での内在性シグナルＲＮＡの直接的または間接的切断を果たし得る付加的機能的ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、この場合、前記付加的切断部位は、所定シグナル配列の５′末端の０〜１０００ヌクレオチド上流に位置する。例えば、図２１Ｂ参照。別の実施形態では、前記実施形態に記載の付加的切断部位は、所定シグナル配列の５′末端の０〜５ヌクレオチド上流に位置する。例えば、図２１Ｂ参照。
９．本発明のさらなる実施形態の説明
この節では、内在性シグナルＲＮＡを切断することなく、細胞内の内在性シグナルＲＮＡの存在に応答して対象外来性ＲＮＡの切断に向かわせる本発明のさらなる実施形態を記載する。このような実施形態は、例えばウイルス起源の内在性シグナルＲＮＡに有用であり得る。
いくつかの実施形態によれば、細胞内の内在性シグナルＲＮＡの存在に応答して対象外来性ＲＮＡを切断するための、下記組成物が提供され、前記対象外来性ＲＮＡは本組成物からコードされ、前記内在性シグナルＲＮＡは、５′末端に所定シグナル配列を含むＲＮＡ分子であり、前記所定シグナル配列は、１８〜２５ヌクレオチド長の所定の配列であり、本組成物は、
（ａ）対象外来性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列（この場合、前記対象外来性ＲＮＡは、例えば標的特異的ＲＮＡ干渉を指示するために所定シグナル配列と十分な相補性がある特定の配列を含むＲＮＡ配列である）；
（ｂ）キャリアＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列（この場合、キャリアＲＡＮ配列のポリヌクレオチド配列の発現は、ポリメラーゼＩに基づくプロモーターおよびポリメラーゼＩＩＩに基づくプロモーターからなる群から選択されるプロモーターにより駆動され、前記キャリアＲＮＡは少なくとも約１８ヌクレオチド長のＲＮＡ分子であって、かつ、前記ＲＮＡ分子は、
（１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド下流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の下流に延びる）；
（２）前記第１の配列の下流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；
（３）前記第１の配列の上流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
から本質的になる）
を含む１以上のポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子）を含み；
これにより、内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に本組成物を導入した後には、キャリアＲＮＡはエッジ配列とハイブリダイズし、所定シグナル配列のプロセシングを指示し、次に、プロセシングされた所定シグナル配列は、特定の配列内に位置する特定の標的（切断部位）での対象外来性ＲＮＡの切断を指示し得る。例えば、図３７Ａ参照。
さらなる実施形態では、細胞内の内在性シグナルＲＮＡの存在に応答して対象外来性ＲＮＡを切断するための、下記組成物が提供され、前記対象外来性ＲＮＡは本組成物からコードされ、前記内在性シグナルＲＮＡは、５′末端に所定シグナル配列を含むＲＮＡ分子であり、前記シグナル配列は、１８〜２５ヌクレオチド長の所定配列であり、本組成物は１以上のポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）を含み、前記ポリヌクレオチド分子はともに、
（ａ）対象外来性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列（この場合、前記対象外来性ＲＮＡは、例えば標的特異的ＲＮＡ干渉による切断を指示するために所定シグナル配列と十分な相補性がある特定の配列を含むＲＮＡ配列である）；
（ｂ）少なくとも約１８ヌクレオチド長のキャリア配列を含むＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド配列（前記キャリア配列は、
（１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記内在性シグナルＲＮＡの５′末端から０〜５ヌクレオチド下流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の下流に延びる）；
（２）前記第１の配列の下流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；
（３）前記第１の配列の上流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
から本質的になる）；
（ｃ）キャリア切断部位でのキャリアＲＮＡ配列の直接的または間接的切断を果たし得る機能的核酸をコードする１以上のポリヌクレオチド配列（この場合、前記キャリア切断部位はキャリア配列の３′末端である）
を含み；
これにより、内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に本組成物を導入した後には、機能的核酸はキャリア配列の３′末端でのキャリアＲＮＡ配列の直接的または間接的切断を果たし、次に、切断されたキャリア配列はエッジ配列とハイブリダイズし、所定シグナル配列のプロセシングを指示し、次に、プロセシングされた所定シグナル配列は、特定の配列内に位置する特定の切断／標的部位での対象外来性ＲＮＡの切断を指示する。例えば、図３７Ｂ参照。
本発明のいくつかの実施形態では、上記のエッジ配列は２３〜２９ヌクレオチド長であり、内在性シグナルＲＮＡの５′末端から約２３〜２９ヌクレオチド下流までに位置してよく、この場合、第２の配列は２ヌクレオチド長であってよく、第３の配列は０ヌクレオチド長であってよい。例えば、図３７Ａ、３７Ｂ参照。
さらなる実施形態では、細胞内の内在性シグナルＲＮＡの存在に応答して対象外来性ＲＮＡを切断するための、下記組成物が提供され、前記対象外来性ＲＮＡは本組成物からコードされ、前記内在性シグナルＲＮＡは、３′末端に所定シグナル配列を含むＲＮＡ分子であり、前記所定シグナル配列は、１８〜２５ヌクレオチド長のランダム配列であり、本組成物は、１以上のポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）を含み、前記ポリヌクレオチド分子はともに、
（ａ）対象外来性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列（この場合、前記対象外来性ＲＮＡは、例えば標的特異的ＲＮＡ干渉による切断を指示するために所定シグナル配列と十分な相補性がある特定の配列を含むＲＮＡ配列である）；
（ｂ）キャリアＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列（この場合、キャリアＲＡＮの発現は、ポリメラーゼＩに基づくプロモーターおよびポリメラーゼＩＩＩに基づくプロモーターからなる群から選択されるプロモーターにより駆動され、前記キャリアＲＮＡは少なくとも約１８ヌクレオチド長のＲＮＡ分子であって、かつ、前記ＲＮＡ分子は、
（１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記内在性シグナルＲＮＡの３′末端から０〜５ヌクレオチド上流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延びる）；
（２）前記第１の配列の上流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；
（３）前記第１の配列の下流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
から本質的になる）
を含み；
これにより、内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に本組成物を導入した後には、キャリアＲＮＡはエッジ配列とハイブリダイズし、所定シグナル配列のプロセシングを指示し、次に、プロセシングされた所定シグナル配列は、特定の配列内に位置する特定の切断／標的部位での対象外来性ＲＮＡの切断を指示する。例えば、図３８Ａ参照。
さらなる実施形態によれば、細胞内の内在性シグナルＲＮＡの存在に応答して対象外来性ＲＮＡを切断するための下記組成物が提供され、前記対象外来性ＲＮＡは本組成物からコードされ、前記内在性シグナルＲＮＡは、３′末端に所定シグナル配列を含むＲＮＡ分子であり、前記所定シグナル配列は、１８〜２５ヌクレオチド長のランダム／所定配列であり、本組成物は、１以上のポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）を含み、前記ポリヌクレオチド分子はともに、
（ａ）対象外来性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列（この場合、前記対象外来性ＲＮＡは、例えば標的特異的ＲＮＡ干渉による切断を指示するために所定シグナル配列と十分な相補性がある特定の配列を含むＲＮＡ配列である）；
（ｂ）少なくとも約１８ヌクレオチド長のキャリア配列を含むＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド配列（前記キャリア配列は、
（１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記内在性シグナルＲＮＡの３′末端から０〜５ヌクレオチド上流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延びる）；
（２）前記第１の配列の上流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；
（３）前記第１の配列の下流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
から本質的になる）；
（ｃ）キャリア切断部位でのキャリアＲＮＡ配列の直接的または間接的切断を果たし得る機能的核酸をコードする１以上のポリヌクレオチド配列（この場合、前記キャリア切断部位はキャリア配列の５′末端である）
を含み；
これにより、内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に本組成物を導入した後には、機能的核酸はキャリア配列の５′末端でのキャリアＲＮＡ配列の直接的または間接的切断を果たし、次に、切断されたキャリア配列はエッジ配列とハイブリダイズし、所定シグナル配列のプロセシングを指示し、次に、プロセシングされた所定シグナル配列は、特定の配列内に位置する特定の切断／標的部位での対象外来性ＲＮＡの切断を指示する。例えば、図３８Ｂ参照。
いくつかの例示的実施形態によれば、上記のエッジ配列は約２５〜３０ヌクレオチド長であり、内在性シグナルＲＮＡの３′末端から２ヌクレオチド上流に位置し、かつ、内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延びてよく、この場合、第２の配列は０ヌクレオチド長であってよく、第３の配列は０ヌクレオチド長であってよい。例えば、図３８Ａ、３８Ｂ参照。
いくつかの実施形態によれば、上記の機能的核酸は、
（ａ）キャリアＲＮＡ配列内に位置する特異的核酸配列（この場合、前記特異的核酸配列は、例えば、エンドヌクレアーゼ認識部位、内在性ｍｉＲＮＡ結合部位、シス作用リボザイム、ｍｉＲＮＡ配列など、またはそれらの組合せである）；または
（ｂ）前記ポリヌクレオチド分子からコードされる阻害ＲＮＡ（この場合、前記阻害ＲＮＡは、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、投げ輪型ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボザイムなど、またはそれらの組合せである）
である。例えば、図３７Ｂ、３８Ｂ参照。
いくつかの実施形態によれば、上記の対象外来性ＲＮＡは、第３の配列に位置する。
さらなる実施形態によれば、上記の対象外来性ＲＮＡは、
（ａ）対象外来性タンパク質をコードする配列；および
（ｂ）対象外来性タンパク質の発現を阻害し得る阻害配列
をさらに含んでよく；
この場合、特定の標的／切断部位は阻害配列と対象タンパク質をコードする配列の間に位置し、これにより、内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に本組成物を導入した後には、対象外来性ＲＮＡが転写され、特定の標的／切断部位で切断され、その結果、阻害配列が対象タンパク質をコードする配列から分離され、対象タンパク質が発現され得る。
別の実施形態では、上記の阻害配列は特定の標的／切断部位の上流に位置してよく、この場合、阻害配列は複数の開始コドンを含み、この場合、各開始コドンと対象外来性タンパク質をコードする配列は同じリーディングフレームになく、各開始コドンは５′−ＡＵＧ−３′から本質的になり、これらの開始コドンのうちの少なくとも１つがＫｏｚａｋ配列内に位置する。
１０．本発明のさらなる実施形態
この節では、前記節のいずれかにおける前記実施形態のいずれかに記載の本発明の組成物のさらなる実施形態を定義および記載する。
内在性シグナルＲＮＡは、例えば、限定されるものではないが、所定シグナル配列を含む、ウイルスＲＮＡ、例えばｍＲＮＡなどの細胞ＲＮＡなどであってよい。所定シグナル配列は、例えば、新生細胞に独特なシグナル配列、ウイルス由来のシグナル配列など、またはそれらの組合せであり得る。いくつかの実施形態では、所定シグナル配列は、細胞内でＲＮＡ分子の切断を指示または果たし得る他の任意のタイプの内在性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、ｓｔＲＮＡなど）は含まない。
いくつかの実施形態によれば、本発明の実施形態において使用可能な細胞は、例えば、限定されるものではないが、哺乳動物細胞、鳥類細胞、植物細胞、ヒト細胞、動物細胞などのいずれの起源に由来するいずれのタイプの細胞であってもよい。この細胞は培養細胞（初代細胞もしくは細胞株）、または生物もしくは植物内に存在する任意の細胞であり得る。
いくつかの実施形態によれば、理論または機構に縛られるものではないが、キャリアＲＮＡ／配列が切断された内在性シグナルＲＮＡとハイブリダイズした際に形成される二本鎖（例えば、第１節に記載されているものなど）は、ダイサーの基質となり得る。
いくつかの実施形態では、第１節の実施形態に記載のエッジ配列は２３〜２８ヌクレオチド長であり、所定切断部位から約２３〜２８ヌクレオチド下流までに位置し、この場合、第２の配列は２ヌクレオチド長であり、第３の配列は０ヌクレオチド長である。
別の実施形態では、第１節の実施形態に記載のエッジ配列は２５〜３０ヌクレオチド長であり、所定切断部位から２ヌクレオチド上流に位置し、かつ、内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延び、この場合、第２の配列は０ヌクレオチド長であり、第３の配列は０ヌクレオチド長である。
さらなる実施形態では、上記第１節または第９節に記載のキャリアＲＮＡまたはキャリア配列は、所定シグナル配列が例えばダイサーによって切断された際に形成される二本鎖が、所定シグナル配列の３′末端よりも所定シグナル配列の５′末端が熱力学的に弱くなるように設計することができる。その結果、Ｒｉｓｃにロードされる鎖は、所定シグナル配列を含む鎖である。
「十分な相補性」とは、限定されるものではないが、結合することができる、または少なくとも部分的に相補的である場合を含み得る。いくつかの実施形態では、十分な相補性とは、約３０〜１００％の範囲である。例えば、いくつかの実施形態では、十分な相補性とは、少なくとも約３０％の相補性である。例えば、いくつかの実施形態では、十分な相補性とは、少なくとも約５０％の相補性である。例えば、いくつかの実施形態では、十分な相補性とは、少なくとも約７０％の相補性である。例えば、いくつかの実施形態では、十分な相補性とは、少なくとも約９０％の相補性である。例えば、いくつかの実施形態では、十分な相補性とは、約１００％の相補性である。
本発明の一実施形態では、第１節に記載のキャリアＲＮＡポリヌクレオチド配列の発現は、ポリメラーゼＩに基づくプロモーターまたはポリメラーゼＩＩＩに基づくにより駆動され得る。いくつかの実施形態では、第１節に記載のキャリアＲＮＡポリヌクレオチド配列の発現は、限定されるものではないが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ ５Ｓプロモーター、Ｕ６プロモーター、アデノウイルスＶＡ１プロモーター、Ｖａｕｌｔプロモーター、Ｈ１プロモーター、テロメラーゼＲＮＡまたはｔＲＮＡ遺伝子プロモーターまたはそれらの機能的誘導体であり得るプロモーターにより駆動され得る。
第７節、第８節または第９節のいずれかに記載の対象外来性タンパク質は、いずれのタイプのタンパク質またはペプチドであってもよい。いくつかの実施形態では、対象外来性タンパク質は、例えば、限定されるものではないが、アルファトキシン、サポリン、トウモロコシＲＩＰ（ｍａｉｚｅ ＲＩＰ）、オオムギＲＩＰ、コムギＲＩＰ、トウモロコシＲＩＰ（ｃｏｒｎ ＲＩＰ）、ライムギＲＩＰ、アマＲＩＰ、志賀毒素、志賀毒素様ＲＩＰ、モモルジン、ブタクサ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、シュードモナス外毒素、シュードモナス外毒素Ａまたはそれらの改変形態であり得る。いくつかの実施形態では、対象外来性タンパク質は、例えば、限定されるものではないが、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素フラグメントＡまたはそれらの改変形態であり得る。対象外来性タンパク質は、例えば、限定されるものではないが、酵素（例えば、ルシフェラーゼ）、蛍光タンパク質、構造タンパク質などであってもよい。
本発明のいくつかの実施形態では、対象外来性タンパク質は、隣接細胞にも影響を及ぼし得る毒素であり得る。この毒素は、例えば、限定されるものではないが、完全な形態のリシン、アブリン、ジフテリア毒素またはそれらの改変形態であり得る。本発明の別の実施形態では、対象外来性タンパク質は、その産物が隣接細胞も死滅させ得る酵素であってもよい。このような酵素は、例えば、限定されるものではないが、ＨＳＶ１チミジンキナーゼ（この場合、本発明の組成物は、プロドラッグとしてのガンシクロビルをさらに含む）；または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（この場合、本発明の組成物は、プロドラッグとしての５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）をさらに含む）であり得る。
本発明の別の実施形態では、第７節、第８節または第９節のいずれかに記載の対象外来性ＲＮＡまたは中間体ＲＮＡはウイルスベクターからコードされ、対象外来性タンパク質は、ウイルスベクターの複製に必要な遺伝子の産物であり、この場合、ウイルスベクターは細胞内の内在性シグナルＲＮＡの存在に応答して複製し、その複製の過程で細胞を死滅させる。このウイルスベクターはまた、例えば、限定されるものではないが、細胞内に特定の分子（例えば、ＴｅｔＲ−ＶＰ１６／ドキシサイクリン）が存在する場合にウイルスベクターの複製を停止することができる遺伝子であってもよい。従って、ウイルスベクターが、内在性シグナルＲＮＡを含まない細胞で複製するのに十分な突然変異を蓄積していると思われる場合には、その体内での全てのウイルスベクターの複製を停止させるために特定の分子を投与することができ、次に、身体の細胞のウイルスベクターの大部分が分解した後に、新たなウイルスベクターを再び投与することができる。このウイルスベクターはまた、特定のプロドラッグ（例えば、チミジンキナーゼ／ガンシクロビル）が存在する場合に細胞を死滅させ得る遺伝子も含んでよく、ウイルスベクターが、内在性シグナルＲＮＡを含まない細胞で複製するのに十分な突然変異を蓄積していると思われる場合に、その体内の全てのウイルスベクターを死滅させるために特定のプロドラッグを投与することができ、その後、新たなウイルスベクターを再び投与することができる。
別の実施形態では、本発明の組成物からコードされるＲＮＡ分子は、複製の過程で細胞を死滅させることができる方法で複製され得るウイルスベクターからコードされる。この場合、所定シグナル配列は例えば癌細胞には存在せず、特定の患者の身体のほとんどの健康な細胞または非転移性の腫瘍形成細胞に存在し、第７節、第８節または第９節のいずれかに記載の対象外来性タンパク質は、例えば、限定されるものではないが、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素フラグメントＡまたはそれらの改変形態であり得る毒素である。この場合、ウイルスベクターは、健康な細胞または非転移性の腫瘍形成細胞に入るとその細胞を死滅させ、ウイルスベクターが癌細胞に入ると、ウイルスベクターの複製の過程で癌細胞を死滅させるので、高濃度のウイルスベクターが身体の癌領域に存在する。このウイルスベクターはまた、例えば、特定の分子（例えば、ＴｅｔＲ−ＶＰ１６／ドキシサイクリン）が細胞に存在する場合にウイルスベクターの複製を停止することができる遺伝子を含んでもよい。この場合、ウイルスベクターが、内在性シグナルＲＮＡを含まない細胞で複製するのに十分な突然変異を獲得していると思われる場合には、その体内での全てのウイルスベクターの複製を停止させるために特定の分子を投与することができ、次に、身体の細胞のウイルスベクターの大部分が分解した後に、新たなウイルスベクターを再び投与することができる。このウイルスベクターはまた、特定のプロドラッグ（例えば、チミジンキナーゼ／ガンシクロビル）が存在する場合に、例えば、細胞を死滅させ得る遺伝子も含んでよく、ウイルスベクターが、内在性シグナルＲＮＡを含まない細胞で複製するのに十分な突然変異を獲得していると思われる場合に、その体内の全てのウイルスベクターを死滅させるために特定のプロドラッグを投与することができ、その後、新たなウイルスベクターを再び投与することができる。
本発明の別の実施形態では、第１節または第９節に記載の対象外来性ＲＮＡ内に位置する特定の配列は複数の特定の配列であり、特定の標的／切断部位は複数の特定の標的／切断部位である。この場合、第７節に記載の対象外来性ＲＮＡに関して前記「特定の切断部位の上流」には、これら全ての切断部位の上流も含み、前記「切断部位の下流」には、これら全ての特定の切断部位の下流も含む。例えば、図３２Ａ、３２Ｂ参照。
別の実施形態では、第１節または第９節に記載の対象外来性ＲＮＡ内に位置する特定の配列は１以上の特定の配列であり、特定の標的／切断部位は１以上の特定の標的／切断部位であり、対象外来性ＲＮＡは、特定の標的／切断部位の下流の対象外来性タンパク質をコードする配列、１以上の独特な配列（この場合、各独特な配列は標的特異的ＲＮＡ干渉を指示するために所定シグナル配列と十分な相補性があり、各独特な配列は対象外来性タンパク質をコードする配列の下流に位置する）、および２つの阻害配列（一方は対象外来性ＲＮＡの５′末端にあり、他方は対象外来性ＲＮＡの３′末端にあり、各阻害配列は対象外来性タンパク質の発現を阻害し得る）をさらに含む。従って、細胞内に内在性シグナルＲＮＡが存在する場合には、これらの２つの阻害配列は対象外来性タンパク質をコードする配列から分離され、対象外来性タンパク質が発現され得る。例えば、図３２Ｃ参照。
本発明の別の実施形態では、第１節、第８節または第９節のいずれかに記載の組成物のポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）は、ダイサーをコードするポリヌクレオチド配列、またはそのホモログをさらに含んでもよい。
本発明の別の実施形態では、第１節または第９節に記載の組成物のポリヌクレオチド分子はともに、１以上のＲＩＳＣ成分をコードするポリヌクレオチド配列、またはそのホモログをさらに含む。
本発明の別の実施形態では、第１節、第８節または第９節のいずれかに記載の組成物のポリヌクレオチド分子は、所定シグナル配列において内在性シグナルＲＮＡの二次構造を解くことができる１以上のＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでよく。
本発明の別の実施形態では、第１節、第８節または第９節のいずれかに記載の組成物のポリヌクレオチド分子は、内在性エキソヌクレアーゼの直接的または間接的発現を阻害し得る特定の機能的ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでよい。特定の機能的ＲＮＡは、例えば、限定されるものではないが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、投げ輪型ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはリボザイムであり得る。
上記実施形態のいずれかに記載の阻害配列は、対象外来性タンパク質をコードする配列から分離された際に、対象外来性タンパク質が発現され得る、かつ、対象外来性タンパク質をコードする配列から分離されていない際には、それが対象外来性ＲＮＡ内で特定の配置関係にある限り、対象外来性タンパク質の発現を阻害し得る配列または配列の一部であり得る。この場合、阻害配列はまた、その特定の配置関係にある上記阻害配列のいずれかの一部だけであってもよい。例えば、リーディングフレーム５′−ＡＵＧ−３′の外側の阻害配列の代わりに、阻害配列はまた、−−ＵＧ−３′または−−Ｇ−３′の構成のそれぞれＡ部分または５′−ＡＵ−３′部分だけであってもよい（言い換えれば、対象外来性ＲＮＡは、５′末端にリーディングフレーム５′−ＡＵＧ−３′の外側を含むが、分離される配列は５′−ＡＵ−３′部分のみである）。
別の実施形態では、第１節に記載のキャリアＲＮＡはまた１４〜１８ヌクレオチド長であってもよい。
別の実施形態では、第１節、第８節または第９節のいずれかに記載の第１の配列およびエッジ配列はまた、それらがハイブリダイズした際に形成される二本鎖が細胞内でＰＫＲを活性化しない限り、２９〜２００ヌクレオチド長であってもよい。
さらなる実施形態では、本発明の組成物が挿入／導入される、前節のいずれかの前記実施形態のいずれかに記載の細胞は、さらに、細胞タンパク質（例えば、ダイサー、Ｒｉｓｃ）を含む細胞抽出物またはｉｎ ｖｉｔｒｏ混合物であってもよい。
本発明の別の実施形態では、第７節に記載の対象外来性ＲＮＡは、特定の標的／切断部位と対象外来性タンパク質をコードする配列の間に細胞内局在（共翻訳移入を含む）のためのＲＮＡ局在化シグナルをさらに含んでよく、この場合、阻害配列は細胞内局在のためのＲＮＡ局在化シグナルの機能を阻害することができ、この対象外来性ＲＮＡの細胞内局在は対象タンパク質の適切な発現に必要なものである。例えば、図３９Ａ、３９Ｂ参照。
本発明の別の実施形態では、第７節に記載の阻害配列は、特定の標的／切断部位の上流に開始コドンを含み、この場合、開始コドンは５′−ＡＵＧ−３′から本質的になり、前記阻害配列はさらに開始コドンのすぐ下流にアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列と前記対象外来性タンパク質をコードする配列は同じリーディングフレームにあり、前記アミノ酸配列は対象外来性タンパク質の細胞内局在のための局在化シグナルの機能阻害し、この対象外来性タンパク質の細胞内局在はその適切な発現に必要なものである。例えば、図３９Ｃ参照。
本発明の別の実施形態では、第７節に記載の対象外来性ＲＮＡは、対象外来性タンパク質をコードする配列の最初のコドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）の下流に終止コドンを含まず、この場合、阻害配列は、対象外来性ＲＮＡ内の対象外来性タンパク質をコードする配列の下流に位置し、阻害配列と対象外来性タンパク質をコードする配列は同じリーディングフレームにあり、阻害配列は、
（ａ）対象外来性タンパク質の機能／活性を阻害し得るアミノ酸配列；
（ｂ）細胞内局在のための局在化シグナルであるアミノ酸配列；
（ｃ）タンパク質分解シグナルであるアミノ酸配列；
（ｄ）対象タンパク質の細胞内局在のための局在化シグナルの機能を阻害し得るアミノ酸配列；および
（ｅ）特定の標的／切断部位と対象外来性タンパク質をコードする配列の最初のコドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）の間に位置するヌクレオチド配列によりコードされるペプチド配列の切断を阻害し得るアミノ酸配列（この場合、前記ヌクレオチド配列と対象外来性タンパク質をコードする配列は同じリーディングフレームにあり、前記ペプチド配列は哺乳動物細胞内のプロテアーゼにより切断され得る）
からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする。ヒト細胞では、終止コドンのない末端切断型ｍＲＮＡの翻訳中、リボソームが最後のコドンで停止し、同族ｔＲＮＡ分子がポリペプチド鎖およびリボソームと結合したままとなるが、ペプチジル−ｔＲＮＡ種では、翻訳中に小胞体シグナルペプチダーゼによりプロセシングが可能であることがこれまでに報告されている［３７］。例えば、図３９Ｄ参照。
１１．本発明の組成物の調製
本発明の一実施形態では、第１節の実施形態に記載の対象外来性ＲＮＡおよび機能的ＲＮＡは、同じＲＮＡ分子に位置することも異なるＲＮＡ分子に位置することもできる。本発明の別の実施形態では、第１節の実施形態に記載の対象外来性ＲＮＡおよび／または機能的ＲＮＡは、第３の配列内に位置することができる。
本発明の別の実施形態では、第１節の実施形態に記載の対象外来性ＲＮＡ、機能的ＲＮＡ、キャリアＲＮＡおよび機能的核酸は、１以上のＲＮＡ分子上に位置することができる。
本発明のいくつかの実施形態では、前節のいずれかの前記実施形態のいずれかに記載の１以上のポリヌクレオチド分子は、１以上のＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、前記１以上のＤＮＡ分子は、１以上のＤＮＡベクター（例えば、発現ベクター）および／またはウイルスベクターに存在する。
本発明の組成物のポリヌクレオチド分子（ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子など）は、ポリヌクレオチド分子の大規模複製も提供し、かつ、本発明の組成物からコードされるＲＮＡ分子の転写を指示するための必須エレメントを含む種々の宿主ベクター系に、当技術分野で公知の任意の方法によって組換え導入することができる。標的細胞を患者にトランスフェクトするためのこのようなベクターの使用は、本発明の組成物からコードされる十分な量のＲＮＡ分子の転写をもたらし得る。例えば、ベクターは、それが細胞により取り込まれ、これらのＲＮＡ分子の転写を指示するようにｉｎ ｖｉｖｏに導入することができる。このようなベクターは、それが転写されて本発明の組成物からコードされる所望のＲＮＡ分子を産生できる限り、エピソームに留まってもよいし、または染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術により構築することもできるし、またはＤＮＡ分子の合成に関して当技術分野で公知のいずれかの方法によって作製することもできる。
本発明の組成物からコードされるＲＮＡ分子をコードする組換えポリヌクレオチド構築物（例えば、組換えＤＮＡ構築物）は、適当な標的細胞（例えば、哺乳動物細胞であり得る）において複製および発現のために用いられる、例えば、プラスミド、ベクター、ウイルス構築物、または当技術分野で公知のその他のものであり得る。これらのＲＮＡ分子の発現は、標的細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞を含む）において機能することが当技術分野で知られている任意のプロモーターによって調節することができる。このようなプロモーターは誘導型または構成型であり得る。このようなプロモーターとしては、例えば、限定されるものではないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルスの３′長い末端反復配列に含まれているプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列、ウイルスＣＭＶプロモーター、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンβプロモーターなどが含まれる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター（すなわち、ＲＮＡＰｏｌ．Ｉにより認識されるプロモーター）、例えば、リボゾームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）遺伝子のプロモーターであり得る。このような実施形態では、対象外来性ＲＮＡ分子の終結シグナルは、ＲＮＡＰｏｌ．Ｉ終結シグナルまたはａＲＮＡポリメラーゼＩＩ終結シグナル（例えば、ポリＡシグナル）であり得る。いずれのタイプのプラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターでも、標的組織／細胞部位に直接導入できる組換えポリヌクレオチド構築物を作製するために使用可能である。あるいは、所望の標的細胞に選択的に観戦するウイルスベクターを使用することができる。
ウイルス感染に耐性のあるトランスジェニック生物の形成のためには、本発明の組成物からコードされるＲＮＡ分子をコードするベクターが選択マーカーを有することが望ましい。多くの選択系が使用可能であり、限定されるものではないが、それぞれｔｋ欠損細胞、ｈｇｐｒｔ欠損細胞またはａｐｒｔ欠損細胞における単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｔｅｒａｓｅ）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質の発現に関する選択が含まれる。また、代謝拮抗物質耐性は、ジヒドロ葉酸トランスフェラーゼ（ｄｈｆｒ）（メトトレキサート耐性を付与）；キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）（ミコフェノール酸耐性を付与）；ネオマイシン（ｎｅｏ）（アミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与）；およびハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒｏ）（ハイグロマイシン耐性を付与）の選択の基礎として使用することができる。
本発明の実施に用いるベクターは任意の真核生物発現ベクターを含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の組成物からコードされるＲＮＡ分子は、ウイルス発現ベクターによりコードされる。ウイルス発現ベクターは、例えば、限定されるものではないが、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、痘瘡ウイルス科（Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ）、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ニューモウイルス科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、ハンタウイルス科（Ｈａｎｔａｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科またはヘパシウイルス科（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｉｄａｅ）に属するものであり得る。ウイルス発現ベクターとしてはまた、限定されるものではないが、その細胞向性が線維表面に発現されるファイバータンパク質のアデノウイルス末ノブドメイン（ＨＩループ）の置換によって改変されているアデノウイルスベクターを含み得る。
本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は、この組成物からコードされるＲＮＡ分子、または誘導体もしくはその改変型、一本鎖または二本鎖を含み得る。本発明の組成物からコードされるこれらのＲＮＡ分子は、例えば、限定されるものではないが、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオシド、ホスホジエステル結合、改変結合または生物学的に存在する５つの塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基であり得る。
本発明の組成物からコードされるＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子の合成に関して当技術分野で公知のいずれかの方法によって作製することができる。例えば、これらのＲＮＡ分子は、市販の試薬と当技術分野で周知の方法による合成装置を用いて化学合成してもよい。あるいは、これらのＲＮＡ分子は、これらのＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ転写によって作製することができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ多様なベクターに組み込むことができる。これらのＲＮＡ分子は、ＳＰＳ６５などのプラスミドを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって高収量で生産することができる。さらに、Ｑ−β増幅などのＲＮＡ増幅法を利用してこれらのＲＮＡ分子を生産することもできる。
ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子などのポリヌクレオチド分子、および／または本組成物によりコードされるＲＮＡ分子は、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、細胞への輸送などを向上させるために塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で修飾することができる。さらに、ヌクレアーゼ分解感受性を低減するための修飾を行うこともできる。本発明の組成物のポリヌクレオチド分子および／または本組成物によりコードされるＲＮＡ分子は、例えば、ペプチド（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて宿主細胞受容体を標的化するため）、または細胞膜もしくは血液脳関門を渡る輸送を助長する薬剤、ハイブリゼーション誘発型切断剤またはインターカレート剤などの他の任意の附属基を含み得る。細胞内での安定性を高め、半減期を延長する手段として、種々の他の周知の修飾を導入することもできる。可能性のある修飾としては、限定されるものではないが、分子の５′および／または３′末端への、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのフランキング配列の付加が含まれる。安定性の向上が望まれる状況によっては、２′−０−メチル化などの修飾されたヌクレオシド間結合（ｉｎｔｅｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）を有する核酸が好ましい場合がある。修飾されたヌクレオシド間結合（ｉｎｔｅｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）を含む核酸は、当技術分野で周知の試薬および方法を用いて合成され得る。
本組成物のポリヌクレオチド分子および／または本発明の組成物からコードされるＲＮＡ分子は、当技術分野で周知のような好適な任意の手段（例えば、逆相クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動）により精製するされ得る。
また、本発明の組成物からコードされるＲＮＡ分子をともにコードするウイルスベクターを生産する細胞を、継続的治療を目的とした患者への移植に使用することもできる。これらの細胞は、特異的分子が患者の循環系に導入される場合には、それらの細胞を死滅させ得る特異的遺伝子（例えば、ＨＳＶ１チミジンキナーゼ／ガンシクロビル）をさらに有してもよい。
一実施形態では、本発明の組成物からコードされるＲＮＡ分子のそれぞれ１つは、ＲＮＡ分子または複製中のＲＮＡ分子であり得る。この場合、複製中のＲＮＡ分子は、これらのＲＮＡ分子のいずれかに相補的な配列を含むＲＮＡ分子であり、複製中のＲＮＡ分子は、これらのＲＮＡ分子の形成のために細胞内で複製可能なものである。
別の実施形態では、本発明の組成物からコードされるＲＮＡ分子のそれぞれ１つは、限定されるものではないが、合成ＲＮＡ、塩基が改変されている合成ＲＮＡ、ＲＮＡｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により産生される、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子をコードする塩基が改変されているＲＮＡ分子またはＤＮＡをコードするベクターまたはウイルスベクターを含む種々のタイプから作製することができる。例えば、機能的ＲＮＡは合成ｓｉＲＮＡであり得、対象外来性ＲＮＡはウイルスベクターからコードされてよく、キャリアＲＮＡはプラスミドからコードされてよい。
１２．本発明の組成物の使用および投与
本発明の組成物は、限定されるものではないが、遺伝子発現の調節、標的化細胞死、種々の疾患および種々の健康関連状態（例えば、増殖性障害（例えば、癌）、感染性疾患）の治療および／または予防、種々の健康関連状態の診断、トランスジェニック生物の形成、自殺遺伝子療法などを含む種々の適用に使用可能である。１つの例示的実施形態では、本発明の組成物は、ウイルスＲＮＡを含む細胞を死滅させることを目的に、これらの細胞内で毒性遺伝子を活性化させるために使用することができる。別の例示的実施形態では、本発明の組成物は、癌細胞に独特な所定シグナル配列を含む内在性ｍＲＮＡを含む細胞の標的化および特異的死滅を目的に、これらの細胞内で毒性遺伝子を活性化させるために使用することができる。
従って、いくつかの実施形態によれば、特定の細胞／細胞集団を死滅させるための方法が提供され、ここで、前記細胞集団は、これらの細胞に独特かつ特異的な所定シグナル配列を含む内在性シグナルＲＮＡを含み、前記方法は前記細胞に本発明の組成物を導入することを含み、前記組成物は、所定シグナル配列とハイブリダイズするために十分な相補性がある特定の配列内に位置する特定の標的部位での対象外来性ＲＮＡの特異的切断を指示するための１以上のポリヌクレオチドを含み、前記対象外来性ＲＮＡの切断は、前記細胞を死滅させ得る対象外来性タンパク質の発現をもたらす。
いくつかの実施形態によれば、対象外来性タンパク質は、限定されるものではないが、細胞機能に障害を与え、その結果、細胞死をもたらし得る任意のタイプのタンパク質から選択され得る。タンパク質は、限定されるものではないが、毒素、細胞増殖阻害剤、細胞増殖調節剤、細胞シグナル伝達経路阻害剤、細胞シグナル伝達経路調節剤、細胞透過性調節剤、細胞プロセシング調節剤などのタイプのタンパク質から選択され得る。
いくつかの実施形態によれば、理論または機構に縛られるものではないが、本発明の組成物および方法は、特異的かつ標的化された細胞の「前または無」応答を提供し得る。言い換えれば、本発明の組成物および方法は、特異的内在性シグナルＲＮＡを含む標的細胞でのみ対象外来性ＲＮＡが切断され（その結果、対象タンパク質が発現および活性化され）るものであり、内在性シグナルＲＮＡを含まない細胞には、本発明の組成物による行使はない。従って、本発明の組成物および方法は、所定シグナル配列を含む内在性シグナルＲＮＡを含まない細胞では、対象外来性タンパク質の発現の漏れは見られないため、高い安全性および制御性を提供する。
さらなる実施形態では、本発明の組成物は、ウイルス感染疾患の診断を目的に、ウイルスＲＮＡの存在下でリポーター遺伝子を活性化させるために使用することができる。別の実施形態では、本発明の組成物は、ウイルス感染に耐性のあるトランスジェニック生物の形成を目的に細胞を安定してトランスフェクトするために使用することができる。別の実施形態では、本発明の組成物は、ウイルス感染疾患の診断を目的に、ウイルスＲＮＡの存在下でリポーター遺伝子を活性化させることができるトランスジェニック生物の形成のため、細胞を安定してトランスフェクトするために使用することができる。さらに別の実施形態では、本発明の組成物は、細胞内のＲＮＡ配列の変化をリアルタイムでモニタリングするために使用することができる。
本発明の組成物を標的細胞に移入／導入／トランスフェクトするために使用することができる種々の送達系および方法が当技術分野で周知である。これらの送達系および方法には、例えば、種々のトランスフェクト剤の使用、リポソーム、微粒子、マイクロカプセへの封入、本組成物を発現し得る組換え細胞、受容体を介するエンドサイトーシス、ウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての本発明の組成物の構築、複製の過程で細胞を死滅させずに複製することができ、かつ、本発明の組成物を含むウイルスベクター、複製能がなく、かつ、本発明の組成物を含むウイルスベクター、本発明の組成物を含むウイルスベクターを産生する細胞の注射、ＤＮＡの注射、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムを介するトランスフェクションなど、または既知もしくは将来開発される他の任意の好適な送達系が含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明はまた、有効量の本発明の組成物と薬学上許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。「薬学上許容される」とは、連邦もしくは州政府の規制機関によって承認されていること、または動物、より詳しくはヒトでの使用に関して米国薬局方もしくは他の一般に認知されている薬局方に挙げられていることを意味する。「薬学上許容される担体」という句の「担体」とは、それとともに治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療を必要とする標的領域に局所投与することができる。これは例えば、限定されるものではないが、手術中の局所注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯とともに、注射、カテーテルの手段、坐剤の手段、またはインプラントの手段による、前記インプラントは、シラスティック膜などの膜またはファイバーなどを含む多孔質、無孔質またはゼラチン状の材料である）により果たすことができる。局所投与はまた、ナノ粒子、マトリクス（徐放性ポリマーまたはヒドロゲルなど）などの徐放性薬物送達系によっても果たすことができる。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、標的化細胞において所望の効果をもたらすのに有効な量で投与することができる。本発明の組成物の有効容量は、生体半減期、バイオアベイラビリティおよび毒性などのパラメーターを検討するこれらの当技術分野で周知の手順によって決定することができる。本発明の組成物の有効量は、治療する疾患または障害の性質によって異なり、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、最適な容量範囲を特定する助けとするために所望によりｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用することができる。投与手段としてはまた、限定されるものではないが、患者血流への本発明の組成物の永久的または持続的注射が含まれる。
いくつかの実施形態によれば、本発明はまた、本発明の医薬組成物の１以上の成分が充填された１以上の容器を、所望により、医薬または生物製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により指示された形式で添付文書（この添付文書は、ヒトまたは動物投与のための製造、使用または販売機関により承認されていることを表す）とともに含む医薬パックまたはキットを提供する。
以下の実施例は、限定としてではなく例として示されるものであり、本発明の実施形態の例である。
実施例１：特定の患者の癌細胞を死滅させるための本発明の組成物の使用
米国癌協会によれば、２００７年中に世界で７６００万人が癌が原因で死亡する。
本実施例では、本発明の組成物は、特定の患者の癌細胞を特異的に死滅させるように設計される。特定の患者のための本発明の組成物を設計する第１の工程は、この特定の患者の癌細胞に存在する内在性ＲＮＡ分子の１８〜２５ヌクレオチド長の配列である所定シグナル配列を同定することであり、この場合、前記所定シグナル配列は、前記特定の患者の身体の健康な細胞または非転移性腫瘍形成細胞の内在性ＲＮＡ分子には存在しない。従って、前記所定シグナル配列は、癌細胞において突然変異した遺伝子のＲＮＡ配列である。平均して、各腫瘍は９０のタンパク質コード遺伝子に突然変異を含み［１６］、各腫瘍は単一の創始細胞に起源し［３８］、従って、それらのうち、癌細胞においてＲＮＡ分子へ転写されるものを１つだけ同定する必要がある。
この所定シグナル配列の同定のために種々の方法が使用でき、これらの方法には、限定されるものではないが、ＤＮＡマイクロアレイ、Ｔｉｌｌｉｎｇ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅｓ）および癌ゲノムの大規模シーケンシングが含まれる。さらに、このシグナル配列の同定は、それらの遺伝子により癌の原因となる遺伝子突然変異を全て一覧化した癌ゲノムアトラスプロジェクトを利用することができる。
本実施例では、特定の患者の癌細胞に独特な所定シグナル配列は、５′−ＵＡＵＵＡＵＵＡＵＣＵＵＧＧＣＣＧＣＣＣＧ−３′（配列番号４１）であり、内在性ｍＲＮＡ（配列番号４２）内に位置する。従って、本実施例では、本発明の組成物は、配列５′−ＵＡＵＵＡＵＵＡＵＣＵＵＧＧＣＣＧＣＣＣＧ−３′（配列番号４１）を含むｍＲＮＡを含む細胞を死滅させるように設計される。本実施例の機能的ＲＮＡ（配列番号４３）は、所定シグナル配列の５′末端の切断を果たすように設計されたｓｈＲＮＡである。内在性ｍＲＮＡとハイブリダイズするダイサーによるプロセシングの後に生じる、切断されたｓｈＲＮＡ部分の配列は、配列番号４４に示されている。機能的ＲＮＡは、ｏｆＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの極めて強力なＵ６プロモーターの制御下で転写される。このｓｈＲＮＡの５′末端のＧと３′末端のＵＵは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのＵ６プロモーターの転写に必要である。例えば、図４０参照。細胞において、切断されたｍＲＮＡの２つの部分のそれぞれの機能的半減期は完全なｍＲＮＡの２．６分の１〜１．７分の１になるに過ぎないことが報告されている［１０］。また、細胞においてＲＩＳＣ−ＲＮＡ複合体により切断されたｍＲＮＡの２つの部分はノーザン分析により容易に検出できることも報告されている［６］。
本実施例のキャリアＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの極めて強力なＵ６プロモーターの制御下で転写されるように設計され、かつ、配列：３′−ＵＵＡＵＡＡＵＡＡＵＡＧＡＡＣＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＵＧ−５′（配列番号４５）（このキャリアＲＮＡの５′末端のＧと３′末端のＵＵはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのＵ６プロモーターの転写に必要である）を含むように設計される。この細胞において、キャリアＲＮＡは、所定シグナル配列を含む切断されたｍＲＮＡ部分とハイブリダイズされ、ダイサー（配列番号４６）によるプロセシングの後に生じた二本鎖は、所定シグナル配列の５′末端の方が熱力学的に弱くなるので、所定シグナル配列がＲｉｓｃにロードされる鎖となる［３］。例えば、図４０参照。ダイサーによるプロセシングの後に生じた、切断されたキャリアＲＮＡ部分の配列は配列番号４７に示されている。
細胞において、５′末端に約１９ヌクレオチド長の相補的領域を有する約２３ヌクレオチド長の２つのＲＮＡ転写物は互いにハイブリダイズし、標的特異的ＲＮＡ干渉を指示できることが報告されている［７］。また、これらの３′末端のうち一方に２０ヌクレオチド長のｓｓＲＮＡをさらに含む５２ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡが、平滑末端においてダイサーの基質となることも報告されている［８］。さらに、哺乳動物Ｒｉｓｃがダイサーと結合することも報告されている［９］。
本実施例の対象外来性ＲＮＡ中の特定の配列は、所定シグナル配列に１００％相補的な配列：５′−ＣＧＧＧＣＧＧＣＣＡＡＧＡＵＡＡＵＡＡＵＡ−３′（配列番号４８）を含むように設計される。例えば、図４０参照。対象外来性ＲＮＡはまた、特定の配列の下流に、ジフテリア毒素フラグメントＡ（ＤＴ−Ａ）をコードする配列を含むように設計される。対象外来性ＲＮＡは、強力なウイルスＣＭＶプロモーターの制御下で転写されるように設計される。例えば、図４０参照。
ジフテリア毒素フラグメントＡが細胞に導入されただけで細胞を死滅させることができ［１４］、哺乳動物細胞では、キャップの除去がｍＲＮＡの翻訳を３５分の１〜５０分の１にし、機能的ｍＲＮＡ半減期は１．７分の１になるに過ぎないことが報告されている［１０］。
対象外来性ＲＮＡはまた、特定の配列の上流に阻害配列を含むように設計され、この阻害配列は３つの開始コドンを含み、そのうち２つはヒトＫｏｚａｋコンセンサス配列：５′−ＡＣＣＡＵＧＧ−３′（配列番号２５）内に位置し、それらのそれぞれはＤＴ−Ａの開始コドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）とは同じリーディングフレームにない。例えば、図４０参照。
対象外来性ＲＮＡはまた、切断されるまで本発明の対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を抑えるために、５′末端に、極めて効率の良いシス作用ハンマーヘッドリボザイムＮ１１７［２３］を含むように設計される。シス作用ハンマーヘッドリボザイムＮ１１７はまた２つの開始コドンを含むが、ＤＴ−Ａの開始コドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）とは同じリーディングフレームにない。例えば、図４０参照。本実施例の外来性ＲＮＡの全配列は配列番号４９として示されている。
本実施例では、機能的ＲＮＡ、キャリアＲＮＡおよび対象外来性ＲＮＡは、ウイルスベクターにより転写される。例えば、図４０参照。
この場合、細胞において、ウイルスベクターは、機能的ＲＮＡ、キャリアＲＮＡおよび対象外来性ＲＮＡを転写する。対象外来性ＲＮＡにおけるシス作用リボザイムＮ１１７は、対象外来性ＲＮＡによる翻訳を低減するために５′末端からキャップ構造を除去し、開始コドンがリーディングフレーム外にあることでＤＴ−Ａの翻訳が妨げられる。機能的ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、所定シグナル配列の５′末端の切断を果たす。キャリアＲＮＡは、所定シグナル配列を含む切断されたｍＲＮＡ部分とハイブリダイズし、所定シグナル配列がダイサーによりプロセシングされ、Ｒｉｓｃにロードされる。このＲｉｓｃ−シグナル配列複合体は対象外来性ＲＮＡを特定の配列で切断し、リーディングフレーム外の開始コドンが分離され、その結果、ＤＴ−Ａが少なくとも１回発現され、細胞死を引き起こすにはこれで十分である。例えば、図４０参照。本実施例の切断された外来性ＲＮＡの配列は配列番号５０として示されている。
実施例２：ＥＢＶに関連する胃癌細胞、鼻咽頭癌細胞、バーキットリンパ腫細胞およびホジキンリンパ腫細胞を死滅させるための本発明の組成物の使用
エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）は、初感染後にＢリンパ球において生涯続く潜伏感染を確立する遍在ヒトガンマヘルペスウイルスである。ＥＢＶは、世界中の大多数の集団に感染し、バーキット腫、ホジキンリンパ腫、胃癌および鼻咽頭癌（ＮＰＣ）を含む数種のヒト悪性腫瘍の病因に関連が見出されている［３２］。ＥＢＶ感染は、主として、ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２およびＥＢＥＲを含む潜伏遺伝子の発現を特徴とする［３２］。ＬＭＰ１（潜伏膜タンパク質１）は、その発癌能によって細胞株を形質転換し、細胞の表現型を変更し得ることが見出された最初のＥＢＶ潜伏遺伝子であった［３２］。ヒト上皮細胞では、ＬＭＰ１は、腫瘍の進行および浸潤に関与する多くの機能的特性を変更する［３２］。
本実施例では、本発明の組成物は、内在性シグナルＲＮＡとしてＬＭＰ１ ｍＲＮＡを用い、所定シグナル配列として配列：５′−ＣＵＣＵＧＵＣＣＡＣＵＵＧＧＡＧＣＣＣＵＵ−３′（配列番号５１−ＬＭＰ１ ｍＲＮＡのヌクレオチド２６９〜２８９）を用いることにより、ＥＢＶが潜伏感染しているバーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、胃癌および鼻咽頭癌の癌細胞を死滅させるように設計される。例えば、図４１参照。また、ＬＭＰ１ ｍＲＮＡのヌクレオチド２５５〜３０４は図面に示され、配列番号５２として示されている。この所定シグナル配列は、ＲＮＡ二次構造を持たない領域に位置することから、また、ｓｉＲＮＡの良好な標的となることが示されている領域に位置することから選択される［３３］。さらに、この所定シグナル配列はまた、その切断が２８９ヌクレオチド長という比較的短いＲＮＡ分子を作り出すことから選択される。
本実施例では、キャリア配列および機能的ＲＮＡは、細胞内でハイブリダイズされる同じＲＮＡ二本鎖に位置し、この場合、二本鎖領域はキャリア配列の５′末端に位置し、二本鎖領域がダイサーによりプロセシングされると、キャリア配列がＲＮＡ二本鎖から分離され、生じたｓｉＲＮＡ二本鎖が機能的ＲＮＡとなり、所定シグナル配列の３′末端においてＬＭＰ−１のｍＲＮＡの切断を果たし得る。ＲＮＡ二本鎖の２鎖は、３′−ＵＵＣＵＣＵＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＵＧＡＡＣＣＵＣＧＧＧＡＡＣＣＵＣＧＧＧＡＡＡＣＡＵＡＵＧＡＧＧ−５′（配列番号５３）および５′−ＧＧＡＧＣＣＣＵＵＵＧＵＡＵＡＣＵＣＣＵＵ−３′（配列番号５４）である。ＲＮＡ二本鎖の２鎖は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの極めて強力なＵ６プロモーターの制御下で転写され、このようにそれらの５′末端はＧであり、それらの３′末端はＵＵである。例えば、図４１参照。ＬＭＰ−１のｍＲＮＡとハイブリダイズでき、かつ、所定シグナル配列の３′末端でのその切断に影響を及ぼし得る、切断された鎖（ダイサープロセシングの後）の配列は、配列番号５５として示されている。
ＬＭＰ−１のｍＲＮＡは、所定シグナル配列の３′末端で切断され、キャリア配列（配列番号５６）は所定シグナル配列にダイサープロセシングを指示し、生じた二本鎖は、所定シグナル配列の５′末端の方が熱力学的に弱くなるので、所定シグナル配列がＲｉｓｃにロードされる鎖となる［３］。例えば、図４１参照。もう一方の鎖、すなわち、ダイサーによるプロセシング後の切断されたキャリア配列の配列は、配列番号５７として示されている。
本実施例の対象外来性ＲＮＡ中の特定の配列は、所定シグナル配列に１００％相補的な配列：３′−ＧＡＧＡＣＡＧＧＵＧＡＡＣＣＵＣＧＧＧＡＡ−５′（配列番号５８）を含むように設計される。対象外来性ＲＮＡはまた、特定の配列の下流にジフテリア毒素（ＤＴ）をコードする配列を含むように設計される。対象外来性ＲＮＡは、強力なウイルスＣＭＶプロモーターの制御下で転写されるように設計される。対象外来性ＲＮＡはまた、特定の配列の上流に阻害配列を含むように設計される。阻害配列は２つの開始コドンを含み、これらはヒトＫｏｚａｋコンセンサス配列：５′−ＡＣＣＡＵＧＧ−３′（配列番号２５）内に位置し、それぞれはＤＴの開始コドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）と同じリーディングフレームにない。対象外来性ＲＮＡはまた、切断されるまで本発明の対象外来性ＲＮＡの翻訳効率を低減するために、５′末端に極めて効率の良いシス作用ハンマーヘッドリボザイム、すなわち、スノルボザイム［２２］を含むように設計される。シス作用ハンマーヘッドリボザイム、すなわち、スノルボザイムも２つの開始コドンを含むが、それぞれはＤＴの開始コドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）と同じリーディングフレームにない。対象外来性ＲＮＡはまた、特定の配列の２３ヌクレオチド下流であって、ＤＴをコードする配列の上流にヌクレオチド配列を含むように設計され、この場合、ヌクレオチド配列はＤＴをコードする配列の下流に位置する２３ヌクレオチの配列に結合することができ、対象外来性ＲＮＡは、特に対象外来性ＲＮＡが切断された際にＤＴの翻訳効率を高める環状構造を形成する。例えば、図４１参照。本実施例の外来性ＲＮＡの全配列は、配列番号５９として示されている。
本実施例では、ＲＮＡ二本鎖および対象外来性ＲＮＡの２鎖はウイルスベクターにより転写される（図４１参照）。この場合、細胞において、ウイルスベクターはＲＮＡ二本鎖と対象外来性ＲＮＡの２鎖を転写する。対象外来性ＲＮＡにおいて、シス作用リボザイムであるスノルボザイムは、対象外来性ＲＮＡによる翻訳を低減するために５′末端からキャップ構造を除去し、開始コドンがリーディングフレーム外にあることでＤＴ−Ａの翻訳が妨げられる。このＲＮＡ二本鎖の２鎖は互いに、また、ＬＭＰ−１ ｍＲＮＡにおける所定シグナル配列とハイブリダイズし、前記ＲＮＡ二本鎖の二本鎖領域はダイサーにより切断され、ｓｉＲＮＡである機能的ＲＮＡとキャリア配列を生じる。ｓｉＲＮＡは所定シグナル配列を３′末端で切断し、キャリア配列は切断された所定シグナル配列にダイサープロセシングを指示する。プロセシングされた所定シグナル配列はＲｉｓｃにロードされ、その後、Ｒｉｓｃ−シグナル配列複合体は対象外来性ＲＮＡを特定の配列で切断し、リーディングフレーム外開始コドンが切断され、その結果、ＤＴが発現され得る。本実施例の切断された外来性ＲＮＡの配列は、配列番号６０として示されている。ＤＴをコードする配列を含むＲＮＡ部分は、癌細胞および隣接細胞を死滅させるためにＤＴの翻訳を高める環状構造を形成する。例えば、図４１参照。
本実施例では、機能的ＲＮＡおよびキャリア配列は同じＲＮＡ二本鎖に位置し、従って、キャリア配列は機能的ＲＮＡを所定シグナル配列に近接させることができ、これにより、ＲＮＡ干渉経路の成分（例えば、ダイサーおよびＲｉｓｃ）も所定シグナル配列に近接させることができる。
実施例３：ＨＩＶ−１感染細胞を死滅させるための本発明の組成物の使用
世界保健機関によれば、２００６年で、世界のＨＩＶ保有人口は約３９５０万人であった。国連合同エイズ計画（Ｊｏｉｎｔ Ｕｎｉｔｅｄ Ｎａｔｉｏｎｓ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｎ ＨＩＶ ａｎｄ ＡＩＤＳ）の現在の推計によれば、ＨＩＶはアフリカで９０００万人の感染者を出そうとしている。ＨＩＶを含む多くのウイルスは、休眠期または潜伏期を示し、その間はタンパク質合成はほとんど、または全く起こらない。ウイルス感染は、このような期間には免疫系の監視を本質的に逃れている。現行の抗ウイルス治療レジメンは、潜伏ウイルスの細胞貯蔵庫を除去するということには主として有効でない［１５］。ウイルスは、それらのゲノム中の癌遺伝子のために発癌性となり得る。レトロウイルスもまた、遺伝子を末端切断する位置、または遺伝子を強力なウイルスシス作用調節エレメントの制御下に置く位置に組み込まれることにより発癌性となり得る。ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）をもたらし得る。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の２種のＨＩＶがヒトに感染する。ＨＩＶ−１の方が病原性が高く、比較的容易に伝染し、世界的に見て大多数のＨＩＶ感染の原因となっている。ＨＩＶ−２はＨＩＶ−１よりも伝染性が低く、西アフリカに限定されている。
ＨＩＶを含む多くのウイルスは休眠期または潜伏期を示し、その間、タンパク質合成はほとんど起こらないか、または全く起こらない。ウイルス感染は、このような期間には免疫系から本質的に隠れている。現行の抗ウイルス治療レジメンは、潜伏ウイルスの細胞貯蔵庫を除去するということには主として有効でない［１５］。
本実施例では、本発明の組成物は、内在性シグナルＲＮＡとしてＨＩＶ−１ ｍＲＮＡを用い、所定シグナル配列として配列：５′−ＵＡＣＣＡＡＵＧＣＵＧＣＵＵＧＵＧＣＣＵＧ−３′（配列番号６１−ＨＩＶ−１ ｍＲＮＡのヌクレオチド８４９２〜８５１２）を用いることにより、ＨＩＶ−１感染細胞を死滅させるように設計される。例えば、図４２参照。また、ＨＩＶ−１ ｍＲＮＡのヌクレオチド８４７７〜８５２７は図面に示され、配列番号６２として示されている。この所定シグナル配列は、二次構造を含まない領域に位置することから、また、ｓｉＲＮＡの良好な標的であることが示されている領域に位置することから選択される［３４］。
本実施例の対象外来性ＲＮＡは、強力なウイルスＣＭＶプロモーターの制御下で転写され、２つの特定の配列を含むように設計され、この場合、それらのそれぞれは所定シグナル配列に１００％相補的な３′−ＡＵＧＧＵＵＡＣＧＡＣＧＡＡＣＡＣＧＧＡＣ−５′（配列番号６３）である。対象外来性ＲＮＡはまた、この２つの特定の配列間にジフテリア毒素フラグメントＡ（ＤＴ−Ａ）をコードする配列を含むように設計される。哺乳動物細胞では、ただ１分子のジフテリア毒素フラグメントＡが細胞に導入されるだけで細胞を死滅させることができる［１４］。対象外来性ＲＮＡはまた、一方は５′末端に、他方は３′末端に、２つの阻害配列を含むように設計される。対象外来性ＲＮＡの５′末端に位置する阻害配列は３つの開始コドンを含むように設計され、この場合、そのうち１つはヒトＫｏｚａｋコンセンサス配列：５′−ＡＣＣＡＵＧＧ−３′（配列番号２５）内に位置し、それらのそれぞれはＤＴ−Ａの開始コドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）と同じリーディングフレームになく、これら３つの開始コドンは総て同じリーディングフレームにある。対象外来性ＲＮＡの５′末端に位置する阻害配列はまた、これら３つの開始コドンの下流であって、かつ、２つの特定の配列の上流にヌクレオチド配列を含み、この場合、このヌクレオチド配列は３つの開始コドンと同じリーディングフレームにあり、ヌクレオチド配列は、ヒトアルキルジヒドロキシアセトンリン酸シンターゼのペルオキシソームシグナル２（Ｈ２Ｎ−−−ＲＬＲＶＬＳＧＨＬ−配列番号２７）である、細胞内局在のための局在化シグナルをコードする［３０］。哺乳動物細胞では、細胞内局在のための局在化シグナルを担持するタンパク質は、それらのｍＲＮＡで翻訳されながら、細胞内に局在することができる。例えば、４２参照。
対象外来性ＲＮＡの３′末端に位置する阻害配列は、２つの特定の配列の下流にイントロンを含むように設計され、この場合、対象外来性ＲＮＡは、コード配列の下流にイントロンを含むＲＮＡ分子を分解するナンセンス依存分解（ＮＭＤ）の標的となる［３１］。イントロンは、５′末端および３′末端における所定シグナル配列の切断に作用するように設計された２つの人工マイクロＲＮＡ（それぞれ配列番号６４および６５）［３５］を含む。対象外来性ＲＮＡの３′末端に位置する阻害配列はまた、３′末端に、対象外来性ＲＮＡの分解を刺激するＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）も含む。このＡＵリッチエレメントは４７ヌクレオチド長であり、配列：５′−ＡＵＵＵＡ−３′（配列番号３１）と５′−ＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）−３′（配列番号３２）を含む［２８］。例えば、図４２参照。本実施例の外来性ＲＮＡの全配列は、配列番号６６、配列番号１１３、およびその間に上記の２つの人工マイクロＲＮＡを含むイントロンから構成される。本実施例では、キャリアＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの極めて強力なＵ６プロモーターの制御下で転写されるように設計され、かつ、配列：３′−ＵＵＡＵＧＧＵＵＡＣＧＡＣＧＡＡＣＡＣＧＧ−５′（配列番号６７）（このキャリアＲＮＡの５′末端のＧと３′末端のＵＵはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのＵ６プロモーターによる転写に必要である）を含むように設計される。細胞において、本発明のキャリアＲＮＡは切断された所定シグナル配列とハイブリダイズすることができ、生じた二本鎖は所定シグナル配列の５′末端の方が熱力学的に弱くなるので、所定シグナル配列がＲｉｓｃにロードされる鎖となる［３］。例えば、図４２参照。
本実施例では、キャリアＲＮＡおよび対象外来性ＲＮＡはウイルスベクターにより転写される。この場合、細胞において、ウイルスベクターはキャリアＲＮＡと対象外来性ＲＮＡを転写する。開始コドンがリーディングフレーム外にあることでＤＴ−Ａの翻訳が妨げられ、ペルオキシソーム標的化シグナル２は誤ったタンパク質と対象外来性ＲＮＡをペルオキシソームに送る。イントロンは、対象外来性ＲＮＡをナンセンス依存分解（ＮＭＤ）による分解の標的とし、ＡＵリッチエレメントも対象外来性ＲＮＡの分解を刺激する。細胞内にＨＩＶ−１ ｍＲＮＡが存在する場合、２つの人工マイクロＲＮＡが５′末端と３′末端で所定シグナル配列を切断し、キャリアＲＮＡが、切断された所定シグナル配列とハイブリダイズし、シグナル配列がＲｉｓｃにロードされ得る。次に、Ｒｉｓｃ−シグナル配列複合体は対象外来性ＲＮＡを２つの特定の配列で切断することができ、全ての阻害配列が分離され、その結果、ＤＴ−Ａが少なくとも１回発現され、細胞死を引き起こすにはこれで十分である。例えば、図４２参照。本実施例の切断された外来性ＲＮＡの配列は配列番号６８として示されている。
本実施例では、所定シグナル配列は、その両末端から切断され、従って、キャリアＲＮＡとともに、ダイサーまたはＲｉｓｃのより良い基質となる。
ウイルスベクターはまた、ＨＩＶ−１感染細胞（例えば、ＮＦ−κＢ）においてＨＩＶ−１ ｍＲＮＡの転写を増強することができる転写因子もコードしてもよい。ウイルスベクターは、新たなＨＩＶ−１粒子の生産を妨げることができる遺伝子（例えば、ＨＩＶ−１ ｍＲＮＡスプライシングを妨げるＲｅｖ）をさらにコードしてもよい。
実施例４：ｈｓｖ−１感染細胞を死滅させるための本発明の組成物の使用
ＨＳＶ−１（単純ヘルペスウイルス−１）を含む多くのウイルスが休眠期または潜伏期を示し、その間、タンパク質合成は行われない。ウイルス感染は、このような期間には免疫系の監視を本質的に逃れている。現行の抗ウイルス治療レジメンは、潜伏ウイルスの細胞貯蔵庫を除去するということには主として有効でない［１５］。単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）の潜伏関連転写物（ＬＡＴ）が、ニューロン潜伏感染中に発現される唯一のウイルス遺伝子である。ＬＡＴは、アポトーシスを阻害し、感染したニューロンの生存を促進することによって潜伏を維持する。ＬＡＴ遺伝子に帰属されているタンパク質産物はない。
本実施例では、本発明の組成物は、内在性シグナルＲＮＡとして潜伏関連転写物（ＬＡＴ）を用い、所定シグナル配列として配列：５′−ＡＡＧＣＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＵＧＧＵ−３′（配列番号６９−ＨＳＶ−１の潜伏関連転写物ＬＡＴのヌクレオチド１０８〜１２８）を用いることにより、ＨＳＶ−１感染細胞を死滅させるように設計される。例えば、図４３参照。また、ＨＳＶ−１ ＬＡＴ ｍＲＮＡヌクレオチド１０１〜１４０は図面に示され、配列番号７０として示されている。この所定シグナル配列は、その切断が１２８ヌクレオチド長という比較的短いＲＮＡ分子をを作り出すことから選択される。例えば、図４３参照。
本実施例では、キャリア配列および機能的ＲＮＡは、ｔｈｅＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ Ｕ６プロモーターにより転写される同じステムループ構造（配列番号７１）に位置する。この場合、ステムループ構造がダイサーによりプロセシングされると、キャリア配列（配列番号７２）がステムループ構造から分離され、生じたｓｉＲＮＡ二本鎖が機能的ＲＮＡとなり、所定シグナル配列の３′末端においてＬＡＴの切断を果たし得る。生じるｓｉＲＮＡ二本鎖の鎖の配列は配列番号７３および７４として示されている。所定シグナル配列を含む切断されたＬＡＴ部分の配列は配列番号７５として示されている。ステムループ構造の５′末端のＧと３′末端のＵＵは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのＵ６プロモーターによる転写に必要である。
細胞において、キャリア配列は、所定シグナル配列を含む切断されたＬＡＴ部分とハイブリダイズし、ダイサーによるプロセシング後に、生じる二本鎖は、所定シグナル配列の５′末端の方が熱力学的に弱くなるので、所定シグナル配列がＲｉｓｃにロードされる鎖となる［３］。例えば、図４３参照。
本実施例の対象外来性ＲＮＡは、強力なウイルスＣＭＶプロモーターの制御下で転写され、２つの特定の配列を含むように設計され、この場合、それらのそれぞれは、所定シグナル配列に１００％相補的な５′−ＡＣＣＡＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＧＣＵＵ−３′（配列番号７６）である。対象外来性ＲＮＡはまた、２つの特定の配列間にジフテリア毒素（ＤＴ）をコードする配列を含むように設計される。対象外来性ＲＮＡはまた、一方は対象外来性ＲＮＡの５′末端に、他方は３′末端に、２つの阻害配列を含むように設計される。対象外来性ＲＮＡの５′末端に位置する阻害配列は、３つの開始コドンを含むように設計され、この場合、そのうち２つはヒトＫｏｚａｋコンセンサス配列：５′−ＡＣＣＡＵＧＧ−３′（配列番号２５）内に位置し、それらのそれぞれはＤＴの開始コドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）と同じリーディングフレームにない。対象外来性ＲＮＡの３′末端に位置する阻害配列は、２つの特定の配列の下流に翻訳レプレッサーｓｍａｕｇ認識エレメント（ＳＲＥ）：５′−ＵＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＣＵＣＵＧＧＣＡＧＣＵＵＵＵＧＣＡＧＣＧ−３′（配列番号２８）を含むように設計される。例えば、図４３参照。Ｓｍａｕｇ １はヒト染色体１４にコードされ、ＳＲＥ含有メッセンジャーの翻訳を抑制することができる［２６、２７］。ネズミＳｍａｕｇ １は脳で発現され、翻訳がシナプス刺激により厳格に調節されている細胞領域であるシナプトノイロゾームに豊富である［２６］。対象外来性ＲＮＡの３′末端に位置する阻害配列はまた、３′末端に、末梢を有髄化するためのＲＮＡ局在化シグナル（Ａ２ＲＥ−核内リボヌクレオタンパク質Ａ２応答エレメント）：５′−ＧＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＡＵＧ−３′（配列番号２９）も含む［２９］。例えば、図４３参照。Ａ２ＲＥは、ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）ｍＲＮＡの３′非翻訳領域に位置するシス作用配列であり、乏突起神経膠細胞の有髄末梢へのＭＢＰ ｍＲＮＡの輸送に必要十分である［２９］。ｈｎＲＮＰ（異種核リボヌクレオタンパク質）Ａ２は、Ａ２ＲＥと結合し、ＭＢＰの輸送を媒介する［２９］。
本実施例の対象外来性ＲＮＡはまた、ＤＴをコードする配列のすぐ下流に細胞質ポリアデニル化エレメント（ＣＰＥ）も含む。このＣＰＥは、ＤＴをコードする配列のすぐ下流に配列５′−ＵＵＵＵＵＵＡＵＵ−３′（配列番号３８）を、かつ、ＤＴをコードする配列の９１ヌクレオチド下流に配列５′−ＵＵＵＵＡＵＵ−３′（配列番号３９）を含む［２５］。例えば、図４３参照。哺乳動物では、ＣＰＥＢ（細胞質ポリアデニル化エレメント結合タンパク質）は、海馬の樹状細胞層（脳の長期記憶を担う部分）に存在する［３６］。哺乳動物海馬ニューロンのシナプス−樹状突起コンパートメントでは、ＣＰＥＢは、ポリアデニル化により誘導される翻訳によって、ＣＰＥを含むα−ＣａＭＫＩＩ ｍＲＮＡの翻訳を刺激すると思われる［３６］。本実施例の外来性ＲＮＡの全配列は、配列番号７７として示されている。
本実施例では、対象外来性ＲＮＡとステムループ構造はウイルスベクターにより転写される。この場合、対象外来性ＲＮＡおよびステムループ構造の転写後に、開始コドンがリーディングフレーム外にあることでＤＴ−Ａの翻訳が妨げられ、Ｓｍａｕｇ１（翻訳レプレッサー）がｓｍａｕｇ認識エレメント（ＳＲＥ）に結合し、ＤＴ翻訳を阻害し、ｈｎＲＮＰ Ａ２はＡ２ＲＥに結合し、有髄末梢へのＲＮＡ分子の輸送を媒介する。それに対応して、ステムループ構造がダイサーによりプロセシングされ、その結果、キャリア配列がステムループ構造から分離され、生じるｓｉＲＮＡ二本鎖が機能的ＲＮＡとなり、次に、機能的ＲＮＡが所定シグナル配列の３′末端でのＬＡＴの切断を果たす。その後、キャリア配列は、所定シグナル配列を含むＬＡＴ部分とハイブリダイズし、所定シグナル配列はダイサーによりプロセシングされ、Ｒｉｓｃにロードされる。その後、Ｒｉｓｃ−シグナル配列複合体は対象外来性ＲＮＡを２つの特定の配列で切断し、全ての阻害配列が分離され、その結果、ＣＰＥＢ（細胞質ポリアデニル化エレメント結合タンパク質）がＣＰＥと結合し、切断された対象外来性ＲＮＡにおけるポリＡテールの伸長を刺激し、その結果、ＤＴが発現され、その細胞と隣接細胞を死滅させることができる。例えば、図４３参照。本実施例の切断された外来性ＲＮＡの配列は、配列番号７８として示されている。
本実施例では、機能的ＲＮＡおよびキャリア配列は、転写単位をほとんど必要としない同じＲＮＡ分子に位置する。このように機能的ＲＮＡとキャリア配列が近接していることの主な利点は、細胞内の同じ場所で同時に、かつ一定の比率で作り出されることである。
実施例５：特定の患者の癌細胞を死滅させるための本発明の組成物の使用
本実施例では、本発明の組成物は、特定の患者の癌細胞を死滅させるように設計される。
上記の実施例１に記載のとおり、特定の患者のための本発明の組成物の設計における第１のステップは、この特定の患者の癌細胞に存在するＲＮＡ分子の１８〜２５ヌクレオチド長の配列である所定シグナル配列を同定することであり、この場合、この所定シグナル配列は、この特定の患者の身体の健康細胞または非転移性腫瘍形成細胞のＲＮＡ分子には存在しない。従って、所定シグナル配列は、癌細胞において突然変異している遺伝子のＲＮＡ配列である。平均して、各腫瘍は９０のタンパク質コード遺伝子に突然変異を含み［１６］、各腫瘍は単一の創始細胞に起源し［３８］、従って、それらのうち、癌細胞においてＲＮＡ分子へ転写されるものを１つだけ同定する必要がある。この所定シグナル配列の同定のために種々の方法が使用でき、これらの方法には、限定されるものではないが、ＤＮＡマイクロアレイ、Ｔｉｌｌｉｎｇ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅｓ）および癌ゲノムの大規模シーケンシングが含まれる。さらに、この所定シグナル配列の同定は、それらの遺伝子により癌の原因となる遺伝子突然変異を全て一覧化した癌ゲノムアトラスプロジェクトを利用することができる。
本実施例では、特定の患者の癌細胞に独特な所定シグナル配列は、５′−ＡＡＵＵＡＡＧＵＵＵＡＵＧＡＡＣＧＧＧＵＣ−３′（配列番号７９）であり、内在性ｍＲＮＡ内に位置する。従って、本実施例では、本発明の組成物は、配列５′−ＡＡＵＵＡＡＧＵＵＵＡＵＧＡＡＣＧＧＧＵＣ−３′（配列番号７９）を含む内在性ｍＲＮＡ（内在性シグナルＲＮＡとして）を含む細胞を死滅させるように設計される。前記所定シグナル配列を含む例示的内在性ｍＲＮＡは図４４に示され、配列番号８０として示されている。
本実施例では、機能的ＲＮＡは、所定シグナル配列の３′末端の切断を果たすように設計されたハンマーヘッド型リボザイムであるＲｚ−Ｂ（配列番号８１）［２１］である。切断後の、所定シグナル配列を含む例示的内在性ｍＲＮＡの配列は配列番号８２として示されている。ハンマーヘッド型リボザイムＲｚ−Ｂは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの極めて強力なＵ６プロモーターの制御下で転写される。このハンマーヘッド型リボザイムＲｚ−Ｂの５′末端のＧと３′末端のＵＵは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのＵ６プロモーターによる転写に必要である。例えば、図４４参照。細胞において、切断されたｍＲＮＡの２つの部分のそれぞれの機能的半減期は完全なｍＲＮＡの２．６分の１〜１．７分の１になるに過ぎないことが報告されている［１０］。また、細胞においてＲＩＳＣ−ＲＮＡ複合体により切断されたｍＲＮＡの２つの部分はノーザン分析により容易に検出できることも報告されている［６］。
本実施例のキャリア配列は、５′−ＣＣＣＧＵＵＣＡＵＡＡＡＣＵＵＡＡＵＵＡＡＣＣＧＧＵＣ−３′（配列番号８３）であり、１０３の連続するキャリア配列は、強力なウイルスＣＭＶプロモーターの制御下で転写されるＲＮＡ配列内に位置する。この場合、ハンマーヘッド型リボザイムＲｚ−Ａ（配列番号８４）［２１］は、ＲＮＡ配列の５′末端に位置するキャリア配列の３′末端の切断を果たすように設計される。ハンマーヘッド型リボザイムＲｚ−Ａは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの極めて強力なＵ６プロモーターの制御下で転写される。ハンマーヘッド型リボザイムＲｚ−Ａの５′末端のＧと３′末端のＵＵは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのＵ６プロモーターのよる転写に必要である。例えば、図４４参照。
細胞において、ハンマーヘッド型リボザイムＲｚ−Ａは、１つのＲＮＡ配列から最大１０１の完全キャリア配列を分離する。分離されたキャリア配列は、所定シグナル配列を含む切断されたｍＲＮＡ部分とハイブリダイズし、ダイサープロセシングの後、生じる二本鎖は、所定シグナル配列の５′末端の方が熱力学的に弱くなるので、所定シグナル配列がＲｉｓｃｎロードされる鎖となる［３］。例えば、図４４参照。生じる二本鎖の第２鎖の配列、すなわち、ダイサーンによるプロセシング後の切断されたキャリア配列は、配列番号８５として示されている。
本実施例の対象外来性ＲＮＡ内の特定の配列は、所定シグナル配列に１００％相補的な配列：３′−ＵＵＡＡＵＵＣＡＡＡＵＡＣＵＵＧＣＣＣＡＧ−５′（配列番号８６）を含むように設計される。対象外来性ＲＮＡはまた、特定の配列の下流にジフテリア毒素（ＤＴ）をコードする配列を含むように設計される。対象外来性ＲＮＡは、強力なウイルスＣＭＶプロモーターの制御下で転写されるように設計される。対象外来性ＲＮＡはまた、特定の配列の上流に阻害配列を含むように設計される。阻害配列は３つの開始コドンを含み、それらのうち２つはヒトＫｏｚａｋコンセンサス配列：５′−ＡＣＣＡＵＧＧ−３′（配列番号２５）内に位置し、それらのそれぞれは、ＤＴの開始コドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）と同じリーディングフレームにない。本発明の対象外来性ＲＮＡはまた、ＤＴをコードする配列の下流にヒトＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ（Ｈ２ａｃ）遺伝子３′ＵＴＲ由来の回文型終結エレメント（ＰＴＥ）（５′−ＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣ−３′−配列番号３４））も含む。例えば、図４４参照。ＰＴＥは、ｍＲＮＡプロセシングおよび安定性に重要な役割を果たす［１１］。ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ遺伝子からの転写物はポリ（Ａ）テールを欠きながら、ＰＴＥのためになお安定である。本実施例の外来性ＲＮＡの全配列は、配列番号８７として示されている。
本実施例では、対象外来性ＲＮＡ、ハンマーヘッド型リボザイムＲｚ−Ｂ／Ｒｚ−Ａ、および１０３のキャリア配列を含むＲＮＡ配列は、ウイルスベクターにより転写される。この場合、細胞において、ウイルスベクターは、対象外来性ＲＮＡ、ハンマーヘッド型リボザイムＲｚ−Ｂ／Ｒｚ−Ａ、および１０３キャリア配列を含むＲＮＡ配列を転写する。開始コドンがリーディングフレーム外にあることでＤＴの翻訳は妨げられる。ハンマーヘッド型リボザイムＲｚ−Ｂは、所定シグナル配列の３′末端を切断する。ハンマーヘッド型リボザイムＲｚ−Ａは、１つのＲＮＡ配列から最大１０１の完全なキャリア配列を分離する。分離されたキャリア配列は、所定シグナル配列を含む切断されたｍＲＮＡ部分とハイブリダイズし、所定シグナル配列はダイサーによりプロセシングされ、Ｒｉｓｃにロードされる。Ｒｉｓｃ−シグナル配列複合体は対象外来性ＲＮＡを特定の配列で切断し、リーディングフレーム外開始コドンが分離され、回文型終結エレメントが切断された対象外来性ＲＮＡを安定化し、それを分解から保護し、その結果、ＤＴが発現され、その細胞および隣接細胞集団を死滅され得る。例えば、図４４参照。本実施例の切断された外来性ＲＮＡの配列は、配列番号８８として示されている。
実施例６ 対象外来性ＲＮＡによりコードされる対象外来性タンパク質の特異的細胞発現
本明細書の下記の試験のための一般プロトコール：
トランスフェクション前日に、１ウェル当たり約１２０，０００のＴ２９３細胞を２４ウェルプレートに播種し、トランスフェクション当日に、各ウェルに、
１．ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）／ルシフェラーゼプラスミド−ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子およびホタルルシフェラーゼ遺伝子（プラスミドＥ１１、Ｐｓｖ４０−イントロン−ＭＣＳ−ＲＬｕｃ−−−Ｐｈｓｖｔｋ−Ｆｌｕｃ、配列番号２２またはプラスミドＥ６５、Ｐｓｖ４０−イントロン−Ｔｓｐ−ＴＤ１−ＴＬａｃＺ−ＲＬｕｃ−ＰＴＳ−６０ＡＴＧ−−−Ｐｈｓｖｔｋ−ＦＬｕｃ、配列番号２３）を発現する１７０ｎｇのプラスミド
２．試験プラスミド＝３０ｎｇの試験プラスミド（下記に詳説）
３．ｓｉＲＮＡ＋またはｓｉＲＮＡ−＝１０ｐモルのｓｉＲＮＡ二本鎖分子（試験プラスミドによりコードされているｍＲＮＡの切断を誘導することができるもの（ｓｉＲＮＡ＋）、または切断を誘導することができないもの（ｓｉＲＮＡ−））（下記に詳説）
で同時トランスフェクションを行った。
トランスフェクションは、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者のプロトコールに従って用いて行った。トランスフェクション４８時間後、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子発現を、デュアルルシフェラーゼリポートアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）および照度計（ｇｌｏｍａｘ ２０／２０ ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定し、相対発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ）（ＲＬＵ）を求めた。
試験プラスミドは以下のプラスミドのいずれのタイプであってもよい：
陰性対照＝ジフテリア毒素（ＤＴＡ）をコードしないプラスミド；
陽性対照＝ジフテリア毒素（ＤＴＡ）を構成的にコードするプラスミド；
試験プラスミド＝本発明の組成物のプラスミド、すなわち、阻害配列とジフテリア毒素（ＤＴＡ）をコードする下流配列の間にｓｉＲＮＡ＋の標的部位を含むプラスミド。試験プラスミドでは、同時トランスフェクトされたｓｉＲＮＡ＋が試験プラスミドの阻害配列を切断すると、ジフテリア毒素が発現され、それが発現される細胞を死滅させることができ、それにより、ウミシイタケの発現およびＲＬＵの全体的な測定値が低減される。
試験プラスミドは、２種類の異なるｓｉＲＮＡｓ＋、および２種類の異なるｓｉＲＮＡｓ−で別々に、それぞれ３回試験した。
結果は次のように計算される。
活性化倍率＝試験プラスミドとともに２種類のｓｉＲＮＡ−のそれぞれの存在下で測定されたＲＬＵ（相対発光量）の平均（６ウェル）を、試験プラスミドとともにｓｉＲＮＡ＋の一方を用いた場合のＲＬＵの平均（３ウェル）で割ったもの。
漏出倍率＝陰性対照プラスミドとともに全てのｓｉＲＮＡｓ−／＋を用いた場合のＲＬＵの平均を、試験プラスミドとともに２種類のｓｉＲＮＡ−のそれぞれを用いた場合の平均で割ったもの。
ｓｉＲＮＡ＋／−ＲＬＵ＝１種類の同時トランスフェクトｓｉＲＮＡ＋の存在下または２種類の同時トランスフェクトｓｉＲＮＡ−の存在下で独立に測定されたＲＬＵの平均。
これらのプラスミドは、分子生物学の分野で実施されている一般的かつ既知の方法を用いて構築した。本明細書で以下に記載される構築プラスミドのバックボーンベクターは、ｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）−２ベクター（ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｃ８０２１）またはｐｃｍｖ６−Ａ−ＧＦＰ（ＯｒｉＧｅｎｅ、カタログ番号ＰＳ１０００２６）である。試験プラスミドに関して、各プラスミドの付属名は、以下にさらに詳細に示すように、そのプラスミド配列内に含まれる配列を示す。
ｓｉＲＮＡ配列：
１．ＲＬ二本鎖（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、カタログ番号Ｐ−００２０７０−０１−２０）（配列番号６５（センス鎖）および配列番号６６（アンチセンス鎖））。
２．ＧＦＰ二本鎖ＩＩ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、カタログ番号Ｐ−００２０４８−０２−２０）、（配列番号６７（センス鎖）および配列番号６８（アンチセンス鎖））。
３．ｓｉＲＮＡ−対照（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＶＣ３０００２ ００００１０）（配列番号６９（センス鎖）および配列番号７０（アンチセンス鎖））。
４．アンチβＧａｌ ｓｉＲＮＡ−１（（標的部位：Ｔｌａｃｚ（配列番号７１）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、カタログ番号Ｐ−００２０７０−０１−２０）（配列番号７２（センス鎖）および配列番号７３（アンチセンス鎖））。
５．ルシフェラーゼＧＬ３二本鎖（（標的部位：Ｔｆｌｕｃ（配列番号７４）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、カタログ番号Ｄ−００１４００−０１−２０）（配列番号７５（センス鎖）および配列番号７６（アンチセンス鎖））。
６．ＧＦＰ二本鎖Ｉ（（標的部位：ＴＤ１（配列番号７７）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、カタログ番号Ｐ−００２０４８−０１−２０）（配列番号７８（センス鎖）および配列番号７９（アンチセンス鎖））。
７．ＴＣＴＬ（標的部位：ＴＣＴＬ（配列番号８０）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、配列番号８１（センス鎖）および配列番号８２（アンチセンス鎖））。
各試験において、試験プラスミド内に標的部位を有するｓｉＲＮＡをｓｉＲＮＡ＋として用い、試験プラスミド内に対応する標的部位を持たない他方のｓｉＲＮＡをｓｉＲＮＡ−として用いた。
陰性対照プラスミド：
１．Ｅ３４（配列番号１０）−Ｐｃｍｖ−４ＯＲＦ＾−ＴＤ１−Ｔｆｌｕｃ−−−Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ。
２．Ｅ７１（配列番号１７）−Ｐｓｖ４０−イントロン−４ＯＲＦ＾−−−Ｐｈｓｖｔｋ−Ｆｌｕｃ。
３．Ｅ３８−３ＣＡＲｚ−４Ｓ＆Ｌ。Ｅ３８の挿入配列（配列番号１９）をＰＭＫシャトルベクター（ＧｅｎｅＡｒｔ）のｐａｃＩおよびＸｈｏＩ制限部位に連結した。
陽性対照プラスミド：
１．Ｅ２８（配列番号１１）−Ｐｃｍｖ−Ｔｆｌｕｃ−ＴＤ１−ｃＤＴＡＷＴ−−−Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ。
２．Ｅ２０（配列番号１２）−Ｐｃｍｖ−ｎｓＤＴＡ−−−Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ。
３．Ｅ７０（配列番号１３）−Ｐｓｖ４０−イントロン−ｃＤＴＡＷＴ−−−Ｐｈｓｖｔｋ−Ｆｌｕｃ。
４．Ｅ３（配列番号１４）−Ｐｃｍｖ−ＫＤＴＡ−−−Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ。
５．Ｅ８９（配列番号１５）−Ｐｃｍｖ−−−ＤＴ＾Ａ−−−Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ。
６．Ｅ１１０（配列番号１６）−Ｐｃｍｖ−Ｄ５＾ＴＡ−−−Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ。
７．Ｅ４（配列番号１８）−Ｐｃｍｖ−ＫＤＴＡ−−−Ｐｓｖ４０−Ｈｙｇｒｏ。
８．Ｅ１０（配列番号２０）−Ｐｅｆ１−ＤＴＡ２４−−−ＺＥＯ：：ＧＦＰ−Ｐｃｍｖ。
９．Ｅ１４３（配列番号２１）−３ポリＡ−Ｐｒｐｌ１９−ｃＤＴＡＷＴ−−−Ｐｈｓｖｔｋ−Ｆｌｕｃ。
試験プラスミド
１．Ｅ８０（配列番号１）−Ｐｃｍｖ−４ＯＲＦ＾−ＴＤ１−Ｔｆｌｕｃ−Ｓ−ｃＤＴＡＷＴ−−−Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ（ｐＣＭＶプロモーター（配列番号１のｎｔ４２０〜９３８）；４ＯＲＦ＾＝４つの連続するＯＲＦ内に、隣接するＡＴＧコドン間の５７、５７、３６、３６、２１、２１、２１および２１ｎｔとともに９つのＴＩＳＵ配列および５７のｋｏｚａｋ配列から構成される阻害配列（配列番号１のｎｔ１０２７〜３５４７）。第１のＯＲＦ（配列番号１のｎｔ１０３１〜１６５１）は６２１ｎｔであり、ＴＩＳＵ（配列番号１のｎｔ１０２７〜１０３８）から翻訳され、次の３ＯＲＦ＾（配列番号１のｎｔ１６６２〜２９９６、ｎｔ２３０６〜２９４１およびｎｔ２９５１〜３５４７）はＫｏｚａｋ配列から翻訳され、最後のＯＲＦ（配列番号１のｎｔ２９５１〜３５４７）は、野生型ＤＴＡのコード配列（ｃＤＴＡｗｔ＝プロモーター／スプライシング／終結／ポリＡ部位を持たず、ｋｏｚａｋ配列を持つｗｔ ＤＴＡコード領域（配列番号１の３５６８〜４１５５）の前で停止する、その後に、ＳＶ４０プロモーターの制御下のＴＧＦＰコード配列））。このプラスミドはさらに、標的部位ＴＤ１（配列番号７７）およびＴｆｌｕｃ（配列番号７４）を含む。
２．Ｅ５４（配列番号２）−Ｐｃｍｖ−４ＣＡＲＺ−ＰＴＳ−６０ＡＴＧ＾−３ＯＲＦ＾−ＴＤ１−Ｔｆｌｕｃ−ｉｎｃＤＴＡＷＴ−−−Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ（ｐＣＭＶプロモーター（配列番号２のヌクレオチド（ｎｔ）４２０〜９３８）；４ＣＡＲ＝４つのシス作用リボザイム（配列番号２のｎｔ１０１３〜１３７３）；ＰＴＳ＝ペルオキシソーム標的化シグナル（配列番号２のｎｔ１４２０〜１５００）；６０ＡＴＧ＾＝６１ＡＴＧ、ほぼ全ての２ＡＴＧ間に５３ｎｔ（配列番号２のｎｔ１５３４〜４５５４）とＤＴＡコード配列（配列番号２のｎｔ６７４５〜７３３２）内に終止コドンを有するＫｏｚａｋ配列内の４６；ｐｓｖ４０プロモーター（配列番号２のｎｔ８０９２〜８３９９）の制御下のＴＧＦＰコード配列（配列番号２のｎｔ８４５２〜９１４３））。このプラスミドはさらに、標的部位ＴＤ１（配列番号７７）およびＴｆｌｕｃ（配列番号７４）を含む。
３．Ｅ１１３（配列番号３）−Ｐｃｍｖ−４ＯＲＦ＾−ＴＤ１−Ｔｆｌｕｃ−ＰＫ−Ｄ５＾ＴＡ−−−Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ（ｐＣＭＶプロモーター（配列番号３のｎｔ４２０〜９３８）；４ＯＲＦ＾（配列番号３のｎｔ１０２７〜３５４７）；ＰＫ＝シュードノット、すなわち、ステムとループ、この場合、６ｎｔのループがＤＴＡ（配列番号３のｎｔ３５６１〜３６１１）の開始コドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）とハイブリダイズする；５＾＝ＤＴＡ（配列番号３のｎｔ３６０９〜３８０６）のコード配列内に位置し、ＲＮＡポリメラーゼ１および／または３の転写を終結させるためのＴリッチ配列を含む５つのヒトイントロン（配列番号３のｎｔ３７１２〜３８０１、３８５６〜３９６０、４０６６〜４１７３、４３８０〜４５１９および４６１７〜４７８３）、これらのイントロンはｃＤＴＡｗｔコード配列内に埋め込まれている；ｐｓｖ４０プロモーター（配列番号３のｎｔ５５４６〜５８５３）の制御下のＴＧＦＰコード配列（配列番号３のｎｔ５９０６〜６５９７））。このプラスミドはさらに、標的部位ＴＤ１（配列番号７７）およびＴｆｌｕｃ（配列番号７４）を含む。
４．Ｅ９１（配列番号４）−Ｐｃｍｖ−４ＯＲＦ＾−ＴＤ１−Ｔｆｌｕｃ−ＤＴ＾Ａ−−−Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ（ｐＣＭＶプロモーター（配列番号４のｎｔ４２０〜９３８）、４ＯＲＦ＾（配列番号４のｎｔ１０２７〜３５０７）；ＤＴ＾Ａ＝ヒトコラーゲン１６Ａ１遺伝子由来のイントロンを持ち、プロモーター／スプライシング／ポリＡシグナル（配列番号４のｎｔ３５２０〜４４４４）を持たないｋｏｚａｋ ＤＴＡ；ｐＳＶ４０プロモーター（ｎｔ５１８４〜５４９１）の制御下のＴＧＦＰコード配列（配列番号４のｎｔ５５４４〜６２３５））。このプラスミドはさらに、標的部位ＴＤ１（配列番号７７）およびＴｆｌｕｃ（配列番号７４）を含む。
５．Ｅ１１２（配列番号５）−Ｐｃｍｖ−４ＯＲＦ＾−２ｘＴＬａｃＺｉｎＩＮＴＲＯＮ−８Ｘ［ＴＣＴＬ＋ＴＤ１］−ＰＫ−Ｄ５＾ＴＡ−−−Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ（ｐＣＭＶプロモーター（配列番号５のｎｔ４２０〜９３８）、４ＯＲＦ＾（配列番号５のｎｔ１０２７〜３４３６）；２ｘＴＬａｃＺｉｎＩＮＴＲＯＮ＝市販のプラスミドｐＳＥＬＥＣＴ−ＧＦＰｚｅｏ−ＬａｃＺのイントロン内のＴＬａｃＺの２つの標的（配列番号５のｎｔ３４３８〜３６３８）；８Ｘ［ＴＣＴＬ＋ＴＤ１］（配列番号５のｎｔ３６４７〜４０５２）；ＰＫ＝シュードノット、すなわち、ステムとループ、この場合、６ｎｔのループがＤＴＡ（配列番号５のｎｔ４０５９〜４１０９）の開始コドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）とハイブリダイズする；５＾＝ＤＴＡのコード配列（配列番号５のｎｔ４１０７〜５３０４）内に位置し、ＲＮＡポリメラーゼ１および／または３の転写を終結させるためのＴリッチ配列を含む５つのヒトイントロン（配列番号５のｎｔ４２１０〜４２９９、４３５４〜４４５８、４５６４〜４６７１、４８７８〜５０１７および５１１５〜５２８１）、これらのイントロンはｃＤＴＡｗｔコード配列に埋め込まれている；ｐｓｖ４０プロモーター（配列番号５のｎｔ６０４４〜６３５１）の制御下のＴＧＦＰコード配列（配列番号５のｎｔ６４０４〜７０９５））。このプラスミドはさらに、８コピーの標的部位ＴＤ１（配列番号７７）、ＴＣＴＬ（配列番号８０）および２コピーのＴＬａｃＺ（配列番号７１）を含む。
６．Ｅ８７（配列番号６）−Ｐｃｍｖ−４ＯＲＦ＾−ＴＤ１−３ＴＬａｃＺ−Ｔｃｔｌ−ＢＧｌｏｂ−２５Ｇ−ＸＲＮ１Ｓ＆Ｌ−ＤＴ＾Ａ−−−Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ（ｐＣＭＶプロモーター（配列番号６のｎｔ４２０〜９３８）；４ＯＲＦ＾（配列番号６のｎｔ１０２７〜３４３０）；ＢＧｌｏｂ＝キャップされているβグロビン５′末端切断型末端（配列番号６のｎｔ３５７７〜３６５５）。２５Ｇ＝ＸＲＮエキソリボヌクレアーゼ酵素で遮断／干渉可能な２５の連続するＧヌクレオチドのストレッチ（配列番号６のｎｔ３６６０〜３６８４）；ＸＲＮ１Ｓ＆Ｌ＝ＸＲＮ１エキソリボヌクレアーゼを遮断することができる黄熱病ウイルス３′ＵＴＲのステムおよびループ構造（配列番号６のｎｔ３６８７〜３７６７）。ＤＴ＾Ａ＝ヒトコラーゲン１６Ａ１遺伝子由来のイントロンを持ち、プロモーター／スプライシング／ポリＡシグナルを持たないｋｏｚａｋ ＤＴＡ（配列番号６のｎｔ３７８７〜４７１１）；ｐｓｖ４０プロモーター（配列番号６のｎｔ５８１１〜６５０２）の制御下のＴＧＦＰコード配列（配列番号６のｎｔ６４０４〜７０９５））。このプラスミドはさらに、ＴＤ１（配列番号７７）、３コピーのＴＬａｃｚ（配列番号７１）およびＴＣＴＬ標的部位（配列番号８０）を含む。
７．Ｅ１２３（配列番号７）−Ｐｓｖ４０−イントロン−４ＯＲＦ＾−３Ｘ［ＴＤ１−ＴＬａｃＺ］−４ＰＴＥ−ＳＶ４０イントロン−ＨＢＢ−ＤＴＡ−−−Ｐｈｓｖｔｋ−Ｆｌｕｃ（ｐＳＶ４０プロモーター（配列番号７のｎｔ７〜４１９）、４ＯＲＦ＾＝４つの連続するＯＲＦ内に、隣接するＡＴＧコドン間の５７、５７、３６、３６、２１、２１、２１および２１ｎｔとともに９つのＴＩＳＵ配列および５７のｋｏｚａｋ配列（配列番号７のｎｔ７２２〜２３８７）；４ＰＴＥ＝回文型終結エレメントの４種類のステムおよびループ構造（配列番号７のｎｔ３３１８〜３４７３）。ＳＶ４０イントロン＝ＳＶ４０小型ｔ抗原イントロン（配列番号７のｎｔ３５０５〜３５９６）；ＨＢＢ＝ＡＴＧを持たず、その第１のイントロンを含むヘモグロビンβｍＲＮＡ（配列番号７のｎｔ３６２７〜４４０６）；ｃＤＴＡｗｔコード配列（配列番号７のｎｔ４４３１〜５０１４）；ＨＳＫＶＫプロモーター（配列番号７のｎｔ５１０６〜５８５８）およびホタルルシフェラーゼコード配列（配列番号７のｎｔ５８９４〜７５４６））。このプラスミドはさらに、３コピーのＴＤ１（配列番号７７）およびＴＬａｃｚ標的部位（配列番号７１）を含む。
８．Ｅ３０（配列番号８）−Ｐｃｍｖ−４ＯＲＦ＾−ＴＤ１−Ｔｆｌｕｃ−ｉｎｃＤＴＡＷＴ−−−Ｐｓｖ４０−ＴＧＦＰ（ｐＣＭＶプロモーター（配列番号８のｎｔ４２０〜９３８）；４ＯＲＦ＾＝４つの連続するＯＲＦ内に、隣接するＡＴＧコドン間の５７、５７、３６、３６、２１、２１、２１および２１ｎｔとともに９つのＴＩＳＵ配列および５７のｋｏｚａｋ配列（配列番号８のｎｔ１０２７〜３５４７）。第１のＯＲＦ（配列番号８のｎｔ１０３１〜１６５１）はＴＩＳＵ（配列番号８のｎｔ１０２７〜１０３８）から翻訳され、次の３ＯＲＦ＾（配列番号８のｎｔ１６６２〜２９９６、ｎｔ２３０６〜２９４１およびｎｔ２９５１〜３５４７）はＫｏｚａｋ配列から翻訳され、最後のＯＲＦ（配列番号８のｎｔ２９５１〜３５１６）は野生型ＤＴＡのコード配列（ｃＤＴＡｗｔ＝プロモーター／スプライシング／終結／ポリＡ部位を持たず、ｋｏｚａｋ配列を持つｗｔ ＤＴＡコード領域（配列番号８のｎｔ３５６８〜４１５５）内で停止する、その後に、ＳＶ４０プロモーターの制御下のＴＧＦＰコード配列））。このプラスミドはさらに、標的部位ＴＤ１（配列番号７７）およびＴｆｌｕｃ（配列番号７４）を含む。
９．Ｅ１４２（配列番号９）−３ポリＡ−Ｐｒｐｌ１９−４ＯＲＦ＾−ＴＤ１−Ｔｆｌｕｃ−Ｓ−ｃＤＴＡＷＴ−−−Ｐｈｓｖｔｋ−Ｆｌｕｃ。３ポリＡ＝ＨＳＶポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、合成ポリＡ（配列番号９のｎｔ６０〜２４７）；Ｐｒｐｌ１９＝その第１のイントロンとともに採取されたＲＰＬ１９のプロモーター（リボゾームタンパク質Ｌ１９）（配列番号９のｎｔ２４８〜１９４１）；４ＯＲＦ＾＝４つの連続するＯＲＦ内に、隣接するＡＴＧコドン間の５７、５７、３６、３６、２１、２１、２１および２１ｎｔとともに９つのＴＩＳＵ配列および５７のｋｏｚａｋ配列（配列番号９のｎｔ１９４８〜４３６６）；野生型ＤＴＡのコード配列（配列番号９のｎｔ４４５７〜５０４４）；ＨＳＫＶＫプロモーター（配列番号９のｎｔ５１３６〜５８８８）およびホタルルシフェラーゼコード配列（配列番号９のｎｔ５９２４〜７５７６）。このプラスミドはさらに、標的部位ＴＤ１（配列番号７７）およびＴｆｌｕｃ（配列番号７４）を含む。
結果：
これらの結果は、下記表１〜５および６Ａ−Ｃに示されている。これらの結果は、種々の試験条件下で示されているプラスミドとｓｉＲＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞において測定されたＲＬＵを示す。使用したｓｉＲＮＡ＋分子は、試験プラスミド内のそれらの対応する標的配列と結合することができるｓｉＲＮＡ分子である。
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表６Ａ〜６Ｃに関して：
＊＝２種類のｓｉＲＮＡ＋が有意な活性化を示すことを示す
＊＊＝１５５ｎｇのプラスミドＥ３８（配列番号１９）でも同時トランスフェクションを行った。
上記表１〜５および６Ａ〜６Ｃで示される結果は、対象外来性ＲＮＡの切断を誘発することができるｓｉＲＮＡ分子の存在下で、対象外来性タンパク質（ＤＴＡ）が発現され、細胞死の増大をもたらすことを明らかに示す。細胞死の増大の結果、ルシフェラーゼ遺伝子を発現／生産する細胞が少なくなるので、ウェルの総ＲＬＵ測定値が低下する。これらの結果は、実際に、特異的ｓｉＲＮＡを含む細胞だけに、対象外来性タンパク質（本実施例ではＤＴＡ）が発現されることを示すが、これは、これらの細胞だけに切断部位での対象外来性ＲＮＡの切断が誘導され、それにより、それらの細胞において対象外来性タンパク質の発現が可能となるためである。
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３０． Ｓｕｒｅｓｈ ｓｕｂｒａｍａｎｉ， １９９８， Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｉｍｐｏｒｔ， Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ， Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， Ｔｕｒｎｏｖｅｒ， ａｎｄ Ｍｏｖｅｍｅｎｔ， ＰＨＹＳＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＲＥＶＩＥＷＳ ７８： １７１−１８８．
３１． Ｉｓｋｅｎ Ｏ， Ｍａｑｕａｔ ＬＥ， ２００７， Ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｍＲＮＡ： ｓａｆｅｇｕａｒｄｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｂｎｏｒｍａｌ ｍＲＮＡ ｆｕｎｃｔｉｏｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２１， １５：１８３３−５６．
３２． Ｚｈｅｎｇ Ｈ， Ｌｉ ＬＬ， Ｈｕ ＤＳ， Ｄｅｎｇ ＸＹ， Ｃａｏ Ｙ， ２００７， Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ， Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ３： １８５−９６．
３３． Ｍｅｉ ＹＰ， Ｚｈｏｕ ＪＭ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｈｕａｎｇ Ｈ， Ｄｅｎｇ Ｒ， Ｆｅｎｇ ＧＫ， Ｚｅｎｇ ＹＸ， Ｚｈｕ ＸＦ， ２００７， Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＬＭＰ１ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＡＫＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ＥＢＶ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ， Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ６， １１： １３７９−８５．
３４． Ｊａｃｑｕｅ ＪＭ， Ｔｒｉｑｕｅｓ Ｋ， Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ Ｍ， ２００２， Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ−１ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ， Ｎａｔｕｒｅ ４１８， ６８９６： ４３５−８．
３５． Ｚｅｎｇ Ｙ， Ｗａｇｎｅｒ ＥＪ， Ｃｕｌｌｅｎ ＢＲ， ２００２， Ｂｏｔｈ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｍｉｃｒｏ ＲＮＡｓ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｏｇｎａｔｅ ｍＲＮＡｓ ｗｈｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６： １３２７−３３．
３６． Ｊｏｅｌ Ｄ． Ｒｉｃｈｔｅｒ， ２００１， Ｔｈｉｎｋ ｇｌｏｂａｌｌｙ， ｔｒａｎｓｌａｔｅ ｌｏｃａｌｌｙ： Ｗｈａｔ ｍｉｔｏｔｉｃ ｓｐｉｎｄｌｅｓ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｙｎａｐｓｅｓ ｈａｖｅ ｉｎ ｃｏｍｍｏｎ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９８， １３： ７０６９−７０７１．
３７． Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ． Ｗｏｌｌｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｓａｎｆｏｒｄ Ｍ． Ｓｉｍｏｎ， ２００４， Ｓｉｇｎａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｔＲＮＡ Ｐｒｉｏｒ ｔｏ Ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌｏｃｏｎ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ．２７９： ２４９１９−２４９２２．
３８． Ｄａｎ Ｆｒｕｍｋｉｎ， Ａｄａｍ Ｗａｓｓｅｒｓｔｒｏｍ， Ｓｈａｌｅｖ Ｉｔｚｋｏｖｉｔｚ， Ｔｏｍｅｒ Ｓｔｅｒｎ， Ａｌｏｎ Ｈａｒｍｅｌｉｎ， Ｒａｙａ Ｅｉｌａｍ， Ｇｉｄｅｏｎ Ｒｅｃｈａｖｉ ａｎｄ Ｅｈｕｄ Ｓｈａｐｉｒｏ， ２００８， Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｔｕｍｏｒ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６８： ５９２４−５９３１．
３９． Ｅｌｆａｋｅｓｓ Ｒ， Ｄｉｋｓｔｅｉｎ Ｒ． （２００８）． Ａ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｍＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ｖｅｒｙ ｓｈｏｒｔ ５′ＵＴＲ ｔｈａｔ ａｌｓｏ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ． ＰｌｏＳ Ｏｎｅ． ２００８ Ａｕｇ ２８；３（８）：ｅ３０９４．

Claims (69)

  1. 対象外来性ＲＮＡの特定の標的部位での特異的切断を指示するための１以上のポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記切断が細胞内に内在性シグナルＲＮＡが存在する場合にのみ起こり、前記内在性シグナルＲＮＡが、シグナル配列を含むＲＮＡ分子であり、前記シグナル配列が１８〜２５ヌクレオチド長の任意の所定配列であり、
    これにより、前記組成物を前記内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に導入することで、特定の配列内に位置する特定の標的部位での前記対象外来性ＲＮＡの切断が指示され、前記特定の配列は所定シグナル配列とハイブリダイズするために十分な相補性がある、組成物。
  2. 前記１以上のポリヌクレオチドが、
    前記対象外来性ＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチド配列；
    所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を媒介し得る機能的ＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチド配列；および
    キャリアＲＮＡをコードする第３のポリヌクレオチド配列
    を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記キャリアＲＮＡが少なくとも約１８ヌクレオチド長のＲＮＡ分子であって、かつ、前記ＲＮＡ分子が、
    （１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド下流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の下流に延びる）；
    （２）前記第１の配列の下流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；
    （３）前記第１の配列の上流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
    から本質的になり；かつ
    前記所定切断部位が前記所定シグナル配列の５′末端である、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記キャリアＲＮＡが少なくとも約１８ヌクレオチド長のＲＮＡ分子を含み、かつ、前記ＲＮＡ分子が、
    （１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド上流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延びる）；
    （２）前記第１の配列の上流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；
    （３）前記第１の配列の下流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
    から本質的になり；かつ
    前記所定切断部位が前記所定シグナル配列の３′末端である、請求項２に記載の組成物。
  5. 前記キャリアＲＮＡが少なくとも約１８ヌクレオチド長のキャリア配列を含むポリヌクレオチド配列からプロセシングされ、前記キャリア配列が、
    （１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド下流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の下流に延びる）；
    （２）前記第１の配列の下流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；および
    （３）前記第１の配列の上流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
    から本質的になり；
    前記ポリヌクレオチド配列が、細胞内において、前記キャリア配列の３′末端であるキャリア切断部位で切断され；
    前記キャリア切断部位での切断が、前記組成物の第４のポリヌクレオチド配列によりコードされている機能的核酸によって果たされ；かつ
    前記所定切断部位が前記所定シグナル配列の５′末端である、請求項２に記載の組成物。
  6. 前記キャリアＲＮＡが少なくとも約１８ヌクレオチド長のキャリア配列を含むポリヌクレオチド配列からプロセシングされ、前記キャリア配列が、
    （１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド上流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延びる）；
    （２）前記第１の配列の上流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；および
    （３）前記第１の配列の下流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
    から本質的になり；
    前記ポリヌクレオチド配列が、細胞内において、前記キャリア配列の５′末端であるキャリア切断部位で切断され；
    前記キャリア切断部位での切断が、前記組成物の第４のポリヌクレオチド配列によりコードされている機能的核酸によって果たされ；かつ
    前記所定切断部位が前記所定シグナル配列の３′末端である、請求項２に記載の組成物。
  7. 前記エッジ配列が２３〜２８ヌクレオチド長であって、所定切断部位から約２３〜２８ヌクレオチド下流までに位置し、前記第２の配列が２ヌクレオチド長であり、かつ、前記第３の配列が０ヌクレオチド長である、請求項３または５に記載の組成物。
  8. 前記エッジ配列が２５〜３０ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から２ヌクレオチド上流に位置し、前記内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延び、前記第２の配列が０ヌクレオチド長であり、かつ、前記第３の配列が０ヌクレオチド長である、請求項４または６に記載の組成物。
  9. 前記内在性シグナルＲＮＡが細胞ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡまたはその双方である、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記所定シグナル配列が新生細胞、ウイルス感染細胞またはその双方に独特なものである、請求項１に記載の組成物。
  11. 十分な相補性が少なくとも３０％の相補性である、請求項１に記載の組成物。
  12. 前記十分な相補性が少なくとも９０％である、請求項１に記載の組成物。
  13. 前記１以上のポリヌクレオチドが１以上のＤＮＡ分子、１以上のＲＮＡ分子またはその組合せを含む、請求項１に記載の組成物。
  14. 前記機能的ＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、投げ輪型ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびリボザイムからなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
  15. 前記対象外来性ＲＮＡが、
    （ａ）対象外来性タンパク質をコードする配列；および
    （ｂ）前記対象外来性タンパク質の発現を阻害し得る阻害配列
    をさらに含み、
    前記特定の標的部位が前記阻害配列と前記対象外来性タンパク質をコードする配列の間に位置し、これにより、前記組成物を内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に導入した後に、前記対象外来性ＲＮＡが転写され、前記特定の標的部位で切断され、それにより、前記阻害配列が前記対象外来性タンパク質をコードする配列から分離され、対象外来性タンパク質が発現され得る、請求項１に記載の組成物。
  16. 前記対象外来性タンパク質が、リシン、リシンＡ鎖、アブリン、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素Ａ鎖およびそれらの改変形態からなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記対象外来性タンパク質が、アルファトキシン、サポリン、トウモロコシＲＩＰ（ｍａｉｚｅ ＲＩＰ）、オオムギＲＩＰ、コムギＲＩＰ、トウモロコシＲＩＰ（ｃｏｒｎ ＲＩＰ）、ライムギＲＩＰ、アマＲＩＰ、志賀毒素、志賀毒素様ＲＩＰ、モモルジン、チミジンキナーゼ、ブタクサ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、シュードモナス外毒素、シュードモナス外毒素Ａ、大腸菌シトシンデアミナーゼおよびそれらの改変形態からなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
  18. 前記阻害配列が前記特定の標的部位の上流に位置し、かつ、前記阻害配列が前記対象外来性タンパク質の翻訳効率を低減する、請求項１５に記載の組成物。
  19. 前記阻害配列が複数の開始コドンを含み、前記開始コドンのそれぞれと前記対象外来性タンパク質をコードする配列が同じリーディングフレームにない、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記対象外来性ＲＮＡが、前記開始コドンと前記対象外来性タンパク質をコードする配列の最初のコドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）との間に位置する終止コドンをさらに含み、前記終止コドンと前記開始コドンが同じリーディングフレームにある、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記阻害配列が開始コドンの下流にヌクレオチド配列をさらに含み、前記ヌクレオチド配列と前記開始コドンが同じリーディングフレームにあり、かつ、前記ヌクレオチド配列が細胞内局在のための選別シグナルをコードする、請求項１９に記載の組成物。
  22. 前記細胞内局在がミトコンドリア、核、エンドソーム、リソソーム、ペルオキシソームおよび小胞体（ＥＲ）からなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記阻害配列が開始コドンの下流にヌクレオチド配列をさらに含み、前記ヌクレオチド配列と前記開始コドンが同じリーディングフレームにあり、かつ、前記ヌクレオチド配列がタンパク質分解シグナルをコードする、請求項１９に記載の組成物。
  24. 前記阻害配列が開始コドンの下流にヌクレオチド配列をさらに含み、前記ヌクレオチド配列と前記開始コドンが同じリーディングフレームにあり、前記ヌクレオチド配列と前記対象外来性タンパク質をコードする配列が同じリーディングフレームにあり、前記ヌクレオチド配列があるアミノ酸配列をコードし、これにより、前記アミノ酸配列が前記対象外来性タンパク質に融合されると、前記対象外来性タンパク質の生物学的機能が阻害される、請求項１９に記載の組成物。
  25. 前記対象外来性ＲＮＡが前記開始コドンの下流に終止コドンをさらに含み、前記終止コドンと前記開始コドンが同じリーディングフレームにあり、かつ、前記対象外来性ＲＮＡが前記終止コドンの下流にイントロンをさらに含み、これにより、前記対象外来性ＲＮＡがナンセンス依存分解（ＮＭＤ）の標的となる、請求項１９に記載の組成物。
  26. 前記阻害配列が前記対象外来性タンパク質をコードする配列の下流に位置し、前記阻害配列が細胞内局在のためのＲＮＡ局在化シグナルまたは内在性ｍｉＲＮＡ結合部位を含む、請求項１５に記載の組成物。
  27. 前記対象外来性ＲＮＡが前記特定の切断部位の下流であって、かつ、前記対象外来性タンパク質をコードする配列の上流に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含み、前記ＩＲＥＳ配列が完全な対象外来性ＲＮＡ内よりも切断された対象外来性ＲＮＡ内でより機能的となる、請求項１５に記載の組成物。
  28. 前記対象外来性ＲＮＡが前記対象外来性タンパク質をコードする配列からすぐ上流にヌクレオチド配列をさらに含み、前記ヌクレオチド配列が切断された対象外来性ＲＮＡにおける前記対象外来性タンパク質の翻訳効率を高め得る内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含む、請求項１５に記載の組成物。
  29. 前記対象外来性ＲＮＡが前記対象外来性タンパク質をコードする配列からすぐ下流に位置する細胞質ポリアデニル化エレメントを含むヌクレオチド配列をさらに含み、前記細胞質ポリアデニル化エレメントが切断された対象外来性ＲＮＡにおける前記対象外来性タンパク質の翻訳効率を高める、請求項１５に記載の組成物。
  30. 前記組成物が付加的ＲＮＡ分子をコードする付加的ポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記付加的ＲＮＡ分子がその３′末端に、前記特定の標的部位の上流であって、かつ、前記対象外来性タンパク質をコードする配列の下流に位置する配列に結合し得るヌクレオチド配列を含み、前記付加的ＲＮＡ分子が、切断された対象外来性ＲＮＡにおける前記対象外来性タンパク質の翻訳効率を高める、請求項１５に記載の組成物。
  31. 前記組成物が阻害配列の上流に位置する位置での前記対象外来性ＲＮＡの切断を果たし得る切断成分をコードする付加的ポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記切断成分が
    （ａ）前記対象外来性ＲＮＡ内に位置し、エンドヌクレアーゼ認識部位、内在性ｍｉＲＮＡ結合部位、シス作用リボザイムおよびｍｉＲＮＡ配列からなる群から選択され、前記対象外来性ＲＮＡにおける前記対象外来性タンパク質の翻訳効率を低減する、核酸配列；
    （ｂ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、投げ輪型ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびリボザイムからなる群から選択され、前記対象外来性ＲＮＡにおける前記対象外来性タンパク質の翻訳効率を低減する、阻害ＲＮＡ
    からなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
  32. 前記特定の配列が複数の特定の配列であり、前記特定の標的部位が複数の特定の標的部位である、請求項１５に記載の組成物。
  33. 前記阻害配列が前記対象外来性タンパク質をコードする配列の上流に位置し、前記阻害配列が折畳み自由エネルギーが−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である二次構造を形成することができ、これにより、前記二次構造が、読み取りリボソームが前記対象外来性タンパク質の最初のコドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）に達しないよう遮断するために十分なものとなる、請求項１５に記載の組成物。
  34. 前記対象外来性ＲＮＡと前記機能的ＲＮＡを同じまたは異なるポリヌクレオチド分子上に位置させることができる、請求項２に記載の組成物。
  35. 前記対象外来性ＲＮＡ、機能的ＲＮＡおよび機能的核酸を１以上のポリヌクレオチド分子上に位置させることができる、請求項５または６に記載の組成物。
  36. 前記１以上のポリヌクレオチドが細胞ゲノムに組み込まれる、請求項１に記載の組成物。
  37. 前記細胞がヒト細胞、動物細胞、培養細胞および植物細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
  38. 前記細胞が生物体内に存在する、請求項１に記載の組成物。
  39. 細胞において対象外来性タンパク質の特異的発現を指示するための１以上のポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記対象外来性タンパク質が細胞に内在性シグナルＲＮＡが存在する場合にのみ発現され、前記内在性シグナルＲＮＡがシグナル配列を含むＲＮＡ分子であり、前記シグナル配列が１８〜２５ヌクレオチド長の任意の所定配列であり、これにより、前記組成物を前記内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に導入することで、特定の配列内に位置する特定の標的部位での対象外来性ＲＮＡの切断が指示され、前記特定の配列は所定シグナル配列とハイブリダイズするために十分な相補性があり、細胞において前記対象外来性ＲＮＡが切断された後にのみ、前記切断された対象外来性ＲＮＡによりコードされている対象外来性タンパク質がその細胞において発現され得る、組成物。
  40. 前記１以上のポリヌクレオチドが、
    前記対象外来性ＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチド配列；
    所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を媒介し得る機能的ＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチド配列；および
    キャリアＲＮＡをコードする第３のポリヌクレオチド配列
    を含む、請求項３９に記載の組成物。
  41. 前記キャリアＲＮＡが少なくとも約１８ヌクレオチド長のＲＮＡ分子であって、かつ、前記ＲＮＡ分子が、
    （１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド下流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の下流に延びる）
    （２）前記第１の配列の下流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；および
    （３）前記第１の配列の上流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
    から本質的になる、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記キャリアＲＮＡが少なくとも約１８ヌクレオチド長のＲＮＡ分子を含み、かつ、前記ＲＮＡ分子が、
    （１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド上流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延びる）
    （２）前記第１の配列の上流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；および
    （３）前記第１の配列の下流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
    から本質的になる、請求項４０に記載の組成物。
  43. 前記キャリアＲＮＡが少なくとも約１８ヌクレオチド長のキャリア配列を含むポリヌクレオチド配列からプロセシングされ、前記キャリア配列が、
    （１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド下流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の下流に延びる）
    （２）前記第１の配列の下流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；および
    （３）前記第１の配列の上流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
    から本質的になり、
    前記ポリヌクレオチド配列が、細胞内において、前記キャリア配列の３′末端であるキャリア切断部位で切断され；かつ
    前記キャリア切断部位での切断が、前記組成物の第４のポリヌクレオチド配列によりコードされている機能的核酸によって果たされる、請求項４０に記載の組成物。
  44. 前記キャリアＲＮＡが、少なくとも約１８ヌクレオチド長のキャリア配列を含むポリヌクレオチド配列からプロセシングされ、前記キャリア配列が、
    （１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド上流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延びる）
    （２）前記第１の配列の上流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；および
    （３）前記第１の配列の下流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
    から本質的になり、
    前記ポリヌクレオチド配列が、細胞内において、前記キャリア配列の５′末端であるキャリア切断部位で切断され；かつ
    前記キャリア切断部位での切断が、前記組成物の第４のポリヌクレオチド配列によりコードされている機能的核酸によって果たされる、請求項４０に記載の組成物。
  45. 前記対象外来性ＲＮＡが、
    ａ）前記対象外来性タンパク質をコードする配列；および
    ｂ）対象外来性タンパク質の発現を阻害し得る阻害配列
    をさらに含み、
    前記特定の標的部位が、前記阻害配列と前記対象外来性タンパク質をコードする配列の間に位置し、これにより、前記組成物を内在性シグナルＲＮＡを含む細胞に導入した後に、前記対象外来性ＲＮＡが転写され、前記特定の標的部位で切断され、それにより、前記阻害配列が前記対象外来性タンパク質をコードする配列から分離され、対象外来性タンパク質が発現され得る、請求項３９に記載の組成物。
  46. 前記内在性シグナルＲＮＡが細胞ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡまたはその双方である、請求項３９に記載の組成物。
  47. 前記所定シグナル配列が新生細胞、ウイルス感染細胞またはその双方である、請求項３９に記載の組成物。
  48. 十分な相補性が少なくとも３０％の相補性である、請求項３９に記載の組成物。
  49. 前記十分な相補性が少なくとも９０％である、請求項３９に記載の組成物。
  50. 前記１以上のポリヌクレオチドが１以上のＤＮＡ分子、１以上のＲＮＡ分子またはその組合せを含む、請求項３９に記載の組成物。
  51. 前記対象外来性タンパク質がリシン、リシンＡ鎖、アブリン、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素Ａ鎖、アルファトキシン、サポリン、トウモロコシＲＩＰ（ｍａｉｚｅ ＲＩＰ）、オオムギＲＩＰ、コムギＲＩＰ、トウモロコシＲＩＰ（ｃｏｒｎ ＲＩＰ）、ライムギＲＩＰ、アマＲＩＰ、志賀毒素、志賀毒素様ＲＩＰ、モモルジン、チミジンキナーゼ、ブタクサ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、シュードモナス外毒素、シュードモナス外毒素Ａ、大腸菌シトシンデアミナーゼおよびそれらの改変形からなる群から選択される、請求項３９に記載の組成物。
  52. 前記機能的ＲＮＡがマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、投げ輪型ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびリボザイムからなる群から選択される、請求項３９に記載の組成物。
  53. 前記細胞がヒト細胞、動物細胞、培養細胞および植物細胞から選択される、請求項４２に記載の組成物。
  54. 前記細胞が生物体に存在する、請求項４２に記載の組成物。
  55. 内在性シグナルＲＮＡを含む特異的細胞集団を死滅させる方法であって、前記細胞集団に、対象外来性ＲＮＡの、特定の配列内に位置する特定の標的部位での特異的切断を指示するための１以上のポリヌクレオチドを含む組成物を導入することを含み、前記特定の配列が前記内在性シグナルＲＮＡとハイブリダイズするために十分な相補性があり、前記内在性シグナルＲＮＡがシグナル配列を含むＲＮＡ分子であり、前記シグナル配列が１８〜２５ヌクレオチド長の任意の所定配列であり；
    前記細胞集団において対象外来性ＲＮＡが切断されると、前記細胞集団を死滅させ得る対象外来性タンパク質の発現が可能となる、方法。
  56. 前記１以上のポリヌクレオチドが、
    前記対象外来性ＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチド配列；
    所定切断部位での内在性シグナルＲＮＡの切断を媒介し得る機能的ＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチド配列；および
    キャリアＲＮＡをコードする第３のポリヌクレオチド配列
    を含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記キャリアＲＮＡが少なくとも約１８ヌクレオチド長のＲＮＡ分子であって、かつ、前記ＲＮＡ分子が
    （１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド下流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の下流に延びる）
    （２）前記第１の配列の下流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；および
    （３）前記第１の配列の上流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
    から本質的になる、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記キャリアＲＮＡが少なくとも約１８ヌクレオチド長のＲＮＡ分子を含み、かつ、前記ＲＮＡ分子が
    （１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド上流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延びる）
    （２）前記第１の配列の上流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；および
    （３）前記第１の配列の下流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
    から本質的になる、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記キャリアＲＮＡが、少なくとも約１８ヌクレオチド長のキャリア配列を含むポリヌクレオチド配列からプロセシングされ、前記キャリア配列が、
    （１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド下流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の下流に延びる）
    （２）前記第１の配列の下流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；および
    （３）前記第１の配列の上流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
    から本質的になり、
    前記ポリヌクレオチド配列が、細胞内において、前記キャリア配列の３′末端であるキャリア切断部位で切断され；かつ
    前記キャリア切断部位での切断が、前記組成物の第４のポリヌクレオチド配列によりコードされている機能的核酸によって果たされる、請求項５６に記載の方法。
  60. 前記キャリアＲＮＡが、少なくとも約１８ヌクレオチド長のキャリア配列を含むポリヌクレオチド配列からプロセシングされ、前記キャリア配列が、
    （１）エッジ配列とハイブリダイズするためにそれと十分な相補性がある１４〜３１ヌクレオチド長の第１の配列（前記エッジ配列は１４〜３１ヌクレオチド長であって、前記所定切断部位から０〜５ヌクレオチド上流に位置し、かつ、前記内在性シグナルＲＮＡ内の上流に延びる）
    （２）前記第１の配列の上流にあり、０〜５ヌクレオチド長のランダム配列である第２の配列；および
    （３）前記第１の配列の下流にあり、０〜７０００ヌクレオチド長である第３の配列
    から本質的になり、
    前記ポリヌクレオチド配列が、細胞内において、前記キャリア配列の５′末端であるキャリア切断部位で切断され；かつ
    前記キャリア切断部位での切断が、前記組成物の第４のポリヌクレオチド配列によりコードされている機能的核酸によって果たされる、請求項５６に記載の方法。
  61. 前記内在性シグナルＲＮＡが細胞ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡまたはその双方である、請求項５５に記載の方法。
  62. 十分な相補性が少なくとも３０％の相補性である、請求項５５に記載の方法。
  63. 前記十分な相補性が少なくとも９０％である、請求項５５に記載方法。
  64. 前記ポリヌクレオチドが１以上のＤＮＡ分子、１以上のＲＮＡ分子またはその組合せである、請求項５５に記載方法。
  65. 前記機能的ＲＮＡがマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、投げ輪型ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ発現ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびリボザイムからなる群から選択される、請求項５５に記載方法。
  66. 前記対象外来性タンパク質がリシン、リシンＡ鎖、アブリン、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素Ａ鎖、アルファトキシン、サポリン、トウモロコシＲＩＰ（ｍａｉｚｅ ＲＩＰ）、オオムギＲＩＰ、コムギＲＩＰ、トウモロコシＲＩＰ（ｃｏｒｎ ＲＩＰ）、ライムギＲＩＰ、アマＲＩＰ、志賀毒素、志賀毒素様ＲＩＰ、モモルジン、チミジンキナーゼ、ブタクサ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、シュードモナス外毒素、シュードモナス外毒素Ａ、大腸菌シトシンデアミナーゼおよびそれらの改変形態からなる群から選択される、請求項５５に記載方法。
  67. 前記細胞集団がヒト細胞、動物細胞、培養細胞および植物細胞からなる群から選択される、請求項５５に記載方法。
  68. 前記細胞集団が新生細胞集団である、請求項５５に記載の方法。
  69. 前記細胞集団が生物体に存在する、請求項５５に記載方法。
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