JP2013544497A - Gbm患者の生存を予測するために有用なテモゾロミドによるtop2a阻害 - Google Patents
Gbm患者の生存を予測するために有用なテモゾロミドによるtop2a阻害 Download PDFInfo
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Abstract
Description
a)付随及び循環アジュバントテモゾロミド治療を伴う放射線治療を受ける際に、TOP2A遺伝子の発現のレベルを特異的に検出することができる試薬;及び
b)付随及び循環アジュバントテモゾロミド治療を伴う放射線治療を受ける前記ヒト対象における膠芽細胞腫の予後を決定するための前記キットを使用するための説明書
を含む。
腫瘍サンプルの採取
腫瘍サンプルを、インド バンガロールのSri Sathya Sai Institute of Higher Medical Sciences(SSSIHMS)とNational Institute of Mental Health and Neuroscience(NIMHANS)で手術した患者から採取した。難治性てんかんのための手術中に得られた正常な脳組織(前側頭葉)を、対照サンプルとして使用した。試験は、2つの臨床センターの倫理委員会により精査され及び承認され、そして患者の同意は、IECガイドライン及び承認の通りに試験の開始前に取得した。
細胞株、siRNA及び形質移入
U373、U138、LN18、LN229、U343、U87、K562、U251及びSVG細胞を、37℃、5%CO2を有する加湿雰囲気で、それぞれ10%ウシ胎児血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを有するDMEM中で培養した。ヒトTOP2A及びシクロフィリンの二本鎖siRNAを設計し、Dharmacon Research(Lafayette,CO)により化学的に合成した。SMARTpool siRNAは、TOP2Aの違ったコード領域配列(Genbank(商標)アクセッション番号NM_001067)を標的とする4つの異なる二本鎖siRNAの混合物である。二本鎖siRNAを、1×ユニバーサルRNAオリゴ緩衝液(20mMのKCl、6mMのHEPES‐KOH(pH7.5)、0.2mMのMgCl2)中に溶解した。siRNA形質移入(200nM)を、Dharmafect(Dharmacon Research)を使用してメーカーの説明通りに行った。
細胞生存能力アッセイ
化学療法感受性アッセイのために、細胞をプレートに蒔いた24時間後に、細胞を細胞毒性薬剤で処理し、そして37℃、5%CO2で45時間インキュベートした。この時点で、MTT(20μL(5mg/mL))を細胞に添加した。MTT添加3時間後、ホルマザン結晶をDMSO(200μL)に溶解し、そして550nmでの吸光度として測定した。対照細胞による吸光度を、100%であると考え、そしてすべてのサンプルを対照細胞に対して規格化した。すべてのアッセイを3連で行った。
RNAの単離及びRT‐qPCR
全RNAをTRI Reagent(Sigma、USA)を使用して凍結組織から抽出した。RNAサンプルを、分光光度計を使用して吸光度を測定することにより定量し、そして品質保証のために、MOPSホルムアルデヒドゲル上で可視化した。選択した遺伝子の発現レベルの相対定量を、以下の2ステップ方法を使用して行った。第一ステップにおいて、cDNAを、cDNA Archive kit(ABI PRISM)を使用して、異なる組織サンプル由来のRNAから生成し;続いて、リアルタイム定量PCRを、cDNAをテンプレートとして、遺伝子特異的プライマーセット及びSYBRグリーン色素を含むDynamo kit(Finnzyme、Finland)を使用して、ABI PRISM7900(Applied Biosystems)配列決定システムで行った。すべての測定を、3連で行った。GARS(グリシル‐tRNA合成酵素)、AGPAT1(1‐アシルグリセロール‐3‐リン酸 O‐アシルトランスフェラーゼ1)、ATP5G1(ATP合成酵素、H+輸送、ミトコンドリアF0複合体、サブユニットC1(サブユニット9))及びRPL35A(リボソームタンパク質L35a)遺伝子を、それらの発現レベルがアレイ試験において不変であることを見出したので内部対照として使用した。てんかん患者からの正常な脳組織サンプルを、参照として使用した。デルタデルタCT法を、比率の計算のために使用した。使用するRT‐PCRプライマーの配列及び条件を、要求に応じて提供する。図1B、並びに2A、B、C、D及びEにおけるそれぞれのドットは、内部参照遺伝子で規格化後、1つのサンプル由来の転写産物レベルの中央値を示す。すべての群(正常、DA、AA及びGBM)のRNA発現レベル(log2比)を、正規分布について試験し、そしてそれらが、正常に分布していないことを見出した。結果を、平均log2比±SDの形式で表した。群間の比較を、クラスカル‐ウォリス(Kruskal‐Wallis)の一元配置分散分析を使用して実施し、そしてさらにサブグループ内の比較を、SPSSバージョン16.0ソフトウェアを使用して、ボンフェローニ補正事後(adjusted post‐hoc)検定で実施した。
ウェスタンブロッティング
細胞株由来のタンパク質溶解物を、RIPA緩衝液中で調製し、そして総タンパク質の等量を、ブラッドフォード試薬により定量後、イムノブロッティングのために使用した。次の抗体(TOP2A(Dakocytomation;Cat#M7186;1:250)及びアクチン(Sigma;Cat#A3854;1:25000))を、本試験について使用した。
TOP2A酵素アッセイ
TOP2A活性を、プラスミド緩和アッセイを使用してインビトロで測定した。簡単に言えば、緩和アッセイは、トポイソメラーゼII反応緩衝液(50mM Tris‐Cl(pH8.0)、150mM KCl、10mM MgCl2、5mM ATP、0.5mM DTT、30μg/ml BSA)の最終容量30μl中に、プラスミドDNA(pBR322;200ng/反応物)及び2ユニットのTOP2A(Topgen Cat#200H‐2)を含む。反応物を37℃で30分間、インキュベートし、そして2.5μlのローディング色素(30%グリセロール及び0.25%ブロモフェノールブルー)の添加により反応を停止した。サンプルを1%ネイティブアガロースゲル(インターカレーターなし)上で分析した。ゲルを、エチジウムブロマイドで10〜15分間染色した。エトポシド又はテモゾロミドの効果を決定するために、反応混合物中に特定量を添加した。
免疫組織化学(IHC)
腫瘍組織及び対照サンプルからパラフィン切片(4μm)を、シランコートスライド上に採取し、そしてTOP2Aのタンパク質発現を、127サンプル(16DA、21AA、77GBM、及び13対照サンプル)に関して、免疫組織化学(IHC)により評価した。脱パラフィン切片の熱誘導抗原回復(heat‐induced antigen retrieval)を、クエン酸緩衝液(10mM、pH6.0)中で、600Wで30〜35分間、マイクロ波オーブンで行った。最初のプロセシングステップ後、切片を、TOP2A(Dakocytomation;Cat#M7186、1:60希釈)一次抗体で、室温で一晩、インキュベートした。これは、次に超高感度非ビオチンHRP検出システム(QD440‐XAK、Biogenex、USA)でのインキュベーションを行う。3,3’‐ジアミノベンジジン(Sigma‐Aldrich、St.Louis、U.S.A)を、発色物質として使用した。顕著に増加したTOP2AのmRNAレベルを示した腫瘍を、陽性対照として供給した。一次抗体を除いた陰性対照スライドを、染色のそれぞれのバッチと組み合わせた。核及び細胞質染色の両方を認めた。核及び細胞質の免疫組織化学染色を、0〜2の3ポイントスケールに関して、半定量的にスコア化し、ここで腫瘍の中心部内で、0=非染色、1+=弱染色、及び2+=強染色である。2+の核及び細胞質陽性のみ、分析のために考慮した。免疫陽性を、それぞれの腫瘍標本由来の1000超の細胞で評価した。標識指数(labeling index)(LI)を、カウントした全細胞のうち、2+染色を示した細胞のパーセンテージとして表す。
IHCデータに関する統計分析
すべての連続変数を、正規分布について試験し、そしてそれらは、非正規であることを見出した。グレード特異的発現パターンを決定するために、非パラメトリック検定、クラスカル‐ウォリスの順位の一元配置分散分析を、IHCによって評価したデータで実施した。4つの群すべての平均間の有意差を、一元配置分散分析の後に多重比較のためのボンフェローニ補正事後検定により決定した。結果を、平均LI±SDの形式で表す。すべての分析を、SPSSバージョン15.0を使用して実施した。
腫瘍サンプル
腫瘍サンプルを、インド バンガロールのSri Sathya Sai Institute of Higher Medical Sciences(SSSIHMS)とNational Institute of Mental Health and Neuroscience(NIMHANS)で手術した患者から採取した。難治性てんかんのための手術中に得られた正常な脳組織(前側頭葉)を、対照サンプルとして使用した。試験は、2つの臨床センターの倫理委員会により精査され及び承認され、そして患者の同意は、IECガイドライン及び承認の通りに試験の開始前に取得した。組織を二等分し、そして半分を液体窒素中で瞬間凍結し、そしてRNAの単離まで−80℃で保存した。他の半分を、ホルマリンで固定し、そしてパラフィン切片に処理した。これらを、星状細胞腫及び免疫組織化学の病理組織学的グレーディングのために使用した。172の膠芽細胞腫(GBM)、54の悪性星状細胞腫(グレードIII(AA))、30のびまん性星状細胞腫(グレードII(DA))、及び20の正常対照を含む全部で276サンプルを、本試験で使用した。172のGBMサンプル中102が、標準化処置プロトコール(詳細は後述)を受けたGBM患者の前向き選択コホートに由来する。TOP2Aのタンパク質発現を、127サンプルでIHCにより腫瘍組織切片上で分析した。
生存とTOP2AのmRNAレベルとの相関関係
2つの臨床センター(NIMHANS/SSIHMS)で手術を受けた新たに診断された膠芽細胞腫患者(n=102)を、前向き試験に含んだ。倫理委員会による承認及び患者の同意を、試験を開始する前に取得した。患者を以下の組み入れ基準:1)テント上大葉性腫瘍(supratentorial lobar tumor)成人患者(年齢18〜65歳の間)、2)術後のMRIスキャン上で認めたれた最小限の残留物を有する、腫瘍の最大限安全な切除を受けた患者、3)術後のカルノフスキーのパフォーマンススコア(KPS)≧70を有する患者に基づいて採用した。
高いTOP2AレベルがGBM患者において良好な予後指標である
102のGBM患者のコホートを前向き試験に採用し、そして標準処置プロトコール(方法で説明した通り)により管理した。この群に関するすべての生存期間の中央値は、16月であると分かった(カプランマイヤー分析)。本コホートにおいて、予想通り、年齢は、コックス回帰分析(p=0.037;HR=1.023;B=0.022)で認められたように、予後不良の重要な予測因子であった。興味深いことに、TOP2AのmRNAの発現が、GBM患者における予後と有意に相関したことを認め;より高いTOP2A転写産物レベルが、より良好な予後を予測した(P=0.043;HR=0.889;B=−0.117;コックス回帰分析)。生存に関するTOP2A転写産物レベル及び年齢の影響を、コックス比例ハザードモデルによりさらに評価して、生存に関するTOP2Aの独立した影響を導き出した。年齢(p=0.033;HR=1.023;B=0.023)及びTOP2A転写産物レベル(P=0.035;HR=0.888;B=−0.119)の両方が、多変量解析による有意な予測因子であることを認めた。さらなる分析に関して、TOP2AのmRNAの発現を二分して、予後の予測についてカットオフを明らかにした。TOP2AのmRNAレベル<9.25log2比を有する患者は、mRNAレベル≧9.25log2比を有する患者と比較した場合、有意により不良な予後を有することを報告する(それぞれ13月対22月の生存期間の中央値)(図1A)。
膠芽細胞腫及び他のより低いグレードの星状細胞腫における、TOP2A及びトポイソメラーゼファミリーの他のメンバーの発現の制御に関連するさらなる研究を行った。TOP2Aの転写産物レベルが、DA、AA及び正常な脳サンプルと比較して、GBMにおいて非常に高いレベルに有意に上方制御されることを本明細書で報告する(図1B;表1A)。星状細胞腫において悪性腫瘍のグレードの昇順とともにTOP2Aの細胞質の発現の減少はあったが、TOP2Aタンパク質の有意に増加した発現(核)を、他のグレードと比較して膠芽細胞腫において観察した(表1B)。同様に、TOP2B転写産物レベルがまた、DA、AA及び正常な脳サンプルと比較して、GBMにおいて上方制御されることを見出した(図2B、表1A)。さらにTOP3A転写産物レベルがまた、DA及びAAと比較してGBMにおいて上方制御されることを見出した(図2C;表1A)。これらの遺伝子とは違って、TOPORSの転写産物レベルは、正常な脳サンプルと比較して悪性腫瘍の星状細胞腫(AA及びGBM)において有意に下方制御されることを見出した(図2E;表1A)。他のトポイソメラーゼのメンバー、TOP1及びTOP3Bは、グリオーマの異なるグレードにわたって制御差異を示さなかった(図2A及びD)。同様に、良好な相関について、グリオーマ由来の確立された細胞におけるトポイソメラーゼファミリー遺伝子の同様の制御を見出した(図4)。
高いTOP2Aレベルを有するがん細胞が、細胞増殖へのなんらかの影響なしにエトポシドなどのTOP2A阻害剤に対してより敏感であることが示されてきた(Haoら、2000; Asanoら、1996; Zhouら、2001)。本発明者等の結果が、高いレベルの腫瘍のTOP2Aを有するGBM患者が、テモゾロミド化学療法に対してより良好な反応を示すので、テモゾロミドがTOP2A阻害剤かもしれないという仮説を立てた。この可能性を試験するために、本発明者等は、テモゾロミドの存在下でスーパーコイルプラスミドDNAを緩和するTOP2A酵素(170kDa)の能力を評価するTOP2A酵素アッセイを実施した。TOP2A酵素は、スーパーコイルプラスミドDNAを非常に効率的に緩和した(図3Aのレーン2と1との比較)。この反応への公知のTOP2阻害剤であるエトポシドの添加は、濃度依存的態様で非常に効率的にTOP2A緩和活性を阻害する(図3Aのレーン5,4及び3と2との比較)。興味深いことに、テモゾロミドの添加はまた、TOP2A緩和活性を効率的に阻害する(図3Bのレーン3及び4と2との比較)。従って、これらの結果は、テモゾロミドがTOP2A阻害剤であることを示す。
本発明者等の結果は、テモゾロミドが、TOP2A酵素活性を阻害し、そして高い腫瘍のTOP2Aを有するGBM患者が、テモゾロミド化学療法に対してより良好に反応することを示したので、TOP2Aの下方制御が、テモゾロミドに対する耐性をグリオーマ細胞に与えると仮説を立てた。TOP2A特異的siRNAの形質移入は、U251グリオーマ細胞において、TOP2Aタンパク質レベルを効率的に低減した(61%)(図3C)。TOP2A特異的siRNAで形質移入したU251細胞は、シクロフィリンsiRNAの形質移入と比較して、テモゾロミド処置に対して有意に耐性であることを見出した(図3E)。他で示したように、エトポシドは、シクロフィリンsiRNA形質移入細胞よりもTOP2AのsiRNA形質移入細胞を効率悪く阻害した(図3D)。従って、これらの結果は、テモゾロミドがTOP2A経路を通じて、その阻害をおそらく引き起こすことにより働き、そして高いTOP2Aレベルがテモゾロミド化学療法に対する感受性を提供することを示唆する。
本発明の利点は、以下:
1.付随及び循環アジュバントテモゾロミド治療を伴う放射線治療を受けるGBM患者のための有用な予後指標TOP2Aを提供し、
2.従って、最も適切な治療を決定することが可能である
ことである。
Claims (8)
- 膠芽細胞腫の予後を決定するインビトロ方法であって、ここで、前記方法が、試験サンプル及び対照サンプル中のTOP2A遺伝子の発現レベルを決定することを含み、ここで、前記対照サンプルと比較して、試験サンプル中のTOP2Aの高いレベルの発現が、膠芽細胞腫の良好な予後を示す、方法。
- 前記試験サンプルが、手術を受け、及びすぐに付随及び循環アジュバントテモゾロミド治療を伴う放射線治療を受けることができるヒト対象から取得した脳腫瘍組織細胞である、請求項1に記載のインビトロ方法。
- 前記遺伝子の発現レベルの決定が、インサイチュハイブリダイゼーション若しくはRT‐PCR分析などの核酸ベースの検出方法においてオリゴヌクレオチドを使用することにより前記遺伝子のmRNA転写産物のレベルを決定すること、又は任意により、免疫組織化学、ELISA若しくはウェスタンブロット分析などのタンパク質ベースの検出方法において抗体を使用することにより前記遺伝子のそれぞれのタンパク質のレベルを決定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 膠芽細胞腫の患者におけるテモゾロミドの細胞毒性を検出するための方法であって、ここで、低濃度のTOP2Aタンパク質を有する細胞が、高濃度のTOP2Aを含む細胞よりもテモゾロミドに対してより低い感受性である、方法。
- 請求項4に記載の膠芽細胞腫の患者におけるテモゾロミドの細胞毒性を検出するために有用なTOP2Aバイオマーカー。
- テモゾロミド治療を受けるヒト対象における膠芽細胞腫の前記予後を決定するためのキットであって、前記キットが、以下:
a)付随及び循環アジュバントテモゾロミド治療を伴う放射線治療を受ける際に、TOP2A遺伝子の発現のレベルを特異的に検出することができる試薬;及び
b)付随及び循環アジュバントテモゾロミド治療を伴う放射線治療を受ける前記ヒト対象における膠芽細胞腫の予後を決定するための前記キットを使用するための説明書
を含む、キット。 - 前記試薬が、前記遺伝子のmRNAと相補的な核酸プローブを含む、請求項6に記載のキット。
- 前記試薬が、前記遺伝子によってコードされるタンパク質と特異的に結合する抗体を含む、請求項6に記載のキット。
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