JP2013544377A - 光学顕微鏡において空間光学モジュレータを較正するための方法とシステム - Google Patents

Abstract

本発明は、空間光学モジュレータ（６）を備えている光学装置を較正するための方法とシステムに関し、入射ビームを受け、および／またはサンプルが反射した光学ビームを集めることが可能な大きな開口数の光学レンズ（８）と、このレンズ（８）と光学的に共役な面に設置されるカメラ（１４）と、さらに、カメラ（１４）の上流で光学ビームに設置してある空間光学モジュレータ（６）とを備えている。本発明による方法は、以下の工程：レンズ（８）の焦点面と共役な面に強度でＰＳＦの３次元像を獲得する工程；位相ダイバーシティアルゴリズムを用いてビームの振幅および／または位相との両方でプロファイルを再構築する工程；さらに、プロファイル上の空間光学モジュレータ（６）の複数の要素（Ｐ_１、・・・・Ｐ_Ｎ）のそれぞれの影響関数を、ビームの振幅Ａおよび／または位相φで決定する工程を備えている。
【選択図】図１

Description

本発明は、空間光学モジュレータを備えている光学機器の較正のための方法とシステムに関する。より正確には、本発明は、光学顕微鏡の中にあるいはその上流に配設されている空間光学モジュレータが、その顕微鏡で得られる像の品質に及ぼす影響を較正するための方法と装置に関する。

光学顕微鏡検査（構造化した照明による共焦点顕微鏡検査、走査蛍光顕微鏡検査、誘導放出減損（ＳＴＥＤ）、非直線光学技術等）における新しい作像技術の発展と、生物学や遺伝学の作像における新しい応用の発展とには、高品質の像を作成する光学顕微鏡が必要である。平面状であるか空気中に位置している対象物は、顕微鏡で見ると極めて高解像度の像が一般的に得られる。にもかかわらず、肉厚の生物サンプルを光学顕微鏡で見ると、像の空間解像度を制限する光学収差の問題に遭遇する。こうした光学収差は、顕微鏡の対物レンズから、すなわち、屈折率の局所的内部変化を起こす、対物レンズ、液浸材およびサンプル（サンプル自体の性質）間の屈折率のミスマッチからもたらされる可能性がある。

顕微鏡に空間光学モジュレータを使用することは、すでに提案されており、光学ビームを振幅および／または位相で空間的に変調することや光学的収差を訂正することが行われている。一般的に空間光学モジュレータは、入射場の空間プロファイルを変調する振幅および／または位相のための装置である。空間光学モジュレータの中でも特筆すべきは、アクチュエータおよび液晶の空間光学モジュレータ（ＳＬＭ）を備えた変形可能ミラーである。本明細書の以下の記載では、空間光学モジュレータは、光ビームの振幅および／または位相を変調するための制御手段にリンクされた複数の要素を備えた光学部品を意味している。空間光学変調の異なる技術によって、空間解像度、応答時間および波長応答に関して種々の性能で、反射や伝達が動作できる。たとえば、液晶の空間モジュレータは、各ピクセルがそれぞれ制御できる非常に良好な空間解像度でビームを変調できる。

表面がアクチュエータで変形できるミラーを使用は、光学器具が生成する像の質を改善する能動光学と、高い時間周波数で波面を変調する補償光学とに応用される。補償光学は、大気の乱れが引き起こす像のゆがみをリアルタイムで補正する天体観測のために意図された大型望遠鏡として特に実施される。顕微鏡の作像においては、光学収差は、サンプルごとに変動する可能性があるが、多くの応用例では、ある像における収差の変動は、時間に関して比較的ゆっくりである。しかしながら、顕微鏡のある応用においては、検知像の品質を急速に最適化することも必要である場合がある。従って、補償光学は、顕微鏡の光学収差を補償することと、特に、生物学の応用において顕微鏡作像における解像度の限界を改良する解決策として提案されている。

補償光学の顕微鏡では、励起光ビームの波面の変調とまた顕微鏡の対物レンズを通して集めた信号の変調とを行う変形可能ミラーが一般的に使用されている。この変調は、顕微鏡の対物レンズの入口のところで振幅と位相のプロファイルを変動させる。この変動自体、顕微鏡の励起パルス応答（ポイント−スプレッド−ファンクションすなわちＰＳＦ）の変動を誘起する。このＰＳＦは、光学システムのソースポイントに対する応答を表すとともに、強度として観察される結果像を形成するため、対象物の各点がどのようにして光学システムにより改変されるのかを記述する。

顕微鏡で観察される見本のタイプによれば、たとえば、ビームの非点収差や脱焦点を補償するため、正確な変形が適用できることが望ましい。従って、Ｄ．Ｄｅｂａｒｒｅ等の出版物「２−光子顕微鏡検査のための像に基づく補償光学」、オプティクスレターズ（Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第３４巻、Ｎ^○１６、２４９５−２４９７ｐには、組み合わせたＺｅｒｎｉｋｅモード型の予め特定された機能で制御される変形可能ミラーを用いて、顕微鏡の像を改良することが記載されている。

液晶の空間モジュレータの場合、各ピクセルの制御は、ピクセルごとを基準とする既知の位相変調を発生する。しかしながら、ビームに対してＳＬＭを正確に位置決めすることは一般的には未知である。さて、光ビームに対する振幅および／または位相の空間光学モジュレータの厳密な影響は、空間光学モジュレータに関する光ビームの位置と寸法の両方に依存している。この影響、モジュレータが光学装置の焦点面にあるかどうか、すなわち、光ビームがどこに合焦するか、または光ビームが広がっている場合、モジュレータが瞳の面にあるかどうかは、一般に前もって知ることはできない。

実際、たとえば、変形可能なミラーを望遠鏡や顕微鏡の中で較正する方法がある。

較正技術の第１グループは、変形可能なミラーで反射した後、瞳の面における波面位相の分析に基づいている。第１の解決策は、波面分析器、たとえば、シャック−ハートマン（Ｓｈａｃｋ−Ｈａｒｔｍａｎｎ）型のものを使用することに基づいている。この分析器によって、光ビームの波面の場所ごとの変形を測定することが可能になる。しかしながら、波面分析器は、高価で幾何学的な制限もある。ＳＨＳを顕微鏡に結合することには制限がある。なぜなら、検出したビームの直径には制限（約５mmまで）があるので、顕微鏡の入射瞳と各顕微鏡の対物レンズに対する波面分析器との間にビームの倍率を合わせる必要がある。その対物レンズに対しては、変形可能なミラーを較正しておかなければならない。さらに、シャック−ハートマン型の分析器による位相の空間解像度は、約３０×３０ピクセルに制限されている。

第２の解決策は、ミケルソンかトイマン−グリーン（Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ ｏｒ Ｔｗｙｍａｎ−Ｇｒｅｅｎ）タイプの干渉計において干渉縞を測定したり分析したりして、波面の位相変化を導出することに基づく。それゆえ、デー．ドバレ等（Ｄ．Ｄｅｂａｒｒｅ ｅｔ ａｌ．）の出版物「２−光子顕微鏡検査のための像に基づく補償光学」、オプティクスレターズ（Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第３４巻、Ｎ^○１６、２４９５−２４９７ｐでは、対物レンズの射出瞳に写されるミラーの領域を精細に較正するために、対物レンズの焦点面に位置しているミラーを使用する。しかしながら、干渉計測定には、精密な心合わせのプロセスを要し、大きな可干渉距離の光源が必要になる。パルスレーザービームを使用する顕微鏡検査の応用例においては、干渉計は別の光源が必要となる。この光源は、ターゲット応用例のものとは異なった位置に概ね配置され、また前記応用例のものとは異なった周波数である。さらに、干渉計は、顕微鏡のものとは容易に比肩できない寸法をもっている。

技術の別のグループは、「位相ダイバーシティ」として参照する方法によれば、装置の焦点面における強度パルス応答（またはＰＳＦ）の測定と、振幅の計算および／または波面の位相再構築の計算とに基づいている。パルス応答の測定は、装置の焦点面に位置している点光源の像を、特徴づける光学装置を介して獲得することである。位相ダイバーシティ法は、第１には、同じ対象物の少なくとも２つの像をその像間の既知の位相シフトで測定する工程と、第２には、多くは、ゼルニケ（Ｚｅｒｎｉｋｅ）の多項式に基づいて位相を分解することにより、各像のフーリエ（Ｆｏｕｒｉｅｒ）面に複素領域をモデル化する工程と、最後に、最小化アルゴリズムを２つの像に対応する視野に適用して、波面の振幅および／または位相の空間再構築をそのフィールドから抽出する工程とから構成される。

天体用の補償光学望遠鏡の場合、レーフダール（Ｌoｆｄａｈｌ）等は、位相ダイバーシティ法（レーフダール等の「位相ダイバーシティを用いる変形可能なミラーとストレール比の測定の較正方法」、Ａｐｐｌ．Ｏｐｔ．３９、ｐｐ．９４−１０３、２０００）に基づく、変形可能なミラーの較正のための装置と方法を提案している。このＰＳＦ測定の実験装置は、入力光ビームの点光源発生器と、均一被照射の瞳と、ほぼゼロの数値開口でのビームを反射する変形可能なミラーと、さらに、この変形可能なミラーによって高解像度のカメラに反射されたビームの像を形成する大焦点レンズとから構成される。２枚の位相シフトＰＳＦ像がカメラの前方にプリズムを挿入することで得られる。このカメラによって、互いに軸方向に焦点を外した２枚の像が形成される。そして、波面における変形可能なミラーの影響の較正は、ゼルニケ（Ｚｅｒｎｉｋｅ）の多項式に基づく分解に従い波面を推定しおよび最小化する従来の方法により行われる。しかしながら、レーフダール等の方法によれば、変形可能なミラーの較正のマトリックスは、ノイズが入るだけでなく不完全でもある。なぜなら、この方法では、独立した方法で較正しなければならない変形可能なミラーが誘起する「欠落」と「傾斜」とが測定できないからである。さらに、望遠鏡は点光源の像を拡大するが、顕微鏡はその小さい像を形成する。それゆえ、レーフダールの較正方法は、顕微鏡では直接使用することができない。すなわち、顕微鏡の対物レンズは、微小で直接目視できないスポットにビームを絞る場合と、対物レンズの開口数が総体的に高い場合とである。

顕微鏡検査の場合は、位相ダイバーシティによる波面再構築を改変して、大きな開口数をもつ装置に応用している（ハンセル（Ｈａｎｓｅｒ）等の「広分野の蛍光顕微鏡検査における位相回復の瞳関数」、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ２１６、ｐｐ３２〜４８、（２００４）； および(ハンセル等の「高数値開口の光学システムのための位相回復」、Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．２８ ｐｐ．８０１−８０３（２００３））。特に、大きい開口数をもつ装置において、システムの瞳の機能はもはや一定であるとは考えられない。
理論的に言えば、ＰＳＦは、波長λで対物レンズの焦点面の中心に位置している極めて小さい点光源の像に対応している。実験的に言えば、光学顕微鏡のＰＳＦを測定するため、ハンセル等は、サイズが顕微鏡の光学解像度の限界より小さい蛍光ボールで形成された点光源を選択する。蛍光ボールは、顕微鏡の焦点面に配置され、励起ビームで照射される。しかしながら、これらボールの蛍光の信号は、強度と時間の両方が制限され、ＰＳＦ測定で得られるＳ／Ｎ比を制限する。信号の弱さは、非常に高感度のカメラの使用を要求し、従って、装置のコストが高くなる。他方、分析を改良するために、再構築アルゴリズムの複雑さを増す試みも行われてきた。これは、得られる成果の精度を低下させる。さらに、使用するボールは所定のサイズがあるため、ＰＳＦ測定にエラーが生じ、そのため顕微鏡検査には致命的になる可能性がある。最後に、ハンセル２００３とハンセル２００４の出版物は、空間光学モジュレータを備える顕微鏡には関連していない。

補償光学顕微鏡検査においては、ツラガ等（Ｔｕｒａｇａ ｅｔ ａｌ．）の出版物は、位相ダイバーシティの変動による、変形可能なミラーの較正方法を記載している（「広視野の顕微鏡検査における変形可能ミラーの像に基づく較正」、ツラガ等、Ａｐｐｌ．Ｏｐｔ．４９、ｐｐ．２０３０〜２０４０、２０１０）。本例においては、蛍光ボールのＰＳＦ測定を対物レンズ（位相シフトのない像）の単一焦点面で行う。再構築のアルゴリズムは、変形可能なミラーの異なるアクチュエータ上で、送られた異なるコマンドに対して行われる全ての測定を使用する。これによって、対物レンズの出口の所でビームの位相プロファイルが決定される。この方法には２つの大きな制限がある。一方では、ビームの強度プロファイルが、（一般例ではないが）既知のものと仮定され、また変動しないものと仮定されるので、対物レンズの入射瞳と共役の変形可能ミラーの較正に、方法の応用を限定してしまう。他方では、位相プロファイルの再構築に必要な計算時間は、非常に長い（３２ＭＢＲＡＭのシステムに対しては、アクティブ要素当たり３分、すなわち５２アクチュエータをもつ変形可能ミラーに対しては、約２時間３０分である）。

最後に、より基本的なことであるが、レフダール（Ｌｏｆｄａｈｌ）等、ハンセル（Ｈａｎｓｅｒ）等およびツラガ（Ｔｕｒａｇａ）等の出版物では、実施した測定の数を減少したため（１または２）、極小化アルゴリズムの信頼性を、調査される波面を先験的にモデル化することで与えられる補償をしなければならない。この波面は、ゼルニケ（Ｚｅｒｎｉｋｅ）モードか関数の別ベースに従って分解され、直交と仮定されるか、変形可能なミラーに幾何学的によりよく適合すると仮定される。これにより、位相の再構築の精度を本質的に減少させるとともに、較正方法を、対物レンズの入射瞳と共役の面内に位置しているミラーが位相の純粋な変調を誘起する場合と、射出瞳における視野振幅が一定と考えられる場合とに限定してしまう。

本明細書では、「射出瞳」と「入射瞳」は、同義的に用いられており、対物レンズの焦点面と共役な面として参照する。

ボッチェヴィ（Ｂｏｔｃｈｅｂｙ）等の「顕微鏡検査におけるリモート焦点合わせ用の光学技術」、Ｏｐｔ．Ｃｏｍｍ、ｐｐ．２８１、８８０〜８８７（２００８）は、顕微鏡の対物レンズのＰＳＦ測定の別の方法を記載している。この方法では、顕微鏡の対物レンズの焦点面の近傍に置いたミラーと、対物レンズの焦点面と共役の面に位置するＣＣＤカメラとを用いている。像は、平面鏡またはカメラの異なった軸方向オフセット位置に対して得られ、３次元の強度ＰＳＦが得られる。それでもこのＰＳＦ測定は、視野プロファイルの振幅や位相再構築のためには、まして変形可能なミラーの較正のためには使用されていない。

本発明の一つの目的は、顕微鏡内蔵の空間光学モジュレータの正確かつ信頼できる較正のための装置と方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、対物レンズの交換ごとに機器を適合させる必要無く、異なった顕微鏡の対物レンズと適合する空間光学モジュレータを較正する装置を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、光学ビームの強度が比較的低い場合における、高い空間解像力と高精度の較正を可能にし、射出瞳の視野の周辺点を備えた較正方法を提供することにある。

本発明の目的は、空間光学モジュレータが挿入された場所かその上流にある顕微鏡の光学特性に対する、空間光学モジュレータの要素に与える指令の影響を較正する方法を提供することにある。

そうした目的のために、本発明は、空間光学モジュレータを有する光学装置を較正するための方法に関し、該光学装置は、点光源と、入射ビームを受け、および／またはサンプルが反射する光学ビームを収集するようにされている大開口数の光学対物レンズと、この対物レンズの焦点面と光学的に共役な面におかれたカメラと、カメラの上流の光学ビームにおかれる空間光学モジュレータとを備える。本発明によれば、前記方法は以下の工程を備える：
（ａ）対物レンズの焦点面の近傍に反射面サンプルを配設する工程と；
（ｂ）サンプルに入射し、および／またはサンプルにより反射される光学ビームを変調するように、空間光学モジュレータの要素Ｐ_ｉに振幅Ｒ^ｉ _ｊの指令を与える工程と；
（ｃ）対物レンズの焦点面と共役な面に強度ＰＳＦの像を得る工程と；
（ｄ）対物レンズと反射サンプル間の相対軸方向距離を既知量Ｚで改変する工程と；
（ｅ）サンプルと対物レンズの焦点面との間の複数の相対軸方向距離に対して、工程（ｃ）と工程（ｄ）を繰り返す工程と；
（ｆ）要素Ｐｉの値Ｒ^ｉ _ｊに対する位相ダイバーシティアルゴリズムによって、対物レンズの焦点面と共役な面において、振幅および／または位相のプロファイルを再構築する工程と；
（ｇ）空間光学モジュレータの要素Ｐｉに対する複数の振幅値Ｒ^ｉ _ｊに対して工程（ｂ）から（ｆ）までを繰り返す工程と；
（ｈ）要素Ｐｉの影響関数Ｅｉを、ビームの振幅プロファイルＡおよび／または位相プロファイルφに基づいて決定する工程と；
（ｉ）空間光学モジュレータの異なる要素Ｐｉ（ｉ＝１、・・・・、Ｎ）に対して工程（ｂ）ないし（ｈ）を繰り返す工程；さらに
（ｊ）ビームの振幅プロファイルＡおよび／または位相プロファイルφに基づいて、空間光学モジュレータのすべての要素（Ｐ_１、・・・・Ｐ_Ｎ）の影響関数（Ｅ_１、・・・・、Ｅ_Ｎ ）を決定する工程。

本発明の特定の実施の形態によれば、ＰＳＦ測定は、対物レンズとサンプルとの間の３つの相対軸方向距離に対して行われ、対物レンズの焦点面におけるサンプルの位置に関してＺ＝（−Ｚ_０、０、＋Ｚ_０）のようにして特定される。
本発明の好ましい実施の形態によれば、位相ダイバーシティによるビームの振幅および／または位相プロファイルの再構築工程（ｆ）は、以下の工程を備える：
初期設定：
−相対的な３位置−Ｚ_０、０、＋Ｚ_０に対応する脱焦点項を推定する工程；
−対物レンズの入射瞳内で視野プロファイルを最初に推定する工程；
−対物レンズの入射瞳の透過プロファイルを推定する工程；
計算のアルゴリズム：
−３つの脱焦点項それぞれにより、対物レンズの入射瞳で推定される視野プロファイルを掛け合わせて、３つの視野プロファイルを計算する工程；
−フーリエ変換を適応して３つの相対位置−Ｚ_０、０、＋Ｚ_０に対して推定ＰＳＦを計算する工程；
−Ｚ（−Ｚ_０、０、＋Ｚ_０）の各値のそれぞれに対して測定されたＰＳＦの値で、計算したＰＳＦの振幅を置換する工程；
−得られた３視野に対して逆フーリエ変換を適応する工程；
−各位置Ｚ（−Ｚ_０、０、＋Ｚ_０）にそれぞれ対応する脱焦点項で割算する工程；
−得られた３複素数視野を平均化する工程；
−対物レンズの入射瞳の透過プロファイルで視野平均を掛け合わせて、対物レンズの射出瞳で視野プロファイルの新規推定を得る工程；および
−１終結条件が充足されるまで振幅計算のアルゴリズムおよび／または位相プロファイル再構築の計算アルゴリズムの全工程を繰り返す工程；
最終段階
−計算され、測定された３つのＰＳＦの間の振幅の２乗偏差を計算する工程。値が収束基準（相対偏差で１０^−６オーダーが代表的）より低い場合には、アルゴリズムを終了する；
−フーリエ変換アルゴリズムにより、プロファイル位相を抽出し表す工程。

本発明の特定の実施の形態によれば、工程（ｊ）の前に追加の工程をさらに含み、この追加の工程は、空間光学モジュレータの複数の要素に対するコマンドの異なった同時の組み合わせのために、工程（ｂ）ないし（ｉ）を繰り返す。

実施の形態の特定の態様によれば、本発明の較正方法は、工程（ｃ）に続いて、測定したＰＳＦ像をデジタル濾波して、空間解像度を低下することおよび／または像の寸法を対物レンズの瞳の寸法に適合させることを行う追加の工程を備える。

特定の実施の形態によれば、本発明の較正方法は、工程（ｊ）に続いて、空間光学モジュレータの全要素（Ｐ_１、・・・・Ｐ_Ｎ）の影響関数を線形回帰アルゴリズムで逆変換して、変形可能ミラーの較正を振幅Ａ（ｘ，ｙ）＝Ｍ_Ａ（Ｒ^ｉ _ｔ）および／またはＲ^ｉ _ｔ＝Ｍ_Ａ ^−１（Ａ（ｘ，ｙ））と位相φ（ｘ，ｙ）＝Ｍ_φ（Ｒ^ｉ _ｔ）および／またはＲ^ｉ _ｔ＝Ｍ_φ ^−１（φ（ｘ，ｙ））のそれぞれに関して、線形回帰アルゴリズムから導出する追加の工程を備えている。

本発明はまた、空間光学モジュレータをもつ光学装置を較正するためのシステムに関する。前記装置は、入射ビームを発生する点光源と、入射ビームを受け、および／またはサンプルが反射した光学ビームを集めるようになっている大きな開口数の光学対物レンズと、対物レンズの焦点面に形成される点光源の像と、複数の要素（Ｐ_１、・・・・Ｐ_Ｎ）を備えた空間光学モジュレータと、前記空間光学モジュレータのこれらの要素（Ｐ_１、・・・・Ｐ_Ｎ）を制御するための手段を備え、前記空間光学モジュレータは、光学ビーム上に配置されて、入射および／または反射光学ビームを変調し、
前記較正システムは、
・対物レンズの焦点面の近傍におかれた反射平面サンプルと、
・対物レンズの焦点面と前記サンプルの間の距離Ｚの調整手段と、
・前記サンプルが反射したビームの一部を受けるとともに対物レンズの焦点面の像を共役面に形成するようになっている光学システムと、
・対物レンズの焦点面と光学的に共役な前記面におかれるカメラと、さらに
・距離Ｚの調整手段を制御するためのユニット、空間光学モジュレータの要素（Ｐ_１、・・・・Ｐ_Ｎ）を制御するためのユニット、複数の距離Ｚに対して、カメラによって獲得された複数の像を処理し、これらから装置のＰＳＦの測定を導出するようになっているユニット、さらに、距離Ｚの調整手段と空間光学モジュレータの要素とにそれぞれ与えられるコマンドの値を、ＰＳＦ測定の関数として決定するようになっている計算手段を備えた制御システムを備えている。

本発明の較正システムの種々の特定の態様によれば、計算手段は、
・位相ダイバーシティアルゴリズムを用いてビームの振幅および／または位相プロファイルを再構築する手段；
・空間光学モジュレータのすべての要素Ｐ_１、・・・・Ｐ_Ｎの影響関数（Ｅ_１、・・・・Ｅ_Ｎ）を振幅プロファイルＡおよび／または位相プロファイルφにおいて決定するための手段；および／または
・空間光学モジュレータの全要素Ｐ_１、・・・・Ｐ_Ｎの影響関数を線形回帰アルゴリズムで反転する手段と、空間光学モジュレータの較正を推定する最小化手段とを備えている。

本発明は、以下の記載から証明され、また単独であるいは技術的に可能ないかなる組み合わせでも考慮されねばならない特徴にも関している。

添付の図面を参照して非限定的な実施例に対して行う以下の説明により、本発明をどのように実施できるかをより良く理解できるであろう。

本発明の第１実施例による較正装置の概要を図示している。 本発明の第２実施例による較正装置の概要を図示している。 本発明の第３実施例による較正装置の概要を図示している。 本発明の方法の主工程の概要を図示している。 位相ダイバーシティアルゴリズムの初期設定の工程の変形例の概要を図示している。 発明の実施例による位相ダイバーシティアルゴリズムの変形例を概要的に図示している。 空間光学モジュレータの要素Ｐ_ｉの影響関数の決定工程の変形例を概要的に図示している。

図１は、顕微鏡中の空間光学モジュレータ６の較正の実験装置の第１例を図示している。図示の例では、空間光学モジュレータは、複数のアクチュエータを備えている変形可能なミラーである。しかしながら、空間光学モジュレータは、発明の範囲から逸脱しないで、別のタイプの空間モジュレータ（たとえば液晶のＳＬＭ）でありうる。顕微鏡の構成要素の極一部だけが図１に図示してある。特に、顕微鏡の鏡筒は図１には図示していない。

光源１は、サンプル１０を照射するよう意図された励起ビーム１ａを発生する。光源は、顕微鏡の一部であるか、あるいは顕微鏡の入力ポートに連結されていてもよい。光源は、連続光源や、パルスレーザーのようなパルス光源であってもよい。光源１は、後にターゲット応用に用いるよう意図した光源であるのが有利である。レーザー光源の場合、光源の空間程度は非常に制限されるので、入口ダイアフラムは必要でない。空間に広げた光源の場合、点と考えてもよいほど十分小さいダイアフラムを、対物レンズの焦点面と光学的に共役な面内の入射ビームに配置しなければならない（実際には、ダイアフラムのサイズは、システムの理想的な励起ＰＳＦに対応するエアリー（Ａｉｒｙ）スポットの幅のせいぜい半分でなければならない）。この明細書の以下の記載では、光源１は点光源を例としている。

光源ビーム１ａは光学システム２によって顕微鏡の光路に合わせられている。

偏光分極キューブ３は、（λ／４板タイプの）プレート４と無限焦点光学システム５ａ、５ｂとに向って入射ビームを送って、変形可能ミラー６を照明する。この変形可能ミラー６は、顕微鏡の内部か上流におかれて、励起光ビームの波面の変調を誘起する。変形可能ミラー６は、アクチュエータＰ_１・・・Ｐ_ｉ・・・Ｐ_Ｎで変形され得る反射表面を備えている。異なった技術のアクチュエータ（磁気の、圧電の・・・）が存在する。アクチュエータは、制御システム１５で制御するが、この制御システムはコマンドを１台だけのアクチュエータにあるいは数台のアクチュエータに同時に送ってもよい。入射ビームの反射に用いる変形可能ミラー６は、顕微鏡の対物レンズ８の入射瞳９と共役になっている。

偏光分極キューブ３は、変形可能ミラー６により反射され、変調されたビームを受光する。入射分極に関して４５°に配向されたλ／４板を２回通過した後、ビームの分極状態は９０°回転させられ、キューブ３を始めに透過したビームは、出力ロスなく反射される。キューブ３は、変調したビームを光学システム７に向って送り返す。この光学システム７は、変調ビームを、入射瞳９の視野をカバーするように顕微鏡対物レンズ８に向ける。入射瞳９の直径が顕微鏡対物レンズ８の開口数を決定する。顕微鏡対物レンズの開口数は、一般的に０．２と１．４５の間にある。

顕微鏡は、顕微鏡対物レンズ８の焦点近傍に位置するサンプル１０を配設するサンプルキャリヤを備えている。サンプル１０は平面鏡であることが好ましい。使用する対物レンズ８がサンプルを覆うスライドと共に使用されるようになっているのであれば、要求される厚さをもつスライドは、対物レンズ用の光学接着剤や一滴のオイルでミラーに接着される。ある光学指数をもつ媒体に浸漬する液浸顕微鏡の対物レンズの場合、液浸材料（たとえば、空気、水、グリセロール、油）は、ミラーおよび／またはスライドと対物レンズとの間に添加されるが、これは、対物レンズ使用上の通常の条件である。

サンプルキャリヤは、たとえば圧電式の位置決めシステム１１に設けられており、使用した対物レンズによっては、対物レンズ８とたぶんスライドを覆っているサンプル１０との間に相対軸方向位置ずれをもたらす。

図１の較正装置は、対物レンズ８の上流においた分離板１２（たとえば、半反射板）を備えている。分離板１２は、サンプル１０で反射されるビームを取り込む。ビームは次に光学システム１３によってカメラ１４で焦点合わせがされるので、カメラ１４の検知面は対物レンズ８の焦点面と光学的に共役になっている。

制御システム１５は、変形可能ミラー６のアクチュエータＰ_１・・・Ｐ_ｉ・・・Ｐ_Ｎを制御するためのユニットと、対物レンズ−サンプル位置決めシステム１１を制御するためのユニットと、カメラ１４で獲得した像を処理するための像処理ユニットと、さらに、変形可能ミラー６のアクチュエータＰ_１・・・Ｐ_ｉ・・・Ｐ_Ｎと対物レンズ−サンプルの軸方向距離を位置決めするためのシステム１１とに与えるコマンドの値を、それぞれ、以下詳細に述べるアルゴリズムによる像ＰＳＦの測定の関数として決定するための計算ユニットとを備えている。

本発明の較正装置で得られる測定を既知の波面センサーで直接得られるものと比較するために、サンプルと、シャック−ハートマン（Ｓｈａｃｋ−Ｈａｒｔｍａｎｎ（ＳＨＳ））タイプの波面分析器１７と、光学結合レンズ１８とが反射したビームの光路に、着脱可能なミラー１６が配置されている。レンズ１８は、ビームプロファイルのサイズを波面センサー１７のものに適合する対物レンズ８の関数として選定されている。数個のレンズ１８を使用するかわりに、可変焦点距離の望遠鏡を用いてもよい。その場合、波面分析器１７を用いて瞳９の面において波面の空間分布の基準測定をしてもよい。しかしながら、ＳＨＳ１７、レンズ１８および脱着ミラー１６は、発明の較正装置のパーツではない。

以下図１の装置の動作を説明する。光源ビーム１ａは、光学システム５ａ、５ｂにより変形可能ミラー６に合わせられる。変形可能ミラー６は、励起光ビームの波面の変調を誘起する。この変調の結果、顕微鏡の対物レンズ８の入射瞳９の面に位相と振幅のプロファイルが変動する。こうした波面プロファイルの変動により、カメラ１４が検出した顕微鏡の強度励起パルス応答（ＰＳＦ）の変動が誘起される。すなわち、波面プロファイルの変化を用いて、顕微鏡やサンプル自体が誘起する収差を訂正したり、作像、光活性、光アブレーション等のためにＰＳＦを形成したりする。検知した信号が変形可能ミラー６（図２か図３の装置を参照）で再反射される場合、検知パルス応答の変調も起こる。

一般的に、変形可能ミラー６が誘起するすべての変調を較正するため、以下のこの明細書では、検知器が位置する平面で得られる励起ＰＳＦだけでなく結果ＰＳＦが考慮される。ＰＳＦは、光路に存在する異なる要素、すなわち、変形可能ミラー６、顕微鏡の光学要素、対物レンズ８やこれらの要素の相対位置に本来的に依存している。変形可能ミラー６の各能動的要素、（すなわちアクチュエータＰ_１・・・Ｐ_ｉ・・・Ｐ_Ｎ）の影響は、実現する光学組立体に依存している。正確にいえば、ミラーの較正は、目標となる応用の測定の構成で本来の場所で行わなければならない。

図２は、斜めの入射下で反射で作用する別タイプの顕微鏡において、変形可能ミラーの較正の実験装置の第２の実施例を図示している。図２の装置は、図１の装置と同様な要素を備えている。変形可能ミラーは、励起ビームの光路ではなく、サンプル１０が反射するビームの光路に位置している。光学システム１３は、サンプルが反射し、カメラ１４の変形可能ミラー６が変調するビームの像を形成する。図１の装置と同様に、制御システム１５は、変形可能ミラー６のアクチュエータＰ_１・・・Ｐ_ｉ・・・Ｐ_Ｎを制御するためのユニットと、対物レンズ−サンプル位置決めシステム１１を制御するためのユニットと、カメラ１４が獲得した像を処理するためのユニットと、変形可能ミラー６のアクチュエータと位置決めシステム１１に、それぞれ以下に詳述するアルゴリズムによる像ＰＳＦの測定関数として適用されるコマンドの値を決定する計算ユニットとを備えている。

図１に図示した装置は、分離板１２が対物レンズ８のすぐ上流に配置されており、励起ＰＳＦを測定するのに理想的である。しかしながら、分離板１２、レンズ１３およびカメラ１４のユニットは、ビームの光路のどこに配置してもよい。ただし、カメラ１４が対物レンズ８の焦点面と共役であること、カメラに到達する前に対物レンズの前後にビームが空間モジュレータで反射されないことが条件である。たとえば、共焦点顕微鏡の全ＰＳＦ（励起＋検知）に及ぼす変形可能ミラーの影響を測定したい場合、２つのＰＳＦ（すなわち励起と検知）の測定が成功しなければならない。しかしながら、励起と検知は、波長が同一か近似であれば、一般的に可能であり、装置の幾何学によれば最も実用的な測定だけが実現できる。したがって、図３は、顕微鏡内の変形可能ミラー６の較正用実験装置の第３実施例を示している。図３の装置は、図１と図２の装置と同様な要素を備えている。変形可能ミラー６は、励起ビームの光路と撮像するサンプルが反射したり生成するビームの光路との両方に撮像中に配置されている。そうした顕微鏡を較正するためには、入射ビームの光路を改変したり、カメラ１４を通常の検知器のところに配置したりすることで、検知ＰＳＦ（図３ａ）を測定することが可能になる。また、分離板１２、レンズ１３およびカメラ１４のユニットを対物レンズの直後に配置することで励起ＰＳＦ（図３ｂ）を測定することが可能になる。一例として、図３に図示した装置は、レーザービームをサンプルに走査することが可能なＸＹスキャナとも呼ぶビーム走査器１９と、共焦点信号を検知するためのポイント検知器（たとえば、ピンホール＋フォトマルチプライヤ）とから構成される。
本発明の較正方法も、直立反転または水平の顕微鏡の場合に該当する。すべての場合、平面鏡を焦点の近くで用いており、必要なら、顕微鏡のスライドをその上におき、顕微鏡用オイルか光学接着剤の一滴で固定してよい。

較正方法
図４は、位相ダイバーシティアルゴリズムに基づく本発明の較正方法の主な工程を示している。

変形可能ミラー６の較正は以下の工程に従って実行される。
・システムの初期設定（工程２０）、平面ミラー１０は、このミラーと対物レンズ８の焦点面との間の距離Ｚ_０で特定される、対物レンズの焦点面近傍の第１位置に位置付けられている工程と、
・コマンドベクトルを変形可能ミラー６に送信（工程３０）して、励起および／または反射の光学ビームを変調する工程（工程４０）と、
・全光学装置の三次元ＰＳＦを測定する工程（工程５０〜６０）と、
・三次元ＰＳＦ測定に基づいて顕微鏡の入射瞳のレベルで位相および／または強度を再構築する工程（工程７０）と、
・各アクチュエータ（変形可能ミラー６が線形の場合）あるいはアクチュエータのコマンドの各可能な組み合わせ（変形可能ミラー６が線形でない場合）の影響が既知になるまで、異なるコマンドベクトルを繰り返す工程（工程８０〜９０）と、さらに
・影響関数を逆変換してそこから変形可能なミラーの較正を推定する工程（工程１００）である。

本発明の好ましい実施の形態によれば、較正方法は以下の工程を備える。
・励起ビームを反射する対物レンズ８の焦点面の近傍に配置された平面鏡１０と、対物レンズの焦点面と共役な面におかれるカメラ１４とにより実施される顕微鏡の強度ＰＳＦの測定工程と、
・サンプルキャリヤか対物レンズの軸方向ずれの装置を用いて、平面ミラーの３つの異なる既知の軸方向位置の３つＰＳＦ測定を獲得する工程（工程５０〜６０）と、
・対物レンズ８の瞳９の面における励起ビームの位相および振幅のプロファイルを、反復アルゴリズムを用いる３軸ＰＳＦ測定から、係数内に再構築する工程（工程７０）と、
・変形可能ミラーの各アクチュエータの異なる位置に対して先行する工程を反復する工程（工程３０〜７０）と、
・（三次元ＰＳＦを決定する）対物レンズの入口において、光学視野に対する変形可能ミラーのアクチュエータの複素数影響関数を計算する工程（工程８０〜９０）と、さらに、
・ＰＳＦが決定した顕微鏡の光学特性に対する変形可能ミラーの影響を、そのまま完全かつ本来的に決定する工程（工程１００）である。

較正方法の詳細な工程
工程毎に以下詳細に説明する。
Ｉ−ＰＳＦの測定
たとえば、図１に示した配置を考察してみる。ここでの仮定は、対物レンズ８の透過が入射瞳９の全体にわたって均一であること、対物レンズ８、半反射板１２およびレンズ１３はビームの波面で何も収差を生じないことである。ＣＣＤカメラ１４では、対の対物レンズ８とレンズ１３の倍率で拡大したＰＳＦの像が、直接的に対物レンズ８の焦点面に関して軸方向位置２×Ｚ_０で測定されることを示すことができる。したがって、平面ミラー１０と顕微鏡対物レンズ８との間の距離Ｚ_０を変化させることになり、システムのＰＳＦの三次元像を再構築できる。

対物レンズ８、レンズ１３および／または反射板１２が誘起する収差が無視できない場合、あるいは、対物レンズ８の透過プロファイルが均一でない場合、（ビームの位相と強度のプロファイルの改変を記述している）光学移送関数のさらなる変調が存在する。したがって、測定したＰＳＦは焦点面のレベルで得られたものと同じではなくなっている。しかしながら、この変調は、変形可能ミラー６の形状が変わっても一定であり、変形可能ミラー６にリンクしたビームの位相と強度のプロファイルの変動は、それでも同じ精度で決定される。

したがって、変形可能ミラー６が励起ビームに配置される場合、測定するのは励起ＰＳＦ（図１の場合）である。同様に、変形可能ミラー６をサンプルが反射するビームに配置すると、測定されるのは、検知ＰＳＦである（図２の場合）。最後に、変形可能ミラー６を励起ビームと反射ビームの光路におくと（図３の場合）、ビームの一方か他方あるいは両方が測定されて、顕微鏡の全ＰＳＦ（励起＋検出）に対する変形可能ミラーの影響が得られる。

ＩＩ−ビームの位相と強度のプロファイルの再構築
図５ないし図７は、位相ダイバーシティアルゴリズムによる三次元ＰＳＦからビームの振幅および／または位相プロファイルを再構築するアルゴリズムを実施する一例を模式的に図示している。

図５は計算アルゴリズムの初期設定の工程を、図６は再構築の反復の工程を図示している。

アルゴリズム（図５）の初期設定は、入射瞳９の視野にわたって、たとえば一定の関数φ_ｉｋによって入射位相のプロファイルを初期設定（工程２０ａ）することが最初である。同様に、入射瞳９上の視野の振幅Ａ_ｉｋが初期化される（工程２０ｂ）。この振幅Ａ_ｉｋはたとえば一定と仮定してある。対物レンズの入射瞳９の伝達プロファイルは、たとえばゲート関数のような関数П_ｉｋで推定する（工程２０ｃ）。積Ａ_ｉｋП_ｉｋｅｘｐ[ｊφ_ｉｋ]に等しい視野プロファイルの最初の推定は、それから演繹される（工程２０ｄ）。他方、信号上のノイズの代表的条件において位相ダイバーシティアルゴリズムが良好に収束するためには、異なる面Ｚ_０上でＰＳＦの３つの像が必要である。収束は、工程２０ｄで得られる視野プロファイルの最初の推定から開始される。脱収束項は、ｅｘｐ（−ｊＺ_０δ）、１そしてｅｘｐ（＋ｊＺ_０δ）に等しいが、３相対位置に対してそれぞれ、−Ｚ_０、０、＋Ｚ_０と見積もられる（工程２０ｅ〜２０ｆ）。

図６は、位相ダイバーシティによる三次元プロファイルの再構築アルゴリズムを模式的に図示している。初期設定（工程７０ａ、たとえば、図５に関連して工程２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄにしたがって表示したように）後は、視野プロファイルの初期推定と、（たとえば図５の工程２０ｅ〜２０ｆにしたがって表示した）３つの相対位置：−Ｚ_０、０、および＋Ｚに対する脱焦点項δの初期推定が得られる。工程７０ｂでは、初期視野プロファイルにそれぞれ３つの脱焦点項、ｅｘｐ（−ｊＺ_０δ）、１およびｅｘｐ（＋ｊＺ_０δ）を掛け合わせることにより、３つの視野プロファイルが計算される。フーリエ交換（ＴＦ）を適用して、３相対位置−Ｚ_０、０、＋Ｚ_０に対して、推定したＰＳＦを計算する（工程７０ｃ）。次に、計算したＰＳＦの振幅を、Ｚの各値に対して測定したＰＳＦの値で置換する（工程７０ｄ）。逆フーリエ交換（ＴＦ^−１）の操作を、得られた３視野に適用する（工程７０ｅ）。各位置−Ｚ_０、０、＋Ｚ_０に対応する脱焦点項で割算を実行する（工程７０ｆ）。得られた３複素視野の平均を計算する（工程７０ｇ）。平均の１つは、３視野の平均に、対物レンズの入射瞳の伝達プロファイルを掛けるものである（工程７０ｇ）。このようにして得られるプロファイルは、対物レンズの射出瞳のレベルで、視野の新しい推定として作用する。工程７０ｂ〜７０ｇは、１つの終了条件が充足されるまで繰り返す（工程７０ｈ）。

終了工程は、たとえば、計算し測定した３つのＰＳＦ値間の振幅２乗偏差を計算することである。その値が収束基準（相対偏差で１０^−６のオーダーが代表的）より低いと、アルゴリズムは終了する。この段階で、視野プロファイルの推定が得られており、視野プロファイルは、一方では、視野の振幅から、他方では、視野のほぼ丸めた位相（法２π）からなる（工程７０ｉ）。追加の工程（工程７０ｊ）によって、プロファイルの丸めていない位相をフーリエ変換アルゴリズムで取り出すことができる。位相を丸めないアルゴリズムの一例が、Ｄ．Ｃ．ＧＨＩＧＬＩＡ Ｍ．Ｄ．ＰＲＩＴＴの出版物「Ｔｗｏ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｐｈａｓｅ ｕｎｗｒａｐｐｉｎｇ：ｔｈｅｏｒｙ，ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ，＆ｓｏｆｔｗａｒｅ”，ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ（１９９８）」に記載されている。
用いたアルゴリズムによって、位相と振幅のプロファイルがパラメータだけで完全に再構築できるようになる。パラメータは、カメラ画素の寸法、ビームの波長、焦点面とカメラの面間の光学倍率、用いた３つの位置Ｚ_０間の軸方向ずれ、対物レンズの開口数、用いた浸漬媒体の指標である。これらのパラメータの値によれば、アルゴリズムの収束を加速化するために、出発像を切り取ったり（得られる位相と強度のプロファイルにおける最終解像度の低下）、あるいは「封印」（再構築したプロファイルを過剰なマージンを避けるため、顕微鏡の入射瞳の寸法に調節すること）することができる。最近のコンピュータ（２ＭＢ ＲＡＭ、２ＧＨ_Ｚのプロセッサ）を用いる本例では、再構築には位相プロファイル当たり約２秒かかる。

ＩＩＩ−変形可能ミラーの較正
変形可能ミラー６の動作が線形である最新の事例では、較正は、各アクチュエータＲ_ｉの（ビームのプロファイルに関する）影響関数Ｅｉを決定することによって得られる。この方法は、図７の工程ダイヤグラムによって模式的に示されている。各アクチュエータＲ_ｉは次から次へと較正される。すなわち、（線形範囲に対して少なくとも２つの値の）一連のコマンドがアクチュエータＲ_ｉに送信されて、対応するプロファイルが各コマンド値に対して測定される。最終的に得られる異なるプロファイルの調整によって、各要素Ｒ_ｉの影響関数Ｅ_ｉが決定できる_。
線形のふるまいをするミラーの場合、ミラーの実働要素に、位相が異なったコマンド値で得られると、線形回帰の工程を用いて、各実働要素の影響関数を算定する。次に、与えられた位相と振幅のプロファイルを得るためミラーに送るコマンドベクトルを決定したいならば、追加の工程を用いてコマンドマトリックスを得る。このマトリックスは、（モード当たり１係数ベクトルで記述してある）獲得したいモード（ゼルニケまたは他の）の組み合わせを、実働要素のそれぞれに送るコマンドベクトルと直接リンクする。たとえば、ゼルニケモードを作りたいならば、各影響関数Ｅ_ｉを、作りたいゼルニケモードに基づいて分解して、このように得られたマトリックスを疑似的に反転してコマンドマトリックスを得る。

滅多にないケースであるが、変形可能ミラー６の動作が直線的で無いでないという頻度が少ない場合、すなわちアクチュエータの応答が互いに独立していないときには、変形可能ミラー６のアクチュエータに送られたコマンドの起こり得るあらゆる組み合わせに対してビームのプロファイル変動を測定する必要がある。

実験的測定の例
図１に模式的に図示してあるような組立体によるテストスタンドで、測定を行ってきた。反射に用いた変形可能ミラー６は、顕微鏡対物レンズ８の入射瞳９と共役になっている。変形可能ミラーは５２台のアクチュエータを備えている。用いる対物レンズ８によるスライドでおそらく覆われた平面鏡１０は、対物レンズ８と平面鏡１０との間に相対移動を与える圧電型の位置決めシステム１１に設けられている。ＰＳＦの検知は、１２００×８００画素のマトリックスをもつ８−ビットのＣＣＤカメラで行われる。

較正の装置と方法を推定するために、着脱可能ミラー１６も用いてシャック−ハートマン（Ｓｈａｃｋ−Ｈａｒｔｍａｎｎ）（ＳＨＳ）タイプの波面分析器１７上で波面を測定する。追加の光学結合レンズ１８を、対物レンズ８に従って選定して、ビームプロファイルのサイズを波面分析器１７のものに合わせる。

この実施の形態では、変形可能ミラー６は、顕微鏡の対物レンズ８の入射瞳９と共役になっている。これは使用が最頻度の場合であって、ミラーが誘起する変調が位相プロファイルだけに関連し励起ビームの強度プロファイルには関連しない。位相に対する影響の再構築された強度のプロファイルと関数は、開口数０．７５で２０×空中対物レンズの入射瞳と共役の変形可能ミラーの５２の能動要素１つに対して計算してある。得られた結果は、シャック−ハートマン（Ｓｈａｃｋ−Ｈａｒｔｍａｎｎ）波面測定装置で得られる測定と比較してある。

用いた方法の確固さを推定するため、同じ変形可能ミラー６の影響関数は、非常に異なる３つの顕微鏡対物レンズ８に対して測定する。すなわち、
・開口数０．７５（入射瞳１３．５ｍｍ）の滑り補正した空中２０×倍率の対物レンズ、
・スライドなしで開口数０．４（入射瞳９ｍｍ）の空中１０×倍率の対物レンズ、および
・開口数１．２（入射瞳５．４ｍｍ）滑り補正した水中６０×倍率の対物レンズ。
本発明の方法による対物レンズの瞳の平面における位相再構築は、３枚の対物レンズに対して、シャック−ハートマン（Ｓｈａｃｋ−Ｈａｒｔｍａｎｎ）波面センサーで得られる直接測定と完全に比肩できる結果を与える。さらに、１メガピクセルの解像度を示す標準のＣＣＤカメラでもってさえ、シャック−ハートマンが与えるものより優れた空中解像度で位相の測定を可能にすることが観測される。
他方、現在入手可能なＳＨＳセンサーは、約３０×３０画素に制限される。さらに、ＳＨＳは、ビームの明るさが低い像の端での精度が欠けている。これに反して、本発明の方法は、像の周辺であってもよい感度を位相プロファイルに与える。したがって、本発明の方法は、広範囲の応用を包含する非常に多様な特性の顕微鏡の対物レンズに対する確かさを強調している。

測定した影響関数の正確さを証明する別の方法は、変形可能ミラー６に送られてゼルニケ（Ｚｅｒｎｉｋｅ）モードを生ずるようにするコマンドベクトルを計算するために発明の方法により決定される影響関数を用いることである。既知のゼルニケモードは、６０×の対物レンズで、たとえば非点収差を修正するために選定される。結果となるＰＳＦ測定は、望んだゼルニケモードが、使用されるコマンドベクトルで正しく作れたことを示している。このことも、シャック−ハートマン（Ｓｈａｃｋ−Ｈａｒｔｍａｎｎ）の波面センサーを用いて波面測定によって確認される。

この出願で意図した主範囲は、波面成形（すなわち、収差の修正および／またはパルス応答の成形）を備えた光学顕微鏡検査であって、特に、
・作像：共焦点顕微鏡検査、多光子、超解像度等
・レーザーフォト−アブレーション；および
・光学操作：フォトアクティベーション、フォト誘起アンケージング。

本発明の較正方法と装置は、同様に、光ビームの振幅および／または位相を変調する変形可能ミラーとは別のタイプの空間光学モジュレータを備える顕微鏡に適合する。空間光学モジュレータの一般的な場合、モジュレータの各要素は、制御手段で制御されるので、光ビームの振幅および／または位相を変調する。したがって、液晶モジュレータに対しては、要素は、各画素に電圧を付与できる電極が制御する画素であって、各画素は、振幅および／または位相の所定の場所ごとの変動を生ずる。

波面測定法（直接的または干渉的）と比べると、本発明によって提案される方法と装置は、任意のタイプの光源（連続、パルス状、波長がどうあれ）、既存の少ないかあるいは何も改変しなくとも、空間光学モジュレータ、対物レンズや顕微鏡に適用され得る。さらに、本発明は、使用を意図する厳密な条件における、完全にアクティブな光学システムユニット（光源＋空間光学モジュレータ＋顕微鏡＋対物レンズ）の較正を提供する。最後に、本発明は、空間光学モジュレータの要素に与えられる異なるコマンドに対して励起パルス応答を直接実験的に測定することもできる。

既存の方法とは異なり、提案した方法は、先験的に、波面の変調を何も用いない。本発明は、三次元ＰＳＦの直接測定に基づいているが、これにより近似をしなくとも位相と強度のプロファイルを再構築できる。したがって、空間光学モジュレータ、顕微鏡および対物レンズからなる全体がアクティブな光学装置が、システムの全体の光学応答に対する１セットのコマンドの影響の関数として直接較正される。システムにおける空間光学モジュレータの厳密な位置決めは、このようにして本来的に考慮されている。

さらに、位相プロファイルの再構築に必要な計算時間は従来の方法に比べてはるかに短縮される。本発明の方法では、アクティブな要素の較正が２ＭＢのＲＡＭをもつシステムで２０〜５０秒以内で得られる。

本発明の方法と装置では、現存の顕微鏡の変形可能ミラーを効果的に統合することによって光学顕微鏡の解像度を著しく改善でき、そこでの収差を矯正できる。

較正品質の改良により、空間光学モジュレータに結合した光学顕微鏡の３Ｄ解像度が、特に、以下の点で改良できる。
・容量で均質でない生物学的サンプル、
・ミスマッチの指標の媒質に液浸したサンプル、および／または
・光学収差が残っている光学システムをもつ顕微鏡。
既存の顕微鏡を改変して、コスト的に工夫を要することなく、空間光学モジュレータとそれの較正システムと結合できる。実際、ほとんどの顕微鏡は、共通にポートを備えているが、このポートは、カメラを受け入れて対物レンズの焦点面の拡大像を形成するためのものである。

本発明の方法と装置によって、既存の顕微鏡の作像性能を、適度なコストと複雑さで著しく改善できる。

１ 光源
２ 光学システム
３ 偏光分極キューブ
４ プレート
５ａ、５ｂ 無限焦点光学システム
６ 空間光学モジュレータ
７ 光学システム
８ 顕微鏡対物レンズ
９ 入射瞳
１０ サンプル
１１ 位置決めシステム
１２ 分離板
１３ 光学システム
１４ カメラ
１５ 制御システム
１６ 脱着ミラー
１７ 波面分析器
１８ 光学結合レンズ
１９ ビーム走査器
Ｐ_１〜Ｐ_ｉ〜Ｐ_Ｎ アクチュエータ

Claims (10)

1. 空間光学モジュレータ（６）をもつ光学装置を較正するための方法であって、該光学装置は、点光源（１）と、入射ビームを受け、および／またはサンプルが反射する光学ビームを収集するようにされている大開口数の光学対物レンズ（８）と、この対物レンズ（８）の焦点面と光学的に共役な面におかれたカメラ（１４）と、カメラ（１４）の上流の光学ビームにおかれる空間光学モジュレータとを備え、前記方法は以下の工程を備える：
   （ａ）対物レンズ（８）の焦点面の近傍に反射平面サンプル（１０）を配設する工程と；
   （ｂ）サンプル（１０）に入射し、および／またはサンプルにより反射される光学ビームを変調するように、空間光学モジュレータ（６）の要素Ｐ_ｉに振幅Ｒ^ｉ _ｊのコマンドを与える工程と；
   （ｃ）対物レンズ（８）の焦点面と共役な面に強度ＰＳＦの像を得る工程と；
   （ｄ）対物レンズ（８）と反射サンプル（１０）間の相対軸方向距離を既知量Ｚで改変する工程と；
   （ｅ）サンプル（１０）と対物レンズ（８）の焦点面との間の複数の相対軸方向距離に対して、工程（ｃ）と工程（ｄ）を繰り返す工程と；
   （ｆ）要素Ｐｉの値Ｒ^ｉ _ｊに対する位相ダイバーシティアルゴリズムによって、対物レンズの焦点面と共役な面において、振幅および／または位相のプロファイルを再構築する工程と；
   （ｇ）空間光学モジュレータ（６）の要素Ｐｉに対する複数の振幅値Ｒ^ｉ _ｊに対して工程（ｂ）から（ｆ）までを繰り返す工程と；
   （ｈ）要素Ｐｉの影響関数Ｅｉを、ビームの振幅プロファイルＡおよび／または位相プロファイルφに基づいて決定する工程と；
   （ｉ）空間光学モジュレータ（６）の異なる要素Ｐｉ（ｉ＝１、・・・・、Ｎ）に対して工程（ｂ）ないし（ｈ）を繰り返す工程；さらに
   （ｊ）ビームの振幅プロファイルＡおよび／または位相プロファイルφに基づいて、空間光学モジュレータ（６）のすべての要素（Ｐ_１、・・・・Ｐ_Ｎ）の影響関数（Ｅ_１、・・・・、Ｅ_Ｎ ）を決定する工程。
2. ＰＳＦ測定は、対物レンズ（８）とサンプル（１０）との間の３つの相対軸方向距離に対して行われ、対物レンズの焦点面におけるサンプルの位置に関して、Ｚ＝（−Ｚ_０、０、＋Ｚ_０）のようにして特定されることを特徴とする請求項１に記載の較正方法。
3. 請求項２に記載の較正方法であって、ビームの振幅プロファイルおよび／または位相プロファイルの再構築工程（ｆ）は、以下の工程を備えていることを特徴とする：
   −相対的な３位置−Ｚ_０、０、＋Ｚ_０に対応する脱焦点項を推定する工程；
   −対物レンズの入射瞳内で視野プロファイルを最初に推定する工程；
   −対物レンズの入射瞳の透過プロファイルを推定する工程；
   −３つの脱焦点項それぞれにより、対物レンズの入射瞳で推定される視野プロファイルを掛け合わせて、３つの視野プロファイルを計算する工程；
   −フーリエ変換を適応して３つの相対位置−Ｚ_０、０、＋Ｚ_０に対して推定ＰＳＦを計算する工程；
   −Ｚ（−Ｚ_０、０、＋Ｚ_０）の各値のそれぞれに対して測定されたＰＳＦの値で、計算したＰＳＦの振幅を置換する工程；
   −得られた３視野に対して逆フーリエ変換を適応する工程；
   −各位置Ｚ（−Ｚ_０、０、＋Ｚ_０）にそれぞれ対応する脱焦点項で割算する工程；
   −得られた３複素数視野を平均化する工程；
   −対物レンズの入射瞳の透過プロファイルで視野平均を掛け合わせて、対物レンズの射出瞳で視野プロファイルの新規推定を得る工程；
   −１終結条件が充足されるまで振幅計算のアルゴリズムおよび／または位相プロファイル再構築の計算アルゴリズムの全工程を繰り返す工程。
4. 請求項１ないし３の１項に記載の較正方法であって、工程（ｊ）の前に追加の工程を備え、この追加の工程は、複数の要素に対するコマンドの異なった同時の組み合わせのために、工程（ｂ）ないし（ｉ）を繰り返すことを特徴とする較正方法。
5. 請求項１ないし４の１項に記載の較正方法であって、工程（ｃ）に続いて、測定したＰＳＦ像をデジタル濾波して、空間解像度を低下することおよび／または像の寸法を対物レンズ（８）の瞳（９）の寸法に適合させることを行う追加の工程からなることを特徴とする較正方法。
6. 請求項１ないし５の１項に記載の較正方法であって、工程（ｊ）に続いて、空間光学モジュレータ（６）の全要素Ｐ_１、・・・・Ｐ_Ｎの影響関数を線形回帰アルゴリズムで逆変換する追加の工程を備え、それにより空間光学モジュレータ（６）の較正を、振幅Ａ（ｘ，ｙ）＝Ｍ_Ａ（Ｒ^ｉ _ｔ）および／またはＲ^ｉ _ｔ＝Ｍ_Ａ ^−１（Ａ（ｘ，ｙ））と位相φ（ｘ，ｙ）＝Ｍ_φ（Ｒ^ｉ _ｔ）および／またはＲ^ｉ _ｔ＝Ｍ_φ ^−１（φ（ｘ，ｙ））のそれぞれにおいて、線形回帰アルゴリズムから導出することを特徴とする較正方法。
7. 空間光学モジュレータ（６）をもつ光学装置を較正するためのシステムであって、前記光学装置は、入射ビーム（１ａ）を発生する点光源（１）と、入射ビームを受け、および／またはサンプルが反射した光学ビームを集めるようになっている大きな開口数の光学対物レンズ（８）と、点光源（１）の像は対物レンズ（８）の焦点面に形成されており、複数の要素（Ｐ_１、・・・・Ｐ_Ｎ）を備えた空間光学モジュレータ（６）と、これらの要素（Ｐ_１、・・・・Ｐ_Ｎ）を制御するための手段を備え、空間光学モジュレータ（６）は光学ビーム上に置かれて入射および／または反射光学ビームを変調するようになっており、
   前記較正システムは、
   ・対物レンズ（８）の焦点面の近傍におかれる反射平面サンプル（１０）と、
   ・対物レンズ（８）の焦点面と前記サンプル（１０）との間の距離Ｚの調整手段（１１）と、
   ・前記サンプル（１０）が反射したビームの一部を受けるとともに対物レンズ（８）の焦点面の像を共役面に形成するようになっている光学システム（８、１２、１３）と、
   ・対物レンズ（８）の焦点面と光学的に共役の前記面に配置されたカメラ（１４）と、さらに
   ・距離Ｚの調整手段（１１）を制御するためのユニット、空間光学モジュレータ（６）の要素（Ｐ_１、・・・Ｐｉ・・・Ｐ_Ｎ）を制御するためのユニット、複数の距離Ｚに対して、カメラ（１４）によって獲得された像を処理し、これらから装置のＰＳＦの測定を導出するようになっているユニット、さらに、距離Ｚの調整手段（１１）と空間光学モジュレータ（６）の要素とにそれぞれ与えられるコマンドの値を、それぞれＰＳＦ測定の関数として決定するようになっている計算手段からなる制御システム（１５）と備えていることを特徴とするシステム。
8. 請求項７によるシステムであって、計算手段は、位相ダイバーシティアルゴリズムを用いてビームの振幅プロファイルおよび／または位相プロファイルを再構築する手段を備えていることを特徴とする較正システム。
9. 請求項８によるシステムであって、計算手段は、空間光学モジュレータ（６）のすべての要素（Ｐ_１、・・・・Ｐ_Ｎ）の影響関数（Ｅ_１、・・・・Ｅ_Ｎ）を、ビームの振幅プロファイルＡおよび位相プロファイルφにおいて決定するための手段を備えていることを特徴とする較正システム。
10. 請求項９によるシステムであって、計算手段は、空間光学モジュレータ（６）の全要素（Ｐ_１、・・・・Ｐ_Ｎ）の影響関数を線形回帰アルゴリズムで反転する手段と、これらにより空間光学モジュレータ（６）の較正を推定する最小化手段とを備えていることを特徴とする較正システム。
    
    

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