JP2013544377A - 光学顕微鏡において空間光学モジュレータを較正するための方法とシステム - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
理論的に言えば、PSFは、波長λで対物レンズの焦点面の中心に位置している極めて小さい点光源の像に対応している。実験的に言えば、光学顕微鏡のPSFを測定するため、ハンセル等は、サイズが顕微鏡の光学解像度の限界より小さい蛍光ボールで形成された点光源を選択する。蛍光ボールは、顕微鏡の焦点面に配置され、励起ビームで照射される。しかしながら、これらボールの蛍光の信号は、強度と時間の両方が制限され、PSF測定で得られるS/N比を制限する。信号の弱さは、非常に高感度のカメラの使用を要求し、従って、装置のコストが高くなる。他方、分析を改良するために、再構築アルゴリズムの複雑さを増す試みも行われてきた。これは、得られる成果の精度を低下させる。さらに、使用するボールは所定のサイズがあるため、PSF測定にエラーが生じ、そのため顕微鏡検査には致命的になる可能性がある。最後に、ハンセル2003とハンセル2004の出版物は、空間光学モジュレータを備える顕微鏡には関連していない。
(a)対物レンズの焦点面の近傍に反射面サンプルを配設する工程と;
(b)サンプルに入射し、および/またはサンプルにより反射される光学ビームを変調するように、空間光学モジュレータの要素Piに振幅Ri jの指令を与える工程と;
(c)対物レンズの焦点面と共役な面に強度PSFの像を得る工程と;
(d)対物レンズと反射サンプル間の相対軸方向距離を既知量Zで改変する工程と;
(e)サンプルと対物レンズの焦点面との間の複数の相対軸方向距離に対して、工程(c)と工程(d)を繰り返す工程と;
(f)要素Piの値Ri jに対する位相ダイバーシティアルゴリズムによって、対物レンズの焦点面と共役な面において、振幅および/または位相のプロファイルを再構築する工程と;
(g)空間光学モジュレータの要素Piに対する複数の振幅値Ri jに対して工程(b)から(f)までを繰り返す工程と;
(h)要素Piの影響関数Eiを、ビームの振幅プロファイルAおよび/または位相プロファイルφに基づいて決定する工程と;
(i)空間光学モジュレータの異なる要素Pi(i=1、・・・・、N)に対して工程(b)ないし(h)を繰り返す工程;さらに
(j)ビームの振幅プロファイルAおよび/または位相プロファイルφに基づいて、空間光学モジュレータのすべての要素(P1、・・・・PN)の影響関数(E1、・・・・、EN )を決定する工程。
本発明の好ましい実施の形態によれば、位相ダイバーシティによるビームの振幅および/または位相プロファイルの再構築工程(f)は、以下の工程を備える:
初期設定:
−相対的な3位置−Z0、0、+Z0に対応する脱焦点項を推定する工程;
−対物レンズの入射瞳内で視野プロファイルを最初に推定する工程;
−対物レンズの入射瞳の透過プロファイルを推定する工程;
計算のアルゴリズム:
−3つの脱焦点項それぞれにより、対物レンズの入射瞳で推定される視野プロファイルを掛け合わせて、3つの視野プロファイルを計算する工程;
−フーリエ変換を適応して3つの相対位置−Z0、0、+Z0に対して推定PSFを計算する工程;
−Z(−Z0、0、+Z0)の各値のそれぞれに対して測定されたPSFの値で、計算したPSFの振幅を置換する工程;
−得られた3視野に対して逆フーリエ変換を適応する工程;
−各位置Z(−Z0、0、+Z0)にそれぞれ対応する脱焦点項で割算する工程;
−得られた3複素数視野を平均化する工程;
−対物レンズの入射瞳の透過プロファイルで視野平均を掛け合わせて、対物レンズの射出瞳で視野プロファイルの新規推定を得る工程;および
−1終結条件が充足されるまで振幅計算のアルゴリズムおよび/または位相プロファイル再構築の計算アルゴリズムの全工程を繰り返す工程;
最終段階
−計算され、測定された3つのPSFの間の振幅の2乗偏差を計算する工程。値が収束基準(相対偏差で10−6オーダーが代表的)より低い場合には、アルゴリズムを終了する;
−フーリエ変換アルゴリズムにより、プロファイル位相を抽出し表す工程。
前記較正システムは、
・対物レンズの焦点面の近傍におかれた反射平面サンプルと、
・対物レンズの焦点面と前記サンプルの間の距離Zの調整手段と、
・前記サンプルが反射したビームの一部を受けるとともに対物レンズの焦点面の像を共役面に形成するようになっている光学システムと、
・対物レンズの焦点面と光学的に共役な前記面におかれるカメラと、さらに
・距離Zの調整手段を制御するためのユニット、空間光学モジュレータの要素(P1、・・・・PN)を制御するためのユニット、複数の距離Zに対して、カメラによって獲得された複数の像を処理し、これらから装置のPSFの測定を導出するようになっているユニット、さらに、距離Zの調整手段と空間光学モジュレータの要素とにそれぞれ与えられるコマンドの値を、PSF測定の関数として決定するようになっている計算手段を備えた制御システムを備えている。
・位相ダイバーシティアルゴリズムを用いてビームの振幅および/または位相プロファイルを再構築する手段;
・空間光学モジュレータのすべての要素P1、・・・・PNの影響関数(E1、・・・・EN)を振幅プロファイルAおよび/または位相プロファイルφにおいて決定するための手段;および/または
・空間光学モジュレータの全要素P1、・・・・PNの影響関数を線形回帰アルゴリズムで反転する手段と、空間光学モジュレータの較正を推定する最小化手段とを備えている。
本発明の較正方法も、直立反転または水平の顕微鏡の場合に該当する。すべての場合、平面鏡を焦点の近くで用いており、必要なら、顕微鏡のスライドをその上におき、顕微鏡用オイルか光学接着剤の一滴で固定してよい。
図4は、位相ダイバーシティアルゴリズムに基づく本発明の較正方法の主な工程を示している。
・システムの初期設定(工程20)、平面ミラー10は、このミラーと対物レンズ8の焦点面との間の距離Z0で特定される、対物レンズの焦点面近傍の第1位置に位置付けられている工程と、
・コマンドベクトルを変形可能ミラー6に送信(工程30)して、励起および/または反射の光学ビームを変調する工程(工程40)と、
・全光学装置の三次元PSFを測定する工程(工程50〜60)と、
・三次元PSF測定に基づいて顕微鏡の入射瞳のレベルで位相および/または強度を再構築する工程(工程70)と、
・各アクチュエータ(変形可能ミラー6が線形の場合)あるいはアクチュエータのコマンドの各可能な組み合わせ(変形可能ミラー6が線形でない場合)の影響が既知になるまで、異なるコマンドベクトルを繰り返す工程(工程80〜90)と、さらに
・影響関数を逆変換してそこから変形可能なミラーの較正を推定する工程(工程100)である。
・励起ビームを反射する対物レンズ8の焦点面の近傍に配置された平面鏡10と、対物レンズの焦点面と共役な面におかれるカメラ14とにより実施される顕微鏡の強度PSFの測定工程と、
・サンプルキャリヤか対物レンズの軸方向ずれの装置を用いて、平面ミラーの3つの異なる既知の軸方向位置の3つPSF測定を獲得する工程(工程50〜60)と、
・対物レンズ8の瞳9の面における励起ビームの位相および振幅のプロファイルを、反復アルゴリズムを用いる3軸PSF測定から、係数内に再構築する工程(工程70)と、
・変形可能ミラーの各アクチュエータの異なる位置に対して先行する工程を反復する工程(工程30〜70)と、
・(三次元PSFを決定する)対物レンズの入口において、光学視野に対する変形可能ミラーのアクチュエータの複素数影響関数を計算する工程(工程80〜90)と、さらに、
・PSFが決定した顕微鏡の光学特性に対する変形可能ミラーの影響を、そのまま完全かつ本来的に決定する工程(工程100)である。
工程毎に以下詳細に説明する。
I−PSFの測定
たとえば、図1に示した配置を考察してみる。ここでの仮定は、対物レンズ8の透過が入射瞳9の全体にわたって均一であること、対物レンズ8、半反射板12およびレンズ13はビームの波面で何も収差を生じないことである。CCDカメラ14では、対の対物レンズ8とレンズ13の倍率で拡大したPSFの像が、直接的に対物レンズ8の焦点面に関して軸方向位置2×Z0で測定されることを示すことができる。したがって、平面ミラー10と顕微鏡対物レンズ8との間の距離Z0を変化させることになり、システムのPSFの三次元像を再構築できる。
図5ないし図7は、位相ダイバーシティアルゴリズムによる三次元PSFからビームの振幅および/または位相プロファイルを再構築するアルゴリズムを実施する一例を模式的に図示している。
用いたアルゴリズムによって、位相と振幅のプロファイルがパラメータだけで完全に再構築できるようになる。パラメータは、カメラ画素の寸法、ビームの波長、焦点面とカメラの面間の光学倍率、用いた3つの位置Z0間の軸方向ずれ、対物レンズの開口数、用いた浸漬媒体の指標である。これらのパラメータの値によれば、アルゴリズムの収束を加速化するために、出発像を切り取ったり(得られる位相と強度のプロファイルにおける最終解像度の低下)、あるいは「封印」(再構築したプロファイルを過剰なマージンを避けるため、顕微鏡の入射瞳の寸法に調節すること)することができる。最近のコンピュータ(2MB RAM、2GHZのプロセッサ)を用いる本例では、再構築には位相プロファイル当たり約2秒かかる。
変形可能ミラー6の動作が線形である最新の事例では、較正は、各アクチュエータRiの(ビームのプロファイルに関する)影響関数Eiを決定することによって得られる。この方法は、図7の工程ダイヤグラムによって模式的に示されている。各アクチュエータRiは次から次へと較正される。すなわち、(線形範囲に対して少なくとも2つの値の)一連のコマンドがアクチュエータRiに送信されて、対応するプロファイルが各コマンド値に対して測定される。最終的に得られる異なるプロファイルの調整によって、各要素Riの影響関数Eiが決定できる。
線形のふるまいをするミラーの場合、ミラーの実働要素に、位相が異なったコマンド値で得られると、線形回帰の工程を用いて、各実働要素の影響関数を算定する。次に、与えられた位相と振幅のプロファイルを得るためミラーに送るコマンドベクトルを決定したいならば、追加の工程を用いてコマンドマトリックスを得る。このマトリックスは、(モード当たり1係数ベクトルで記述してある)獲得したいモード(ゼルニケまたは他の)の組み合わせを、実働要素のそれぞれに送るコマンドベクトルと直接リンクする。たとえば、ゼルニケモードを作りたいならば、各影響関数Eiを、作りたいゼルニケモードに基づいて分解して、このように得られたマトリックスを疑似的に反転してコマンドマトリックスを得る。
図1に模式的に図示してあるような組立体によるテストスタンドで、測定を行ってきた。反射に用いた変形可能ミラー6は、顕微鏡対物レンズ8の入射瞳9と共役になっている。変形可能ミラーは52台のアクチュエータを備えている。用いる対物レンズ8によるスライドでおそらく覆われた平面鏡10は、対物レンズ8と平面鏡10との間に相対移動を与える圧電型の位置決めシステム11に設けられている。PSFの検知は、1200×800画素のマトリックスをもつ8−ビットのCCDカメラで行われる。
・開口数0.75(入射瞳13.5mm)の滑り補正した空中20×倍率の対物レンズ、
・スライドなしで開口数0.4(入射瞳9mm)の空中10×倍率の対物レンズ、および
・開口数1.2(入射瞳5.4mm)滑り補正した水中60×倍率の対物レンズ。
本発明の方法による対物レンズの瞳の平面における位相再構築は、3枚の対物レンズに対して、シャック−ハートマン(Shack−Hartmann)波面センサーで得られる直接測定と完全に比肩できる結果を与える。さらに、1メガピクセルの解像度を示す標準のCCDカメラでもってさえ、シャック−ハートマンが与えるものより優れた空中解像度で位相の測定を可能にすることが観測される。
他方、現在入手可能なSHSセンサーは、約30×30画素に制限される。さらに、SHSは、ビームの明るさが低い像の端での精度が欠けている。これに反して、本発明の方法は、像の周辺であってもよい感度を位相プロファイルに与える。したがって、本発明の方法は、広範囲の応用を包含する非常に多様な特性の顕微鏡の対物レンズに対する確かさを強調している。
・作像:共焦点顕微鏡検査、多光子、超解像度等
・レーザーフォト−アブレーション;および
・光学操作:フォトアクティベーション、フォト誘起アンケージング。
・容量で均質でない生物学的サンプル、
・ミスマッチの指標の媒質に液浸したサンプル、および/または
・光学収差が残っている光学システムをもつ顕微鏡。
既存の顕微鏡を改変して、コスト的に工夫を要することなく、空間光学モジュレータとそれの較正システムと結合できる。実際、ほとんどの顕微鏡は、共通にポートを備えているが、このポートは、カメラを受け入れて対物レンズの焦点面の拡大像を形成するためのものである。
2 光学システム
3 偏光分極キューブ
4 プレート
5a、5b 無限焦点光学システム
6 空間光学モジュレータ
7 光学システム
8 顕微鏡対物レンズ
9 入射瞳
10 サンプル
11 位置決めシステム
12 分離板
13 光学システム
14 カメラ
15 制御システム
16 脱着ミラー
17 波面分析器
18 光学結合レンズ
19 ビーム走査器
P1〜Pi〜PN アクチュエータ
Claims (10)
- 空間光学モジュレータ(6)をもつ光学装置を較正するための方法であって、該光学装置は、点光源(1)と、入射ビームを受け、および/またはサンプルが反射する光学ビームを収集するようにされている大開口数の光学対物レンズ(8)と、この対物レンズ(8)の焦点面と光学的に共役な面におかれたカメラ(14)と、カメラ(14)の上流の光学ビームにおかれる空間光学モジュレータとを備え、前記方法は以下の工程を備える:
(a)対物レンズ(8)の焦点面の近傍に反射平面サンプル(10)を配設する工程と;
(b)サンプル(10)に入射し、および/またはサンプルにより反射される光学ビームを変調するように、空間光学モジュレータ(6)の要素Piに振幅Ri jのコマンドを与える工程と;
(c)対物レンズ(8)の焦点面と共役な面に強度PSFの像を得る工程と;
(d)対物レンズ(8)と反射サンプル(10)間の相対軸方向距離を既知量Zで改変する工程と;
(e)サンプル(10)と対物レンズ(8)の焦点面との間の複数の相対軸方向距離に対して、工程(c)と工程(d)を繰り返す工程と;
(f)要素Piの値Ri jに対する位相ダイバーシティアルゴリズムによって、対物レンズの焦点面と共役な面において、振幅および/または位相のプロファイルを再構築する工程と;
(g)空間光学モジュレータ(6)の要素Piに対する複数の振幅値Ri jに対して工程(b)から(f)までを繰り返す工程と;
(h)要素Piの影響関数Eiを、ビームの振幅プロファイルAおよび/または位相プロファイルφに基づいて決定する工程と;
(i)空間光学モジュレータ(6)の異なる要素Pi(i=1、・・・・、N)に対して工程(b)ないし(h)を繰り返す工程;さらに
(j)ビームの振幅プロファイルAおよび/または位相プロファイルφに基づいて、空間光学モジュレータ(6)のすべての要素(P1、・・・・PN)の影響関数(E1、・・・・、EN )を決定する工程。 - PSF測定は、対物レンズ(8)とサンプル(10)との間の3つの相対軸方向距離に対して行われ、対物レンズの焦点面におけるサンプルの位置に関して、Z=(−Z0、0、+Z0)のようにして特定されることを特徴とする請求項1に記載の較正方法。
- 請求項2に記載の較正方法であって、ビームの振幅プロファイルおよび/または位相プロファイルの再構築工程(f)は、以下の工程を備えていることを特徴とする:
−相対的な3位置−Z0、0、+Z0に対応する脱焦点項を推定する工程;
−対物レンズの入射瞳内で視野プロファイルを最初に推定する工程;
−対物レンズの入射瞳の透過プロファイルを推定する工程;
−3つの脱焦点項それぞれにより、対物レンズの入射瞳で推定される視野プロファイルを掛け合わせて、3つの視野プロファイルを計算する工程;
−フーリエ変換を適応して3つの相対位置−Z0、0、+Z0に対して推定PSFを計算する工程;
−Z(−Z0、0、+Z0)の各値のそれぞれに対して測定されたPSFの値で、計算したPSFの振幅を置換する工程;
−得られた3視野に対して逆フーリエ変換を適応する工程;
−各位置Z(−Z0、0、+Z0)にそれぞれ対応する脱焦点項で割算する工程;
−得られた3複素数視野を平均化する工程;
−対物レンズの入射瞳の透過プロファイルで視野平均を掛け合わせて、対物レンズの射出瞳で視野プロファイルの新規推定を得る工程;
−1終結条件が充足されるまで振幅計算のアルゴリズムおよび/または位相プロファイル再構築の計算アルゴリズムの全工程を繰り返す工程。 - 請求項1ないし3の1項に記載の較正方法であって、工程(j)の前に追加の工程を備え、この追加の工程は、複数の要素に対するコマンドの異なった同時の組み合わせのために、工程(b)ないし(i)を繰り返すことを特徴とする較正方法。
- 請求項1ないし4の1項に記載の較正方法であって、工程(c)に続いて、測定したPSF像をデジタル濾波して、空間解像度を低下することおよび/または像の寸法を対物レンズ(8)の瞳(9)の寸法に適合させることを行う追加の工程からなることを特徴とする較正方法。
- 請求項1ないし5の1項に記載の較正方法であって、工程(j)に続いて、空間光学モジュレータ(6)の全要素P1、・・・・PNの影響関数を線形回帰アルゴリズムで逆変換する追加の工程を備え、それにより空間光学モジュレータ(6)の較正を、振幅A(x,y)=MA(Ri t)および/またはRi t=MA −1(A(x,y))と位相φ(x,y)=Mφ(Ri t)および/またはRi t=Mφ −1(φ(x,y))のそれぞれにおいて、線形回帰アルゴリズムから導出することを特徴とする較正方法。
- 空間光学モジュレータ(6)をもつ光学装置を較正するためのシステムであって、前記光学装置は、入射ビーム(1a)を発生する点光源(1)と、入射ビームを受け、および/またはサンプルが反射した光学ビームを集めるようになっている大きな開口数の光学対物レンズ(8)と、点光源(1)の像は対物レンズ(8)の焦点面に形成されており、複数の要素(P1、・・・・PN)を備えた空間光学モジュレータ(6)と、これらの要素(P1、・・・・PN)を制御するための手段を備え、空間光学モジュレータ(6)は光学ビーム上に置かれて入射および/または反射光学ビームを変調するようになっており、
前記較正システムは、
・対物レンズ(8)の焦点面の近傍におかれる反射平面サンプル(10)と、
・対物レンズ(8)の焦点面と前記サンプル(10)との間の距離Zの調整手段(11)と、
・前記サンプル(10)が反射したビームの一部を受けるとともに対物レンズ(8)の焦点面の像を共役面に形成するようになっている光学システム(8、12、13)と、
・対物レンズ(8)の焦点面と光学的に共役の前記面に配置されたカメラ(14)と、さらに
・距離Zの調整手段(11)を制御するためのユニット、空間光学モジュレータ(6)の要素(P1、・・・Pi・・・PN)を制御するためのユニット、複数の距離Zに対して、カメラ(14)によって獲得された像を処理し、これらから装置のPSFの測定を導出するようになっているユニット、さらに、距離Zの調整手段(11)と空間光学モジュレータ(6)の要素とにそれぞれ与えられるコマンドの値を、それぞれPSF測定の関数として決定するようになっている計算手段からなる制御システム(15)と備えていることを特徴とするシステム。 - 請求項7によるシステムであって、計算手段は、位相ダイバーシティアルゴリズムを用いてビームの振幅プロファイルおよび/または位相プロファイルを再構築する手段を備えていることを特徴とする較正システム。
- 請求項8によるシステムであって、計算手段は、空間光学モジュレータ(6)のすべての要素(P1、・・・・PN)の影響関数(E1、・・・・EN)を、ビームの振幅プロファイルAおよび位相プロファイルφにおいて決定するための手段を備えていることを特徴とする較正システム。
- 請求項9によるシステムであって、計算手段は、空間光学モジュレータ(6)の全要素(P1、・・・・PN)の影響関数を線形回帰アルゴリズムで反転する手段と、これらにより空間光学モジュレータ(6)の較正を推定する最小化手段とを備えていることを特徴とする較正システム。
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