JP2013542945A - 治療を送達するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞または被験体に治療を送達するための組成物および方法を提供する。

Description

本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、２０１０年１１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／４０９，３７２号明細書および２０１１年８月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／５２６，９７６号明細書に対する優先権を主張するものである。前述の出願は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。

本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）／国立薬物乱用研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ａｂｕｓｅ）から与えられた助成金１ＰＯ１ＤＡ０２６１４６−０１の下で、政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

本発明は、全般的に、治療の送達に関する。より具体的には、本発明は、ウイルス感染の治療のために患者に治療剤を送達するための組成物および方法に関する。

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の治療における、抗レトロウイルス薬のバイオアベイラビリティ、薬理、細胞毒性、および投与間隔を改善する必要性が認識されている（Ｂｒｏｄｅｒ，Ｓ．（２０１０）Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｒｅｓ．，８５：１−１８；Ｅｓｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｒｅｓ．，８５：２５−３３；Ｍｏｒｅｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，６５：８２７−８３５）。抗レトロウイルス剤療法（ＡＲＴ）の導入以来、ＨＩＶ−１感染に関連した死亡および併存症の発生率は両方とも劇的に減少した。ナノ製剤化されたインジナビル（ＩＤＶ）が体内分布および抗レトロウイルス効果を改善しうることが実証されてきた（Ｄｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０８：２８２７−２８３５；Ｄｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３：６６１−６６９；Ｄｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３５８：１４８−１５８；Ｎｏｗａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：９０３−９１７）。しかし、ＨＩＶに感染した個体におけるウイルス複製の完全な抑制を妨害するＡＲＴに付随した多くの制限が依然として存在する。これらの制限には、不十分な薬物動態（ＰＫ）および体内分布、生涯にわたる治療、ならびに複数の有害な毒性副作用が含まれる（Ｇａｒｖｉｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ａｄｏｌｅｓｃ．Ｈｅａｌｔｈ ４４：１２４−１３２；Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｔ．（２００６）ＡＩＤＳ Ｐａｔｉｅｎｔ Ｃａｒｅ ＳＴＤｓ ２０：６−１８；Ｒｏｙａｌ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＡＩＤＳ Ｃａｒｅ ２１：４４８−４５５）。抗レトロウイルス薬は体内から迅速に排出され、すべての器官にもれなく浸透するとは限らないため、投与スケジュールは複雑になり、かつ大量の薬物が必要となる傾向がある。患者は、最適以下のアドヒアランスに導く治療ガイドラインに適切に従うことに困難を覚え、耐性ウイルスを発生させるリスクを増加させ、その結果、疾患の治療不成功および増悪の加速がもたらされうる（Ｄａｎｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９：６６−７６）。精神疾患および精神障害ならびに／または薬物乱用も経験しているＨＩＶ感染患者にとっては、治療に適切なアドヒアランスはさらに一層困難である（Ｍｅａｄｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＡＩＤＳ Ｐａｔｉｅｎｔ Ｃａｒｅ ＳＴＤｓ ２３：２５９−２６６；Ｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．，５０：９３−９９）。

したがって、細胞取り込みを最適化し、細胞内安定性を改善し、薬物放出を延長し、抗レトロウイルス効果を維持し、かつ輸送細胞内での細胞毒性を最小化する薬物送達システムの必要性がある。

本発明に従って、少なくとも１つの治療剤および少なくとも１つの界面活性剤を含む結晶性ナノ粒子を提供する。特定の実施形態では、界面活性剤は両親媒性ブロックコポリマーである。特定の実施形態では、界面活性剤は、マクロファージターゲティングリガンドなど、少なくとも１つのターゲティングリガンドに連結されている。特定の実施形態では、治療剤は、抗ウイルス化合物、抗レトロウイルス化合物、または抗ＨＩＶ化合物である。少なくとも本発明のナノ粒子および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物も提供する。

本発明の別の態様に従って、器官に治療剤をターゲティングするための方法、および被験体の疾患または障害を治療、抑制、または予防するための方法を提供する。特定の実施形態では、本方法は、本発明の少なくとも１つのナノ粒子を被験体に投与することを含む。特定の実施形態では、本方法は、脳に治療剤をターゲティングすることを含む。特定の実施形態では、本方法は、ＨＩＶ感染を治療、抑制、または予防することを目的とし、ナノ粒子の治療剤は抗ＨＩＶ化合物である。特定の実施形態では、本方法は、疾患または障害のための少なくとも１つのさらなる治療剤または療法、例えば、少なくとも１つの追加の抗ＨＩＶ化合物を投与することをさらに含む。

図１は、ナノＡＲＴの形態およびナノＡＲＴの細胞取り込みを示す画像である。０．２μｍポリカーボネート濾過膜上にある、ＩＤＶＭ（１００１〜Ｍ１００５）、ＲＴＶ（Ｍ２００１〜Ｍ２００５）、ＡＴＶ（Ｍ３００１〜Ｍ３００５）、およびＥＦＶ（Ｍ４００１〜Ｍ４００５）のナノ製剤の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析（倍率、１５，０００倍）。ＩＤＶナノＡＲＴはすべて、縁が粗い球形から楕円形であった；リトナビル（ＲＴＶ）ナノＡＲＴは、縁が滑らかな太い棒に類似していた；アタザナビル（ＡＴＶ）ナノＡＲＴは、縁が滑らかな細い棒に類似していた；そしてエファビレンツ（ＥＦＶ）ナノＡＲＴは、縁が粗い球形から楕円形であった。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）（倍率、１５，０００倍）は、Ｍ１００４、Ｍ２００６、Ｍ３００１、およびＭ４００２に曝露されたＭＤＭの中へのナノＡＲＴの取り込みを示した。細胞内では、各タイプのナノＡＲＴは、形状により容易に同定可能であり、ＩＤＶ（Ｍ１００４）、ＲＴＶ（Ｍ２００６）、ＡＴＶ（Ｍ３００１）、およびＥＦＶ（Ｍ４００２）に対する例を示す。すべてのフレームの尺度バーは１．０μｍに等しい。 図２は、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）へのＩＤＶ、ＲＴＶ、ＡＴＶおよびＥＦＶナノＡＲＴの取り込みの時間経過を示す。ナノＡＲＴで処理し、１、２、４、および８時間に収集した培養ＭＤＭの細胞溶解物のＩＤＶ（図２Ａ）、ＲＴＶ（図２Ｂ）、ＡＴＶ（図２Ｃ）、またはＥＦＶ（図２Ｄ）レベルを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりアッセイした。データは、各時点当たりｎ＝３の測定に対する平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。 図３は、ＭＤＭへのナノＡＲＴの取り込みの曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。ＩＤＶ（図３Ａ）、ＲＴＶ（図３Ｂ）、ＡＴＶ（図３Ｃ）およびＥＦＶ（図３Ｄ）の取り込みのＡＵＣは、１００μΜナノＡＲＴで処理し、１、２、４、および８時間後に収集した培養ＭＤＭの細胞溶解物において測定した。データは、各処理当たりｎ＝３の測定に対する平均ＡＵＣを表す。 図４は、薬物の取り込み、放出、および抗レトロウイルス活性に基づいた、ナノＡＲＴ製剤のスコアリングを示す。^ａ８時間にわたる、ＭＤＭ中の薬物濃度のＡＵＣに基づいた薬物の取り込み。^ｂ１５日間にわたる、ＭＤＭ中に保持された薬物濃度のＡＵＣに基づいた細胞保持。^ｃ１５日間にわたる、培地中に放出された薬物濃度のＡＵＣに基づいた培地放出。^ｄ１５日間にわたる、感染ＭＤＭに由来する上清の逆転写酵素（ＲＴ）活性のＡＵＣから決定された抗レトロウイルス活性。^ｅスコア化されたパラメーターの平均値に基づいたＧＯ／ＮＯＧＯ。 図５Ａは、ＩＤＶおよびＲＴＶのナノＡＲＴの細胞保持および放出の時間経過を示す。細胞溶解物および細胞培地における、ＩＤＶまたはＲＴＶのレベルを、ナノＡＲＴ処理後１、５、１０、および１５日目にＨＰＬＣによりアッセイした。データは、各時点当たりｎ＝３の測定に対する平均値±ＳＥＭを表す。Ｍ１００２〜Ｍ１００５の場合、ＩＤＶレベルは、１５日目の培地において検出できなかった（検出限界：０．０２５μｇ／ｍｌ）。 図５Ｂは、ＡＴＶおよびＥＦＶのナノＡＲＴの細胞保持および放出の時間経過を示す。細胞溶解物および細胞培地における、ＡＴＶまたはＥＦＶのレベルを、ナノＡＲＴ処理後１、５、１０、および１５日目にＨＰＬＣによりアッセイした。データは、各時点当たりｎ＝３の測定に対する平均値±ＳＥＭを表す。 図６は、ナノＡＲＴの抗レトロウイルス効果を示す。ナノＡＲＴによる前処理後１５日目にＨＩＶ−１_ＡＤＡに曝露されたＭＤＭにおける抗レトロウイルス作用を、ウイルス曝露後１０日目のＲＴ活性で測定したときの比較。ＲＴ活性は、^３Ｈ−ＴＴＰ取り込みにより測定した。データは、各処理当たりｎ＝８の測定値に対する平均値を表す。 図７は、ナノＡＲＴで処理された細胞のＨＩＶ−１ ｐ２４抗原の発現を示す。ナノＡＲＴによる前処理後１〜１５日目にＨＩＶ−１_ＡＤＡに曝露されたＭ１００２とＭ１００４、Ｍ２００２とＭ２００４、Ｍ３００１とＭ３００５、ならびにＭ４００３とＭ４００５の抗レトロウイルス作用の比較。それぞれのウイルス暴露後１０日目に、細胞をＨＩＶ−１ ｐ２４抗原に対して免疫染色した。両ＩＤＶ製剤、Ｍ２００２（ＲＴＶ）、およびＭ３００５（ＡＴＶ）で処理された細胞では、時間経過につれて、ウイルス阻害が徐々に消失し、ＨＩＶ ｐ２４発現が増加することが示された；一方、Ｍ２００４（ＲＴＶ）、Ｍ３００１（ＡＴＶ）、および両ＥＦＶ製剤で処理された細胞では、ウイルスｐ２４発現の完全な抑制または顕著に改善された抑制が示された。しかし、ウイルスの劇的な発現が起こったナノＡＲＴ処理細胞においても、ｐ２４発現は、ナノＡＲＴで処理されなかったＨＩＶ−１感染細胞よりも少なかった。 図８は、リトナビルナノ粒子およびその細胞との相互作用の特性評価を示す。図８Ａは物理的性質の測定値ならびにｍＰＥＧ_２０００−ＤＳＰＥ／１８８の内層コーティングおよびＤＯＴＡＰの外層コーティングの図示と共に、ＲＴＶ−ＮＰを示す図である。サイズおよび電荷は動的光散乱により決定した。各読み取りは少なくとも４回反復し、分散は２％未満であった。０．２μｍポリカーボネート膜上のＲＴＶ−ＮＰの走査型電子顕微鏡（倍率、１５，０００倍）が縁が滑らかな短い棒に類似の典型的な形態を示す（図８Ｂ）。１２時間にわたる、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）におけるＲＴＶ−ＮＰの取り込みおよび１５日間にわたる、ＭＤＭ内部におけるＲＴＶ−ＮＰの保持（左側ｙ軸）および周辺培地への薬物の放出（右側ｙ軸）は、高速液体クロマトグラフィーにより測定した（図８Ｃおよび８Ｄ）。蛍光ＲＴＶ−ＮＰに曝露されたＭＤＭのフローサイトメトリーデータおよび蛍光ＲＴＶ−ＮＰに曝露されたＭＤＭの高速液体クロマトグラフィーデータにより、クラスリン阻害剤ＤｙｎａｓｏｒｅでＭＤＭを処理すると取り込みが顕著に減少することが実証される（図８Ｅおよび８Ｆ）。データはすべて、ｎ＝３の平均値±平均値の標準誤差を表す。 図９は、ＲＴＶ−ＮＰ存在場所のプロテオーム解析を示す。透過型電子顕微鏡（倍率１５，０００倍）によって、細胞内ＲＴＶ−ＮＰが、明瞭な膜結合コンパートメント内に同定された（図９Ａ）。図９Ｂは、細胞内局在工程を示す図である。ＲＴＶ−ＮＰをブリリアントブルー−２５０で標識し、ＭＤＭに曝露した。細胞を溶解し、細胞内コンパートメントをショ糖密度勾配遠心により分離した。バンドは、ＲＴＶ−ＮＰを含有するコンパートメントを表す。これらのバンドを収集し、タンパク質を電気泳動により分離した。ゲル内トリプシン消化に続いて、液体クロマトグラフィー／質量分析を使用してタンパク質を同定した。図９Ｃは、同定されたタンパク質の細胞内分布を示すグラフである。合計３８のエンドソームタンパク質が同定された。プロテオ−ム解析により、ＲＴＶ−ＮＰ分布が主として、再循環エンドソーム（ＲＥ）および初期エンドソーム（ＥＥ）コンパートメントであることが示された。 図１０は、リトナビル−ナノ粒子を含有するエンドソームに関連したタンパク質マーカーを示す表である。^†各タンパク質について同定されたユニークな有意（ｐ＜０．０５）ペプチドの数。^＊ＤＮＡ配列から計算される初期翻訳産物の理論分子量。§ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇでアクセス可能）の受託番号。¶推定細胞内局在（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ、ｌｏｃａｔｅ．ｉｍｂ．ｕｑ．ｅｄｕ．ａｕ、およびｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄを参照のこと）。＃推定細胞機能（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ、ｌｏｃａｔｅ．ｉｍｂ．ｕｑ．ｅｄｕ．ａｕ、およびｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄを参照のこと）。ＣＣＰ：クラスリン被覆ピット；Ｌ：リソソーム；ＬＥ：後期エンドソーム；ＭＶＢ：多小胞体；ＳＥ：選別エンドソーム。 図１１は、ナノ粒子の細胞内局在の免疫組織学的同定を示す。共焦点顕微鏡検査により、エンドサイトーシスコンパートメント内のＲＴＶ−ＮＰの分布を確認した（図１１Ａ〜Ｈ）。ピアソンの共局在係数により、ＲＴＶ−ＮＰが、初期エンドソームのＲａｂ８またはＲａｂ７エンドソームおよびリソソームと比較して、Ｒａｂ１１およびＲａｂ１４の再循環エンドソームに優先的に分布することが示される（図１１Ｉ）。ｐＨｒｏｄｏ（商標）−デキストランビーズにより同定された、酸性化された（分解）コンパートメント内のＲＴＶ−ＮＰ分布の分析は、細胞内のＲＴＶ−ＮＰのバイパス分解の可能性を示すオーバーラップが最小であることを示し、主として放出のために再循環される。トランスフェリンとの高いＲＴＶ−ＮＰ共局在は、粒子の再循環が最も可能性が高いことを示す。尺度バーは１μｍに等しい。グラフデータは、ｎ＝３に対する平均値±平均値の標準誤差を表す。 図１２は、ナノ粒子の細胞内局在の検証を示す。ｓｉＲＮＡによるエンドサイトーシス再循環の破壊（Ｒａｂ８、１１、および１４）およびブレフェルジンＡによる細胞分泌の破壊は、関連タンパク質のノックアウトをもたらし、ＲＴＶ−ＮＰを単球由来マクロファージ内に再分布させた（図１２Ａおよび１２Ｂ）。それぞれの場合に、ｓｉＲＮＡ処理は、大型液胞内の核周囲領域でＲＴＶ−ＮＰの凝集をもたらした。特異タンパク質のｓｉＲＮＡサイレンシングがウエスタンブロットにより確認された（図１２Ｃ）。細胞内（図１２Ｄ）および培養液中（図１２Ｅ）のＲＴＶ−ＮＰの高速液体クロマトグラフィーによる定量により、エンドサイトーシス再循環の破壊および分泌の阻害が、ＲＴＶ−ＮＰの細胞内保持を有意に高め、かつ放出を減少させることが実証された。上位ｐ値は、対照細胞との差が有意であることを示し、下位ｐ値は、スクランブルｓｉＲＮＡで処理された細胞との差が有意であることを示す。尺度バーは１μｍに等しい。グラフデータは、ｎ＝３に対する平均値±平均値の標準誤差を表す。 図１３は、リトナビルナノ粒子がエンドサイトーシス選別の間に輸送されることを示す。薬物結晶それ自体ではなく、ポリマーコートに結合する脂溶性色素（ＤｉＤまたはＤｉＯ）でＲＴＶ−ＮＰを標識したので、薬物のエンドサイトーシス分布が標識ポリマーと一致するか否かが試験された。ＲＴＶ−ＮＰによるＭＤＭの処理およびその後に続く細胞内コンパートメントの免疫単離ならびに薬剤含量のＨＰＬＣ分析（図１３Ａ）。図１３Ｂは、ＨＰＬＣ分析前の免疫単離したエンドソームコンパートメントと磁気ビーズを示す画像である；Ｒａｂ１１チューブ中のビーズペレット上にある白い物質が、ＲＴＶ−ＮＰで満たされたエンドソームと推察された。図１３Ｃは、免疫単離したコンパートメントのＨＰＬＣ分析のグラフである。これにより、Ｒａｂ１１エンドソーム中のＲＴＶ量がＥＥＡ１またはＬＡＭＰ１のいずれよりも多いことが確認される。グラフデータは、ｎ＝３に対する平均値±平均値の標準誤差を表す。^†対照と有意に（ｐ＜０．０１）異なる。^＃Ｒａｂ１１と有意に（ｐ＜０．０１）異なる。 図１４は、リトヴァニルナノ粒子がインタクトで放出され、それらの抗レトロウイルス効果が保持されていることを示す。本来のＲＴＶ−ＮＰの走査型電子顕微鏡（倍率１５，０００倍）（図１４Ａ）および周囲培地中に細胞から放出されたＲＴＶ−ＮＰの走査型電子顕微鏡（倍率１５，０００倍）（図１４Ｂ）である。ＲＴＶ−ＮＰを超遠心分離により溶解した薬物から分離し、微粒子形態および溶解形態の両方における薬物の合計薬物に対するパーセントが示される。合計薬物濃度は４０μｇ／ｍｌであった（図１４Ｃ）。単球由来マクロファージを、遊離ＲＴＶ、本来のＲＴＶ−ＮＰ、または放出されたＲＴＶ−ＮＰで処理した後、ＨＩＶに曝露した。放出されたＲＴＶ−ＮＰによる単球由来マクロファージの処理により、ｐ２４染色および多核巨細胞の形成（図１４Ｄ）、ＲＴ活性測定（図１４Ｅ）、およびｐ２４染色密度（図１４Ｆ）で示されるように、本来の（エンドシトーシスされなかった）粒子と同様なレベルにウイルス感染が減少した。ＲＴ活性およびｐ２４密度測定の双方について、データはすべて、ｎ＝４に対する平均値±平均値の標準誤差を表す。 図１５は、リトナビルナノ粒子の可能性のある細胞内経路の概略図である。ＲＴＶ−ＮＰはクラスリン被覆ピットを介してＭＤＭに入り、次いで、初期エンドソーム（ＥＥ）コンパートメントに輸送される。ＥＥコンパートメントからは、粒子には３つの異なる運命がありうる：Ｒａｂ４＋または１４＋エンドソームを介して迅速に再循環する；後期エンドソームに移行し、ＥＳＣＲＴ機構により部分的に調節されて、分泌リソソームとして最終的に放出される；または、大部分の粒子については、長期間貯留することになる再循環エンドソーム（ＲＥ）コンパートメントに輸送され、Ｒａｂ１１＋エンドソームを介して緩除に再循環する。 図１６は、葉酸（ＦＡ）末端ポロキサマー（Ｐ１８８およびＰ４０７）の合成を示す概略図である。 図１７は、ＡＴＶナノ懸濁液の形態を示す画像である。０．２μｍポリカーボネート膜上のＡＴＶナノ製剤の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ；倍率１５，０００倍）。ＡＴＶナノ製剤はすべて、ポリマーコーティングのタイプにかかわらず棒状であった。バー＝１ミクロン。 図１８は、非修飾Ｐ１８８またはＦＡ−Ｐ１８８を含有するＡＴＶナノ懸濁液の取り込みを示す。図１８Ａは、粒子が１０％または３０％のＦＡ−Ｐ１８８でコーティングされた場合に、活性化されていないヒト単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）へのＡＴＶナノ懸濁液の取り込みが増強されることを示す。図１８Ｂは、５０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで２４時間、前処理されたＭＤＭにおいて、ＡＴＶナノ懸濁液の取り込みが変化しなかったことを示す。図１８Ｃは、２０％ＦＡ−Ｐ１８８でコーティングされたＡＴＶナノ懸濁液の取り込みの増強が、２．５ｍＭ遊離葉酸の添加によって減弱することを示す。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。 図１９は、ＦＡ−Ｐ４０７で修飾されたＡＴＶナノ懸濁液の取り込みを示す。Ｐ４０７−ＡＴＶナノ懸濁液の取り込みは、ポリマーコーティング中へのＦＡ−Ｐ４０７の包含により増強された。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。 図２０は、葉酸修飾ポロキサマーを含有するおよび含有しないＡＴＶナノ懸濁液のマクロファージによる取り込み、保持、および放出を示す。Ｐ４０７を含有するＡＴＶナノ懸濁液の取り込みは、Ｐ１８８を含有するＡＴＶナノ懸濁液の取り込みよりも増強された。非結合ポロキサマーコーティングＡＴＶナノ懸濁液に対して葉酸結合ポロキサマーコーティングＡＴＶナノ懸濁液の取り込みが改善されていることが観察された。１５日間を通したＡＴＶナノ懸濁液の細胞保持プロフィールは、すべてのポリマーコーティングについて同様であり、初期細胞負荷に依存した。培地中へのＡＴＶ持続放出は、すべての製剤に対して１５日間を通して同様であった。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。 図２１は、ＡＴＶナノ懸濁液の抗レトロウイルス作用を示す。ＡＴＶナノ懸濁液を８時間負荷し、次いで薬物処理後、１、５、１０、および１５日目にＨＩＶ−１_ＡＤＡに曝露した細胞に由来する培地中の逆転写酵素（ＲＴ）活性。ＲＴ活性は^３Ｈ−ＴＴＰの取り込みにより測定した。データは、Ｎ＝８測定の平均を表す。 図２２は、ＡＴＶナノ懸濁液を負荷し、ＨＩＶ−１_ＡＤＡで感染させたＭＤＭにおけるＨＩＶ−１ ｐ２４＋染色を示す。ＭＤＭは、ナノＡＲＴで８時間負荷し、次いで培地からＡＴＶナノ懸濁液を除去した後、１、５、１０、１５日目にＨＩＶ−１ウイルスに曝露した。尺度バーは±２５０ミクロン。 図２３は、マンノース末端Ｆ１２７（マンノース−Ｆ１２７）の合成を示す概略図である。 図２４は、葉酸ＡＴＶナノＡＲＴのＭＤＭへの取り込みを示す。Ｐ１８８−ＦＡ、Ｆ１２７−ＦＡ、およびＦ１２７−Ｍはそれぞれ、葉酸−Ｆ６８ＡＴＶナノＡＲＴ、葉酸−Ｆ１２７ＡＴＶナノＡＲＴ、およびマンノース−Ｆ１２７ＡＴＶナノＡＲＴのＭＤＭへの取り込みを表す。Ｐ１８８およびＦ１２７は、非ターゲティングＦ６８およびＦ１２７ＡＴＶナノＡＲＴのＭＤＭへの取り込みを表す。

ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）感染に対する長期間抗レトロウイルス剤療法（ＡＲＴ）は、代謝および細胞毒性の異常を誘導する一方、薬物動態および体内分布に制限を示す。また、ＡＲＴは複雑な投与スケジュールを通常必要とし、耐性ウイルスの出現および治療不成功をもたらす。本発明のナノ製剤化されたＡＲＴ組成物は、そのような制限を排除して、臨床成績の改善に影響を与える。本明細書では、クラスリン依存エンドシトーシスに続いて、ナノ粒子（ＮＰ）が初期エンドソームから再循環エンドソームへの経路に選別されて、リソソーム分解を回避することを実証した。粒子はインタクトのまま放出され、完全な抗レトロウイルス効果を保持した。これらの結果は、粒子の完全性および抗レトロウイルス活性の両方を維持する、抗レトロウイルスナノ製剤の細胞内輸送の可能な経路を提供し、ターゲティング薬物送達に対してこの手法が高い有用性を有することを実証する。実際に、ＮＰの細胞内存在場所およびＮＰの除放性は、長期間抗レトロウイルス効果の基礎となる。さらに、データは、マクロファージなどの細胞が薬物トランスポーターとして機能し、かつ重要なことには、輸送において薬物積載粒子を分解も修飾もしないことを実証する。そのため、生物学的に活性な薬物は、それが目的とする標的部位に変化せずに送達される。

本発明は、細胞に化合物を送達するためのナノ粒子を包含する。特定の実施形態では、ナノ粒子は被験体に抗レトロウイルス剤療法を送達するためのものである。本発明のナノ粒子は、少なくとも１つの目的化合物および少なくとも１つの界面活性剤を含む。ナノ粒子のこれらの成分は、他の任意選択の成分と共に、以下に記載される。

Ｉ．治療剤
本発明のナノ粒子は、細胞または被験体（非ヒト動物を含む）に、任意の薬剤または化合物、特に生物活性剤（例えば治療剤または診断薬）を送達するために使用することができる。本明細書で使用する用語「生物活性剤」には、薬物または植物保護剤の開発における潜在的なリードとしてスクリーニングされる化合物も含まれる。生物活性剤および治療剤としては、限定はされないが、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、核酸、合成薬および天然薬、ペプトイド、ポリエン、マクロサイル（ｍａｃｒｏｃｙｌｅｓ）、グリコシド、テルペン、テルペノイド、脂肪族化合物および芳香族化合物、小分子、ならびにそれらの誘導体および塩が挙げられる。特定の実施形態では、治療剤は、合成薬および天然薬などの化学物質である。本発明の組成物および方法により、任意のタイプの化合物を細胞または被験体に送達することができるが、本発明の以下の説明は化合物を治療剤として例示する。

本発明のナノ粒子は少なくとも１つの治療剤を含む。ナノ粒子は、一般に、治療剤の結晶性（結晶特性がある固体）ナノ粒子であり、典型的には、約９９％純度の治療剤を含む。特定の実施形態では、ナノ粒子は、界面活性剤（下記に記載）溶液に、治療剤、特に治療剤の遊離塩基形態を加え、次いで、湿式粉砕または高圧ホモジナイゼーションによりナノ粒子を生成することにより合成される。治療剤および界面活性剤の溶液を撹拌した後、湿式粉砕または高圧ホモジナイゼーションを行ってもよい。

特定の実施形態では、得られるナノ粒子は直径が最大１μｍである。特定の実施形態では、ナノ粒子の直径は、約２００ｎｍ〜約５００ｎｍであり、具体的には約２５０〜３５０ｎｍである。特定の実施形態では、ナノ粒子は、不規則形状でも円形状でもなく、棒状、具体的には細長い棒状である。本発明のナノ粒子は、中性であっても荷電していてもよい。ナノ粒子は、正に荷電しても負に荷電してもよい。

治療剤は、疎水性であっても、水不溶性化合物であっても、または水難溶性化合物であってもよい。例えば、治療剤は、ｐＨ範囲０〜１４、具体的にはｐＨ４と１０の間で、具体的には２０℃にて、約１０ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、より具体的には約１００μｇ／ｍｌ未満、およびより具体的には約２５μｇ／ｍｌ未満の水溶性または水溶媒溶解性であってよい。

特定の実施形態では、本発明のナノ粒子の治療剤は抗菌剤である。別の実施形態では、治療剤は抗ウイルス剤、より具体的には抗レトロウイルス剤である。抗レトロウイルス剤は、レンチウイルスに有効または特異的でありうる。レンチウイルスとしては、限定はされないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡ）が挙げられる。特定の実施形態では、治療剤は抗ＨＩＶ剤である。

抗ＨＩＶ化合物または抗ＨＩＶ剤はＨＩＶを阻害する化合物である。抗ＨＩＶ剤の例としては、限定はされないが、以下のものが挙げられる。

（Ｉ）ヌクレオシドアナログ系逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）。ＮＲＴＩは、ＨＩＶ−１逆転写酵素の活性を阻害するヌクレオシドおよびヌクレオチドならびにそれらのアナログを指す。ヌクレオシドアナログ系逆転写酵素阻害剤の例としては、限定はされないが、アデフォビルピボキシルが挙げられる。

（ＩＩ）非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）。ＮＮＲＴＩは、ＨＩＶ逆転写酵素上の非基質結合部位に可逆的に結合し、それによって活性部位の形状を変化させるかまたはポリメラーゼ活性を阻止するアロステリック阻害剤である。ＮＮＲＴＩの例としては、限定はされないが、デラビルジン（ＢＨＡＰ、Ｕ−９０１５２；ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ（登録商標））、エファビレンツ（ＤＭＰ−２６６、ＳＵＳＴＩＶＡ（登録商標））、ネビラピン（ＶＩＲＡＭＵＮＥ（登録商標））、ＰＮＵ−１４２７２１、カプラビリン（Ｓ−１１５３、ＡＧ−１５４９）、エミビリン、（＋）−カラノリドＡ（ＮＳＣ−６７５４５１）およびＢ、エトラビリン（ＴＭＣ−１２５）、リルピビリン（ＴＣ２７８、Ｅｄｕｒａｎｔ（商標））、ＤＡＰＹ（ＴＭＣ１２０）、ＢＩＬＲ−３５５ ＢＳ、ＰＨＩ−２３６、およびＰＨＩ−４４３（ＴＭＣ−２７８）が挙げられる。

（ＩＩＩ）プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）。プロテアーゼ阻害剤は、ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤である。プロテアーゼ阻害剤の例としては、限定はされないが、ダルナビル、アンプレナビル（１４１Ｗ９４、ＡＧＥＮＥＲＡＳＥ（登録商標））、チプラニビル（ＰＮＵ−１４０６９０、ＡＰＴＩＶＵＳ（登録商標））、インジナビル（ＭＫ−６３９；ＣＲＩＸＩＶＡＮ（登録商標））、サキナビル（ＩＮＶＩＲＡＳＥ（登録商標）、ＦＯＲＴＯＶＡＳＥ（登録商標））、ホスアンプレナビル（ＬＥＸＩＶＡ（登録商標））、ロピナビル（ＡＢＴ−３７８）、リトナビル（ＡＢＴ−５３８、ＮＯＲＶＩＲ（登録商標））、アタザナビル（ＲＥＹＡＴＡＺ（登録商標））、ネルフィナビル（ＡＧ−１３４３、ＶＩＲＡＣＥＰＴ（登録商標））、ラシナビル（ＢＭＳ−２３４４７５／ＣＧＰ−６１７５５）、ＢＭＳ−２３２２６２３、ＧＷ−６４０３８５Ｘ（ＶＸ−３８５）、ＡＧ−００１８５９、およびＳＭ−３０９５１５が挙げられる。

（ＩＶ）融合阻害剤（ＦＩ）。融合阻害剤は、ＨＩＶエンベロープタンパク質に結合してウイルスが宿主細胞と融合するのに必要な構造変化を阻止することにより作用する、ペプチドなどの化合物である。融合阻害剤の例としては、限定はされないが、マラビロク（Ｓｅｌｚｅｎｔｒｙ（登録商標）、Ｃｅｌｓｅｎｔｒｉ）、エンフビルチド（ＩＮＮ、ＦＵＺＥＯＮ（登録商標））、Ｔ−２０（ＤＰ−１７８、ＦＵＺＥＯＮ（登録商標））、およびＴ−１２４９が挙げられる。

（Ｖ）インテグラーゼ阻害剤。インテグラーゼ阻害剤は、宿主細胞のＤＮＡにウイルスゲノムを挿入するウイルスの酵素であるインテグラーゼの作用を阻止するように設計された抗レトロウイルス薬のクラスである。融合阻害剤の例としては、限定はされないが、ラルテグラビル、エルビテグラビル、およびＭＫ−２０４８が挙げられる。

抗ＨＩＶ化合物にはさらに、限定はされないが、ＡＬＶＡＣ（商標登録） ＨＩＶ（ｖＣＰ１５２１）、ＡＩＤＳＶＡＸ（登録商標）Ｂ／Ｅ（ｇｐｌ２０）、およびそれらの組合せなどのＨＩＶワクチンが含まれる。抗ＨＩＶ化合物にはさらに、ＨＩＶ抗体（例えば、ｇｐｌ２０またはｇｐ４１に対する抗体）、具体的には広範な中和抗体が含まれる。

特定の実施形態では、本発明の抗ＨＩＶ剤は、プロテアーゼ阻害剤であるＮＮＲＴＩまたはＮＲＴＩである。特定の実施形態では、抗ＨＩＶ剤は、インジナビル、リトナビル、アタザナビル、およびエファビレンツからなる群から選択される。具体的には、異なる作用機序を有する場合には、２種類以上の抗ＨＩＶ剤を使用してもよい。特定の実施形態では、抗ＨＩＶ療法は、高活性抗レトロウイルス剤療法（ＨＡＡＲＴ）である。

ＩＩ．界面活性剤
上述したように、本発明のナノ粒子は少なくとも１つの界面活性剤を含む。「界面活性剤」は、湿潤剤、洗浄剤、分散剤、または乳化剤と通常呼ばれる物質を含む界面活性剤を指す。界面活性剤は通常両親媒性の有機化合物である。特定の実施形態では、界面活性物質は両親媒性ブロックコポリマーである。特定の実施形態では、ナノ粒子の少なくとも１つの界面活性剤は、両親媒性ブロックコポリマー、具体的には、ポリ（オキシプロピレン）の少なくとも１つのブロックおよびポリ（オキシエチレン）の少なくとも１つのブロックを含むコポリマーである。

本発明の特定の実施形態では、界面活性剤は、ナノ粒子を合成するために（上記に記載のように）、ナノ粒子および／または界面活性剤の溶液中に約０．０００１％〜約５％の範囲の濃度で存在する。特定の実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．１％〜約２％の範囲にある。

本発明の界面活性剤は、荷電していても中性であってもよい。特定の実施形態では、界面活性剤は、正または負に荷電しており、具体的には負に荷電している。

特定の実施形態では、両親媒性ブロックコポリマーは、ポリ（オキシエチレン）の少なくとも１つのブロックおよびポリ（オキシプロピレン）の少なくとも１つのブロックを含むコポリマーである。両親媒性ブロックコポリマーは、以下の式で示すブロックコポリマーにより例示される。

式中、ｘ、ｙ、ｚ、ｉ、およびｊは、約２〜約８００、具体的には約５〜約２００、より具体的には約５〜約８０の値を示し、式（ＩＶ）および（Ｖ）で示される各Ｒ１、Ｒ２ペアについては、一方は水素であり、他方はメチル基である。当業者は、ｘ、ｙ、およびｚの値は、統計的平均を通常示し、ｘおよびｚの値は、必ずではないが、同じであることが多いことを認識している。式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）ついては、実際は、Ｂブロック内のイソプロピレン基の配向がランダムになるという点で簡素化され過ぎている。このランダム配向は、式（ＩＶ）および（Ｖ）では示されており、これらの式はより完全である。このようなポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）化合物は、Ｓａｎｔｏｎ（Ａｍ．Ｐｅｒｆｕｍｅｒ Ｃｏｓｍｅｔ．（１９５８）７２（４）：５４−５８）；Ｓｃｈｍｏｌｋａ（Ｌｏｃ．ｃｉｔ．（１９６７）８２（７）：２５−３０）、Ｓｃｈｉｃｋ，ｅｄ．（Ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ Ｓｕｉｆａｃｔａｎｔｓ，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９６７ ｐｐ．３００−３７１）により記載されている。このような化合物のいくつかは、「リポロキサマー（ｌｉｐｏｌｏｘａｍｅｒｓ）」、「Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）」、「ポロキサマー」、および「シンペロニクス（ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃｓ）」などの総称商品名で市販されている。Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）に典型的なＡ−Ｂ−Ａ式とは対照的なＢ−Ａ−Ｂ式内のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）コポリマーは、多くの場合、「逆の」Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）、「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｒ」または「メロキサポール（ｍｅｒｏｘａｐｏｌ）」と呼ばれる。一般に、ブロックコポリマーは、親水性の「Ａ」と疎水性の「Ｂ」のブロックセグメントを有するものとして記載することができる。したがって、例えば、式Ａ−Ｂ−Ａのコポリマーは、別の親水性ブロックに結合した疎水性ブロックに結合した親水性ブロックからなるトリブロックコポリマーである。式（ＩＶ）の「ポリオキサミン（ｐｏｌｙｏｘａｍｉｎｅ）」ポリマーは、商品名Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）でＢＡＳＦから入手可能である。式（ＩＶ）で表わされるポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロックの順序を逆転して、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ Ｒ（登録商標）を創製することが可能であり、これは、ＢＡＳＦからも入手可能である（Ｓｃｈｍｏｌｋａ，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ．Ｓｏｃ．（１９７９）５９：１１０を参照のこと）。

ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーはまた、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの反復単位のランダムな混合物を含む親水性ブロックを有するように設計することができる。ブロックの親水性を維持するために、エチレンオキシドを優勢にすることができる。同様に、疎水性ブロックは、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの反復単位の混合物であってもよい。このようなブロックコポリマーは、商品名Ｐｌｕｒａｄｏｔ（商標）でＢＡＳＦから入手可能である。第１セグメントを構成するポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロック単位は、エチレンオキシドのみからなる必要はない。また、Ｂ−タイプセグメントがすべて、プロピレンオキシド単位のみからなる必要もない。代わりに、最も簡単な場合には、例えば、セグメントＡにおけるモノマーの少なくとも１つを側鎖基で置換してもよい。

いくつかのポロキサマーコポリマーは、下記の式を満たすように設計される。

ポロキサマーの例としては、限定はされないが、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ３１、Ｌ３５、Ｆ３８、Ｌ４２、Ｌ４３、Ｌ４４、Ｌ６１、Ｌ６２、Ｌ６３、Ｌ６４、Ｐ６５、Ｆ６８、Ｌ７２、Ｐ７５、Ｆ７７、Ｌ８１、Ｐ８４、Ｐ８５、Ｆ８７、Ｆ８８、Ｌ９２、Ｆ９８、Ｌ１０１、Ｐ１０３、Ｐ１０４、Ｐ１０５、Ｆ１０８、Ｌ１２１、Ｌ１２２、Ｌ１２３、Ｆ１２７、１０Ｒ５、１０Ｒ８、１２Ｒ３、１７Ｒ１、１７Ｒ２、１７Ｒ４、１７Ｒ８、２２Ｒ４、２５Ｒ１、２５Ｒ２、２５Ｒ４、２５Ｒ５、２５Ｒ８、３１Ｒ１、３１Ｒ２、および３１Ｒ４が挙げられる。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ブロックコポリマーは、接頭文字に２桁または３桁の数字を続けて名付けられる。接頭文字（Ｌ、Ｐ、またはＦ）は、各ポリマーの物理的形態（液体、ペースト、またはフレーク化可能な固体）を指す。数字コードは、ブロックコポリマーの構造パラメーターを定義する。このコードの最後の桁は、ＥＯブロックの重量含量を１０重量パーセント単位で近似する（例えば、その桁が８であれば８０重量％、その桁が１であれば１０重量％である）。残りの上１桁または上２桁は、中心ＰＯブロックの分子量をコードする。コードを判読する場合は、対応する数字に３００を乗じて、ダルトン（Ｄａ）単位でのおよその分子量を得るべきである。したがって、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ命名法では、参考文献がない場合に、ブロックコポリマーの特性を評価するための便利なアプローチが得られる。例えば、コード「Ｆ１２７」は、固体で、３６００Ｄａ（１２×３００）のＰＯブロックと７０重量％のＥＯとを有するブロック共重合体を定義する。各Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ブロックコポリマーの正確な分子特性は製造業者から得ることができる。

他の生体適合性両親媒性コポリマーには、Ｇａｕｃｈｅｒら（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．（２００５）１０９：１６９−１８８）に記載のものが含まれる。他のポリマーの例としては、限定はされないが、ポリ（２−オキサゾリン）両親媒性ブロックコポリマー、ポリエチレングリコール−ポリ乳酸（ＰＥＧ−ＰＬＡ）、ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＥＧ、ポリエチレングリコールポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＥＧ−ＰＬＧ）、ポリエチレングリコール−ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール−ポリカプロラクトン（ＰＥＧ−ＰＣＬ）、ポリエチレングリコール−ポリアスパルタート（ＰＥＧ−ＰＡｓｐ）、ポリエチレングリコール−ポリ（グルタミン酸）（ＰＥＧ−ＰＧｌｕ）、ポリエチレングリコール−ポリ（アクリル酸）（ＰＥＧ−ＰＡＡ）、ポリエチレングリコール−ポリ（メタクリル酸）（ＰＥＧ−ＰＭＡ）、ポリエチレングリコール−ポリ（エチレンイミン（ＰＥＧ−ＰＥＩ）、ポリエチレングリコール−ポリ（Ｌ−リジン）（ＰＥＧ−ＰＬｙｓ）、ポリエチレングリコール−ポリ（２−（Ν，Ν−ジメチルアミノ）メタクリル酸エチル）（ＰＥＧ−ＰＤＭＡＥＭＡ）、およびポリエチレングリコール−キトサン誘導体が挙げられる。

特定の実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、１，２−ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン−メチル−ポリエチレングリコールコンジュゲート−２０００（ｍＰＥＧ_２０００ＤＳＰＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および１，２−ジオレオイロキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ））からなる群から選択される少なくとも１つを含む。

本発明の界面活性剤は、ターゲティングリガンドに連結されてもよい。ターゲティングリガンドは、特定の組織型または細胞型に特異的に結合する化合物である。特定の実施形態では、ターゲティングリガンドは細胞表面マーカー／受容体に対するリガンドである。ターゲティングリガンドは、標的となる組織または細胞型に優先的または独占的に発現する細胞表面マーカー（例えば、タンパク質または炭水化物）に免疫学的に特異的な抗体またはその断片であってもよい。ターゲティングリガンドは、界面活性剤に直接連結されてもリンカーを介して連結されてもよい。一般に、リンカーは、界面活性剤に共有結合でリガンドを結合させる、共有結合を含む化学成分または一続きの原子である。リンカーは、リガンドおよび界面活性剤の合成的に可能な任意の位置に連結することができる。代表的なリンカーは、場合によっては置換された；飽和もしくは不飽和の；直鎖、分枝、もしくは環状アルキル基、または場合によっては置換されたアリール基を少なくとも１つ含むことができる。リンカーはまた、ポリペプチド（例えば、約１〜約１０、具体的には約１〜約５のアミノ酸）であってもよい。リンカーは非分解性であってもよく、かつ生理的環境または条件下で実質的に切断されないか全く切断されない共有結合または任意の他の化学構造であってもよい。

特定の実施形態では、ターゲティングリガンドは、マクロファージターゲティングリガンドである。マクロファージターゲティングリガンドとしては、限定はされないが、葉酸受容体リガンド（例えば、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）（葉酸（ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ））ならびに葉酸受容体抗体およびその断片（例えば、Ｓｕｄｉｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．，４１：１４７−１６２を参照のこと）、マンノース受容体リガンド（例えば、マンノース）、およびホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ）リガンド（例えば、Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＦ））が挙げられる。以下に実証されるように、マクロファージへのナノ粒子のターゲティングは、遊離薬物または非ターゲティングナノ粒子と比較して、中枢神経系ターゲティング（例えば、脳ターゲティング）、より優れた肝臓ターゲティング、排出率低下、毒性低下、半減期の延長を提供する。

ＩＩＩ．投与
本発明は、本発明の少なくとも１つのナノ粒子（時として本明細書ではナノＡＲＴとして言及される）および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物を包含する。上述のように、ナノ粒子は２つ以上の治療剤を含んでもよい。特定の実施形態では、組成物は、第１の治療剤を含む第１のナノ粒子と第２の治療剤を含む第２のナノ粒子とを含み、ここで、第１の治療剤と第２の治療剤は異なる。本発明の組成物は、他の治療剤（例えば、他の抗ＨＩＶ化合物）をさらに含んでもよい。

本発明はまた、微生物感染（例えば、ウイルスまたは細菌）、具体的にはレトロウイルスまたはレンチウイルスの感染、具体的にはＨＩＶ感染（例えばＨＩＶ−１）を予防、抑制、および／または治療するための方法を包含する。本発明の医薬組成物は、ＨＩＶ感染を治療／阻止するために、動物、具体的には哺乳動物、より具体的にはヒトに投与することができる。本発明の医薬組成物はまた、少なくとも１つの他の抗微生物剤、具体的には少なくとも１つの他の抗ＨＩＶ化合物／剤を含んでもよい。追加の抗ＨＩＶ化合物はまた、本発明の抗ＨＩＶ ＮＰとは別の組成物で投与してもよい。これらの組成物は、同時に投与しても別に（例えば、連続して）投与してもよい。

本発明の組成物の投与における投薬量範囲は、所望の作用（例えば、ＨＩＶ感染、その症状（例えば、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ）、またはそれに対する素因の治癒、緩和、治療、および／または予防）をもたらすのに十分な範囲である。特定の実施形態では、本発明の組成物は、より低用量、例えば、約５０ｍｇ／ｋｇ以下、約２５ｍｇ／ｋｇ以下、または約１０ｍｇ／ｋｇ以下で投与される。投薬量は、望まれない交差反応、アナフィラキシー反応等の有害な副作用を引き起こすほど高くすべきではない。一般に、投薬量は、患者の年齢、症状、性別、疾患の程度に応じて異なり、当業者によって決定されうる。投薬量は、何らかの禁忌（ｃｏｕｎｔｅｒ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）がある事象では、個々の医師によって調整されうる。

本明細書に記載のナノ粒子は、一般に、医薬調製物として患者に投与することになる。本明細書で使用する用語「患者」は、ヒトまたは動物の被験体を指す。これらのナノ粒子は、医師の指導の下で治療上使用されうる。治療剤が本明細書で例示されるが、任意の生物活性剤、例えば診断薬またはイメージング剤を患者に投与することができる。

本発明のナノ粒子を含む組成物は、薬学的に許容可能な任意の担体と共に、投与のために好都合に製剤化することができる。例えば、複合体は、水、緩衝食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、オイル、洗浄剤、懸濁化剤、またはそれらの適切な混合物などの許容される媒体と共に製剤化することができる。選ばれた媒体中のナノ粒子の濃度を変えることは可能であり、媒体は、医薬調製物の所望の投与ルートに基づいて選ぶことができる。いかなる従来の媒体または薬剤でも、投与されるナノ粒子と適合しない場合を除いて、医薬調製物中でそれを使用することが考えられる。

特定の患者への投与に適した、本発明によるナノ粒子の用量および投与計画は、患者の年齢、性別、体重、全身健康状態、およびナノ粒子の投与目的である特定の症状およびその重症度を考慮して、医師により決定することができる。医師はまた、投与ルート、医薬担体、およびナノ粒子の生物活性を考慮に入れることができる。

適切な医薬調製物の選択は、選ばれた投与方法にも依存することになる。例えば、本発明のナノ粒子は、直接注射または静脈内に投与することができる。この実例では、医薬調製物は、注射部位と適合する媒体中に分散したナノ粒子を含む。

本発明のナノ粒子は任意の方法で投与することができる。例えば、本発明のナノ粒子は、限定はされないが、非経口的に、皮下に、経口的に、局所的に、肺に、直腸に、経膣的に、静脈内に、腹腔内に、髄腔内に、脳内に、硬膜外に、筋肉内に、皮内に、または頸動脈内に投与することができる。特定の実施形態では、ナノ粒子は静脈内にまたは腹腔内に投与される。注射用の医薬調製物は当技術分野で知られている。ナノ粒子を投与する方法として注射が選択された場合には、十分な量の分子または細胞がその標的細胞に到達して生物学的作用を発揮することを確認する工程を取らなければならない。経口投与のための投与剤形としては、限定はされないが、錠剤（例えば、コーティングおよび非コーティング、噛み砕き可能）、ゼラチンカプセル剤（例えば、軟質または硬質）、ロゼンジ剤、トローチ剤、溶液、乳剤、懸濁液、シロップ剤、エリキシル剤、粉末／果粒（例えば、再構成可能または分散性）、ガム、および発泡錠が挙げられる。非経口投与のための投与剤形としては、限定はされないが、溶液、乳剤、懸濁液、分散液、および再構成用粉末／果粒が挙げられる。局所投与のための投与剤形としては、限定はされないが、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、塗布剤、パッチ、および経皮送達システムが挙げられる。

薬学的に許容可能な担体との親和的な混合物中の有効成分として本発明のナノ粒子を含有する医薬組成物を、従来の医薬配合技術に従って調製することができる。担体は、投与、例えば静脈内、経口、直接注射、頭蓋内、硝子体内投与のために望ましい調製形態に応じて多種多様な形態を取ることができる。

本発明の医薬調製物は、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために投薬量単位形態で製剤化することができる。本明細書で使用する場合、投薬量単位形態は、治療を受けている患者に適した医薬調製物の物理的に別々の単位を指す。各投薬量は、選択された医薬担体と共同して所望の作用をもたらすように計算された有効成分量を含有すべきである。適切な投薬量単位を決定するための手順は、当業者には周知である。

投薬量単位は患者の体重に基づいて、比例的に増加または減少させることができる。当技術分野で知られているように、特定の病的症状の緩和にとって適切な濃度を、投薬量濃度曲線を計算することにより決定することができる。

本発明に従って、ナノ粒子の投与に適切な投薬量単位を、動物モデルにおける分子または細胞の毒性評価により決定することができる。医薬調製物中の種々の濃度のナノ粒子をマウスに投与することができ、その処置の結果として観察された有益な結果および副作用に基づいて、最小および最大の投薬量を決定することができる。適切な投薬量単位はまた、他の標準薬と組み合わせたナノ粒子治療の効果を評価することにより決定することができる。ナノ粒子の投薬量単位は、検出された効果に従って、個別にまたは各治療と組み合わせて決定することができる。

ナノ粒子を含む医薬調製物は、病的症状が減少または緩和するまで、適切な間隔、例えば少なくとも１日２回以上で投与することができ、その後投与量を維持レベルに減少させることができる。特定の症例における適切な間隔は、患者の容態に通常依存することになる。

本発明は、疾患／障害を治療する方法であって、本発明のナノ粒子および具体的には少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法を包含する。本発明はまた、生体外療法を介して被験体を治療する方法を包含する。具体的には、本方法は、被験体から細胞を取り出こと、その細胞を本発明のナノ粒子にインビトロで曝露／接触させること、およびその細胞を被験体に戻すことを含む。特定の実施形態では、細胞はマクロファージを含む。疾患または障害を治療する他の方法を、本発明の方法と組み合わせることができ、本発明の組成物と同時投与することができる。

本発明はまた、本発明のナノ粒子を細胞にインビトロで（例えば培養で）送達することを含む。ナノ粒子は少なくとも１つの担体で細胞に送達してもよい。

ＩＶ．定義
「薬学的に許容可能な」は、動物およびより具体的にはヒトにおける使用に対して、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認されたもの、または米国薬局方もしくは他の一般に認められ薬局方に収載されたものを指す。

「担体」は、例えば、本発明の活性薬剤と共に投与される希釈剤、アジュバント、防腐剤（例えば、チメロゾール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、乳化剤、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、抗菌剤、増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、賦形剤、補助剤、またはビヒクルを指す。薬学的に許容可能な担体は、石油、動物、植物、または合成起源のものを含む、水およびオイルなどの無菌液体であってもよい。水または生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセリンの水溶液は、具体的には注射液用担体として使用することができる。適切な医薬担体は、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；およびＫｉｂｂｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎに記載されている。

本明細書で使用する用語「治療する」は、患者症状（例えば、１つまたは複数の徴候）の改善、症状進行の遅延を含む、疾患に苦しむ患者に利益をもたらす任意のタイプの治療を指す。特定の実施形態では、レトロウイルス感染の治療は、少なくとも感染細胞数の抑制／減少をもたらす。

化合物または医薬組成物の「治療有効量」は、特定の障害または疾患の徴候を予防、抑制、治療、または低減するのに有効な量を指す。本明細書における微生物感染（例えば、ＨＩＶ感染）の治療は、微生物感染、その徴候、またはそれに対する素因を治癒、緩和、および／または予防することを指すことができる。

本明細書で使用する用語「治療剤」は、症状、疾患、または障害を治療するかまたは症状、疾患または障害の徴候を低減するために使用することができる、限定はされないが、核酸、ペプチド、タンパク質、および抗体を含む化学物質または生体分子を指す。

本明細書で使用する用語「小分子」は、比較的低分子量（例えば、４，０００未満、２，０００未満、具体的には１ｋＤａ未満または８００Ｄａ未満）の物質または化合物を指す。典型的には、小分子は有機物であり、アミノ酸またはジペプチドである可能性はあるが、タンパク質でも、ポリペプチドでも、核酸でもない。

本明細書で使用する用語「抗菌剤」は、細菌、真菌類、ウイルス、または原生動物などの微生物の成長を阻止または阻害する物質を示す。

本明細書で使用する用語「抗ウイルス剤」は、ウイルスを破壊するかまたはウイルスの複製（再生産）を抑制する物質を指す。

本明細書で使用する用語「高活性抗レトロウイルス剤療法」（ＨＡＡＲＴ）は、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、および融合阻害剤などの療法を種々組み合わせたＨＩＶ療法を指す。

本明細書で使用する用語「両親媒性」は、水および脂質／無極性環境の両方に溶解する能力を意味する。典型的には、両親媒性化合物は親水性部分と疎水性部分とを含む。「疎水性」は、無極性環境に対する選好を示す（例えば、疎水性物質または部分は、水よりも炭化水素などの無極性溶媒に容易に溶解または湿潤する）。本明細書で使用する用語「親水性」は、水に溶解する能力を意味する。

本明細書で使用する用語「ポリマー」は、２つ以上の反復単位またはモノマーの化学的結合から形成される分子を示す。用語「ブロックコポリマー」は、最も単純には、各ポリマーセグメントが同種の２つ以上の隣接した単位を含む、少なくとも２つの異なるポリマーセグメントのコンジュゲートを指す。

「抗体」または「抗体分子」は、特異抗原に結合する抗体およびその断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む、任意の免疫グロブリンである。本明細書で使用する場合、抗体または抗体分子は、インタクトな免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の融合物を想定する。

本明細書で使用する用語「免疫学的に特異的な」は、目的のタンパク質または化合物の１つまたは複数のエピトープに結合するが、抗原性生体分子の混合集団を含有する試料中の他の分子を実質的に認識および結合しないタンパク質／ポリペプチド、具体的には抗体を指す。

以下の実施例は、本発明の実行方法を例示的に提供するもので、本発明の範囲を限定する意図はまったくない。

実施例１
組織の聖域、具体的には中枢神経系（ＣＮＳ）のウイルス複製を減弱させる必要性が大いにある（Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．，６：７７１−７８４；Ｖａｒａｔｈａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｒｅｓ．，８２：Ａ９９−Ａ１０９）。そのような目標を達成する１つの方法は、ナノ製剤化薬物送達手法の適用によってである（Ｍａｌｌｉｐｅｄｄｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄ．，５：５３３−５４７；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，６２：５０３−５１７；Ｎｏｗａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｎｏｍｅｄ．，４：５５７−５７４；ｄａｓ Ｎｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，６２：４５８−４７７）。実際、ナノ製剤化化合物は、二次的な細胞および組織の毒性を同時に低減しながら、抗レトロウイルス剤療法（ＡＲＴ）の薬物動態および薬力学に良好な影響を与える（Ｃｈｉｒｅｎｊｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｅｃｔ．Ｔｈｅｒ．，８：１１７７−１１８６；Ｄｅｓｔａｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＢＭＣ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，９：１９８；Ｄｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０８：２８２７−２８３５；Ｄｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８３：６６１−６６９；Ｍａｈａｊａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｕｒｒ．ＨＩＶ Ｒｅｓ．，８：３９６−４０４；Ｐａｒｉｋｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８３：１０３５８−１０３６５；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１８：１１７−１２３）。さらに、ナノ製剤化薬物の細胞仲介輸送により、罹病器官、具体的には中枢神経系への薬物の送達が改善される見込みがあることが示された（Ｄｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８３：６６１−６６９）。このシステムは、血液由来マクロファージがナノ製剤化物質を取り込み、細胞内コンパートメント内にそれらを貯蔵し、血管壁を横切って活動性疾患部位に薬物を送達する能力に基づいている。食作用、排除、抗原提示、および分泌機能に加えて、マクロファージは、ウイルスの潜伏場所、ウイルス輸送の担体、および進行中のＨＩＶ−１複製のリザーバーとしても機能する（Ｂｅｎａｒｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ ７：２９；Ｋｕｒｏｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，８７：５６９−５７３；Ｌｅ Ｄｏｕｃｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ ７：３２；Ｐｅｒｓｉｄｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，７４：６９１−７０１）。

薬物送達システムでは、ＨＩＶ−１感染に対する抗レトロウイルス剤療法（ＡＲＴ）送達のために単球マクロファージを利用することができる（Ｄｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８３：６６１−６６９；Ｄｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３５８：１４８−１５８；Ｎｏｗａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：５９２−６０１；Ｎｏｗａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：９０３−９１７）。ここで、ナノ製剤化薬物は、抗レトロウイルス薬結晶から構成され、インジナビル（ＩＤＶ）、リトナビル（ＲＴＶ）、アタザナビル（ＡＴＶ）、およびエファビレンツ（ＥＦＶ）を含む。個々の親薬物について、大型結晶を界面活性剤の存在下で湿式粉砕によりナノ粒子（ＮＰ）に細分化することができる。これらのミクロからナノ製剤化抗レトロウイルス薬は、「ナノＡＲＴ」と呼ばれる。次いで、マクロファージを使用してナノＡＲＴを取り込み、長期間にわたりそれらを徐々に放出することができる。ナノ製剤化薬物の構造および組成は、安定性、細胞間相互作用、効果、および細胞毒性に重要な影響を及ぼす（Ｃａｌｄｏｒｅｒａ−Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．，７：４７９−４９５；Ｄｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ７：Ｓ４０３−Ｓ４１０；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３１：４３８−４４８；Ｚｏｌｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １５１：４５８−４６５）。

本明細書では、治療効果を目的とした、ナノＡＲＴの細胞ベースの送達のための単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）プラットフォームの最適化を、製造、特性評価、および薬力学を改善することにより実施する。水難溶性薬物の結晶性ナノ粒子を製造するために以前使用されていたので、湿式粉砕を開発に使用した。これにより臨床的使用のためにスケールアップが可能になる（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）５７：１０５０−１０５７；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．，３０：２３３−２４５）。

材料および方法
ナノＡＲＴの調製および特性評価
リトナビル（ＲＴＶ）（Ｓｈｅｎｇｄａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）およびエファビレンツ（ＥＦＶ）（Ｈｅｔｅｒｏ Ｌａｂｓ ＬＴＤ．，Ｈｙｄｅｒａｂａｄ，Ｉｎｄｉａ）は、遊離塩基形態で入手した。インジナビル（ＩＤＶ）硫酸塩（Ｌｏｎｇｓｈｅｍ Ｃｏ．，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）およびアタザナビル（ＡＴＶ）硫酸塩（Ｇｙｍａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）の遊離塩基を、１Ｎ ＮａＯＨ溶液を使用して作製した。本研究で使用した界面活性剤は以下のとおり：ポロキサマー−１８８（Ｐ１８８；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１，２−ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン−メチル−ポリエチレングリコールコンジュゲート−２０００（ｍＰＥＧ_２０００ＤＳＰＥ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＬＬＣ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）および１，２−ジオレオイロキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）。各ナノ懸濁液の調製においては、界面活性剤を、以下の５つの組合せ（重量／体積）で１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．８）に懸濁した：（１）０．５％Ｐ１８８単独；（２）０．５％ＰＶＡおよび０．５％ＳＤＳ；（３）０．５％Ｐ１８８および０．５％ＳＤＳ；（４）０．３％Ｐ１８８および０．１％ｍＰＥＧ_２０００ＤＳＰＥ；ならびに（５）０．５％Ｐ１８８、０．２％ｍＰＥＧ_２０００ＤＳＰＥ、および０．１％ＤＯＴＡＰ。次いで、遊離塩基薬物（ＡＴＶ、ＥＦＶ、ＩＤＶ、またはＲＴＶ；０．６重量％）を、界面活性剤溶液に加えた。この懸濁液を、均一分散になるまで、Ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ（登録商標）Ｔ−１８ローター−ステータミキサーを使用して撹拌した。次いで、この混合物を、０．８ｍｍ粉砕媒体（ジルコニウムセラミックビーズ）５０ｍＬと共に、ＮＥＴＺＳＣＨ ＭｉｃｒｏＳｅｒｉｅｓ Ｗｅｔ Ｍｉｌｌ（ＮＥＴＺＳＣＨ Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ）に移した。この試料を、所望の粒子サイズになるまで、６００〜４３２０ｒｐｍの範囲の速度で３０分〜１時間処理した。粒子サイズ、多分散性、および表面電荷については、ナノ懸濁液２０μｌを蒸留／脱イオン水で５０倍に希釈し、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を使用して、動的光散乱により分析した。所望のサイズを得た後、試料を遠心分離し、得られたペレットを、浸透圧を調整するための９．２５％ショ糖と共にそれぞれの界面活性剤溶液に再懸濁した。最終薬物濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して決定した。

ヒト単球の単離および培養
ＨＩＶ−１および肝炎血清反応陰性ドナーから白血球除去により得られたヒト単球を、向流遠心分離により精製した。単球を、１０％熱失活プールヒト血清、１％グルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌシプロフロキサシン、および１０００Ｕ／ｍｌ組換えヒトマクロファージコロニー刺激因子と共に、１×１０^６細胞／ｍｌの濃度で３７℃、ＤＭＥＭ中で培養した（Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６７：１４２８−１４４１）。

電子顕微鏡法
細胞試料を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の３％グルタルアルデヒドで固定し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の１％四酸化オスミウムでさらに１時間固定した。次いで、試料を漸加的エタノール系列で脱水し、走査型電子顕微鏡用にＥｐｏｎ８１２（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）に包埋した。透過型電子顕微鏡の場合は、薄片（８０ｎｍ）を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、日立Ｈ７５００−Ｉ透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ）下で観察した。

ナノＡＲＴの取り込みおよび放出
以前に公表された方法の修正版を使用して、ナノＡＲＴの取り込みおよび放出を研究した（Ｎｏｗａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：９０３−９１７）。７日間の分化の後に、ＭＤＭを１００μΜナノＡＲＴで処理した。ナノＡＲＴの取り込みは、８時間培地交換せずに評価した。付着したＭＤＭをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、掻き取ってＰＢＳ中に集めた。細胞を４℃で１０分間、９５０×ｇで遠心分離してペレットにした。細胞ペレットを、メタノール２００μｌ中で短時間超音波処理し、４℃で１０分間、２０，０００×ｇで遠心分離した。このメタノール抽出物を−８０℃で保存した。ナノＡＲＴの細胞保持および放出を研究するために、ＭＤＭを１００μΜナノＡＲＴに８時間曝露し、ＰＢＳで３回洗浄し、新たなナノＡＲＴ不含培地を加えた。培地の半分を一日おきに交換しながら１５日間ＭＤＭを培養した。ナノＡＲＴ処理後１、５、１０、および１５日目に、細胞取り込みのために、記載のようにＭＤＭを収集した。以前に記載のように（Ｎｏｗａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：５９２−６０１）ＨＰＬＣ分析まで、細胞抽出物および培地の両方を−８０℃で保存した。

生細胞の顕微鏡検査
Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｉＯ細胞標識溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してＭＤＭを染色し、緑色蛍光により生存ＭＤＭを同定した。ＮＰは、界面活性剤コーティングに蛍光リン脂質を加えることにより、リサミンローダミンＢ １，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩（ｒＤＨＰＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で標識した。ｒＤＨＰＥ標識ＮＰは赤色蛍光を示した。添加したトレーサの量に基づくと、標識リン脂質分子の数は、総コーティング物質のうちの極めて小さな割合を表し、リン脂質コーティングの厚さへの寄与は最小であった。これは、ｒＤＨＰＥリン脂質の存在下または非存在下で製剤化されたナノＡＲＴのサイズには顕著な差がないことがサイズ測定により示されて確認された。蛍光リン脂質と共に製剤化された薬物の取り込みおよび放出は、非標識粒子と比較して差が検出されなかった。掃引フィールド共焦点顕微鏡、４８８ｎｍ（緑）および５６８ｎｍ（赤）レーザ励起、および６０倍対物レンズを備えたニコンＴＥ２０００−Ｕ（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用して、３０秒ごとに画像を取り込んだ。

ナノＡＲＴの抗レトロウイルス活性
ＭＤＭを１００μΜナノＡＲＴで８時間処理し、洗浄して過剰な薬物を除去し、ナノＡＲＴ処理後１０および１５日目に、０．０１感染性ウイルス粒子／細胞の感染多重度にてＨＩＶ−１_ＡＤＡで感染させた（Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６７：１４２８−１４４１）。ウイルス感染に続いて、一日おきに培地の半分を交換しながら、１０日間細胞を培養した。逆転写酵素（ＲＴ）活性（Ｋａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６：２９８−３０６）によりアッセイされる子孫ウイルス粒子産生を測定するために１０日目に培地試料を収集した。感染細胞によるＨＩＶ−１ ｐ２４抗原の発現についての並行分析を、免疫染色により実施した。

逆転写酵素活性
培地試料（１０μｌ）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、３００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、および０．１％ノニルフェノキシルポリエトキシエタノール−４０（ＮＰ−４０）を含有する溶液１０μｌと混合した。この反応混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。この時点で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０５％ＮＰ−４０、１０μｇ／ｍｌポリ（Ａ）、０．２５０Ｕ／ｍｌオリゴｄ（Ｔ）１２−１８、および１０μＣｉ／ｍｌ ^３ＨＴＴＰを含有する溶液２５μｌを各ウェルに加え、３７℃で１８時間インキュベートした。インキュベーション後、氷冷１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）５０μｌを各ウェルに加え、これらのウェルをグラスファイバーフィルター上に採取し、β−シンチレーション分光法により、フィルターについて^３Ｈ−ＴＴＰ取り込みを評価した（Ｋａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６：２９８−３０６）。

免疫組織化学
ＨＩＶ−１感染後１０日目に、４％リン酸緩衝化パラホルムアルデヒドを用いて室温（ＲＴ）で１５分間、細胞を固定した。固定細胞を、１０％ＢＳＡ ｗ／１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＰＢＳ中）を用いてＲＴで３０分間ブロックし、ＨＩＶ−１ ｐ２４に対するマウスモノクローナル抗体（１：１００，Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）と共に３時間インキュベートした。Ｄａｋｏ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）＋ Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ標識ポリマー抗マウス二次抗体およびジアミノベンジジン染色を使用して、ｐ２４抗体の結合を検出した（Ｎｏｗａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：５９２−６０１；Ｎｏｗａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：９０３−９１７）。細胞核はヘマトキシリンで対比染色した。４０倍対物レンズを備えたニコンＴＥ３００顕微鏡を使用して画像を取得した。

細胞毒性
細胞生存率に対するナノＡＲＴ処理の影響を判定するために、ＭＤＭを１００μΜナノＡＲＴで８時間処理し、ＰＢＳで洗浄し、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）アッセイを使用して生存率を評価した。細胞生存率に対する影響は、使用した処理濃度ではいずれの製剤でも観察されなかった。

ナノＡＲＴの効果
８時間のＭＤＭ薬物取り込み、１５日間のＭＤＭ薬物放出（細胞および培地でのレベル）、および１５日間の抗レトロウイルス効果（ＨＩＶ感染ＭＤＭ由来の上清におけるＲＴ活性）の曲線下面積（ＡＵＣ）を決定した。取り込みおよび放出のスコアリングは、各親薬物／実験パラメーターについて最良のＡＵＣの関数としての各製剤の１０進重み付け（ｄｅｃａｄｅ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ）比として計算した。抗レトロウイルス活性のスコアリングは、各親薬物のＲＴ活性ＡＵＣの逆数の１０進重み付け比から決定した。ＡＵＣは、時間の関数として各薬物またはＲＴ活性のレベルから決定した。各親薬物の中で、取り込み、細胞保持、または培地への放出に対して最大ＡＵＣが得られたナノ製剤を１０とスコア化する一方、最小ＲＴ活性が得られた製剤を１０とスコア化した。各親薬物群の中の残りの製剤は、ＡＵＣ／ＡＵＣ_ｂｅｓｔ比に基づいて、１０の最高スコアに比例するようにスコア化した。各薬物ナノ製剤の各パラメーターからのスコアは平均して、各製剤に対する平均最終スコアを得た。各親薬物群の上位第２四分位数内の平均最終スコアを有する製剤を試験の継続（ＧＯ）に指定し、一方、下位第２四分位数内の平均を有する製剤の評価を中止した（ＮＯＧＯ）。

結果
ナノＡＲＴの製造および特性評価
２１のナノＡＲＴ製剤は、リン脂質界面活性剤で薄層コーティングされた遊離塩基抗レトロウイルス薬のナノサイズ化された薬物結晶からなった。５つの異なる界面活性剤の組合せを、薬物当たり合計５つの製剤のために各薬物について使用した。細胞取り込みおよび放出ならびに抗レトロウイルス効果に対するサイズの効果を決定するために、より大型な粒子の追加のＲＴＶ製剤を、界面活性剤Ｐ１８８／ｍＰＥＧ_２０００ＤＳＰＥを使用して作製した。すべての製剤を、コーティング、サイズ、電荷、および形状を含むそれらの物理的性質に基づいて特徴づけた。これらの製剤は、同様のサイズからなり、２３３ｎｍ（ＩＤＶ製剤Ｍ１００５）〜４２３ｎｍ（ＲＴＶ製剤Ｍ２００５）の範囲にあって、平均サイズが３０９ｎｍであった（表１）。粒子サイズ分布は、湿式粉砕方法により製造されたリポソームまたは他のナノ製剤化薬物製剤について知られているものと相違するものではなかった（Ｔａｋａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）５７：１０６１−１０６７；Ｖａｎ Ｅｅｒｄｅｎｂｒｕｇｈ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，３３８：１９８−２０６）。各製剤の粒子サイズの均一性を評価するために、各製剤の多分散性を測定した。多分散性指標（ＰＤＩ）は、０．１８０（ＲＴＶ製剤Ｍ２００４）〜０．３０１（ＡＴＶ製剤Ｍ３００４）の範囲にあり、これから、粒子の大部分は計算平均サイズに近いが、各製剤内でサイズに広がりがあることが示された。追加のＲＴＶ−Ｐｌ８８／ｍＰＥＧ_２０００ＤＳＰＥ製剤（Ｍ２００６）は、サイズが５４０ｎｍあり、Ｍ２００２（２６５ｎｍ）のサイズの約２倍であった。各製剤のゼータ電位も測定された。最も負に荷電した製剤は、界面活性剤としてＰ１８８およびＳＤＳを含有するもの（Ｍ１００４、Ｍ２００４、Ｍ３００４、およびＭ４００４）であった。ＤＯＴＡＰの追加は、製剤Ｍ１００３、Ｍ２００３、Ｍ３００３、およびＭ４００３に正電荷を付与した。残りの界面活性剤の組合せからは、負電荷の大きさが種々異なる製剤が得られた。粒子形態は薬物に応じて異なっていた；しかし、同じ薬物の製剤はすべて同様の形状であった（図１）。ＩＤＶおよびＥＦＶの粒子は、縁が粗い多角形状であった。ＡＴＶ製剤は、縁が滑らかな長い細い棒に類似しており、一方ＲＴＶ製剤は、縁が滑らかな短い太い棒に類似していた。透過型電子顕微鏡により、ナノＡＲＴの細胞内取り込みが確認され、ナノＡＲＴの完全な構造が細胞内部で保持されることが実証された。

ナノＡＲＴの取り込み
物理的性質を特徴づけた後、これらの製剤についてインビトロＰＫおよびＭＤＭによる細胞処理を試験した。ＭＤＭにおけるナノＡＲＴの取り込みでは、完全な取り込みの９５％超がほとんどのナノＡＲＴについて８時間までに起こることが示された（Ｄｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０８：２８２７−２８３５；Ｄｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３５８：１４８−１５８；Ｎｏｗａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：５９２−６０１；Ｎｏｗａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：９０３−９１７）。したがって、取り込み実験はすべて８時間実施し、その時点で細胞内に含有された薬物量を最大と見なした。ＩＤＶ製剤すべてについて、取り込み速度は同様であり、最大取り込みの８５％が４時間までに起こった（図２Ａ）。８時間での細胞薬物レベルは、Ｍ１００４およびＭ１００２について、それぞれ１０．７〜１６．７μｇ／１０^６細胞の範囲であった。ＲＴＶ製剤すべてについても、取り込み速度は同様であった（図２Ｂ）。４時間までに、最大取り込みの約８０％が起こった。８時間での細胞内ＲＴＶの最大レベルは、Ｍ２００５およびＭ２００４について、それぞれ１８．２〜２７．０μｇ／１０^６細胞の範囲であった。ＩＤＶおよびＲＴＶとは対照的に、ＡＴＶ製剤間では取り込み速度が異なっており、４時間での細胞レベルは、最大の６５％〜９０％の範囲であった（図２Ｃ）。ナノＡＲＴの取り込みの最大量は、ＡＴＶ製剤すべてについて８時間で起こった。ＡＴＶの最大細胞レベルは、製剤間で顕著に異なり、Ｍ３００５およびＭ３００１について、それぞれ８．６〜３７．１μｇ／１０^６細胞の範囲であった。ＥＦＶ製剤すべてについて、取り込み速度は同様であり、大多数の最大取り込みは１時間までに起こった（図２Ｄ）。ＥＦＶ製剤の最大細胞レベルの範囲は狭く、Ｍ４００３およびＭ４００５について、それぞれ０．５〜１．５μｇ／１０^６細胞であった。薬物取り込みは、生細胞の共焦点イメージングを使用して、リアルタイムで視覚化した。これらの実験では、緑色で標識したＭＤＭを、赤色で標識したＭ３００１またはＭ３００５で処理し、４時間にわたり３０秒ごとに画像を取得した。得られたビデオは、薬物取り込みのＨＰＬＣ測定を支持する。ＭＤＭは、細胞質中の赤色ＮＰの数が示すように、Ｍ３００５粒子よりもはるかに速い速度でかつ多量にＭ３００１粒子を蓄積した。図３に、８時間インキュベーションにおける、ＭＤＭ内の薬物濃度についてのＡＵＣを図示する。ナノＡＲＴ製剤すべてについて、ＡＵＣ（μｇ／１０^６細胞での測定薬物濃度の合計）を評価した。これらの値は、図４における、ナノＡＲＴ製剤の取り込みについてのスコアリングに使用した。

ナノＡＲＴの細胞保持および放出
ナノＡＲＴを８時間負荷した後、ＭＤＭを薬物不含培地でさらに１５日間培養して、ナノＡＲＴの細胞保持および培地への放出の両方を研究した。１５日間にわたり一日おきに培地の半分を交換して、薬物の放出を促進した。ＩＤＶ製剤すべてについて、細胞保持および細胞放出に関するプロフィールは同様であった（図５）。負荷後に細胞内に含有されたものの約９０％が最初の２４時間以内に放出された；しかし、ＩＤＶ製剤すべてについて、薬物レベルは低いものではあったが、１５日を通して細胞内に検出可能であった（表２）。培地内のＩＤＶ濃度は、１日目から１０日目まで安定して減少し続けた（図５）。Ｍ１００１については、低いが検出可能な量の薬物が１５日を通して培地中に見出された；しかし、他のＩＤＶ製剤すべてについては、ＩＤＶは１５日目までには培地中に検出できなくなった。ＲＴＶ製剤すべてについても、細胞保持および細胞放出に関するプロフィールは同様であった（図５）。ＩＤＶとは対照的に、負荷後に細胞内に含有されたＲＴＶの２０％のみが、最初の２４時間以内に放出され、ＲＴＶ製剤すべてについて、１５日目においても依然として細胞内に薬物を検出することができた（表２）。ＲＴＶ製剤すべてについて、培地中のＲＴＶ濃度は１日目から１５日目まで着実に低下し、１５日目でも６μｇ／ｍｌを超えるレベルがあった。ＩＤＶおよびＲＴＶの製剤についてのように、ＡＴＶ製剤すべてについて、細胞保持に関するプロフィールは同様であった（図５）；しかし、薬物の絶対量は８時間の負荷レベルに応じて異なっていた。負荷後の初期細胞レベルにかかわらず、最初の２４時間以内に、ＡＴＶ約４μｇ／１０^６細胞がすべての製剤で放出された。しかし、薬物放出のこの初期バーストの後では、細胞は薬物を保持し、少量のみが時間経過と共に放出された。１５日目の後でも、Ｍ３００１およびＭ３００４を負荷された細胞は、初期量の５０％を超える薬物を保持した（表２）。ナノＡＲＴ負荷細胞からのＡＴＶの放出による培地中の薬物濃度のプロフィールは、すべての製剤について、ほとんど同じであった（図５）。５日目まで、培地中のＡＴＶ含量は、Ｍ３００５以外のすべての製剤について、１．５μｇ／ｍｌを超えており、１５日目を通して０．２５〜１．１μｇ／ｍｌの間に留まった。ＥＦＶ製剤すべてについても、細胞保持および放出の両方に関するプロフィールおよび量は同様であった（図５）。ＩＤＶ製剤について観察されたように、時間０で細胞内に存在したＥＦＶの約９０％が最初の２４時間以内に放出された；しかし、１５日目においても依然として、ＥＦＶ製剤すべてについて、細胞内に薬物を検出することができた（表２）。ＥＦＶ製剤すべてについて、培地中のＥＦＶ濃度は１日目から１５日目まで着実に低下し（図５）、１５日目を通して低レベルの薬物が検出可能であった（表２）。

抗レトロウイルス効果
ＨＩＶ複製の阻害におけるナノＡＲＴの有効性を判定するために、ＡＲＴ処理後１、５、１０、および１５日目にＭＤＭをＨＩＶ−１_ＡＤＡに曝露した。ＨＩＶ暴露後、ＭＤＭを引き続き培養し、１０日後にＲＴ分析のために培地試料を収集した。ＩＤＶ製剤はすべて、低いが同様の抗レトロウイルス効果を示した。ウイルス暴露をナノＡＲＴ処理後１５日目に行った場合、ＨＩＶ複製は約２０％低下した（図６）。これに対して、ＥＦＶ製剤はすべて、細胞内に留まった薬物が比較的少量にもかかわらず、ナノＡＲＴ処理後１５日目の曝露によるＨＩＶ感染をほぼ完全に防止した。ＲＴＶおよびＡＴＶの製剤では、ＨＩＶ阻害が幅広く変動することが実証された。１５日目のウイルス暴露において、阻害範囲は、ＲＴＶ製剤（それぞれＭ２００２およびＭ２００４）について２５％〜６０％、ＡＴＶ製剤（それぞれＭ３００５およびＭ３００１）について２０％〜８０％であった。興味深いことに、ＲＴ活性は、ＡＴＶおよびＥＦＶの製剤については、細胞内に保持された薬物量と直接相関し、各薬物群に対する相関係数は０．９２であった。

ＨＩＶ−１ ｐ２４抗原の発現を使用して、ＲＴ活性およびＨＩＶ増殖を確認した。各種抗レトロウイルス薬について、取り込み、細胞保持、薬物放出、およびＲＴ活性により判定された、最良および最悪性能の製剤を、比較を目的として試験した。これらの製剤は、Ｍ１００４とＭ１００２（ＩＤＶ）、Ｍ２００４とＭ２００２（ＲＴＶ）、Ｍ３００１と３００５（ＡＴＶ）、ならびにＭ４００５とＭ４００３（ＥＦＶ）であった。ナノＡＲＴを負荷したＭＤＭを、ナノＡＲＴ処理後１、５、１０、および１５日目にＨＩＶ−１_ＡＤＡに曝露し、次いで感染後１０日目にｐ２４抗原の存在について試験した。ｐ２４抗原発現の実験による評価により、ナノＡＲＴすべてについて、時間経過と共にＨＩＶ感染が漸増する（茶色染色の増加により示される）ことが実証された。しかし、各薬物の最良性能の製剤、すなわち、Ｍ１００４、Ｍ２００４、Ｍ３００１、およびＭ４００５は、最悪性能の製剤、すなわち、Ｍ１００２、Ｍ２００２、Ｍ３００５、およびＭ４００３よりも高度にｐ２４発現の増加を抑制した（図７）。特に興味深いことには、ＥＦＶ製剤はすべて、１５日目の暴露によるウイルス感染を抑制した。ナノＡＲＴ製剤すべてについて、ｐ２４の発現はＲＴ活性のレベルを反映した。

ナノＡＲＴのスコアリングシステム
ナノ製剤すべてについて、ＭＤＭへの取り込みおよびＭＤＭからの放出、ならびにＨＩＶ−１感染細胞におけるそれらの抗レトロウイルス活性を評価した。各実験パラメーター内でナノ製剤を、各親薬物群の中で最良性能の製剤に基づいてスコア化しランク付けした（図４）。蓄積スコア（合計）および平均最終スコアに基づいて、データをランク付けした。「Ｇｏ」判定は、上位２中央四分位数内にスコア化された製剤に与えられ、一方「Ｎｏ Ｇｏ」指定は、下位２中央四分位数にスコア化されたものに与えられた。しかし、「ｎｏ ｇｏ」の指定は、それらの製剤を治療または他の目的に使用することができない、または使用すべきではないことを示すものでは決してなく、この指定は、他の製剤が本アッセイおよび結果に基づいてより好ましいことを単に示しているだけである。ＩＤＶ製剤のＭ１００２およびＭ１００５は、最高の平均最終スコアを示し、したがって「Ｇｏ」判定を与えられた。ＲＴＶ製剤については、Ｍ２００３およびＭ２００５の共有平均スコア（７．３）は、中央値でもある；したがって、２つの製剤（Ｍ２００４およびＭ２００６）のみが「Ｇｏ」指定を与えられた。ＡＴＶ製剤については、Ｍ３００１およびＭ３００２が「Ｇｏ」と指定された。７．５対５．１というスコアにおける明確な分離が、「Ｇｏ／Ｎｏ Ｇｏ」ＡＴＶ製剤間に観察された。ＥＦＶ製剤の１つであるＭ４００５は、試験した各パラメーターで最高スコアを示し、最終平均アコアが１０となった。ＥＦＶ製剤について次に高い最終スコア（Ｍ４００２）は、（Ｍ４００５）のほぼ半分で５．１であった。平均最終スコアの差は、これら２つの製剤にとって実質的であるが、両方に「Ｇｏ」判定が与えられた。

４つの抗レトロウイルス薬について２１のナノＡＲＴ製剤を製造して特性評価し、ＭＤＭのインビトロ試験システムでナノＡＲＴを評価するために試験した。薬物タイプ、界面活性剤コーティング、および形状が、粒子の取り込み、薬物放出、および抗レトロウイルス反応に対して本質的な影響を及ぼすことが実証されたが、一方マイナーな効果を及ぼすものは粒子電荷およびサイズであった。界面活性剤コーティングでは、薬物タイプの間で実質的な相違があった。ＩＤＶ、ＲＴＶ、およびＥＦＶの場合、５つの製剤のうち４つは、同様の試験結果であった。界面活性剤の組合せＰｌ８８／ｍＰＥＧ_２０００ＤＳＰＥは、ＡＴＶを例外として、試験したすべての薬物について「ＧＯ」製剤と指定された。

粒子形状は、ナノＡＲＴの性能に影響を及ぼした。ＩＤＶおよびＥＦＶの粒子は、縁が不揃いの円形であり、細胞取り込みの減少を示した。これに対して、ＲＴＶおよびＡＴＶは、縁が滑らかで整然とした棒様形状であった。ＲＴＶ棒は短く角が滑らかであるが、ＡＴＶは棒が長く縁が鋭利である。最も効果的な粒子取り込みは、ＡＴＶ製剤のＭ３００１で認められ、これにより棒が長い方がより迅速に取り込まれることが示唆された。これらの結果は、マクロファージの食細胞運動カイネティクスに対する粒子形状の影響を検討して、球状微粒子が短い棒形より緩除に取り込まれること、長い棒形が短い棒形より迅速に取り込まれることを見出した研究と一致している（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３１：４３８−４４８；Ｃｈｉｔｈｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，６：６６２−６６８；Ｇｒａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０５：１１６１３−１１６１８）。

ナノＡＲＴの性能に影響を及ぼす最も重要な因子の１つは、親薬物の化学的性質であった。ＡＴＶ製剤はすべて、ＰＫは良好であるが抗レトロウイルス効果は比較的不良であることが実証された。さらに、ＥＦＶナノＡＲＴは、取り込みが低いにもかかわらず、最良の抗レトロウイルス効果を示した。興味深いことには、遊離塩基ＡＴＶの溶解性は、他の遊離塩基薬物の溶解性よりも３００倍超大きく（ＩＤＶ：１５μｇ／ｍｌ、ＥＦＶ：９μｇ／ｍｌ、またはＲＴＶ：１〜２μｇ／ｍｌに対してＡＴＶ：４〜５ ｍｇ／ｍｌ）（Ｗｉｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｄ９０１−Ｄ９０６；Ｗｉｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３４：Ｄ６６８−Ｄ６７２）、ＡＴＶナノ製剤の取り込みおよび放出は、界面活性剤コーティングにより最も影響を受けるように見えた。ナノＡＲＴは最大９９％の純粋な薬物結晶からなりうるものであり、その結果として、特定の抗レトロウイルス薬が、他のものよりもＭＤＭ細胞を媒介とした送達に一層よく適合する可能性がある。単一薬物群内ですべてのナノＡＲＴ製剤の抗レトロウイルス活性を比較すると、効果の良好な予測因子として、細胞内に含有される薬物量が挙げられる。ＥＦＶおよびＡＴＶのナノＡＲＴ製剤の場合に、細胞内に含有された薬物量とＨＩＶ感染に対する防御度の間に強い相関（０．９２）が証明された。含有した薬物が多い細胞ほど、周囲培地中に存在した薬物量にかかわらず、防御レベルが高いことが示された。５日目および１５日目において、薬物製剤すべてについて、培地中に存在する薬物量は、種々のＨＩＶ株および宿主細胞型に関して報告された抗ＨＩＶ活性のＥＣ_５０レベルを超えていた（１．７〜２５ｎＭ、ＥＦＶ；３５〜２００ｎＭ、ＲＴＶ；５〜２９ｎＭ ＩＤＶ；２〜５ｎＭ ＡＴＶ）（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４４：２０９３−２０９９）。さらに、すべての薬物について、５日目の培地レベルは、治療ヒト血漿レベルに等しかった（１．８〜４．１μｇ／ｍｌ、ＥＦＶ；３．５〜９．６μｇ／ｍｌ ＲＴＶ；０．１５〜８．０μｇ／ｍｌ ＩＤＶ、および０．３〜２．２μｇ／ｍｌ、ＡＴＶ）（Ｓｈａｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｄｄａｄ ａｎｄ Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ’ｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｏｖｅｒｄｏｓｅ，４ｔｈ ｅｄ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００７；ｖｏｎ Ｈｅｎｔｉｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，６２：５７９−５８２）。これらの結果をまとめると、ナノＡＲＴは、主として細胞内部で抗レトロウイルス作用を及ぼすことが示される。

ＭＤＭ内に含有されたナノＡＲＴ量は、ＨＩＶ−１感染に対する防御度の重要な指標であるが、唯一の決定要素ではない。ナノＡＲＴ薬物の一部は、極めて少量で高度に効果的であったが、より多量に細胞内にあった他のものはそれより効果が少なかった。例えば、１５日目において、ナノＡＲＴ処理細胞内のＩＤＶレベルは検出できなかった；それでもＨＩＶ−１感染は約２０％減少した。これに対して、ナノＡＲＴ処理後に細胞内に含有されたＥＦＶ量はすべての製剤について極めて低かったが、細胞はＨＩＶ感染からほぼ完全に防御された。さらに、ＡＴＶナノＡＲＴ処理細胞は、ＥＦＶナノＡＲＴ処理細胞よりも１０００倍超の薬物濃度であったが、それでもＨＩＶ感染の程度は様々であった。この現象に対する可能な説明は、すべてのナノＡＲＴが同一の様式で細胞内を移行し、様々な細胞内コンパートメントに貯留されうるとは限らないということである。これが真実ならば、細胞内でのナノＡＲＴ局在も、細胞に実際に入る薬物量と同様に重要になりうることが示唆される。例えば、ナノＡＲＴが、ＨＩＶ複製が起こっている同じエンドソームコンパートメントに共存する場合、完全なウイルス複製の阻害は、少量の薬物のみで可能となりうる。一方、ＨＩＶ複製が起こっているところとは別のコンパートメントに貯留されたナノＡＲＴは、多量に存在したとしても、効果が少ない可能性がある。ナノ物質の内部機構、細胞内移行、細胞内貯留が、それらの生物作用にとって重要であることが実証されてきた（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：１４５−１５０；Ｖａｌｌｈｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，７：３５７６−３５８２；Ｓｌｏｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２８：１４７９２−１４７９３）。

ここで、ナノＡＲＴの性能に比較的影響が少ない２つの因子は、サイズおよび電荷であった。他の研究では、ナノ粒子のサイズが機能に顕著に影響を及ぼしうることが示されているが、本研究では、粒子サイズのみに基づいた、ナノＡＲＴ性能の明らかな差は認められなかった（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：１４５−１５０；Ｖａｌｌｈｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，７：３５７６−３５８２；Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｍ．（２００８）Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：１３１−１３２）。サイズ効果のこの欠如は、ナノＡＲＴのサイズが類似していることによる可能性がある。このサイズは、２３３ｎｍ〜４２３ｎｍの範囲にあり、全体的に１００ｎｍを超えて変動することはなかった。例外は、Ｍ２００６とＭ２００２との全般的な性能比較であった；両方は同じ界面活性剤の組合せでコーティングされたが、サイズは約２倍異なっていた。ＲＴＶナノＡＲＴ製剤の中で全般的に最悪の性能であったＭ２００２は、性能が２番目のＭ２００６の約半分のサイズであった。これは、より大きなナノＡＲＴ粒子がより小さなナノＡＲＴ粒子よりも性能がよい可能性があることを意味し、提案されたより大きなナノＡＲＴ（サイズが１μｍに近い）が、薬物放出の延長と共に、ＭＤＭにより一層効率的に取り込まれうるという他の発見と対応する。粒子電荷もまた、ナノＡＲＴの性能に対して、効果がより限定的であった。粒子の大部分が強い負電荷（＜−１５．０ｍＶ）であり、少数のものが比較的弱い電荷（−１５ｍＶ〜０ｍＶの間）であり、少数のものが強い正電荷（＞２０ｍＶ）であった。強く荷電したＮＰは弱電荷または中性電荷のＮＰよりも取り込みが良好であることが示されてきた（Ｒｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，４６：２５５−２６３）。試験した各薬物について最良の性能を示したナノＡＲＴ製剤は強い負電荷を有していたが、弱い負電荷（≦−８．２）を有した製剤は、下位の２つにランク付けされた。正に荷電した粒子は、その群の真中にランク付けされる傾向があった。この結果は、荷電したナノＡＲＴが中性電荷のものよりも性能が良好であることを強く示唆する。

伝統的なＡＲＴ薬物をナノＡＲＴに再パッケージし、トランスポーターとしてマクロファージを使用すると、以下のものを含む、ＨＩＶ−１感染の治療に対していくつかの利点が得られる：（ｉ）長時間の血漿薬物濃度；（ｉｉ）除放的かつ安定した薬物放出；（ｉｉｉ）活動的な感染部位への薬物送達のターゲティング；および（ｉｖ）毒性の低減。インビトロおよびインビボの両方の研究において、ナノＡＲＴをマクロファージに負荷すると、抗レトロウイルス薬の体内分布および効果が大幅に改善されつつ、同時に細胞毒性が低減することが実証された。実際、結晶性抗レトロウイルスＮＰを使用するインビボ研究では、治療効果が示され、インビボ投与すると、これらのタイプのＮＰがマクロファージに取り込まれうることがわかった。

実施例２
結晶性抗レトロウイルスナノ粒子（ナノＡＲＴ）は、事実上、薬物の投与間隔を延長し、投与薬物濃度を減少させ、ウイルスの潜伏場所への薬物到達を促進し、有害な副作用を低減し、感染個体への薬物アベイラビリティを改善する。後者は、服薬遵守が悪いか、経口薬物吸収が限定されているか、または必要とされる医薬を得る機会がほとんどない患者を対象とする。ナノＡＲＴの運搬に単球および単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を使用すると、製剤化されていない薬物と比較して、優れた安定性、低い毒性、および強力な抗レトロウイルス効果が示される（Ｄｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０８：２８２７−２８３５；Ｄｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３５８：１４８−１５８；Ｎｏｗａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｎｏｍｅｄ．４：９０３−９１７）。実際に、ナノＡＲＴ積載ＭＤＭは、サイトカインシグナル伝達に応答して生物学的障壁を横断し、感染組織に薬物を直接送達し、ウイルス複製を劇的に減少させることができる（Ｄｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８３：６６１−６６９）。動物試験では、インビトロの結果が支持され、臨床的に適切な薬物量が、単回投与後最大３ヶ月間血清および組織の両方に存在することが実証された（Ｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，７２：５０２−５０８；Ｖａｎ’ｔ Ｋｌｏｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，５４：２０４２−２０５０）。

ここで、最初の取り込み時点から最終放出までのナノＡＲＴの細胞内局在を研究した。迅速なクラスリン依存性内部移行に続いて、薬物粒子は再循環経路に選別され、そのため分解が回避される。ＭＤＭから薬物はインタクトのままで放出され、抗レトロウイルス効果に低下はなかった。興味深いことには、粒子移行経路は、ＨＩＶのエンドサイトーシス選別に対して観察されたものと対応する。ＨＩＶとナノＡＲＴとの間の細胞内エンドサイトーシス存在場所のこのような対応関係は、ウイルス複製の制限に関してさらなる利点を提供する。まとめると、これらの発見により、ＨＩＶに感染した人々に対する効率的かつ単純化された薬物レジメンのための治療オプションとしてマクロファージ媒介性薬物送達があることが示される。

材料および方法
抗体および試薬
Ｒａｂ１１およびＲａｂ７に対するヤギ抗体（Ａｂ）、ならびにＲａｂ８、Ｒａｂ１１、およびＲａｂｌ４に対するヒトｓｉＲＮＡは、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＳｉｌｅｎｃｅＭａｇ ｓｉＲＮＡ送達試薬および磁気プレートは、Ｏｚ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。リソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）に対するウサギＡｂは、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ＣＯ，ＵＳＡ）から購入した。初期エンドソーム抗原１（ＥＥＡ１）、クラスリン、Ｒａｂ８、およびＲａｂｌ４に対するウサギＡｂは、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。食作用に対するｐＨｒｈｏｄｏ−デキストランコンジュゲート、ローダミンファロイジン、ファロイジンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８および６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４結合トランスフェリン（Ｔｆｎ）、抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、５９４、および６４７、抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、５９４、および６４７、抗ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）含有ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ抗フェージング溶液はすべて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ＯＲ，ＵＳＡ）から購入した。Ｄｙｎａｓｏｒｅおよびインドメタシンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。

ＲＴＶ−ＮＰの製造および特性評価
リトナビルナノ粒子（ＲＴＶ−ＮＰ）は、以前に記載のように（上記およびＮｏｗａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｎｏｍｅｄ．，４：９０３−９１７を参照のこと）、Ａｖｅｓｔｉｎ Ｃ−５ホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、高圧ホモジナイゼーションにより調製した。薬物結晶をコーティングするために使用した界面活性剤は、ポロキサマー１８８（Ｐ１８８；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）、１，２−ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミンメチル−ポリエチレングリコール２０００（ｍＰＥＧ_２０００−ＤＳＰＥ）、および１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含み、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ（ＡＬ，ＵＳＡ）から購入した。ナノサイズ化された薬物結晶をコーティングするために、各界面活性剤は、Ｐ１８８（０．５％）、ｍＰＥＧ_２０００−ＤＳＰＥ（０．２％）、およびＤＯＴＡＰ（０．１％）（重量／容積％）から構成した。ナノ懸濁液は、緩衝液として１０ｍＭリン酸ナトリウムまたは１０ｍＭ ＨＥＰＥＳのいずれかを使用して、ｐＨ７．８の弱アルカリ性で製剤化した。浸透圧は、グリセリン（２．２５％）またはショ糖（９．２５％）で調整した。遊離塩基薬物に界面活性剤溶液を加え、約２％［容積に対する重量の割合（％）］の濃度にした。この溶液を、粒子サイズを低減するためにＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ（商標）Ｔ−１８（ＩＫＡ（登録商標）Ｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．［ＮＣ，ＵＳＡ］）ローター−ステータミキサーを使用して１０分間混合した。この懸濁液を、約３０パスの間、または所望の粒子サイズが得られるまで、２０，０００ｐｓｉでホモジナイズした。サイズは、ＨＯＲＩＢＡ ＬＡ ９２０光散乱測定機器（ＨＯＲＩＢＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して測定した。多分散性およびゼータ電位の測定については、懸濁液０．１ｍｌを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）９．９ｍｌに希釈し、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ （Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して動的光散乱により分析した。各読み取りにつき少なくとも４回反復し、読み取りの変動は２％未満であった。所望のサイズを得た後、試料を遠心分離し、得られたペレットを、浸透圧を調整するための９．２５％ショ糖を含有する界面活性剤溶液に再懸濁した。粒子サイズおよび形状は、下記に記載のように、走査型電子顕微鏡により特徴づけた。ＲＴＶ−ＮＰは、Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）１，１’ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＯ）細胞標識溶液（Ｅｘ：４８４ｎｍ；Ｅｍ：５０１ｎｍ）または３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＤ；Ｅｘ：６４４ｎｍ；Ｅｍ：６６５ｎｍ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ［ＣＡ，ＵＳＡ］）を使用して蛍光標識した。ＲＴＶ−ＮＰ懸濁液１ｍｌと色素５μｌとを合わせて一晩混合することにより粒子を標識した。２０，０００×ｇで遠心分離後、過剰色素がすべて除去されるまで、５％ヒト血清含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で粒子を洗浄した（少なくとも５回の洗浄）。製剤の最終薬物含量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。

ヒト単球の単離および培養
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｂｒａｓｋａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒの施設内倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）により承認を得た後、ヒト単球を、ＨＩＶおよび肝炎血清反応陰性ドナーから白血球を除去することにより取得し、向流遠心分離により精製した。Ｗｒｉｇｈｔ染色サイトスピンを調製し、細胞純度を抗ＣＤ６８（クローンＫＰ−１）による免疫標識によりアッセイした。単球は、１０％熱失活プールヒト血清、１％グルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０μｇ／ｍｌシプロフロキサシン、およびＰｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．（ＭＡ，ＵＳＡ）からの好意の贈与である１０００Ｕ／ｍｌ組換えヒトマクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）を添加したＤＭＥＭ中で、加湿環境（５％ＣＯ_２）下３７℃にて、１×１０^６細胞／ｍｌの濃度で培養した。マクロファージへの分化を誘導するために、単球をＭＣＳＦの存在下で７日間培養した。

ＲＴＶ−ＮＰの取り込みおよび放出
単球由来マクロファージ（１ウェル当たり２×１０^６）を１００μΜ ＲＴＶ−ＮＰと共に培養した。粒子の取り込みは、細胞収集を指定時間に行いながら、２４時間培地交換せずに評価した。付着したＭＤＭを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１ｍｌで３回洗浄した後、ＰＢＳ１ｍｌ中に細胞を掻き取った。試料を４℃で１０分間、９５０×ｇで遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットをメタノール２００μｌ中で超音波処理し、４℃で１０分間、１０，０００×ｇで遠心分離した。このメタノール抽出物を、ＨＰＬＣ分析の実施まで、−８０℃で保存した。最初の１２時間、ＲＴＶ−ＮＰに曝露した後、一日おきに培地の半分を交換してＭＤＭからの薬物放出を２週間にわたり評価した。培地試料を対応細胞と共に保管し、ＨＰＬＣ分析が実行可能となるまで−８０℃で保存した。メタノール抽出細胞懸濁液を、４℃で１０分間、２１，８００×ｇで遠心分離した。培地試料を融解し、メタノールを添加して除タンパクした。試料を４℃で１０分間、２１，８００×ｇで遠心分離した；上清を減圧乾固し、１００％メタノール７５μｌに再懸濁した。処理した培地または細胞の三つ組み試料２０μｌを、Ｃ８ガードカートリッジを装着したＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｏｃｔｙｌ Ｃ８カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｉｎｃ．［ＭＡ，ＵＳＡ］）を使用して、ＨＰＬＣにより評価した。４７％アセトニトリル／５３％ ２５ｍＭ ＫＨ_２Ｐ０_４（ｐＨ４．１５）からなる移動相を０．４ｍｌ／ｍｉｎで送出し、ＵＶ／Ｖｉｓ検出を２１２ｎｍで行った。細胞および培地におけるＲＴＶレベルを、メタノールで作製した遊離薬物（０．０２５〜１００μｇ／ｍｌ）の標準曲線と比較してピーク面積で決定した。

免疫細胞化学および共焦点顕微鏡検査
蛍光免疫染色のために、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、室温で３０分間、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。細胞をブロッキング／透過化溶液（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ、ＰＢＳ中の５％ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］）で処理し、５０ｍＭ ＮＨ４Ｃ１で１５分間クエンチした。細胞をＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎで１回洗浄し、一次および二次Ａｂと連続して室温でインキュベートした。複数のＡｂで染色したＭＤＭの場合、免疫染色の前に、二次Ａｂの非特異的交差結合について試験した。同じ宿主に由来するかまたは同じ宿主を認識する二次Ａｂの使用は回避した。スライドをＤＡＰＩ含有ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ抗フェージング試薬で覆い、ＬＳＭ ５１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＵＳＡ）で６３倍オイルレンズを使用して画像化した。

再循環コンパートメントのイメージング
ポリ−ｄ−リジンコーティングのチャンバースライド中で増殖した単球由来マクロファージを、無血清ＤＭＥＭと共に３時間インキュベートしてヒト血清を枯渇させた。細胞を、１μΜ Ａｌｅｘａ５９４−Ｔｆｎおよび１００μΜ ＤｉＯ標識ＲＴＶ−ＮＰと４時間共インキュベートした。内部移行しなかった微粒子を、ＰＢＳで３回連続して洗浄することにより除去した。細胞を４％ＰＦＡで固定し、ＬＳＭ ５１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．）の６３倍オイルレンズを使用して画像化した。

酸性化コンパートメントの検出
単球由来マクロファージを、デキストランビーズに結合したｐＨｒｈｏｄｏ（商標）および１００μΜ ＤｉＯ標識ＲＴＶ−ＮＰに３７℃で４時間曝露した。内部移行しなかった微粒子を、Ｈａｎｋｓ平衡塩類溶液（ｐＨ７．４）で３回洗浄して除去した後、４％ＰＦＡによる固定およびイメージングを行った。様々なｐＨレベル（３．０〜８．５）でのｐＨｒｈｏｄｏ（商標）色素の蛍光強度を、Ｍ５開花（Ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ［ＣＡ，ＵＳＡ］）を使用して、あらかじめ測定した。

ＲＴＶ−ＮＰ取り込みの阻害
単球由来マクロファージをＰＢＳで３回洗浄し、無血清培地と共に３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、１００μΜ ｄｙｎａｓｏｒｅ、１００μΜインドメタシン、および両方の組合せに、無血清培地中で３０分間曝露するか、または未処理のままにした。細胞を無血清培地で１回洗浄し、無血清培地で再構成した１００μΜ ＤｉＤ標識ＲＴＶ−ＮＰを、新たな阻害剤と共に３７℃で３時間ＭＤＭに加えた。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、細胞リフターを使用して機械的に引き剥がした。細胞を４％ＰＦＡで３０分間固定し、フローサイトメトリーによりＲＴＶ−ＮＰの取り込みを分析した。データは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター上で得た。薬物含量のＨＰＬＣ分析については、反復実験を行った。

電子顕微鏡検査
試料を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の３％グルタルアルデヒドで固定し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の１％四酸化オスミウムでさらに１時間固定した。試料を漸加的エタノール系列で脱水し、走査型電子顕微鏡用にＥｐｏｎ８１２（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ［ＰＡ，ＵＳＡ］）に包埋した。薄片（８０ｎｍ）を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈ７５００−Ｉ；Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．［ＩＬ，ＵＳＡ］）下で観察した。

エンドサイトーシスコンパートメントの濃縮
ＲＴＶ−ＮＰ結合コンパートメントの濃縮のために、ＲＴＶ−ＮＰを、０．０１％ブリリアントブルーＲ−２５０色素（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて室温で１２時間標識した。過剰な色素を、ＰＢＳで５回の洗浄およびその後の２０，０００×ｇで１０分間の５回の遠心分離によって除去した。次いで、１００μΜ ＲＴＶ−ＮＰを３７℃で１２時間ＭＤＭに加えた。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＲＴＶ−ＮＰの取り込みを、ニコンＥｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３００顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．［ＮＹ，ＵＳＡ］）上で明視野設定を使用して視覚化した。細胞をホモジナイゼーション緩衝液（１００ｍＭショ糖、１０ｍＭイミダゾール溶液、ｐＨ７．４）で引き剥がした後、ダンス型ホモジナイザー上で１５ストローク行った。５００×ｇで１０分間遠心分離して細胞デブリおよび核を除去した。上清を６０％ショ糖、１０ｍＭイミダゾール溶液、ｐＨ７．４と等比で混合してショ糖濃度を３０％に調整した後、６０、３５、２０、および１０％のショ糖勾配上に積層し、４℃で１時間、１００，０００×ｇで遠心分離した。濃縮されたエンドサイトーシスコンパートメント（青色）を含有する１０〜２０と３５〜６０％のショ糖バンドの間の界面を収集した。ペレットを、４℃で３０分間、１００，０００×ｇで遠心分離して収集し、ＰＢＳで３回洗浄してショ糖を除去した。次いで、下記に記載のように、ペレットをプロテオミクス分析のために処理した。

エンドサイトーシスコンパートメントの免疫単離を、一部改変して以前の記載のように実施した（Ｂａｓｙｕｋ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ５：１６１−１７４）。ＭＤＭ（４００×１０^６細胞）を１００μΜ ＲＴＶ−ＮＰで６時間処理した。細胞をＰＢＳで３回洗浄して細胞外のＲＴＶ−ＮＰを除去し、次いで、ホモジナイゼーション緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．２、２５０ｍＭショ糖、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）_２）中で掻き取った。次いで、ダンス型ホモジナイザーで１５ストローク行って細胞を破壊した。４℃で１０分間、４００×ｇで遠心分離して、核および破壊されていない細胞を除去した。ＥＥＡ１、リソソーム結合ＬＡＭＰ１、およびＲａｂ１１抗体に結合した（４℃で１２時間、ＰＢＳ中の１０％ＢＳＡにおいて結合）プロテインＡ／Ｇ常磁性ビーズ（スラリー２０μｌ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を上清とインキュベートした。ビーズのみも細胞溶解物に曝露して結合特異性を試験した。４℃で２４時間インキュベートした後、ＥＥＡ１＋、ＬＡＭＰ１＋、およびＲａｂ１１＋のエンドサイトーシスコンパートメントを洗浄し、磁気分離機（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に収集した。各コンパートメントのＲＴＶ−ＮＰ含量を、上記のようにＨＰＬＣにより測定した。

プロテオミクス分析および質量分析
エンドサイトーシスコンパートメントを、溶解緩衝液、ｐＨ８．５［３０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート、２０ｍＭジチオスレイトール、および１Ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）］でピペッティングにより可溶化した。タンパク質を、製造業者の説明書に従って、２Ｄクリーンアップキットを使用して沈殿させ、２Ｄ Ｑｕａｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ［ＷＩ，ＵＳＡ］）により定量した。試料をＢｉｓ−Ｔｒｉｓ ４−１２％および７％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で泳動させ、低分子量および高分子量のタンパク質を分離した。電気泳動後、１０％メタノール、７％酢酸で１時間固定し、室温で２４時間クーマシー染色を行った。バンドを手作業で切り取り、３７℃で１６時間、ゲル内トリプシン消化を行った（１０ｎｇ／スポットのトリプシン［Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ］）。μＣ１８ ＺｉｐＴｉｐｓ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用するペプチド抽出および精製を、Ｐｒｏｐｒｅｐ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤｉｇｅｓｔｉｏｎおよびＭａｓｓ Ｓｐｅｃ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＭＩ，ＵＳＡ）上で実施した。

抽出されたペプチドを、ミクロキャピラリーＲＰＣ_１８カラム（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ，Ｉｎｃ．［ＭＡ，ＵＳＡ］）上で分画し、ナノスプレー構成の液体クロマトグラフィーエレクトロスプレイイオン化タンデム型質量分析システム（ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を備えたＰｒｏｔｅｏｍｅＸ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して配列決定した。取得したスペクトルについて、ＳＥＱＵＥＳＴサーチエンジン（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＢｉｏＷｏｒｋｓ ３．１ＳＲソフトウェア）を使用して、ヒトタンパク質のサブセットに限定したＮＣＢＩ．ｆａｓｔａタンパク質データベースに対して検索した。ＴｕｒｂｏＳＥＱＵＥＳＴ（登録商標）検索パラメーターは以下のように設定した：Ｄｔａ生成閾値１００００、Ｄｔａ生成に対する前駆体質量許容値１．４、Ｄｔａ検索、ペプチド許容値１．５、およびフラグメントイオン許容値１．００。電荷状態は「ａｕｔｏ」に設定した。データベースｎｒ．ｆａｓｔａを、ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖから取得し、「インハウス」でインデックス付きｈｕｍａｎ．ｆａｓｔａ．ｉｄｘｗを作製するために使用した（キーワード：ホモサピエンス、ヒト、霊長類）。２つ以上のユニークなペプチド配列（ｐ＜０．０５）を有するタンパク質は、高度に信頼性があると見なした。

ｓｉＲＮＡ処理およびウエスタンブロッティング
ｓｉＲＮＡを磁気ビーズと組み合せて、製造業者の説明書の指示どおりに、ＭＤＭに形質移入し、次いで、タンパク質ノックダウンを最大にするために、さらに７２時間培養した。タンパク質の除去は、ウエスタンブロッティングにより確認した。タンパク質試料は、Ｐｉｅｒｃｅ６６０−ｎｍタンパク質アッセイおよび曲線を標準化するための前希釈タンパク質アッセイＢＳＡスタンダード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ［ＩＬ，ＵＳＡ］）を使用して定量した。各タンパク質試料から、１０〜１５μｇを、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に負荷し電気泳動に付した；ゲルをポリフッ化ビニリデン膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ［ＣＡ，ＵＳＡ］）に転写した。膜をＰＢＳ−Ｔ中の５％粉乳／５％ＢＳＡでブロックし、次いで、一次Ａｂおよびその後に二次Ａｂで探査した。タンパク質バンドを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ［ＩＬ，ＵＳＡ］）を使用して識別した。次いで、ｓｉＲＮＡを形質移入したＭＤＭを、１００μΜ ＲＴＶ−ＮＰで処理した後、細胞および対応培地試料を採取して、ＨＰＬＣにより薬物分析を行った。

マクロファージのＲＴＶ−ＮＰの放出および遊離薬物への解離
細胞に薬物を負荷した１８時間後に、ＲＴＶＮＰ負荷ＭＤＭから細胞培養培地を収集した。インタクトなＲＴＶ−ＮＰを、ベックマンＴＬ−１００超遠心分離機（Ｂｒｅａ［ＣＡ，ＵＳＡ］）上で、４℃で１時間、１００，０００×ｇで遠心分離して、溶解した薬物から分離した。得られた上清およびＮＰペレットを、ＨＰＬＣによる薬物定量のために処理した。

ＲＴＶの抗レトロウイルス活性
エタノール中に溶解した非製剤化状態（最終濃度０．０１％）、本来のＲＴＶＮＰ、または放出されたＲＴＶ−ＮＰのいずれかのＲＴＶを等量用いて、単球由来マクロファージを１２時間処理し、次いで洗浄した。ＲＴＶ−ＮＰ処理後１日目に、薬物処理したＭＤＭに、０．０１感染性ウイルス粒子／細胞の感染多重度でＨＩＶＡＤＡを感染させた（Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６７：１４２８−１４４１）。ウイルス感染に続いて、一日おきに培地の半分を交換しながら、１０日間細胞を培養した。逆転写酵素（ＲＴ）活性（Ｋａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６：３３９６−３４０４）によりアッセイされる子孫ウイルス粒子産生を測定するために、感染後１０日目に培地試料を収集した。感染細胞におけるＨＩＶ ｐ２４抗原の発現についての並行分析を、培地採取と同じ日に、ｐ２４マウスモノクローナルＡｂ（Ｄａｋｏ［ＣＡ，ＵＳＡ］）を使用する免疫染色により実施した。

ＲＴアッセイ
９６ウェルプレートにおいて、培地試料（１０μｌ）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、３００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭジチオスレイトール、０．１％ノニルフェノキシルポリエトキシルエタノール４０（ＮＰ−４０）、および水を含有する溶液１０μｌと混合した。この反応混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭジチオスレイトール、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０５％ＮＰ−４０、１０μｇ／ｍｌポリ（Ａ）、０．２５０Ｕ／ｍｌオリゴｄ（Ｔ）１２−１８、および１０μＣｉ／ｍｌトリチウム標識チミジン三リン酸を含有する溶液２５μｌを各ウェルに加えた；プレートを３７℃で１８時間インキュベートした。インキュベーション後、冷１０％ＴＣＡ５０μｌを各ウェルに加えた；これらのウェルをグラスファイバーフィルター上に採取し、β−シンチレーション分光法により、フィルターについてトリチウム標識チミジン三リン酸の取り込みをＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．［ＭＡ，ＵＳＡ］）を使用して評価した（Ｋａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６：３３９６−３４０４）。

ＨＩＶ−１ ｐ２４染色の免疫組織化学および定量
ＨＩＶ−１感染後合計１０日目に、４％リン酸緩衝化ＰＦＡを用いて室温で１５分間、細胞を固定した。固定細胞を、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中の１０％ＢＳＡを用いて室温で３０分間ブロックし、ＨＩＶ−１ ｐ２４に対するマウスモノクローナル抗体（１：１００，Ｄａｋｏ）と共に室温で３時間インキュベートした。Ｄａｋｏ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）＋ Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ標識ポリマー抗マウス二次Ａｂおよびジアミノベンジジン染色を使用して、ｐ２４Ａｂの結合を検出した。細胞核をヘマトキシリンで６０秒間対比染色した。４０倍対物レンズを備えたニコンＴＥ３００顕微鏡を使用して画像を取得した。免疫染色の定量は、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ｖ．４．０（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．［ＭＤ，ＵＳＡ］）を使用するデンシトメトリーにより実施した。ｐ２４の発現は、顕微鏡視野当たり全画像領域のパーセントとして陽性領域（指標）を決定することにより定量した。

統計分析
免疫染色の定量を、ＪＡＣｏＰプラグイン（ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｐｌｕｇｉｎｓ／ｔｒａｃｋ／ｊａｃｏｐ．ｈｔｍｌ）を利用して、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで実施し、ピアソンの共局在係数を計算した。同じ光学設定で取得された３〜５組の画像について比較した。グラフおよび統計分析は、ＥｘｃｅｌおよびＰｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．［ＣＡ，ＵＳＡ］）使用して作製した。取り込みおよび放出試験の薬物レベルの有意差は、二元配置分散分析およびそれに続くボンフェローニの多重比較検定により判定した。ｓｉＲＮＡ実験におけるＲＴ活性、ｐ２４密度、および薬物含量の有意差は、一元配置分散分析およびそれに続くダネットの多重比較検定より判定した。他のすべてのデータについては、両側スチューデントｔ検定を使用した；特に明記がない限り、エラーバーは±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として示される。結果は、Ｐ＜０．０５の場合、有意であると見なした。

結果
ＲＴＶ−ＮＰの特性評価およびインビトロの薬物動態
リトナビルＮＰは、ナノＡＲＴの代表的な製剤であり、そのため細胞粒子局在化および放出のアッセイのために使用した。ＲＴＶ−ＮＰは、ｍＰＥＧ_２０００−ＤＳＰＥ、Ｐ１８８、およびＤＯＴＡＰのリン脂質界面活性剤で薄層コーティングされた遊離塩基ＲＴＶの薬物結晶からなった。図８Ａに、粒子の物理的性質（サイズ、形状、およびゼータ電位）を示す。Ｐ１８８およびｍＰＥＧ_２０００−ＤＳＰＥは、粒子安定性を増加させたが、一方ＤＯＴＡＰコーティングは正の表面電荷を可能にした。多分散性指数は０．１９６であり、これは、ＲＴＶ−ＮＰの大多数は計算された平均測定サイズであるが、粒子集団全体は不均一であることを示す。Ｐ１８８単独、Ｐｌ８８／ｍＰＥＧ_２０００−ＤＳＰＥ、またはＰｌ８８／ｍＰＥＧ_２０００−ＤＳＰＥ−ＤＯＴＡＰは、ＲＴＶ−ＮＰの細胞取り込みに影響を及ぼさないことは留意すべきである。走査型電子顕微鏡では、ＲＴＶ−ＮＰの滑らかな棒様形態が示され、サイズ測定および分布が確認された（図８Ｂ）。

ＲＴＶ−ＮＰのＭＤＭ取り込みに関する細胞ベースの薬物動態および放出を評価した。細胞をＤＭＥＭ中の１００μＭ ＲＴＶ−ＮＰに曝露し、薬物取り込みをＨＰＬＣにより評価した。この薬物濃度は、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド、黄色のテトラゾール）アッセイおよびＲＴ活性によりそれぞれアッセイした場合に、細胞毒性および強力な抗レトロウイルス効果を制限したことを示す以前の観察に基づいて選択した。ＭＤＭにおけるＲＴＶ−ＮＰの内部移行は、３０分に観察され、４時間にピークに達した（図８Ｃ）。内部移行した粒子は、最大１５日間ＭＤＭに検出された（図８Ｄ）。マクロファージへのＲＴＶ−ＮＰの侵入機序を分析するために、化学ブロッカーを使用して、クラスリンおよびカベオラ媒介細胞侵入を阻害した。１００μΜ ｄｙｎａｓｏｒｅ（ダイナミンの阻害によってクラスリン被覆ピット形成を妨害する）またはインドメタシン（カベオラ阻害剤）で１時間前処理した後に、ＭＤＭを蛍光ＲＴＶ−ＮＰに曝露した。フローサイトメトリーおよびＨＰＬＣ分析により、ＲＴＶ−ＮＰの内部移行がクラスリン被覆ピットを介して起こることが実証された（図８Ｅおよび８Ｆ）。

プロテオ−ム解析による、ＲＴＶ−ＮＰを含有するエンドサイトーシスコンパートメントの同定
透過型電子顕微鏡による、ＲＴＶ−ＮＰ積載ＭＤＭのイメージングにより、明瞭な細胞質小胞へのインタクト粒子の取り込みが確認された（図９Ａ）。次いで、ＭＤＭ内部におけるＲＴＶＮＰの細胞内分布を研究した。ＲＴＶ−ＮＰをブリリアントブルーＲ−２５０色素で標識し、ＭＤＭに１２時間加えた。ＭＤＭを機械的に破壊し、ＲＴＶ−ＮＰを含有するエンドサイトーシスコンパートメント（青色）を、ショ糖勾配上の青色バンドとして収集した（図９Ｂ）。これらの分画の質量分析により、明瞭なエンドソーム集団に結合した３８のタンパク質を同定した（図１０）。それらの仮定される細胞内局在に基づいて、タンパク質を、クラスリン被覆ピット、初期エンドソーム（ＥＥ）、再循環エンドソーム（ＲＥ）、多小胞体、後期エンドソーム（ＬＥ）、およびリソソーム（Ｌ）に分類した。タンパク質は、初期および再循環エンドサイトーシス細胞コンパートメントに主として分布した（ＥＥ［２４％］およびＲＥ［２２％］）（図９Ｃ）。これらのデータは、ＲＴＶ−ＮＰの細胞内選別における再循環コンパートメントの役割を示す。

ＲＴＶ−ＮＰの細胞内分布についての共焦点顕微鏡検査
プロテオミクスによる発見をさらに実証するために、共焦点顕微鏡検査を実施して、初期（ＥＥＡ１）、再循環（Ｒａｂ８、１１、および１４）、および分解エンドサイトーシスコンパートメント（後期分解エンドソーム［Ｒａｂ７］）、ならびにＬ（ＬＡＭＰ１）に伴うＲＴＶ−ＮＰの細胞内分布を視覚化し、定量化した。ＭＤＭを、ＤｉＤまたはＤｉＯのいずれかで蛍光標識したＲＴＶＮＰで１２時間処理し、次いで、プロテオ−ム解析により同定されたエンドサイトーシスコンパートメントに対して免疫染色した（図１１）。共焦点イメージングにより、主としてＥＥおよびＲＥと共局在する細胞質および核周囲領域の全体にわたって、ＮＰが点状パターンで分布することが示された（図１１Ａ〜Ｈ）。ピアソンの共局在検定を使用する、フルオロフォアオーバーラップの定量により、ＥＥＡ１＋（９．５±０．４％［平均値±ＳＥＭ］；ｎ＝４１）初期エンドソーム、ならびにＲａｂ８＋（１２．８±０．２％；ｎ＝５６）、Ｒａｂ１１＋（３１．０±０．６％；ｎ＝３３）、およびＲａｂｌ４＋（２２．８±０．５％；ｎ＝１８９）ＲＥに伴うＲＴＶ−ＮＰの蓄積が、Ｒａｂ７ ＬＥ（４．１±０．４％；ｎ＝４７）およびＬ（５．０±０．９％；ｎ＝２８；図１１Ｇ）などの分解コンパートメントと比較して、有意であることが示された（ｐ＜０．００１）。これらのデータは、ヒトＭＤＭにおいて、粒子は分解ではなくエンドサイトーシス再循環を受けることを示す。

ｓｉＲＮＡおよびブレフェルジンＡによるエンドサイトーシス再循環の破壊は、ＲＴＶ−ＮＰ放出を阻止する
ＲＴＶ−ＮＰ移行のための再循環経路を確認するために、Ｒａｂ８、１１、および１４をｓｉＲＮＡにより抑制した。ｓｉＲＮＡおよびＤｉＤ標識ＲＴＶ−ＮＰに曝露したＭＤＭを、細胞分布については共焦点顕微鏡検査により、薬物保持（細胞溶解物）および放出（培地）についてはＨＰＬＣにより分析した。未処理ＭＤＭおよびスクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ｓｉＲＮＡまたは標的ｓｉＲＮＡのいずれかに曝露されたＭＤＭを使用するウエスタンブロットにより、Ｒａｂタンパク質サイレンシングが確認された（図１２Ｃ）。共焦点顕微鏡検査により、ｓｉＲＮＡ処理ＭＤＭでは、未処理およびスクランブル処理ＭＤＭと比較して、ＲＴＶ−ＮＰの分布が相当変化することが示された（図１１および１２Ａ）。処理細胞では、ＲＴＶ−ＮＰとＲａｂ８、１１、および１４との共分布の減少、細胞質点状分布の消失および核に隣接した粒子凝集が示された（図１２Ａ）。ＨＰＬＣ分析により、Ｒａｂ１１およびＲａｂｌ４のｓｉＲＮＡで処理された細胞が、未処理、ｓｉＲＮＡスクランブル処理、およびＲａｂ８のｓｉＲＮＡ処理のＭＤＭよりも、より多くの薬物を保持し（図１２Ｄ）、培地により少ない薬物を放出する（図１２Ｅ）ことが示された。ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ；再循環および分泌活性の破壊物質）による処理でも同様の結果が得られ、核周囲領域へのＲＴＶ−ＮＰの凝集が起こった（図１２Ｂ）。ＨＰＬＣ分析により、ＢＦＡで処理されたＭＤＭが、未処理およびｓｉＲＮＡスクランブル処理細胞よりも、より多くの薬物を保持し、より少ない薬物を放出することが示された（図１２Ｄおよび１２Ｅ）。その結果、ＢＦＡ処理細胞の培地には、ＲＴＶ−ＮＰはほとんど検出されなかった。これらのデータをまとめると、ＲＴＶ−ＮＰの細胞内移行および放出の両方におけるエンドサイトーシス再循環経路が実証される。

エンドサイトーシスコンパートメント間のインタクトＲＴＶ−ＮＰの移行
後期分解エンドソームおよびＬへのＲＴＶ−ＮＰの最小分布は、実際に薬物が分解経路を回避するか否かについて疑問を抱かせた。界面活性剤（薬物結晶ではない）のみが脂溶性色素ＤｉＤおよびＤｉＯで蛍光標識されたので、粒子がインタクトの状態で移行されたか否かを検討した。ＲＴＶ−ＮＰに曝露した細胞を機械的に破壊し、ＥＥＡ１、Ｒａｂ１１、およびＬＡＭＰ１に結合したプロテインＡ／Ｇ常磁性ビーズを使用して、ＥＥ、ＲＥ、およびＬを免疫単離した（図１３Ａ）。ビーズに結合したエンドサイトーシスコンパートメントを、磁気分離により収集し、デジタル画像化し、次いで薬物含量をＨＰＬＣにより分析した（図１３Ａ）。興味深いことには、ビーズペレット（茶色）を覆う薬物（白色）の薄層は、免疫単離されたＲａｂ１１エンドソームにおいては容易に見ることができたが、他のコンパートメントでは見ることはできなかった（図１３Ｂ）。共局在共焦点検査と一致して、ＨＰＬＣ分析により、Ｒａｂ１１エンドソーム中に薬物が存在すること、また、さらに重要なことには、ＥＥＡ１またはＬＡＭＰ１結合小胞と比較して、著しく多量に存在することが確認された（図１３Ｃ）。これらの結果は、ポリマーコートおよびＲＴＶ−ＮＰの薬物結晶部分が実際に同じ選別（再循環）経路に入ることを示す。ＲＴＶ−ＮＰがエンドサイトーシス移行の間保護され、インタクトの状態で放出されるか否かを判定するために、取り込み後２４時間に培養液から収集したＲＴＶ−ＮＰを、薬物含量の測定に加えて、画像化した。オリジナルＲＴＶ−ＮＰの収集を回避するために、ＭＤＭをＤｉＤ標識ＲＴＶ−ＮＰに１２時間曝露し、徹底的に洗浄し（ＰＢＳ１ｍｌで５回）、蛍光顕微鏡で画像化して細胞内粒子のみの存在を確認し、次いで、取り込み後２４時間薬物を放出させた。走査型電子顕微鏡画像により、放出されたＲＴＶ−ＮＰはインタクトであり（図１４Ｂ）、オリジナル粒子（図１４Ａ）と同じサイズおよび形状を示すことがわかる。しかし、縁が滑らかで、すべてが個々に識別される本来の粒子（図１４Ａ）とは対照的に、放出された粒子は粗い縁を示し、凝集物として放出された（図１４Ｂ）。放出されたＲＴＶ−ＮＰが細胞培養液中に同定されたので、溶解した遊離薬物と比較した、粒子形態で存在する薬物の相対量を測定した。粒子状ＲＴＶを超遠心分離により可溶性ＲＴＶから分離し、ＨＰＬＣにより定量した。図１４Ｃに示すように、ＲＴＶの総量のうち、３２％が培地に溶解し、６８％がインタクトＮＰとして存在した。これらのデータは、薬物の大多数が粒子形態で細胞から放出されることを示す。

デキストラン結合ｐＨ感受性色素（ｐＨ＜５．５で明赤色蛍光を発する）により標識される酸性（分解）コンパートメントへの分布が最小であることから、ＲＥの温和なｐＨ環境がＲＴＶ−ＮＰの完全性を維持する可能性を示唆する（図１１Ｇ）。さらに、Ｔｆｎ＋コンパートメントとＲＴＶ−ＮＰが相当オーバーラップすることは、細胞膜への迅速な再循環もインタクト粒子の維持に寄与している可能性を示す（図１１Ｅ）。これらの結果は、ＲＴＶ−ＮＰの物理的性質および形態が、マクロファージ内での移行中に影響を受けないことを示す。

ＲＴＶ−ＮＰは、細胞放出後に抗レトロウイルス活性を維持する。
抗レトロウイルス活性が粒子放出後に維持されるか否かを試験するために、ＭＤＭを、同じ濃度の本来のＲＴＶ−ＮＰ、放出されたＲＴＶ−ＮＰ、および遊離薬物に曝露した後、ＨＩＶ感染に曝露した。抗レトロウイルス作用は、ＨＩＶ ｐ２４の発現およびＲＴ活性により測定した。遊離ＲＴＶによる前処理は、感染を防御しなかったが、本来のＲＴＶ−ＮＰおよび放出されたＲＴＶ−ＮＰの両方は、同等に、ＨＩＶの複製（ｐ２４染色）および多核巨細胞の形成を有意に（ｐ＜０．０１）抑制することができた（図１４Ｄおよび１４Ｆ）。逆転写酵素活性は、未処理細胞および遊離薬物に曝露された細胞と比較して、オリジナルＲＴＶ−ＮＰおよび放出ＲＴＶ−ＮＰに曝露されたＭＤＭでは有意に抑制された（図１４Ｅ）。これらの発見は、エンドサイトーシス選別がＲＴＶ−ＮＰの抗レトロウイルス効果に影響を及ぼさないことを実証し、効率的な薬物積載粒子送達ビヒクルとしてのマクロファージの高い可能性を示唆する。

単核食細胞（ＭＰ；単球および組織マクロファージ）による輸送のためにＡＲＴ薬物をナノ結晶に再製剤化すると、臨床の薬物効果が改善する。実際、生物学的障壁により防御されたＨＩＶの潜伏場所への薬物送達ビヒクルとしてＭＰを利用することは、薬物レジメンを単純化するだけでなく、それらの治療係数を高めるためにも役立つ。ＡＲＴ薬物は水に不溶であり、したがって水溶液中で安定な結晶を形成することができる。その食作用および遊走機能のために、ＭＰは外来物質を容易に摂取し、かつ微生物感染および炎症の部位に移動することができる。薬物ＮＰが負荷されると、これらの細胞は、そうでなければ物理的または生化学的障壁のいずれかが存在するために接近できない部位に薬物を送達する。ＭＰは、ＨＩＶの標的であり、かつウイルスのリザーバーおよびトランスポーターの両方として機能しうるので、ナノＡＲＴを輸送するための理想的な候補となる。特に、ナノ製剤は、癌化学療法および一連の微生物感染のために開発されてきた（例えば、Ｂｌｙｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ．Ｒｅｖ．２：ＣＤ００６３４３；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｏｐｉｎ．，２５：３０１１−３０２０；Ｐａｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．２４：５１−６１；Ｄｅｓｔａｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＢＭＣ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，９：１９８；Ｄｅｓｔａｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，６５：２１８３−２１８７；Ｂｅｄｕｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ４：ｅ４３４３；Ｂｒｙｎｓｋｉｋｈ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｎｏｍｅｄ．，５：３７９−３９６；Ｇｏｒａｎｔｌａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，８０：１１６５−１１７４；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，２００：４１−５２）。さらに、ＭＰの遊走機能が治療効果のために利用可能であるという考えは、実際的な意味をなす。その理由は、この同じ細胞がウイルスの標的および担体であり、強健な食作用能を示し、かつ持続的なウイルス増殖および炎症の部位に容易に遊走するからである。特に、ナノＡＲＴとマクロファージとの間の相互作用は、治療への転換が達成されることになれば、重要である。興味深いことには、ＲＴＶ−ＮＰの大多数は、保護環境を提供するコンパートメント内に含有され、これらの粒子が抗レトロウイルス活性を保持したインタクトな状態で放出されることが可能になる。重要なことには、ＲＴＶ−ＮＰのエンドサイトーシスコンパートメントは、ＨＩＶの生活環で使用されるものをそのまま写したものである。これらの結果は、活性薬物の細胞媒介送達が効果的であることを強く示す。

限定された細胞毒性に基づいて、ウイルス標的組織（リンパ系およびＣＮＳを含む）での高い抗レトロウイルス薬レベルの維持を、養子細胞移入で観察されるように、実現することができる。病院で広範囲に使用されるためには、ナノＡＲＴ合成をスケールする必要があろう。沈殿、ホモジナイゼーション、および湿式粉砕などの手法を使用して、十分な薬物負荷、適切な浸透圧濃度、粘性、および無菌に適した物理的および化学的安定性を備えたナノＡＲＴを調製することができる（Ｍａｒｒｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，３９：１１８３−１２０２；Ｍｕｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．，３４：１３９４−１４０５；Ｔａｋａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）５７：１０６１−１０６７）。

本明細書では、ＮＰが主としてクラスリン媒介経路（Ｋｕｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０：２５６−２７５）を通してマクロファージに入ることを実証する。ＮＰの細胞内分布は、再循環エンドソームコンパートメントに認められた。実際、共局在免疫細胞化学研究により、他のコンパートメントよりも、ＲＥ、具体的にはＲａｂ１１＋小胞内に顕著に多くのＲＴＶ−ＮＰが存在することが実証された。ＲＴＶ−ＮＰの細胞内分布パターンは核周囲領域に濃縮されており、これはＲＥへのそれらの局在化をさらに支持した（Ｈａｔｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，１１９：４８６６−４８７７；Ｊｕｎｕｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，１５：２２１８−２２２９；Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：６７７−６８２；Ｓｅａｍａｎ，Ｍ．Ｎ．（２００８）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，６５：２８４２−２８５８）。ＲＴＶ−ＮＰの存在が、酸性小胞との限定的な粒子オーバーラップによりＬＥおよびＬでも観察されたが、ＬＥおよびＬの内部に含有された粒子は分解されずにむしろ再循環コンパートメントに再移送される可能性がある。例えば、プロテオ−ム解析により同定されたＲａｂ９は、トランスゴルジ網と最終的に融合し、ＲＥに包括されるＬＥの逆行性輸送と関係している（Ｂａｒｂｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１５６：５１１−５１８；Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７：５６８−５７９）。これらの結果は、ＲＴＶ−ＮＰが細胞内分解を回避し、再循環コンパートメント内に主として貯留され、最終的に細胞表面で放出されることを示唆する。機能研究では、ＲＥ移行に関連したタンパク質を除去すると、ＲＴＶ−ＮＰ含有細胞からの薬物放出が阻害されることが実証された。具体的には、細胞内再循環のマーカー（Ｈｏｅｋｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，１１７：２１８３−２１９２；Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２２：５２８−５３４；Ｊｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．２４：１１７１−１１８０；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８：５４９−５５７；Ｍａｘｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１２１−１３２；Ｓｏｎｎｉｃｈｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４９：９０１−９１４；Ｚｅｒｉａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２：１０７−１１７）であるＲａｂ１１が、粒子移行および放出の両方を促進するように見えた。エンドソーム再循環には２つの主なタイプ、緩除タイプと迅速タイプがある。Ｒａｂ１１はＲａｂ９と共に（これら両方はプロテオ−ム解析中に同定された）、緩除循環に関与するタンパク質として認識されてきた（Ｃａｙｏｕｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １８０３：８０５−８１２；Ｓｈｅｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４５：１２３−１３９；Ｕｌｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３５：９１３−９２４；ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｌｕｉｊｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４３７９−４３８９）。さらに、迅速再循環として知られる、ゴルジから直接細胞表面に輸送するように導くＲａｂ８および１４とは対照的に、Ｒａｂ１１は、緩除再循環として知られる、ゴルジからエンドソームを介した、最終的に細胞表面への物質輸送を制御することができる点でエンドサイトーシスにおいてある役割を果たすことが示されてきた（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２９：１６５−１７５；Ｌａｒａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：３７８０３−３７８１３）。これにより、Ｒａｂタンパク質の除去の結果認められた機能的差異を説明することができた。すべての場合に、再循環Ｒａｂタンパク質を除去すると、ＲＴＶ−ＮＰが核近辺に極めて高密度に再分布するようになり、これらのタンパク質すべてが、粒子移行に関与することが示唆された。しかし、Ｒａｂ８を除去しても薬物放出は阻害されず、Ｒａｂｌ４を除去するとほんのわずか薬物放出が低下した。一方、Ｒａｂ１１を除去すると極めて顕著な阻害効果があり、粒子の一部は迅速に放出されうるが、主要機序としてＲａｂ１１＋を介する細胞膜への緩除再循環がおそらく含まれることが示唆された。Ｒａｂ１１がＴｆｎの迅速再循環に関与しており（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：６８０−６８５）、相当量の粒子がＴｆｎと共局在することが観察されたことは注目に値する。Ｒａｂ１１の除去が薬物放出を完全には阻害しなかったので、ＲＴＶ−ＮＰの迅速再循環が生じている可能性がある；しかし、ＲＴＶ−ＮＰが２週間を超えてＭＤＭ中に残存するので、粒子の大多数は実際には緩除再循環している可能性の方が高い。理論に拘束されるものではないが、ＲＴＶ−ＮＰの取り込みから放出までの細胞内移行の提案された経路を図１５に示す。最終的に、Ｒａｂ１１は、細胞骨格フィラメントに沿って小胞を輸送する、アクチンおよび微小管の両方をベースとしたモータータンパク質複合体を動員することが知られている（Ｊｏｒｄｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｔｒａｆｆｉｃ ６：１０７０−１０７７）。これらのタンパク質の多くもプロテオ−ム解析中に同定された。

まとめると、これらのデータから、ＲＴＶ−ＮＰが細胞内分解を回避し、細胞膜に再循環される経路が明らかになる。これは、粒子積載ＭＤＭから放出されたインタクトＲＴＶ−ＮＰを視覚的に同定することにより実証された。これらの放出された粒子が完全な抗レトロウイルス活性を保持ことがさらに実証された。この点で、ＭＤＭは、ＨＩＶ複製を阻害するインタクトＲＴＶ−ＮＰを取り込み、保持し、輸送し、そして放出する。これにより、マクロファージが、活性薬物をウイルス感染部位に送達する、ナノＡＲＴの真の「トロイの木馬」として機能できることが示される。第２に、少量のＲＴＶ−ＮＰがウイルス複製を完全に抑制することができる一方、同量の遊離薬物には効果がない以上、ＲＴＶ−ＮＰは、細胞内機序を介してウイルス複製を阻害することができると考えられる。ＮＰ−マクロファージ相互作用のこの面は、ＲＴＶ−ＮＰが、ＨＩＶのようにクラスリン被覆ピットによってマクロファージに入るという考えを支持する（Ｖｅｎｄｅｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １５：２３４７−２３６０）。さらに、ウイルスの生活環の重要な構成要素がＲＥ内部に存在する（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１１７４２−１１７５１；Ｖａｒｔｈａｋａｖｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｔｒａｆｆｉｃ ７：２９８−３０７）。まとめると、これらの発見は、ＲＴＶ−ＮＰがＨＩＶと共に細胞に入るだけでなく、同一の細胞内目的地も有しうることを示し、したがって、特定の細胞内コンパートメントに薬物をターゲティングすることが可能になる。これは、ナノＡＲＴが、幅広い意味で、極めて低い細胞内濃度でも強力な抗レトロウイルス効果を発揮しうる理由に有力な理論的根拠を提供する。この細胞内レベルでＨＩＶ複製が直接抑制されることにより、その結果としてＡＲＴの治療係数が向上し、それによって、ウイルス複製を阻害するために必要とされる薬物量が低下する。

実施例３
材料および方法
材料および機器
ポロキサマー１８８（Ｐ１８８；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８）、ポロキサマー４０７（Ｐ４０７；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１２７）、および葉酸は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ν，Ν’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、およびトリエチルアミンは、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）から購入した。ＬＨ−２０は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手した。ＡＴＶ硫酸塩は、Ｇｙｍａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）から購入し、次いで、抽出によりトリエチルアミンを用いて遊離塩基にした。指定されていない限り、他のすべての試薬および溶媒は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）またはＡｃｒｏｓから購入した。^１Ｈおよびスペクトルは、５００ＭＨｚの核磁気共鳴分光計（Ｖａｒｉａｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で記録した。アタザナビルナノ懸濁液は、ＮＥＴＺＳＣＨ ＭｉｃｒｏＳｅｒｉｅｓ Ｗｅｔ Ｍｉｌｌ（ＮＥＴＺＳＣＨ Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ）またはＡｖｅｓｔｉｎ Ｃ５高圧ホモジナイザーにより調製した。

葉酸末端Ｐ１８８（ＦＡ−Ｐ１８８）およびＰ４０７（ＦＡ−Ｐ４０７）の合成
ｐ−トルエンスルホニル末端Ｐ１８８の合成（ＴＯＳ−Ｐ１８８、２）。Ｐ１８８（８．４ｇ、１ｍｍｏｌ）をトルエン（３×５０ｍＬ）と共蒸発させて脱水し、次いで、ＤＭＡＰ（６１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１．０１ｇ、ｌ０ｍｍｏｌ）と共に無水ＤＣＭ２０ｍＬにアルゴン下で溶解した。この反応混合物を０℃に冷却し、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（１．９ｇ、ｌ０ｍｍｏｌ）を加えた。室温で一晩反応させた後、混合物を濾過して濃縮し、エーテルで沈殿させた。次いで、粗生成物をＤＣＭ／Ｂｒｉｎｅで抽出し、有機層を無水硫化マグネシウムで乾燥し、次いで減圧下で濃縮した。次いで、溶媒をエーテルで沈殿させて粗生成物を得た。ＬＨ ２０カラムでさらに精製することにより分析純度の生成物を得た。収率：６．８ｇ。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ（ｐｐｍ）７．７８（ｄ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ），７．４８（ｄ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ），４．１１（ｔ，Ｊ＝４．３９Ｈｚ），３．６４−３．３７（ｍ），１．０４（ｄ，Ｊ＝３．９０Ｈｚ）。

アジド末端Ｐ１８８（アジド−Ｐｌ８８、３）の合成。ＴＯＳ−Ｐ１８８（５．２２ｇ、０．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ２０ｍＬに溶解し、次いでアジ化ナトリウム（０．３９ｇ、６ｍｍｏｌ）を加えた。反応を１００℃で２日間、撹拌しながら実施した。濾過後、真空下で溶媒を除去した。粗生成物をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解し、塩水（３×ｌ５ｍＬ）で抽出した。有機層を無水硫化マグネシウムで乾燥した。有機溶媒の除去後、粗生成物をＬＨ ２０カラムによりさらに精製して、分析純度の生成物を得た。収率：４．５ｇ^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_５）δ（ｐｐｍ）３．６５（ｔ，Ｊ＝４．３９Ｈｚ），３．６１−３．３８（ｍ），１．０４（ｄ，Ｊ＝３．９０Ｈｚ）。

アミン末端Ｐ１８８（アミン−Ｐｌ８８、４）の合成。Ｎ３−Ｐ１８８（１．２６ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）およびＰｄ／Ｃ１０ｍｇ（１０重量％）を、丸底フラスコ中、Ｈ_２雰囲気下で、室温７２時間、無水ＭｅＯＨ１０ｍｌ中で撹拌した。反応混合物を濾紙により濾過してＰｄ／Ｃを分離し、溶媒を蒸発させた。生成物のさらなる精製を、ジクロロメタン／エーテル混合物から０℃で沈殿させることにより実施した。生成物を濾過し、真空下で乾燥して固体を得た。収率：０．９ｇ。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ（ｐｐｍ）２．６５（ｔ，Ｊ＝４．３９Ｈｚ），３．６４−３．４３（ｍ），１．０３（ｄ，Ｊ＝３．９０ Ｈｚ）。

葉酸活性エステル（葉酸−ＮＨＳ、６）の合成。葉酸０．５ｇを、ＤＭＳＯ１０ｍｌおよびトリエチルアミン０．２５ｍｌに溶解する。モル比１．１のＮＨＳ（０．１３ｇ）およびＤＣＣ（０．２３ｇ）を加える。この混合物を、室温で一晩、暗所で撹拌する。副生成物であるジシクロヘキシル尿素を濾過により除去する。濾液中のＮＨＳ−葉酸をジエチルエーテルで沈殿させ、無水エーテルで数回洗浄し、乾燥させた後、黄色粉末として保存した。収率：０．４ｇ。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ（ｐｐｍ）８．６６（ｓ，１Ｈ），８．１６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝７．８０Ｈｚ，２Ｈ），６．９３（ｔ，Ｊ＝５．８５Ｈｚ，１Ｈ），６．６４（ｄ，Ｊ＝７．８０Ｈｚ，２Ｈ），４．５０（ｄ，Ｊ＝５．８５Ｈｚ，２Ｈ），４．２３（ｍ，１Ｈ），２．８３（ｓ，４Ｈ），２．３１（（ｔ，Ｊ＝６．８３Ｈｚ，２Ｈ）），２．０３（ｍ，１Ｈ），１．９３（ｍ，１Ｈ）。

葉酸末端Ｐ１８８（ＦＡ−Ｐ１８８、７）の合成。アミン−Ｐｌ８８（０．８４ｇ、０．１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ１０ｍＬに溶解し、この溶液に葉酸−ＮＨＳ（３２２ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を徐々に加え、室温で一晩、暗所にて反応させた。粗生成物をエーテルに沈殿させ、ＬＨ ２０カラムでさらに精製した。収率：０．６ｇ。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ（ｐｐｍ）８．６６（ｓ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ），６．９２（ｔ，Ｊ＝４．８８Ｈｚ），６．６４（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ），４．４８（ｄ，Ｊ＝５．３７Ｈｚ），４．２８（ｍ），３．６５（ｔ，Ｊ＝４．３９Ｈｚ），３．６０−３．４１（ｍ），２．１８（ｂ），２．０８−１．８９（ｍ），１．０４（ｄ，Ｊ＝５．８５Ｈｚ）。

上記と同じ手順を使用して、より多くのＦＡ−Ｐ１８８および葉酸末端Ｐ４０７（ＦＡ−Ｐ４０７）を、この研究のために合成した。

葉酸アタザナビルナノ懸濁液（ＦＡ−Ｐ１８８−ＡＴＶおよびＦＡ−Ｐ４０７−ＡＴＶ）の調製および特性評価
葉酸アタザナビルナノ懸濁液の調製については、以下の界面活性剤の組合せを使用した：（１）０．５％Ｐ１８８単独；（２）０．０５％ＦＡ−Ｐ１８８および０．４５％Ｐ１８８；（３）０．１％ＦＡ−Ｐ１８８および０．４％Ｐ１８８；（４）０．１５％ＦＡ−Ｐ１８８および０．３５％Ｐ１８８；（５）０．５％Ｐ４０７単独；（６）０．０２５％ＦＡ−Ｐ４０７および０．４７５％Ｐ４０７；（７）０．１％ＦＡ−Ｐ４０７および０．４％Ｐ４０７；（８）０．２％ＦＡ−Ｐ４０７および０．３％Ｐ４０７を、ｌ０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．８）に別々に懸濁した。次いで、遊離塩基型ＡＴＶ（１重量％）を、界面活性剤溶液に加えた。この懸濁液を、Ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ（登録商標）Ｔ−１８ローター−ステータミキサーを使用して均一分散になるまで撹拌した。湿式粉砕によるナノ懸濁液の調製については、懸濁液を、０．８ｍｍ粉砕媒体（ジルコニウムセラミックビーズ）５０ｍＬと共に、ＮＥＴＺＳＣＨ ＭｉｃｒｏＳｅｒｉｅｓ Ｗｅｔ Ｍｉｌｌ（ＮＥＴＺＳＣＨ Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ）に移し、６００〜４３２０ｒｐｍの範囲の速度で、３０分〜１時間粉砕して、所望の粒子サイズのＡＴＶナノ懸濁液を調製した。ホモジナイゼーションによるナノ懸濁液の調製については、懸濁液をＡｖｅｓｔｉｎ Ｃ５高圧ホモジナイザーに移し、約３０パスの間、または所望の粒子サイズが得られるまで、２０，０００ポンド／平方インチでホモジナイズした。粒子サイズ、多分散性、および表面電荷は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ−Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）で分析した。所望の粒子サイズが得られた後、試料を４℃で３０分間、１０，０００×ｇで遠心分離した。得られたペレットを、０．９２５％ショ糖および０．５％ポリマー溶液で２回洗浄し、次いで、ホモジナイゼーション後に浸透圧を調整するための０．９２５％ショ糖と共にそれぞれの界面活性剤溶液に再懸濁した。ナノ懸濁液中のＡＴＶ濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して測定した。

ＭＤＭにおけるＦＡ−ＡＴＶナノ懸濁液の取り込み、保持、および放出
７日間の分化の後、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を０および５０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで２４時間活性化した。次いで、これらの活性化ＭＤＭおよび非活性化ＭＤＭの一部を、０％、１０％、および３０％のＦＡ−Ｐ１８８を含有する１００μΜ ＦＡ−Ｐ１８８−ＡＴＶで処理した。これらのＭＤＭの別の一部を、最初に葉酸で処理し、次いで０％、１０％、および３０％のＦＡ−Ｐ１８８を含有する１００μΜ ＦＡ−Ｐ１８８−ＡＴＶで処理した。ＦＡ−Ｐ１８８−ＡＴＶの取り込みは、８時間培地交換せずに、種々の時点で評価した。付着したＭＤＭをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中に掻き取って集めた。細胞を４℃で１０分間、９５０×ｇで遠心分離してペレットにした。細胞ペレットを、メタノール２００μｌ中で短時間超音波処理し、４℃で１０分間、２０，０００×ｇで遠心分離した。メタノール抽出物を、ＨＰＬＣ分析まで−８０℃に保存した（図１７）。ＭＤＭによるＦＡ−Ｐ４０７−ＡＴＶの取り込みは、ＦＡ−Ｐ１８８−ＡＴＶと同じ方法を使用して評価した。

ＦＡ−ＡＴＶナノ懸濁液の抗レトロウイルス活性
ＭＤＭを１００μΜ ＡＴＶナノ懸濁液で８時間処理し、洗浄して過剰な薬物を除去し、ナノＡＲＴ処理後１０および１５日目に、０．０１感染性ウイルス粒子／細胞の感染多重度にてＨＩＶ−１_ＡＤＡで感染させた。ウイルス感染に続いて、一日おきに培地の半分を交換しながら、１０日間細胞を培養した。培地試料を、逆転写酵素（ＲＴ）活性により分析される子孫ウイルス粒子産生の測定のために１０日目に収集した。感染細胞によるＨＩＶ−１ ｐ２４抗原の発現についての並行分析を、免疫染色により実施した。

結果
葉酸−ポロキサマーの合成
抗レトロウイルス剤をＨＩＶ感染部位にターゲティング送達するために、葉酸修飾ポロキサマーを設計し、下記工程により合成した（図１６）。手短に言えば、過剰量のｐ−トルエンスルホニルクロリドでポロキサマー（Ｐ１８８およびＰ４０７、１）を活性化した後、トシル化された生成物（２）を、１００℃で一晩、ＤＭＦ中の過剰量のアジ化ナトリウムと反応させることによりアジド−ポロキサマー（３）に変換し、次いでトリフェニルホスフィンでアミン−ポロキサマー（４）に還元した。最後に、葉酸（５）をＤＣＣ／ＮＨＳで活性化し、得られた活性化エステル（６）をアミン−ポロキサマーと反応させて、所望の葉酸−ポロキサマー（ＦＡ−Ｐ１８８およびＦＡ−Ｐ４０７、７）を得た。ＬＨ−２０カラムによる精製後、純粋なＦＡ−Ｐ１８８およびＦＡ−Ｐ４０７（約２．５ｇ）を、ＭＤＭの取り込み、保持、放出、および抗レトロウイルス試験のために統合した。

本試験で使用したナノ製剤は、同様のサイズ、電荷、および形状であった。粒子サイズは、ホモジナイゼーションにより調製されたＰ１８８−ＡＴＶ（Ｈ３００１）の場合の２８１ｎｍから、界面活性剤として５％ＦＡ−Ｐ４０７／９５％Ｐ４０７を用いて調製されたＦＡ−Ｐ４０７−ＡＴＶ（Ｈ３０２４）の場合の４４０ｎｍまでの範囲となった（表３）。粒子はすべて負に荷電した。最大荷電の製剤はホモジナイゼーションにより調製されたＰ１８８−ＡＴＶ（Ｈ３００１）であり、最小負荷電のものは２０％ＦＡ−Ｐｌ８８／８０％Ｐ１８８（Ｈ３０１６）を含有する製剤であった。葉酸修飾またはポリマーにかかわらず、粒子はすべて長い棒状形状であった（図１７）。

ＭＤＭによるＡＴＶナノ懸濁液の取り込みおよび保持
ナノ結晶のポリマーコーティングの葉酸修飾により、ＭＤＭによるナノ製剤の処理方法が改変されることになるか否かを判定するために、細胞取り込みを測定した。結果によれば、葉酸受容体の発現が非活性化マクロファージよりも活性化マクロファージで大きいことが示された。したがって、ＦＡ−ＡＴＶナノ懸濁液の取り込みが培養ＭＤＭの活性化により影響を受けることになるか否かを最初に判定した。ＡＴＶナノ懸濁液（ＦＡ−ポロキサマーを含有または非含有）の添加前に、５０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳでＭＤＭを２４時間処理して活性化した。ナノ製剤の取り込みを１および８時間で測定した。ほとんどのＡＴＶナノ懸濁液について、全取り込みの９５％超が８時間までに起こることを実証した以前の研究に基づいて、最大取り込みに関して８時間を使用した。ＦＡ−Ｐ１８８で修飾されたＡＴＶナノ懸濁液の取り込みは、ＦＡ−Ｐ１８８で修飾されていないＡＴＶナノ懸濁液の取り込みよりも約２倍超大きかった。取り込みの増強は、Ｐ１８８−ＡＴＶナノ懸濁液中のＦＡ−Ｐ１８８のパーセントにより影響を受けなかった（図１８Ａ）。興味深いことには、ＦＡ−Ｐ１８８−ＡＴＶの取り込みの増強は、ＬＰＳによるＭＤＭの活性化により増加せず（図１８Ｂ）、ＬＰＳ活性化が、使用したＭＤＭの細胞表面上の葉酸受容体の発現を増加させないことが示唆された。ＦＡ−Ｐ１８８−ＡＴＶの取り込みの増強が受容体媒介性であるか否かを判定するために、ＡＴＶナノ懸濁液の添加の３０分前に葉酸（２．５ｍＭ）を培地に加えた。その結果より、過剰量の葉酸の添加が葉酸修飾ＡＴＶナノ懸濁液の取り込みの増強を阻止すること、およびＦＡ−Ｐ１８８を含有するＡＴＶナノ懸濁液の取り込みが、ＦＡ−Ｐ１８８を含有しないＡＴＶナノ懸濁液の取り込みに類似すること（図１８Ｃ）が示され、ＦＡ−ＡＴＶナノ懸濁液の取り込みの増強およびターゲティング能力が示された。

Ｐ１８８の高いＣＭＣプロフィールのために、ＦＡ−Ｐ１８８−ＡＴＶナノ製剤は、ＡＴＶナノ懸濁液のターゲティング任務を遂行しないＦＡ−Ｐ１８８ユニマーを大量に含有することになる。次いで、ＣＭＣが低いＰ４０７を、ＡＴＶを製剤化するための代替賦形剤として選択した。このポリマーも葉酸で修飾して、ＦＡ−Ｐ４０７−ＡＴＶナノ懸濁液を調製し、種々のパーセントのＦＡ−Ｐ４０７を含有するＡＴＶナノ懸濁液におけるＭＤＭの取り込みの差を、ＦＡ−Ｐ１８８−ＡＴＶと同じ条件下で測定した。図１９に示すように、５、２０、または４０％のＦＡ−Ｐ４０７（Ｈ３０２０）を含有するＡＴＶナノ製剤の取り込みは、非修飾Ｐ４０７−ＡＴＶナノ懸濁液の取り込みよりも大きく、ＦＡ−Ｐ４０７のパーセントに依存した。４０％のＦＡ−Ｐ４０７を含有する製剤の取り込みは、非修飾Ｐ４０７のみを含有するＡＴＶナノ製剤の取り込みよりも８時間において５倍大きかった。

これらの結果に基づいて、Ｐ１８８単独（Ｈ３００１）、２０％のＦＡ−Ｐ１８８（Ｈ３０１６）、Ｐ４０７単独（Ｈ３０１９）、または４０％のＦＡ−Ｐ４０７（Ｈ３０２０）を含有するＡＴＶナノ懸濁液を、８時間にわたるＭＤＭ取り込みならびに１５日間にわたるそれらの保持および放出を直接比較するさらなる試験のために選択した。８時間後における、Ｐ４０７でコーティングされたＡＴＶナノ懸濁液の取り込みは、ｐ１８８でコーティングされた粒子の取り込みよりも２．３倍増強された（２０．７μｇ／１０^６細胞対８．８ｐｇ／１０^６細胞）。ＡＴＶナノ懸濁液の葉酸修飾は、非修飾ＡＴＶナノ懸濁液に対して、ＭＤＭ取り込みを２．９倍（Ｐ１８８）または１．６倍（Ｐ４０７）増加させた。１５日間にわたる、ＡＴＶナノ懸濁液の保持プロフィールは、研究されたすべての製剤について同様であったが、ＭＤＭにおけるＦＡ−ＡＴＶナノ懸濁液の保持は、非ＦＡ修飾ＡＴＶナノ懸濁液よりも顕著に高かった。Ｈ３００１、Ｈ３０１９、Ｈ３０１６、およびＨ３０２０の負荷に続いてそれぞれ、最初の２４時間の細胞放出の間に、ＭＤＭから薬物の２４％、３７％、１７％、および１３％が消失し、すべての製剤について、処理後１５日間を通して、細胞ＡＴＶレベルは比較的一定に維持され、培地へのそれらの放出は持続的であった（図２０）。１５日目では、細胞薬物濃度は、１日目の薬物濃度の６７％（Ｈ３００１）〜１００％（Ｈ３０１６）であった。これらの結果は、これらの製剤が持続的な抗レトロウイルス作用を有することを示す。

ＡＴＶナノ懸濁液の抗レトロウイルス効果
製剤の抗レトロウイルス効果を判定するために、Ｐ１８８単独（Ｈ３００１）、２０％のＦＡ−Ｐ１８８（Ｈ３０１６）、Ｐ４０７単独（Ｈ３０１９）、または４０％のＦＡ−Ｐ４０７（Ｈ３０２０）を含有するＡＴＶナノ懸濁液を、これらの試験のために選択した。ＭＤＭは、ＡＴＶナノ懸濁液で８時間負荷し、次いで、ＡＴＶナノ懸濁液の負荷後、１、５、１０、または１５日目にＨＩＶ−１_ＡＤＡウイルスに曝露した。ウイルスの暴露後１０日目に、培地中の逆転写酵素活性および細胞のＨＩＶ−１ ｐ２４＋染色を測定した。ＨＩＶ−１ウイルス感染は、すべての製剤により同等に阻害された。ＡＴＶナノ懸濁液処理後１０日目にウイルス暴露を行った場合は、ＲＴ活性は７０〜９０％阻害され、ナノ粒子処理後１５日目にウイルス曝露を行った場合は、７０％超阻害された（図２１）。ｐ２４抗原の発現は、ＲＴ活性について観察されたウイルス阻害を確認した（図２２）。ｐ２４＋染色（茶色の染色）は、ＡＴＶナノ懸濁液処理後１および５日目にウイルスに曝露された細胞ではほとんど観察されなかった。ＡＴＶナノ懸濁液処理後１０および１５日目にウイルスに曝露すると、これらの細胞において、いくつかの明白なｐ２４染色が生じた。これらの結果をまとめると、葉酸修飾ポロキサマーでコーティングされたＡＴＶナノ懸濁液は、非修飾ポロキサマーでコーティングされた粒子と同様の抗ウイルス効果を有することが示される。

実施例４
材料および方法
活性エステル（ペンチン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル、９）の合成
４−ペンチン酸１．０ｇ（１０ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２４０ｍｌに溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）１．２７ｇ（１１ｍｍｏｌ）を加えた（図２３を参照）。次いで、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を加えた（２．１１ｇ、１１ｍｍｏｌ）。反応は、室温で一晩撹拌した。反応混合物を塩水で３回抽出した。有機層を蒸発乾固し、純生成物を得た。収量：１．５ｇ。

２−ブロモエチル−Ｏ−α−Ｄ−マンノピラノシドの合成（１１）
１．５ｇのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＩＲ−１２０を２−ブロモエタノール（２０．３ｇ；０．１６４モル）１１．５ｍｌに懸濁した。この混合物を、冷却器を装着したフラスコ中、９０℃で加熱した。３０〜４０分後、約１．５ｇのＤ−マンノース（０．００８３モル）を１回で加えた。反応混合物を同じ条件で３時間撹拌し、次いで室温に冷却して濾過した。真空下で溶媒を除去した。得られた粘着性残査をメタノールに溶解し、シリカゲル５ｇをフラスコに加えて懸濁液を作製した。溶媒を減圧下で蒸発させて除去した。シリカ支持反応混合物を、あらかじめＳｉ０_２が充填されたカラムに負荷し、酢酸エチル、次いでエチル酢酸：メタノール、１９：１（ｖ／ｖ）で前溶出した。収率：６１％。

２−アジドエチル−Ｏ−α−Ｄ−マンノピラノシド（１２）の合成
アジ化ナトリウム０．４６ｇ（０．００７モル）および２−ブロモエチル−Ｏ−α−Ｄ−マンノピラノシド１ｇ（０．００３５モル）を、ＤＷ３ｍｌに溶解した。次いで、この混合物にアセトン２０ｍｌを加えて、わずかに混濁した溶液を形成させた。反応は、２４時間撹拌しながら還流するまで加熱した。反応混合物の精製は、溶出液として酢酸エチル：メタノール（５：１）を用いてカラムクロマトグラフイーにより行った。

アセチレン末端Ｆ１２７（アセチレン−Ｆ１２７、１４）の合成
ＮＨ_２−Ｆ１２７（２．５６ｇ、０．２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ１０ｍｌに溶解し、次いでペンチン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル０．３９ｇ（２ｍｍｏｌ）をこの溶液に加えた。反応溶液を室温で２日間撹拌した。反応溶液を濃縮し、次いでエーテルで沈殿させた。次いで、粗生成物をＬＨ２０カラムで精製した。収量：１．９ｇ。

マンノース末端Ｆ１２７（マンノース−Ｆ１２７、１５）の合成
アセチレン末端Ｆ１２７（１．２５ｇ、０．１ｍｍｏｌ）、２−アジドエチル−Ｏ−α−Ｄ−マンノピラノシド（１００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、安定化剤（８．７ｍｇ、２０μｍｏｌ）、およびＣｕＳ０_４−５Ｈ_２０（５ｍｇ、２０μｍｏｌ）を、４ｍｌのメタノール／Ｈ_２０に撹拌しながら溶解した。アルゴンを泡立たせて酸素を除去し、次いで０．５ｍＬのＨ_２０中のアスコルビン酸ナトリウム（４０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）をこの溶液に一滴ずつ加えた。反応混合物を室温で２日間撹拌した。真空下で溶媒を除去した。粗生成物をＬＨ−２０カラムにより精製した。収量：０．８ｇ。

ナノ懸濁液の調製
マンノース−Ｆｌ２７をｌ０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．８）に懸濁した。次いで、遊離塩基型ＡＴＺ（０．１重量％）を界面活性剤溶液に加えた。この懸濁液を、Ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ（商標）Ｔ−１８ローター−ステータミキサーを使用して均一分散になるまで撹拌した。次いで、この混合物を、０．８ｍｍ粉砕媒体（ジルコニウムセラミックビーズ）５０ｍＬと共に、ＮＥＴＺＳＣＨ ＭｉｃｒｏＳｅｒｉｅｓ Ｗｅｔ Ｍｉｌｌに移した。試料を約４ｋｒｐｍの速度で約１時間処理して、所望の粒子サイズを有するナノＡＲＴを調製した。

結果
ナノＡＲＴの取り込みを培地交換せずに種々の時点で評価した。付着したＭＤＭをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中に掻き取って集めた。細胞を４℃で１０分間、９５０×ｇで遠心分離してペレットにした。細胞ペレットを、メタノール２００μｌ中で短時間超音波処理し、４℃で１０分間、２０，０００×ｇで遠心分離した。このメタノール抽出物を、ＨＰＬＣ分析まで−８０℃で保存した。図２４に、マンノースＡＴＶナノＡＴが、非標識ＡＴＶナノＡＲＴよりも高レベルにマクロファージに取り込まれることを示す。

実施例５
Ｐ１８８−ＡＴＶナノＡＲＴを０日目および７日目にＮＳＧマウスに投与した。血清薬物レベルを１、６、および１４日目に分析し、組織薬物レベルを１４日目に分析した。毒性は、血清化学的および組織病理学的評価からは明白ではなかった。２回目の２５０ｍｇ／ｋｇ投与後７日目の血清レベル（４００ｎｇ／ｍｌ）は、最小のヒト治療血清レベルである１５０ｎｇ／ｍｌを超えていた。ＡＴＶレベルは、２回目の投与後７日目の肝臓において最も高かった（１６５０ｎｇ／ｇ、ｗ／２５０ｍｇ／ｋｇ）。脾臓、腎臓、および肺のＡＴＶレベルは同等であった（１４０〜１５０ｎｇ／ｇ、ｗ／２５０ｍｇ／ｋｇ）。脳のＡＴＶレベルは定量限界であった。血清および組織の濃度は用量依存的であることがわかった。

次に、ＰＢＬで再構成したＮＳＧマウスに、ＨＩＶ−１感染前に投与した単回ナノナノＡＴＶ／ＲＴＶ処置が、持続的な血清および組織薬物送達および同じ用量の遊離薬物にまさる改善された抗ウイルス効果を提供するか否かを研究した。ナノＡＲＴ処置後９日目の血清薬物レベルは、遊離薬物後のレベルを２ログ上回った。より具体的には、ナノＡＲＴ（ＡＴＶ、ＲＴＶ、またはＥＦＶ）は、１４日間の時間経過にわたり遊離薬物より顕著に高い血清レベルを保持した。組織薬物レベルは、ナノＡＲＴ処置マウスにおいて、遊離薬物処置よりも１００〜１０００倍高かった。ＣＤ４＋細胞の数は、ナノＡＲＴ処置マウス対遊離薬物処置マウスにおいて差がなかった。ナノＡＲＴ処置は脾臓におけるＨＩＶ−１ ｐ２４＋を抑制したが、これは遊離薬物単独では観察されなかった。

次いで、ＰＢＬで再構成したマウスにＨＩＶ−１感染後に２回の毎週投与がなされた場合、ナノＡＴＶ／ＲＴＶまたはナノＡＴＶ／ＲＴＶ／ＥＦＶが、治療血清ＡＴＶレベル、リンパ組織におけるリザーバー薬物レベル、および抗レトロウイルス効果を提供するか否かを判定した。手短に言えば、ＰＢＬを−７日目にＮＳＧマウスに投与した。これらのマウスを−０．５日目にＨＩＶ−１に曝露した。ナノＡＲＴを０および７日目に投与した（ナノＡＴＶ／ＲＴＶを２５０ｍｇ／ｋｇまたはナノＡＴＶ／ＲＴＶ／ＥＦＶを１００ｍｇ／ｋｇ）。血清薬物レベルを１、６、および１４日目に検査し、組織薬物レベルを、ＣＤ４＋細胞およびｐ２４染色またはＲＮＡ検出と共に１４日目に分析した。

ＡＴＶの治療血清レベルは、ナノＡＲＴの２回用量で処置されたマウスで得られた。肝臓のＡＴＶレベルは、同様のナノＡＴＶ／ＲＴＶ用量で処置された通常ＮＳＧマウスよりも２倍高かった。脾臓のＡＴＶレベルは、通常ＮＳＧマウスとは異なり、処置マウスにおいて肝臓ＡＴＶレベルよりも１ログ高かった。脳のＡＴＶレベルは、定量限界であった。ＨＩＶ−１感染マウスのナノＡＲＴ処置後のＣＤ４＋細胞とＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞との比は、非感染マウスと同様であった。しかし、ナノＡＴＶ／ＲＴＶおよびナノＡＴＶ／ＲＴＶ／ＥＦＶは両方とも、これらのマウスのＨＩＶ−１感染に対して防御的であった（両方の療法は、ｐ２４レベルをほぼ検出不可能なレベルに低下させた）。

また、マウスに、わずか１０ｍｇ／ｋｇのナノ粒子または遊離薬物をＳＣ注射により投与した。表４に見られるように、この低用量のナノ粒子が、遊離薬物より優れた、驚くほど高レベルの薬物濃度をインビボでもたらした。

最後に、賦形剤として葉酸修飾ポリマーを含有するナノＡＴＶ／ＲＴＶが、血清のＡＴＶ薬物レベルの増加、リンパ組織のＡＴＶレベルの増加、および治療効果の改善をもたらすか否かを判定した。葉酸−Ｐ４０７のＡＴＶナノＡＲＴを、ＨＩＶ−１暴露後に、上記のようにＰＢＬで再構成したＮＳＧマウスに投与した。脾臓および肺のＡＴＶレベルは、Ｐｌ８８−ナノＡＴＶ／ＲＴＶで処置された動物と同様であった。腎臓、肝臓、および脳のＡＴＶレベルは、非修飾ナノＡＲＴよりも葉酸修飾ナノＡＲＴで処置されたマウスにおいて、それぞれ約５分の１に低下、約５倍上昇、および約１０倍上昇していた。ＣＤ４＋細胞数とＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞数との比は、非感染マウスで観察されたレベルに増加した。脾臓におけるＨＩＶ−１ ｐ２４＋細胞およびＲＮＡは、葉酸修飾ナノＡＲＴ処置マウスにおいて、ほぼ検出不可能なレベルに低下した。

いくつかの刊行物および特許文献を、本発明が属する現況技術を記載するために上述の明細書の全体にわたって引用する。これらの引用文献のそれぞれの開示全体を、参照により本明細書に組み込むものとする。

いくつかの本発明の好ましい実施形態を、上記に記載しかつ具体的に例示しているが、本発明をそのような実施形態に限定することを意図するものではない。以下の特許請求の範囲で述べられる本発明の範囲および精神から逸脱することなく、種々の修正を行うことができる。

Claims (23)

1. 少なくとも１つの治療剤および少なくとも１つの界面活性剤を含み、結晶性であることを特徴とするナノ粒子。
2. 請求項１に記載のナノ粒子において、前記界面活性剤が前記治療剤の結晶をコーティングすることを特徴とするナノ粒子。
3. 請求項１に記載のナノ粒子において、棒状形状または円形であることを特徴とするナノ粒子。
4. 請求項１に記載のナノ粒子において、ｚ−平均直径が約１００ｎｍ〜１μｍであることを特徴とするナノ粒子。
5. 請求項１に記載のナノ粒子において、前記界面活性剤が両親媒性ブロックコポリマーを含むことを特徴とするナノ粒子。
6. 請求項５に記載のナノ粒子において、前記両親媒性ブロックコポリマーが、ポリ（オキシエチレン）の少なくとも１つのブロックおよびポリ（オキシプロピレン）の少なくとも１つのブロックを含むことを特徴とするナノ粒子。
7. 請求項１に記載のナノ粒子において、前記界面活性剤が、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、１，２−ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン−メチル−ポリエチレングリコールコンジュゲート−２０００（ｍＰＥＧ_２０００ＤＳＰＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および１，２−ジオレオイロキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）からなる群から選択されることを特徴とするナノ粒子。
8. 請求項１に記載のナノ粒子において、前記界面活性剤が少なくとも１つのターゲティングリガンドに連結されていることを特徴とするナノ粒子。
9. 請求項８に記載のナノ粒子において、前記ターゲティングリガンドがマクロファージターゲティングリガンドであることを特徴とするナノ粒子。
10. 請求項９に記載のナノ粒子において、前記マクロファージターゲティングリガンドが葉酸であることを特徴とするナノ粒子。
11. 請求項１に記載のナノ粒子において、前記治療剤が抗レトロウイルスであることを特徴とするナノ粒子。
12. 請求項１に記載のナノ粒子において、前記治療剤が、アタザナビル（ＡＴＶ）、エファビレンツ（ＥＦＶ）、インジナビル（ＩＤＶ）、およびリトナビル（ＲＴＶ）からなる群から選択されることを特徴とするナノ粒子。
13. 請求項１２に記載のナノ粒子において、前記治療剤が、ＥＦＶ、ＩＤＶ、およびＲＴＶからなる群から選択されることを特徴とするナノ粒子。
14. 請求項１に記載のナノ粒子において、前記界面活性剤が荷電性であることを特徴とするナノ粒子。
15. 請求項１４に記載のナノ粒子において、前記界面活性剤が負に荷電していることを特徴とするナノ粒子。
16. 請求項１に記載のナノ粒子において、前記ナノ粒子が少なくとも約９５％治療剤を含むことを特徴とするナノ粒子。
17. 請求項１６に記載のナノ粒子において、前記ナノ粒子が少なくとも約９９％治療剤を含むことを特徴とするナノ粒子。
18. 請求項１に記載の少なくとも１つのナノ粒子および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
19. 必要のある被験体において、ＨＩＶ感染を治療または抑制する方法であって、前記方法が、前記治療剤が抗ＨＩＶ化合物である、請求項１８に記載の少なくとも１つの組成物を前記被験体に投与することを含む方法。
20. 請求項１９に記載の方法において、少なくとも１つの追加の抗ＨＩＶ化合物の投与をさらに含むことを特徴とする方法。
21. 請求項１９に記載の方法において、前記ターゲティングリガンドがマクロファージターゲティングリガンドであることを特徴とする方法。
22. 請求項２１に記載の方法において、前記マクロファージターゲティングリガンドが葉酸であることを特徴とする方法。
23. 請求項１９に記載の方法において、前記ナノ粒子が約１０ｍｇ／ｋｇ以下で投与されることを特徴とする方法。

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