JP2013542228A - Ｅｇｆｒ依存性疾患またはｅｇｆｒファミリーメンバーを標的とする薬剤に対して獲得耐性を有する疾患の治療における２−カルボキサミドシクロアミノウレア誘導体の使用 - Google Patents

Abstract

上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）依存性疾患、またはＥＧＦＲファミリーメンバーを標的とする薬剤に対して獲得耐性を有する疾患の治療における式（Ｉ）の化合物の使用、前記疾患の治療用の医薬組成物を製造するための前記化合物の使用、前記使用のための前記化合物とＥＧＦＲモジュレーターとの組合せ、前記化合物によって前記疾患を治療する方法、および前記化合物を単独でまたは特にＥＧＦＲモジュレーターと組み合わせて含む、前記疾患の治療用の医薬製剤。
【化７】

【選択図】 なし

Description

本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＨＥＲ１またはＥｒｂ−Ｂ１としても知られているＥＧＦＲ１、ＨＥＲ２またはＥｒｂ−Ｂ２としても知られているＥＧＦＲ２、ＨＥＲ３またはＥｒｂ−Ｂ３としても知られているＥＧＦＲ３、あるいはＥＧＦＲ４を含む）依存性疾患、またはＥＧＦＲファミリーメンバーを標的とする薬剤に対して獲得耐性を有する疾患の治療における、特定の２−カルボキサミドシクロアミノウレア誘導体の新規使用、前記疾患の治療用の医薬組成物を製造するための前記化合物の使用、前記使用のための前記化合物とＥＧＦＲモジュレーターとの組み合わせ、前記化合物によって前記疾患を治療する方法、および前記化合物を単独でまたは特にＥＧＦＲモジュレーターと組み合わせて含む、前記疾患の治療用の医薬製剤に関する。

ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインにおける体細胞変異は、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））またはエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））などの、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する臨床応答に関連している（Paezら, 2004, EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy, Science, vol 304, 1497-1500）。上皮成長因子受容体ファミリーは、ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ１またはＥｒｂ−Ｂ１としても知られている）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ２またはＥｒｂ−Ｂ２としても知られている）、およびＥＧＦＲ３（ＨＥＲ３またはＥｒｂ−Ｂ３としても知られている）、ならびに膜貫通タンパク質であるＥＧＦＲ４を含む、受容体のＥＲｂＢファミリーのメンバーを含む、４つのサブタイプから構成されている。ＥＧＦＲモジュレーターに対する獲得耐性は、初期には治療に対して臨床的に応答したが、その後、進行性の腫瘍を発症した患者に起こる。ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する応答不良は、二次的な耐性変異であるＴ７９０Ｍで例示され（Kobayashiら; 2005; EGFR mutation and resistance of non-small cell lung cancer to gefitinib, N.Engl J Med, Vol 352, 786-792）、これは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者（Gorreら; 2002; Bcr-Abl point mutants isolated from patients with imatinib mesylate resistant chronic leukemia remain sensitive to inhibitors of the Bcr-Abl chaperone heat shock protein 90, Blood, vol 100, 3041-3044）、またはＧＩＳＴ患者（Antonescuら; 2005; Acquired resistance to Imatinib in gastrointestinal stromal tumors occurs through secondary gene mutation, Clin Cancer Res, Vol 11, 4182-4190）において、Ｇｌｅｅｖｅｃ／Ｇｌｉｖｅｃまたはダサチニブで観察される耐性の変異に類似している。

活性化されたＥＧＦＲの下流におけるＰＩ３Ｋ経路の活性化の証拠が文献中に存在する。したがって、マウス胚線維芽細胞におけるＰＩ３Ｋ触媒サブユニット（ｐ１１０）の遺伝的除去により、細胞はＥＧＦＲの活性化型による形質転換に対して耐性にされる（Zhaoら; 2006; The p110 alpha isoform of PI3K is essential for proper growth factor signaling and oncogenic transformation, PNAS, vol 103, 16296-16300）。ＥＧＦＲファミリーの４つのメンバーの１つであり、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ１）のパートナーであるＨＥＲ３（ＥｒｂＢ−３）は、ＥＧＦＲ阻害剤に感受性を示す腫瘍中で、しばしば過剰発現され、これは、構成的ＰＩ３Ｋの動員および活性化と相関がある（Engelmanら; 2005; ErbB-3 mediates phosphoinositide 3-kinase activity in gefitinib-sensitive non small cell lung cancer cell lines, PNAS vol 102, 3788-3793; Serginaら; 2007; Escape from HER-family tyrosine kinase inhibitor therapy by the kinase-inactive HER 3; Nature; vol 445, 437-41）。ＥＧＦＲ増幅およびＥＧＦＲ阻害剤耐性を保持する腫瘍生検標本ならびに腫瘍細胞系を、遺伝子的および生化学的に特徴付けると、ＰＩ３Ｋ経路の構成的活性化状態が明らかとなった（Engelmanら; 2006; Allelic dilution obscures detection of a biologically significant resistance mutation in EGFR amplified lung cancer, The Journal of Clinical Investigation, vol 116, 2695-2706)。

驚くべきことに、国際公開第２０１０／０２９０８２号に記載の特定の２−カルボキサミドシクロアミノウレア誘導体は、単剤として、およびＥＧＦＲキナーゼモジュレーターとの組合せで、強力な抗増殖活性、ならびに増幅ＥＧＦＲおよび／または変異ＥＧＦＲ１を有する乳癌および胃癌細胞系のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍応答を引き起こすことが見出された。したがって、前記化合物は、ＥＧＦＲ依存性疾患の治療に有用である。

本発明は、ＥＧＦＲ依存性疾患（特に悪性腫瘍）またはＥＧＦＲの獲得耐性に推進される疾患の治療のための式Ｉの化合物（本明細書では「化合物Ｉ」と呼ぶ）またはその塩の使用に関する：

［式中、
Ａは、

からなる群から選択されるヘテロアリールを表し、
Ｒ^１は、以下の置換基の１つを表し：（１）非置換または置換の、好ましくは置換Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル（ここで前記置換基は、以下の部分の１つ以上、好ましくは１〜９つから独立に選択される：ジュウテリウム、フルオロ、または１〜２つの以下の部分：Ｃ_３〜Ｃ_５シクロアルキル）；（２）任意に置換されているＣ_３〜Ｃ_５シクロアルキル［ここで前記置換基は、以下の部分の１つ以上、好ましくは１〜４つから独立に選択される：ジュウテリウム、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル（好ましくはメチル）、フルオロ、シアノ、アミノカルボニル］；（３）任意に置換されているフェニル［ここで前記置換基は、以下の部分の１つ以上、好ましくは１〜２つから独立に選択される：ジュウテリウム、ハロ、シアノ、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキルアミノ、ジ（Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル）アミノ、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル）アミノカルボニル、Ｃ_１〜Ｃ_７アルコキシ］；（４）任意に一置換または二置換されているアミン［ここで前記置換基は、以下の部分から独立に選択される：ジュウテリウム、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル（非置換であるか、あるいはジュウテリウム、フルオロ、クロロ、ヒドロキシの群から選択される１つ以上の置換基によって置換されている）、フェニルスルホニル（非置換であるか、あるいは１つ以上、好ましくは１つのＣ_１〜Ｃ_７アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_７アルコキシ、ジ（Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル）アミノ−Ｃ_１〜Ｃ_７アルコキシによって置換されている）］；（５）置換スルホニル［ここで前記置換基は、以下の部分から選択される：Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル（非置換であるか、あるいはジュウテリウム、フルオロの群から選択される１つ以上の置換基によって置換されている）、ピロリジノ（非置換であるか、あるいはジュウテリウム、ヒドロキシ、オキソの群から選択される１つ以上の置換基、特に１つのオキソによって置換されている）］；（６）フルオロ、クロロ；
Ｒ^２は水素を表し；
Ｒ^３は、（１）水素、（２）フルオロ、クロロ、（３）任意に置換されているメチルを表す（ここで前記置換基は、以下の部分の１つ以上、好ましくは１〜３つから独立に選択される：ジュウテリウム、フルオロ、クロロ、ジメチルアミノ）；
ただし、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−ピリミジン−４−イル］−４−メチル−チアゾール−２−イル｝−アミド）は除く］。

本発明はさらに、ＥＧＦＲ依存性疾患もしくは悪性腫瘍、またはＥＧＦＲモジュレーターに対して獲得耐性を有する疾患の治療のための医薬製剤を製造するための、上で定義した式Ｉの化合物、またはその塩の使用に関する。

本発明はさらに、ＥＧＦＲ依存性疾患もしくは悪性腫瘍、またはＥＧＦＲモジュレーターに対して獲得耐性を有する疾患を治療するための式Ｉの化合物の、他の活性化合物、例えば、国際公開第２０１０／０２９０８２号に開示の組合せパートナーとの組合せでの使用に関する。ＥＧＦＲファミリー標的剤が最も好ましい。

本発明はさらに、例えば、非小細胞肺癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、乳癌、神経膠芽腫を含む悪性脳腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、すい臓癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、および／または卵巣癌を含むＥＧＦＲ依存性疾患を治療するために、同時、別個または逐次に使用するための、式Ｉの化合物と、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＮＶＰ−ＡＥＥ７７８、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＢＩＲＷ２９９２、ＢＭＳ６９０５１４、ペリチニブ、バンデタニブ、ＡＶ４１２、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体−Ｙ９０／Ｒｅ−１８８、セツキシマブ、パニツムマブ、マツズマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、ペルツズマブ、ＭＤＸ−２１４、ＣＤＸ１１０、ＩＭＣ１１Ｆ８、ペルツズマブ、トラスツズマブ、ＴＤＭ１、Ｚｅｍａｂ（登録商標）、Ｈｅｒ２ワクチンＰＸ１０４１、ならびにＨＳＰ９０阻害剤のＣＮＦ１０１０、ＣＮＦ２０２４、タネスピマイシン アルベスピマイシン、ＩＰＩ５０４、ＳＮＸ５４２２およびＮＶＰ−ＡＵＹ９２２からなる群から選択されるＥＧＦＲモジュレーターと、任意に、少なくとも１種の薬学的に許容される担体とを含む組合せであって、活性成分が、各場合において、遊離形態または塩の形態で存在する組合せに関する。

別の実施形態では、本発明は、ＥＧＦＲ依存性疾患または悪性腫瘍、好ましくは、ＥＧＦＲモジュレーターによる治療中に、前記ＥＧＦＲキナーゼモジュレーターに対する耐性を獲得した悪性腫瘍を治療する方法であって、式Ｉの特定の２−カルボキサミドシクロアミノウレア誘導体、特に好ましくは、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ａ）、または薬学的に許容されるその塩の治療上有効な量を、単独でまたはＥＧＦＲモジュレーターと組み合わせて、それを必要とする温血動物に投与することを含む方法に関する。

さらなる実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物、特に好ましくは、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ａ）、またはその塩、および少なくとも１種の薬学的に許容される担体を、単独でまたはＥＧＦＲモジュレーターと組み合わせて含む、ＥＧＦＲ依存性疾患、またはＥＧＦＲモジュレーターによる治療中に耐性を獲得した疾患の治療用の医薬製剤に関する。

さらなる実施形態では、本発明は、ＥＧＦＲ依存性疾患、またはＥＧＦＲモジュレーターによる治療中に耐性を獲得した疾患を治療するための、式Ｉの化合物、特に好ましくは、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ａ）、またはその塩の使用に関する。

ＰＩＫ３ＣＡ変異体、およびＥｒｂＢ２増幅乳癌細胞系ＢＴ４７４に対する、化合物Ａの抗腫瘍活性を示す図である。 同所性ＰＩＫ３ＣＡ変異体、およびＥｒｂＢ２増幅乳癌細胞系ＢＴ４７４を有するマウスにおける、ビヒクルおよび化合物Ａの治療群の平均体重を示す図である。 図１および図２におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験について、ＢＴ４７４同所性異種移植片を有する雌の胸腺欠損マウスを、図示した用量および計画で、化合物Ａまたはビヒクルによって治療した。治療は、腫瘍細胞移植後１６日目に開始し、１１日連続で継続した。腫瘍体積の変化量に関する統計は、一元配置ＡＮＯＶＡ、事後Ｄｕｎｎｅｔｔ法（ビヒクル対照に対して^＊ｐ＜０．０５）によって実施された。 ＰＩＫ３ＣＡ変異体、およびＥｒｂＢ２増幅乳癌細胞系ＢＴ４７４に対する、化合物Ａ１２．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．、ｑ２４ｈ（すなわち、２４時間ごと））の用量応答抗腫瘍活性を示す図である。 図３のｉｎ ｖｉｖｏ試験について、ＢＴ４７４同所性異種移植片を有する雌の胸腺欠損マウスを、１２．５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）、２５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）、または５０ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．）の用量および計画で、化合物Ａまたはビヒクルによって治療した。治療は、腫瘍細胞移植後１４日目に開始し、１４日連続で継続した。腫瘍体積の変化量に関する統計は、一元配置ＡＮＯＶＡ、事後Ｄｕｎｎｅｔｔ法（ビヒクル対照に対して^＊ｐ＜０．０５）によって実施された。 ＥｒｂＢ２増幅胃癌細胞系ＮＣＩ−Ｎ８７に対する、化合物Ａの抗腫瘍活性を示す図である。 皮下ＥｒｂＢ２増幅胃癌細胞系ＮＣＩ−Ｎ８７を有するマウスにおける、ビヒクルおよび化合物Ａの治療群の平均体重を示す図である。 図３および図４におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験について、ＮＣＩ−Ｎ８７皮下異種移植片を有する雌の胸腺欠損マウスを、図示した用量および計画で、化合物Ａまたはビヒクルによって治療した。治療は、腫瘍細胞移植後２５日目に開始し、２１日連続で継続した。腫瘍体積の変化量に関する統計は、一元配置ＡＮＯＶＡ、事後Ｄｕｎｎｅｔｔ法（ビヒクル対照に対して^＊ｐ＜０．０５）によって実施された。 ＰＩＫ３ＣＡ変異体、およびＥｒｂＢ２増幅乳癌細胞系ＢＴ４７４に対する、ビヒクル、化合物Ａの単剤１２．５ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．、１日１回）、トラスツズマブの単剤３ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．、週に３回）、および化合物Ａとトラスツズマブとの組合せの抗腫瘍活性、ならびに同所性ＰＩＫ３ＣＡ変異体およびＥｒｂＢ２増幅乳癌細胞系ＢＴ４７４を有するマウスにおける、ビヒクル、化合物Ａの単剤、トラスツズマブの単剤、および化合物Ａとトラスツズマブとの組合せの治療群の補正後の平均体重変化量（個々の動物それぞれについて百分率で表される、測定日の体重と１１日目の初期体重［どちらも初期の腫瘍重量を差し引くことによって補正済み］との間の比によって表される）を示す図である。値は平均±ＳＥＭであり、サンプルサイズ（１群あたりｎ＝７〜１０匹のマウス）。（^＊ｐ＜０．０５、ビヒクル対照群と比較して有意性のある阻害、＃：ｐ＜０．０５、単剤治療と比較すると有意性のある阻害（マンホイットニー順位和検定、ｎｓ：有意性がない）。 ＰＩＫ３ＣＡ変異体、およびＥｒｂＢ２増幅乳癌細胞系ＢＴ４７４に対する、ビヒクル、化合物Ａの単剤５０ｍｇ／ｋｇ（ｐ．ｏ．、１日１回）、トラスツズマブの単剤１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．、１日３回）、および化合物Ａとトラスツズマブとの組合せの抗腫瘍活性、ならびに同所性ＰＩＫ３ＣＡ変異体およびＥｒｂＢ２増幅乳癌細胞系ＢＴ４７４を有するマウスにおける、ビヒクル、化合物Ａの単剤、トラスツズマブの単剤、および化合物Ａとトラスツズマブとの組合せの治療群の補正後の平均体重変化量（個々の動物それぞれについて百分率で表される、測定日の体重と１２日目の初期体重［どちらも初期の腫瘍重量を差し引くことによって補正済み］との間の比によって表される）を示す図である。値は平均±ＳＥＭであり、サンプルサイズ（１群あたりｎ＝９〜１０匹のマウス）。（^＊ｐ＜０．０５、ビヒクル対照群と比較して有意性のある阻害、＃：ｐ＜０．０５、単剤治療と比較すると有意性のある阻害（マンホイットニー順位和検定）。

別段の指定がない限り、本明細書では、以下の一般的な定義に当てはまるものとする：

「ハロゲン」（または「ハロ」）とは、フッ素、臭素、塩素またはヨウ素、とりわけフッ素、塩素を意味する。ハロゲンによって置換されているアルキル基（ハロアルキル）などのハロゲン置換基および部分は、モノ−、ポリ−またはパーハロゲン化されていてもよい。

「ヘテロ原子」とは、炭素および水素以外の原子、好ましくは窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）、とりわけ窒素である。

炭素含有基、部分または分子は、１〜７個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、最も好ましくは１個または２個の炭素原子を含有する。２個以上の炭素原子を有する基または部分を含有する任意の非環式炭素は、直鎖であるか、または分岐している。

接頭語「低級」または「Ｃ_１〜Ｃ_７」は、最大７個以下、特に最大４個以下の炭素原子を有する基を意味し、問題の基は直鎖であるか、あるいは単一または複数の枝分かれで分岐している。

「アルキル」とは、直鎖または分岐鎖アルキル基のことを言い、好ましくは直鎖または分岐鎖Ｃ_１〜１２アルキルを表し、とりわけ好ましくは直鎖または分岐鎖Ｃ_１〜７アルキルを表し、例えばメチル、エチル、ｎ−またはイソプロピル、ｎ−、イソ、ｓｅｃ−またはｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシルであり、とりわけ好ましくは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、およびｎ−ブチルならびにイソブチルである。アルキルは非置換であってもよく、または置換されていてもよい。例示的な置換基には、以下に限定されないが、ジュウテリウム、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロおよびアミノが含まれる。置換アルキルの一例はトリフルオロメチルである。シクロアルキルもまた、アルキルの置換基であってもよい。こうした場合の一例は、（アルキル）−シクロプロピルまたはアルカンジイル−シクロプロピル、例えば−ＣＨ_２−シクロプロピルの部分である。Ｃ_１〜Ｃ_７アルキルは好ましくは、１つ以上７つ以下、好ましくは１つ以上４つ以下を有するアルキルであり、直鎖であるか、または分岐しており、好ましくは低級アルキルは、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどのブチル、ｎ−プロピルもしくはイソプロピルなどのプロピル、エチル、または好ましくはメチルである。

「アルコキシ」、「アルコキシアルキル」、「アルコキシカルボニル」、「アルコキシ−カルボニルアルキル」、「アルキルスルホニル」、「アルキルスルホキシル」、「アルキルアミノ」、「ハロアルキル」のような他の基の各アルキル部分は、「アルキル」の上記定義において記載したものと同じ意味を有するものとする。

「アルカンジイル」とは、異なる２個の炭素原子によって部分に結合している、直鎖または分岐鎖アルカンジイル基のことを言い、それは好ましくは直鎖または分岐鎖Ｃ_１〜１２アルカンジイルを表し、とりわけ好ましくは、直鎖または分岐鎖Ｃ_１〜６アルカンジイルを表し、例えばメタンジイル（−ＣＨ_２−）、１，２−エタンジイル（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）、１，１−エタンジイル（（−ＣＨ（ＣＨ_３）−）、１，１−、１，２−、１，３−プロパンジイルおよび１，１−、１，２−、１，３−、１，４−ブタンジイルであり、とりわけ好ましくは、メタンジイル、１，１−エタンジイル、１，２−エタンジイル、１，３−プロパンジイル、１，４−ブタンジイルである。

「アルケンジイル」とは、異なる２個の炭素原子によって分子に結合している、直鎖または分岐鎖アルケンジイル基のことを言い、それは好ましくは直鎖または分岐鎖Ｃ_２〜６アルカンジイルを表し、例えば−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２−、−Ｃ（ＣＨ_３）＝ＣＨ−ＣＨ_２−、−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（ＣＨ_３）Ｈ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ（ＣＨ_３）＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ_３）−ＣＨ＝ＣＨ−であり、とりわけ好ましくは、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−である。アルケンジイルは置換されていてもよく、または非置換であってもよい。

「シクロアルキル」とは、１炭素環あたり３〜１２個の環原子を有する、飽和または部分的に飽和している単環式、縮合多環式、またはスピロ多環式の炭素環のことを言う。シクロアルキル基の実例には、以下の部分：シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが含まれる。シクロアルキルは非置換であってもよく、または置換されていてもよく、例示的な置換基は、アルキルについての定義で提示されており、またアルキル自体（例えばメチル）も含む。−（ＣＨ_３）シクロプロピルのような部分は、置換シクロアルキルと見なされる。

「アリール」とは、６個以上の炭素原子を有する芳香族の単環式環系（すなわち環形成原子は炭素だけ）のことを言い、アリールは、フェニルまたはナフチル、好ましくはフェニルなどの、好ましくは６〜１４個の環炭素原子、より好ましくは６〜１０個の環炭素原子を有する芳香族部分である。アリールは非置換でもよく、あるいは以下に記載の非置換または置換ヘテロシクリル、特にピロリジノなどのピロリジニル、オキソピロリジノなどのオキソピロリジニル、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキルピロリジニル、２，５−ジ−（Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル）−ピロリジノなどの２，５−ジ−（Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル）ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、チオフェニル、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキルピラゾリジニル、ピリジニル、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキルピペリジニル、ピペリジノ、アミノまたはＮ−モノ−もしくはＮ，Ｎ−ジ−［低級アルキル、フェニル、Ｃ_１〜Ｃ_７アルカノイルおよび／またはフェニル−低級アルキル）−アミノにより置換されているピペリジノ、非置換または環炭素原子により結合しているＮ−低級アルキル置換ピペリジニル、ピペラジノ、低級アルキルピペラジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、Ｓ−オキソ−チオモルホリノまたはＳ，Ｓ−ジオキソチオモルホリノ；Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル、アミノ−Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル、Ｎ−Ｃ_１〜Ｃ_７アルカノイルアミノ−Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル、Ｎ−Ｃ_１〜Ｃ_７アルカンスルホニル−アミノ−Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル、カルバモイル−Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル、［Ｎ−モノ−またはＮ，Ｎ−ジ−（Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル）−カルバモイル］−Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_７アルカンスルフィニル−Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_７アルカンスルホニル−Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル、フェニル、ナフチル、モノ−〜トリ−［Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル、ハロ、および／またはシアノ］−フェニルまたはモノ−〜トリ−［Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル、ハロ、および／またはシアノ］−ナフチル；Ｃ_３〜Ｃ_８シクロアルキル、モノ−〜トリ−［Ｃ_１〜Ｃ_７アルキルおよび／またはヒドロキシ］−Ｃ_３〜Ｃ_８シクロアルキル；ハロ、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アルコキシ−低級アルコキシ、（低級アルコキシ）−低級アルコキシ−低級アルコキシ、ハロ−Ｃ_１〜Ｃ_７アルコキシ、フェノキシ、ナフチルオキシ、フェニル−またはナフチル−低級アルコキシ；アミノ−Ｃ_１〜Ｃ_７アルコキシ、低級アルカノイルオキシ、ベンゾイルオキシ、ナフトイルオキシ、ホルミル（ＣＨＯ）、アミノ、Ｎ−モノ−もしくはＮ，Ｎ−ジ−（Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル）−アミノ、Ｃ_１〜Ｃ_７アルカノイルアミノ、Ｃ_１〜Ｃ_７アルカンスルホニルアミノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、例えばベンジルオキシカルボニルなどのフェニル−またはナフチル−低級アルコキシカルボニル；アセチル、ベンゾイル、ナフトイルなどのＣ_１〜Ｃ_７アルカノイル、カルバモイル、Ｎ−モノ−またはＮ，Ｎ−二置換カルバモイルなどのＮ−モノ−またはＮ，Ｎ−二置換カルバモイル（ここで置換基は、低級アルキル、（低級アルコキシ）−低級アルキルおよびヒドロキシ−低級アルキルから選択される）；アミジノ、グアニジノ、ウレイド、メルカプト、低級アルキルチオ、フェニル−またはナフチルチオ、フェニル−またはナフチル−低級アルキルチオ、低級アルキル−フェニルチオ、低級アルキル−ナフチルチオ、ハロ−低級アルキルメルカプト、スルホ（−ＳＯ_３Ｈ）、低級アルカンスルホニル、フェニル−またはナフチル−スルホニル、フェニル−またはナフチル−低級アルキルスルホニル、アルキルフェニルスルホニル、トリフルオロメタンスルホニルなどのハロ−低級アルキルスルホニル；スルホンアミド、ベンゾスルホンアミド、アジド、アジド−Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル、特にアジドメチル、Ｃ_１〜Ｃ_７アルカンスルホニル、スルファモイル、Ｎ−モノ−もしくはＮ，Ｎ−ジ−（Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル）−スルファモイル、モルホリノスルホニル、チオモルホリノスルホニル、シアノおよびニトロ［ここで、置換アルキル（または、同様に本明細書で述べた置換アリール、ヘテロシクリルなど）の置換基または置換基の部分としての上記のフェニルまたはナフチルの各々（フェニキシまたはナフトキシ中においても同様）は、それ自体、非置換であるか、あるいはハロ、トリフルオロメチルなどのハロ−低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、アジド、アミノ、Ｎ−モノ−もしくはＮ，Ｎ−ジ−（低級アルキルおよび／もしくはＣ_１〜Ｃ_７アルカノイル）−アミノ、ニトロ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、シアノ、ならびに／またはスルファモイルから独立して選択される、１つ以上、例えば３つまで、好ましくは１つまたは２つの置換基によって置換されている］からなる群から独立して選択される１つ以上、好ましくは３つまで、より好ましくは２つまでの置換基によって置換されていてもよい。

「ヘテロシクリル」とは、不飽和（＝１つまたは複数の環内に最大可能数の共役二重結合を有する）、飽和、または部分的に飽和しているヘテロ環式基のことを言い、好ましくは単環式であるか、または本発明のより広範な態様では、二環式、三環式もしくはスピロ環式環であり、３〜２４個、より好ましくは４〜１６個、最も好ましくは５〜１０個、最も好ましくは５個または６個の環原子を有しており、ここで、１個または複数、好ましくは１〜４個、特に１個または２個の環原子はヘテロ原子である（したがって、残りの環原子は炭素である）。結合している環（すなわち、分子に連結している環）は、好ましくは４〜１２個、特に５〜７個の環原子を有する。用語ヘテロシクリルはヘテロアリールも含む。ヘテロ環式基（ヘテロシクリル）は、非置換であってもよく、あるいは置換アルキルについて上記で定義した置換基からなる群、および／または以下の置換基：オキソ（＝Ｏ）、チオカルボニル（＝Ｓ）、イミノ（＝ＮＨ）、イミノ−低級アルキルの１つもしくは複数から独立して選択される、１つ以上、特に１〜３つの置換基によって置換されていてもよい。さらに、ヘテロシクリルは、特にオキシラニル、アジリニル、アジリジニル、１，２−オキサチオラニル、チエニル（＝チオフェニル）、フラニル、テトラヒドロフラニル、ピラニル、チオピラニル、チアントレニル、イソベンゾフラニル、ベンゾフラニル、クロメニル、２Ｈ−ピロリル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、イミダゾリル、イミダゾリジニル、ベンズイミダゾリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピラゾリジニル、チアゾリル、イソチアゾリル、ジチアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピリダジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、（Ｓ−オキソまたはＳ，Ｓ−ジオキソ）−チオモルホリニル、インドリジニル、アゼパニル、ジアゼパニル、特に１，４−ジアゼパニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、インドリル、ベンズイミダゾリル、クマリル、インダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、イソキノリル、キノリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、デカヒドロキノリル、オクタヒドロイソキノリル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ジベンゾチオフェニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリル、キナゾリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、ベータ−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ペリミジニル、フェナントロリニル、フラザニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、クロメニル、イソクロマニル、クロマニル、ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルおよび２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イルからなる群から選択されるヘテロシクリル基であり、これらの基の各々は非置換であるか、あるいは置換アリールについて上記で述べたもの、および／または以下の置換基：オキソ（＝Ｏ）、チオカルボニル（＝Ｓ）、イミノ（＝ＮＨ）、イミノ−低級アルキルの１つ以上から選択される、１つ以上、好ましくは３つまでの置換基によって置換されている。

「アリールアルキル」とは、アルキル基（例えばメチルまたはエチル基）を介して分子と結合しているアリール基を意味し、好ましくはフェネチルまたはベンジル、特にベンジルである。同様に、シクロアルキル−アルキルおよびヘテロシクリル−アルキルは、アルキル基によって分子に結合しているシクロアルキル基、またはアルキル基によって分子に結合しているヘテロシクリル基を表す。各例において、アリール、ヘテロシクリル、シクロアルキルおよびアルキルは、上記で定義した通りに置換されていてもよい。

「治療」には、予防的（防止的）および治療的治療、ならびに疾患または障害の進行の遅延が含まれる。本明細書で使用する用語「進行の遅延」とは、治療されるべき増殖性疾患の前段階または早期にある患者への組合せの投与を意味し、例えば、これらの患者において対応する疾患の前形態が診断され、あるいはこれらの患者が、例えば医療治療中の状態または事故に起因する状態にあり、こうした状態下において対応する疾患が発症する可能性が高い。

「上皮成長因子受容体依存性疾患」または「ＥＧＦＲ依存性疾患」とは特に、有益に（例えば、１つ以上の症状の寛解、疾患の開始の遅延、疾患からの一時的または完全な治癒まで）、上皮成長因子受容体ファミリーのメンバー（ここで、治療されるべき疾患の中には、癌または腫瘍疾患などの増殖性疾患が含まれてよい）の阻害に応答する障害または悪性腫瘍である。上皮成長因子受容体ファミリーは、４つのメンバー：ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ１またはＥｒｂ−Ｂ１としても知られている）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ２またはＥｒｂ−Ｂ２としても知られている）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ３またはＥｒｂ−Ｂ３としても知られている）、およびＥＧＦＲ４から構成されている。

「医薬製剤」または「医薬組成物」とは、哺乳類に発症する特定の疾患または状態を予防、治療または管理するために、哺乳類、例えばヒトに投与されるべき少なくとも１種の治療用化合物を含有する混合物または溶液のことを言う。

「薬学的に許容される」とは、過度の毒性、刺激、アレルギー応答および妥当な利益／リスク比と一致する他の問題となる合併症がなく、正しい医療判断の範囲内で、哺乳動物、特にヒトの組織との接触に適している化合物、材料、組成物および／または剤形のことを言う。

「塩」（これが意味するのは「またはその塩（or salts thereof）」あるいは「またはその塩（or a salt thereof）」である）は、単独または式（Ｉ）の遊離化合物との混合物で存在することができ、好ましくは薬学的に許容される塩である。こうした塩は、例えば塩基性窒素原子を有する式（Ｉ）の化合物から、好ましくは有機酸または無機酸との酸付加塩、特に薬学的に許容される塩として形成される。適切な無機酸は、例えば塩酸、硫酸またはリン酸などのハロゲン酸である。適切な有機酸は、例えばフマル酸またはメタンスルホン酸などのカルボン酸またはスルホン酸である。分離または精製目的で、薬学的に許容されない塩、例えばピクリン酸塩または過塩素酸塩を使用することも可能である。治療用途に関しては、薬学的に許容される塩または遊離化合物だけが用いられ（必要に応じて、医薬製剤の形態で）、したがって、これらが好ましい。遊離形態の新規化合物とそれらの塩（例えば、新規化合物の精製または同定において中間体として使用することができる塩を含む）の形態のものとの間の密接な関係を考慮すると、上記および下記における遊離化合物に対するいかなる言及も、適切かつ好都合に対応する塩にも言及するものとして理解されたい。式（Ｉ）の化合物の塩は，好ましくは薬学的に許容される塩であり、薬学的に許容される塩を形成する適切な対イオンは、当分野で公知である。

「組合せ」とは、１回投与量単位形態の固定した組合せ、または併用投与向けの固定しない組合せ（またはキットオブパーツ（kit of parts））のいずれかのことを言い、後者の場合、式（Ｉ）の化合物および組合せパートナー（例えば、以下に説明する他の薬物、「治療剤」または「助剤（co-agent）」とも呼ぶ）を同時に独立して投与してもよく、または、特に、組合せパートナーが、協同効果、例えば相乗効果を示すことが可能な時間間隔内に別個に投与してもよい。本明細書で利用される用語「併用投与」などは、それを必要とする単一の対象（例えば、患者）への、選択された組合せパートナーの投与を包含することを意味し、薬剤を同じ投与経路によって、または同時に必ずしも投与しない治療計画を含むものと意図される。用語「固定した組合せ」とは、活性成分、例えば式（Ｉ）の化合物および組合せパートナーをどちらも、単一の実体または投与量の形態で、同時に患者に投与することを意味する。「固定しない組合せ」または「キットオブパーツ」という用語は、活性成分、例えば式（Ｉ）の化合物および組合せパートナーの両方を、別個の実体として、同時に、一斉に、または逐次に、特定の時間制限なしに患者に投与することを意味し、ここでこうした投与は、患者の体内において２種の化合物の治療上有効なレベルをもたらす。後者はまた、カクテル療法、例えば、３種以上の活性成分の投与にも当てはまる。

「治療上有効な」とは、好ましくは、増殖性疾患の進行に対して、治療的に、またはより広範な意味においては予防的に有効である量に関する。

本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーメンバー（ＨＥＲ１またはＥｒｂ−Ｂ１としても知られているＥＧＦＲ１、ＨＥＲ２またはＥｒｂ−Ｂ２としても知られているＥＧＦＲ２、ＨＥＲ３またはＥｒｂ−Ｂ３としても知られているＥＧＦＲ３、およびＥＧＦＲ４を含む）依存性疾患の治療における特定の２−カルボキサミドシクロアミノウレア誘導体の単独または組合せでの使用に関する。

本発明に適した特定の２−カルボキサミドシクロアミノウレア誘導体、それらの調製およびそれを含有する適切な医薬製剤は、国際公開第２０１０／０２９０８２号に記載されており、式Ｉの化合物またはその塩を含む：

［式中、
Ａは、

からなる群から選択されるヘテロアリールを表し、
Ｒ^１は、以下の置換基の１つを表し：（１）非置換または置換の、好ましくは置換のＣ_１〜Ｃ_７アルキル（ここで前記置換基は、以下の部分の１つ以上、好ましくは１〜９つから独立に選択される：ジュウテリウム、フルオロ、または１〜２つの以下の部分：Ｃ_３〜Ｃ_５シクロアルキル）；（２）任意に置換されているＣ_３〜Ｃ_５シクロアルキル［ここで前記置換基は、以下の部分の１つ以上、好ましくは１〜４つから独立に選択される：ジュウテリウム、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル（好ましくはメチル）、フルオロ、シアノ、アミノカルボニル］；（３）任意に置換されているフェニル［ここで前記置換基は、以下の部分の１つ以上、好ましくは１〜２つから独立に選択される：ジュウテリウム、ハロ、シアノ、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキルアミノ、ジ（Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル）アミノ、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル）アミノカルボニル、Ｃ_１〜Ｃ_７アルコキシ］；（４）任意に一置換または二置換されているアミン［ここで前記置換基は、以下の部分から独立に選択される：ジュウテリウム、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル（非置換であるか、あるいはジュウテリウム、フルオロ、クロロ、ヒドロキシの群から選択される１つ以上の置換基によって置換されている）、フェニルスルホニル（非置換であるか、あるいは１つ以上、好ましくは１つのＣ_１〜Ｃ_７アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_７アルコキシ、ジ（Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル）アミノ−Ｃ_１〜Ｃ_７アルコキシによって置換されている）］；（５）置換スルホニル［ここで前記置換基は、以下の部分から選択される：Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル（非置換であるか、あるいはジュウテリウム、フルオロの群から選択される１つ以上の置換基によって置換されている）、ピロリジノ（非置換であるか、あるいはジュウテリウム、ヒドロキシ、オキソの群から選択される１つ以上の置換基、特に１つのオキソによって置換されている）］；（６）フルオロ、クロロ；
Ｒ^２は水素を表し；
Ｒ^３は、（１）水素、（２）フルオロ、クロロ、（３）任意に置換されているメチルを表す（ここで前記置換基は、以下の部分の１つ以上、好ましくは１〜３つから独立に選択される：ジュウテリウム、フルオロ、クロロ、ジメチルアミノ）；
ただし、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−ピリミジン−４−イル］−４−メチル−チアゾール−２−イル｝−アミド）は除く］。

式Ｉの化合物の定義において使用される基および記号は、国際公開第２０１０／０２９０８２号に開示されている意味であり、その公報は参照により本出願に組み込まれている。

本発明の好ましい化合物は、具体的に国際公開第２０１０／０２９０８２号に記載されている化合物である。

本発明の非常に好ましい化合物は、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ａ）、または薬学的に許容されるその塩である。（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）の合成は、例えば、国際公開第２０１０／０２９０８２号において、実施例１５として記載されている。

ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ１またはＥｒｂ−Ｂ１としても知られている）、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ２またはＥｒｂ−Ｂ２としても知られている）、およびＥＧＦＲ３（ＨＥＲ３またはＥｒｂ−Ｂ３としても知られている）、ならびにＥＧＦＲ４を含む受容体のＥＲｂＢファミリーは、細胞増殖性障害、または癌において過剰発現することが多い。ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）は、乳癌、卵巣癌および胃癌で過剰発現することが多い。ＥｒｂＢ２に対する有効な治療手法は存在するものの、増幅／過剰発現したＨＥＲ２を患う患者の５０％は、トラスツズマブなどのＥｒｂＢ２モジュレーターに応答しない。乳癌ＢＴ４７４およびＨＢＣｘ−５細胞系、および胃癌ＮＣＩ−Ｎ８７細胞系は、ｉｎ ｖｉｖｏでＥｒｂＢ２増幅および高い腫瘍形成能を有する有用なモデルである。式Ｉの化合物などのＰＩ３Ｋ阻害剤の抗腫瘍活性は、ＥｒｂＢ２に推進される腫瘍モデルの両方に対して試験される。

意外なことに、化合物Ａを投与すると、両モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍成長阻害を引き起こす。ＥｒｂＢ２増幅を含有するまたは含有しない乳房、ＣＲＣおよびすい臟の細胞系のパネルでは、化合物Ａは細胞増殖を減少させ、ＢＴ４７４乳癌モデルではＧＩ_５０の中央値が１３９±８２ｎＭとなり、ＨＣＣ１９５４乳癌モデルではＧＩ_５０の中央値が６８７±１３２ｎＭとなり、ＥｒｂＢ２を過剰発現した細胞系のどちらにおいても細胞死を誘発する。

雌の胸腺欠損ヌードマウスにおける同所的に移植されたＢＴ４７４乳癌異種移植片モデルでは、化合物Ａは、ビヒクル治療群と比較して、１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの用量によって治療した化合物Ａの群において、統計的に有意な抗腫瘍効果を生じている（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ、事後Ｄｕｎｎｅｔｔ法）。最初の実験において、５０ｍｇ／ｋｇで１日１回経口投与（ｐ．ｏ．）された化合物Ａは、ビヒクル（平均腫瘍変化量３１５．１±１６．４ｍｍ^３）と比較して、−２９．７±１５．６ｍｍ^３の腫瘍体積の平均腫瘍変化を生じており、２３．０％の退縮である（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡおよび事後Ｄｕｎｎｅｔｔ法）（図１を参照されたい）。２番目の実験において、１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇで１日１回経口投与された化合物Ａは、ビヒクル（腫瘍体積の平均変化量５５７．７±７９．０ｍｍ^３）と比較して、それぞれ１７１．８±３３．０ｍｍ^３（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡおよび事後Ｄｕｎｎｅｔｔ法）、９５．５±２６．５ｍｍ^３（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡおよび事後Ｄｕｎｎｅｔｔ法）、および２０．８±１５．９ｍｍ^３（Ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡおよび事後Ｄｕｎｎｅｔｔ法）の腫瘍体積の平均変化を生じている（図３を参照されたい）。

ビヒクル治療群（０．１±１．２％）および化合物Ａ治療群（それぞれ、１．４±１．２％および−１．２±１．２％）について、平均体重変化量に統計的有意性がないことによって実証されているように、１２．５および２５ｍｇ／ｋｇで化合物Ａの耐容性はよい。しかし、２つの実験において、化合物Ａ５０ｍｇ／ｋｇによって治療された群は、１０．６±４．１％（ｐ＜０．０５、対応のあるｔ−検定を使用）および８．２±２．６％（ｐ＜０．０５、対応のあるｔ−検定を使用）という、統計的に有意な平均体重変化量を示している（図２を参照されたい）。

雌の胸腺欠損ヌードマウスにおける皮下ＮＣＩ−Ｎ８７胃異種移植片モデルでは、実験において、化合物Ａは、ビヒクル（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）と比較して、化合物Ａ治療群において統計的に有意な抗腫瘍効果を生じており、退縮は１１％である（図４を参照されたい）。５０ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回経口投与（ｐ．ｏ．）された化合物Ａ治療群は、ビヒクル（腫瘍体積の平均変化量６９４．０±９３．５ｍｍ^３）と比較して、−１１．８±１７．２ｍｍ^３の腫瘍体積の平均変化量を生じている（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡおよび事後Ｄｕｎｎｅｔｔ法）。５０ｍｇ／ｋｇの用量での化合物Ａ。実験において、化合物Ａ５０ｍｇ／ｋｇによって治療した群について、平均体重変化量に統計的有意性がない（３．８±２．１％）ことによって実証されているように、化合物Ａの耐容性はよい（図５を参照されたい）。

したがって、式Ｉの化合物、特に化合物Ａは、このようなＥＧＦＲ依存性疾患、特に悪性腫瘍、またはＥＧＦＲファミリーメンバーの獲得耐性に推進される疾患の治療に有用である。ＥＧＦＲ活性の調節異常への分子リンクが確立されたまたはその可能性がある疾患または悪性腫瘍は、例えば、「Mendelsohn and Baselga; Status of Epidermal Growth Factor Receptor Antagonists in the Biology and Treatment of Cancer, Journal of Clinical Oncology, 2787-2799」;「Mendelsohn and Baselga; Epidermal Growth Factor Receptor Targeting in Cancer, Seminars in Oncology, Vol 33, 369-385」; Irmerら, 2007, EGFR kinase domain mutations-functional impact and relevance for lung cancer therapy, Oncogene, 1-9; Roche-Limaら, EGFR targeting of solid tumors; Cancer Control, 2007, Vol 14 (3), 295-304）に記載されており、これらはすべて（その中に引用されている参考文献を含む）、参照により本出願に組み込まれている。

本発明によれば、式Ｉの化合物、特に化合物Ａによって、以下のＥＧＦＲ依存性疾患、特に悪性腫瘍を治療するのが好ましい：
・非小細胞肺癌
・頭頸部癌
・結腸直腸癌
・乳癌
・神経膠芽腫を含む悪性脳腫瘍
・前立腺癌
・膀胱癌
・腎細胞癌
・すい臓癌
・子宮頸癌
・食道癌
・胃癌
・卵巣癌
または、それらの任意の組合せ。

さらに、本発明は、ＥＧＦＲ依存性疾患または悪性腫瘍の治療のための医薬製剤を製造するための、上記の式Ｉの化合物またはその塩の使用に関する。

一実施形態では、本発明は、ＥＧＦＲ依存性疾患もしくは悪性腫瘍、またはＥＧＦＲファミリーメンバーを標的とする他の化合物に対して獲得耐性を有する疾患の治療のための医薬製剤を製造するための、式Ｉの化合物、特に、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ａ）、またはその塩の使用に関する。

本発明によるＥＧＦＲファミリーのメンバーを標的とする化合物には、ＥＧＦＲファミリーのキナーゼモジュレーター、ＥＧＦＲ発現レベルを変化させる、または腫瘍細胞内のＥＧＦＲファミリーメンバーの発現に関係した細胞免疫応答を引き出す化合物が含まれる。本明細書で使用する場合、用語「ＥＧＦＲモジュレーター」とは、ＥＧＦＲ活性またはＥＧＦＲシグナル伝達経路を、直接的または間接的に調節する生体分子または小分子である化合物または薬物を意味するものとする。直接的または間接的な調節には、ＥＧＦＲ活性もしくはＥＧＦＲシグナル伝達経路の活性化または阻害が含まれる。一態様では、阻害とは、例えばＥＧＦなどのＥＧＦＲリガンドへのＥＧＦＲの結合形成を阻害することを言う。別の態様では、阻害とは、ＥＧＦＲのキナーゼ活性の阻害のことを言う。

ＥＧＦＲモジュレーターによる治療に対する耐性は、前記ＥＧＦＲモジュレーターによる治療中に獲得される可能性があり、またはそのタンパク質における１つ以上の変異によることもある。

好ましいＥＧＦＲモジュレーターは、ＥＧＦＲの機能活性の阻害剤としてそれらの活性を示す。本発明によるＥＧＦＲファミリーのメンバーを標的とする化合物としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＮＶＰ−ＡＥＥ７７８、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＢＩＲＷ２９９２、ＢＭＳ６９０５１４、ペリチニブ、バンデタニブ、ＡＶ４１２、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体−Ｙ９０／Ｒｅ−１８８、セツキシマブ、パニツムマブ、マツズマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、ペルツズマブ、ＭＤＸ−２１４、ＣＤＸ１１０、ＩＭＣ１１Ｆ８、ペルツズマブ、トラスツズマブ、ＴＤＭ１、Ｚｅｍａｂ（登録商標）、Ｈｅｒ２ワクチンＰＸ１０４１、ならびにＨＳＰ９０阻害剤のＣＮＦ１０１０、ＣＮＦ２０２４、タネスピマイシン アルベスピマイシン、ＩＰＩ５０４、ＳＮＸ５４２２およびＮＶＰ−ＡＵＹ９２２が挙げられるが、それらに限定されない。

ＥＧＦＲモジュレーターには、例えばＥＧＦＲ特異的リガンド、小分子ＥＧＦＲ阻害剤、およびＥＧＦＲモノクローナル抗体が含まれる。一態様では、ＥＧＦＲモジュレーターは、ＥＧＦＲ活性を阻害し、かつ／またはＥＧＦＲシグナル伝達経路を阻害する。別の態様では、ＥＧＦＲモジュレーターは、ＥＧＦＲ活性を阻害し、かつ／またはＥＧＦＲシグナル伝達経路を阻害するＥＧＦＲモノクローナル抗体である。

ＥＧＦＲモジュレーターには、生体分子または小分子が含まれる。生体分子には、分子量が４５０を超える、単糖、アミノ酸、およびヌクレオチドのすべての脂質およびポリマーが含まれる。したがって、生体分子には例えば、オリゴ糖および多糖、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質、ならびにオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドには例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。

生体分子は、さらに上記の分子のいずれかの誘導体も含まれる。例えば、生体分子の誘導体には、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質の脂質およびグリコシル化誘導体が含まれる。

生体分子の誘導体には、さらにオリゴ糖および多糖の脂質誘導体、例えばリポ多糖が含まれる。最も典型的には、生体分子は抗体、または抗体の機能的等価物である。抗体の機能的等価物は、抗体の結合特性に匹敵する結合特性を有しており、ＥＧＦＲを発現する細胞の成長を阻害する。こうした機能的等価物は例えば、キメラ化、ヒト化、および一本鎖抗体、ならびにそれらの断片が含まれる。

抗体の機能的等価物には、抗体の可変または超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。他の配列と本質的に同じであるが、１つ以上の置換、付加、および／または欠失によってその他の配列と異なるアミノ酸配列は、等価な配列と見なされる。配列中、好ましくは５０％未満、より好ましくは２５％未満、さらにより好ましくは１０％未満のアミノ酸残基数が、タンパク質に対して置換されており、タンパク質に付加されており、またはタンパク質から欠失している。

抗体の機能的等価物は、好ましくはキメラ化またはヒト化抗体である。キメラ化抗体は、非ヒト抗体の可変領域およびヒト抗体の定常領域を含む。ヒト化抗体は、非ヒト抗体の超可変領域（ＣＤＲ）を含む。超可変領域以外の可変領域、例えばフレームワーク可変領域、およびヒト化抗体の定常領域は、ヒト抗体のものである。

非ヒト抗体の適切な可変領域および超可変領域は、モノクローナル抗体が作製されるあらゆる非ヒト哺乳動物によって産生される抗体に由来することができる。ヒト以外の哺乳動物の適切な例には、例えば、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ヤギまたは霊長類が含まれる。

機能的等価物には、抗体全体の結合特性と同じであるか、またはこれに匹敵する結合特性を有する抗体の断片がさらに含まれる。抗体の適切な断片には、ＥＧＦＲチロシンキナーゼに特異的に結合するのに十分な超可変（すなわち、相補性決定）領域の一部を含み、こうした受容体を発現する細胞の成長を阻害するのに十分なＥＧＦＲチロシンキナーゼに対する親和性を有する、あらゆる断片が含まれる。

そのような断片には、例えば、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２断片の一方または両方を含有することができる。好ましくは、抗体断片は、抗体全体の６つの相補性決定領域すべてを含有するが、こうした領域をすべてよりも少なく（３、４、または５つのＣＤＲなど）含有する機能的断片も含まれる。

一態様では、断片は一本鎖抗体またはＦｖ断片である。一本鎖抗体は、相互連結しているリンカーを有するまたは有さない状態で、軽鎖の可変領域に結合している抗体の重鎖の可変領域を少なくとも含むポリペプチドである。したがって、Ｆｖ断片は抗体結合部位全体を含む。こうした鎖は、細菌中または真核細胞中で産生することができる。

抗体および機能的等価物は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥなどの任意のクラスの免疫グロブリンおよびそれらのサブクラスのメンバーとすることができる。

上で議論した生体分子に加えて、本発明において有用なＥＧＦＲモジュレーターは、小分子とすることもできる。生体分子ではないいずれの分子も、本明細書では小分子と見なされる。小分子のいくつかの例には、有機化合物、有機金属化合物、有機および有機金属化合物の塩、糖、アミノ酸ならびにヌクレオチドが含まれる。小分子は、それらの分子量が４５０Ｄａ以下であることを除いて、他の点では生体分子と見なされうる分子をさらに含む。したがって、小分子は、分子量が４５０Ｄａ以下である脂質、オリゴ糖、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチド、ならびにそれらの誘導体とすることができる。

とりわけ、本発明は、式Ｉの化合物、特に化合物Ａまたはその塩の使用による、ＥＧＦＲファミリーメンバーに依存しまたはＥＧＦＲモジュレーターによる治療中に耐性を獲得した疾患または悪性腫瘍の治療に関する。治療時に耐性が生じ得る、考えられるＥＧＦＲモジュレーターには、例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、トラスツズマブ、およびＴＤＭ１が挙げられる。

さらなる実施形態では、本発明は、ＥＧＦＲ依存性疾患もしくは悪性腫瘍、またはＥＧＦＲモジュレーターに対して獲得耐性を有する疾患（「ＥＧＦＲ獲得耐性疾患」）を治療するための式（Ｉ）の化合物の、他の活性化合物、例えば、国際公開第２０１０／０２９０８２号に開示の組合せパートナーとの組合せでの使用に関する。本発明のこの態様についてさらに好ましい組合せパートナーは、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＮＶＰ−ＡＥＥ７７８、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＢＩＲＷ２９９２、ＢＭＳ６９０５１４、ペリチニブ、バンデタニブ、ＡＶ４１２、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体−Ｙ９０／Ｒｅ−１８８、セツキシマブ、パニツムマブ、マツズマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、ペルツズマブ、ＭＤＸ−２１４、ＣＤＸ１１０、ＩＭＣ１１Ｆ８、ペルツズマブ、トラスツズマブ、ＴＤＭ１、Ｚｅｍａｂ（登録商標）、Ｈｅｒ２ワクチンＰＸ１０４１、ならびにＨＳＰ９０阻害剤のＣＮＦ１０１０、ＣＮＦ２０２４、タネスピマイシン アルベスピマイシン、ＩＰＩ５０４、ＳＮＸ５４２２およびＮＶＰ−ＡＵＹ９２２などのＥＧＦＲファミリー標的薬剤であるが、それらに限定されない。

さらなる実施形態では、本発明はまた、例えば、非小細胞肺癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、乳癌、神経膠芽腫を含む悪性脳腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、すい臓癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、および／または卵巣癌を含むＥＧＦＲ依存性疾患を治療するために、同時、別個または逐次に使用するための、式Ｉの化合物、特に（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ａ）と、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＮＶＰ−ＡＥＥ７７８、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＢＩＲＷ２９９２、ＢＭＳ６９０５１４、ペリチニブ、バンデタニブ、ＡＶ４１２、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体−Ｙ９０／Ｒｅ−１８８、セツキシマブ、パニツムマブ、マツズマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、ペルツズマブ、ＭＤＸ−２１４、ＣＤＸ１１０、ＩＭＣ１１Ｆ８、ペルツズマブ、トラスツズマブ、ＴＤＭ１、Ｚｅｍａｂ（登録商標）、Ｈｅｒ２ワクチンＰＸ１０４１、ならびにＨＳＰ９０阻害剤のＣＮＦ１０１０、ＣＮＦ２０２４、タネスピマイシン アルベスピマイシン、ＩＰＩ５０４、ＳＮＸ５４２２およびＮＶＰ−ＡＵＹ９２２からなる群から選択されるＥＧＦＲモジュレーターと、任意に、少なくとも１種の薬学的に許容される担体とを含む組合せであって、活性成分が、各場合において、遊離の形態または塩の形態で存在する、組合せにも関する。

とりわけ、本発明は、非小細胞肺癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、乳癌、神経膠芽腫を含む悪性脳腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、すい臓癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、および卵巣癌を治療するために、同時、別個または逐次に使用するための、２（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）からなる群から選択される式Ｉの化合物と、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、トラスツズマブ、およびＴＤＭ１からなる群から選択されるＥＧＦＲモジュレーターと、任意に、少なくとも１種の薬学的に許容される担体との組合せであって、活性成分が、各場合において、遊離形態または薬学的に許容される塩の形態で存在する、組合せに関する。

別の実施形態では、本発明は、ＥＧＦＲ依存性疾患または悪性腫瘍、好ましくは、ＥＧＦＲモジュレーターによる治療中に、前記ＥＧＦＲキナーゼモジュレーターに対する耐性を獲得した悪性腫瘍を治療する方法であって、式Ｉの特定の２−カルボキサミドシクロアミノウレア誘導体、特に好ましくは、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ａ）、または薬学的に許容されるその塩の治療上有効な量を、単独でまたはＥＧＦＲモジュレーターと組み合わせて、それを必要とする温血動物に投与することを含む方法に関する。

この方法により治療されるべき疾患は、優先的には、非小細胞肺癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、乳癌、神経膠芽腫を含む悪性脳腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、すい臓癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、および卵巣癌である。

さらなる実施形態では、本発明は、式Ｉの化合物、特に好ましくは、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ａ）、またはその塩、および少なくとも１種の薬学的に許容される担体を、単独でまたはＥＧＦＲモジュレーターと組み合わせて含む、ＥＧＦＲ依存性疾患、またはＥＧＦＲモジュレーターによる治療中に耐性を獲得した疾患の治療のための医薬製剤に関する。

この医薬製剤によって治療されるべき疾患は、優先的には、非小細胞肺癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、乳癌、神経膠芽腫を含む悪性脳腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、すい臓癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、および卵巣癌である。

さらなる実施形態では、本発明は、ＥＧＦＲ依存性疾患、またはＥＧＦＲモジュレーターによる治療中に耐性を獲得した疾患を治療するための、式Ｉの化合物、特に好ましくは、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ａ）、またはその塩の使用に関する。

この化合物の単独、またはＥＧＦＲモジュレーターとの組合せによって治療されるべき疾患は、優先的には、非小細胞肺癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、乳癌、神経膠芽腫を含む悪性脳腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、すい臓癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、および卵巣癌である。

式（Ｉ）の化合物はまた、既知の治療方法、例えば、ホルモン投与、または特に放射線と組み合わせて有利に使用されてもよい。式（Ｉ）の化合物は、特に放射線療法に感受性の乏しい腫瘍の治療のために、放射線増感剤として特に使用してもよい。

本発明による治療は、症候的または予防的であってもよい。

式Ｉの化合物は、単独で、または１つ以上の他の治療用化合物と組み合わせて投与することができ、可能な組合せ療法は、固定した組合せの形態、あるいは、時間差を設けて、または互いに独立して与えられる本発明の化合物および１つ以上の他の治療用化合物の投与、あるいは、固定した組合せおよび１つ以上の他の治療用化合物の併用投与とすることができる。

活性成分の投与量は、患者のタイプ、人種、年齢、体重、性別、および医療状態、治療されるべき状態の重症度、投与経路、患者の腎臓および肝臓機能、ならびに用いられる特定の化合物を含む種々の要因で決まる。通常の技能を有する医師、臨床医または獣医師は、状態の進行を予防、反撃または抑止するために必要な薬物の有効な量を、容易に決め、処方することができる。有効性を得る範囲内で薬物の濃度を達成する最適精度には、標的部位への薬物アベイラビリティ（drug's availability）の動力学に基づいた計画が必要である。これには、薬物の分布、平衡および排出に関する検討が必要である。

本発明の化合物は、任意の従来の経路により、とりわけ非経口的に、例えば注射可能な溶液もしくは懸濁液の形態で、経腸的に、例えば経口的に、例としては錠剤もしくはカプセル剤の形態で、局所的に、例としてはローション剤、ゲル剤、軟膏剤もしくはクリーム剤の形態で、または、経鼻もしくは座剤の形態で投与されてもよい。局所投与としては、例えば、皮膚への投与がある。局所投与の別の形態としては、眼への投与がある。少なくとも１種の薬学的に許容される担体または賦形剤と共に、本発明の化合物を含む医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合することによって、従来の様式で製造されてもよい。

医薬組成物は、局所投与、経腸投与、例えば、経口投与もしくは直腸投与、または非経口投与に適しており無機または有機の固体または液体でもよい薬学的に許容される担体と一緒に、上記の障害の１つの治療において有効な量の式Ｉの化合物、またはその塩を含む。賦形剤、例えばラクトース、デキシトロース、マニトール、および／もしくはグリセロール、ならびに／または滑沢剤および／もしくはポリエチレングリコールと一緒に、活性成分を含む、経口投与ために使用される医薬組成物、特に、錠剤またはゼラチンカプセル剤がある。錠剤は、結合剤、例えばマグネシウムアルミニウムシリケート、トウモロコシ、小麦もしくは米デンプンなどのデンプン、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン、必要に応じて、崩壊剤、例えばデンプン、寒天、アルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩、および／または発泡剤混合物、あるいは吸着剤、着色剤、香味剤および甘味剤を含んでもよい。本発明の薬理活性化合物を、非経口的に投与可能な組成物の形態、または輸液の形態で使用することも可能である。医薬組成物は、滅菌してもよく、ならびに／あるいは添加剤、例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤化合物、および／または乳化剤、溶解剤、浸透圧を調節するための塩、および／または緩衝液を含んでもよい。本発明の医薬組成物は、必要に応じて他の薬理活性な物質を含んでよく、それ自体既知の様式で、例を挙げると従来の混合法、顆粒化法、糖剤化法、溶解法または凍結乾燥法により調製され、１種または複数種の活性成分をおよそ１％〜９９％、特におよそ１％〜およそ２０％含む。

以下の実施例は、上記の本発明を例示するが、それらは本発明の範囲を決して限定する意図はない。本発明の医薬的組合せの有益な効果は、関連技術における当業者にそれ自体公知の他の試験モデルによっても決定することができる。

実施例１−ＢＴ４７４乳癌異種移植片モデルにおける化合物Ａの効果
実験は、治療開始時においておよそ８〜１２週齢の雌ＨｓｄＮｐａ：胸腺欠損ヌード−ｎｕマウスで実施された。動物はすべて、食物および水へのフリーアクセスを伴って、ＭａｋｒｏｌｏｎタイプＩＩＩケージ（１ケージあたり最大１０動物）中において、最適化された衛生状態の下に収容された。

ＢＴ−４７４細胞は、ヒトの乳管癌細胞、およびＰＩＫ３ＣＡ変異Ｋ１１１Ｎで増幅したＥｒｂＢ２であるが、これを１０％の熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補給した４．５ｇ／ｌグルコースを含有するＤＭＥＭ培養培地において成長させて、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。細胞培養用試薬は、ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ（Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、スイス）から購入された。

動物の右側の３番目の乳腺に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ ＃ ３４２３４）１ｍｇ／ｍｌを含有するＨＢＳＳ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８２６４）３０μｌ中の３×１０^６個の細胞を同所的に注射することによって、ＢＴ−４７４腫瘍をｉｎ ｖｉｖｏで定着させた。腫瘍がおよそ１３０ｍｍ^３の平均サイズに達したとき（細胞注射後１４〜１６日目）、有効性試験を開始した。腫瘍が１５０〜２５０ｍｍ^３のサイズに達したとき（細胞注射後２２日目）、ＰＫ／ＰＤ実験を実施した。細胞を注射した日に、０．０２５の１７βエストラジオールペレットは、Ｆｏｒｅｎｅ（登録商標）吸入麻酔下、各実験動物の左側腹部の皮下に埋め込まれている。

化合物Ａを、ＮＭＰ／ＰＥＧ３００／Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ１５／水（１０：３０：２０：４０体積％）中で配合した。化合物を、ＮＭＰ中に完全に溶かした。次に、ＰＥＧ３００および液化Ｓｏｌｕｔｏｌを添加した（各試薬の添加後、順にボルテックスしながら）。動物へ投与する直前に水を添加した。化合物Ａまたはビヒクルを、１０ｍｌ／ｋｇの体積で経口投与した。

腫瘍体積を測径器（caliper）で測定し、式：長さ×直径^２×π／６に従って決定した。抗腫瘍活性は、Ｔ／Ｃ％（治療動物の腫瘍体積の平均変化量／対照動物の腫瘍体積の平均変化量）×１００として表される。退縮（％）は、式（（治療終了時の平均腫瘍体積−治療開始時の平均腫瘍体積）／治療開始時の平均腫瘍体積）×１００に従って算出された。体重および腫瘍体積は、週に２度記録された。

適用可能な場合、データは平均±ＳＥＭとして示される。すべての試験について、有意性レベルをｐ＜０．０５に設定した。腫瘍体積については、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後にＤｕｎｎｅｔｔ検定を使用して治療群とビヒクル対照群との間の比較を行った。治療期間の開始と終了との間の群内の体重変化量の有意性レベルは、対応のあるｔ−検定を使用して決定された。治療群とビヒクル対照群との間のデルタ体重の比較は、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後に事後Ｄｕｎｎｅｔｔ検定によって実施された。

最初の実験では、ＢＴ−４７４同所性異種移植片の腫瘍を有するヌードマウスに、化合物Ａを５０ｍｇ／ｋｇの用量で、毎日経口投与した。ビヒクル対照は、ＮＭＰ／ＰＥＧ３００／Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ１５／水（１０：３０：２０：４０体積％）の混合物１０ｍｌ／ｋｇを、毎日、経口投与を受ける動物からなった。最初の実験において、５０ｍｇ／ｋｇで１日１回経口投与された化合物Ａは、ビヒクル（平均腫瘍変化量３１５．１±１６．４ｍｍ^３）と比較して、−２９．７±１５．６ｍｍ^３の腫瘍体積の平均腫瘍変化量を生じており、退縮は２３．０％である（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡおよび事後Ｄｕｎｎｅｔｔ法）。

２番目の実験では、ＢＴ−４７４同所性異種移植片の腫瘍を有するヌードマウスに、化合物Ａを１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの用量で、毎日経口投与した。ビヒクル対照は、ＮＭＰ／ＰＥＧ３００／Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ１５／水（１０：３０：２０：４０体積％）の混合物１０ｍｌ／ｋｇを、毎日、経口投与を受ける動物からなった。化合物Ａは、１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの用量によって治療した化合物Ａの群において、ビヒクル治療群と比較すると統計的に有意な抗腫瘍効果を生じている（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ、事後Ｄｕｎｎｅｔｔ法）（図１を参照されたい）。２番目の実験において、１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇで１日１回、経口投与された化合物Ａは、ビヒクル（腫瘍体積の平均変化量５５７．７±７９．０ｍｍ^３）と比較して、それぞれ１７１．８±３３．０ｍｍ^３（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡおよび事後Ｄｕｎｎｅｔｔ法）、９５．５±２６．５ｍｍ^３（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡおよび事後Ｄｕｎｎｅｔｔ法）、および２０．８±１５．９ｍｍ^３（Ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡおよび事後Ｄｕｎｎｅｔｔ法）の腫瘍体積の平均変化量を生じている（図３を参照されたい）。

ビヒクル治療群（０．１±１．２％）および化合物Ａ治療群（それぞれ、１．４±１．２％および−１．２±１．２％）について、平均体重変化量に統計的有意性がないことによって実証されているように、１２．５および２５ｍｇ／ｋｇで化合物Ａの耐容性はよかった。しかし、２つの実験において、化合物Ａ５０ｍｇ／ｋｇによって治療された群は、１０．６±４．１％（ｐ＜０．０５、対応のあるｔ−検定を使用）および８．２±２．６％（ｐ＜０．０５、対応のあるｔ−検定を使用）という、統計的に有意な平均体重変化量を示した（図２を参照されたい）。

実施例２−ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌異種移植片モデルにおける化合物Ａの効果
実験は、治療開始時においておよそ８〜１２週齢の雌ＨｓｄＮｐａ：胸腺欠損ヌード−ｎｕマウスで実施された。動物はすべて、食物および水へのフリーアクセスを伴って、ＭａｋｒｏｌｏｎタイプＩＩＩケージ（１ケージあたり最大１０動物）中において、最適化された衛生状態の下に収容された。

ＮＣＩ−Ｎ８７細胞（米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）から入手）は、胃を起源とする増幅したＥｒｂＢ２であるが、これを１０％の熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補給した４．５ｇ／ｌグルコースを含有するＤＭＥＭ培養培地において成長させた。細胞を、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。細胞をトリプシン（０．２５ｗ／ｖ％）−ＥＤＴＡ（０．５３ｍＭ）によって採取し、培養培地（添加物を有する）中に再懸濁してＣａｓｙ（登録商標）システムにより計数した。細胞培養用試薬は、ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ（Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、スイス）から購入された。

ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍を、外套針によって雌ＨｓｄＮｐａ：胸腺欠損ヌード−ｎｕマウスに皮下移植されたおよそ４０ｍｇの断片から定着させた。腫瘍がおよそ１１０ｍｍ^３のサイズに達したとき（移植後２５日目）、治療を開始した。

化合物Ａを、ＮＭＰ／ＰＥＧ３００／Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ１５／水（１０：３０：２０：４０体積％）中で配合した。化合物を、ＮＭＰ中に完全に溶かした。次に、ＰＥＧ３００および液化Ｓｏｌｕｔｏｌを添加した（各試薬の添加後、順にボルテックスしながら）。動物へ投与する直前に水を添加した。

腫瘍体積を測径器（caliper）で測定し、式：長さ×直径^２×π／６に従って決定した。抗腫瘍活性は、Ｔ／Ｃ％（治療動物の腫瘍体積の平均変化量／対照動物の腫瘍体積の平均変化量）×１００として表される。退縮（％）は、式（（治療終了時の平均腫瘍体積−治療開始時の平均腫瘍体積）／治療開始時の平均腫瘍体積）×１００に従って算出された。体重および腫瘍体積は、週に２度記録された。

適用可能な場合、データは平均±ＳＥＭとして示される。すべての試験について、有意性レベルをｐ＜０．０５に設定した。腫瘍体積については、治療群とビヒクル対照群との間の比較を、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後にＤｕｎｎｅｔｔ検定を使用して行った。治療期間の開始と終了との間の群内の体重変化量の有意性レベルは、対応のあるｔ−検定を使用して決定された。治療群とビヒクル対照群との間のデルタ体重の比較は、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後に事後Ｄｕｎｎｅｔｔ検定によって実施された。

化合物Ａを５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍を有する動物に毎日、経口投与した。治療は、腫瘍細胞移植後１８日目に開始し、２０日間連続で継続した。ビヒクル対照は、ＮＭＰ／ＰＥＧ３００／Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ１５／水（１０：３０：２０：４０体積％）の混合物の経口投与を毎日受ける動物からなった。化合物Ａは、統計的に有意な抗腫瘍効果（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）を生じており、退縮は１１％であった。ビヒクル（腫瘍体積の平均変化量６９４．０±９３．５ｍｍ^３）と比較すると、化合物Ａは、−１１．８±１７．２ｍｍ^３（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡおよび事後Ｄｕｎｎｅｔｔ法）という腫瘍体積の平均変化量を生じた。実験において、５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａによって治療した群について、平均体重変化量に統計的有意性がない（３．８±２．１％）ことによって実証されているように、化合物Ａの耐容性はよかった（図４および図５を参照されたい）。

実施例３−ＢＴ４７４乳癌異種移植片モデルにおける化合物Ａとトラスツズマブとの組合せの効果
実験は、治療開始時においておよそ８〜１２週齢の雌ＨｓｄＮｐａ：胸腺欠損ヌード−ｎｕマウスで実施された。動物はすべて、食物および水へのフリーアクセスを伴って、ＭａｋｒｏｌｏｎタイプＩＩＩケージ（１ケージあたり最大１０動物）中において、最適化された衛生状態の下に収容された。

ＢＴ−４７４細胞は、ヒトの乳管癌細胞、およびＰＩＫ３ＣＡ変異Ｋ１１１Ｎで増幅したＥｒｂＢ２であるが、これを１０％の熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補給した４．５ｇ／ｌグルコースを含有するＤＭＥＭ培養培地において成長させて、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。細胞培養用試薬は、ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ（Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、スイス）から購入された。

動物の右側の３番目の乳腺に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ ＃ ３４２３４）１ｍｇ／ｍｌを含有するＨＢＳＳ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８２６４）３０μｌ中の３×１０^６個の細胞を同所的に注射することによって、ＢＴ−４７４腫瘍をｉｎ ｖｉｖｏで定着させた。腫瘍がおよそ１３０ｍｍ^３の平均サイズに達したとき（細胞注射後１４日目）、有効性実験を開始した。細胞を注射した日に、０．０２５の１７βエストラジオールペレットは、Ｆｏｒｅｎｅ（登録商標）吸入麻酔下、各実験動物の左側腹部の皮下に埋め込まれている。

化合物Ａを、ＮＭＰ／ＰＥＧ３００／Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ１５／水（１０：３０：２０：４０体積％）中で配合した。化合物を、ＮＭＰ中に完全に溶かした。次に、ＰＥＧ３００および液化Ｓｏｌｕｔｏｌを添加した（各試薬の添加後、順にボルテックスしながら）。動物へ投与する直前に水を添加した。化合物Ａまたはビヒクルを、１０ｍｌ／ｋｇの体積で経口投与した。トラスツズマブをＰＢＳ中で再構成し、３ｍｇ／ｋｇの濃度で、週あたり３回腹腔内投与した。

腫瘍体積を測径器で測定し、式：長さ×直径^２×π／６に従って決定した。抗腫瘍活性は、Ｔ／Ｃ％（治療動物の腫瘍体積の平均変化量／対照動物の腫瘍体積の平均変化量）×１００として表される。退縮（％）は、式［（治療終了時の平均腫瘍体積−治療開始時の平均腫瘍体積）／治療開始時の平均腫瘍体積］sy×１００に従って算出された。体重および腫瘍体積は、週に２度記録された。

適用可能な場合、データは平均±ＳＥＭとして示される。すべての試験について、有意性レベルをｐ＜０．０５に設定した。腫瘍体積については、一元配置ＡＮＯＶＡその後にＤｕｎｎｅｔｔ検定を使用して、治療群とビヒクル対照群との間の比較を行った。治療期間の開始と終了との間の群内の体重変化量の有意性レベルは、対応のあるｔ−検定を使用して決定された。治療群とビヒクル対照群との間のデルタ体重の比較は、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後に事後Ｄｕｎｎｅｔｔ検定によって実施された。

さらに、薬物の相互作用の見積もりを、Clarke R., Breast Cancer Res. Treat (1997) 46:255-278に記載の方法を使用して行った。これは腫瘍体積の変化量に適用されており、限られたデータから相互作用を推定するのに有用であることが知られていた。Ｃｌａｒｋｅにより記載された方法に準拠：化合物Ａ、ＢまたはＡＢの組合せ（対照群Ｃで）の場合、計算値ＡＢ／Ｃ＞Ａ／Ｃ×Ｂ／Ｃの場合、拮抗が予想され、ＡＢ／Ｃ＝Ａ／Ｃ×Ｂ／Ｃの場合、付加的な効果が予想され、Ａ×Ｂ／Ｃ＜Ａ／Ｃ×Ｂ／Ｃの場合、相乗効果が予想される。

化合物Ａを単剤として、１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、ＢＴ−４７４腫瘍を有する動物に毎日、経口投与した。単剤としてのトラスツズマブを、週あたり３回、３ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射として投与した。化合物Ａは、Ｔ／Ｃ２１．５％で、統計的に有意な抗腫瘍効果（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）を生じた。トラスツズマブもまた、Ｔ／Ｃ３５．８％で、統計的に有意な抗腫瘍効果（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）を生じた。Clarke R., Breast Cancer Res. Treat (1997) 46:255-278によって記載された方法による組合せの相互作用の解析は、単剤と比較すると、毎日１２．５ｍｇと週あたり３回３ｍｇ／ｋｇとの組合せは、相乗的な抗腫瘍効果があることを示した（図６を参照されたい）。

しかし、この組合せは、単剤（マンホイットニー順位和検定）としての化合物Ａと統計的な差があるだけに過ぎず、単剤としてのトラスツズマブとは差がなかった。顕著な体重減少が観察されなかったので、治療の耐容性はよかった。

化合物Ａを単剤として、５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＢＴ−４７４腫瘍を有する動物に毎日、経口投与した。単剤としてのトラスツズマブを、週あたり３回、１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射として投与した。化合物Ａは、統計的に有意な抗腫瘍効果（ｐ＜０．０５、マンホイットニー順位和検定）を生じた。トラスツズマブもまた、統計的に有意な抗腫瘍効果（ｐ＜０．０５、マンホイットニー順位和検定）を生じた。Clarke R., Breast Cancer Res. Treat (1997) 46:255-278によって記載された方法による組合せの相互作用の解析は、単剤と比較すると、毎日５０．０ｍｇの化合物Ａと週あたり３回１０ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブとの組合せは、相乗的な抗腫瘍効果があることを示した（図７を参照されたい）。

顕著な体重減少が、単剤としての化合物Ａ、または化合物Ａとトラスツズマブとの組合せで観察された（それぞれ、約１２％および約１０％）。

実施例４−ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌異種移植片モデルにおける、化合物Ａ単独、および化合物Ａとトラスツズマブとの組合せの効果
実験は、治療開始時においておよそ７〜８週齢であり体重（ＢＷ）範囲が１４．７〜２１．２ｇである雌ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウス（Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤ（登録商標）、ＣＢ１７／Ｉｃｒ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）で実施された。すべての動物に、水（逆浸透、Ｃｌ １ｐｐｍ）、ならびに１８．０％粗タンパク質、５．０％粗脂肪および５．０％粗繊維からなるＮＩＨ ３１ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｌａｂ Ｄｉｅｔ（登録商標）を自由摂取させた。マウスを、２１〜２２℃および湿度４０〜６０％において、１２時間の光周期で照射された静的マイクロアイソレーター中のＥｎｒｉｃｈ−ｏ’ｃｏｂｓ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｂｅｄｄｉｎｇに収容した。

ＮＣＩ−Ｎ８７細胞（米国培養細胞系統保存機関から入手）は、胃を起源としＥｒｂＢ２が増幅されているが、これを１０％のウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００ユニット／ｍＬのペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ−１６４０培地において、指数関数的に成長する培養物として維持した。腫瘍細胞は、５％ＣＯ_２および９５％空気の雰囲気中、３７℃の湿度の高いインキュベータ内の組織培養フラスコ中で培養された。細胞をトリプシン（１×）によって採取し、５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌを有する冷リン酸緩衝生理食塩水中に、５×１０^７個の細胞／ｍＬの濃度で懸濁した。各マウスに、１×１０^７個の細胞（０．２ｍＬの細胞懸濁液）を、右側腹部に皮下注射した。腫瘍体積を測径器で測定し、式：幅^２×長さ／２に従って決定し、１ｍｇが腫瘍体積１ｍｍ^３に相当するという仮定をして腫瘍重量を推定した。腫瘍移植（研究の１日目）後９日目に、それぞれ１２６〜３２０ｍｍ^３の腫瘍体積を有するマウスを、群の平均腫瘍体積が２３１〜２３９ｍｍ^３となる、８匹のマウスの１２群に振り分けた。

化合物Ａを、ＮＭＰ／ＰＥＧ３００／Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ１５／脱イオン水（１０：３０：２０：４０体積％）中で配合した。化合物を、ＮＭＰ中に完全に溶かした。次に、ＰＥＧ３００および液化Ｓｏｌｕｔｏｌを添加した（各試薬の添加後、順にボルテックスしながら）。動物へ投与する前に水を添加した。新鮮な投与用溶液を毎週調製し、４℃で保管して光から保護した。

投与日ごとに、生理食塩水（ビヒクル２）でトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、２１ｍｇ／ｍＬ）を新たに希釈した。

治療は、腫瘍細胞移植後９日目に開始し、３０日間連続（または、腫瘍体積＝２０００ｍｍ^３になるまで）で継続した。化合物Ａを、ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍を有する動物に１日１回経口投与し、トラスツズマブを４週間、週に２回、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって投与した。対照（群１）は、１日１回経口（ｐ．ｏ．）によるＮＭＰ／ＰＥＧ３００／Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ１５／水（１０：３０：２０：４０体積％）の混合物（ビヒクル１）、および４週間、週に２回の腹腔内注射（ｉ．ｐ．）による生理食塩水（ビヒクル２）を受ける動物からなった。組合せ療法については、トラスツズマブは化合物Ａの後３０分以内に投与された。投与体積（１０ｍＬ／ｋｇは、前週のＢＷを持ち越す週末を除いて、投与日に決定された各動物の重量に対して計られた。群２〜４は、それぞれ１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａによる単独療法を受けた。群５および６は、それぞれ３および１０ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブによる単独療法を受けた。群７〜９は、それぞれ１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを、各々３ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブと組み合わせて受けた。群１０〜１２は、それぞれ１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを、各々１０ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブと組み合わせて受けた。群４、９および１２は、早期に止めた。体重は、各治療日（週末を除く）の１〜５日目、その後は、研究の終了まで週に２回記録された。

抗腫瘍活性は、Ｔ／Ｃ％（治療動物の腫瘍体積の平均変化量／対照動物の腫瘍体積の平均変化量）×１００として表される。４０％以下のＴ／Ｃ値を達成する治療は、治療活性が潜在的にあると分類されると考えられる。治療有効性は退縮応答の数値からも決定することができる：（ａ）部分退縮（ＰＲ）は、腫瘍が、研究における３回連続の測定についてその開始１日目の体積の５０％以下であり、かつこれらの３回の測定の１回または複数について１３．５ｍｍ３以上であったことを示し、（ｂ）完全退縮（ＣＲ）は、腫瘍体積が、研究中の３回連続の測定について１３．５ｍｍ^３未満であったことを示す。

適用可能な場合、データは平均±ＳＥＭとして示される。統計およびグラフ解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＰｒｉｓｍ３．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ）によって実施された。すべての試験について、差の有意性レベルはＢａｒｔｌｅｔｔ検定によるＡＮＯＶＡを使用して行われ、事後Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定は、各薬物治療群ついての平均変化量を群１についての平均値と比較した。等しい分散性に対するＢａｒｔｌｅｔｔ検定が有意差（Ｐ＝０．０４０１）を示した場合、群を、非パラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定により比較し、この検定は、体積変化量の中央値（Ｐ＜０．０００１）の間で有意差を示した。薬物治療群および群１についての体積変化量の中央値の間の差の有意性を、Ｄｕｎｎ多重比較検定により事後解析した。両側統計解析はＰ＝０．０５で行われた。Ｐｒｉｓｍは検定結果を、Ｐ＞０．０５で有意性がない（ｎｓ）、０．０１＜Ｐ≦０．０５で有意性がある（「^＊」の記号で表す）、０．００１＜Ｐ≦０．０１で非常に有意性がある（「^＊＊」の記号で表す）、およびＰ≦０．００１でかなり有意性がある（「^＊＊＊」の記号で表す）、としてまとめる。

事後Ｄｕｎｎ多重比較検定によるＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓで算出された統計的有意性により、以下の結果を得た：

化合物Ａと３ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブとの組合せによって治療された群７〜９について、群７は、群２および５（Ｐ＜０．０１）における対応する単独療法よりも、かなり強い阻害を生じた。群８および９は、最終的な群のサイズが小さいので、統計的評価から除外された。

化合物Ａと１０ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブとの組合せによって治療された群１０〜１２について、群１０は、群２における化合物Ａの単独療法および群６におけるトラスツズマブの単独療法よりも、かなり強い活性を生じた。群１１は、有意な活性（Ｐ＜０．００１）および６つの部分退縮を生じた。群６の組合せは、群３における化合物Ａの単独療法、および群６におけるトラスツズマブの単独療法より著しく優れていた。群１２は、最終的な群のサイズが小さいので、統計的評価から除外された。

実施例５−ＨＢＣｘ−５乳癌異種移植片モデルにおける、化合物Ａ単独、および化合物Ａとトラスツズマブとの組合せの効果
実験は、およそ８〜１０週齢であり体重がおよそ１９〜２５グラムである雌ＨＳＤ：胸腺欠損ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスで実施された。研究前の６日間、食物および水への自由なアクセスを伴ってマウスを慣れさせた。体重減少が治療の最初の日と比較して１５％に達するとき、ＤｉｅｔＧｅｌ（登録商標）を動物に提供した。

マウスは、各群１０匹のマウスを含む５群に分けた。治療は、ＨＢＣｘ−５異種移植片腫瘍の移植後３４日目に開始した。ＨＢＣｘ−５は原発性乳癌に由来する異種移植片である。それは、野生型ＴＰ５３を有しＲＢ発現が高くＨＥＲ２を過剰発現している管腺癌である。異種移植片を移植するために、塩酸ケタミン１００ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン１０ｍｇ／ｋｇによりマウスに麻酔をかけた。無菌技術を使用して、３ｍｍの腫瘍断片をマウスの肩甲骨間３ｍｍに移植した。平均腫瘍体積および範囲が治療群間で統計的に類似するように、腫瘍体積に応じて動物を無作為に分けた。投与の開始時において、週あたり３回、腫瘍を測径器で測定した。腫瘍は式：＝幅^２×長さ／２を使用して計算された。腫瘍サイズおよび体重は、治療期間中、週あたり３回測定された。実験の予定エンドポイントは６週の治療期であり、追跡期はなかった。

化合物Ａを、０．５％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中に、ｍｇ／ｍｌで懸濁した。これをボルテックス撹拌および超音波処理により、均質にした。懸濁液を７日間４℃で保管し、光から保護した。トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）溶液１ｍｇ／ｍｌを各投与日に調製した。投与直前に、注射用滅菌水で２１ｍｇ／ｍｌのストック溶液を１ｍｇ／ｍｌに希釈した。カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）５４０ｍｇ／ｍｌを４℃に維持し、光から保護した。カペシタビンペレットを粉砕し、０．９％ＮａＣｌ中に懸濁した。

化合物Ａを単独でまたはトラスツズマブと組み合わせて、４２日間、５０ｍｇ／ｋｇで経口栄養（ｐ．ｏ．）によって毎日投与した。トラスツズマブは、６週間、週１回、１０ｍｇ／ｋｇで（ｉ．ｐ．)投与された。用量は、各注射時に体重で調節された。

カペシタビンは、２週間、週あたり５回（すなわち、５日連続の投与日／週）、５４０ｍｇ／ｍｌで経口栄養（ｐ．ｏ．）によって投与された。１週の休みの後、２回目の治療サイクルを実施した。

抗腫瘍活性は、Ｔ／Ｃ％（治療動物の腫瘍体積の平均変化量／対照動物の腫瘍体積の平均変化量）×１００として表される。統計解析のために、腫瘍体積および相対体重を使用した。群比較は、治療群と対照群との間で、Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙの非パラメトリック検定を使用して実施された。

この研究において、５０ｍｇ／ｋｇの単剤として投与された化合物Ａは、ＨＢＣｘ−５乳房異種移植片モデルについて有意な抗腫瘍活性を実証した（Ｔ／Ｃ＝１７．５７％、ｐ＜０．００１）。１０ｍｇ／ｋｇの単剤で投与されたトラスツズマブは、いかなる有意な抗腫瘍活性（Ｔ／Ｃ−８１．４４％）も実証しなかった。化合物Ａ５０ｍｇ／ｋｇとトラスツズマブ１０ｍｇ／ｋｇとの組合せは、有意な抗腫瘍活性（Ｔ／Ｃ−１９．４４％、ｐ＜０．００１）を実証した。しかし、併用投与の抗腫瘍活性は、化合物Ａ単剤と顕著な差はなかった。部分退縮または完全退縮は観察されなかった。

単独でまたはトラスツズマブと組み合わせて使用された化合物Ａの耐容性はよかった。最初の投与の１０日後、最大体重減少９．５％に達し、これが研究の終了まで安定した。この体重減少は顕著だが、許容可能であった。顕著な体重減少は、トラスツズマブ単独では観察されなかった。化合物Ａをトラスツズマブと組み合わせて投与したとき、顕著ではあるが容認できる７．９％の体重減少が観察された。

４０ｍｇ／ｋｇの単剤として投与されたカペシタビンは、ＨＢＣｘ−５乳房異種移植片モデルにおいて、非常に活性が高かった（Ｔ／Ｃ＝９．０３％、ｐ＜０．００１）。カペシタビンは、９．１％という顕著で一時的な体重減少を誘発した。

実施例６−ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌異種移植片モデルにおける、化合物Ａ単独、および化合物Ａとラパチニブとの組合せの効果
実施例４に記載した研究プロトコルを使用して、ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウス異種移植片モデルにおいて化合物Ａの効果を、単独療法として、およびラパチニブと組合せて研究した。雌ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウス（Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤ（登録商標）、ＣＢ１７／Ｉｃｒ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）は、研究の１日目において１０週齢であり１５．８〜２１．９ｇの体重（ＢＷ）範囲を有していた。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を、トリプシン（５×）により採取した。腫瘍移植（研究の１日目）後８日目に、個々の腫瘍体積が８８〜１９６ｍｍ^３であるマウスを、群の平均腫瘍体積が１４３〜１４９ｍｍ^３となる、１０匹のマウスの１０群に振り分けた。

実施例４で使用されたトラスツズマブにかえて、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、２５０ｍｇ錠剤）を、投与用に０．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース：０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０：９９．４％脱イオン水（ビヒクル２）中に懸濁した。新鮮なラパチニブ懸濁液を週に１回調製し、４℃で保管して光から保護した。

治療は、腫瘍細胞移植後８日目に開始し、５９日間連続、または腫瘍体積＝１０００ｍｍ^３になるまで継続した。ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍を有する動物に、化合物Ａを１日１回経口投与し、ラパチニブを２１日間１日２回（ｂ．ｉ．ｄ．）または２１日間１日１回のどちらかで、経口投与した。ｂ．ｉ．ｄ．の投与スケジュールの場合、最初の用量を１日目の午後に与え、最後の用量を２２日目の午前に与えた。組合せ療法については、ラパチニブは、化合物Ａの後３０分以内に投与された。投与体積（１０ｍＬ／ｋｇは、前週のＢＷを持ち越す週末を除いて、投与日に決定された各動物の重量に対して計られた。対照（群１）は、１日１回経口（ｐ．ｏ．）によるＮＭＰ／ＰＥＧ３００／Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ１５／水（１０：３０：２０：４０体積％）の混合物（ビヒクル１）、および１日１回経口による０．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース：０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０：９９．４％脱イオン水（ビヒクル２）を受ける動物からなった。群２および３は、それぞれ１２．５および２５ｍｇ／ｋｇの化合物Ａによる単独療法を受けた。群４は、ｂ．ｉ．ｄの５０ｍｇ／ｋｇでのラパチニブ単独療法を受けた。群５および６は、１日１回、それぞれ１００および１５０ｍｇ／ｋｇのラパチニブによる単独療法を受けた。群７および８は、１日１回のそれぞれ１２．５および２５ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを、各々１日１回のラパチニブと組み合わせて受けた。群９は、１日１回の化合物Ａ１２．５ｍｇ／ｋｇを、ｂ．ｉ．ｄのラパチニブ５０ｍｇ／ｋｇと組み合わせて受けたが、この場合、化合物Ａは、ラパチニブの午後の投与と一緒に投与された。群１０は、１日１回の化合物Ａ１２．５ｍｇ／ｋｇを、１日１回のラパチニブ１５０ｍｇ／ｋｇと組み合わせて受けた。群７、８、９および１０の治療は、早期に終了した。体重は、各治療日（週末を除く）の１〜５日目、その後は、研究の終了まで週に２回記録された。

適用可能な場合、データは平均±ＳＥＭとして示される。その新生物がエンドポイントの体積（１０００ｍｍ^３）に達したとき、または研究の最後の日（５９日目）に、各動物を安楽死させた。エンドポイントまでの時間（ＴＴＥ）は、式：ＴＴＥ＝（ｌｏｇ_１０（エンドポイントの体積）−ｂ）／ｍによって算出される（式中、ＴＴＥは日数で表され、エンドポイント体積はｍｍ３においてであり、ｂは切片であり、ｍは対数変換された腫瘍成長のデータセットの線形回帰によって得られる直線の傾きである）。治療有効性は腫瘍成長遅延（Tumor Growth Delay）（ＴＧＤ）から決定され、これは対照群と比較した治療群についての、エンドポイントまでの時間（ＴＴＥ）の中央値の増加分（ＴＧＤ＝Ｔ−Ｃ）（日数で表される）として、または対照群のＴＴＥの中央値の百分率（％ＴＧＤ＝（（Ｔ−Ｃ）／Ｃ）×１００）として定義された（式中、Ｔ＝治療群についてのＴＴＥの中央値であり、Ｃ＝指定対照群についてのＴＴＥの中央値である）。

統計およびグラフ解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＰｒｉｓｍ３．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ）によって実施された。すべての試験について、差の有意性レベルはＢａｒｔｌｅｔｔ検定によるＡＮＯＶＡを使用して行われ、事後のＤｕｎｎｅｔｔ多重比較検定は、各薬物治療群ついての平均変化量を群１についての平均値と比較した。生存は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によって解析された。エンドポイントまでの時間（ＴＴＥ）の値に基づいて、２群の全生存経験間の差の有意性を解析するために、ログランク検定を用いた。両側統計解析はＰ＝０．０５で行われた。Ｐｒｉｓｍは検定結果を、Ｐ＞０．０５で有意性がない（ｎｓ）、０．０１＜Ｐ≦０．０５で有意性がある（「^＊」の記号で表す）、０．００１＜Ｐ≦０．０１で非常に有意性がある（「^＊＊」の記号で表す）、およびＰ≦０．００１でかなり有意性がある（「^＊＊＊」の記号で表す）、としてまとめる。

ログランク検定で算出された統計的有意性により、以下の結果が得られた：

Claims (15)

1. ＥＧＦＲ依存性疾患の治療のための医薬製剤を製造するための式Ｉの化合物またはその塩の使用：
   

   

   
   ［式中、
   Ａは、
   

   

   
   からなる群から選択されるヘテロアリールを表し；
   Ｒ^１は、以下の置換基の１つを表し：（１）非置換または置換の、好ましくは置換のＣ_１〜Ｃ_７アルキル（ここで前記置換基は、以下の部分の１つ以上、好ましくは１〜９つから独立に選択される：ジュウテリウム、フルオロ、または１〜２つの以下の部分：Ｃ_３〜Ｃ_５シクロアルキル）；（２）任意に置換されているＣ_３〜Ｃ_５シクロアルキル［ここで前記置換基は、以下の部分の１つ以上、好ましくは１〜４つから独立に選択される：ジュウテリウム、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル（好ましくはメチル）、フルオロ、シアノ、アミノカルボニル］；（３）任意に置換されているフェニル［ここで前記置換基は、以下の部分の１つ以上、好ましくは１〜２つから独立に選択される：ジュウテリウム、ハロ、シアノ、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキルアミノ、ジ（Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル）アミノ、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル）アミノカルボニル、Ｃ_１〜Ｃ_７アルコキシ］；（４）任意に一置換または二置換されているアミン［ここで前記置換基は、以下の部分から独立に選択される：ジュウテリウム、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル（非置換であるか、あるいはジュウテリウム、フルオロ、クロロ、ヒドロキシの群から選択される１つ以上の置換基によって置換されている）、フェニルスルホニル（非置換であるか、あるいは１つ以上、好ましくは１つのＣ_１〜Ｃ_７アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_７アルコキシ、ジ（Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル）アミノ−Ｃ_１〜Ｃ_７アルコキシによって置換されている）］；（５）置換スルホニル［ここで前記置換基は、以下の部分から選択される：Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル（非置換であるか、あるいはジュウテリウム、フルオロの群から選択される１つ以上の置換基によって置換されている）、ピロリジノ（非置換であるか、あるいはジュウテリウム、ヒドロキシ、オキソの群から選択される１つ以上の置換基、特に１つのオキソによって置換されている）］；（６）フルオロ、クロロ；
   Ｒ^２は水素を表し；
   Ｒ^３は、（１）水素、（２）フルオロ、クロロ、（３）任意に置換されているメチルを表す（ここで前記置換基は、以下の部分の１つ以上、好ましくは１〜３つから独立に選択される：ジュウテリウム、フルオロ、クロロ、ジメチルアミノ）；
   ただし、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−ピリミジン−４−イル］−４−メチル−チアゾール−２−イル｝−アミド）は除く］。
2. 前記式Ｉの化合物が、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ａ）である、請求項１に記載の使用。
3. 前記疾患がＥＧＦＲモジュレーターによる治療に対して耐性である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の使用。
4. 前記ＥＧＦＲモジュレーターによる治療に対する耐性は、前記ＥＧＦＲモジュレーターによる治療中に獲得されたものである、請求項３に記載の使用。
5. 前記耐性は、タンパク質における１つまたは複数の変異によるものである、請求項３に記載の使用。
6. 前記ＥＧＦＲモジュレーターは、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、トラスツズマブおよびＴＤＭ１からなる群から選択される、請求項３または４に記載の使用。
7. ＥＧＦＲモジュレーターと一緒での、請求項１〜２のいずれか一項に記載の使用。
8. 前記ＥＧＦＲモジュレーターは、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＮＶＰ−ＡＥＥ７７８、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＢＩＲＷ２９９２、ＢＭＳ６９０５１４、ペリチニブ、バンデタニブ、ＡＶ４１２、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体−Ｙ９０／Ｒｅ−１８８、セツキシマブ、パニツムマブ、マツズマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、ペルツズマブ、ＭＤＸ−２１４、ＣＤＸ１１０、ＩＭＣ１１Ｆ８、ペルツズマブ、トラスツズマブ、Ｚｅｍａｂ（登録商標）、Ｈｅｒ２ワクチンＰＸ１０４１、ならびにＨＳＰ９０阻害剤のＣＮＦ１０１０、ＣＮＦ２０２４、タネスピマイシン アルベスピマイシン、ＩＰＩ５０４、ＳＮＸ５４２２およびＮＶＰ−ＡＵＹ９２２からなる群から選択される、請求項７に記載の使用。
9. 治療されるべき疾患が、
   ・非小細胞肺癌
   ・頭頸部癌
   ・結腸直腸癌
   ・乳癌
   ・神経膠芽腫を含む悪性脳腫瘍
   ・前立腺癌
   ・膀胱癌
   ・腎細胞癌
   ・すい臓癌
   ・子宮頸癌
   ・食道癌
   ・胃癌
   ・卵巣癌
   または、それらのいずれかの組合せ
   である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
10. 非小細胞肺癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、乳癌、神経膠芽腫を含む悪性脳腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、すい臓癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌および／または卵巣癌を治療するために、同時、別個または逐次に使用するための、Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ａ）からなる群から選択される式Ｉの化合物と、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＮＶＰ−ＡＥＥ７７８、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＢＩＲＷ２９９２、ＢＭＳ６９０５１４、ペリチニブ、バンデタニブ、ＡＶ４１２、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体−Ｙ９０／Ｒｅ−１８８、セツキシマブ、パニツムマブ、マツズマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、ペルツズマブ、ＭＤＸ−２１４、ＣＤＸ１１０、ＩＭＣ１１Ｆ８、ペルツズマブ、トラスツズマブ、ＴＤＭ１ Ｚｅｍａｂ（登録商標）、Ｈｅｒ２ワクチンＰＸ１０４１、ならびにＨＳＰ９０阻害剤のＣＮＦ１０１０、ＣＮＦ２０２４、タネスピマイシン アルベスピマイシン、ＩＰＩ５０４、ＳＮＸ５４２２およびＮＶＰ−ＡＵＹ９２２からなる群から選択されるＥＧＦＲモジュレーターと、任意に、少なくとも１種の薬学的に許容される担体との組合せであって、活性成分が、各場合において、遊離形態または薬学的に許容される塩の形態で存在する組合せ。
11. ＥＧＦＲ依存性疾患またはＥＧＦＲモジュレーターによる治療中に耐性を獲得した疾患の治療方法であって、請求項１〜２のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物の治療上有効な量を、それを必要とする温血動物に投与することを含む方法。
12. 治療されるべき前記疾患が請求項９に記載の疾患である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記式Ｉの化合物が、請求項８に記載のＥＧＦＲモジュレーターと一緒に投与される、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 請求項１〜２のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物または薬学的に許容されるその塩、および少なくとも１種の薬学的に許容される担体を含む、ＥＧＦＲ依存性疾患またはＥＧＦＲモジュレーターによる治療中に耐性を獲得した疾患の治療のための医薬製剤。
15. 請求項８に記載のＥＧＦＲモジュレーターを含む、請求項１４に記載の医薬製剤。

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