JP2013540720A - 神経変性疾患の処置のための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ゲラニルゲラニルアセトンの5-cisおよび5-trans異性体、好ましくは合成された該異性体、および該異性体を含有する医薬組成物に関する。本発明の別の態様は、神経細胞死の阻害、神経活性の増大、および軸索成長および細胞生存率の増大のための方法における、ゲラニルゲラニルアセトン及びその異性体の使用に関する。ゲラニルゲラニルアセトンは、市販されており、臨床現場で使用されている抗潰瘍薬として知られている。ＧＧＡはさらに、眼、脳および心臓等の様々な器官に対する細胞保護効果も発揮することが示されている。

Description

関連出願のクロスリファレンス
本発明は、米国仮出願第61/379,316号（出願日2010年9月1日）および同第61/510,002号（出願日：2011年7月20日）の優先権を主張するものであり、これらはその全体が本明細書の一部を構成する。

発明の分野
本発明は、総じて、ゲラニルゲラニルアセトン（GAA）による神経細胞死の阻害及び神経活性の増大のための方法、ならびにこれら適応症に対して用いられる組成物に関する。本発明はさらに、ゲラニルゲラニルアセトンのcisおよびtrans異性体、および種々のＧＧＡ異性体の混合物、ならびにそれらの治療上の使用に関する。

技術水準
ゲラニルゲラニルアセトンは、レチノイド骨格を有する非環式イソテルペノイド化合物であり、様々なタイプの組織において熱ショックタンパク質の発現を誘導することが示されている。ＧＧＡは、市販されており臨床現場で用いられている抗潰瘍薬として知られている。

ＧＧＡはまた、眼、脳、心臓等、様々な器官に対する細胞保護作用を示すことが示されている（例えば、Ishii Y., et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 2003; 44:1982-92; Tanito M, et al., J Neurosci 2005; 25:2396-404; Fujiki M, et al., J Neurotrauma 2006; 23:1164-78; Yasuda H, et al., Brain Res 2005; 1032:176-82; Ooie T, et al., Circulation 2001; 104:1837-43; and Suzuki S, et al., Kidney Int 2005; 67:2210-20を参照）。これらの状況におけるＧＧＡの効果および細胞保護の利益は、これら細胞保護の恩恵にＧＧＡの異性体が関係しているとはあまり理解されていない。特に興味深いのは、細胞内あるいは細胞外の両方での核外の神経変性に対するＧＧＡの効果である。

神経変性はしばしば、加齢、散発的変異、疾患および/または神経細胞内のタンパク質凝集の結果として起こる。神経変性疾患はしばしば、神経系の組織の進行性の神経変性および神経自体の機能の損失によって特徴付けられる。多くの神経変性疾患にみられる一つの共通点は、細胞内または細胞のニューロン間の細胞外空間でのタンパク質凝集体の蓄積である。

タンパク質凝集は、細胞のタンパク質の部分的アンフォールディングまたは変性によって促進される。これは、DNA配列の変異、転写の際の誤った取り込み、RNAに対する修飾、およびタンパク質に対する修飾や酸化ストレスに起因する。タンパク質の凝集が疾患の進行に寄与していることを示唆する証拠が増えている。ある研究では、２つの非疾患タンパク質の凝集体をin vitroで形成し、培養細胞の培地に添加された。粒状構造のタンパク質凝集体の添加により、線維芽細胞（NIH-3T3）と神経細胞株（PC12）の細胞生存率がいずれも低下した。しかし、より組織化された繊維状のタンパク質凝集体の添加では、細胞の生存性が損なわれることはなかった。(Bucciantini et al.(2002) Nature 14:507-510.)

タンパク質凝集体は、細胞外（即ち、神経細胞間の空間）、核内等の細胞内（即ち、細胞の核内）、あるいは細胞質内に存在し得る。細胞外および/または細胞質タンパク質凝集体は、アルツハイマー病（AD）および筋萎縮性側索硬化症（ALS）の病理学的特徴である。ADは、記憶や認知機能を破壊する進行性の脳の病気である。ADは、β-アミロイドペプチドの凝集と関連している。β-アミロイドペプチドは、βおよびγセクレターゼと呼ばれる二つのアスパルチルプロテアーゼによりプロセシングを受けたアミロイド前駆体タンパク質（APP）に由来する。ADと同様、ALSもまた進行性の神経変性疾患であり、運動ニューロンの機能の損失によって特徴付けられる。運動ニューロンの進行性の変性は、筋肉の動きを開始し制御する脳の能力に損失をもたらす。ALSは壊滅的な疾患であり、その最終段階は完全な麻痺である。ALSの疾患進行の完全な分子メカニズムはまだ明らかではないが、Cu/Znスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）遺伝子SOD1の変異が運動ニューロンの変性に関係している。ALSとADの疾患の症状は異なり得るものの、両疾患における細胞傷害性の凝集タンパク質の存在は、病原性における共通のメカニズムを示唆している。(Ross & Poirier.(2004) Nat Med. ppS10-S17; Irvine et al.(2008) Mol Med.14(7-8):451-464; Wang et al.(2008) PLoS One Vol. 6, Issue 7, pp1508-1526.Iguchi et al.(2009) J. Bio Chem.Vol. 284 no. 33 pp. 22059-22066.)

最近、Neuro-2a細胞におけるTDP-43蛋白質（TAR DNA結合タンパク質、TARDBP）の枯渇が、ALSで観察されるものと同様のタンパク質凝集を引き起こすことがわかった。事実、TARDBPにおける点変異は、家族性および弧発性ALSに関係している。Neuro-2a細胞におけるTARDBP siRNAによるTDP-43枯渇もまた、低分子量Ｇタンパク質のRhoファミリーの生物学的活性の阻害を引き起こす。したがって、TDP-43およびRhoファミリータンパク質は、神経細胞におけるタンパク質凝集体形成に対し負に作用する。Rhoファミリータンパク質は、細胞運動、細胞生存、細胞増殖、転写および細胞の運動性の調節を司っている(Iguchi et al.(2009) J. Bio Chem.Vol. 284 no. 33 pp. 22059-22066)。TDP-43またはRhoファミリータンパク質の量および/または活性の低下を防ぐ治療は、細胞に対する神経保護効果を有し得る。

ADやALSなどの神経変性疾患のためのより効果的な治療が求められている。研究によれば、タンパク質の凝集を制御する細胞のメカニズムを標的とする治療が、これらの疾患におけるニューロンの機能及び生存の損失を低減し、症状を軽減する可能性があることが示唆されている。低分子量Ｇタンパク質の活性を高める治療法もまた、神経細胞死の抑制に有用であり、ALSにおける神経活性を増大し得る。本願は、タンパク質凝集体の形成を阻害または変化させ、神経細胞における低分子量Ｇタンパク質の活性を調節するための、ゲラニルゲラニルアセトン（GGA）の使用に関する。

発明の概要
本発明は、ゲラニルゲラニルアセトンの医薬としての使用、ゲラニルゲラニルアセトンの異性体の化合物および医薬組成物、好ましくは合成されたゲラニルゲラニルアセトンおよびそのような化合物および医薬組成物の使用方法に関する。さらに、本発明は、ＧＧＡ及びその異性体の製造方法に関する。ある特定の態様では、本発明は、式Ｉで示される5-trans異性体に関する。

Ｉ
（Ｉは少なくとも８０％が5E,9E,13E配置である）。一実施形態では、本発明は、合成された5E,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトンである化合物を提供する。別の実施形態では、合成された5E,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトンは、5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトンを含まない。別の態様では、本発明は、合成されたＧＧＡまたは合成された5E,9E,13E-GGAと、少なくとも１つの製薬的添加物を含有してなる医薬組成物を提供する。

別の態様では、本発明は、ADまたはALSに関連する病原性のタンパク質凝集体の発生のリスクのあるニューロンからの１またはそれ以上の神経伝達物質の発現および／または放出を増大するための組成物であって、該組成物がタンパク質の凝集を阻害する量のＧＧＡ、またはその異性体もしくは異性体の混合物を含有してなる組成物を提供する。

別の態様では、本発明は、細胞外病原性タンパク質凝集体の発生のリスクのあるニューロンからの１またはそれ以上の神経伝達物質の発現および／または放出を増大するための組成物であって、該組成物が細胞外タンパク質の凝集を阻害する量のＧＧＡ、またはその異性体もしくは異性体の混合物を含有してなる組成物を提供する。

本発明の別の態様は、式ＩＩ：

ＩＩ
（ここでＩＩは、少なくとも８０％が5Z,9E,13E-配置である）か、または式ＸＩＩ：

ＸＩＩ
［式中、各R₅は独立してＣ₁-Ｃ₆アルキルであるか、または２つのR₅基がそれらが結合している酸素原子と一緒になって５または６員環を形成し、該環は場合により１〜３の、好ましくは１〜２のＣ₁-Ｃ₆アルキル基で置換されていてもよい］
で示されるそのケタールである、合成された5-trans異性体に関する。好ましくは、２つのR₅基は同一である。一実施形態では、R₅は、メチル、エチルまたはプロピルである。別の実施形態では、環は、

である。

本発明の方法の一態様では、下記工程の１またはそれ以上を含んでなる方法を提供する。式ＩＩＩの化合物をハロゲン化条件下で反応させて、式ＩＶの化合物を得る。式ＩＶの化合物をアルキル化条件下で式Ｒ₁ＯＯＣＣＨ₂ＣＯＣＨ₃（式中、Ｒ₁はアルキルである）のアルキルアセトアセテートと反応させて、式Ｖの化合物をＲおよびＳエナンチオマーの混合物として得る。式Ｖの化合物を加水分解及び脱カルボキシル化の条件下で反応させて式ＶＩの化合物を得る。

式ＶＩの化合物をオレフィン化条件下で式ＶＩＩ（式中、Ｒ₂およびＲ₃は独立してアルキルである）の化合物と反応させて、式ＶＩＩＩの化合物を立体選択的に得る。式ＶＩＩＩの化合物を還元条件下で反応させて式ＩＸの化合物を得る。式Ｘの化合物が得られる条件下で式ＩＸの化合物をハロゲン化する。式Ｘの化合物とアルキルアセトアセテートとをアルキル化条件下で反応させて式ＸＩの化合物をＲおよびＳエナンチオマーの混合物として得る。式ＸＩの化合物を加水分解および脱カルボキシル化の条件下で反応させて式Ｉの化合物を得る。

さらに別の修飾法では、本発明は、式ＸＩＡの化合物またはその塩を脱カルボキシル化する方法を提供する（式中、Ｒ₄は−ＣＨ₂−ＣＨ（ＣＯＣＨ₃）ＣＯ₂Ｈである）。

本発明の方法のさらなる態様では、ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させることにより該ニューロンの軸索成長を増大する方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、神経細胞死になりやすいニューロンの細胞死を阻害または減少する方法であって、該ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させることを含んでなる方法に関する。

本発明のさらに別の方法の態様では、ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させることによる、該ニューロンの神経突起成長を増大する方法を提供する。

本発明の他の態様は、ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させることによる神経刺激の方法に関する。一実施形態では、神経刺激は、ニューロンからの１またはそれ以上の神経伝達物質の発現および／または放出の増大からなる。別の実施形態では、神経刺激は、ニューロンのシナプス形成の増大、またはあるいは電気興奮性の増大からなる。さらに別の実施形態では、神経刺激はニューロンのＧタンパク質の活性の調節を包含する。関連する実施形態では、Ｇタンパク質の活性化はＧＧＡにより増強される。

別の実施形態では、本発明は、ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させることによる、神経細胞の損傷または神経細胞死のリスクのあるニューロンの神経保護のための方法を提供する。ある１つの特定の実施形態では、神経毒性または神経細胞死のリスクのあるニューロンには、アルツハイマー病またはALSの病態におけるまたはそれによって影響を受けたものが包含される。それぞれのケースにおいて、神経の損傷または神経細胞死のリスクのあるニューロンを有効量のＧＧＡと接触させることにより、神経保護の作用を及ぼす。

本発明のさらに別の態様は、神経保護の方法、例えば、神経毒性のリスクのあるニューロンを保護するための方法であって、神経毒性のリスクのあるニューロンを含んでなる細胞と有効量のＧＧＡとを接触させることを含んでなる方法に関する。特定の理論には限定されないが、ＧＧＡはβ−アミロイドペプチドまたはそのオリゴマーもしくはポリマーの神経毒性に拮抗すると考えられる。

さらに別の神経保護の態様は、ALSから生じる神経変性からニューロンを保護するための方法である。

さらなる態様では、本発明は、ニューロン間、ニューロンの外または内のいずれかの病原性のタンパク質凝集体の形成又はさらなる形成に起因するニューロンの死を阻害するための方法であって、該病原性のタンパク質凝集体を生じるリスクのあるニューロンを、タンパク質の凝集を阻害する量のＧＧＡと接触させる方法（但し、該病原性のタンパク質凝集体はSBMAに関連するものではない）に関する。

さらに別の態様では、本発明は神経疾患を患っている哺乳類における、神経細胞死を阻害するおよび神経活性を増大する方法であって、該神経疾患の病因がニューロンに対して病原性のタンパク質凝集体の形成を含んでなり、該哺乳類に対し、さらなる病原性のタンパク質凝集を阻害する量のＧＧＡを投与することを含んでなる方法（但し、該病原性のタンパク質凝集は核内でない）に関する。

本発明の別の態様は、神経疾患を患っている哺乳類における、神経細胞死を阻害するおよび神経活性を増大するための方法であって、該神経疾患の病因が、ニューロンに対して病原性のタンパク質凝集体の形成を含んでなり、該哺乳類に対し、さらなる病原性のタンパク質凝集を阻害する量のＧＧＡを投与することを含んでなる方法（但し、該病原性のタンパク質凝集はSBMAに関連するものでない）に関する。

詳細な記載
本発明が、記載した特定の実施形態に限定されないと言うことは理解されよう。また、本発明の範囲は添付する請求の範囲によってのみ限定され、本明細書において用いられる用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定を意図するものではない。

本明細書および添付する請求の範囲において用いられるように、単数形「a」、「an」および「the」には、文脈によって明確に指示されない限り複数形を包含する。したがって、例えば、「an excipient」とあれば、複数の添加物を包含する。

１.定義
特に定義しない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術を有する者が一般に理解している意味と同じ意味を有する。本明細書において用いられる下記の用語は以下の意味を有する。

本明細書において用いられる用語「含んでなる」は、本組成物及び本方法が、列記した要素を包含するがそれ以外のものを排除しないことを意味すると意図される。組成物および方法を定義するのに用いられる「本質的になる」は、記載した目的についての組み合わせに対して本質的な意義を有するその他の要素を排除することを意味するものである。したがって、本明細書で定義した要素から本質的になる組成物は、請求項に記載した発明の基本的で新規な特徴に対して大きな影響を及ぼさない他の物質または工程を排除するものではない。「からなる」とは、他の成分の微量のエレメントおよび実質的な方法の工程以外のものを除くことを意味する。これらそれぞれの移行句で定義された実施形態は、本発明の範囲内である。

用語「神経保護」とは、分解を受けやすいニューロンが対照と比較して分解から保護されるアッセイにおいて、in vitroで測定されたニューロンの毒性の減少を意味する。神経保護効果はまた、組織切片におけるニューロンをカウントすることによりin vivoで評価することもできる。

用語「ニューロン」は、中枢神経及び末梢神経系を構成するすべての電気的興奮性の細胞を意味する。ニューロンは、動物の体内の細胞でも動物の体外で培養された細胞でもよい。用語「ニューロン」はまた、哺乳類の神経細胞に由来する確立されたまたは一次の組織培養細胞系またはニューロンに分化した組織細胞系を意味する。「ニューロン」はまた、染色体外で又は染色体内で特定のタンパク質を発現するように修飾された上記の任意のタイプの細胞を意味する。さらに、「ニューロン」は、グリア細胞など脳内の神経芽細胞腫細胞や支持細胞等の形質転換したニューロンも意味する。

用語「タンパク質凝集体」は、特にまたは全体的にミスフォールドであり得るタンパク質の集合体を意味する。タンパク質集合体は可溶性または不溶性であってよく、細胞内でも、細胞間の空間において細胞外に存在していてもよい。細胞内のタンパク質凝集体は、それらが核内で核の内側、あるいはそれらが核の外側の空間の細胞質内に存在し得るが、細胞膜の内側に存在する。本発明で記載するタンパク質凝集体は、粒状のタンパク質凝集体である。

本明細書に記載される、用語「タンパク質凝集を阻害する量」とは、少なくとも部分的にまたは全体的にタンパク質凝集体の形成を阻害するＧＧＡの量を意味する。特に記載しない限り、阻害は、細胞の内側または細胞の外側でのタンパク質凝集に対するものである。

本明細書において用いられる、「核内」は、動物細胞の核コンパートメントの内側の空間を意味する。

用語「細胞質」は、動物細胞の核の外側で、細胞壁内の空間を意味する。

本明細書において用いられる、用語「病原性タンパク質凝集体」は、疾患に関連するタンパク質凝集体を意味する。これらの疾患としては、細胞の死または２又はそれ以上の細胞間の神経シグナル伝達の部分的又は完全な損失が挙げられるがこれに限定されない。病原性タンパク質凝集体は、細胞の内側（例えば、病原性の細胞内タンパク質凝集体）、または細胞の外側（病原性細胞外タンパク質凝集体）に存在し得る。

本明細書において用いられる、用語「SBMA」は、球脊髄性筋萎縮症を意味する。球脊髄性筋萎縮症は、アンドロゲン受容体タンパク質が核内で病的に蓄積することによって引き起こされる疾患である。

本明細書において用いられる、用語「ALS」とは、筋萎縮性側索硬化症を意味する。

本明細書において用いられる、用語「AD」とは、アルツハイマー病を意味する。

用語「神経伝達物質」とは、ニューロンから標的細胞へシグナルを伝達する化学物質を意味する。神経伝達物質の例としては、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、γ-アミノ酪酸、グリシンなどのアミノ酸；ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、ヒスタミン、セロトニン、メラトニン等のモノアミン；アセチルコリン、アデノシン、アナンドアミド及び一酸化窒素等の他の分子が挙げられるがこれらに限定されない。

用語「シナプス」は、ニューロン間の接合部位を意味する。これらの接合部位により、ある細胞から別の細胞への化学物質のシグナル伝達が可能となる。

用語「Ｇタンパク質」とは、細胞の外側で化学物質のシグナルを伝達に関与し、細胞内での変化を引き起こすタンパク質のファミリーを意味する。Ｇタンパク質のRhoファミリーは、低分子量のＧタンパク質であり、アクチン細胞骨格動態の調節、細胞の運動、移動、転写、細胞の生存及び細胞増殖に関与する。RHOA、RAC1およびCDC42は、もっとも研究されているRhoファミリーのタンパク質である。活性なＧタンパク質は、細胞がその最大の生物学的作用を発揮する場所である細胞膜に存在する。

本明細書において用いられる、用語「処置」または「処置する」は、以下に挙げられる１またはそれ以上の患者における疾患または状態の任意の処置を意味する：
疾患または状態の予防または保護、即ち、例えば、そのような疾患又は状態を患うリスクのある患者において臨床的症状が進行しないようにし、それによってその疾患または状態の発症を実質的に回避すること；
疾患または状態の阻害、即ち、臨床上の症状の発現を停止する、または抑制すること；および／または
疾患または状態の軽減、即ち、臨床上の症状を軽減すること。

用語「軸索］は、シナプスを介して他の細胞にシグナル伝達を行うニューロンの突起を意味する。用語「軸索の成長」は、軸索の先端の成長円錐を介する軸索の突起伸張を意味する。

用語「神経疾患」とは、ニューロンの細胞の生存を危うくする疾患を意味する。前記神経疾患の病因が、ニューロンに対して病原性のタンパク質凝集体の形成（但し、そのタンパク質凝集は、SBMAに関連するものでなく、核内でもない）を含んでなる神経疾患としては、ALS、AD、パーキンソン病、多発性硬化症、およびクールー、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群などのプリオン病が挙げられるがこれらに限定されない。これらの神経疾患はまた、ポリグルタミン反復配列を含まない点で、SBMAと異なる。神経疾患は、組織培養細胞においてin vitroで再現することができる。たとえばＡＤは、予め凝集したβ-アミロイドペプチドを細胞に添加することによりin vitroでモデル化することができる。ALSは、ALSの疾患関連タンパク質TDP-43を枯渇させることによりモデル化することができる。神経疾患もまた、細胞に毒性ストレスを与えてタンパク質凝集体を生じさせることによりin vitroでモデル化することができる。１つの方法として、神経芽細胞腫細胞などのニューロンをドーパミンと混合することによってこれを達成することができる。これらの神経疾患はまた、マウスモデルにおいてインビボで再現することができる。変異型Sod1タンパク質を発現するトランスジェニックマウスは、ヒトのALS患者に類似した病態を有する。同様に、APPを過剰発現するトランスジェニックマウスは、ADを有するヒトと類似した病態を有する。

「アルキル」なる語は、置換または非置換の、直鎖または分岐鎖の、C₁−C₁₂、C₁−C₆、好ましくはC₁−C₄炭素原子を有するアルキル基を意味する。

用語「アリール」は、６〜１０員の、好ましくは６員のアリール基を意味する。アリール基は、１〜５、好ましくは１〜３の、ハロ、アルキル、および/または−Ｏ−アルキル基で置換されてもよい。

ＧＧＡの有効量は、in vitroまたはin vivoで保護効果を生じるのに必要なＧＧＡの量である。いくつかの実施形態では、in vitroでの有効量は、0.1nM〜約１mMである。いくつかの実施形態では、in vitroでの有効量は、約0.1nM〜約0.5nM、または約0.5nM〜約１.0nM、または約１.0nM〜約5.0 nM、または約5.0nM〜約１0nM、または約１0nM〜約50nM、または約50nM〜約１00nM、または約１00nM〜約500 nM、または約500nM〜約１mMである。いくつかの実施形態では、in vivoの効果のための有効量は、約0.1mg〜約１00 mg、好ましくは、約１ｍg〜約50 mg、または、より好ましくは約１ｍg〜約25ｍg/kg/日である。他のいくつかの実施形態では、in vivoでの有効量は、約１0 mg / kg /日〜約１00 mg / kg /日、約20 mg / kg /日〜約90 mg / kg /日、約30 / mg / kg /日〜約80 mg / kg /日、約40 mg / kg /日〜約70 mg / kg /日、または約50 mg / kg /日〜約60 mg / kg /日である。さらに別の実施形態では、in vivoでの有効量は、約１00 mg / kg /日〜約１000 mg / kg /日である。

投与経路は、哺乳動物にＧＧＡを投与する方法を指す。投与は様々な方法によって行うことができる。これらには、皮下、静脈内、経皮、舌下、または腹腔内注射または経口投与が含まれるがそれらに限定されない。

例えば、温度、時間、量、濃度、それらの範囲を含め、数字表記の前に使用される場合、「約」なる語は、±10％、5％または1％で変動し得る近似値を示す。

用語「ハロゲン化」は、ヒドロキシ基をハロ基に変換することとして定義される。用語「ハロ」または「ハロ基」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを意味する。

用語「立体選択性」とは、新たに形成された二重結合についてＥ異性体を90％以上生じるものとして定義される。

「幾何異性体」は、１以上のオレフィン中心の配置が異なる化合物を指す。「E」または「（E）」はトランス配置、「Z」または「（Z）」は、シス配置を示す。

ゲラニルゲラニルアセトン（GGA）は次式の化合物：

を意味し、ここで、この化合物を含んでなる組成物はこの幾何異性体の混合物である。

ゲラニルゲラニルアセトンの5-trans異性体は、式Ｉ

Ｉ
［式中、５番の炭素原子は5-trans（5E）配置である］
で示される化合物を意味する。

ゲラニルゲラニルアセトンの5-cis異性体は、式ＩＩ：

ＩＩ
［式中、５番の炭素原子は5-cis（5Z）配置である］
で示される化合物を意味する。

２．化合物
本発明は、ゲラニルゲラニルアセトンの異性体である化合物およびその医薬組成物に関する。ある特定の態様では、本発明は、式Ｉ：

Ｉ
［ここで、Ｉは少なくとも８０％が5E,9E,13E-配置である］
で示される合成された5-trans異性体化合物に関する。幾つかの実施形態では、本発明は、少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％が、5E,9E,13E-配置である式Ｉの化合物を提供する。式Ｉの化合物に関する本発明の幾つかの態様では、ＧＧＡのいかなるcis異性体も含まない。

本発明の別の態様は、式ＩＩ：

ＩＩ
［ここで、ＩＩは少なくとも75％が5Z,9E,13E-配置である］
で示される合成された5-cis異性体化合物に関する。幾つかの実施形態では、本発明は、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％が5E,9E,13E-配置である式ＩＩの化合物を提供する。本発明の幾つかの態様では、式ＩＩの化合物はＧＧＡのいかなるtrans異性体も含まない。

化合物の立体配置は、キラル分光法、核磁気共鳴分光法など、当業者に公知の方法によって決定することができる。

実施例に含まれるデータは、低濃度で、ＧＧＡのトランス異性体が薬理学的に活性であり、用量依存的な関係を示すことを示している。対照的に、ＧＧＡのcis異性体は、用量依存的関係は示さず、活性はせいぜい最小限度のものであると考えられる。

３．医薬組成物
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの製薬的に許容し得る添加剤および本発明のＧＧＡのトランス異性体化合物の有効量を含有する医薬組成物に関する。

医薬組成物は、種々の投与経路のために処方することができる。おそらく経口投与に適した組成物が最も頻繁に使用されるが、静脈内、動脈内、肺、直腸、鼻腔、膣、舌、筋肉内、腹腔内、皮内、経皮、頭蓋内、および皮下経路などの他の投与経路も用いることができる。他の剤形としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、エアロゾル剤、坐剤、注射剤、ならびに懸濁液、溶液および乳液を含む経口用液剤が挙げられる。徐放性剤形もまた、例えば経皮パッチの形で使用し得る。当技術分野で標準的である方法を用いてすべての剤型を調製することができる（Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th ed., A. Oslo editor, Easton Pa. 1980を参照）。

本願組成物は、一般的に、ＧＧＡまたはＧＧＡのトランス異性体化合物、またはその混合物を、少なくとも１つの製薬的に許容し得る添加剤と組み合わせてなる。許容し得る添加剤は、非毒性で、投与を支援するものであり、本発明の化合物の治療上の利益に悪影響を及ぼさないものである。このような添加剤は、一般に当業者に利用可能な、任意の固体、液体、半固体、またはエアゾール組成物の場合は気体の添加剤であってよい。本発明の医薬組成物は、当分野で公知の方法を用いて慣用の方法により調製される。

本明細書に開示される組成物は、医薬調製物に一般に用いられる任意のビークルや添加剤、例えば、タルク、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性又は非水性の溶剤、油、パラフィン誘導体、グリコール類など、と組み合わせて用いることができる。特に経口投与用の組成物では、着色剤や香料も調製物に添加してもよい。溶液剤は、水、またはエタノール、1,2−プロピレングリコール、ポリグリコール、ジメチルスルホキシド、脂肪アルコール、トリグリセリド、グリセリンの部分エステル等の生理学的に適合し得る有機溶媒を用いて調製することができる。

固体の製薬的添加剤としては、デンプン、セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルクなどが挙げられる。液体および半固体の添加剤は、グリセリン、プロピレングリコール、水、エタノール、及び石油、動物、植物または合成由来のものを含む種々の油（例えば、ピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）から選択することができる。

添加剤の濃度は、当業者によって効果的であると容易に判断することができるものであり、使用される具体的な添加剤に応じて変えることができる。溶液中の添加剤の総濃度は、約0.001％〜約90％または約0.001％〜約１0％とすることができる。

本発明の特定の実施形態では、式Ｉの化合物及びα−トコフェロールを含んでなる医薬組成物を提供する。関連する実施形態は、式Ｉの化合物、α−トコフェロールおよびヒドロキシプロピルセルロースを含有する医薬組成物を提供する。別の実施形態では、式Ｉの化合物、α−トコフェロールおよびアラビアゴムを含有する医薬組成物を提供する。さらなる実施形態では、式Ｉの化合物およびアラビアゴムを含有する医薬組成物を提供する。関連する実施形態では、式Ｉの化合物、アラビアゴムおよびヒドロキシプロピルセルロースを含有する医薬組成物を提供する。

α−トコフェロールを単独でまたは他の添加剤と組み合わせて用いる場合、その濃度は重量ベースで約0.001重量％〜約１重量％、または約0.001重量％〜約0.005重量％、または約0.005重量％〜約0.01重量％、または約0.01重量％〜約0.015重量％、または約0.015重量％〜約0.03重量％、または約0.03重量％〜約0.05重量％、または約0.05重量％〜約0.07重量％、または約0.07重量％〜約0.1重量％、または約0.1重量％〜約0.15重量％、または約0.15重量％〜約0.3重量％、または約0.3重量％〜約0.5重量％、または約0.5重量％〜約１重量％重量であり得る。いくつかの実施形態では、α−トコフェロールの濃度は、約0.001重量％、あるいは約0.005重量％、または約0.008重量％、または約0.01重量％、または約0.02重量％、または約0.03重量％、または約0.04重量％、または約0.05重量％である。

ヒドロキシプロピルセルロースを単独でまたは他の添加剤と組み合わせて用いる場合、その濃度は重量ベースで約0.1重量％〜約30重量％、または約１重量％〜約２０重量％、または約１重量％〜約５重量％、または約１重量％〜約１０重量％、または約２重量％〜約４重量％、または約５重量％〜約１０重量％、または約１０重量％〜約１５重量％、または約１５重量％〜約２０重量％、または約２０重量％〜約２５重量％、または約２５重量％〜約３０重量％であり得る。いくつかの実施形態では、ヒドロキシプロピルセルロースの濃度は、約１重量％、あるいは約２重量％、または約３重量％、または約４重量％、または約５重量％、または約６重量％、または約７重量％、または約８重量％、または約１０重量％または約１５重量％である。

アラビアゴムを単独でまたは他の添加剤と組み合わせて用いる場合、その濃度は重量ベースで約0.５重量％〜約５０重量％、または約１重量％〜約２０重量％、または約１重量％〜約１０重量％、または約３重量％〜約６重量％、または約５重量％〜約１０重量％、または約４重量％〜約６重量％であり得る。いくつかの実施形態では、ヒドロキシプロピルセルロースの濃度は、約１重量％、あるいは約２重量％、または約３重量％、または約４重量％、または約５重量％、または約６重量％、または約７重量％、または約８重量％、または約１０重量％または約１５重量％である。

ＧＧＡまたはtrans-ゲラニルゲラニルアセトン異性体の濃度は、本明細書で提供される医薬組成物中、約１重量％〜９９重量％であり得る。他の実施形態では、trans-ゲラニルゲラニルアセトン異性体の濃度は、約１重量％〜約７５重量％、あるいは約１重量％〜約４０重量％、または約１重量％〜約３０重量％、または約１重量％〜約２５重量％、または約１重量％〜約２０重量％、または約２重量％〜約２０重量％、または約１重量％〜約１０重量％、または約１０重量％〜約２０重量％、または約１０重量％〜約１５重量％であり得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物中のゲラニルゲラニルアセトンの濃度は、約５重量％、または約１０重量％、または約２０重量％、または約１重量％、または約２重量％、または約３重量％、または約４重量％、または約６重量％、または約７重量％、または約８重量％、または約９重量％、または約１１重量％、または約１２重量％、または約１４重量％、または約１６重量％、または約１８重量％、または約２２重量％、または約２５重量％、または約２６重量％、または約２８重量％、または約３０重量％、または約３２重量％、または約３４重量％、または約３６重量％、または約３８重量％、または約４０重量％、または約４２重量％、または約４４重量％、または約４６重量％、または約４８重量％、または約５０重量％、または約５２重量％、または約５４重量％、または約５６重量％、または約５８重量％、または約６０重量％、または約６４重量％、または約６８重量％、または約７２重量％、または約７６重量％、または約８０％重量％である。

一実施形態では、本発明は、有効量のＧＧＡを含有する薬物デポー剤またはパッチ剤等の徐放製剤を提供する。別の実施形態では、パッチ剤はさらに、α−トコフェロールの存在下、アラビアゴムまたはヒドロキシプロピルセルロースを別個にまたは組み合わせて含有してなる。好ましくは、ヒドロキシプロピルセルロースは、１０，０００〜１００，０００の平均分子量を有する。さらに好ましい実施形態では、ヒドロキシプロピルセルロースは、５，０００〜５０，０００の平均分子量を有する。様々な実施形態において、パッチ剤は、ＧＧＡ（好ましくはその5E,9E,13E-異性体）を、血漿中ＧＧＡの治療上有効な量を１２時間維持するのに十分な量含有する。一実施形態では、ＧＧＡは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が5E,9E,13E-異性体であるＧＧＡを含んでなる。

本発明の化合物および医薬組成物は、単独で、または他の化合物と組み合わせて用いることができる。他の薬剤とともに投与する場合、その共投与については、両者の薬理学的効果が患者において同時に現れる任意のやりかたが可能である。したがって、共投与は、本発明の化合物と他の薬剤の両者の投与に際し、単一の医薬組成物、同一の剤型、または同一の投与経路を用いる必然性も、あるいは、この２つの薬剤をまさに同時に投与する必然性もない。しかしながら、共投与は、同一の剤型、同一の投与経路により、実質的に同時に行うのが最も便利であろう。いうまでもなく、本発明の新規の医薬組成物において両活性成分を同時に送達することでそのような投与が最も有利に実行される。

幾つかの実施形態では、本発明の化合物は、慣用の薬物療法の補助として用いることができる。

４．治療方法
本発明は、神経細胞死の阻害するためのおよび神経活性を増大するための、ＧＧＡ、好ましくはtrans-ＧＧＡ、さらに好ましくは合成されたtrans-ＧＧＡ、またはそれら各々の異性体、の使用方法を提供する。例えば、本発明は、ゲラニルゲラニルアセトン（GGA）化合物を用いて、神経変性疾患又は傷害の進行を遅らせるための方法を提供するが、これには限定されない。上記の医薬組成物および／または化合物は、本明細書に記載した方法において有用である。

一態様では、ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させることにより該ニューロンの軸索成長を増大する方法を提供する。神経疾患は、ニューロン間のシグナル伝達の障害をもたらし得る。これは、部分的には、軸索投射の形成が減少することに起因する。ニューロンとＧＧＡとの接触は軸索成長を増大させる。ＧＧＡは、神経疾患を患っているニューロンにおいて軸索成長を回復すると考えられる。関連する実施形態では、接触前のニューロンは軸索成長の能力の減少を示す。さらに別の実施形態では、本願のＧＧＡは、ＧＧＡの5-trans異性体である。

方法には、ＧＧＡの使用およびＧＧＡの5-trans異性体の使用が含まれる。ある特定の態様では、ＧＧＡの5-trans異性体は、ＧＧＡの5-transおよび5-cis異性体の混合物よりも有効であることが示されている。特定の理論に限定されないが、ＧＧＡの5-cis異性体は阻害特性を有すると考えられる。ＧＧＡの5-cis異性体のこれらの阻害特性は、異性体混合物や5-transＧＧＡの組成物によってもたらされる効果の減弱をもたらす。

本発明の一実施形態は、神経細胞死になりやすいニューロンの細胞死を阻害するための方法であって、該ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させることを含んでなる方法に関する。神経細胞死になりやすいニューロンとしては、神経変性疾患の特徴を有するものおよび／または外傷または毒性ストレスを受けているものが挙げられる。細胞に対して毒性ストレスを生じさせる方法の１つは、ドーパミンを神経芽腫細胞等のニューロンと混合することによるものである。毒性ストレスの別の供給源は、酸化的ストレスである。酸化的ストレスは神経疾患または外傷により起こりうる。ニューロンをＧＧＡと接触させることにより、MＴＴアッセイまたは当業者に慣用の他の技術により測定されるニューロンの死が阻害されると考えられる。

別の態様では、ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させることにより該ニューロンの神経突起成長を増大する方法を提供する。
用語「神経突起」とは軸索と樹状突起の両方を意味する。神経疾患は、ニューロン間のシグナル伝達の障害をもたらし得る。これは、部分的には、軸索および／または樹状突起の投射の成長が減少することに起因する。ニューロンをＧＧＡと接触させることにより神経突起の成長が増大すると考えられる。ＧＧＡは、神経疾患を患っているニューロンにおいて神経突起の成長を回復すると考えられる。関連する実施形態では、接触前のニューロンは神経突起の成長能の減少を示す。さらに別の実施形態では、本願のＧＧＡは、ＧＧＡの5-trans異性体である。

本発明の一実施形態は、ニューロンからの１またはそれ以上の神経伝達物質の発現および／または放出を増大させるための方法であって、該ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させることを含んでなる方法に関する。ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させることにより１またはそれ以上の神経伝達物質の発現レベルが増大すると考えられる。また、ニューロンをＧＧＡと接触させることによりニューロンからの１またはそれ以上の神経伝達物質の放出が増大すると考えられる。１またはそれ以上の神経伝達物質のこの放出は、それによって１またはそれ以上の神経伝達物質を含有する分泌ビークルが、その神経伝達物質をニューロンの外に向かわせる細胞膜と融合する、細胞外放出プロセスを指す。神経伝達物質の発現および／または放出の増大は、さもなければ神経伝達物質の発現又は放出のレベルが疾患に起因して減少するニューロンにおいて、シグナル伝達の増大につながると考えられる。それらの発現及び放出の増大は、当分野において一般に知られている分子技術によって測定することができる。

本発明の一実施形態は、ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させることによりニューロンのシナプス形成を誘導する方法に関する。シナプスは２つのニューロン間の接合である。シナプスはニューロンの機能に不可欠であり、ある１つのニューロンから隣のニューロンへのシグナルの伝達を可能にする。したがって、神経のシナプスの増大は、２またはそれ以上のニューロン間のシグナル伝達の増大につながる。ニューロンと有効量のＧＧＡとの接触により、さもなければ神経疾患の結果としてシナプス形成の減少を経験するニューロンにおいて、シナプス形成を増大すると考えられる。

本発明の別の実施形態は、ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させることによりニューロンの電気興奮性を増大する方法に関する。電気的興奮は、２またはそれ以上のニューロン間の情報伝達の一形態である。ニューロンと有効量のＧＧＡとの接触により、さもなければ電気的興奮及び他の神経情報伝達の手段が神経疾患に起因して障害を受けるようなニューロンの、電気的興奮を増大すると考えられる。電気的興奮は、当業者に一般に知られている電気生理学的方法によって測定することができる。

上記３つの段落のそれぞれにおいて、ＧＧＡの投与はニューロン間の情報伝達を増大し、したがって、認知症の危険性のあるまたは初期のもしくは部分的な認知症を患っている哺乳類において、認知技能を保持しつつ、認識能力の損失を阻害する方法を提供する。哺乳類における初期のまたは部分的な認知症は、その哺乳類が、依然としてある程度の認知技能を有しているが、その技能が時間とともに失われるおよび／または衰えるというものである。方法は、有効量のＧＧＡをその患者に投与することを含んでなる。

別の実施形態では、本発明は、病原性のタンパク質凝集体のニューロン間、ニューロン外またはニューロン内での形成又はさらなる形成に起因するニューロンの死を阻害するための方法であって、該病原性のタンパク質凝集体を生じるリスクのあるニューロンを、タンパク質凝集体の形成を阻害する有効量のＧＧＡＧＧＡと接触させることを含んでなり、該病原性のタンパク質凝集体がSBMAに関連するものでない、方法に関する。本発明の一実施形態では、病原性のタンパク質凝集体は、ニューロン間またはニューロンの外で形成する。本発明の別の実施形態では、病原性のタンパク質凝集体は、ニューロンの内側で形成する。本発明の一実施形態では、病原性のタンパク質凝集体は、細胞に対する毒性ストレスの結果である。細胞に対して毒性ストレスを生じさせる方法の１つは、ドーパミンを神経芽腫細胞等のニューロンと混合することによるものである。ニューロンをＧＧＡと接触させることにより、MTTアッセイまたは当業者に一般的に知られている他の技術により測定されるそれらニューロンの死が阻害されると考えられる。

本発明の別の実施形態は、病原性の細胞外のタンパク質凝集体からニューロンを保護する方法であって、該ニューロンおよび／または該病原性のタンパク質凝集体を、さらなる病原性のタンパク質凝集を阻害する有効量のＧＧＡと接触させることを含んでなる方法に関する。本発明の一実施形態では、該ニューロンおよび／または該病原性のタンパク質凝集体と有効量のＧＧＡとの接触によって、病原性のタンパク質凝集体が非病原性の形態に変化する。いかなる理論にも限定されないが、ニューロンおよび／または病原性のタンパク質凝集体とＧＧＡとの接触により、細胞間、細胞外または細胞内に存在する病原性のタンパク質凝集体の少なくとも一部分が可溶化すると考えられる。さらに、ニューロンおよび／または病原性のタンパク質凝集体とＧＧＡとの接触により、病原性のタンパク質凝集体が、非病原性になるよう変化すると考えられる。タンパク質凝集体の非病原性の形態は、ニューロンの死または損失に寄与しない形態である。培養細胞においてあるいは哺乳動物においてニューロンの保護を測定するための当業者に知られている多くのアッセイが存在する。その一例として、MTTアッセイにより、増大した細胞の生存の測定が挙げられる。さらなる例としては、細胞死の指標となる分子（例えばカスパーゼまたはヨウ化プロピジウム等）に関してニューロンをin vitroまたはin vivoで免疫染色することによる方法が挙げられる。

本発明のさらに別の実施形態では、病原性の細胞内タンパク質凝集体からニューロンを保護するための方法であって、該ニューロンを、さらなる病原性のタンパク質凝集を阻害する量のＧＧＡと接触させることを含んでなる方法（但し、該タンパク質凝集はＳＢＭＡと関連するものではない）を提供する。本方法は、病原性タンパク質凝集が細胞内である神経疾患またはタンパク質凝集がＳＢＭＡに関連する疾患の、弊害を阻害または減少することを意図するものではない。ＳＢＭＡは、病原性のアンドロゲン受容体タンパク質の蓄積によって引き起こされる疾患である。ＳＢＭＡの病原性のタンパク質凝集体はポリグルタミンを含んでおり、また核内に形成するため、本願において言及する神経疾患とは区別される。また、タンパク質凝集体はアンドロゲン受容体タンパク質の蓄積により形成するので、本願において記載する神経疾患とは区別される。ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させることにより、病原性のタンパク質凝集体が非病原性の形態に変わると考えられる。

本発明の一実施形態は、ニューロンにおけるＧタンパク質の活性を調節するための方法であって、該ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させることを含んでなる方法に関する。ニューロンとＧＧＡを接触させると、細胞内での局在に変化が生じ、細胞におけるＧタンパク質の活性が変わると考えられる。本発明の一実施形態では、ニューロンとＧＧＡとの接触により、ニューロンにおけるＧタンパク質の活性が増大する。ＧＧＡをニューロンと接触させることにより、Ｇタンパク質の発現レベルが増大すると考えられる。また、ＧＧＡをニューロンと接触させることで、Ｇタンパク質の細胞内の局在が、生物学的活性が発揮される細胞膜へと変化することにより、Ｇタンパク質の活性が増大すると考えられる。

本発明の一実施形態は、細胞死のリスクのあるニューロンにおけるＧタンパク質の活性を調節または増大する方法であって、該ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させる方法に関する。ニューロンはＡＬＳに関連した遺伝子変化の結果として細胞死のリスクがあり得る。そのような遺伝子変異の１つに、ＴＤＰ−４３タンパクの枯渇がある。ＴＤＰ−４３が枯渇したまたはＡＬＳに伴う他の遺伝子変異を有するニューロンは、ＧＧＡと接触させた後にＧタンパク質の活性が増大又は変化すると考えられる。さらに、ＧＧＡは、Ｇタンパク質の細胞内の局在を、生物学的活性が発揮される細胞膜へと変化させることにより、これらの細胞におけるＧタンパク質の活性の増大をもたらすと考えられる。

本発明のさらなる実施形態は、６−アミロイドペプチドの神経毒性を有効量のＧＧＡにより阻害するための方法に関する。本発明の一実施形態では、β−アミロイドペプチドは、ニューロン間またはニューロンの外に存在する。本発明のさらなる実施形態では、β−アミロイドペプチドは、β−アミロイド斑の一部である。ニューロンをＧＧＡと接触させることにより、β−アミロイドペプチドの少なくとも一部の可溶化をもたらし、それにより神経毒性が減少すると考えられる。さらに、ＧＧＡは、β−アミロイドペプチドを細胞に対してもはや毒性とはならないよう変化させることによって、その毒性を減少すると考えられる。さらに、ＧＧＡは、ニューロンにおいて熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）の発現を誘導すると考えられる。また、ＨＳＰは、グリア細胞等の支持細胞において誘導されると考えられる。ニューロンまたはグリア細胞において誘導された熱ショックタンパク質は、細胞外に輸送され細胞外タンパク質凝集体を溶解するように作用し得る。細胞の生存は、当業者に一般に知られている標準的なアッセイ法によって測定することができる。細胞の生存を測定するためのそのようなアッセイ法の一例は、ＭＴＴアッセイである。別の例としては、ＭＴＳアッセイがある。タンパク質凝集の調節は、当業者に一般に知られている免疫染色または組織学的染色法により可視化することができる。

本発明の一実施形態は、神経疾患を患っている哺乳類において、神経細胞死を阻害し、神経活性を増大するための方法であって、該神経疾患の病因が、ニューロンに対して病原性であるタンパク質凝集体の形成を含んでなり、さらなる病原性のタンパク質凝集を阻害する量のＧＧＡを該哺乳類に投与することを含んでなる方法に関する。本方法は、病原性タンパク質凝集が細胞内である神経疾患またはタンパク質凝集がＳＢＭＡに関連する疾患における神経細胞死を阻害し神経活性を増大することを意図するものではない。

ＡＤやＡＬＳなどの神経疾患は、神経細胞の細胞質内か、または２またはそれ以上の神経細胞間の細胞外の空間でのタンパク質凝集という共通の特徴を有する。本発明は、タンパク質凝集体の形成を阻害するためのまたは病原性のタンパク質凝集体を非病原性の形態に変えるための、ＧＧＡ化合物の使用方法に関する。このことにより、これら神経疾患に伴う症状の幾つかは減弱すると考えられる。

一実施形態では、哺乳類は神経疾患を患っているヒトである。本発明の一実施形態では、阻害または減少される神経疾患の弊害とはＡＬＳのことである。ＡＬＳは、運動ニューロンの機能の損失によって特徴付けられる。この結果、筋肉の運動が制御不能になる。ＡＬＳは、核内のタンパク質凝集を一般的には示さない神経変性疾患である。ＧＧＡは、核内ではなく、またＳＢＭＡに関連するものでもなく、細胞外での、または細胞内の細胞質での、タンパク質凝集を予防または阻害すると考えられる。さらに、ＧＧＡは、病原性のタンパク質凝集体を非病原性に変えると考えられる。ＡＬＳを診断する方法は当業者に一般に知られている。さらに、ＡＬＳを診断するための方法を記載した数多くの特許が存在する。これらには、米国特許第5851783号や同第7356521号が挙げられ、いずれもその内容の全体が本明細書の一部を構成する。

本発明の一実施形態では、阻害または減少される神経疾患の弊害とはＡＤのことである。ＡＤは、核内のタンパク質凝集を一般的には示さない神経変性疾患である。ＧＧＡは、細胞外または細胞内のタンパク質凝集体の形成を予防または阻害すると考えられる。さらに、ＧＧＡは、病原性のタンパク質凝集体を非病原性に変えると考えられる。ＡＤを診断する方法は当業者に一般に知られている。さらに、ＡＤを診断するための方法を記載した数多くの特許が存在する。これらには、米国特許第6130048号や同第6391553号が挙げられ、いずれも本明細書の一部を構成する。

別の実施形態では、哺乳類は、マウス等の実験動物である。本発明の一実施形態では、神経疾患はＡＬＳである。ＡＬＳに関するマウスモデルの１つに、Ｓｏｄ１遺伝子変異を有するトランスジェニックマウスがある。ＧＧＡは、変異Ｓｏｄ１遺伝子を有するマウスに投与した場合、運動技能および体重を増大すると考えられる。さらに、ＧＧＡをこのマウスに投与すると、Ｓｏｄ１変異マウスの生存率が増大すると考えられる。運動技能は、当業者に一般に知られている標準的な技術によって測定することができる。本発明のさらに別の実施形態では、神経疾患はＡＤである。ＡＤに関するトランスジェニックマウスの一例としては、ＡＰＰ（アミロイドβ前駆体タンパク質）を過剰発現するマウスがある。ＧＧＡをトランスジェニックＡＤマウスに投与することにより、そのマウスの学習および記憶技能が改善すると考えられる。また、ＧＧＡは、β−アミロイドペプチドおよび／またはニューロン内、ニューロン間もしくはニューロン外に見られる斑の、量および／またはサイズを減少すると考えられる。β−アミロイドペプチドまたは斑は、免疫染色または他の染色技術により、組織切片において可視化することができる。

本発明の一実施形態では、ＧＧＡの哺乳類への投与は、存在している病原性のタンパク質凝集体を非病原性の形態に変える。本発明の別の形態では、哺乳類へのＧＧＡの投与は、病原性のタンパク質凝集体が形成するのを防ぐ。

本発明の別の態様は、治療上有効量のＧＧＡを投与することを含んでなり、それにより発作が減少する、そのような処置を必要とする哺乳類において発作を減少させるための方法に関する。発作の減少は、発作の回数および／または重篤度を減少させることを意味する。一実施形態では、発作はてんかん性発作である。別の実施形態では、本発明の方法は、てんかん性発作での神経細胞死を予防する。発作の重篤度は当業者によって測定することができる。

本明細書に記載した方法において、ＧＧＡは、cis異性体、trans異性体またはＧＧＡの混合物の、上記の化合物および／また医薬組成物を意味する。そのような方法において、trans異性体は、混合物またはcis異性体と比較して、より効果的な結果を示し得る。cis異性体の阻害効果は、上記の方法における混合物またはtrans異性体の効果を減弱させるために用いることが可能であると考えられる。したがって、各方法の一実施形態では、用いるＧＧＡはＧＧＡのtrans異性体である。さらに別の実施形態では、使用するＧＧＡは、ＧＧＡのcis異性体である。さらに別の実施形態では、本願の方法は、ニューロンを有効量の5-cis異性体と接触させて、混合物又は5-trans異性体の効果を減弱させることを含んでなる。

ある特定の態様では、本明細書に記載した方法は、ＧＧＡまたは異性体化合物またはＧＧＡの組成物のin vitroでの投与に関する。他の態様では、投与はin vivoである。さらに別の態様では、in vivoの投与は哺乳類への投与である。哺乳類としては、ヒトおよび一般的な実験動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ネコおよびウサギ）が挙げられるがこれに限定されない。

５．合成方法
本発明は１またはそれ以上の以下の工程を含んでなる合成方法を提供する：
（ｉ）式ＩＩＩ

ＩＩＩ
の化合物をハロゲン化条件下で反応させて式ＩＶ

ＩＶ
の化合物を得ること；
（ｉｉ）式ＩＶの化合物をアルキルアセトアセテートとアルキル化条件下で反応させて式Ｖ

Ｖ
の化合物（立体中心での立体化学がラセミ体、即ちＲまたはＳ配置であってよい）を得ること；
（ｉｉｉ）加水分解および脱カルボキシル化条件下、式Ｖの化合物を反応させて式ＶＩ

ＶＩ
の化合物を得ること；
（ｉＶ）オレフィン化条件下、式ＶＩの化合物を式ＶＩＩ

ＶＩＩ
［式中、Ｒ₂及びＲ₃はそれぞれ独立してアルキル又は置換もしくは置換されていないアリールである］
の化合物と反応させて式ＶＩＩＩ

ＶＩＩＩ
の化合物を選択的に得ること；
（ｖ）式ＶＩＩＩの化合物を還元条件下で反応させて式ＩＸ

ＩＸ
の化合物を得ること。

化合物ＩＩＩは、典型的には不活性な溶媒中、少なくとも等モル量のハロゲン化剤と混合する。本願において用いられる「不活性な溶媒」は、それが溶媒として用いられる反応条件下では反応しない溶媒である。反応は、典型的には、約０℃〜２０℃の温度にて、反応が実質的に完結するのに十分な時間行う。適当な溶媒としては、ジエチルエーテル、アセトニトリル等が挙げられるが、これらは単なる一例に過ぎない。適当なハロゲン化剤としては、PBr₃またはPPh₃/CBr₄が挙げられる。反応が完結した後、得られた生成物、化合物ＩＶを、抽出、沈殿、濾過、クロマトグラフィー等の慣用の条件下で回収することができる、あるいは精製および／または単離することなく次の反応工程において用いることができる。

化合物ＩＶは、塩基と不活性な溶媒の存在下、少なくとも等モル量のアルキルアセトアセテートと混合する。反応は、典型的には最初は０℃で、そして次いで反応が実質的に完結するのに十分な時間をかけて室温にまで上昇させる。適当な溶媒としては、エタノール等の種々のアルコール、ジオキサンおよびそれらの混合物が挙げられるが、これらは単なる一例に過ぎない。適当な塩基としては、ナトリウムエトキシド等のアルカリ金属アルコキシドが挙げられるが、これらは単なる一例にすぎない。

化合物Ｖは、少なくとも等モル量、好ましくは過剰量のアルカリ水溶液と反応させる。反応は、典型的には、約４０℃〜８０℃、好ましくは約８０の温度にて、反応が実質的に完結するのに十分な時間行う。適当な溶媒としては、メタノール、エタノール等の種々のアルコールが挙げられるが、これらは単なる一例に過ぎない。

化合物ＶＩは、不活性な溶媒中、少なくとも等モル量の、好ましくは過剰量の式ＶＩＩの化合物、および少なくとも等モル量の、好ましくは過剰量の塩基と混合する。反応は、典型的には最初は約−３０℃で１〜２時間、次いで室温にて反応が実質的に完結するのに十分な時間行う。適当な溶媒としては、テトラヒドロフラン、ジオキサン等が挙げられるが、これらは単なる一例に過ぎない。適当な塩基としては、水素化ナトリウム、カリウムヘキサメチルジシラジド（KHMDS）、またはカリウムtert-ブトキシド（tBuOK）等のアルカリ金属水素化物等が挙げられるが、これらは単なる一例に過ぎない。

化合物ＶＩＩＩは、不活性な溶媒中、還元剤と混合する。反応は、典型的には約０℃で約１５分間、そして室温にて反応が実質的に完結するのに十分な時間行う。適当な還元剤としては、ＬｉＡｌＨ₄が挙げられるがこれに限定されない。適当な溶媒としては、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等が挙げられるが、これらは単なる一例に過ぎない。

当業者には明かであるが、反応が完結した後、得られた生成物は、沈殿、濾過、クロマトグラフィー等の慣用の条件下で回収することができる、あるいは精製および／または単離することなく次の反応工程において用いることができる。

幾つかの実施形態では、本願の方法はさらに、式ＶＩＩＩの化合物に対して、工程（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）をこの順番に繰り返し、ｍが２である式Ｉの化合物を得ることを含んでなる。

I

別の実施形態では、本願の方法または手順は、さらに工程（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）をこの順番に１〜３回繰り返すことを含んでなる。

合成方法の別の態様では、以下の工程の１またはそれ以上を含んでなる方法を提供する：
（ｉ）式ＩＩＩＢ

ＩＩＩＢ
［式中、ｍは１〜３である］
の化合物をハロゲン化条件下で反応させて式ＩＶＢ

ＩＶＢ
の化合物を得ること；
（ｉｉ）式ＩＶＢの化合物をアルキルアセトアセテートとアルキル化条件下で反応させて式ＶＢ：

ＶＢ
［式中、Ｒ₁は置換されているまたは置換されていないアルキルである］
の化合物（立体中心での立体化学がラセミ体、即ちＲまたはＳ配置であってよい）を得ること；
（ｉｉｉ）加水分解および脱カルボキシル化条件下、式ＶＢの化合物を反応させて式ＶＩＢ

ＶＩＢ
の化合物を得ること。

その合成方法の別の態様では、本発明は、工程（ｉ）または工程（ｉｉ）または工程（ｉ）＋（ｉｉ）を含んでなる方法を提供する：
（ｉ）式ＸＣ：

ＸＣ
の化合物を、アルキル化条件下でアルキルアセトアセテートと反応させて式ＸＩＣ：

ＸＩＣ
［式中、Ｒ₁は上記と同意義である］
の化合物（立体中心での立体化学がラセミ体、即ちＲまたはＳ配置であってよい）を得ること；
（ｉｉｉ）加水分解および脱カルボキシル化条件下、式ＸＩＣの化合物を反応させて式ＩＩ：

ＩＩ
の化合物を得ること。
当業者には明らかなように、上記記載に従い、化合物ＶＩＢまたは５Ｚ異性体を得るための様々な反応工程が行われる。

合成方法の別の態様では、本発明は、式ＸＩＩ：

ＸＩＩ
［式中、Ｒ₅はそれぞれ独立にＣ₁−Ｃ₆アルキルであるか、または２つのＲ₅基がそれらが結合している酸素原子と一緒になって、場合により１〜３の、好ましくは１〜２のＣ₁−Ｃ₆アルキル基で置換されていてもよい５または６員環を形成する］
のケタール化合物を、加水分解条件下で反応させて式ＩＩの化合物を得ることを含んでなる。

ケタール化合物は、不活性な溶媒中、少なくとも触媒量の、例えば１〜２０モル％の、水溶性の酸、好ましくは水溶性の鉱酸と混合する。反応は、典型的には、約２５℃〜約８０℃の温度にて、反応が実質的に完結するのに十分な時間行う。適当な酸としては、塩酸、硫酸等があげあれるが、これらに限定されない。適当な溶媒としては、メタノール、エタノール等のアルコール、テトラヒドロフラン等が挙げられる。

別の態様では、本発明は、式ＸＩ：

ＸＩ
で示される化合物を、加水分解次いで脱カルボキシル化の条件下で反応させて、式Ｉ

Ｉ
で示される化合物を形成することを含んでなる方法を提供する。

あるいは、式ＶＩＩの化合物をＸと反応させた後、化合物のin situでの加水分解および脱カルボキシル化により、式Ｉの化合物を得ることができる。

別の実施形態では、本発明は、式ＸＩＣ：

ＸＩＣ
で示される化合物を、加水分解次いで脱カルボキシル化の条件下で反応させて式ＩＩ：

ＩＩ
で示される化合物を形成することを含んでなる方法を提供する。
これらの方法において有用な、加水分解および脱カルボキシル化の条件は、本願明細書の開示を読めば当業者には明かであろう。

さらに、本願方法が、クロマトグラフィー、蒸留または結晶化等の方法にしたがって、化合物を単離するための慣用の分離または精製工程をさらに採用することは当業者には明かであろう。

６．有用性
ＧＧＡは、市販されており臨床現場で用いられている抗潰瘍薬として知られている。ＧＧＡはまた、眼、脳、心臓等、様々な器官に対する細胞保護作用を示すことが示されている（例えば、Ishii Y., et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 2003; 44:1982-92; Tanito M, et al., J Neurosci 2005; 25:2396-404; Fujiki M, et al., J Neurotrauma 2006; 23:1164-78; Yasuda H, et al., Brain Res 2005; 1032:176-82; Ooie T, et al., Circulation 2001; 104:1837-43; and Suzuki S, et al., Kidney Int 2005; 67:2210-20を参照）。

ある特定の場合では、細胞保護効果を発揮するのに必要なＧＧＡの濃度は、６００ｍg／ｋg／日を超える過剰量である（Katsuno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100,2409-2414）。Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100,2409-2414). ＧＧＡのtrans異性体は、ＧＧＡの１：２〜１：３のcis：trans混合物の組成物、およびＧＧＡのcis異性体単独の組成物と比較して低い濃度で、より効果的であることが示された。したがって、ＧＧＡのtrans異性体は、cis異性体または１：２〜１：３のcis：trans混合物よりも低い濃度で、細胞に対する細胞保護効果を発揮するのに有用である。以下に例示するように、意外にも、増加下量のcis異性体は、trans異性体の活性を中和することが分かった。

ＧＧＡの異性体混合物および／またはＧＧＡの5-trans異性体を含有する組成物は、神経疾患を患っている哺乳類において、神経細胞死を阻害し、神経活性を増大するのに用いることができると考えられ、該神経疾患の病因がニューロンに対して病原性のタンパク質凝集体の形成を含んでなり、該方法は、神経細胞死を阻害し神経活性を増大する、または神経疾患の進行を遅らせる、ＧＧＡの量を該哺乳類に投与することを含んでなる。ＧＧＡの異性体混合物と関連するが、本方法は、病原性タンパク質凝集が核内である神経疾患またはタンパク質凝集がＳＢＭＡに関連する疾患の弊害を阻害または減少することを意図するものではない。

本発明のＧＧＡおよびＧＧＡの5-trans異性体によって阻害または減少される神経疾患の弊害としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群などのプリオン病、筋萎縮性側索硬化症、または脊髄の損傷が挙げられるがこれらに限定されない。ＧＧＡおよびＧＧＡの5-trans異性体はまた、てんかん性発作での神経細胞死を防止すると考えられる。

７．アッセイ
本明細書に記載された、単離されたcisおよびtrans化合物はまた、細胞保護効果が推定される化合物を評価するアッセイにおいて有用である。特に、そのようなアッセイにおいて、ＧＧＡのcis異性体はベースラインまたはネガティブコントロールとして、trans異性体はポジティブコントロールとして考えられる。推定される化合物は実施例１０に記載したアッセイにおいて試験し、その活性をcis-およびtrans-異性体に対して相関させた。trans異性体と同様またはそれ以上の活性を示す化合物を活性な化合物であるとする。cis異性体と同様の活性を示す化合物を不活性な化合物であるとする。したがって、cis−異性体は本アッセイにおけるネガティブコントロールとして有用性を有する。

８．本発明の実施例
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態の説明を目的に記載するものであって、本発明のいかなる限定も意図するものではない。本実施例は、本明細書に記載する方法と併せて、好ましい実施形態の現時点での代表例、典型例であり、本発明の範囲に対する限定を意図するものではない。ここに記載した事項に対する変更や特許請求の範囲によって定義される発明の精神に包含されるその他の用途は当業者が想到するものである。

以下の実施例、ならびに本願明細書の全体にわたって、以下の略語は下記の意味を有する。定義がされていなければ、その用語は、一般に認識されている意味を有する。
℃＝摂氏温度
ＰＢｒ₃＝三臭化リン
ＥＥ＝エチルエーテル
ＥｔＯＨ＝エタノール
ＮａＯＥｔ＝ナトリウムエトキシド
Ｏｅｔ＝エトキシド
Ｎ＝規定度
ＫＯＨ＝水酸化カリウム
ａｑ＝水性
ｈ＝時間
ＲＴ＝室温
ＬＡＨ＝水素化アルミニウムリチウム
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ｍｉｎ＝分
Ｅｔ＝エチル
ＭｅＯＨ＝メタノール
ＮａＨ＝水素化ナトリウム
ＯＮ＝一晩
Ｅまたは（Ｅ）＝トランス
Ｚまたは（Ｚ）＝シス
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー
ＧＧＡ＝ゲラニルゲラニルアセトン
μＬ＝マイクロリットル
ｍＬ＝ミリリットル
ＰＫ＝解離定数Ｋの負の対数
ＨＰＣ＝ヒドロキシプロピルセルロース
ＤＩ＝脱イオン
Ｍｎ＝モル質量の平均数
Ａｖ＝平均
ｐ−ＴｓＯＨ＝ｐ−トルエンスルホン酸
Ｐｈ₃Ｐ＝トリフェニルホスフィン
Ｂｒ−＝臭化物イオン
ＣＢｒ₄＝テトラブロモメタン
ＬＣ−ＭＳ＝液体クロマトグラフィー質量分析法
Ｒｆ＝遅延係数
ＰＥＧ−２００＝ポリエチレングリコール
ＫＨＭＤＡ＝カリウムヘキサメチレンジアミン
ＡＣＮ＝アセトニトリル
ＴＢＤＭＳ＝ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
Ｋｐ＝ＡＵＣ_brain／ＡＵＣ_plasma比
ＡＵＣ＝曲線下面積

アッセイでのＬＣ−ＭＳパラメータ
システム：Agilent 1100 LC-MSD

パラメータ：
サンプル濃度：7.2 mg （1.44 mL DMSO中）(5mg/mL)１０μLをアセトニトリルで０．５mLに希釈(100ug/mL)
HPLC カラム：Xterra MS, C18, 50 x 2.1, 3.5 ミクロン
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：0.1％ ギ酸水溶液
移動相Ｂ：0.1％ ギ酸アセトニトリル溶液
流速：0.3 mL/分
注入量：5μL
グラジェントLC-MS：
時間(分) Ｂ(％)
０ ５
１５ １００
２５ １００
２５．１ ５
３０ ５

ＭＳパラメータ：
イオン源：エレクトロスプレー
極性：＋
質量範囲：100-1000 amu
フラグメンタ：80
ドライガス：10 l/分
ドライガス温度：350 ℃
Vcap：4000
ネブライザー圧力：35
ゲイン：5

以下に記載する反応の出発物質は一般に知られている化合物であるか又は知られている手順もしくはその自明な修飾法によって製造することができる。
例えば、出発物質の多くは、Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wis., USA), Bachem (Torrance, Calif., USA), Emka-ChemceまたはSigma (St. Louis, Mo., USA)等の商業的な供給元から入手可能である。その他についても、Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1 15 (John Wiley and Sons, 1991), Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Volumes 1 5 and Supplementals (Elsevier Science Publishers, 1989), Organic Reactions, Volumes 1 40 (John Wiley and Sons, 1991), March's Advanced Organic Chemistry, (John Wiley and Sons, 4.sup.th Edition), and Larock's Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers Inc., 1989)等の基本書に記載された手順またはその自明な修飾法によって製造することができる。

実施例１：5E,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトンの合成
5-trans異性体：5E,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン１の合成：
5-trans異性体：5E,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン１は、スキーム−１の記載にしたがって合成することができる。
スキーム１

5E,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン1の合成のための商業的に入手可能な出発材料として、2E,6E-ファルネシルアルコール3（Ｃ２とＣ６位の配置を予めトランスまたはＥとして固定）を設計し、使用した。エチルエーテル（ＥＥ）中三臭化リン（ＰＢＲ₃）またはアセトニトリル（ＡＣＮ）中Ｐｈ₃ＰとＣＢＲ₄を用い、０℃にて、2E,6E-ファルネシルアルコール3のアルコール官能基を対応する臭化物4に変換した。次いで、得られた臭化物を、カルバニオン（アセト酢酸エチル 5とナトリウムエトキシドとの反応により得た）と反応させて、目的の5E,9E-ファルネシルケトエステル6を得た。ホモログ化されたケトエステル 6を、5N KOH水溶液を用いて加水分解および脱カルボキシル化し、所望の5E,9E-ファルネシル アセトン 7を得た。ブロミド 4から対応のファルネシル アセトン 7へのワンポット変換は、中間体のケトエステル 6を単離することなく可能である。

鍵となる工程において、コンジュゲートオレフィン 8のＣ２でのオレフィンのtrans配置を生じさせるために、5E,9E-ファルネシル アセトン7とカルバニオン（(EtO)₂PO-CH₂-COOEtと水素化ナトリウム(NaH)の反応により得た）との反応を−３０℃にて行い、所望の2E,6E,10E-コンジュゲートエステル 8を得た。trans (E)配置のみを有する生成物 8の形成は、反応を−３０℃または−３０℃より低い温度で行った場合にみられ、このとき、３つのオレフィンがtrans (E)配置にセットされる(Kato et al., J. Org.Chem.1980, 45, 1126-1130 and Wiemer et al., Organic Letters, 2005, 7(22), 4803-4806参照)。Kato et al., J. Org.Chem.1980, 45, 1126-1130 and Wiemer et al., Organic Letters, 2005, 7(22), 4803-4806)。副生成物のcis- (Z)-異性体は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を注意深く行うことにより、trans-(E)異性体 8から除去／分離した。しかしながら、反応を０℃またはそれよりも高い温度で行った場合は、対応のcis-異性体(Z)の形成が増えることもみとめられた。また、8のcis (2Z)-とtrans (2E)-異性体の混合物は、カラムクロマトグラフィーによる分離を非常に注意深く行うことにより、分離できることもみとめられた。

得られた2E-コンジュゲートエステル 8を、水素化リチウムアルミニウム (LAH) により還元して対応する2E-アルコール 9を得、これを、０℃にて、エチルエーテル（EE）中三臭化リン(PBr₃)で、またはアセトニトリル（ACN）中Ph₃PとCBr₄で処理し、対応する2E,6E,10E-ゲラニルゲラニルブロミド10に変換した。さらに、カルバニオン(アセト酢酸エチル 5とナトリウムエトキシドから得た)をブロミド10と０℃にて相互作用させて、所望の2E,6E,10E-ゲラニルゲラニル ケトエステル11（5E,9E,13E-ゲラニルゲラニル アセトン 1に必要な前駆体）を得た。次いで、ケトエステル11を、5N KOH水溶液を用い、80℃にて、エステル加水分解及び脱カルボキシル化し、5E,9E,13E-ゲラニルゲラニル アセトン 1を得た。TLC Rf:0.28 (5％ 酢酸エチル（ヘキサン中）); LC 保持時間:16.68 min;
MS (m/e): 313 [M - 18 + H]+, 331 [MH]+, 353 [M + K].

実施例２：5-Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトンの合成
スキーム２

5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン2の合成のための商業的に入手可能な出発材料として、2E,6E-ファルネシルアルコール3（C2とC6位の配置を予めトランスまたはEとして固定）を設計し、使用した。ファルネシルアルコール3を、エチルエーテル（EE）中三臭化リン（PBr₃）またはアセトニトリル（ACN）中Ph₃PとCBr₄を用い、０℃にて反応させて臭化物4を得、これをカルバニオン（アセト酢酸エチル 5とナトリウムエトキシドとの反応により得た）と反応させて、目的の5E,9E-ファルネシルケトエステル6を得た。ホモログ化されたケトエステル 6を、5N KOH水溶液を用いて加水分解および脱カルボキシル化し、5E,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン１と5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン2の合成の重要な中間体の１つである、5E,9E-ファルネシルアセトン 7を得た。

コンジュゲートオレフィン12でC2においてcis配置を有する生成物を得る観点から、5E,9E-ファルネシルアセトン７をカルバニオン（(EtO)₂PO-CH₂-COOEtと水素化ナトリウム(NaH)の反応により得た）との反応を０℃にて行った。この反応により、2E,6E,10E-コンジュゲートエステル 8と 2Z,6E,10E-コンジュゲートエステル 12の混合物が得られ、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kato et al., J. Org. Chem., 1980, 45, 1126-1130参照）を繰り返し注意深く行うことにより、ここから、C2-cis (Z)-異性体12を分離した。

得られた2Z-コンジュゲートエステル 12を、水素化リチウムアルミニウム（LAH）で処理することにより、対応する2Z-アルコール 13に変換した。2Z-アルコール 13は、エチルエーテル（EE）中三臭化リン（PBr₃）またはアセトニトリル（ACN）中Ph₃PとCBr₄で０℃にて処理して、対応する2Z,6E,10E-ゲラニルゲラニルブロミド 14 に変換した後、カルバニオン（アセト酢酸エチル 5とナトリウムエトキシドとの反応により得た）と０℃にて反応させて、5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン2の合成に必要な前駆体である、所望の2Z,6E,10E-ゲラニルゲラニルケトエステル 15を得た。次いで、ケトエステル 15を、5N KOH 水溶液を用い、80℃にて、エステル加水分解及び脱カルボキシル化し、5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン 2を得た。

実施例３：5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトンの合成
5-cis異性体：5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン2の別の合成法：
5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン2の別の合成は、スキーム３に従い行うことができる。
スキーム３

cis（Z）配置を有するさらなる二重結合を形成するために、鍵となる中間体として、5E,9E-ファルネシルアセトン7を使用することができる。ひとつの方法として、5E,9E-ファルネシルアセトン7をwitting試薬16と反応させて、C2位にcis（Z）配置を有するコンジュゲートエステル 12を得ることができる。次いで、エステル 12を水素化リチウムアルミニウム（LAH）で還元して、対応するアルコール 13を生成した後、これを対応のブロミド 14に変換することができる。ブロミド 14からケトエステル 15に変換した後、加水分解と脱カルボキシル化により所望の5-cis（Z）異性体である、5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン (2)を得ることができる。

別の方法では、5E,9E-ファルネシルアセトン 7とトリフェニルメチルホスホランブロミド 17とを塩基性条件下で反応させた後、ホルムアルデヒド（単量体）で処理して、C2がcis（Z）配置である2Z,6E10E-ゲラニルゲラニルアルコール 13を得ることができる（Wiemer et al., Organic Letters, 2005, 7(22), 4803-4806参照）。ブロミド 14からケトエステル 15に変換した後、加水分解と脱カルボキシル化により所望の、5-cis（Z）異性体である、5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン (2)を得ることができる。TLC Rf:0.32 (5％ 酢酸エチル（ヘキサン中）); LC:保持時間：17.18 min; MS (m/e):313 [M - 18 + H]+, 331 [MH, very weak ionization]+, 339 [M - CH2 + Na], 353 [M + K].

ブロミド 4、10および14を除き、中間体生成物はすべて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製後、次の工程に用いた。ブロミド 4、10および14はシリカゲルカラムクロマトグラフィーに対して不安定であるため、これらのブロミドは精製することなく、次の工程に用いた。あるいは、スキーム１、２、３に示した中間体生成物は液体であるので、適当なレベルの減圧下で蒸留することにより分離及び精製することができる。中間体及び最終生成物はすべて、LC−MSによる質量および薄層クロマトグラフィー（TLC）によるRf値により特徴付けた。

実施例４：5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトンの合成
5-cis異性体：5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン2の別の合成法：
5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン2の別の合成は、スキーム４に従い行うことができる。
スキーム４

5Z,9E,13E-GGA 2の収束合成を上記のスキームに示し、以下に説明する。

5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン2の合成のための商業的に入手可能な出発材料として、2E,6E-ファルネシルアルコール3（C2とC6位の配置を予めトランスまたはEとして固定）を設計し、使用した。ファルネシルアルコール3を、エチルエーテル（EE）中三臭化リン（PBr₃）またはアセトニトリル（ACN）中Ph₃PとCBr₄を用い、０℃にて反応させてブロミド 4を得、これをカルバニオン（アセト酢酸エチル 5とナトリウムエトキシドとの反応により得た）と反応させて、目的の5E,9E-ファルネシルケトエステル6を得た。ホモログ化されたケトエステル 6を、5N KOH水溶液を用いて加水分解および脱カルボキシル化し、5E,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン１と5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン2の合成の重要な中間体の１つである、5E,9E-ファルネシルアセトン 7を得た。

他方のシントン、即ちイリド 21は、商業的に入手可能な出発物質である、レブリン酸エチル 16（製糖産業の副産物）から合成することができる。慣用の条件（エチレングリコール, p-TsOH, 共沸還流）を用いてレブリン酸エチル 16をケタール化し、所望の２−オキソ−ケタール 17を得た後、これを０℃にてTHF中LAHを用い、対応のアルコール 18に還元することができる。さらに、アルコール 18をジエチルエーテル中0℃にてPh₃Brで処理してブロミド 19を得、これをPh₃Pで処理した後、ホスホニウムブロミド塩 20を得ることができる。ブロミド塩 20は、マイルドなアルカリ（１N NaOH）で処理して、5Z-ＧＧＡ 2の合成を完成させるのに必要な、所望のイリド 21を得ることができる。

cis配置を有する生成物を得る目的で、室温にてDCM中、5E,9E-ファルネシルアセトン７をイリド 21と反応させ所望の5Z-オキソケタール２２を得た（Ernest et al, Tetrahedron Lett. 1982, 23(2), 167-170参照）。マイルドな酸処理により、22から保護されたオキソ官能基を脱離して所望の5Z,9E,13E-GGA 2を得た。

実施例５：5E,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトンの合成
5-trans異性体5E,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン１の別の合成法：
5E,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン1の別の合成は、スキーム５に従い行うことができる。
スキーム５

5E,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン (1)は、エチルエーテル中、DMAP触媒により、6E-10E-ゲラニルリナロール (23)とジケトン（24）とを反応させて、エステル 25を得ることにより調製することができる。エステル 25を、上昇させた温度でAl(OiPr)₃を用いてCarroll 転位に付することにより、所望の5E,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン(1)を得ることができる。別の方法では、ＧＧＡ（1）は、１６０℃にてAl(OiPr)₃を用いるCarroll 転位にて、メルドラム酸 26でゲラニルリナロール（23）を処理することにより調製することができる。同様に、Carroll 転位にて、tert-ブチルアセトアセテート（27）とゲラニルリナロール（23）を用いて所望の5E,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン (1)を得ることができる。

実施例６：5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトンの合成
5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン2の別の合成は、スキーム６に従い行うことができる。
スキーム6

5-cis異性体5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン2の別の合成法：
5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン2の合成のための商業的に入手可能な出発材料として、2E,6E-ファルネシルアルコール3（C2とC6位の配置を予めトランスまたはEとして固定）を設計し、使用した。ファルネシルアルコール3を、エチルエーテル（EE）中三臭化リン（PBr₃）またはアセトニトリル（ACN）中Ph₃PとCBr₄を用い、０℃にて反応させてブロミド 4を得、これをカルバニオン（アセト酢酸エチル 5とナトリウムエトキシドとの反応により得た）と反応させて、目的の5E,9E-ファルネシルケトエステル6を得た。ホモログ化されたケトエステル 6を、5N KOH水溶液を用いて加水分解および脱カルボキシル化し、5E,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン１と5Z,9E,13E-ゲラニルゲラニルアセトン2の合成の重要な中間体の１つである、5E,9E-ファルネシルアセトン 7を得た。

イリド 31は、商業的に入手可能なモノ−TBDMS保護されたエチレングリコール 28から合成した。アセトニトリル中Ph₃PとCBr₄を用いることによる、28のアルコール官能基の変換により、対応のブロミド 29を得、次いでこれを用いて上昇させた温度にてPh₃Pで処理することにより、ホスホニウムブロミド塩 30を製造した。ブロミド塩 30は、THF中KHMDSで処理して、イリド 31を得た後、これを鍵となる工程でケトン７とin-sistuで反応させ、C2において新たに形成した二重結合についてcis配置を形成して2Z-TBDMSエーテルを得ることができる（Still et al, J. Org. Chem., 1980, 45, 4260-4262 and Donetti et al, Tetrahedron Lett. 1982, 23(21), 2219-2222参照）。塩酸水溶液を用いてTBDMSを脱保護して対応するアルコール 13を得た後、Ph₃PとCBr₄を用いてアルコールをブロミドに変換して所望のブロミド 14を得ることができる。ブロミド 14をアセト酢酸エチルと反応させて、ケトエステル 15を得、次いで、これを加水分解後脱カルボキシル化して所望の 5Z-ＧＧＡ(5-cis) 2を得ることができる。

処方および薬物動態（PK）試験
ゲラニルゲラニルアセトン（GGA）の効果的に投与の観点から、そのPKおよび効力を決定するために、実施例６〜２０に記載する前臨床試験処方を開発した。前臨床試験処方の開発に際し、5E-および5Z-ゲラニルゲラニルアセトン(ＧＧＡという)の異性体混合物を用いた。合成された5E-および／または5Z-ＧＧＡの組成物は、係る前臨床試験処方に用いることができると考えられる。

以下の実施例において、血漿濃度およびPKパラメータは、CNS-101のIV投与及び経口処方のPK試験から得た。PKパラメータは、WinNonlin ソフトウェアおよび線形/対数台形法を用いて、ノンコンパートメント解析（NCA）モデルから計算した。

PKパラメータの定義
1zを必要としないパラメータ：Tmax (min): Cmaxに達する時間(解析データから直接得る)
1zを必要とするパラメータ：終末相半減期(t1/2) = ln(2)/lz best fit（最良適合）を見いだすためにLambda_z法を用いて計算した。必要に応じ、計算のために濃度−時間点をマニュアルで選択した。太字斜体表示の濃度は、計算に用いた点を示す。

実施例６：５％アラビアゴムおよび0.008％α−トコフェロールを用いたＧＧＡ処方

５％アラビアゴム溶液の調製：アラビアゴム1.25gを脱イオン水（23.75mL）に懸濁して全容量を25mLとし、脱イオン水中でアラビアゴムがすべて混和するまで、攪拌器を用いて攪拌した。この溶液にα−トコフェロール（２μL、最終濃度＝0.008）を加え、攪拌して５％のアラビアゴム溶液を得、これをＧＧＡを処方するためのストック溶液として用いた。

５％アラビアゴム水溶液中のＧＧＡ懸濁液の調製：ストック溶液の５％アラビアゴム溶液に、対応量のＧＧＡを加えて得られた混合物を攪拌し、水性懸濁製剤を得た。

５％アラビアゴム中のＧＧＡを水性懸濁製剤としてラットに用いたin-vivoPK試験により、経口バイオアベイラビリティー（％F）37.3％（ｔ１／２＝３．４３時間およびTmax=７．３３時間）との結果を得た。Kp（AUC_brain/AUC_plasma比）を算出するためのin-vivo試験を、ラットに対し６時間および８時間のタイムポイントで実施したところ、ＧＧＡのKpは0.08〜0.11であった。
実施例７：ヒドロキシプロピルセルロース（HPC；平均分子量＝100,000；高平均分子量）および０．００８％α−トコフェロ−ルを用いたＧＧＡ製剤

３％ヒドロキシプロピルセルロース溶液の調製：
３ｇのヒドロキシプロピルセルロース（平均分子量＝100,000）とα−トコフェロール（８μL、終濃度＝0.008％）の混合物に脱イオン水（約９７mL）を加え、全体積を１００mLとした。得られた混合物を攪拌し、ＧＧＡを処方するためのストック溶液を得た。

３％ヒドロキシプロピルセルロース水溶液中のＧＧＡ懸濁液の調製：
ストック溶液の3％ヒドロキシプロピルセルロース溶液に、対応量のＧＧＡを加えて得られた混合物を攪拌し、水性懸濁製剤を得た。

３％ヒドロキシプロピルセルロース（HPC、平均分子量＝100,000）中のＧＧＡを水性懸濁製剤としてラットに用いたin-vivoPK試験により、経口バイオアベイラビリティー（％F）41.8％（ｔ１／２＝３．１３時間およびTmax=8．６６時間）との結果を得た。
実施例８：ヒドロキシプロピルセルロース（HPC；平均分子量＝10,262；低平均分子量）および０．００８％α−トコフェロ−ルを用いたＧＧＡ製剤

３％ヒドロキシプロピルセルロース溶液の調製：
３ｇのヒドロキシプロピルセルロース（平均分子量＝10,262）とα−トコフェロール（８μL、終濃度＝0.008％）の混合物に脱イオン水（約９７mL）を加え、全体積を１００mLとした。得られた混合物を攪拌してＧＧＡを処方するためのストック溶液を得た。

３％ヒドロキシプロピルセルロース溶液中のＧＧＡ懸濁／溶液の調製：
ストック溶液の3％ヒドロキシプロピルセルロース溶液に、対応量のＧＧＡを加えて得られた混合物を攪拌し、水性懸濁製剤を得た。

３％ヒドロキシプロピルセルロース（HPC、平均分子量＝10,262）中のＧＧＡを水性懸濁製剤としてラットに用いたin-vivoPK試験により、経口バイオアベイラビリティー（％F）35％（ｔ１／２＝18．73時間およびTmax=9．33時間）との結果を得た。
実施例９：５％アラビアゴム＋３％ヒドロキシプロピルセルロース（HPC;平均分子量＝100,000；高平均分子量）および０．００８％α−トコフェロ−ルを用いたＧＧＡ製剤

Ａ．５％アラビアゴム溶液の調製：アラビアゴム1.25gを脱イオン水（23.75mL）に懸濁し（全容量を25mLとした）、脱イオン水中でアラビアゴムがすべて混和するまで、攪拌器を用いて攪拌した。この溶液に、α−トコフェロール（２μL、０．００８％）を加え、しばらく攪拌して５％アラビアゴムの製剤を得た。

５％アラビアゴム＋３％ヒドロキシプロピルセルロース（平均分子量＝１００,０００）中のＧＧＡ懸濁／溶液の調製：Mn= 100,000):
ストック溶液の５％アラビアゴムに、対応量のＧＧＡおよびヒドロキシプロピルセルロース（平均分子量＝100,000）を加え、得られた混合物を攪拌して水性懸濁製剤を得た。

５％アラビアゴム＋３％ヒドロキシプロピルセルロース（平均分子量＝100,000）中のＧＧＡを水性懸濁製剤としてラットに用いたin-vivoPK試験により、経口バイオアベイラビリティー（％F）５８％（ｔ１／２＝10.2時間およびTmax=5．33時間）との結果を得た。
実施例１０：５％アラビアゴム＋３％ヒドロキシプロピルセルロース（HPC;平均分子量＝10,262；低平均分子量）および０．００８％α−トコフェロールを用いたＧＧＡ製剤

Ａ．５％アラビアゴム溶液の調製：
アラビアゴム1.25 gを脱イオン水（23.75mL）に懸濁し（全容量を25mLとした）、脱イオン水中でアラビアゴムがすべて混和するまで、攪拌器を用いて攪拌した。この溶液にα−トコフェロール（２μL、最終濃度＝0.008％）を加え、しばらく攪拌して５％のアラビアゴム溶液を得、これをＧＧＡを処方するためのストック溶液として用いた。

５％アラビアゴム＋３％ヒドロキシプロピルセルロース（平均分子量＝１００,０００）中のＧＧＡ懸濁／溶液の調製：Mn= 100,000):
ストック溶液の５％アラビアゴムに、対応量のＧＧＡおよびヒドロキシプロピルセルロース（平均分子量＝10,262）を加え、得られた混合物を攪拌して水性懸濁製剤を得た。

５％アラビアゴム＋３％ヒドロキシプロピルセルロース（平均分子量＝10,262）中のＧＧＡを水性懸濁製剤としてラットに用いたin-vivoPK試験により、経口バイオアベイラビリティー（％F）36.5％（ｔ１／２＝6.73時間およびTmax=13．3時間）との結果を得た。

実施例１１：ラット由来一次運動ニューロンの培養
ラット一次運動ニューロンは、明細書において参考として援用されるHenderson et al.; J Cohen and G P Wilkin (ed.), Neural Cell Culture, (1995) p69-81の方法にしたがって、胚脊髄から単離した。簡単に言えば、脊髄を１５日胚（E15）から切り取り、トリプシン溶液中でインキュベートし、DNase処理により組織片から脊髄細胞を得た。細胞懸濁液を遠心分離して組織断片を除去した。その後、密度勾配遠心分離により運動ニューロンを濃縮した。

運動ニューロンは、ポリオルニチンおよびラミニンでコートした組織培養プレートにてインスリン、フォルスコリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、神経栄養因子、ウシ血清アルブミン、セレン、トランスフェリン、プトレシン、プロゲステロンおよびＢ２７サプリメントを含む無血清Neurobasal培地で培養した。

実施例１２：ＧＧＡの5-trans-異性体(CNS-102)は、ＧＧＡの異性体混合物(CNS-101)よりもin vitroで有効である
実施例１１と同様にラット一次運動ニューロンを調製し、培養した。細胞をプレートに播種する時に、種々の濃度のCNS-101（5-trans及び5-cis−異性体の混合物 (cis:trans比= 1:2-1:3)）、CNS-102 (ＧＧＡの5-trans-異性体ともいう)およびCNS-103 (ＧＧＡの5-cis−異性体ともいう)を加えた。７２時間後、各処置について、５つのフィールドにおける軸索伸張細胞を計数した。同じ倍率フィールドにおける全細胞に対する陽性細胞の百分率を算出し、結果を平均±標準偏差（ｎ＝５）として示した。ＥＣ₅₀は、化合物の有効性の尺度であり、薬物がその最大効果の半分を示す濃度に対応する。これらの結果を以下の表に示す：

実施例１３：大量のＧＧＡ異性体混合物（ＣＮＳ−１０１）は、神経芽細胞腫細胞の生存を阻害した。
ヒトSH-SY5Y 神経芽細胞腫細胞を、10％ウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEM/HAM F12培地で２４時間培養した。５％FBSを添加したDMEM/HAM F12培地中、細胞をレチノイン酸で４８時間処理した。次いで、細胞をCNS-101（100マイクロモル濃度(μＭ)）またはビークル、ジメチルスルホキシドで４８時間処理した。細胞の生存率をATP 検出アッセイ(Promega)で測定した。これらの結果を以下の表に示す：

実施例１４：大量のＧＧＡ異性体混合物(CNS-101)およびcis−異性体(CNS-103)は神経芽細胞腫細胞の生存を阻害した
マウスNeuro2A神経芽細胞腫細胞を、１０％FBSを添加したDMEM中で２４時間培養した。示した種々の濃度の、CNS-101、CNS-102およびCNS-103で細胞を48時間処理した。次いで、２％FBSを添加したDMEM中でレチノイン酸によって分化を誘導した。Ｇタンパク質に対する阻害剤、GGTI-298をインキュベーションした。２４時間インキュベーションした後、神経突起を有する細胞を計数した。大量のＧＧＡ異性体混合物（CNS-101）とcis−異性体（CNS-103）は、神経芽細胞腫細胞の生存を阻害した。これらの結果を以下の表に示す：

実施例１３および１４のデータは、cis−異性体CNS-103が細胞の生存に対して悪影響を及ぼし、trans-異性体が好ましい効果を有するという結論をサポートする。この２つの実施例を併せると、高い濃度では、cis−異性体はtrans-異性体に対して阻害効果を有することが示唆される。実施例１６はさらに、これらの知見を受けてさらに詳しく記述するものである。

実施例１５：酸化的ストレスにさらされた細胞に対するＧＧＡ異性体(CNS-101)混合物の効果
ヒトSH-SY5Y 神経芽細胞腫細胞を、１０％ウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEM/HAM F12培地で２日間培養した。細胞を、5％ FBSを添加したDMEM/HAM F12培地中、レチノイン酸で４８時間処理した。次いで、この細胞を種々の濃度のCNS-101で４８時間処理した。細胞を過酸化水素 (75μＭ)またはDMEM/HAM F12(対照)に２時間暴露した後、細胞の生存をATPアッセイ(Promega)を用いて測定した。これらの結果を以下の表に示す：

実施例１６：細胞の生存に対する、ＧＧＡ異性体混合物(CNS-101)、trans-異性体(CNS-102)およびcis−異性体(CNS-103)、およびＧタンパク質の阻害剤(GGTI-298)の効果
Ｇタンパク質の阻害剤(GGTI-298)の存在下または不在下で、Neuro2A細胞をCNS-101, CNS-102またはCNS-103 とともに培養した。分化を誘導した後、神経突起を伸張した細胞を計数した。これらの結果を以下の表に示す：

実施例１７：ＧＧＡ異性体混合物(CNS-101)は、神経芽細胞腫細胞の神経突起伸長を活性化した
ヒトSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞を１０％ウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEM/HAM F12培地にて２４時間培養した。５％ＦＢＳを添加したDMEM/HAM F12中、レチノイン酸で細胞を処理した。次いで、種々の濃度のCNS-101で細胞を処理した。各処理について、神経突起の全長を測定した。これらの結果を以下の表に示す：

実施例１８：ＧＧＡ異性体混合物(CNS-101)およびtrans-異性体(CNS-102)は、カイニン酸によって誘導される神経変性を軽減した
CNS-101またはCNS-102をSprague-Dawleyラットに経口投与し、カイニン酸を注射した。発作行動を観察しスコア化した（R.J. Racine, Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure, Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 32 (1972) 281-294. Modifications were made for the methods参照）。ラットの脳組織は、組織スライド上で切片にして、海馬組織のニューロンをニッスルで染色した。カイニン酸によって損傷を受けた歯状回組織におけるニューロンを定量した。比較に用いたメマンチン組成物は、市販のNMDA受容体アゴニストを意味する。これらの結果を以下の表に示す：

実施例１９：カイニン酸によって誘導される神経変性の緩和におけるCNS-101およびCNS-102の有効性の比較
CNS-101、CNS-102またはビークルのみの対照をSprague-Dawleyラットに経口投与し、カイニン酸を注射した。発作行動を観察しスコア化した（R.J.Racine, Modification of seizure activity by electrical stimulation:II.Motor seizure, Electroencephalogr.Clin.Neurophysiol.32 (1972) 281-294.Modifications were made for the methods参照）。ラットの脳組織は、組織スライド上で切片にして、海馬組織のニューロンをニッスルで染色した。カイニン酸によって損傷受けたニューロンと発作行動スコアを定量化した。

これらの結果は、低い濃度のＧＧＡのトランス異性体は、高い濃度のＧＧＡの異性体混合物またはcis−異性体のいずれよりも神経損傷に対するニューロンの保護においてより効果的であることを示している。さらに、trans-ＧＧＡのこのような効果は、発作、虚血性発作、緑内障などのような神経障害での組織損傷の保護にも有用であると考えられる。

実施例２０：ニューロンにおけるＧタンパク質の活性に対するＧＧＡの効果
神経芽細胞腫細胞は、American Type Culture Collection (ATCC)から入手して、ＡＴＣＣの推奨される培養法にしたがって培養することができる。培養細胞は、有効量のＧＧＡと接触させる。Ｇタンパク質活性の変化を、細胞の細胞内画分から得たリゼートのウェスタンブロットによりモニターする。細胞内分画は、商業的に入手可能なキット(例えばCalbiochem) を用いて、取扱説明書に従って行うことができる。ウェスタンブロット分析は、細胞膜および細胞質コンパートメントの細胞内画分を用いて行う。ウェスタンブロットは、種々のＧタンパク質に対する抗体:RHOA、RAC1、CDC42、RASD2を用いて標準的な分子生物学的方法に従い行う。神経芽細胞腫細胞を有効量のＧＧＡと反応させると、RHOA、RAC1、CDC42および／またはRASD2の活性な膜結合部分が調節されると考えられる。タンパク質凝集に関与するこれら低分子量のＧタンパク質と遺伝子産物の相互作用も試験する。そのような遺伝子産物としては、Huntington遺伝子産物（Htt）、SUMO化装置等が挙げられる。

神経芽細胞腫細胞またはTDP-43タンパクが枯渇している他のニューロンを用いて同じアッセイを行う。TDP-43枯渇細胞は、ＡＬＳに関連する神経変性の影響を模擬する。TDP-43枯渇は、siRNAおよび／またはshRNA技術を用いて達成することができる。TDP-43枯渇による神経変性の影響を受けやすいニューロンは、該ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させた後Ｇタンパク質活性が変化すると考えられる。さらに、該ニューロンを有効量のＧＧＡと反応させることでＧタンパク質の活性な膜結合部分が増加すると考えられる。

同じアッセイを、神経芽細胞腫細胞またはＧタンパク質のゲラニルゲラニル化の阻害に起因する神経変性を受けやすい他のニューロンを用いて実行する。GGTI-298は、ゲラニルゲラニル化の特異的な阻害剤であり、ゲラニルゲラニル化によるＧタンパク質の活性化阻害を通して神経細胞死を増大させる。したがって、GGTI-298とＧＧＡは両方とも、組織培養の神経芽細胞腫細胞と接触させる。GGTI-298による神経変性を受けやすいニューロンは、該ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させた後Ｇタンパク質活性が変化すると考えられる。さらに、該ニューロンを有効量のＧＧＡと反応させることでＧタンパク質の活性な膜結合部分が増加すると考えられる。

実施例２１：神経変性を受けやすいニューロンにおけるタンパク質凝集の病原性に対するＧＧＡの効果
培養した神経芽細胞腫細胞は、この細胞をドーパミンと混合することにより、神経変性を受けやすくすることができる。その細胞へのドーパミンの添加は、細胞質において病原性のタンパク質凝集を引き起こす。神経変性を受けやすいニューロンに対するＧＧＡの効果を試験するために、有効量のドーパミンをまずニューロンと接触させて、細胞内での病原性のタンパク質凝集体形成を誘導する。次に、有効量のＧＧＡをそのニューロンと接触させる。次いで、当業者に一般に知られている組織学的染色法および／または免疫染色法を用いて、タンパク質凝集体のサイズおよび／または数の変化を測定する。ＧＧＡと、ドーパミンで誘導されたタンパク質凝集に起因する神経変性を受けやすいニューロンとの接触は、そのタンパク質凝集体の少なくとも一部を可溶化し、細胞に対する病原性を減少させると考えられる。さらに、ＧＧＡと、ドーパミンで誘導されたタンパク質凝集に起因する神経変性を受けやすいニューロンとの接触は、そのタンパク質凝集体の形態を非病原性の形態に変え、細胞に対する病原性を減少させると考えらえる。

ニューロンとβ−アミロイドペプチド凝集体とをin vivoで接触させ、in vivoのβ−アミロイドペプチド凝集体に起因するADの毒性作用を反復する。培養した神経芽細胞腫細胞においてＧＧＡがβ−アミロイドペプチド凝集体の病原性を減少するかを試験するため、β−アミロイドペプチド凝集体を培養細胞の培地に直接添加する。β−アミロイドペプチドは購入することができ、in vitroで凝集体を形成し得る。次いで、有効量のＧＧＡを培養細胞に添加して細胞に対する病原性の変化について試験する。ＧＧＡとβ−アミロイドペプチドに起因する神経変性を受けやすいニューロンとの接触は、タンパク質凝集体の少なくとも一部を可溶化し、細胞に対する病原性を減少させると考えられる。さらに、ＧＧＡとβ−アミロイドペプチドに起因する神経変性を受けやすいニューロンとの接触は、病原性のタンパク質凝集体の形態を非病原性の形態に変え、病原性を減少させると考えられる。次いで、当業者に一般に知られている組織学的染色法および／または免疫染色法を用いて、タンパク質凝集体のサイズおよび／または数の変化を測定する。

実施例２２：神経変性を受けやすい哺乳類におけるin vivoでのＧＧＡの効果
ニューロトキシンを用いマウスにおけるＡＤの影響を反復することができる。ＡＤの影響を受ける哺乳類に対するＧＧＡの投与の効果を試験するために、ニューロトキシンを全身投与するかまたはマウスの脳組織へ直接注射して、ADに関連する病状を引き起こす。ニューロトキシンは、ＧＧＡの投与前、投与と同時に、または投与後に投与する。ＧＧＡは製薬的に許容し得る添加剤と混合して、このマウスに投与することができる。次いで、これらマウスを、生存率、脳組織におけるニューロン密度、および学習、記憶および運動技能についてモニターする。学習、記憶および運動技能は、当業者に一般に知られている方法により測定する。有効量のＧＧＡで哺乳類を処置することにより、ニューロトキシンの注射に関連する症状の幾つかが減弱すると考えられる。

種々のヒトの疾患に関連する病態を有するように操作された様々なマウスモデルが入手可能である。そのようなマウスモデルの１つに、アミロイドβ前駆体タンパク質(APP)を過剰発現するマウスがある。このマウスは、ヒトのＡＤと同様の病態を有する。ＡＰＰを過剰発現しているマウスに有効量のＧＧＡを投与する。ＧＧＡを製薬的に許容し得る添加剤と混合してこのマウスに投与する。次いで、これらのマウスを、体重、β−アミロイド斑形成、ならびに学習、記憶および運動技能についてモニターする。さらに、これらマウスの組織切片を、組織染色および免疫組織化学法により解析し、ＧＧＡ投与後の脳における変化を検出する。有効量のＧＧＡで動物を処置することにより、ＡＤに関連する症状の幾つかが減弱すると考えられる。

Sod1変異タンパクを発現するマウスは、ＡＬＳを有するヒトと同様の病態を示す。ＧＧＡの有効量をSod1変異マウスに投与する。ＧＧＡを製薬的に許容し得る添加剤と混合してこのマウスに投与することができる。次いで、これらマウスを、生存率、体重および運動技能についてモニターする。さらに、これらマウスの組織切片を、組織染色および免疫組織化学法により解析し、ＧＧＡ投与後の脳、脊髄または筋肉における変化を検出する。有効量のＧＧＡでSod1変異マウスを処置することにより、生存率、体重は増加し、これらマウスの運動技能は増強されると考えられる。

当然のことながら、本明細書において説明を目的に本発明の具体的な実施形態を記載したが、本発明の精神および範囲から外れることなく様々な修飾が可能である。

本明細書を通して、様々な特許出願および公報を参照し、それらはそれぞれ参考として本明細書の一部を構成する。

Claims (28)

1. 合成された5E,9E,13E−ゲラニルゲラニルアセトンである化合物。
2. 5Z,9E,13E−ゲラニルゲラニルアセトンＩＩを含まない、請求項１記載の化合物。
3. 式ＩＩ：
   

   

   ＩＩ
   で示される、合成された5-cis異性体化合物、または
   式ＸＩＩ：
   

   

   ＸＩＩ
   ［式中、Ｒ₅はそれぞれ独立にＣ₁−Ｃ₆アルキルであるか、または２つのＲ₅基がそれらが結合している酸素原子と一緒になって、場合により１〜３の、好ましくは１〜２のＣ₁−Ｃ₆アルキル基で置換されていてもよい５または６員環を形成する］
   で示されるそのケタール。
4. 請求項１または２に記載の化合物および少なくとも１つの製薬的な添加物を含有する医薬組成物。
5. 製薬的な添加物が、α−トコフェロール、および場合により１またはそれ以上のヒドロキシプロピルセルロースおよびアラビアゴムの１またはそれ以上である、請求項４記載の医薬組成物。
6. ＡＤまたはＡＬＳに関連する病原性のタンパク質凝集体の発生のリスクのあるニューロンからの１またはそれ以上の神経伝達物質の発現および／または放出を増大するための組成物であって、該組成物が、タンパク質凝集を阻害する量のＧＧＡまたはその異性体もしくは異性体の混合物を含有してなる組成物。
7. 細胞外の病原性のタンパク質凝集体の発生のリスクのあるニューロンからの１またはそれ以上の神経伝達物質の発現および／または放出を増大するための組成物であって、該組成物が細胞外タンパク質凝集を阻害する量のＧＧＡ、またはその異性体もしくは異性体の混合物を含有してなる組成物。
8. ニューロンを有効量のＧＧＡと接触させることを含んでなる、
   （ｉ）神経の損傷または神経の死の危険性のあるニューロンの神経保護、
   （ｉｉ）ニューロンの軸索成長の増大、
   （ｉｉｉ）神経細胞死になりやすいニューロンの細胞死の阻害、
   （ｉｖ）ニューロンの神経突起成長の増大、または
   （ｖ）ニューロンからの１またはそれ以上の神経伝達物質の発現および／または放出の増大
   のための方法。
9. ＧＧＡが、ＧＧＡの5-trans異性体である、請求項８記載の方法。
10. 接触させる前のニューロンが、
    （ｉ）軸索成長能の減少
    （ｉｉ）１またはそれ以上の神経伝達物質の減少した発現レベル
    （ｉｉｉ）シナプス形成の減少、及び
    （ｉｖ）電気興奮性の減少
    の１以上を示す、請求項８記載の方法。
11. 神経刺激が、
    （ｉ）ニューロンのシナプス形成の増大または誘導、
    （ｉｉ）ニューロンの電気興奮性の増大または増強、
    （ｉｉｉ）ニューロンにおけるＧタンパク質の活性の調節、
    （ｉｖ）ニューロンにおけるＧタンパク質の活性化の増強。
    の１以上を含んでなる、請求項８記載の方法。
12. 初期のまたは部分的な認知症を患っている哺乳類において、認知技能をいくらか保持しつつ、認知能力の損失を阻害するための方法であって、ニューロンを有効量のＧＧＡの5-trans異性体と接触させることを含んでなる方法。
13. ニューロン間、ニューロン外またはニューロン内での病原性のタンパク質凝集体の形成又はさらなる形成に起因するニューロンの死を阻害するための方法であって、該病原性のタンパク質凝集体を生じるリスクのあるニューロンを、タンパク質凝集を阻害する量のＧＧＡの5-trans異性体と接触させることを含んでなり、該病原性のタンパク質凝集がSBMAに関連するものでない、方法。
14. 病原性のタンパク質凝集がニューロン間、ニューロン外および／またはニューロン内である、請求項１３記載の方法。
15. β−アミロイドペプチドを有効量のＧＧＡの5-trans異性体と接触させることを含んでなる、β−アミロイドペプチドの神経毒性を阻害するための方法。
16. β−アミロイドペプチドが、ニューロン間またはニューロン外に存在する、またはβ−アミロイド斑の一部である、請求項１５記載の方法。
17. 神経疾患を患っている哺乳類において神経細胞死を阻害するおよび／または神経活性を増大するための方法であって、該神経疾患の病因がニューロンに対して病原性であるタンパク質凝集体の形成を含み、該方法が、該哺乳類に対して、さらなる病原性のタンパク質凝集を阻害する量のＧＧＡの5-trans異性体を投与することを含んでなり、該病原性のタンパク質凝集が核内ではない、方法。
18. ＡＬＳまたはＡＤを患っている哺乳類において神経細胞死を阻害するおよび／または神経活性を増大するための方法であって、該ＡＬＳまたはＡＤの病因がニューロンに対して病原性であるタンパク質凝集体の形成を含み、該方法が、該哺乳類に対して、さらなる病原性のタンパク質凝集を阻害する量のＧＧＡの5-trans異性体を投与することを含んでなり、該病原性のタンパク質凝集がSBMAに関連するものではない、方法。
19. 前記量のＧＧＡが病原性のタンパク質凝集体を非病原性の形態に変えるか、または病原性のタンパク質凝集体の形成を防止する、請求項１９記載の方法。
20. 哺乳類における発作中の神経細胞死を予防するための方法であって、それを必要とする哺乳類に治療上有効量のＧＧＡの5-trans異性体を投与することを含んでなる方法。
21. １またはそれ以上の以下の工程を含んでなる方法：
    （ｉ）式ＩＩＩの化合物をハロゲン化条件下で反応させて式ＩＶ：
    

    

    ＩＶ
    の化合物を得ること；
    （ｉｉ）式ＩＶの化合物をアルキル化条件下でアルキルアセトアセテートと反応させて式Ｖ：
    

    

    Ｖ
    の化合物を得ること；
    （ｉｉｉ）加水分解および脱カルボキシル化条件下、式Ｖの化合物を反応させて式ＶＩ：
    

    

    ＶＩ
    の化合物を得ること；
    （ｉｖ）オレフィン化条件下、式ＶＩの化合物を式ＶＩＩ：
    

    

    ＶＩＩ
    ［式中、Ｒ₂および各Ｒ₃は独立してアルキルまたは置換されたもしくは置換されていないアリールである］
    の化合物と反応させて式ＶＩＩＩ：
    

    

    ＶＩＩＩ
    の化合物を選択的に得ること；
    （ｖ）式ＶＩＩＩの化合物を還元条件下で反応させて式ＩＸ：
    

    

    ＩＸ
    の化合物を得ること。
22. 式ＩＸの化合物を用いて、さらに工程（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）をこの順番に繰り返して、ｍが２である式Ｉ
    

    

    Ｉ
    の化合物を得ることを含んでなるか、または
    さらに工程（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）をこの順番に１〜３回繰り返して、ｍが３である式ＩＢの化合物を得ることを含んでなる、請求項２１記載の方法。
23. 式ＶＩＩＩ
    

    

    ＶＩＩＩ
    の化合物を還元条件下で反応させて式ＩＸ：
    

    

    ＩＸ
    （式中、ｎは２である）の化合物を製造することを含んでなる方法。
24. １またはそれ以上の以下の工程を含んでなる方法：
    （ｉ）式ＩＩＩＢ
    

    

    ＩＩＩＢ
    ［式中、ｍは１〜３である］
    の化合物をハロゲン化条件下で反応させて式ＩＶＢ
    

    

    ＩＶＢ
    の化合物を得ること；
    （ｉｉ）アルキル条件下、式ＩＶＢの化合物をアルキルアセトアセテートと反応させて式ＶＢ
    

    

    ＶＢ
    （式中、Ｒ₁は置換されていないまたは置換されたアルキルである）
    の化合物を得ること；
    （ｉｉｉ）加水分解および脱カルボキシル化条件下、式ＶＢの化合物を反応させて式ＶＩＢ
    

    

    ＶＩＢ
    の化合物を得ること。
25. 加水分解及び脱カルボキシル化条件下、式ＶＢ
    

    

    ＶＢ
    ［式中、Ｒ₁はアルキルであり、ｍは０〜３である］
    の化合物を反応させて式ＶＢ
    

    

    ＶＢ
    の化合物を得る方法。
26. 加水分解条件下、式ＸＩＩ
    

    

    ＸＩＩ
    ［式中、Ｒ₅はそれぞれ独立にＣ₁−Ｃ₆アルキルであるか、または２つのＲ₅基がそれらが結合している酸素原子と一緒になって、場合により１〜３の、好ましくは１〜２のＣ₁−Ｃ₆アルキル基で置換されていてもよい５または６員環を形成する］
    のケタール化合物を反応させて式ＩＩ
    

    

    ＩＩ
    の化合物を得ることを含んでなる方法。
27. 式ＸＩ
    

    

    ＸＩ
    の化合物を加水分解次いで脱カルボキシル化条件下で反応させて式Ｉ
    

    

    Ｉ
    で示される化合物を形成することを含んでなる方法。
28. 式ＸＩＣ
    

    

    ＸＩＣ
    で示される化合物を、加水分解次いで脱カルボキシル化条件下で反応させて、式ＩＩ
    

    

    ＩＩ
    で示される化合物を形成することを含んでなる方法。