JP2013534812A - Fibronectin based scaffold proteins with improved stability - Google Patents
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Abstract
本出願は、改善された安定性に関連するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を提供する。本出願はまた、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な製剤、ならびに診断、研究および治療適用におけるそれらの使用に関する。本出願はさらに、そのようなタンパク質、そのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはそれらの断片を含む細胞に、かつ、そのようなポリヌクレオチドを含むベクターに関する。 The present application provides fibronectin based scaffold proteins that are associated with improved stability. The application also relates to stable formulations of fibronectin based scaffold proteins and their use in diagnostic, research and therapeutic applications. The present application further relates to cells containing such proteins, polynucleotides encoding such proteins, or fragments thereof, and vectors containing such polynucleotides.
Description
関連出願
本出願は、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、2010年5月26日に出願された米国仮特許出願第61/348,647号および2010年5月26日に出願された同第61/348,663号の利益を主張する。
RELATED APPLICATIONS This application is filed on May 26, 2010 and US Provisional Patent Application No. 61 / 348,647, filed May 26, 2010, which is incorporated herein by reference in its entirety. Insist on the benefits of 61 / 348,663.
序論
フィブロネクチンをベースとする足場は、対象とする任意の化合物と結合するよう進化させることができるタンパク質のファミリーである。一般に、フィブロネクチンIII型(Fn3)またはFn3様ドメインに由来する足場を使用するこれらのタンパク質は、天然の抗体または操作された抗体(すなわち、ポリクローナル、モノクローナルまたは一本鎖抗体)に特徴的な形で機能し、さらに、構造的利点を有する。具体的には、これらの抗体模倣物の構造は、普通は抗体における構造および機能の喪失につながる条件下でも、フォールディング、安定性および溶解性が最適となるように設計されている。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の一例として、アドネクチン商標(Adnexus,Bristol−Myers Squibbの完全所有の子会社)がある。
Introduction Fibronectin-based scaffolds are a family of proteins that can be evolved to bind to any compound of interest. In general, these proteins using scaffolds derived from fibronectin type III (Fn3) or Fn3-like domains are characterized by natural or engineered antibodies (ie polyclonal, monoclonal or single chain antibodies). Functions and has structural advantages. Specifically, the structure of these antibody mimetics is designed to optimize folding, stability and solubility, even under conditions that usually lead to loss of structure and function in the antibody. An example of a fibronectin based scaffold protein is the Adnectin trademark (Adnexus, a wholly owned subsidiary of Bristol-Myers Squibb).
フィブロネクチンは、細胞外マトリックスの形成および細胞−細胞相互作用において重要な役割を果たす大きなタンパク質であり;3種(I、IIおよびIII型)の小さなドメインの多数の反復からなる(Baron et al., 1991)。Fn3自体が、細胞接着分子、細胞表面ホルモンおよびサイトカイン受容体、シャペロンおよび炭水化物結合ドメインの部分を含む大きなサブファミリーのパラダイムである。総説については、Bork & Doolittle, Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Oct 1;89(19):8990−4; Bork et al., J Mol Biol. 1994 Sep 30;242(4):309−20; Campbell & Spitzfaden, Structure. 1994 May 15;2(5):333−7; Harpez & Chothia, J Mol Biol. 1994 May 13;238(4):528−39)参照。 Fibronectin is a large protein that plays an important role in extracellular matrix formation and cell-cell interactions; it consists of multiple repeats of three (I, II and III) small domains (Baron et al.,). 1991). Fn3 itself is a large subfamily paradigm that includes parts of cell adhesion molecules, cell surface hormones and cytokine receptors, chaperones and carbohydrate binding domains. For reviews, see Bork & Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Oct 1; 89 (19): 8990-4; Bork et al. , J Mol Biol. 1994 Sep 30; 242 (4): 309-20; Campbell & Spitzfaden, Structure. 1994 May 15; 2 (5): 333-7; Harpez & Chothia, J Mol Biol. 1994 May 13; 238 (4): 528-39).
フィブロネクチンIII型(Fn3)ドメインは、N末端からC末端の順に、βまたはβ様鎖、A;ループ、AB;βまたはβ様鎖、B;ループ、BC;βまたはβ様鎖、C;ループ、CD;βまたはβ様鎖、D;ループ、DE;βまたはβ様鎖、E;ループ、EF;βまたはβ様鎖、F;ループ、FG;およびβまたはβ様鎖、Gを含む。ループAB、BC、CD、DE、EFおよびFGのいずれかまたは全てが、標的結合に関与し得る。BC、DEおよびFGループは、免疫グロブリン由来の相補性決定領域(CDR)と構造上および機能上の両面で類似している。米国特許第7,115,396号には、BC、DEおよびFGループの変化が高親和性TNFαバインダーをもたらすFn3ドメインタンパク質が記載されている。米国公開第2007/0148126号には、BC、DEおよびFGループの変化が高親和性VEGFR2バインダーをもたらすFn3ドメインタンパク質が記載されている。 The fibronectin type III (Fn3) domain is, in order from N-terminal to C-terminal, β or β-like chain, A; loop, AB; β or β-like chain, B; loop, BC; β or β-like chain, C; , CD; β or β-like chain, D; loop, DE; β or β-like chain, E; loop, EF; β or β-like chain, F; loop, FG; and β or β-like chain, G. Any or all of loops AB, BC, CD, DE, EF and FG may be involved in target binding. The BC, DE, and FG loops are structurally and functionally similar to complementarity determining regions (CDRs) from immunoglobulins. US Pat. No. 7,115,396 describes Fn3 domain proteins in which changes in the BC, DE and FG loops result in high affinity TNFα binders. US Publication No. 2007/0148126 describes Fn3 domain proteins in which changes in BC, DE and FG loops result in high affinity VEGFR2 binders.
タンパク質製剤は、それらの生成、精製、保存および運搬の間、物理学的および化学的な不安定さを伴い得る。これらの不安定さの問題は、タンパク質治療と関連する生物学的特性に悪影響を与え、それによってそのタンパク質治療の有効性を低減させる。Sola, 2009, J. Pharm Sci, 98(4): 1223−1245。従って、改善された安定性、例えば低減された断片化(fragmentation)および/または凝集に関連し、治療および診断目的の両方のために用いることができる、改善されたフィブロネクチンドメイン足場タンパク質を獲得することは有利だろう。 Protein formulations may involve physical and chemical instabilities during their production, purification, storage and transportation. These instability problems adversely affect the biological properties associated with protein therapy, thereby reducing the effectiveness of the protein therapy. Sola, 2009, J.A. Pharm Sci, 98 (4): 1223-1245. Thus, obtaining an improved fibronectin domain scaffold protein that is associated with improved stability, eg, reduced fragmentation and / or aggregation, and can be used for both therapeutic and diagnostic purposes. Would be advantageous.
概要
本出願の一態様は、低減された断片化および/または低減された凝集を含む、増大した安定性に関連する、新規のフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を提供する。
SUMMARY One aspect of the present application provides novel fibronectin based scaffold proteins that are associated with increased stability, including reduced fragmentation and / or reduced aggregation.
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、フィブロネクチンIII型第10(10Fn3)ドメインを含み、ここに、該10Fn3ドメインは、配列番号:1と少なくとも60%同一性を有するアミノ酸配列を含み、100nM未満のKDで標的分子に結合するものであり、かつ、該10Fn3ドメインは、DK配列を含有しないC末端テールをさらに含むものである。例示的な実施形態では、C末端テールは配列番号:4のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、C末端テールはシステイン残基をさらに含む。他の実施形態では、C末端テールは配列番号:5の配列を含む。 In some embodiments, a fibronectin based scaffold protein provided herein comprises a fibronectin type III 10 ( 10 Fn3) domain, wherein the 10 Fn3 domain comprises SEQ ID NO: 1 and It comprises an amino acid sequence having at least 60% identity are those that bind to a target molecule with a K D of less than 100 nM, and the 10 Fn3 domain are those further comprising a C-terminal tail containing no DK sequence. In an exemplary embodiment, the C-terminal tail comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In some embodiments, the C-terminal tail further comprises a cysteine residue. In other embodiments, the C-terminal tail comprises the sequence of SEQ ID NO: 5.
特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、野生型の10Fn3ドメインによっては結合されない標的に結合する。特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、EGFR、ヒト血清アルブミンまたはPCSK9の一以上に結合しない。特定の実施形態では、単一の10Fn3ドメインを含むフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、EGFR、ヒト血清アルブミンまたはPCSK9の一以上に結合しない。特定の実施形態では、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、標的分子の以下の組合せ:i)EGFRおよびIGF−IR;ii)EGFRおよび任意の他の標的タンパク質;またはiii)ヒト血清アルブミンおよび任意の他の標的タンパク質、の一以上に結合しない。 In certain embodiments, fibronectin based scaffold proteins bind to targets that are not bound by the wild type 10 Fn3 domain. In certain embodiments, the fibronectin based scaffold protein does not bind to one or more of EGFR, human serum albumin or PCSK9. In certain embodiments, a fibronectin based scaffold protein comprising a single 10 Fn3 domain does not bind to one or more of EGFR, human serum albumin or PCSK9. In certain embodiments, the multivalent fibronectin based scaffold protein comprises the following combinations of target molecules: i) EGFR and IGF-IR; ii) EGFR and any other target protein; or iii) human serum albumin and It does not bind to one or more of any other target proteins.
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の10Fn3ドメインは、1−10アミノ酸を含むN末端伸長をさらに含む。他の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の10Fn3ドメインは:M、MG、Gならびに配列番号:19−21および26−31のいずれかからなる群から選択される配列を含む。 In some embodiments, the 10 Fn3 domain of a fibronectin based scaffold protein further comprises an N-terminal extension comprising 1-10 amino acids. In other embodiments, the 10 Fn3 domain of a fibronectin based scaffold protein comprises a sequence selected from the group consisting of: M, MG, G and any of SEQ ID NOs: 19-21 and 26-31.
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、第二の10Fn3ドメインをさらに含み、ここに、該第二の10Fn3ドメインは、配列番号:1と少なくとも60%同一性を有するアミノ酸配列を含み、100nM未満のKDで標的分子に結合するものであり、かつ、該第二の10Fn3ドメインは、DK配列を含有しないC末端テールをさらに含むものである。例示的な実施形態では、第二の10Fn3ドメインは配列番号:4のアミノ酸配列を含むC末端テールを含む。いくつかの実施形態では、第一および第二の10Fn3ドメインは異なる標的に結合する。いくつかの実施形態では、第二の10Fn3ドメインは1−10アミノ酸を含むN末端伸長をさらに含む。いくつかの実施形態では、N末端伸長は:M、MG、Gならびに配列番号:19−21および25−31のいずれかからなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、第一および第二の10Fn3ドメインは、1−30アミノ酸を含むポリペプチドリンカーにより連結される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、グリシン−セリンをベースとするリンカー、グリシン−プロリンをベースとするリンカー、プロリン−アラニンリンカーおよびFnをベースとするリンカーからなる群から選択される。 In some embodiments, the scaffold proteins based on fibronectin, further comprises a second 10 Fn3 domain, here, said second 10 Fn3 domain, SEQ ID NO: having one at least 60% identity It comprises an amino acid sequence are those that bind to a target molecule with a K D of less than 100 nM, and, said second 10 Fn3 domain are those further comprising a C-terminal tail containing no DK sequence. In an exemplary embodiment, the second 10 Fn3 domain comprises a C-terminal tail comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In some embodiments, the first and second 10 Fn3 domains bind to different targets. In some embodiments, the second 10 Fn3 domain further comprises an N-terminal extension comprising 1-10 amino acids. In some embodiments, the N-terminal extension comprises a sequence selected from the group consisting of: M, MG, G and any of SEQ ID NOs: 19-21 and 25-31. In some embodiments, the first and second 10 Fn3 domains are linked by a polypeptide linker comprising 1-30 amino acids. In some embodiments, the polypeptide linker is selected from the group consisting of a glycine-serine based linker, a glycine-proline based linker, a proline-alanine linker and an Fn based linker.
特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、ループ、AB;ループ、BC;ループ、CD;ループ、DE;ループ、EF;およびループ、FGを含む、一以上の10Fn3ドメインを含み、各々、独立して、ヒト10Fn3ドメインの対応するループの配列と比べて、変化したアミノ酸配列を備える、BC、DEおよびFGから選択される少なくとも一つのループを有する。特定の実施形態では、10Fn3ドメインは、配列番号:1により表される天然に存在するヒト10Fn3ドメインと、少なくとも50、60、70または80%同一であるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、2つの10Fn3ドメインを含む二量体である。 In certain embodiments, the fibronectin based scaffold protein comprises one or more 10 Fn3 domains, including loop, AB; loop, BC; loop, CD; loop, DE; loop, EF; and loop, FG. Each independently has at least one loop selected from BC, DE and FG with an altered amino acid sequence compared to the sequence of the corresponding loop of the human 10 Fn3 domain. In certain embodiments, the 10 Fn3 domain comprises an amino acid sequence that is at least 50, 60, 70, or 80% identical to a naturally occurring human 10 Fn3 domain represented by SEQ ID NO: 1. In an exemplary embodiment, the fibronectin based scaffold protein is a dimer comprising two 10 Fn3 domains.
別の態様では、本出願はPCT特許出願国際公開第2009/142773号に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体と比べ、低減されたタンパク質断片化に関連する、新規なフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体を提供する。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、配列番号:48のアミノ酸配列を含む。 In another aspect, the application is based on a novel fibronectin based on reduced protein fragmentation compared to the fibronectin based scaffold protein dimer described in PCT patent application WO 2009/142773. A scaffold protein dimer is provided. In some embodiments, the fibronectin based scaffold protein dimer comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48.
別の態様では、本出願はN1−D1−C1−L−N2−D2−C2構造を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体を提供する。特定の実施形態では、N1およびN2は0−10アミノ酸を独立して含む任意のN末端伸長であり;D1およびD2は、(i)配列番号:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一性を有する第10フィブロネクチンIII型ドメイン(10Fn3)であって、ここに、前記10Fn3ドメインは500nM未満のKDでIGF−IRに結合するものである、および(ii)配列番号:3に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一性を有する10Fn3ドメインであって、ここに、前記10Fn3ドメインは500nM未満のKDでVEGFR2に結合するものである、からなる群から独立して選択され;Lは0−30アミノ酸残基を含むポリペプチドリンカーであり;C1は配列番号:4に示されるアミノ酸配列を含み;ならびに、C2は配列番号:4、5または6に示されるアミノ酸配列を含む。 In another aspect, the application provides a fibronectin based scaffold protein dimer having an N1-D1-C1-L-N2-D2-C2 structure. In certain embodiments, N1 and N2 are any N-terminal extension independently comprising 0-10 amino acids; D1 and D2 are (i) at least 95% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 a tenth fibronectin type III domain having (10 Fn3), wherein the said 10 Fn3 domains are binding to IGF-IR with a K D of less than 500 nM, and (ii) SEQ ID NO: shown in 3 a 10 Fn3 domain having an amino acid sequence at least 95% identity to the, here, the 10 Fn3 domain is one that binds to VEGFR2 with a K D of less than 500 nM, independently selected from the group consisting of; L is a polypeptide linker comprising 0-30 amino acid residues; C1 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 As well as C2 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, 5 or 6.
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はN1−D1−C1−L−N2−D2−C2構造を有し、ここに、D1は配列番号:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一性を有する10Fn3ドメインを含み、D2は配列番号:3に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一性を有する10Fn3ドメインを含むものである。他の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はN1−D1−C1−L−N2−D2−C2構造を有し、ここに、D1は配列番号:3に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一性を有する10Fn3ドメインを含み、D2は配列番号:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一性を有する10Fn3ドメインを含むものである。 In some embodiments, the fibronectin based scaffold protein dimer has a N1-D1-C1-L-N2-D2-C2 structure, wherein D1 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. When comprise 10 Fn3 domain having at least 95% identity, D2 SEQ ID NO: one in which the amino acid sequence shown in 3 and containing 10 Fn3 domain having at least 95% identity. In another embodiment, the fibronectin based scaffold protein dimer has a N1-D1-C1-L-N2-D2-C2 structure, wherein D1 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 includes a 10 Fn3 domain having at least 95% identity, D2 SEQ ID NO: is intended to include 10 Fn3 domain with two amino acid sequence shown in at least 95% identity.
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はN1−D1−C1−L−N2−D2−C2構造を有し、ここに、C2は配列番号:6のアミノ酸配列を含むものである。 In some embodiments, the fibronectin based scaffold protein dimer has a N1-D1-C1-L-N2-D2-C2 structure, wherein C2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. It is a waste.
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はN1−D1−C1−L−N2−D2−C2構造を有し、ここに、N1はM、MG、Gならびに配列番号:19−21および26−31のいずれか一つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである。例示的な実施形態では、N1は配列番号:19のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はN1−D1−C1−L−N2−D2−C2構造を有し、ここに、N2はM、MG、Gならびに配列番号:19−21および26−31のいずれか一つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである。例示的な実施形態では、N2は配列番号:20のアミノ酸配列を含む。 In some embodiments, the fibronectin based scaffold protein dimer has a N1-D1-C1-L-N2-D2-C2 structure, wherein N1 is M, MG, G and SEQ ID NO: It comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of any one of 19-21 and 26-31. In an exemplary embodiment, N1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the fibronectin based scaffold protein dimer has a N1-D1-C1-L-N2-D2-C2 structure, wherein N2 is M, MG, G and SEQ ID NO: It comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of any one of 19-21 and 26-31. In an exemplary embodiment, N2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はN1−D1−C1−L−N2−D2−C2構造を有し、ここに、Lは、グリシン−セリンをベースとするリンカー、グリシン−プロリンをベースとするリンカー、プロリン−アラニンリンカーおよびFnをベースとするリンカーからなる群から選択されるポリペプチドリンカーである。他の実施形態では、Lは配列番号:7のアミノ酸配列を含む。 In some embodiments, the fibronectin based scaffold protein dimer has an N1-D1-C1-L-N2-D2-C2 structure, wherein L is a glycine-serine based linker. A polypeptide linker selected from the group consisting of a glycine-proline based linker, a proline-alanine linker, and an Fn based linker. In other embodiments, L comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、ポリオキシアルキレン部分、ヒト血清アルブミン結合タンパク質、シアル酸、ヒト血清アルブミン、トランスフェリン、IgG、IgG結合タンパク質およびFc断片から選択される一以上の薬物動態(PK)部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、PK部分は、ポリオキシアルキレン部分であり、かつ、前記ポリオキシアルキレン部分はポリエチレングリコ−ル(PEG)である。いくつかの実施形態では、PEG部分は、CysまたはLysアミノ酸を介してフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質と共有結合によって連結している。いくつかの実施形態では、PEGは約0.5kDaおよび約100kDaの間である。 In some embodiments, the fibronectin based scaffold protein is one or more selected from a polyoxyalkylene moiety, human serum albumin binding protein, sialic acid, human serum albumin, transferrin, IgG, IgG binding protein and Fc fragment. A pharmacokinetic (PK) portion of In some embodiments, the PK moiety is a polyoxyalkylene moiety and the polyoxyalkylene moiety is polyethylene glycol (PEG). In some embodiments, the PEG moiety is covalently linked to a fibronectin based scaffold protein via a Cys or Lys amino acid. In some embodiments, the PEG is between about 0.5 kDa and about 100 kDa.
一態様では、本出願は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を含む医薬上許容される組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、本質的に発熱物質を含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、微生物汚染を実質的に含まず、これによって、インビボ投与に適したものとなる。組成物は、例えば、IV、IPまたは皮下投与のために製剤され得る。いくつかの実施形態では、組成物は生理学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物のpHは4.0−6.5の間である。いくつかの実施形態では、組成物のpHは4.0−5.5の間である。他の実施形態では、組成物のpHは5.5である。他の実施形態では、組成物のpHは4.0である。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の濃度は、組成物において5mg/mlである。 In one aspect, the application provides a pharmaceutically acceptable composition comprising a fibronectin based scaffold protein. In some embodiments, the composition is essentially free of pyrogens. In some embodiments, the composition is substantially free of microbial contamination, thereby making it suitable for in vivo administration. The composition can be formulated, for example, for IV, IP or subcutaneous administration. In some embodiments, the composition includes a physiologically acceptable carrier. In some embodiments, the pH of the composition is between 4.0-6.5. In some embodiments, the pH of the composition is between 4.0-5.5. In other embodiments, the pH of the composition is 5.5. In other embodiments, the pH of the composition is 4.0. In some embodiments, the concentration of the fibronectin based scaffold protein is 5 mg / ml in the composition.
別の態様では、本出願は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を含む医薬製剤を提供し、ここに、該製剤は少なくとも5mg/mlのフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を含み、4.0のpHを有し、かつ静脈内投与に適しているものである。いくつかの実施形態では、該医薬製剤は、25℃で4週間、安定である。いくつかの実施形態では、医薬製剤は4%未満の断片化を有する。いくつかの実施形態では、該製剤は4%未満の凝集を有する。 In another aspect, the application provides a pharmaceutical formulation comprising a fibronectin based scaffold protein, wherein the formulation comprises at least 5 mg / ml fibronectin based scaffold protein and a pH of 4.0. And suitable for intravenous administration. In some embodiments, the pharmaceutical formulation is stable at 25 ° C. for 4 weeks. In some embodiments, the pharmaceutical formulation has a fragmentation of less than 4%. In some embodiments, the formulation has an aggregation of less than 4%.
別の態様では、本出願は、本明細書に記載される任意の組成物の治療有効量を、必要とされる対象へ投与することを含む、対象における過剰増殖性障害(hyperproliferative disorder)を処置するための方法を提供する。 In another aspect, the application treats a hyperproliferative disorder in a subject comprising administering to the subject in need a therapeutically effective amount of any of the compositions described herein. Provide a way to do that.
別の態様では、本出願は、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードする核酸を提供する。このようなタンパク質のためのポリヌクレオチドを含有するベクターも同様に含まれる。適したベクターとして、例えば、発現ベクターが挙げられる。本出願のさらなる態様は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、ベクターまたは発現ベクターを含む細胞を提供する。配列は、好ましくは、使用される細胞種において発現を最大にするよう最適化される。いくつかの実施形態では、発現は微生物細胞にある。他の実施形態では、発現はほ乳類細胞にある。好ましくは、発現は大腸菌にある。一態様では、細胞はフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を発現する。一態様では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、選択された細胞種における発現のために最適化されたコドンである。また、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードする核酸を含む、ヌクレイック(nucleic)、ベクターまたは発現ベクターを含む宿主細胞を培養することと、および培養物から発現されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を回収することを含む、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を生成する方法も提供される。 In another aspect, the application provides a nucleic acid encoding a fibronectin based scaffold protein as described herein. Also included are vectors containing polynucleotides for such proteins. Suitable vectors include, for example, expression vectors. A further aspect of the application provides a cell comprising a polynucleotide, vector or expression vector encoding a fibronectin based scaffold protein. The sequence is preferably optimized to maximize expression in the cell type used. In some embodiments, the expression is in microbial cells. In other embodiments, the expression is in mammalian cells. Preferably the expression is in E. coli. In one aspect, the cell expresses a fibronectin based scaffold protein. In one aspect, the polynucleotide encoding a fibronectin based scaffold protein is a codon optimized for expression in a selected cell type. Culturing host cells containing a nucleic, vector or expression vector comprising a nucleic acid encoding a fibronectin based scaffold protein, and a fibronectin based scaffold protein expressed from the culture. Also provided is a method of producing a fibronectin based scaffold protein as described herein comprising recovering.
詳細な説明
定義
「ポリペプチド」によって、長さ、翻訳後修飾または機能にかかわらず、二以上のアミノ酸の任意の配列が意味される。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用される。ポリペプチドは、出典明示により本明細書に組み込まれる米国特許第6,559,126号に記載されるものなどの天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含み得る。ポリペプチドはまた、種々の標準的な化学法のいずれかで修飾されていてもよい(例えば、アミノ酸は保護基で修飾されていてもよい;カルボキシ末端アミノ酸は、末端アミド基にされてもよい;アミノ末端残基は、例えば、親油性を増強するための基で修飾されてもよい;またはポリペプチドは、化学的にグリコシル化されていてもよく、あるいは、安定性もしくはインビボ(in vivo)半減期を増大するよう修飾されていてもよい)。ポリペプチド修飾は、ポリペプチドへの、環状化合物または他の分子などの別の構造の結合(attachment)を含み、また変化した立体配置(すなわち、RもしくはS;または、LもしくはD)で一以上のアミノ酸を含有するポリペプチドを含み得る。
Detailed Description Definition By “polypeptide” is meant any sequence of two or more amino acids, regardless of length, post-translational modification or function. “Polypeptide”, “peptide” and “protein” are used interchangeably herein. Polypeptides can include natural and unnatural amino acids such as those described in US Pat. No. 6,559,126, which is incorporated herein by reference. Polypeptides may also be modified by any of a variety of standard chemical methods (eg, amino acids may be modified with protecting groups; the carboxy terminal amino acid may be terminal amide group). The amino terminal residue may be modified, for example, with a group to enhance lipophilicity; or the polypeptide may be chemically glycosylated, or may be stable or in vivo. May be modified to increase half-life). Polypeptide modifications include attachment of another structure to the polypeptide, such as a cyclic compound or other molecule, and one or more in an altered configuration (ie, R or S; or L or D) Polypeptides containing the amino acids of
本明細書において、「アミノ酸配列同一性パーセント(%)」とは、配列同一性の一部分として保存的置換は全く考慮することなく、最大配列同一性パーセントを達成するために、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入した後の、選択された配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的上、アラインメントは、当技術分野における技術の範囲内にある様々な方法で、例えば、BLAST、BLAST−2、ALIGN、ALIGN−2またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成できる。当業者ならば、比較されている配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適当なパラメーターを決定できる。しかしながら、本明細書における目的上、アミノ酸配列同一性%の値は、配列比較コンピュータープログラムALIGN−2を用いることによって、以下に記載されるように得られる。ALIGN−2配列比較コンピュータープログラムは、Genentech,Inc.によって著作され、ユーザー文書とともに米国著作権局、Washington D.C.,20559に提出されており、ここでは、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されており、Genentech,Inc.,South San Francisco,Calif.を通じて公的に入手可能である。ALIGN−2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくは、デジタルUNIX V4.0Dで使用するために作成されるべきである。すべての配列比較パラメーターは、ALIGN−2プログラムによって設定されており、変動しない。 As used herein, “percent amino acid sequence identity (%)” refers to aligning sequences to achieve maximum percent sequence identity without considering any conservative substitutions as part of sequence identity, Defined as the percentage of amino acid residues in the candidate sequence that are identical to the amino acid residues in the selected sequence, optionally after introducing gaps. For purposes of determining percent amino acid sequence identity, alignment can be performed in a variety of ways within the skill in the art, such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, or Megalign (DNASTAR) software. This can be accomplished using publicly available computer software. One skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared. However, for purposes herein,% amino acid sequence identity values are obtained as described below by using the sequence comparison computer program ALIGN-2. The ALIGN-2 sequence comparison computer program is available from Genentech, Inc. And by the United States Copyright Office, Washington D. C. , 20559, which is registered under US copyright registration number TXU510087, and is registered with Genentech, Inc. , South San Francisco, Calif. Publicly available through The ALIGN-2 program should be created for use with a UNIX operating system, preferably digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not vary.
本明細書における目的上、所与のアミノ酸配列Bと、それに関して、または、それに対する所与のアミノ酸配列Aのアミノ酸配列同一性%(あるいは、所与のアミノ酸配列Bと、それに関して、または、それに対して特定のアミノ酸配列同一性%を有する、または含む所与のアミノ酸配列Aとして表現される場合もある)は、以下のとおりに算出される:100×X/Y比、式中、XはAおよびBのプログラムのアラインメントにおいて配列アラインメントプログラムALIGN−2によって同一マッチとしてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である。当然のことではあるが、アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合には、Bに対するAのアミノ酸配列同一性%は、Aに対するBのアミノ酸配列同一性%とは等しくならない。 For purposes herein, a given amino acid sequence B and with respect thereto, or% amino acid sequence identity of a given amino acid sequence A (or with a given amino acid sequence B and with respect thereto, or (Which may be expressed as a given amino acid sequence A, which has or contains a specific% amino acid sequence identity) is calculated as follows: 100 × X / Y ratio, where X Is the number of amino acid residues scored as an identical match by the sequence alignment program ALIGN-2 in the alignment of the A and B programs, and Y is the total number of amino acid residues in B. Of course, if the length of amino acid sequence A is not equal to the length of amino acid sequence B, then the% amino acid sequence identity of A to B will not be equal to the% amino acid sequence identity of B to A. .
用語「治療有効量」とは、ほ乳類における疾患または障害を治療するために有効な薬物の量を指す。癌の場合には、薬物の治療有効量は、癌細胞の数を低減し得る;腫瘍の大きさを低減し得る;末梢臓器への癌細胞浸潤を阻害し得る(すなわち、ある程度遅延し得る、好ましくは、停止し得る);腫瘍転移を阻害し得る(すなわち、ある程度遅延し得る、好ましくは、停止し得る);腫瘍増殖をある程度阻害し得る;および/または障害と関連している一以上の症状をある程度軽減し得る。薬物が増殖を妨げ、かつ/または既存の癌細胞を死滅させ得る限り、細胞分裂停止性および/または細胞傷害性であり得る。癌治療について、インビボでの有効性は、例えば、無増悪期間(time to disease progression)(TTP)を評価することおよび/または奏効率(RR)を決定することによって測定できる。 The term “therapeutically effective amount” refers to an amount of a drug effective to treat a disease or disorder in a mammal. In the case of cancer, a therapeutically effective amount of the drug can reduce the number of cancer cells; it can reduce the size of the tumor; it can inhibit cancer cell invasion into peripheral organs (ie, it can be delayed to some extent, Preferably may be stopped); may inhibit tumor metastasis (ie may be delayed to some extent, preferably may be stopped); may be inhibited to some extent tumor growth; and / or may be associated with a disorder Symptoms can be reduced to some extent. So long as the drug can prevent growth and / or kill existing cancer cells, it can be cytostatic and / or cytotoxic. For cancer treatment, in vivo efficacy can be measured, for example, by assessing time to disease progression (TTP) and / or determining response rate (RR).
アミノ酸配列または化合物の半減期は、一般に、インビボでポリペプチドの血清濃度が、例えば、天然の機序による、配列もしくは化合物の分解および/または配列もしくは化合物のクリアランスもしくは隔離によって50%低減されるのにかかる時間として定義され得る。半減期は、薬物動態解析によってなど、それ自体公知の任意の方法で決定できる。適した技術は、当業者には明らかであり、例えば、通常治療される霊長類に、アミノ酸配列または化合物の適した用量を適宜投与する工程;前記霊長類から定期的に血液サンプルまたは他のサンプルを採取する工程;前記血液サンプル中の本発明のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定する工程;およびこのように得られたデータ(のプロット)から、本発明のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が、投与時の初期レベルと比べて50%低減されるまでの時間を算出する工程を含み得る。例えば、Kenneth,A et al:Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists and in Peters et al,Pharmacokinete analysis:A Practical Approach(1996)などの標準的なハンドブックが参照される。Marcel Dekker、2nd Rev.edition(1982)により公開された「Pharmacokinetics」,M Gibaldi&D Perronもまた参照される。 The half-life of an amino acid sequence or compound generally reduces the serum concentration of the polypeptide in vivo by 50%, for example, by degradation of the sequence or compound and / or clearance or sequestration of the sequence or compound by natural mechanisms. It can be defined as the time it takes. The half-life can be determined by any method known per se, such as by pharmacokinetic analysis. Suitable techniques will be apparent to those skilled in the art, for example, administering a suitable dose of an amino acid sequence or compound to a primate to be treated as appropriate; a blood sample or other sample from the primate on a regular basis Determining the level or concentration of the amino acid sequence or compound of the invention in the blood sample; and the data thus obtained (a plot of) from the level of the amino acid sequence or compound of the invention or It may include calculating the time until the concentration is reduced by 50% compared to the initial level at the time of administration. For example, Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmaceuticals and in Peters et al, Pharmacokine analysis: A PracticalAp. Marcel Dekker, 2nd Rev. Reference is also made to “Pharmacocetics” published by edition (1982), M Gibaldi & D Perron.
半減期は、t1/2−α、t1/2−βおよび曲線下面積(AUC)などのパラメーターを用いて表現され得る。本明細書において、「半減期の増大」とは、これらのパラメーターのうちいずれか1種、例えば、これらのパラメーターのうち任意の2種、または本質的に3種のこれらのパラメーターの全ての増大を指す。「半減期の増大」とは、特に、t1/2−αおよび/またはAUCまたは両方の増大を伴うか、または伴わない、t1/2−βの増大を指す。 Half-life can be expressed using parameters such as t1 / 2-α, t1 / 2-β and area under the curve (AUC). As used herein, “increased half-life” refers to any increase in any one of these parameters, eg, any two of these parameters, or essentially three of these parameters. Point to. “Increasing half-life” refers specifically to an increase in t1 / 2-β with or without an increase in t1 / 2-α and / or AUC or both.
概説
本明細書には、増大した安定性に関連する、改善されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質が記載されている。本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、一以上の所望の標的に結合するように修飾された、一以上の第10フィブロネクチンIII型ドメインを含む。本明細書にはまた、1つがVEGFR2に特異的に結合するように修飾され、1つがIGF−IRに特異的に結合するように修飾された、2つのヒト第10フィブロネクチンIII型ドメインを含み、増大した安定性に関連する、改善されたVEGFR2/IGF−IR二重特異的フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体が記載されている。PCT特許出願国際公開第2009/142773号には、共有結合によって、または非共有結合によって連結されることができ、かつVEGFR2およびIGF−IRの両方に結合する、フィブロネクチン足場多量体が記載されている。本出願は、幾分かは、VEGFR2およびIGF−IRに結合する二重特異的なフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質が、特定のアスパラギン酸残基で、高頻度の断片化を受けるという驚くべき発見に関する。特に、リジン残基が直接後に続くアスパラギン酸残基が、他のアミノ酸が後に続くアスパラギン酸残基と比べて、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質において、切断に対してより感受性であることが発見された。本出願はまた、同一の保管条件およびこれらの類似するタンパク質間で共有される配列同一性の高いパーセンテージにもかかわらず、VEGFR2/IGF−IR結合フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の断片化の程度が、関連するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質、すなわち、二重特異的なEGFR/IGF−IR結合フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体に関連する断片化の程度よりも相当高い、という驚くべき発見に関する。本出願はまた、DK部位が除去、または、異なるアミノ酸、例えばグルタミン酸でアスパラギン酸残基を置換するために修飾される場合、モデルのフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の断片化が著しく低減されることを実証する。本明細書において、保管の間、増大した安定性を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の改善された組成物もまた提供される。
Overview Described herein are improved fibronectin based scaffold proteins that are associated with increased stability. The fibronectin based scaffold proteins described herein include one or more tenth fibronectin type III domains that are modified to bind to one or more desired targets. The specification also includes two human 10th fibronectin type III domains, one modified to specifically bind to VEGFR2 and one modified to specifically bind to IGF-IR; An improved VEGFR2 / IGF-IR bispecific fibronectin based scaffold protein dimer has been described that is associated with increased stability. PCT patent application WO 2009/142773 describes fibronectin scaffold multimers that can be linked covalently or non-covalently and bind to both VEGFR2 and IGF-IR. . This application is a surprising discovery that, to some extent, bispecific fibronectin based scaffold proteins that bind to VEGFR2 and IGF-IR undergo high frequency fragmentation at specific aspartic acid residues. About. In particular, it has been discovered that aspartic acid residues directly followed by lysine residues are more sensitive to cleavage in fibronectin based scaffold proteins than aspartic acid residues followed by other amino acids. It was. The application also demonstrates the extent of fragmentation of scaffold proteins based on VEGFR2 / IGF-IR binding fibronectin, despite the same storage conditions and a high percentage of sequence identity shared between these similar proteins. The surprising discovery that the relevant fibronectin based scaffold proteins, ie, the degree of fragmentation associated with bispecific EGFR / IGF-IR binding fibronectin based scaffold protein dimers About. The application also shows that fragmentation of the model fibronectin based scaffold protein is significantly reduced when the DK site is modified or modified to replace aspartic acid residues with different amino acids such as glutamic acid. To demonstrate. Also provided herein are improved compositions of fibronectin-based scaffold proteins that have increased stability during storage.
フィブロネクチンをベースとする足場
Fn3はフィブロネクチン由来のIII型ドメインを指す。Fn3ドメインは小さく、単量体であって、可溶性で、かつ安定である。それはジスルフィド結合を欠くため、還元条件下でも安定である。Fn3の全体構造は免疫グロブリンと似ている。Fn3ドメインは、N末端からC末端の順に、βまたはβ様鎖、A;ループ、AB;βまたはβ様鎖、B;ループ、BC;βまたはβ様鎖、C;ループ、CD;βまたはβ様鎖、D;ループ、DE;βまたはβ様鎖、E;ループ、EF;βまたはβ様鎖、F;ループ、FG;およびβまたはβ様鎖、Gを含む。7つの逆平行β鎖は、安定なコアを形成する2つのβシートとしてまとめられ、一方で、βまたはβ様鎖に結合するループから構成される2つの「顔」を作成している。ループAB、CDおよびEFは1つの顔に位置し、ループBC、DEおよびFGは反対側の顔に位置する。任意の、または全てのループAB、BC、CD、DE、EFおよびFGが、リガンド結合に参加し得る。少なくとも15種のFn3の異なるモジュールが存在し、モジュール間の配列相同性は低いが、それらは全て三次構造において高い類似性を共有する。
Fibronectin-based scaffold Fn3 refers to a type III domain derived from fibronectin. The Fn3 domain is small, monomeric, soluble and stable. It lacks disulfide bonds and is stable under reducing conditions. The overall structure of Fn3 is similar to immunoglobulin. The Fn3 domain is, in order from the N-terminus to the C-terminus, β or β-like chain, A; loop, AB; β or β-like chain, B; loop, BC; β or β-like chain, C; loop, CD; β-like chain, D; loop, DE; β or β-like chain, E; loop, EF; β or β-like chain, F; loop, FG; and β or β-like chain, G. The seven antiparallel β strands are grouped together as two β sheets that form a stable core, while creating two “faces” composed of loops that bind to β or β-like strands. Loops AB, CD and EF are located on one face and loops BC, DE and FG are located on the opposite face. Any or all loops AB, BC, CD, DE, EF and FG may participate in ligand binding. There are at least 15 different Fn3 modules, and the sequence homology between modules is low, but they all share high similarity in tertiary structure.
アドネクチン商標(Adnexus,a Bristol−Myers Squibb Company)は、第10フィブロネクチンIII型ドメイン、すなわちFn3の第10モジュール(10Fn3)に基づくリガンド結合足場タンパク質である。天然に存在するヒト10Fn3のアミノ酸配列は、配列番号:37に示される:
配列番号:37において、ABループは残基15−16に対応し、BCループは残基21−30に対応し、CDループは残基39−45に対応し、DEループは残基51−56に対応し、EFループは残基60−66に対応し、かつFGループは残基76−87に対応する。例えば、Xu et al.,Chemistry&Biology 2002 9:933−942を参照のこと。BC、DEおよびFGループは分子の1つの顔に沿って整列し、AB、CDおよびEFループは分子の反対側の顔に沿って整列する。配列番号:37において、β鎖Aは残基9−14に対応し、β鎖Bは残基17−20に対応し、β鎖Cは残基31−38に対応し、β鎖Dは残基46−50に対応し、β鎖Eは残基57−59に対応し、β鎖Fは残基67−75に対応し、かつβ鎖Gは残基88−94に対応する。鎖は、対応するループを介して互いに結合する、例えば、鎖AおよびBは、鎖A、ループAB、鎖Bの順番で、ループABを介して結合する等。配列番号:37の最初の8アミノ酸(上記斜字体)は、分子の結合活性を保有しながら、欠失され得る。配列番号:37において、疎水性コアの形成に関与する残基(「コアアミノ酸残基」)は、配列番号:37の以下のアミノ酸:L8、V10、A13、L18、I20、W22、Y32、I34、Y36、F48、V50、A57、I59、L62、Y68、I70、V72、A74、I88、I90およびY92に対応するアミノ酸を含み、ここに、該コアアミノ酸残基は、一文字アミノ酸コードと、それに続く配列番号:37内でそれらが位置する位置によって表されている。例えば、Dickinson et al.,J.Mol.Biol.236:1079−1092(1994)を参照のこと。 In SEQ ID NO: 37, the AB loop corresponds to residues 15-16, the BC loop corresponds to residues 21-30, the CD loop corresponds to residues 39-45, and the DE loop corresponds to residues 51-56 , The EF loop corresponds to residues 60-66, and the FG loop corresponds to residues 76-87. For example, Xu et al. , Chemistry & Biology 2002 9: 933-942. The BC, DE, and FG loops are aligned along one face of the molecule, and the AB, CD, and EF loops are aligned along the opposite face of the molecule. In SEQ ID NO: 37, β chain A corresponds to residues 9-14, β chain B corresponds to residues 17-20, β chain C corresponds to residues 31-38, and β chain D remains. Corresponding to groups 46-50, β chain E corresponds to residues 57-59, β chain F corresponds to residues 67-75, and β chain G corresponds to residues 88-94. The chains are connected to each other through corresponding loops, for example, chains A and B are connected through loop AB in the order of chain A, loop AB, chain B, etc. The first 8 amino acids of SEQ ID NO: 37 (above italics) can be deleted while retaining the binding activity of the molecule. In SEQ ID NO: 37, the residues involved in the formation of the hydrophobic core (“core amino acid residues”) are the following amino acids of SEQ ID NO: 37: L8, V10, A13, L18, I20, W22, Y32, I34. , Y36, F48, V50, A57, I59, L62, Y68, I70, V72, A74, I88, I90 and Y92, wherein the core amino acid residue is followed by a single letter amino acid code followed by Represented by the position in SEQ ID NO: 37 where they are located. For example, Dickinson et al. , J .; Mol. Biol. 236: 1079-1092 (1994).
10Fn3ドメインは、構造的および機能的に抗体、特に抗体の可変領域に類似している。10Fn3ドメインは「抗体模倣物」または「抗体様タンパク質」と記載され得る一方、それらは従来の抗体を超える多数の利点を示す。特に、それらは抗体に比べてより良好なフォールディングと熱安定性特性を示し、また、特定の条件下で正しいフォールディングを妨害もしくは阻害すると知られているジスルフィド結合を欠く。 The 10 Fn3 domain is structurally and functionally similar to an antibody, particularly the variable region of an antibody. While 10 Fn3 domains can be described as “antibody mimics” or “antibody-like proteins”, they exhibit numerous advantages over conventional antibodies. In particular, they exhibit better folding and thermostable properties compared to antibodies and lack disulfide bonds known to interfere with or inhibit correct folding under certain conditions.
10Fn3ドメインのBC、DEおよびFGループは、免疫グロブリン由来の相補性決定領域(CDR)に類似している。これらのループ領域でのアミノ酸配列の変化が、10Fn3の結合特性を変化させる。AB、CDおよびEFループでの修飾を備える10Fn3ドメインもまた、所望の標的に結合する分子を生成するために作製され得る。ループの外側のタンパク質配列は免疫グロブリン由来のフレームワーク領域に類似し、10Fn3の構造的立体配座(structural conformation)において役割を果たす。10Fn3のフレームワーク様領域における変化は、リガンド結合を撹乱するほど構造的立体配座が変化されない限り、許容される。10Fn3リガンド特異的バインダーを生成するための方法は、高親和性TNFαバインダーを開示するPCT国際公開第00/034787号、同第01/64942号および同第02/032925号、高親和性VEGFR2バインダーを開示するPCT国際公開第2008/097497号、高親和性IGF−IRバインダーを開示するPCT国際公開第2008/066752号、ならびに高親和性多価VEGFR2/IGF−IRバインダーを開示するPCT国際公開第2009/142773号に記載される。10Fn3バインダーおよびバインダーを選択するための方法を議論するさらなる参考文献には、PCT国際公開第98/056915号、同第02/081497号および同第2008/031098号、ならびに米国特許出願公開第2003/0186385号が挙げられる。 The BC, DE and FG loops of the 10 Fn3 domain are similar to complementarity determining regions (CDRs) from immunoglobulins. Changes in the amino acid sequence in these loop regions change the binding properties of 10 Fn3. A 10 Fn3 domain with modifications in the AB, CD and EF loops can also be made to generate molecules that bind to the desired target. The protein sequence outside the loop resembles an immunoglobulin-derived framework region and plays a role in the structural conformation of 10 Fn3. Changes in the framework-like region of 10 Fn3 are tolerated as long as the structural conformation is not altered enough to disrupt ligand binding. Methods for generating 10 Fn3 ligand-specific binders are described in PCT International Publication Nos. 00/034787, 01/64942, and 02/032925, which disclose high affinity TNFα binders, high affinity VEGFR2 binders. PCT International Publication No. 2008/097497 discloses PCT International Publication No. 2008/066752 which discloses high affinity IGF-IR binder, and PCT International Publication No. which discloses high affinity multivalent VEGFR2 / IGF-IR binder 2009/142773. Additional references discussing 10 Fn3 binders and methods for selecting binders include PCT WO 98/056915, 02/081497 and 2008/031098, and US Patent Application Publication No. 2003. No. 0186385.
上述のように、配列番号:37の残基21−30、51−56および76−87に対応するアミノ酸残基は、それぞれBC、DEおよびFGループを定義する。しかしながら、VEGFR2またはIGF−IRなどの、所望の標的に対する強い親和性を有する10Fn3結合ドメインを獲得するために、ループ領域内の全ての残基が修飾される必要があるというわけではないことが理解されるべきである。例えば、いくつかの実施形態では、BCループのアミノ酸23−29、DEループのアミノ酸52−55およびFGループのアミノ酸77−86に対応する残基のみが修飾され、高親和性10Fn3バインダーを生成した(例えば、配列番号:3を有するVEGFR2結合コアを参照)。従って、特定の実施形態では、BCループは配列番号:37の残基23−29に対応するアミノ酸配列により定義され、DEループは配列番号:37の残基52−55に対応するアミノ酸配列により定義され、かつFGループは配列番号:37の残基77−86に対応するアミノ酸配列により定義される。 As mentioned above, the amino acid residues corresponding to residues 21-30, 51-56 and 76-87 of SEQ ID NO: 37 define the BC, DE and FG loops, respectively. However, not all residues in the loop region need to be modified to obtain a 10 Fn3 binding domain with strong affinity for the desired target, such as VEGFR2 or IGF-IR. Should be understood. For example, in some embodiments, only residues corresponding to amino acids 23-29 in the BC loop, amino acids 52-55 in the DE loop, and amino acids 77-86 in the FG loop are modified to produce a high affinity 10 Fn3 binder. (See, for example, the VEGFR2 binding core having SEQ ID NO: 3). Thus, in certain embodiments, the BC loop is defined by the amino acid sequence corresponding to residues 23-29 of SEQ ID NO: 37, and the DE loop is defined by the amino acid sequence corresponding to residues 52-55 of SEQ ID NO: 37. And the FG loop is defined by the amino acid sequence corresponding to residues 77-86 of SEQ ID NO: 37.
さらに、高親和性10Fn3結合ドメインを生成しながら、ループ領域における挿入および欠失もまた作製され得る。例えば、配列番号:3を有するVEGFR2バインダーのFGループは野生型10Fn3ドメインと同じ長さのFGループを有する、すなわち、配列番号:37の10個の残基77−86が配列番号:3の10個の残基69−78で交換された。対照的に、配列番号:2を有するIGF−IRバインダーのFGループは野生型10Fn3ドメインの対応するFGループよりも長さにおいて短い、すなわち、配列番号:37の10個の残基77−86が配列番号:2の6個の残基69−74で交換された。最終的に、配列番号:39を有するEGFRバインダーのFGループは野生型10Fn3ドメインの対応するFGループよりも長さにおいて短い、すなわち、配列番号:37の10個の残基77−86が配列番号:39の15個の残基69−83で交換された。 Furthermore, insertions and deletions in the loop region can also be made while generating high affinity 10 Fn3 binding domains. For example, the FG loop of the VEGFR2 binder having SEQ ID NO: 3 has an FG loop of the same length as the wild type 10 Fn3 domain, ie, 10 residues 77-86 of SEQ ID NO: 37 are of SEQ ID NO: 3 10 residues 69-78 were exchanged. In contrast, the FG loop of the IGF-IR binder having SEQ ID NO: 2 is shorter in length than the corresponding FG loop of the wild type 10 Fn3 domain, ie, 10 residues 77-86 of SEQ ID NO: 37. Were replaced at 6 residues 69-74 of SEQ ID NO: 2. Finally, the FG loop of the EGFR binder having SEQ ID NO: 39 is shorter in length than the corresponding FG loop of the wild type 10 Fn3 domain, ie, the 10 residues 77-86 of SEQ ID NO: 37 are sequenced. Exchanged at 15 residues 69-83 of number: 39.
従って、いくつかの実施形態では、BC、DE、およびFGから選択される一以上のループは、野生型ヒト10Fn3における対応するループと比べて、長さにおいて伸長または短縮されてもよい。いくつかの実施形態では、ループの長さを2−25アミノ酸分、伸長することができる。いくつかの実施形態では、ループの長さを1−11アミノ酸分、短縮することができる。特に、10Fn3のFGループは12残基長である一方、抗体重鎖における対応するループは4から28残基の範囲である。それゆえ、抗原結合を最適化するために、10Fn3のFGループの長さは、4−28残基のCDR3の範囲を覆うように、長さならびに配列において変化され、抗原結合において最も高い可能な可動性および親和性を獲得する。いくつかの実施形態では、インテグリン結合モチーフ「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」(RGD)(配列番号:37のアミノ酸78−80)の一以上の残基が、インテグリン結合を撹乱するように交換され得る。一実施形態では、RGD配列は、極性アミノ酸−中性アミノ酸−酸性アミノ酸配列(N末端からC末端方向)により交換される。別の実施形態では、RGD配列はSGEで交換される。 Thus, in some embodiments, one or more loops selected from BC, DE, and FG may be extended or shortened in length compared to the corresponding loop in wild type human 10 Fn3. In some embodiments, the length of the loop can be extended by 2-25 amino acids. In some embodiments, the loop length can be shortened by 1-11 amino acids. In particular, the FG loop of 10 Fn3 is 12 residues long while the corresponding loop in the antibody heavy chain ranges from 4 to 28 residues. Therefore, to optimize antigen binding, the length of the 10 Fn3 FG loop is varied in length as well as sequence to cover the range of 4-28 residue CDR3, and is most likely in antigen binding Gains mobility and affinity. In some embodiments, one or more residues of the integrin binding motif “arginine-glycine-aspartic acid” (RGD) (amino acids 78-80 of SEQ ID NO: 37) can be exchanged to disrupt integrin binding. . In one embodiment, the RGD sequence is exchanged by a polar amino acid-neutral amino acid-acidic amino acid sequence (N-terminal to C-terminal direction). In another embodiment, the RGD sequence is exchanged with SGE.
10Fn3、つまり「10Fn3足場」の非リガンド結合配列は、10Fn3ドメインがリガンド結合機能および/または構造安定性を保持するという条件で、変化され得る。いくつかの実施形態では、Asp7、Glu9、およびAsp23の一以上は、たとえば、非負荷電アミノ酸残基(たとえばAsn、Lys等)などの他のアミノ酸により交換される。これらの変異は、野生型形態と比べて、中性pHにて、変異体10Fn3のより大きな安定性を促進する効果を有することが報告された(PCT国際公開第02/04523号を参照されたい)。有益なまたは中間的な10Fn3足場における様々なさらなる改変が開示されている。例えば、Batori et al.,Protein Eng.2002 15(12):1015−20;Koide et al.,Biochemistry 2001 40(34):10326−33を参照されたい。 The non-ligand binding sequence of 10 Fn3, a “ 10 Fn3 scaffold” can be altered, provided that the 10 Fn3 domain retains ligand binding function and / or structural stability. In some embodiments, one or more of Asp7, Glu9, and Asp23 are replaced by other amino acids, such as, for example, non-negatively charged amino acid residues (eg, Asn, Lys, etc.). These mutations have been reported to have the effect of promoting greater stability of mutant 10 Fn3 at neutral pH compared to the wild type form (see PCT WO 02/04523). Wanna) Various further modifications in beneficial or intermediate 10 Fn3 scaffolds have been disclosed. For example, Batori et al. , Protein Eng. 2002 15 (12): 1015-20; Koide et al. Biochemistry 2001 40 (34): 10326-33.
10Fn3足場は、一以上の保存的置換によって修飾され得る。10Fn3足場中の5%、10%、20%、またはさらに30%以上ものアミノ酸が、リガンドに対する10Fn3の親和性を実質的に変化することなく、保存的置換により変化され得る。特定の実施形態では、足場は、約0−15、0−10、0−8、0−6、0−5、0−4、0−3、1−15、1−10、1−8、1−6、1−5、1−4、1−3、2−15、2−10、2−8、2−6、2−5、2−4、5−15または5−10個の保存的アミノ酸置換を含み得る。例示的な実施形態では、足場修飾は、好ましくは、リガンドに対する10Fn3バインダーの結合親和性を100分の1、50分の1、25分の1、10分の1、5分の1、または2分の1未満まで低下させる。このような変化は、インビボで10Fn3の免疫原性を変化する場合があり、免疫原性が減少する場合には、このような変化は望ましいであろう。本明細書で用いる場合、「保存的置換基」は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似している残基である。すなわち、保存的置換基およびその参照残基は、同様のサイズ、形状、電荷、共有結合もしくは水素結合を形成する能力を含む化学的特性などを有する。好ましい保存的置換は、Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345−352 (1978 & Supp.)において承認された点突然変異について定義された基準を満たすものである。保存的置換の例は、以下のグループ内での置換である:(a)バリン、グリシン;(b)グリシン、アラニン;(c)バリン、イソロイシン、ロイシン;(d)アスパラギン酸、グルタミン酸;(e)アスパラギン、グルタミン;(f)セリン、トレオニン;(g)リジン、アルギニン、メチオニン;および(h)フェニルアラニン、チロシン。 The 10 Fn3 scaffold can be modified by one or more conservative substitutions. As many as 5%, 10%, 20%, or even 30% or more of the amino acids in the 10 Fn3 scaffold can be altered by conservative substitutions without substantially changing the affinity of 10 Fn3 for the ligand. In certain embodiments, the scaffold is about 0-15, 0-10, 0-8, 0-6, 0-5, 0-4, 0-3, 1-15, 1-10, 1-8, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 2-15, 2-10, 2-8, 2-6, 2-5, 2-4, 5-15 or 5-10 storage Amino acid substitutions may be included. In exemplary embodiments, the scaffold modification preferably has a binding affinity of 10 Fn3 binder to the ligand of 1/100, 50/25, 10/5, or Reduce to less than half. Such changes may change the immunogenicity of 10 Fn3 in vivo, and such changes would be desirable if immunogenicity is reduced. As used herein, a “conservative substituent” is a residue that is physically or functionally similar to a corresponding reference residue. That is, conservative substituents and their reference residues have similar size, shape, charge, chemical properties, including the ability to form covalent or hydrogen bonds, and the like. Preferred conservative substitutions are described in Dayhoff et al. , Atlas of Protein Sequence and Structure 5: 345-352 (1978 & Supp.). Examples of conservative substitutions are substitutions within the following groups: (a) valine, glycine; (b) glycine, alanine; (c) valine, isoleucine, leucine; (d) aspartic acid, glutamic acid; ) Asparagine, glutamine; (f) serine, threonine; (g) lysine, arginine, methionine; and (h) phenylalanine, tyrosine.
一態様において、本出願はフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質、例えば、少なくとも一つの10Fn3ドメインを含み、DK配列を欠くC末端テールを有するポリペプチドを提供する。例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、配列番号:4のアミノ酸配列を含むC末端テールを有する10Fn3ドメインを含む。このようなフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、一以上のDK配列を含有するフィブロネクチンをベースとする足場と比べて、改善された安定性を有する。 In one aspect, the application provides a fibronectin based scaffold protein, eg, a polypeptide having a C-terminal tail that includes at least one 10 Fn3 domain and lacks a DK sequence. In an exemplary embodiment, a fibronectin based scaffold protein comprises a 10 Fn3 domain with a C-terminal tail comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. Such fibronectin based scaffold proteins have improved stability compared to fibronectin based scaffolds containing one or more DK sequences.
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、配列番号:1のアミノ酸配列を有するヒト10Fn3ドメインと、少なくとも40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%または90%同一性を有する10Fn3ドメインを含む。変動(variability)の大半は、一般に一以上のループで起こる。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質における10Fn3ドメインのそれぞれのβまたはβ様鎖は、このような変動が生理学的条件においてポリペプチドの安定性を撹乱しないという条件で、配列番号:1の対応するβまたはβ様鎖の配列と少なくとも80%、85%、90%、95%または100%同一であるアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。例示的な実施形態では、10Fn3ドメインは、500nM、100nM、1nM、500pM、100pM未満またはそれ以下のKDで所望の標的に結合する。例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、野生型10Fn3ドメイン、特に野生型ヒト10Fn3ドメインによって結合されない標的に、特異的に結合する。 In some embodiments, the fibronectin based scaffold protein comprises a human 10 Fn3 domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and at least 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, Contains 10 Fn3 domains with 75%, 80%, 85% or 90% identity. Most of the variability generally occurs in one or more loops. Each β or β-like chain of the 10 Fn3 domain in a fibronectin based scaffold protein has a corresponding β of SEQ ID NO: 1, provided that such variation does not disturb the stability of the polypeptide in physiological conditions. Or comprises, consists essentially of or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95% or 100% identical to the sequence of the β-like chain. In the exemplary embodiment, 10 Fn3 domain, 500nM, 100nM, 1nM, 500pM , bind the desired target with 100pM or less than less K D. In an exemplary embodiment, a fibronectin based scaffold protein specifically binds to a target that is not bound by a wild type 10 Fn3 domain, particularly a wild type human 10 Fn3 domain.
いくつかの実施形態では、本開示内容は、10Fn3ドメインを含むポリペプチドを提供し、ここに、該10Fn3ドメインは、ループ、AB;ループ、BC;ループ、CD;ループ、DE;ループ、EF;およびループ、FGを含み、かつ、ヒト10Fn3ドメインの対応するループの配列と比べて変化したアミノ酸配列を備えるループBC、DEおよびFGから選択される、少なくとも一つのループを有するものである。いくつかの実施形態では、BCおよびFGループが変化されている。いくつかの実施形態では、BC、DEおよびFGループが変化されている、すなわち該10Fn3ドメインは天然に存在しないループを含む。「変化した」によって、鋳型配列(すなわち対応するヒトフィブロネクチンドメイン)に比べて一以上のアミノ酸配列変化を意味し、アミノ酸付加、欠失および置換を含む。アミノ酸配列を変化させることは、一般に核酸コード配列の意図的、盲目的、または自発的な配列変動を通して達成されてもよく、任意の技術、たとえばPCR、エラープローンPCR、または化学的DNA合成によって起こってもよい。 In some embodiments, the present disclosure provides a polypeptide comprising a 10 Fn3 domain, here, the 10 Fn3 domain, loop, AB; loop, BC; loop, CD; loop, DE; loop, EF; and having at least one loop selected from loop BC, DE and FG comprising a loop, FG, and comprising an amino acid sequence that is altered compared to the sequence of the corresponding loop of the human 10 Fn3 domain . In some embodiments, the BC and FG loops are changed. In some embodiments, the BC, DE and FG loops are altered, ie the 10 Fn3 domain comprises a non-naturally occurring loop. By “altered” is meant one or more amino acid sequence changes relative to the template sequence (ie, the corresponding human fibronectin domain), including amino acid additions, deletions and substitutions. Altering the amino acid sequence may generally be accomplished through intentional, blind or spontaneous sequence variation of the nucleic acid coding sequence and occurs by any technique, such as PCR, error-prone PCR, or chemical DNA synthesis. May be.
いくつかの実施形態では、BC、DEおよびFGから選択される一以上のループは、対応するヒトフィブロネクチンループと比べて、長さにおいて伸長または短縮してもよい。いくつかの実施形態では、ループの長さは2−25アミノ酸分、伸長することができる。いくつかの実施形態では、ループの長さは1−11アミノ酸分、短縮することができる。特に、ヒト10Fn3のFGループは12残基長である一方、抗体重鎖における対応するループは4−28残基の範囲である。それゆえ、抗原結合を最適化するために、10Fn3のFGループの長さは、4−28残基のCDR3の範囲を覆うように、長さならびに配列において変化され、抗原結合において最も高い可能な可動性および親和性を獲得する。 In some embodiments, one or more loops selected from BC, DE and FG may extend or shorten in length compared to the corresponding human fibronectin loop. In some embodiments, the loop length can be extended by 2-25 amino acids. In some embodiments, the loop length can be shortened by 1-11 amino acids. In particular, the FG loop of human 10 Fn3 is 12 residues long, while the corresponding loop in the antibody heavy chain ranges from 4-28 residues. Therefore, to optimize antigen binding, the length of the 10 Fn3 FG loop is varied in length as well as sequence to cover the range of 4-28 residue CDR3, and is most likely in antigen binding Gains mobility and affinity.
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、少なくとも一つの選択されたBC、DEおよびFGが変化される、配列番号:1の非ループ領域と少なくとも80、85、90、95、98または100%同一のアミノ酸配列を有する10Fn3ドメインを含む。いくつかの実施形態では、変化したBCループは、最大10のアミノ酸置換、最大4のアミノ酸欠失、最大10のアミノ酸挿入、またはそれらの組合せを有する。いくつかの実施形態では、変化したDEループは、最大6のアミノ酸置換、最大4のアミノ酸欠失、最大13のアミノ酸挿入、またはそれらの組合せを有する。いくつかの実施形態では、FGループは、最大12のアミノ酸置換、最大11のアミノ酸欠失、最大25のアミノ酸挿入、またはそれらの組合せを有する。 In some embodiments, the fibronectin based scaffold protein is a non-loop region of SEQ ID NO: 1 and at least 80, 85, 90, 95, wherein at least one selected BC, DE and FG are altered. It contains 10 Fn3 domains with 98 or 100% identical amino acid sequence. In some embodiments, the altered BC loop has up to 10 amino acid substitutions, up to 4 amino acid deletions, up to 10 amino acid insertions, or combinations thereof. In some embodiments, the altered DE loop has up to 6 amino acid substitutions, up to 4 amino acid deletions, up to 13 amino acid insertions, or combinations thereof. In some embodiments, the FG loop has up to 12 amino acid substitutions, up to 11 amino acid deletions, up to 25 amino acid insertions, or a combination thereof.
特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、一般に以下の配列により定義される10Fn3ドメインを含む:
10Fn3ドメインは一般に、配列番号:37のアミノ酸番号1から開始する。しかしながら、アミノ酸欠失を備えるドメインもまた、本発明により包含される。いくつかの実施形態では、配列番号:37の最初の8アミノ酸が欠失している。さらなる配列もまた、配列番号:37の1−94に対応するアミノ酸または配列番号:37のアミノ酸9−94を有する、10Fn3ドメインのNまたはC末端に付加され得る。例えば、さらなるMG配列が10Fn3ドメインのN末端に配置されてもよい。このMは通常切断され、N末端にGが残るだろう。いくつかの実施形態では、N末端伸長は、M、MG、Gおよび配列番号:19−21のいずれかからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
The 10 Fn3 domain generally begins at
10Fn3ドメインは、長さにおいて1−20、1−15、1−10、1−8、1−5、1−4、1−3、1−2または1アミノ酸のN末端伸長を任意に含み得る。例示的なN末端伸長は、(一文字アミノ酸コードにより表わされる)M、MG、G、MGVSDVPRDL(配列番号:19)、VSDVPRDL(配列番号:20)およびGVSDVPRDL(配列番号:21)、または配列番号:19、20もしくは21のいずれか1つのN末端切断型(truncation)を含む。他の適したN末端伸長は、例えば、XnSDVPRDL(配列番号:26)、XnDVPRDL(配列番号:27)、XnVPRDL(配列番号:28)、XnPRDL(配列番号:29)、XnRDL(配列番号:30)、XnDL(配列番号:31)またはXnLを含み、n=0、1または2アミノ酸であり、n=1である場合、XはMetまたはGlyであり、n=2である場合、XはMet−Glyである。Met−Gly配列が10Fn3ドメインのN末端に付加される場合、このMは通常切断され、N末端にGが残るだろう。 The 10 Fn3 domain optionally includes an N-terminal extension of 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 or 1 amino acid in length obtain. Exemplary N-terminal extensions are M, MG, G, MGVSDVPRDL (SEQ ID NO: 19), VSDVPRDL (SEQ ID NO: 20) and GVSDVPRDL (SEQ ID NO: 21), or SEQ ID NO: N-terminal truncation of any one of 19, 20, or 21 is included. Other suitable N-terminal extensions are, for example, X n SDVPRDL (SEQ ID NO: 26), X n DVPRDL (SEQ ID NO: 27), X n VPRDL (SEQ ID NO: 28), X n PRDL (SEQ ID NO: 29) X n RDL (SEQ ID NO: 30), X n DL (SEQ ID NO: 31) or X n L, where n = 0, 1 or 2 amino acids and n = 1, X is Met or Gly And when n = 2, X is Met-Gly. If a Met-Gly sequence is added to the N-terminus of the 10 Fn3 domain, this M will normally be cleaved, leaving a G at the N-terminus.
本明細書で提供されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、配列番号:4のアミノ酸配列を含むC末端テールを有する10Fn3ドメインを含む。例示的なC末端テールは、長さにおいて1−20、1−15、1−10、1−8、1−5または1−4アミノ酸であるポリペプチドを含む。テール配列の具体的な例は、例えば、EIEK(配列番号:4)、EGSGC(配列番号:5)、EIEKPCQ(配列番号:6)、EIEKPSQ(配列番号:32)、EIEKP(配列番号:33)、EIEKPS(配列番号:34)またはEIEKPC(配列番号:35)を含む、必須としてなる、またはからなる、ポリペプチドを含む。このようなC末端配列は本明細書においてテールまたは伸長と呼ばれ、本明細書でさらに記載される。例示的な実施形態では、C末端テールは配列番号:6のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。好ましい実施形態では、C末端配列はDK配列を欠く。例示的な実施形態では、C末端テールは、PEGによる修飾を容易にする残基、すなわちリジンまたはシステイン残基を含む。好ましい実施形態では、C末端テールはDK配列を欠き、システイン残基を含む。 The fibronectin based scaffold protein provided herein comprises a 10 Fn3 domain with a C-terminal tail comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. Exemplary C-terminal tails include polypeptides that are 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5 or 1-4 amino acids in length. Specific examples of tail sequences include, for example, EIEK (SEQ ID NO: 4), EGSGC (SEQ ID NO: 5), EIEKPCQ (SEQ ID NO: 6), EIEKPSQ (SEQ ID NO: 32), and EIEKP (SEQ ID NO: 33). A polypeptide comprising, consisting of, consisting of, consisting of, consisting of, EIEKPS (SEQ ID NO: 34) or EIEKPC (SEQ ID NO: 35). Such C-terminal sequences are referred to herein as tails or extensions and are further described herein. In an exemplary embodiment, the C-terminal tail comprises, consists or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In a preferred embodiment, the C-terminal sequence lacks a DK sequence. In an exemplary embodiment, the C-terminal tail includes residues that facilitate modification with PEG, ie, lysine or cysteine residues. In a preferred embodiment, the C-terminal tail lacks the DK sequence and contains a cysteine residue.
特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、N末端伸長およびC末端テールの両方を有する10Fn3ドメインを含む。いくつかの実施形態では、His6−タグがN末端またはC末端に配置されてもよい。 In certain embodiments, a fibronectin based scaffold protein comprises a 10 Fn3 domain with both an N-terminal extension and a C-terminal tail. In some embodiments, a His6-tag may be placed at the N-terminus or C-terminus.
例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、VEGFR2に結合する10Fn3ドメインを含む。特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、500nM未満のKDでVEGFR2に結合し、BCループは配列番号:43のアミノ酸配列を含み、DEは配列番号:44のアミノ酸配列を含み、FGループは配列番号:45のアミノ酸配列を含み、かつ該タンパク質はDK配列を欠くC末端テールを含む。例示的な実施形態では、C末端テールはEIEK(配列番号:4)、EGSGC(配列番号:5)、EIEKPCQ(配列番号:6)、EIEKPSQ(配列番号:32)、EIEKP(配列番号:33)、EIEKPS(配列番号:34)またはEIEKPC(配列番号:35)を含む。好ましい実施形態では、C末端テールはEIEK(配列番号:4)またはEIEKPCQ(配列番号:6)を含む。 In an exemplary embodiment, a fibronectin based scaffold protein comprises a 10 Fn3 domain that binds to VEGFR2. In certain embodiments, the scaffold proteins based on fibronectin, bind to VEGFR2 with a K D of less than 500 nM, BC loops SEQ ID NO: comprises the amino acid sequence of 43, DE SEQ ID NO: comprises the amino acid sequence of the 44 , The FG loop comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and the protein comprises a C-terminal tail lacking the DK sequence. In an exemplary embodiment, the C-terminal tail is EIEK (SEQ ID NO: 4), EGSGC (SEQ ID NO: 5), EIEKPCQ (SEQ ID NO: 6), EIEKPSQ (SEQ ID NO: 32), EIEKP (SEQ ID NO: 33). , EIEKPS (SEQ ID NO: 34) or EIEKPC (SEQ ID NO: 35). In a preferred embodiment, the C-terminal tail comprises EIEK (SEQ ID NO: 4) or EIEKPCQ (SEQ ID NO: 6).
特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、二以上の10Fn3ドメインを含む多価タンパク質である。例えば、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、共有結合される2、3またはそれより多い10Fn3ドメインを含んでもよい。例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、2つの10Fn3ドメインを含む二価または二量体タンパク質である。特定の実施形態では、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、第一の標的分子に結合する第一の10Fn3ドメインおよび第二の標的分子に結合する第二の10Fn3ドメインを含む。第一および第二の標的分子は同一または異なる標的分子であってもよい。第一および第二の標的分子が同一である場合、10Fn3ドメイン、すなわち結合ループは、同一または異なっていてもよい。それゆえ、第一および第二の10Fn3ドメインは、同一の標的ではあるが異なるエピトープで結合する。 In certain embodiments, the fibronectin based scaffold protein is a multivalent protein comprising two or more 10 Fn3 domains. For example, a multivalent fibronectin based scaffold protein may comprise 2, 3 or more 10 Fn3 domains covalently linked. In an exemplary embodiment, the fibronectin based scaffold protein is a divalent or dimeric protein comprising two 10 Fn3 domains. In certain embodiments, a multivalent fibronectin based scaffold protein comprises a first 10 Fn3 domain that binds to a first target molecule and a second 10 Fn3 domain that binds to a second target molecule. The first and second target molecules may be the same or different target molecules. If the first and second target molecules are the same, the 10 Fn3 domains, ie the binding loops, may be the same or different. Therefore, the first and second 10 Fn3 domains bind at the same target but at different epitopes.
例示的な実施形態では、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の各10Fn3ドメインは、500nM、100nM、1nM、500pM、100pM未満またはそれ以下のKDで所望の標的に結合する。例示的な実施形態では、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の各10Fn3ドメインは、野生型10Fn3ドメイン、特に野生型ヒト10Fn3ドメインによって結合されない標的に、特異的に結合する。 In the exemplary embodiment, each 10 Fn3 domain scaffold proteins that multivalent fibronectin based binds 500 nM, 100 nM, 1 nM, 500 pM, the desired target with 100pM or less than less K D. In an exemplary embodiment, each 10Fn3 domain of a multivalent fibronectin based scaffold protein specifically binds to a target that is not bound by a wild type 10 Fn3 domain, particularly a wild type human 10 Fn3 domain.
多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質における10Fn3ドメインは、ポリペプチドリンカーにより結合され得る。例示的なポリペプチドリンカーとして、1−20、1−15、1−10、1−8、1−5、1−4、1−3または1−2アミノ酸を有するポリペプチドが挙げられる。適したポリペプチドリンカーの具体例は、本明細書にさらに記載される。特定の実施形態では、該リンカーは、本明細書に記載されるC末端テールポリペプチド、本明細書に記載されるN末端伸長ポリペプチド、以下に記載されるリンカーポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。 The 10 Fn3 domains in a multivalent fibronectin based scaffold protein can be joined by a polypeptide linker. Exemplary polypeptide linkers include polypeptides having 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3 or 1-2 amino acids. Specific examples of suitable polypeptide linkers are further described herein. In certain embodiments, the linker is a C-terminal tail polypeptide as described herein, an N-terminal extension polypeptide as described herein, a linker polypeptide as described below, or any of them It may be a combination.
多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の場合には、好ましくは10Fn3ドメインのどれもがDK配列を含有するC末端テールを含まない。例示的な実施形態では、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は二以上の10Fn3ドメインを含み、ここに、各ドメインは、DK配列を含有しないC末端テールを含むものである。特定の実施形態では、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は二以上の10Fn3ドメインを含み、ここに、各ドメインは、DK配列を含有せず、リジンまたはシステイン残基などの、PEG部分の付加のために適した残基を含有するC末端テールを含むものである。特定の実施形態では、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は二以上の10Fn3ドメインを含み、ここに、各ドメインは、配列番号:4のアミノ酸配列を含むC末端テールを含むものである。特定の実施形態では、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は二以上の10Fn3ドメインを含み、ここに、N末端10Fn3ドメインは配列番号:4のアミノ酸配列を含むC末端テールを含み、C末端10Fn3ドメインはEIEK(配列番号:4)、EGSGC(配列番号:5)、EIEKPCQ(配列番号:6)、EIEKPSQ(配列番号:32)、EIEKP(配列番号:33)、EIEKPS(配列番号:34)またはEIEKPC(配列番号:35)のアミノ酸配列を含むC末端テールを含むものである。 In the case of multivalent fibronectin based scaffold proteins, preferably none of the 10 Fn3 domains contain a C-terminal tail containing a DK sequence. In an exemplary embodiment, a multivalent fibronectin based scaffold protein comprises two or more 10 Fn3 domains, wherein each domain comprises a C-terminal tail that does not contain a DK sequence. In certain embodiments, the multivalent fibronectin based scaffold protein comprises two or more 10 Fn3 domains, wherein each domain does not contain a DK sequence and is a PEG moiety, such as a lysine or cysteine residue. It includes a C-terminal tail containing residues suitable for addition. In certain embodiments, a multivalent fibronectin based scaffold protein comprises two or more 10 Fn3 domains, wherein each domain comprises a C-terminal tail comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In certain embodiments, the multivalent fibronectin based scaffold protein comprises two or more 10 Fn3 domains, wherein the N-terminal 10 Fn3 domain comprises a C-terminal tail comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; The terminal 10 Fn3 domains are EIEK (SEQ ID NO: 4), EGSGC (SEQ ID NO: 5), EIEKPCQ (SEQ ID NO: 6), EIEKPSQ (SEQ ID NO: 32), EIEKP (SEQ ID NO: 33), EIEKPS (SEQ ID NO: 34) or a C-terminal tail comprising the amino acid sequence of EIEKPC (SEQ ID NO: 35).
10Fn3ドメインのループ配列を変えることにより、任意の所望の標的に結合するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を生成することができる。例示的な実施形態では、増大した安定性を有する、本明細書で提供されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、例えば、TNFα、VEGFR2、IGF−IRまたはEGFRなどの治療上望ましい標的に結合し得る。特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、以下の標的:EGFR、IGF−IR、HSAおよびPCSK9、または前述のいずれかの断片、の一以上に結合しない。特定の実施形態では、単一の10Fn3ドメインを含むフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、以下の標的:EGFR、IGF−IR、HSAおよびPCSK9、または前述のいずれかの断片、の一以上に結合しない。特定の実施形態では、単一の10Fn3ドメインを含むフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、以下の標的:EGFR、IGF−IR、HSAおよびPCSK9、または前述のいずれかの断片、のいずれかに結合しない。特定の実施形態では、2つの10Fn3ドメインを含むフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、以下の標的:EGFR、IGF−IR、HSAおよびPCSK9、または前述のいずれかの断片、の一以上に結合しない。特定の実施形態では、2つの10Fn3ドメインを含むフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、標的分子の以下の組み合わせ:i)EGFRおよびIGF−IR;ii)EGFRおよび任意の他の標的タンパク質;またはiii)ヒト血清アルブミンおよび任意の他の標的タンパク質、の一以上に結合しない。特定の実施形態では、2つの10Fn3ドメインを含むフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、標的分子の以下の組み合わせ:i)EGFRおよびIGF−IR;ii)EGFRおよび任意の他の標的タンパク質;またはiii)ヒト血清アルブミンおよび任意の他の標的タンパク質、のいずれかに結合しない。 By altering the loop sequence of the 10 Fn3 domain, a fibronectin based scaffold protein can be generated that binds to any desired target. In exemplary embodiments, fibronectin based scaffold proteins provided herein that have increased stability bind to therapeutically desirable targets such as, for example, TNFα, VEGFR2, IGF-IR or EGFR. obtain. In certain embodiments, the fibronectin based scaffold protein does not bind to one or more of the following targets: EGFR, IGF-IR, HSA and PCSK9, or any of the aforementioned fragments. In certain embodiments, a fibronectin based scaffold protein comprising a single 10 Fn3 domain binds to one or more of the following targets: EGFR, IGF-IR, HSA and PCSK9, or any of the aforementioned fragments. do not do. In certain embodiments, a fibronectin based scaffold protein comprising a single 10 Fn3 domain binds to any of the following targets: EGFR, IGF-IR, HSA and PCSK9, or any of the aforementioned fragments. do not do. In certain embodiments, a fibronectin based scaffold protein comprising two 10 Fn3 domains does not bind to one or more of the following targets: EGFR, IGF-IR, HSA and PCSK9, or any of the aforementioned fragments . In certain embodiments, a fibronectin based scaffold protein comprising two 10 Fn3 domains is a combination of the following target molecules: i) EGFR and IGF-IR; ii) EGFR and any other target protein; or iii ) Does not bind to one or more of human serum albumin and any other target protein. In certain embodiments, a fibronectin based scaffold protein comprising two 10 Fn3 domains is a combination of the following target molecules: i) EGFR and IGF-IR; ii) EGFR and any other target protein; or iii ) Does not bind to any of human serum albumin and any other target protein.
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体
特定の実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、2つの10Fn3ドメインを含む二量体である。一実施形態では、本出願は、(i)配列番号:40のアミノ酸配列を有するBCループ、配列番号:41のアミノ酸配列を有するDEループ、配列番号:42のアミノ酸配列を有するFGループ、および配列番号:4−6のいずれか一つのアミノ酸配列を含むC末端テールを含み、IGF−IRに結合するものである、10Fn3ドメイン;ならびに(ii)配列番号:43のアミノ酸配列を有するBCループ、配列番号:44のアミノ酸配列を有するDEループ、配列番号:45のアミノ酸配列を有するFGループ、および配列番号:4−6のいずれか一つのアミノ酸配列を含むC末端テールを含み、VEGFR2に結合するものである、10Fn3ドメイン:からなる群から選択される第一および第二の10Fn3ドメインを含む、V/Iフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体を提供する。例示的な実施形態では、VEGFR2およびIGF−IR結合10Fn3ドメインのそれぞれは、500nM、100nM、1nM、500pM、100pM未満またはそれ以下のKDでその標的に結合する。
Fibronectin based scaffold protein dimers In certain embodiments, the fibronectin based scaffold proteins described herein are dimers comprising two 10 Fn3 domains. In one embodiment, the application provides (i) a BC loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, a DE loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, an FG loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and a sequence A 10 Fn3 domain comprising a C-terminal tail comprising any one of the amino acid sequences of Nos .: 4-6 and binding to IGF-IR; and (ii) a BC loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43; A DE loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, an FG loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and a C-terminal tail containing any one amino acid sequence of SEQ ID NOs: 4-6, and binds to VEGFR2. those, 10 Fn3 domains: including first and second 10 Fn3 domain is selected from the group consisting of, / A I fibronectin provide anchorage protein dimer based. In the exemplary embodiment, each of the VEGFR2 and IGF-IR binding 10 Fn3 domain binds 500 nM, 100 nM, 1 nM, 500 pM, its target with 100pM or less than less K D.
特定の実施形態では、V/Iフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、N末端からC末端の順に、IGF−IR結合ドメインおよびVEGFR2結合ドメインを含む。例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、(i)配列番号:40のアミノ酸配列を有するBCループ、配列番号:41のアミノ酸配列を有するDEループ、配列番号:42のアミノ酸配列を有するFGループ、および配列番号:4のアミノ酸配列を含むC末端テールを含み、IGF−IRに結合するものである、第一の10Fn3ドメイン;ならびに(ii)配列番号:43のアミノ酸配列を有するBCループ、配列番号:44のアミノ酸配列を有するDEループ、配列番号:45のアミノ酸配列を有するFGループ、および配列番号:6のアミノ酸配列を含むC末端テールを含み、VEGFR2に結合するものである、第二の10Fn3ドメイン:を含む。例示的な実施形態では、VEGFR2およびIGF−IR結合10Fn3ドメインのそれぞれは、500nM、100nM、1nM、500pM、100pM未満またはそれ以下のKDでその標的に結合する。 In certain embodiments, a V / I fibronectin based scaffold protein dimer comprises an IGF-IR binding domain and a VEGFR2 binding domain in order from the N-terminus to the C-terminus. In an exemplary embodiment, a fibronectin based scaffold protein dimer comprises (i) a BC loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, a DE loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42. A first 10 Fn3 domain comprising an FG loop having the amino acid sequence of: and a C-terminal tail comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and binding to IGF-IR; and (ii) of SEQ ID NO: 43 A BC loop having an amino acid sequence, a DE loop having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, an FG loop having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and a C-terminal tail comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and binding to VEGFR2 A second 10 Fn3 domain. In the exemplary embodiment, each of the VEGFR2 and IGF-IR binding 10 Fn3 domain binds 500 nM, 100 nM, 1 nM, 500 pM, its target with 100pM or less than less K D.
特定の実施形態では、V/Iフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、N末端からC末端の順に、VEGFR2結合ドメインおよびIGF−IR結合ドメインを含む。例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、(i)配列番号:43のアミノ酸配列を有するBCループ、配列番号:44のアミノ酸配列を有するDEループ、配列番号:45のアミノ酸配列を有するFGループ、および配列番号:4のアミノ酸配列を含むC末端テールを含み、VEGFR2に結合するものである、第一の10Fn3ドメイン;ならびに(ii)配列番号:40のアミノ酸配列を有するBCループ、配列番号:41のアミノ酸配列を有するDEループ、配列番号:42のアミノ酸配列を有するFGループ、および配列番号:6のアミノ酸配列を含むC末端テールを含み、IGF−IRに結合するものである、第二の10Fn3ドメイン:を含む。例示的な実施形態では、VEGFR2およびIGF−IR結合10Fn3ドメインのそれぞれは、500nM、100nM、1nM、500pM、100pM未満またはそれ以下のKDでその標的に結合する。 In certain embodiments, a V / I fibronectin based scaffold protein dimer comprises a VEGFR2 binding domain and an IGF-IR binding domain in order from the N-terminus to the C-terminus. In an exemplary embodiment, a fibronectin based scaffold protein dimer comprises (i) a BC loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43, a DE loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45. A first 10 Fn3 domain comprising an FG loop having the amino acid sequence of: and a C-terminal tail comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and binding to VEGFR2; and (ii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 A BC loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, an FG loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and a C-terminal tail comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and binding to IGF-IR A second 10 Fn3 domain. In the exemplary embodiment, each of the VEGFR2 and IGF-IR binding 10 Fn3 domain binds 500 nM, 100 nM, 1 nM, 500 pM, its target with 100pM or less than less K D.
特定の実施形態では、V/Iフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、(i)配列番号:2と少なくとも90%、95%、97%、98%、99%または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、配列番号:4−6のいずれか一つのアミノ酸配列を有するC末端テールを含む、必須としてなる、またはからなるものであり、IGF−IRに結合するものである、10Fn3ドメイン;ならびに(ii)配列番号:3と少なくとも90%、95%、97%、98%、99%または100%同一性を有するアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、配列番号:4−6のいずれか一つのアミノ酸配列を有するC末端テールを含む、必須としてなる、またはからなるものであり、VEGFR2に結合するものである、10Fn3ドメイン:からなる群から選択される第一および第二の10Fn3ドメインを含む。例示的な実施形態では、VEGFR2およびIGF−IR結合10Fn3ドメインのそれぞれは、500nM、100nM、1nM、500pM、100pM未満またはそれ以下のKDでその標的に結合する。例示的な実施形態では、第一および第二の10Fn3ドメインはポリペプチドリンカーを介して連結される。特定の実施形態では、V/Iフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、N末端VEGFR2結合10Fn3ドメインおよびC末端IGF−IR結合10Fn3ドメインを含む。特定の実施形態では、V/Iフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、N末端IGF−IR結合10Fn3ドメインおよびC末端VEGFR2結合10Fn3ドメインを含む。特定の実施形態では、N末端10Fn3ドメインは配列番号:4のアミノ酸配列を有するC末端テールを含み、C末端10Fn3ドメインは配列番号:6のアミノ酸配列を有するC末端テールを含む。 In certain embodiments, the V / I fibronectin based scaffold protein dimer has (i) at least 90%, 95%, 97%, 98%, 99% or 100% identity with SEQ ID NO: 2. Comprising, having, or consisting of an amino acid sequence having, and comprising, becoming, or consisting of a C-terminal tail having any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4-6, in IGF-IR A 10 Fn3 domain that binds; and (ii) an amino acid sequence having at least 90%, 95%, 97%, 98%, 99% or 100% identity with SEQ ID NO: 3, Or comprising, consisting of, or consisting of a C-terminal tail having any one amino acid sequence of SEQ ID NO: 4-6 , One that binds to VEGFR2, 10 Fn3 domains: including first and second 10 Fn3 domain is selected from the group consisting of. In the exemplary embodiment, each of the VEGFR2 and IGF-IR binding 10 Fn3 domain binds 500 nM, 100 nM, 1 nM, 500 pM, its target with 100pM or less than less K D. In an exemplary embodiment, the first and second 10 Fn3 domains are linked via a polypeptide linker. In certain embodiments, a V / I fibronectin based scaffold protein dimer comprises an N-terminal VEGFR2 binding 10 Fn3 domain and a C-terminal IGF-IR binding 10 Fn3 domain. In certain embodiments, a V / I fibronectin based scaffold protein dimer comprises an N-terminal IGF-IR binding 10 Fn3 domain and a C-terminal VEGFR2 binding 10 Fn3 domain. In certain embodiments, the N-terminal 10 Fn3 domain comprises a C-terminal tail having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the C-terminal 10 Fn3 domain comprises a C-terminal tail having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
特定の実施形態では、V/Iフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、配列番号:48−55のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、V/Iフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、配列番号:48のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、V/Iフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、配列番号:48−55のいずれか一つのアミノ酸配列と、少なくとも70、75、80、85、90、95、97、98、99または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む。 In certain embodiments, a V / I fibronectin based scaffold protein dimer comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 48-55. In other embodiments, the V / I fibronectin based scaffold protein dimer comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48. In some embodiments, the V / I fibronectin based scaffold protein dimer has an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 48-55 and at least 70, 75, 80, 85, 90, 95, Includes amino acid sequences with 97, 98, 99 or 100% identity.
特定の実施形態では、V/Iフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、N1−D1−C1−L−N2−D2−C2構造を有するポリペプチドを含み、ここに、N1およびN2は0−10アミノ酸を独立して含む任意のN末端伸長であり、D1およびD2は、(i)配列番号:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、97%、98%、99%または100%同一性を有する第10フィブロネクチンIII型ドメイン(10Fn3)、ここに、該10Fn3ドメインは500nM、100nM、1nM、500pM、100pM未満またはそれ以下のKDでIGF−IRに結合するものである、および(ii)配列番号:3に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、97%、98%、99%または100%同一性を有する10Fn3ドメイン、ここに、該10Fn3ドメインは500nM未満のKDでVEGFR2に結合するものである:からなる群から独立して選択され;Lは0−30アミノ酸残基を含むポリペプチドリンカーであり;C1は配列番号:4のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり;C2は配列番号:4、5または6のアミノ酸配列のいずれか一つを含む、必須としてなる、またはからなるものである。特定の実施形態では、D1はVEGFR2に結合し、D2はIGF−IRに結合する。他の実施形態では、D1はIGF−IRに結合し、D2はVEGFR2に結合する。 In certain embodiments, a V / I fibronectin based scaffold protein dimer comprises a polypeptide having a N1-D1-C1-L-N2-D2-C2 structure, wherein N1 and N2 are 0. Any N-terminal extension independently comprising −10 amino acids, wherein D1 and D2 are (i) at least 90%, 95%, 97%, 98%, 99% with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 10th fibronectin type III domain having 100% identity (10 Fn3), wherein, the said 10 Fn3 domains are those that bind 500 nM, 100 nM, 1 nM, 500 pM, the IGF-IR at 100pM less or less a K D And (ii) at least 90%, 95%, 97%, 98%, 99% with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 Here 10 Fn3 domain, with 100% identity, the 10 Fn3 domain is one that binds to VEGFR2 with a K D of less than 500 nM: it is independently selected from the group consisting of; L is 0-30 amino acid residues A polypeptide linker comprising a group; C1 comprises, comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; C2 comprises any one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 4, 5 or 6; It consists of or consists of. In certain embodiments, D1 binds to VEGFR2, and D2 binds to IGF-IR. In other embodiments, D1 binds to IGF-IR and D2 binds to VEGFR2.
特定の実施形態では、D1またはD2領域は、配列番号:43のアミノ酸配列を有するBCループ、配列番号:44のアミノ酸配列を有するDEループ、および配列番号:45のアミノ酸配列を有するFGループを含む、VEGFR2に結合する10Fn3ドメインであって、ここに、該10Fn3ドメインは100nM未満のKDでVEGFR2に結合するものである。 In certain embodiments, the D1 or D2 region comprises a BC loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43, a DE loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, and an FG loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45. , a 10 Fn3 domain that binds to VEGFR2, here, the 10 Fn3 domain is one that binds to VEGFR2 with a K D of less than 100 nM.
特定の実施形態では、D1またはD2領域は、以下のアミノ酸配列により表されるVEGFR2バインダーである:
VEGFR2に結合する10Fn3ドメインは、長さにおいて1−20、1−15、1−10、1−8、1−5、1−4、1−3、1−2または1アミノ酸のN末端伸長(N1またはN2)に、任意に連結され得る。例示的なN末端伸長は、(一文字アミノ酸コードにより表わされる)M、MG、G、MGVSDVPRDL(配列番号:19)、VSDVPRDL(配列番号:20)およびGVSDVPRDL(配列番号:21)、または配列番号:19、20もしくは21のいずれか1つのN末端切断型(truncation)を含む。他の適したN末端伸長は、例えば、XnSDVPRDL(配列番号:26)、XnDVPRDL(配列番号:27)、XnVPRDL(配列番号:28)、XnPRDL(配列番号:29)、XnRDL(配列番号:30)、XnDL(配列番号:31)またはXnLを含み、n=0、1または2アミノ酸であり、n=1である場合、XはMetまたはGlyであり、n=2である場合、XはMet−Glyである。好ましい実施形態では、N1は、配列番号:19のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。好ましい実施形態では、N2は、配列番号:20のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。 The 10 Fn3 domain that binds to VEGFR2 has an N-terminal extension of 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 or 1 amino acid in length It can be optionally linked to (N1 or N2). Exemplary N-terminal extensions are M, MG, G, MGVSDVPRDL (SEQ ID NO: 19), VSDVPRDL (SEQ ID NO: 20) and GVSDVPRDL (SEQ ID NO: 21), or SEQ ID NO: N-terminal truncation of any one of 19, 20, or 21 is included. Other suitable N-terminal extensions are, for example, X n SDVPRDL (SEQ ID NO: 26), X n DVPRDL (SEQ ID NO: 27), X n VPRDL (SEQ ID NO: 28), X n PRDL (SEQ ID NO: 29) X n RDL (SEQ ID NO: 30), X n DL (SEQ ID NO: 31) or X n L, where n = 0, 1 or 2 amino acids and n = 1, X is Met or Gly And when n = 2, X is Met-Gly. In a preferred embodiment, N1 comprises, consists essentially of or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In a preferred embodiment, N2 comprises, consists essentially of or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
VEGFR2に結合する10Fn3ドメインは、C末端テール(C1またはC2)を任意に含み得る。クレームされる発明のフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体のC末端テールは、DK配列を含有しない。例示的なC末端テールとして、長さにおいて1−20、1−15、1−10、1−8、1−5、1−4、1−3、1−2または1アミノ酸であるポリペプチドが挙げられる。C末端テールの具体例として、EIEKPSQ(配列番号:32)、EIEKPCQ(配列番号:6)およびEIEK(配列番号:4)が挙げられる。他の実施形態では、適したC末端テールは、例えば、以下のアミノ酸配列(一文字アミノ酸コードにより表わされる)の一つ:EIE、EIEKP(配列番号:33)、EIEKPS(配列番号:34)またはEIEKPC(配列番号:35)を含む、配列番号:4、6または32のC末端切断された断片であってもよい。他の適したC末端テールには、例えば、ES、EC、EGS、EGC、EGSGS(配列番号:36)またはEGSGC(配列番号:5)が挙げられる。特定の実施形態では、C1は、配列番号:4のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。特定の実施形態では、C2は、配列番号:4、5または6のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。好ましい実施形態では、C1は、配列番号:4のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、C2は、配列番号:6のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。 The 10 Fn3 domain that binds to VEGFR2 can optionally include a C-terminal tail (C1 or C2). The C-terminal tail of the claimed protein fibronectin-based scaffold protein dimer does not contain a DK sequence. Exemplary C-terminal tails include polypeptides that are 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 or 1 amino acid in length Can be mentioned. Specific examples of the C-terminal tail include EIEKPSQ (SEQ ID NO: 32), EIEKPCQ (SEQ ID NO: 6) and EIEK (SEQ ID NO: 4). In other embodiments, a suitable C-terminal tail is, for example, one of the following amino acid sequences (represented by the single letter amino acid code): EIE, EIEKP (SEQ ID NO: 33), EIEKPS (SEQ ID NO: 34) or EIEKPC It may be a C-terminal truncated fragment of SEQ ID NO: 4, 6 or 32, including (SEQ ID NO: 35). Other suitable C-terminal tails include, for example, ES, EC, EGS, EGC, EGSGS (SEQ ID NO: 36) or EGSGC (SEQ ID NO: 5). In certain embodiments, C1 comprises, consists of or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In certain embodiments, C2 comprises, consists of or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 5 or 6. In a preferred embodiment, C1 comprises, consists or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and C2 comprises, consists of, consists of, or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
特定の実施形態では、VEGFR2に結合する10Fn3ドメインは、N末端伸長およびC末端テールの両方を含む。例示的な実施形態では、N1はGlyまたはMet−Glyで始まり、C1はシステイン残基を含有せず、N2はMetで開始せず、かつC2はシステイン残基を含む。VEGFR2に結合する10Fn3ドメインの具体例は:(i)配列番号:3に示されるアミノ酸配列または(ii)配列番号:3に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%、90%、95%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドである。 In certain embodiments, the 10 Fn3 domain that binds to VEGFR2 comprises both an N-terminal extension and a C-terminal tail. In an exemplary embodiment, N1 begins with Gly or Met-Gly, C1 does not contain a cysteine residue, N2 does not start with Met, and C2 contains a cysteine residue. Specific examples of 10 Fn3 domains that bind to VEGFR2 are: (i) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or (ii) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and at least 85%, 90%, 95%, 97% , A polypeptide comprising an amino acid sequence having 98% or 99% identity.
特定の実施形態では、D1またはD2領域は、配列番号:40のアミノ酸配列を有するBCループ、配列番号:41のアミノ酸配列を有するDEループ、および配列番号:42のアミノ酸配列を有するFGループを含む、IGF−IRに結合する10Fn3ドメインであって、ここに、該10Fn3ドメインは100nM未満のKDでIGF−IRに結合するものである。 In certain embodiments, the D1 or D2 region comprises a BC loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, a DE loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, and an FG loop having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42. , a 10 Fn3 domain binding to IGF-IR, wherein the, the 10 Fn3 domain are those binding to IGF-IR with a K D of less than 100 nM.
特定の実施形態では、D1またはD2領域は、以下のアミノ酸配列により表されるIGF−IRバインダーである:
IGF−IRに結合する10Fn3ドメインは、長さにおいて1−20、1−15、1−10、1−8、1−5、1−4、1−3、1−2または1アミノ酸のN末端伸長(N1またはN2)に、任意に連結され得る。例示的なN末端伸長は、(一文字アミノ酸コードにより表わされる)M、MG、G、MGVSDVPRDL(配列番号:19)、VSDVPRDL(配列番号:20)およびGVSDVPRDL(配列番号:21)、または配列番号:19、20もしくは21のいずれか1つのN末端切断型(truncation)を含む。他の適したN末端伸長は、例えば、XnSDVPRDL(配列番号:26)、XnDVPRDL(配列番号:27)、XnVPRDL(配列番号:28)、XnPRDL(配列番号:29)、XnRDL(配列番号:30)、XnDL(配列番号:31)またはXnLを含み、n=0、1または2アミノ酸であり、n=1である場合、XはMetまたはGlyであり、n=2である場合、XはMet−Glyである。好ましい実施形態では、N1は、配列番号:19のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。好ましい実施形態では、N2は、配列番号:20のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。 The 10 Fn3 domain that binds to IGF-IR has a length of 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, or 1 amino acid in length. It can optionally be linked to a terminal extension (N1 or N2). Exemplary N-terminal extensions are M, MG, G, MGVSDVPRDL (SEQ ID NO: 19), VSDVPRDL (SEQ ID NO: 20) and GVSDVPRDL (SEQ ID NO: 21), or SEQ ID NO: N-terminal truncation of any one of 19, 20, or 21 is included. Other suitable N-terminal extensions are, for example, X n SDVPRDL (SEQ ID NO: 26), X n DVPRDL (SEQ ID NO: 27), X n VPRDL (SEQ ID NO: 28), X n PRDL (SEQ ID NO: 29) X n RDL (SEQ ID NO: 30), X n DL (SEQ ID NO: 31) or X n L, where n = 0, 1 or 2 amino acids and n = 1, X is Met or Gly And when n = 2, X is Met-Gly. In a preferred embodiment, N1 comprises, consists essentially of or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In a preferred embodiment, N2 comprises, consists essentially of or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
IGF−IRに結合する10Fn3ドメインは、C末端テール(C1またはC2)を任意に含み得る。クレームされる発明のフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体のC末端テールは、DK配列を含有しない。例示的なC末端テールとして、長さにおいて1−20、1−15、1−10、1−8、1−5、1−4、1−3、1−2または1アミノ酸であるポリペプチドが挙げられる。C末端テールの具体例として、EIEKPSQ(配列番号:32)、EIEKPCQ(配列番号:6)およびEIEK(配列番号:4)が挙げられる。他の実施形態では、適したC末端テールは、例えば、以下のアミノ酸配列(一文字アミノ酸コードにより表わされる)の一つ:EIE、EIEKP(配列番号:33)、EIEKPS(配列番号:34)またはEIEKPC(配列番号:35)を含む、配列番号:4、6または32のC末端切断された断片であってもよい。他の適したC末端テールには、例えば、ES、EC、EGS、EGC、EGSGS(配列番号:36)またはEGSGC(配列番号:5)が挙げられる。特定の実施形態では、C1は、配列番号:4のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。特定の実施形態では、C2は、配列番号:4、5または6のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。好ましい実施形態では、C1は、配列番号:4のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、C2は、配列番号:6のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。 The 10 Fn3 domain that binds to IGF-IR can optionally include a C-terminal tail (C1 or C2). The C-terminal tail of the claimed protein fibronectin-based scaffold protein dimer does not contain a DK sequence. Exemplary C-terminal tails include polypeptides that are 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 or 1 amino acid in length Can be mentioned. Specific examples of the C-terminal tail include EIEKPSQ (SEQ ID NO: 32), EIEKPCQ (SEQ ID NO: 6) and EIEK (SEQ ID NO: 4). In other embodiments, a suitable C-terminal tail is, for example, one of the following amino acid sequences (represented by the single letter amino acid code): EIE, EIEKP (SEQ ID NO: 33), EIEKPS (SEQ ID NO: 34) or EIEKPC It may be a C-terminal truncated fragment of SEQ ID NO: 4, 6 or 32, including (SEQ ID NO: 35). Other suitable C-terminal tails include, for example, ES, EC, EGS, EGC, EGSGS (SEQ ID NO: 36) or EGSGC (SEQ ID NO: 5). In certain embodiments, C1 comprises, consists of or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In certain embodiments, C2 comprises, consists of or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 5 or 6. In a preferred embodiment, C1 comprises, consists or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and C2 comprises, consists of, consists of, or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
特定の実施形態では、IGF−IRに結合する10Fn3ドメインは、N末端伸長およびC末端テールの両方を含む。例示的な実施形態では、N1はGlyまたはMet−Glyで始まり、C1はシステイン残基を含有せず、N2はMetで開始せず、かつC2はシステイン残基を含む。IGF−IRに結合する10Fn3ドメインの具体例は:(i)配列番号:2に示されるアミノ酸配列または(ii)配列番号:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%、90%、95%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドである。 In certain embodiments, the 10 Fn3 domain that binds to IGF-IR comprises both an N-terminal extension and a C-terminal tail. In an exemplary embodiment, N1 begins with Gly or Met-Gly, C1 does not contain a cysteine residue, N2 does not start with Met, and C2 contains a cysteine residue. Specific examples of 10 Fn3 domains that bind to IGF-IR are: (i) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or (ii) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and at least 85%, 90%, 95%, A polypeptide comprising an amino acid sequence having 97%, 98% or 99% identity.
L領域はポリペプチドリンカーである。例示的なポリペプチドリンカーとして、1−20、1−15、1−10、1−8、1−5、1−4、1−3または1−2アミノ酸を有するポリペプチドが挙げられる。適したポリペプチドリンカーの具体例は、本明細書にさらに記載される。特定の実施形態では、該リンカーは、本明細書に記載されるC末端テールポリペプチド、本明細書に記載されるN末端伸長ポリペプチド、またはそれらの組み合わせであってもよい。 The L region is a polypeptide linker. Exemplary polypeptide linkers include polypeptides having 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3 or 1-2 amino acids. Specific examples of suitable polypeptide linkers are further described herein. In certain embodiments, the linker may be a C-terminal tail polypeptide as described herein, an N-terminal extension polypeptide as described herein, or a combination thereof.
特定の実施形態では、N1、N2、L、C1またはC2の一以上が、システインまたはリジン残基などの、PEG化に適したアミノ酸残基を含み得る。例示的な実施形態では、C2が、システインまたはリジン残基などの、PEG化に適した少なくとも一つのアミノ酸を含む。適したポリペプチドリンカーの具体例は、以下にさらに記載される。N1−D1−C1−L−N2−D2−C2構造を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体の具体例は:(i)配列番号:48−55のいずれか一つに示されるアミノ酸配列または(ii)配列番号:48−55のいずれか一つと、少なくとも85%、90%、95%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドである。 In certain embodiments, one or more of N1, N2, L, C1 or C2 may comprise amino acid residues suitable for PEGylation, such as cysteine or lysine residues. In an exemplary embodiment, C2 comprises at least one amino acid suitable for PEGylation, such as a cysteine or lysine residue. Specific examples of suitable polypeptide linkers are further described below. Specific examples of scaffold protein dimers based on fibronectin having N1-D1-C1-L-N2-D2-C2 structure are: (i) Amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 48-55 Or (ii) a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 95%, 97%, 98% or 99% identity with any one of SEQ ID NOs: 48-55.
特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はN1−D1−L−N2−D2構造を有し、ここに、D1およびD2は、各々、以下の配列を有するアミノ酸配列を含むものである:
特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はN1−D1−L−N2−D2構造を有し、ここに、D1およびD2は:(i)配列番号:38を含む10Fn3ドメイン、ここに、XXは配列番号:40のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、Xyは配列番号:41のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、かつXzは配列番号:42のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなるものである、および、(ii)配列番号:38を含む10Fn3ドメイン、ここに、XXは配列番号:43のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、Xyは配列番号:44のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、かつXzは配列番号:45のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなるものである、からなる群から選択されるものである。 In certain embodiments, a fibronectin based scaffold protein dimer has a N1-D1-L-N2-D2 structure, wherein D1 and D2 include: (i) 10 Fn3 comprising SEQ ID NO: 38 A domain, wherein X X comprises, is essential, or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, X y comprises, is essential, or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, and X z Comprises, consists of or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, and (ii) a 10 Fn3 domain comprising SEQ ID NO: 38, wherein XX is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 wherein the result as an essential or consists, X y SEQ ID NO: comprises 44 amino acid sequence of, become as essential or consist, and X z is SEQ ID NO: 4 Comprising the amino acid sequence, comprising as essential, or is made of, are those selected from the group consisting of.
例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はN1−D1−L−N2−D2構造を有し、D1は配列番号:38のアミノ酸配列を含み、ここに、XXは配列番号:40のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、Xyは配列番号:41のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、かつXzは配列番号:42のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなるものであって、かつ、D2は配列番号:38のアミノ酸配列を含み、ここに、XXは配列番号:43のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、Xyは配列番号:44のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、かつXzは配列番号:45のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなるものである。 In an exemplary embodiment, a fibronectin based scaffold protein dimer has the N1-D1-L-N2-D2 structure, wherein D1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, wherein XX is Comprising, consisting of, or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, X y comprising, essential, or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, and X z being the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 the containing, be those made as essential, or consists, and, D2 is SEQ ID NO: 38 comprises the amino acid sequence of, here, X X is SEQ ID NO: comprises 43 amino acid sequence of, become as essential, or consists, X y SEQ ID NO: 44 comprises the amino acid sequence of, become as essential or consist, and X z is SEQ ID NO: comprises the amino acid sequence of 45, it was essential , Or is made of.
別の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はN1−D1−L−N2−D2構造を有し、D1は配列番号:38のアミノ酸配列を含み、ここに、XXは配列番号:43のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、Xyは配列番号:44のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、かつXzは配列番号:45のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなるものであって、かつ、D2は配列番号:38のアミノ酸配列を含み、ここに、XXは配列番号:40のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、Xyは配列番号:41のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、かつXzは配列番号:42のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなるものである。 In another embodiment, the fibronectin based scaffold protein dimer has an N1-D1-L-N2-D2 structure, wherein D1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, wherein XX is the sequence ID NO: 43 comprises the amino acid sequence of, become as essential or consists, X y SEQ ID NO: comprises the amino acid sequence of 44, becomes as essential or consist, and X z is SEQ ID NO: the amino acid sequence of the 45 including, made as essential, or made as in a from and, D2 is SEQ ID NO: 38 comprises the amino acid sequence of, here, X X is SEQ ID NO: comprises the amino acid sequence of 40, becomes as essential or color, becomes, X y SEQ ID NO: comprises 41 amino acid sequence of, become as essential or consists, is and X z comprises SEQ ID NO: 42 amino acid sequence of comprised as essential, It is made of Taha.
特定の実施形態では、N1−D1−L−N2−D2構造を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、C末端テールをさらに含む。例示的な実施形態では、C末端テールは、PEG部分の付加のために適した残基、例えばリジンまたはシステイン残基、を含む。好ましい実施形態では、C末端テールは配列PCQを含む。 In certain embodiments, a fibronectin based scaffold protein dimer having an N1-D1-L-N2-D2 structure further comprises a C-terminal tail. In an exemplary embodiment, the C-terminal tail includes a residue suitable for addition of a PEG moiety, such as a lysine or cysteine residue. In a preferred embodiment, the C-terminal tail comprises the sequence PCQ.
様々な実施形態では、N1−D1−L−N2−D2構造を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体のL領域は、ポリペプチドリンカーである。例示的なポリペプチドリンカーとして、1−20、1−15、1−10、1−8、1−5、1−4、1−3または1−2アミノ酸を有するポリペプチドが挙げられる。適したポリペプチドリンカーの具体例は、本明細書にさらに記載される。加えて、N1およびN2は本明細書で上述のN末端伸長である。 In various embodiments, the L region of a fibronectin based scaffold protein dimer having an N1-D1-L-N2-D2 structure is a polypeptide linker. Exemplary polypeptide linkers include polypeptides having 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3 or 1-2 amino acids. Specific examples of suitable polypeptide linkers are further described herein. In addition, N1 and N2 are the N-terminal extensions described herein above.
好ましい実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、インビトロ(in vitro)、インビボ(in vivo)または両方のいずれかで、増大した安定性を有する。特定の実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、溶液中での保存の間、低減された断片化および/または減少した凝集を有する。特定の実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、増大した血清半減期を有する。 In preferred embodiments, the fibronectin based scaffold protein dimers described herein have increased stability either in vitro, in vivo or both. In certain embodiments, the fibronectin based scaffold protein dimers described herein have reduced fragmentation and / or reduced aggregation during storage in solution. In certain embodiments, the fibronectin-based scaffold protein dimer described herein has an increased serum half-life.
例示的な実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、DK配列を含むフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体に比べて、低減された断片化を有する。特に、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、C末端テール、N末端伸長または2つの10Fn3ドメインの間のリンカーのいずれか一つにおいて、一以上のDK配列を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体に比べて、増大した安定性を有する。例えば、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、例えば、第一および/または第二10Fn3サブユニットの後に配列番号:46を有するテールを含む、一方または両方のC末端テール領域でDK配列を有する、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体よりも、より安定である。例示的な実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、C1および/またはC2が配列番号:46を含む、N1−D1−C1−L−N2−D2−C2式を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体に比べて、低減された断片化を有する。断片化は、例えば、実施例3に記載されるRP−HPLC解析を用いて評価され得る。 In an exemplary embodiment, a fibronectin based scaffold protein dimer described herein exhibits reduced fragmentation compared to a fibronectin based scaffold protein dimer comprising a DK sequence. Have. In particular, the fibronectin-based scaffold protein dimer described herein comprises one or more DK sequences in any one of a C-terminal tail, an N-terminal extension, or a linker between two 10 Fn3 domains. Compared to a fibronectin based scaffold protein dimer with For example, a fibronectin based scaffold protein dimer includes, for example, a DK sequence in one or both C-terminal tail regions, including a tail having SEQ ID NO: 46 after the first and / or second 10 Fn3 subunits. It is more stable than a fibronectin based scaffold protein dimer with In an exemplary embodiment, the fibronectin based scaffold protein dimer described herein is a N1-D1-C1-L-N2-D2 wherein C1 and / or C2 comprises SEQ ID NO: 46. -Has reduced fragmentation compared to fibronectin based scaffold protein dimers with the C2 formula. Fragmentation can be assessed using, for example, the RP-HPLC analysis described in Example 3.
例示的な実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、pH4.0で4週間の溶液中での保存中に、7%、6%、5%、4%、3.5%、3%、2%未満またはそれ以下の断片化を示す。特定の実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、一以上のDK配列を含有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体の同等型(equivalent version)に比べて、少なくとも25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%以上低減される断片化のレベルを示す。 In an exemplary embodiment, the fibronectin based scaffold protein dimer described herein is 7%, 6%, 5% during storage in solution at pH 4.0 for 4 weeks, Shows 4%, 3.5%, 3%, less than 2% or less fragmentation. In certain embodiments, the fibronectin based scaffold protein dimer described herein is an equivalent version of a fibronectin based scaffold protein dimer containing one or more DK sequences. Compared to, the level of fragmentation is reduced by at least 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% or more.
例示的な実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、一以上のDK配列を含有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体の同等型の血清半減期に比べて、少なくとも10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%以上増大した血清半減期を示す。他の実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、一以上のDK配列を含有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体の同等型の血清半減期に比べて、2倍、3倍、5倍、10倍以上増大した血清半減期を示す。 In an exemplary embodiment, a fibronectin-based scaffold protein dimer described herein is an equivalent serum half of a fibronectin-based scaffold protein dimer containing one or more DK sequences. The serum half-life is increased by at least 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% or more compared to the period. In other embodiments, the fibronectin based scaffold protein dimer described herein is an equivalent serum half-life of a fibronectin based scaffold protein dimer containing one or more DK sequences. 2, 3 times, 5 times, 10 times or more increased serum half-life.
特定の実施形態では、本出願は、EGFRに結合する一つの10Fn3ドメインおよびIGF−IRに結合する一つの10Fn3ドメインを含む、E/Iフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体を提供する。特定の実施形態では、E/Iフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、配列番号:22−25のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、E/Iフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、配列番号:25のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、E/Iフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、配列番号:22−25のいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、97、98、99または100%同一性を有するアミノ酸配列を含む。 In certain embodiments, the application provides an E / I fibronectin based scaffold protein dimer comprising one 10 Fn3 domain that binds to EGFR and one 10 Fn3 domain that binds to IGF-IR. . In certain embodiments, the E / I fibronectin based scaffold protein dimer comprises any one amino acid sequence of SEQ ID NOs: 22-25. In other embodiments, the E / I fibronectin based scaffold protein dimer comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the E / I fibronectin based scaffold protein dimer has an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 22-25 and at least 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97. , 98, 99 or 100% identity.
ポリペプチドリンカー
本出願は、ポリペプチドリンカーを介して連結された少なくとも2つの10Fn3ドメインを含む、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体を提供する。一実施形態では、本出願は、ポリペプチドリンカー(L)を介して連結された少なくとも2つの10Fn3ドメインを含む、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体を提供する。ポリペプチドは、第一の10Fn3ドメインを含むN末端ドメインおよび第二の10Fn3ドメインを含むC末端ドメインを含む。第一および第二の10Fn3ドメインは、直接的またはポリペプチドリンカー(L)を介して間接的に連結され得る。さらなるリンカーまたはスペーサー、例えば、配列番号:4、6または32が、10Fn3ドメインとポリペプチドリンカーの間の第一の10Fn3ドメインのC末端において、導入されてもよい。さらなるリンカーまたはスペーサーが、10Fn3ドメインとポリペプチドリンカーの間の第二の10Fn3ドメインのN末端において、導入されてもよい。
Polypeptide Linkers The present application provides multivalent fibronectin based scaffold protein dimers comprising at least two 10 Fn3 domains linked via a polypeptide linker. In one embodiment, the application provides a multivalent fibronectin based scaffold protein dimer comprising at least two 10 Fn3 domains linked via a polypeptide linker (L). Polypeptide comprises a C-terminal domain containing a N-terminal domain and a second 10 Fn3 domain comprises a first 10 Fn3 domain. The first and second 10 Fn3 domains can be linked directly or indirectly through a polypeptide linker (L). An additional linker or spacer, eg, SEQ ID NO: 4, 6, or 32, may be introduced at the C-terminus of the first 10 Fn3 domain between the 10 Fn3 domain and the polypeptide linker. An additional linker or spacer may be introduced at the N-terminus of the second 10 Fn3 domain between the 10 Fn3 domain and the polypeptide linker.
10Fn3ドメインを連結するための適したリンカーとして、別個のドメインが、互いとは独立にフォールディングして、標的分子との高親和性結合を可能にする三次元構造を形成するのを可能にするものがある。本出願は、これらの条件を満たす、適したリンカーが、グリシン−セリンをベースとするリンカー、グリシン−プロリンをベースとするリンカー、プロリン−アラニンをベースとするリンカー、ならびにリンカー配列番号:7を含むことを提供する。国際公開第2009/142773号に記載される例は、これらのリンカーを介して連結されたFn3ドメインが、その標的結合機能を保持することを実証する。いくつかの実施形態では、リンカーはグリシン−セリンをベースとするリンカーである。これらのリンカーはグリシンおよびセリン残基を含み、8−50、10−30および10−20個の間のアミノ酸の長さであり得る。このようなリンカーの例として配列番号:8−12が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは配列番号:8および9から選択される。いくつかの実施形態では、リンカーはグリシン−プロリンをベースとするリンカーである。これらのリンカーはグリシンおよびプロリン残基を含み、3−30、10−30および3−20個の間のアミノ酸の長さであり得る。このようなリンカーの例として配列番号:13、14および15が挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーはプロリン−アラニンをベースとするリンカーである。これらのリンカーはプロリンおよびアラニン残基を含み、長さにおいて、3−30、10−30、3−20および6−18個の間のアミノ酸の長さであり得る。このようなリンカーの例として配列番号:16、17および18が挙げられる。最適なリンカー長およびアミノ酸組成は、当技術分野で周知の方法による、日常の実験により、決定され得ると考えられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは配列番号:7である。例示的な実施形態ではリンカーはDK配列を全く含有しない。 As a suitable linker for linking 10 Fn3 domains, it allows separate domains to fold independently of each other to form a three-dimensional structure that allows high affinity binding to the target molecule. There is something. The present application includes suitable linkers that meet these conditions include glycine-serine based linkers, glycine-proline based linkers, proline-alanine based linkers, and linker SEQ ID NO: 7. To provide that. The example described in WO2009 / 142773 demonstrates that Fn3 domains linked via these linkers retain their target binding function. In some embodiments, the linker is a glycine-serine based linker. These linkers contain glycine and serine residues and can be between 8-50, 10-30 and 10-20 amino acids long. Examples of such linkers include SEQ ID NOs: 8-12. In some embodiments, the polypeptide linker is selected from SEQ ID NOs: 8 and 9. In some embodiments, the linker is a glycine-proline based linker. These linkers contain glycine and proline residues and can be between 3-30, 10-30 and 3-20 amino acids long. Examples of such linkers include SEQ ID NOs: 13, 14, and 15. In some embodiments, the linker is a proline-alanine based linker. These linkers contain proline and alanine residues and can be between 3-30, 10-30, 3-20 and 6-18 amino acids in length. Examples of such linkers include SEQ ID NOs: 16, 17, and 18. It is believed that the optimal linker length and amino acid composition can be determined by routine experimentation by methods well known in the art. In some embodiments, the polypeptide linker is SEQ ID NO: 7. In an exemplary embodiment, the linker does not contain any DK sequences.
薬物動態部分
一態様では、本出願は、薬物動態(PK)部分をさらに含むフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を提供する。薬物動態は、例として、対象による吸収、分布、代謝および排泄を含む、化合物の特性を包含する。改善される薬物動態は、認識される治療的必要性に従って評価できる。おそらくは、タンパク質が、投与後の血清において利用可能なままである時間を増大することによって、バイオアベイラビリティを増大すること、および/または用量間の時間を増大することが望ましいことが多い。場合によっては、経時的な(over time)タンパク質の血清濃度の連続性を改善すること(例えば、投与の直後および次の投与の直前のタンパク質の血清濃度の相違の減少)が望ましい。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、哺乳類(例えば、マウス、ラットまたはヒト)においてポリペプチドのクリアランス速度(clearance rate)を、修飾されていないポリペプチドに比べて三倍超低減する部分に結合させてもよい。薬物動態の改善の他の尺度として、血清半減期を挙げることができ、これはα相およびβ相に分けられることが多い。いずれかの相または両方の相が、適当な部分の付加によって大幅に改善され得る。PK部分は、生物学的に活性な分子と融合される場合、生物学的に活性な分子の薬物動態特性に影響を及ぼす、任意のタンパク質、ペプチドまたは部分を指す。
Pharmacokinetic moiety In one aspect, the application provides a fibronectin based scaffold protein further comprising a pharmacokinetic (PK) moiety. Pharmacokinetics encompasses, for example, the properties of a compound, including absorption, distribution, metabolism and excretion by a subject. Improved pharmacokinetics can be assessed according to recognized therapeutic needs. It is often desirable to increase bioavailability and / or increase the time between doses, possibly by increasing the time that the protein remains available in the serum after administration. In some cases, it is desirable to improve the continuity of the serum concentration of the protein over time (eg, reducing the difference in serum concentration of the protein immediately after administration and immediately before the next administration). Fibronectin-based scaffold proteins bind a moiety that reduces the clearance rate of the polypeptide in mammals (eg, mouse, rat or human) by more than three times compared to the unmodified polypeptide. Also good. Another measure of improved pharmacokinetics can include serum half-life, which is often divided into an alpha phase and a beta phase. Either or both phases can be greatly improved by the addition of appropriate moieties. A PK moiety refers to any protein, peptide or moiety that, when fused with a biologically active molecule, affects the pharmacokinetic properties of the biologically active molecule.
血液からのタンパク質のクリアランスを遅延する傾向があるPK部分として、ポリオキシアルキレン部分、例えば、ポリエチレングリコール、糖(例えば、シアル酸)および耐容性良好であるタンパク質部分(例えば、Fc、Fc断片、トランスフェリンまたは血清アルブミン)が挙げられる。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、米国公開第20070048282号に記載される、アルブミンまたはアルブミンの断片(部分)もしくは変種と融合してもよい。いくつかの実施形態では、PK部分は、米国公開第2007/0178082号および同第2007/0269422号に記載されるものなどの、血清アルブミン結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、PK部分は、米国公開第2007/0178082号に記載されるものなどの、血清免疫グロブリン結合タンパク質である。 PK moieties that tend to delay protein clearance from the blood include polyoxyalkylene moieties such as polyethylene glycol, sugars (eg sialic acid) and well tolerated protein moieties (eg Fc, Fc fragments, transferrin) Or serum albumin). A fibronectin based scaffold protein may be fused to albumin or a fragment (part) or variant of albumin as described in US Publication No. 20070048282. In some embodiments, the PK moiety is a serum albumin binding protein, such as those described in US Publication Nos. 2007/0178082 and 2007/0269422. In some embodiments, the PK moiety is a serum immunoglobulin binding protein, such as those described in US Publication No. 2007/0178082.
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、非タンパク質性ポリマーを含むPK部分に結合されてもよい。いくつかの実施形態では、ポリマーは、米国特許第4,640,835号;同第4,496,689号;同第4,301,144号;同第4,670,417号;同第4,791,192号または同第4,179,337号に記載されるような、ポリエチレングリコール(「PEG」)、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンである。例示的な実施形態では、ポリマーはPEG部分である。 In some embodiments, a fibronectin based scaffold protein may be bound to a PK moiety comprising a non-proteinaceous polymer. In some embodiments, the polymer is a U.S. Pat. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 791, 192 or 4,179,337, polyethylene glycol ("PEG"), polypropylene glycol or polyoxyalkylene. In an exemplary embodiment, the polymer is a PEG moiety.
PEGは、市販されているが、当技術分野で周知の方法に従うエチレングリコールの開環重合によって調製することもできる、周知の、水溶性ポリマーである(Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138−161)。用語「PEG」は、広く使用され、大きさ、PEGの末端での修飾にかかわらず、任意のポリエチレングリコール分子を包含し、式:X−O(CH2CH2O)n−1CH2CH2OH(1)(式中、nは、20から2300であり、Xは、Hまたは末端修飾、例えば、C1−4アルキルである)によって表され得る。一実施形態では、本発明のPEGは、一方の末端でヒドロキシまたはメトキシで終結する、すなわち、Xは、HまたはCH3である(「メトキシPEG」)。PEGは、結合反応に必要な;分子の化学合成に起因する;または分子の部分の最適距離のためのスペーサーである、さらなる化学基を含み得る。さらに、このようなPEGは、一緒に連結している一以上のPEG側鎖からなり得る。二以上のPEG鎖を有するPEGは、マルチアームの、または分岐PEGと呼ばれる。分岐PEGは、例えば、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトールを含む種々のポリオールへのポリエチレンオキシドの付加によって調製できる。例えば、4アームの分岐PEGをペンタエリスリトールおよびエチレンオキシドから調製できる。分岐PEGは、例えば、欧州公開出願番号第473084A号および米国特許第5,932,462号に記載されている。PEGの1つの形として、リジンの第一級アミノ基を介して連結している2つのPEG側鎖(PEG2)が挙げられる(Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62−69)。 PEG is a well-known, water-soluble polymer that is commercially available but can also be prepared by ring-opening polymerization of ethylene glycol according to methods well known in the art (Sander and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New). York, Vol. 3, pages 138-161). The term “PEG” is widely used and encompasses any polyethylene glycol molecule, regardless of size, modification at the end of the PEG, and has the formula: X—O (CH 2 CH 2 O) n-1 CH 2 CH 2 OH (1) where n is 20 to 2300 and X is H or a terminal modification such as C 1-4 alkyl. In one embodiment, the PEG of the invention terminates at one end with hydroxy or methoxy, ie, X is H or CH 3 (“methoxy PEG”). PEG may contain additional chemical groups that are necessary for the conjugation reaction; resulting from the chemical synthesis of the molecule; or a spacer for the optimum distance of the parts of the molecule. Further, such PEG can consist of one or more PEG side chains linked together. PEGs having two or more PEG chains are called multi-armed or branched PEGs. Branched PEGs can be prepared by addition of polyethylene oxide to various polyols including, for example, glycerol, pentaerythritol and sorbitol. For example, a 4-arm branched PEG can be prepared from pentaerythritol and ethylene oxide. Branched PEGs are described, for example, in European Published Application No. 473084A and US Pat. No. 5,932,462. One form of PEG includes two PEG side chains (PEG2) linked via the primary amino group of lysine (Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62 -69).
ペプチドまたはタンパク質とのPEGコンジュゲーションは、一般に、PEGの活性化および活性化されたPEG中間体の、標的タンパク質/ペプチドとの直接的な、またはリンカーとのカップリングを含み、リンカーは、その後に活性化され、標的タンパク質/ペプチドとカップリングされる(Abuchowski, A. et al, J. Biol. Chem., 252, 3571 (1977)およびJ. Biol. Chem., 252, 3582 (1977), Zalipsky, et al., and Harris et. al., in: Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications; (J. M. Harris ed.) Plenum Press: New York, 1992; Chap.21 and 22参照)。PEG分子を含有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質はまた、複合タンパク質(conjugated protein)としても知られているのに対し、結合しているPEG分子を欠くタンパク質は、コンジュゲートしていないと呼ばれることもあるということに留意されたい。 PEG conjugation with a peptide or protein generally involves activation of PEG and coupling of the activated PEG intermediate, either directly with the target protein / peptide or with a linker, which is then Activated and coupled with target protein / peptide (Abuchowski, A. et al, J. Biol. Chem., 252, 3571 (1977) and J. Biol. Chem., 252, 3582 (1977), Zalipsky , Et al., And Harris et.al., in: Poly (ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications; . See Chap.21 and 22); New York, 1992: M. Harris ed) Plenum Press. Fibronectin based scaffold proteins containing PEG molecules are also known as conjugated proteins, whereas proteins lacking PEG molecules attached are called unconjugated Note that there are also.
利用されるPEGの大きさは、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の意図される用途を含む、いくつかの因子に応じて変わる。より大きいPEGが、身体、血液、非血液細胞外液または組織において半減期を増大するために好ましい。インビボ細胞活性のためには、約10から60kDaの範囲のPEG、ならびに約100kDa未満のPEGが好ましく、約60kDa未満がより好ましいが、約100kDaを超える大きさも同様に使用できる。インビボイメージング適用には、大きなPEGと同じ程度には半減期を増大せず、より迅速な分布およびより短い半減期を可能にする、より小さいPEG、一般に、約20kDa未満を使用してもよい。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質へのコンジュゲーションのために、種々の分子量の形態のPEG、例えば、約1,000ダルトン(Da)から100,000Da(nは、20から2300である)が選択できる。PEG中の反復単位の数「n」は、ダルトンで記載される分子量に対して見積もられている。活性化されたリンカー上のPEGの組み合わされた分子量が、製薬学的用途にとって適していることが好ましい。したがって、一実施形態では、PEG分子の分子量は、100,000Daを超えない。例えば、3PEG分子が、リンカーと結合しており、各PEG分子が、12,000Daの同一分子量を有する場合には(各nが約270である)、リンカー上のPEGの総分子量は、約36,000Daである(総nは、約820である)。リンカーと結合しているPEGの分子量は異なっていてもよく、例えば、リンカー上の3分子のうち2つのPEG分子が、各5,000Daであり(各nは、約110である)、1つのPEG分子が12,000Daであり得る(nは、約270である)。いくつかの実施形態では、1つのPEG部分が、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質とコンジュゲートしている。いくつかの実施形態では、PEG部分は、約20、30、40、50、60、70、80または90KDaである。いくつかの実施形態では、PEG部分は、約40KDaである。 The size of the PEG utilized will depend on several factors, including the intended use of the fibronectin based scaffold protein. Larger PEGs are preferred for increasing half-life in the body, blood, non-blood extracellular fluids or tissues. For in vivo cellular activity, PEGs in the range of about 10-60 kDa are preferred, as well as PEGs less than about 100 kDa, more preferably less than about 60 kDa, although sizes greater than about 100 kDa can be used as well. For in vivo imaging applications, smaller PEGs, generally less than about 20 kDa, that do not increase half-life to the same extent as large PEGs, but allow for faster distribution and shorter half-life may be used. Various molecular weight forms of PEG can be selected for conjugation to fibronectin based scaffold proteins, eg, about 1,000 Daltons (Da) to 100,000 Da (n is 20 to 2300) . The number of repeating units “n” in PEG is estimated relative to the molecular weight described in Daltons. It is preferred that the combined molecular weight of PEG on the activated linker is suitable for pharmaceutical use. Thus, in one embodiment, the molecular weight of the PEG molecule does not exceed 100,000 Da. For example, if 3 PEG molecules are attached to a linker and each PEG molecule has the same molecular weight of 12,000 Da (each n is about 270), the total molecular weight of PEG on the linker is about 36 , 000 Da (total n is about 820). The molecular weight of the PEG attached to the linker may be different, for example, 2 out of 3 molecules on the linker are each 5,000 Da (each n is about 110), one The PEG molecule can be 12,000 Da (n is about 270). In some embodiments, one PEG moiety is conjugated to a fibronectin based scaffold protein. In some embodiments, the PEG moiety is about 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 or 90 KDa. In some embodiments, the PEG moiety is about 40 KDa.
いくつかの実施形態では、PEG化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、一、二以上のPEG部分を含む。一実施形態では、PEG部分(単数または複数)は、標的リガンドと接触するタンパク質の表面上にある、および/または表面から離れたアミノ酸残基と結合している。一実施形態では、PEG化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質中のPEGの組み合わされた分子量または総分子量は、約3,000Daから60,000Daまたは約10,000Daから36,000Daである。一実施形態では、PEG化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、実質的に直線の、直鎖PEGである。 In some embodiments, a PEGylated fibronectin based scaffold protein comprises one, two or more PEG moieties. In one embodiment, the PEG moiety (s) are bound to amino acid residues on and / or away from the surface of the protein that contacts the target ligand. In one embodiment, the combined molecular weight or total molecular weight of PEG in a PEGylated fibronectin based scaffold protein is from about 3,000 Da to 60,000 Da or from about 10,000 Da to 36,000 Da. In one embodiment, the PEGylated fibronectin based scaffold protein is a substantially linear, linear PEG.
当業者ならば、例えば、PEG化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質が、どのように治療的に使用されるか、所望の投与量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性、免疫原性および他の検討事項に基づいてPEGの適した分子量を選択できる。タンパク質の特性を増強するためのPEGおよびその使用についての論述については、N. V. Katre, Advanced Drug Delivery Reviews 10: 91−114 (1993)を参照のこと。 A person skilled in the art, for example, how a scaffold protein based on PEGylated fibronectin is used therapeutically, the desired dosage, circulation time, resistance to proteolysis, immunogenicity and others Based on the above considerations, a suitable molecular weight of PEG can be selected. For a discussion of PEG and its use to enhance protein properties, see N.C. V. See Katre, Advanced Drug Delivery Reviews 10: 91-114 (1993).
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、アミド結合を形成するポリ(エチレングリコール)基の−CO(すなわち、カルボニル)を用いて、式:−CO−(CH2)x−(OCH2CH2)m−ORの1つのポリ(エチレングリコール)基と、結合ポリペプチドのアミノ基の1つと共有結合によって連結しており;Rは低級アルキルであり;xは2または3であり;mは約450から約950であり;nおよびmは結合ポリペプチドを引いたコンジュゲートの分子量が、約10から40kDaであるよう選択される。一実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のリジンのε−アミノ基が、利用可能な(遊離)アミノ基である。 In some embodiments, a fibronectin based scaffold protein uses a poly (ethylene glycol) group —CO (ie, carbonyl) that forms an amide bond to form the formula: —CO— (CH 2 ) x —. and one poly (ethylene glycol) group (OCH 2 CH 2) m -OR, are linked by covalent bond with one of the amino groups of the binding polypeptide; R is lower alkyl; x is 2 or 3 Yes; m is about 450 to about 950; n and m are selected such that the molecular weight of the conjugate minus the binding polypeptide is about 10 to 40 kDa. In one embodiment, the ε-amino group of the lysine of the fibronectin based scaffold protein is an available (free) amino group.
特定の一実施形態では、PEG−フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を形成するためにPEGの炭酸エステルが用いられる。N,N’−ジスクシンイミジルカルボネート(DSC)を、PEGとの反応において用いて、活性な混合PEG−スクシンイミジルカルボネートを形成してもよく、これを続いて、リンカーの求核基またはフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のアミノ基と反応させてもよい(米国特許第5,281,698号および米国特許第5,932,462号参照)。同様の種類の反応において、1,1’−(ジベンゾトリアゾリル)カルボネートおよびジ−(2−ピリジル)カルボネートをPEGと反応させて、PEG−ベンゾトリアゾリルおよびPEG−ピリジル混合カルボネートをそれぞれ形成してもよい(米国特許第5,382,657号)。 In one particular embodiment, a carbonate ester of PEG is used to form a PEG-fibronectin based scaffold protein. N, N′-disuccinimidyl carbonate (DSC) may be used in the reaction with PEG to form an active mixed PEG-succinimidyl carbonate, which is then followed by linker determination. It may be reacted with an amino group of a nuclear protein or a fibronectin based scaffold protein (see US Pat. No. 5,281,698 and US Pat. No. 5,932,462). In a similar type of reaction, 1,1 ′-(dibenzotriazolyl) carbonate and di- (2-pyridyl) carbonate are reacted with PEG to form PEG-benzotriazolyl and PEG-pyridyl mixed carbonate, respectively. (US Pat. No. 5,382,657).
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のPEG化は、最先端の方法に従って、例えば、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質と求電子的に活性なPEGとの反応によって実施できる(供給業者:Shearwater Corp., USA、www.shearwatercorp.com)。本発明の好ましいPEG試薬として、例えば、N−ヒドロキシスクシンイミジルプロピオネート(PEG−SPA)、ブタノエート(PEG−SBA)、PEG−スクシンイミジルプロピオネートまたはmPEG2−NHSなどの分岐N−ヒドロキシスクシンイミドがある(Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62−69)。このような方法を用いて、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のリジンのε−アミノ基、またはフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のN末端アミノ基でPEG化してもよい。 PEGylation of fibronectin based scaffold proteins can be performed according to state-of-the-art methods, for example, by reaction of fibronectin based scaffold proteins with electrophilic active PEG (supplier: Shearwater Corp., USA). , Www.shearwatercorp.com). Preferred PEG reagents of the invention include branched N such as, for example, N-hydroxysuccinimidylpropionate (PEG-SPA), butanoate (PEG-SBA), PEG-succinimidylpropionate or mPEG2-NHS. -Hydroxysuccinimide (Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69). Such methods may be used to PEGylate the lysine ε-amino group of a fibronectin based scaffold protein or the N-terminal amino group of a fibronectin based scaffold protein.
別の実施形態では、PEG分子を、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質上のスルフヒドリル基とカップリングしてもよい(Sartore, L., et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 27, 45 (1991);Morpurgo et al., Biocon. Chem., 7, 363−368 (1996); Goodson et al., Bio/Technology (1990) 8, 343;米国特許第5,766,897号)。米国特許第6,610,281号および同第5,766,897号には、スルフヒドリル基とカップリングしてもよい例示的な反応性PEG種が記載されている。 In another embodiment, PEG molecules may be coupled to sulfhydryl groups on fibronectin based scaffold proteins (Sartore, L., et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 27, 45 (1991). Morpurgo et al., Biocon. Chem., 7, 363-368 (1996); Goodson et al., Bio / Technology (1990) 8, 343; US Pat. No. 5,766,897). US Pat. Nos. 6,610,281 and 5,766,897 describe exemplary reactive PEG species that may be coupled with sulfhydryl groups.
いくつかの実施形態では、PEG化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、部位指定PEG化によって、特にシステイン部分とのPEGのコンジュゲーションによって生成される。特定の実施形態では、Cys残基は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の、N末端に、N末端と最もN末端のβまたはβ様鎖の間に、C末端に、またはC末端と最もC末端の間に位置し得る。特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は二量体であり、Cys残基は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体の各結合ドメインの、N末端に、N末端と最もN末端のβまたはβ様鎖の間に、C末端に、またはC末端と最もC末端の間に位置し得る。特定の実施形態では、Cys残基は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体のN末端に、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体の(すなわち、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体のN末端結合ドメインの)N末端と最もN末端のβまたはβ様鎖の間に、あるいはフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体のC末端に、またはフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体の(すなわち、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体のC末端結合ドメインの)C末端と最もC末端のβまたはβ様鎖の間に、位置し得る。Cys残基は、同様に他の位置、特に、標的結合に関与しないループのいずれか、または多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の結合ドメインの間に位置していてもよい。PEG部分はまた、アミンとのコンジュゲーションによるものを含めて、他の化学反応によって結合させてもよい。 In some embodiments, PEGylated fibronectin based scaffold proteins are generated by site directed PEGylation, particularly by conjugation of PEG with a cysteine moiety. In certain embodiments, the Cys residue is at the N-terminus, between the N-terminus and the most N-terminal β- or β-like chain, at the C-terminus, or at the C-terminus and most C of the fibronectin-based scaffold protein. Can be located between the ends. In certain embodiments, the fibronectin based scaffold protein is a dimer and the Cys residue is N-terminal and most N-terminal for each binding domain of the fibronectin-based scaffold protein dimer. It may be located between the terminal β or β-like chain, at the C-terminus, or between the C-terminus and the most C-terminus. In certain embodiments, the Cys residue is at the N-terminus of a fibronectin based scaffold protein dimer, of a fibronectin based scaffold protein dimer (ie, a fibronectin based scaffold protein dimer). Between the N-terminus of the N-terminal binding domain and the most N-terminal β- or β-like chain, or at the C-terminus of a fibronectin based scaffold protein dimer, or a fibronectin based scaffold protein dimer Between the C-terminus (ie, of the C-terminal binding domain of a fibronectin-based scaffold protein dimer) and the most C-terminal β or β-like chain. Cys residues may be located in other positions as well, particularly in any of the loops not involved in target binding, or between the binding domains of multivalent fibronectin based scaffold proteins. The PEG moiety may also be attached by other chemical reactions, including by conjugation with amines.
PEG分子が、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質上のシステイン残基とコンジュゲートしている、いくつかの実施形態では、システイン残基は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質に対して天然である一方、他の実施形態では、一以上のシステイン残基がフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質中で操作されている。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードする配列中に変異を導入し、システイン残基を生成してもよい。これは、例えば、一以上のアミノ酸残基をシステインに変異することによって達成され得る。システイン残基に変異するための好ましいアミノ酸として、セリン、トレオニン、アラニンおよび他の親水性残基が挙げられる。システインに変異される残基は、表面にさらされている残基であることが好ましい。一次配列またはタンパク質に基づいて残基の表面到達性を予測するためのアルゴリズムは、当技術分野で周知である。あるいは、それに基づいてフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質が設計されている、第10fn3ドメインフレームワークの結晶構造が解かれていることを考えると、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のアミノ酸配列を比較することにより、表面残基を予測することができ(Himanen et al., Nature. (2001) 20−27;414 (6866):933−8参照)、それゆえ、表面にさらされている残基が同定される。一実施形態では、システイン残基がフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質に、Nおよび/またはC末端で、もしくはその付近で、またはループ領域内で導入される。システイン残基のPEG化は、例えば、PEG−マレイミド、PEG−ビニルスルホン、PEG−ヨードアセトアミドまたはPEG−オルトピリジルジスルフィドを用いて実施できる。 In some embodiments where the PEG molecule is conjugated to a cysteine residue on a fibronectin based scaffold protein, the cysteine residue is native to the fibronectin based scaffold protein, whereas In other embodiments, one or more cysteine residues are engineered in a fibronectin based scaffold protein. Mutations may be introduced into sequences encoding fibronectin based scaffold proteins to generate cysteine residues. This can be accomplished, for example, by mutating one or more amino acid residues to cysteine. Preferred amino acids for mutating to cysteine residues include serine, threonine, alanine and other hydrophilic residues. The residue that is mutated to cysteine is preferably a residue that is exposed to the surface. Algorithms for predicting surface accessibility of residues based on primary sequence or protein are well known in the art. Alternatively, comparing the amino acid sequence of the fibronectin-based scaffold protein, given that the crystal structure of the 10fn3 domain framework, on which the fibronectin-based scaffold protein has been designed, has been solved Can predict surface residues (see Himanen et al., Nature. (2001) 20-27; 414 (6866): 933-8), thus identifying residues exposed to the surface. Is done. In one embodiment, cysteine residues are introduced into fibronectin based scaffold proteins at or near the N and / or C terminus, or within the loop region. PEGylation of cysteine residues can be performed using, for example, PEG-maleimide, PEG-vinylsulfone, PEG-iodoacetamide or PEG-orthopyridyl disulfide.
いくつかの実施形態では、PEG化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、N末端アミノ酸のαアミノ基と共有結合しているPEG分子を含む。部位特異的N末端還元的アミノ化は、Pepinsky etal., (2001) JPET, 297, 1059および米国特許第5,824,784号に記載されている。他の利用可能な求核アミノ基を利用するタンパク質の還元的アミノ化のためのPEG−アルデヒドの使用は、米国特許第4,002,531号に、Wieder et al., (1979)J. Biol. Chem. 254,12579に、およびChamow et al., (1994) Bioconjugate Chem. 5,133に記載されている。 In some embodiments, the PEGylated fibronectin based scaffold protein comprises a PEG molecule covalently linked to the α-amino group of the N-terminal amino acid. Site-specific N-terminal reductive amination is described in Pepinsky et al. (2001) JPETE, 297, 1059 and US Pat. No. 5,824,784. The use of PEG-aldehydes for reductive amination of proteins utilizing other available nucleophilic amino groups is described in US Pat. No. 4,002,531, Wieder et al. (1979) J. MoI. Biol. Chem. 254, 12579, and Chamow et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5, 133.
別の実施形態では、PEG化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、リンカーと共有結合している一以上のPEG分子を含み、リンカーは、次いで、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のN末端でアミノ酸残基のαアミノ基と結合される。このようなアプローチは、米国公開第2002/0044921号および国際公開第94/01451号に開示されている。 In another embodiment, the PEGylated fibronectin based scaffold protein comprises one or more PEG molecules covalently linked to a linker, which is then at the N-terminus of the fibronectin based scaffold protein. It is combined with the α-amino group of the amino acid residue. Such an approach is disclosed in US Publication No. 2002/0044921 and International Publication No. 94/01451.
一実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、C末端でPEG化される。特定の実施形態では、タンパク質は、C末端アジド−メチオニンの導入およびその後のスタウディンガー反応を介するメチル−PEG−トリアリールホスフィン化合物のコンジュゲーションによって、C末端でPEG化される。このC末端コンジュゲーション法は、Cazalis et al.,C−Terminal Site−Specific PEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity、Bioconjug Chem. 2004;15(5):1005−1009に記載されている。 In one embodiment, the fibronectin based scaffold protein is PEGylated at the C-terminus. In certain embodiments, the protein is PEGylated at the C-terminus by introduction of a C-terminal azido-methionine followed by conjugation of a methyl-PEG-triarylphosphine compound via a Staudinger reaction. This C-terminal conjugation method is described in Cazalis et al. , C-Terminal Site-Specific PEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity, Bioconjug Chem. 2004; 15 (5): 1005-1009.
例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、本明細書にさらに記載されるC末端テール領域でPEG化される。例示的なC末端テールとして、例えば、配列番号:5、6または35のいずれか一つを有するポリペプチドが挙げられる。 In an exemplary embodiment, a fibronectin based scaffold protein is PEGylated at the C-terminal tail region as further described herein. Exemplary C-terminal tails include, for example, a polypeptide having any one of SEQ ID NOs: 5, 6 or 35.
サイズ排除(例えば、ゲル濾過)およびイオン交換クロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の従来の分離および精製技術を用いて、PEG化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を精製できる。SDS−PAGEを用いて生成物を分離してもよい。分離できる生成物として、モノ−、ジ−、トリ−、ポリPEG化された、およびPEG化されていないフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質、ならびに遊離PEGが挙げられる。モノPEGコンジュゲートのパーセンテージは、溶出ピーク周辺の広い画分をプールすることによって制御し、組成物中のモノPEGのパーセンテージを高めることができる。約90パーセントのモノPEGコンジュゲートは、収率および活性の良好なバランスに相当する。例えば、コンジュゲートの少なくとも92パーセントまたは少なくとも96パーセントが、モノPEG種である組成物が望ましいものであり得る。本発明の実施形態では、モノPEGコンジュゲートのパーセンテージは、90パーセントから96パーセントである。 Conventional separation and purification techniques known in the art such as size exclusion (eg gel filtration) and ion exchange chromatography can be used to purify scaffold proteins based on PEGylated fibronectin. Products may be separated using SDS-PAGE. Separable products include mono-, di-, tri-, polyPEGylated and non-PEGylated fibronectin based scaffold proteins, and free PEG. The percentage of mono PEG conjugate can be controlled by pooling a wide fraction around the elution peak to increase the percentage of mono PEG in the composition. About 90 percent of the monoPEG conjugate represents a good balance between yield and activity. For example, a composition in which at least 92 percent or at least 96 percent of the conjugate is a monoPEG species may be desirable. In an embodiment of the invention, the percentage of monoPEG conjugate is from 90 percent to 96 percent.
本発明の一実施形態では、PEG化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質中のPEGは、ヒドロキシルアミンアッセイ、例えば、室温で、8から16時間かけて、450mMヒドロキシルアミン(pH6.5)を用いて、PEG化アミノ酸残基から加水分解されず、したがって、安定である。一実施形態では、組成物の80%超が、より好ましくは、少なくとも90%、最も好ましくは、少なくとも95%が、安定なモノPEGフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質である。 In one embodiment of the invention, PEG in a PEGylated fibronectin based scaffold protein uses a hydroxylamine assay, eg, 450 mM hydroxylamine (pH 6.5) at room temperature for 8 to 16 hours. Thus, it is not hydrolyzed from PEGylated amino acid residues and is therefore stable. In one embodiment, more than 80% of the composition is a scaffold protein based on a stable monoPEG fibronectin, more preferably at least 90%, and most preferably at least 95%.
別の実施形態では、PEG化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、非修飾タンパク質と関連する生物活性の少なくとも約25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%または100%を保持することが好ましい。一実施形態では、生物活性とは、KD、konまたはkoffによって評価される、一以上の標的分子に結合するその能力を指す。具体的な一実施形態では、PEG化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、PEG化されていないフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質と比べて、一以上の標的分子との結合における増大を示す。 In another embodiment, the PEGylated fibronectin based scaffold protein is at least about 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% of the biological activity associated with the unmodified protein. , 95% or 100% is preferred. In one embodiment, the biological activity, K D, is evaluated by the k on or k off, it refers to its ability to bind to one or more target molecules. In one specific embodiment, a PEGylated fibronectin based scaffold protein exhibits an increase in binding to one or more target molecules compared to a non-PEGylated fibronectin based scaffold protein.
PEG修飾されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の血清クリアランス速度は、修飾されていないフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のクリアランス速度と比べて、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%さえも減少され得る。PEG修飾されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、修飾されていないフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の半減期と比べて、増強されている半減期(t1/2)を有し得る。PEG修飾されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の半減期は、修飾されていないフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の半減期と比べて、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%または500%、またはさらに1000%まで増強され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質半減期は、緩衝生理食塩水または血清中などインビトロで決定される。他の実施形態では、タンパク質半減期は、動物の血清または他の体液中でのフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の半減期などの、インビボ半減期である。 The serum clearance rate of scaffold proteins based on PEG-modified fibronectin is about 10%, 20%, 30%, 40%, 50% compared to the clearance rate of unmodified fibronectin based scaffold proteins. 60%, 70%, 80% or even 90%. A scaffold protein based on PEG-modified fibronectin can have an enhanced half-life (t 1/2 ) compared to the half-life of an unmodified fibronectin-based scaffold protein. The half-life of the scaffold protein based on PEG-modified fibronectin is at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50% compared to the half-life of the scaffold protein based on unmodified fibronectin. It can be enhanced to 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400% or 500%, or even 1000%. In some embodiments, the protein half-life is determined in vitro, such as in buffered saline or serum. In other embodiments, the protein half-life is an in vivo half-life, such as the half-life of a fibronectin based scaffold protein in animal serum or other bodily fluids.
核酸−タンパク質融合技術
一態様では、本出願は、例えば、TNF−α、EGFR、VEGFR2、IGF−IRまたは他のタンパク質などの、ヒト標的に結合するフィブロネクチンIII型ドメインを含む、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を提供する。特異的結合特性を備えるFn3ドメインを、迅速に作製し、試験する1つの方法は、Adnexus,Bristol−Myers Squibb企業の核酸−タンパク質融合技術である。核酸−タンパク質融合体(RNA−およびDNA−タンパク質融合体)を利用する、PROfusion商標と呼ばれる、このようなインビトロ発現およびタグ技術を用いて、タンパク質との結合にとって重要である、新規ポリペプチドおよびアミノ酸モチーフを同定し得る。核酸−タンパク質融合技術は、タンパク質をそのコードする遺伝情報と共有結合によってカップリングする技術である。RNA−タンパク質融合技術およびフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質ライブラリースクリーニング法の詳細な説明については、出典明示により本明細書に組み込まれる、Szostak et al.,米国特許第6,258,558号;同第6,261,804号;同第6,214,553号;同第6,281,344号;同第6,207,446号;同第6,518,018号;国際公開第00/34784号;国際公開第01/64942号;国際公開第02/032925号;およびRoberts and Szostak, Proc Natl. Acad. Sci. 94:12297−12302, 1997参照。
Nucleic acid-protein fusion technology In one aspect, the application is based on fibronectin comprising a fibronectin type III domain that binds to a human target, such as, for example, TNF-α, EGFR, VEGFR2, IGF-IR, or other proteins. Provide scaffold protein. One method for rapidly creating and testing Fn3 domains with specific binding properties is the nucleic acid-protein fusion technology of the Adnexus, Bristol-Myers Squibb company. Novel polypeptides and amino acids that are important for protein binding using such in vitro expression and tag technology, referred to as the PROfusion trademark , which utilizes nucleic acid-protein fusions (RNA- and DNA-protein fusions) Motifs can be identified. Nucleic acid-protein fusion technology is a technology for covalently coupling a protein to its encoded genetic information. For a detailed description of RNA-protein fusion techniques and fibronectin-based scaffold protein library screening methods, see Szostak et al., Incorporated herein by reference. U.S. Pat. Nos. 6,258,558; 6,261,804; 6,214,553; 6,281,344; 6,207,446; , 518,018; International Publication No. WO 00/34784; International Publication No. WO 01/64942; International Publication No. WO 02/032925; and Roberts and Szostak, Proc Natl. Acad. Sci. 94: 12297-122302, 1997.
ベクター&ポリヌクレオチド
本明細書に開示される様々なフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のいずれかをコードする核酸は、化学的に、酵素的にまたは組換えによって合成してもよい。コドン使用頻度(codon usage)は、細胞における発現を改良するよう選択され得る。このようなコドン使用頻度は、選択される細胞種に応じて変わる。大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳類細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞については、特定化されたコドン使用パターンが開発されている。例えば:Mayfieldet al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jan 21;100(2):438−42;Sinclair et al. Protein Expr Purif. 2002 Oct;26(1):96−105;Connell ND. Curr Opin Biotechnol. 2001 Oct;12(5):446−9;Makrides et al. Microbiol Rev. 1996 Sep;60(3):512−38;およびSharp et al. Yeast. 1991 Oct;7(7):657−78参照。
Vectors & Polynucleotides Nucleic acids encoding any of the various fibronectin based scaffold proteins disclosed herein may be synthesized chemically, enzymatically or recombinantly. The codon usage can be selected to improve expression in the cell. Such codon usage varies depending on the cell type selected. For E. coli and other bacteria, as well as mammalian cells, plant cells, yeast cells and insect cells, specialized codon usage patterns have been developed. For example: Mayfieldd et al. Proc Natl Acad Sci US 2003
核酸操作の一般的な技術は、例えば、出典明示により本明細書に組み込まれる、Sambrook et al., Molecular Cloning,: A Laboratory Manual, Vols. 1−3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., 1989またはF. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley−Interscience: New York, 1987)および定期的更新に記載されている。ポリペプチドをコードするDNAは、哺乳類、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来する適した転写または翻訳調節エレメントと作動可能に連結されている。このような調節エレメントとして、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適したmRNAリボソーム結合部位をコードする配列ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。宿主において複製する能力は、通常、複製起点により付与され、形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子がさらに組み込まれる。 General techniques for nucleic acid manipulation are described, for example, in Sambrook et al., Incorporated herein by reference. , Molecular Cloning ,: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed. , 1989 or F.R. Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987) and periodic updates. The DNA encoding the polypeptide is operably linked to suitable transcriptional or translational regulatory elements derived from mammalian, viral or insect genes. Such regulatory elements include a transcriptional promoter, any operator sequence to control transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence that controls termination of transcription and translation. The ability to replicate in the host is usually conferred by the origin of replication and further incorporates a selection gene that facilitates recognition of the transformant.
本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、直接的にだけではなく、好ましくは、シグナル配列または成熟タンパク質あるいはポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても、組換えによって生成してもよい。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものであることが好ましい。天然シグナル配列を認識およびプロセシングしない原核生物宿主細胞のために、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppまたは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列で置換される。酵母分泌のためには、天然シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー(サッカロミセス(Saccharomyces)およびクルイベロマイセス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)または酸性ホスファターゼリーダー、C.アルビカンス(albicans)グルコアミラーゼリーダーまたはPCT国際公開90/13646に記載されるシグナルによって置換してもよい。哺乳類細胞発現では、哺乳類シグナル配列ならびにウイルスの分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスgDシグナルが利用可能である。このような前駆体領域のDNAを、タンパク質をコードするDNAにリーディングフレームでライゲートしてもよい。 The fibronectin based scaffold proteins described herein are not only directly, but are preferably signal sequences or mature proteins or other polypeptides having a specific cleavage site at the N-terminus of the polypeptide. A fusion polypeptide with a heterologous polypeptide may also be produced recombinantly. The heterologous signal sequence selected is preferably one that is recognized and processed (ie, cleaved by a signal peptidase) by the host cell. For prokaryotic host cells that do not recognize and process the native signal sequence, the signal sequence is replaced with, for example, a prokaryotic signal sequence selected from the group of alkaline phosphatase, penicillinase, lpp or a thermostable enterotoxin II leader. For yeast secretion, natural signal sequences can be derived from, for example, yeast invertase leaders, factor leaders (including Saccharomyces and Kluyveromyces alpha factor leaders) or acid phosphatase leaders, C.I. Substitution may be by the signals described in the albicans glucoamylase leader or PCT WO 90/13646. For mammalian cell expression, mammalian signal sequences as well as viral secretory leaders such as herpes simplex gD signals are available. Such precursor region DNA may be ligated in reading frame to DNA encoding the protein.
発現ベクターおよびクローニングベクターは両者とも、ベクターが一以上の選択された宿主細胞において複製するのを可能にする核酸配列を含有する。一般に、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主染色体DNAとは独立に複製するのを可能にするものであり、複製起点または自立複製配列を含む。このような配列は、様々な細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌にとって適しており、2ミクロンのプラスミド起点が酵母に適しており、様々なウイルス起点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBPV)が、哺乳類細胞中のクローニングベクターにとって有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳類発現ベクターにとって必要ではない(SV40起点は、通常、単に、それが初期プロモーターを含むために、使用され得る)。 Both expression and cloning vectors contain a nucleic acid sequence that enables the vector to replicate in one or more selected host cells. In general, for cloning vectors, this sequence is one that enables the vector to replicate independently of the host chromosomal DNA, and includes origins of replication or autonomously replicating sequences. Such sequences are well known for a variety of bacteria, yeast and viruses. The origin of replication from plasmid pBR322 is suitable for most gram-negative bacteria, a 2 micron plasmid origin is suitable for yeast, and various viral origins (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) are mammalian. Useful for cloning vectors in cells. In general, an origin of replication component is not required for mammalian expression vectors (the SV40 origin is usually used simply because it contains the early promoter).
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、(b)栄養要求欠損を補完する、または(c)複合培地からは利用できない決定的な栄養素を供給するタンパク質をコードするものであり、例えば、バチルス(Bacilli)のD−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子が挙げられる。 Expression and cloning vectors may contain a selection gene, also termed a selectable marker. Typical selection genes are (a) conferring resistance to antibiotics or other toxins such as ampicillin, neomycin, methotrexate or tetracycline, (b) complement auxotrophy deficiencies, or (c) from complex media It encodes a protein that supplies critical nutrients that are not available, such as the gene encoding the D. alanine racemase of Bacilli.
酵母において使用するために適した選択遺伝子として、酵母プラスミドYRp7中に存在するtrp1遺伝子がある(Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979))。trp1遺伝子は、トリプトファンにおいて増殖する能力を欠く酵母の変異株、例えば、ATCC番号44076またはPEP4−1のための選択マーカーを提供する。Jones, Genetics,85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノム中にtrp1病変部が存在することは、ひいては、トリプトファンの不在下での増殖により、形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。同様に、Leu2欠損酵母株(ATCC20,622または38,626)は、Leu2遺伝子を保有する既知のプラスミドにより補完される。 A suitable selection gene for use in yeast is the trp1 gene present in the yeast plasmid YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)). The trp1 gene provides a selectable marker for a mutant strain of yeast lacking the ability to grow in tryptophan, for example ATCC No. 44076 or PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). The presence of the trp1 lesion in the yeast host cell genome thus provides an effective environment for detecting transformation by growth in the absence of tryptophan. Similarly, Leu2-deficient yeast strains (ATCC 20,622 or 38,626) are complemented by known plasmids carrying the Leu2 gene.
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含有する。原核生物宿主とともに使用するために適したプロモーターとして、phoAプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系、およびtacプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかし、他の既知細菌プロモーターも適している。細菌系において使用するためのプロモーターはまた、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードするDNAと作動可能に連結されたシャイン−ダルガーノ(S.D.)配列を含有するだろう。 Expression and cloning vectors usually contain a promoter that is recognized by the host organism and is operably linked to a nucleic acid encoding a fibronectin based scaffold protein. Suitable promoters for use with prokaryotic hosts include hybrid promoters such as the phoA promoter, β-lactamase and lactose promoter system, alkaline phosphatase, tryptophan (trp) promoter system, and tac promoter. However, other known bacterial promoters are also suitable. Promoters for use in bacterial systems will also contain a Shine-Dalgarno (SD) sequence operably linked to DNA encoding a fibronectin based scaffold protein.
真核生物のためのプロモーター配列は公知である。実質的にすべての真核細胞遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ25から30塩基上流に位置するATリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写の開始から70から80塩基上流に見られる別の配列は、CNCAAT領域であり、ここで、Nは、任意のヌクレオチドであり得る。ほとんどの真核細胞遺伝子の3’末端には、コード配列の3’末端へのポリAテールの付加のためのシグナルであり得るAATAAA配列がある。これらの配列のすべてが、真核細胞発現ベクターに適宜挿入される。 Promoter sequences for eukaryotes are known. Virtually all eukaryotic genes have an AT-rich region located approximately 25 to 30 bases upstream from the site where transcription is initiated. Another sequence found 70 to 80 bases upstream from the start of transcription of a large number of genes is a CNCAAT region, where N can be any nucleotide. At the 3 'end of most eukaryotic genes is an AATAAA sequence that can be a signal for the addition of a poly A tail to the 3' end of the coding sequence. All of these sequences are inserted appropriately into eukaryotic expression vectors.
酵母宿主とともに使用するために適した促進配列の例として、3−ホスホグリセレートキナーゼ、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、3−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素のためのプロモーターが挙げられる。 Examples of facilitating sequences suitable for use with yeast hosts include 3-phosphoglycerate kinase, or enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6 -Promoters for other glycolytic enzymes such as phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, triose phosphate isomerase, phosphoglucose isomerase and glucokinase.
増殖条件によって制御される転写というさらなる利点を有する誘導性プロモーターである、他の酵母プロモーターとして、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のためのプロモーター領域がある。酵母発現における使用のための適したベクターおよびプロモーターは、欧州特許公報番号73,657にさらに記載されている。酵母エンハンサーも、酵母プロモーターとともに有利に用いられる。
Other yeast promoters, which are inducible promoters with the additional advantage of transcription controlled by growth conditions, include
哺乳類宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、(アデノウイルス2などの)アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルスおよび最も好ましくは、サルウイルス40(SV40)などのウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、ヒートショックプロモーターから得られたプロモーターにより、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合するならば、制御され得る。 Transcription from vectors in mammalian host cells is, for example, polyoma virus, fowlpox virus, adenovirus (such as adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus, hepatitis B virus and Most preferably, such a promoter is isolated from the host cell system by a promoter derived from the genome of a virus such as simian virus 40 (SV40), from a heterologous mammalian promoter, such as an actin promoter or an immunoglobulin promoter, and from a heat shock promoter. If fit, it can be controlled.
SV40ウイルスの初期および後期プロモーターは、SV40ウイルス複製起点をも含有するSV40制限断片として都合よく得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、HindIII E制限断片として都合よく得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いる、哺乳類宿主においてDNAを発現するための系は、米国特許第4,419,446号に開示されている。この系の改変は、米国特許第4,601,978号に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンcDNAの発現に関しては、Reyes et al., Nature 297:598−601 (1982)も参照。あるいは、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列(long terminal repeat)をプロモーターとして用いることができる。 The early and late promoters of the SV40 virus are conveniently obtained as an SV40 restriction fragment that also contains the SV40 viral origin of replication. The immediate early promoter of the human cytomegalovirus is conveniently obtained as a HindIII E restriction fragment. A system for expressing DNA in mammalian hosts using the bovine papilloma virus as a vector is disclosed in US Pat. No. 4,419,446. A modification of this system is described in US Pat. No. 4,601,978. For the expression of human β-interferon cDNA in mouse cells under the control of the herpes simplex virus-derived thymidine kinase promoter, see Reyes et al. , Nature 297: 598-601 (1982). Alternatively, a rous sarcoma virus long terminal repeat can be used as a promoter.
高等真核生物によるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードするDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増大されることが多い。哺乳類遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン)に由来する多数のエンハンサー配列が現在知られている。しかし、通常、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを用いるだろう。例として、複製起点の後ろ側のSV40エンハンサー(bp 100−270)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核細胞プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントに関しては、Yaniv, Nature 297:17−18(1982)も参照。エンハンサーは、ポリペプチドコード配列の5’または3’の位置でベクター中にスプライシングされ得るが、プロモーターの5’側に位置することが好ましい。 Transcription of DNA encoding fibronectin-based scaffold proteins by higher eukaryotes is often increased by inserting an enhancer sequence into the vector. A number of enhancer sequences are now known from mammalian genes (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein and insulin). Usually, however, one will use an enhancer from a eukaryotic cell virus. Examples include the SV40 enhancer behind the origin of replication (bp 100-270), the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer behind the origin of replication, and the adenovirus enhancer. See also Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) on enhancer elements for activation of eukaryotic promoters. Enhancers can be spliced into the vector at positions 5 'or 3' of the polypeptide coding sequence, but are preferably located 5 'to the promoter.
真核宿主細胞(例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来の有核細胞)において用いられる発現ベクターはまた、転写の終結のために、かつmRNAを安定化するために必要な配列も含有するだろう。このような配列は一般に、真核細胞またはウイルスのDNAまたはcDNAの5’ 非翻訳領域、および場合により、3’非翻訳領域から得ることができる。これらの領域は、ポリペプチドをコードするmRNAの非翻訳部分中のポリアデニル化断片として転写される、ヌクレオチドセグメントを含有する。1つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開94/11026およびそこで開示される発現ベクターを参照。 Expression vectors used in eukaryotic host cells (eg, nucleated cells from yeast, fungi, insects, plants, animals, humans or other multicellular organisms) also stabilize mRNA and terminate transcription. It will also contain the sequences necessary to do. Such sequences can generally be obtained from the 5 'untranslated region and optionally the 3' untranslated region of eukaryotic or viral DNA or cDNA. These regions contain nucleotide segments that are transcribed as polyadenylated fragments in the untranslated portion of the mRNA encoding the polypeptide. One useful transcription termination component is the bovine growth hormone polyadenylation region. See WO94 / 11026 and the expression vector disclosed therein.
組換えDNAはまた、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を精製するために有用であり得る任意の種類のタンパク質タグ配列を含み得る。タンパク質タグの例として、ヒスチジンタグ、FLAGタグ、mycタグ、HAタグまたはGSTタグが挙げられるが、これらに限定されるものではない。細菌、真菌、酵母および哺乳類細胞宿主とともに使用するために適当なクローニングおよび発現ベクターは、Cloning Vector:A Laboratory Manual,(Elsevier, New York, 1985)中に見ることができ、その関連の開示内容は、出典明示により本明細書に組み込まれる。 The recombinant DNA may also include any type of protein tag sequence that may be useful for purifying fibronectin based scaffold proteins. Examples of protein tags include, but are not limited to, histidine tags, FLAG tags, myc tags, HA tags or GST tags. Suitable cloning and expression vectors for use with bacterial, fungal, yeast and mammalian cell hosts can be found in Cloning Vector: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York, 1985), the relevant disclosures of which are , Incorporated herein by reference.
発現コンストラクトは、当業者には明らかであるように、宿主細胞にとって適当な方法を用いて宿主細胞に導入される。宿主細胞に核酸を導入するための種々の方法が当技術分野で公知であり、エレクトロポレーション;塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE−デキストランまたは他の物質を使用するトランスフェクション;微粒子銃;リポフェクション;および(ベクターが感染性物質である)感染が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 The expression construct is introduced into the host cell using methods appropriate for the host cell, as will be apparent to those skilled in the art. Various methods for introducing nucleic acids into host cells are known in the art and include electroporation; transfection using calcium chloride, rubidium chloride, calcium phosphate, DEAE-dextran or other materials; microparticle guns; lipofection And (but is not limited to) infection (where the vector is an infectious agent).
適した宿主細胞として、原核生物、酵母、哺乳類細胞または細菌細胞が挙げられる。適した細菌として、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌またはバチルス種が挙げられる。好ましくは、S.セレビシエ(cerevisiae)などの、サッカロミセス種に由来する酵母も、ポリペプチドの生成のために使用してよい。様々な哺乳類または昆虫細胞培養系を使用して、組換えタンパク質を発現することもできる。昆虫細胞において異種タンパク質を生成するためのバキュロウイルス系は、Luckow and Summers,(Bio/Technology, 6:47, 1988)に総説されている。適した哺乳類宿主細胞株の例として、内皮細胞、COS−7サル腎臓細胞、CV−1、L細胞、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、ヒト胚性腎細胞、HeLa、293、293TおよびBHK細胞株が挙げられる。精製されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、組換えタンパク質を発現するために適した宿主/ベクター系を培養することにより調製される。多数の適用のために、本明細書に開示される小さいサイズのフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、発現のための好ましい方法として大腸菌において発現を行う。次いで、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、培養培地または細胞抽出物から精製される。 Suitable host cells include prokaryotes, yeast, mammalian cells or bacterial cells. Suitable bacteria include gram negative or gram positive bacteria such as E. coli or Bacillus species. Preferably, S.M. Yeasts derived from Saccharomyces species, such as cerevisiae, may also be used for the production of polypeptides. Various mammalian or insect cell culture systems can also be used to express recombinant protein. Baculovirus systems for producing heterologous proteins in insect cells are reviewed in Luckow and Summers, (Bio / Technology, 6:47, 1988). Examples of suitable mammalian host cell lines include endothelial cells, COS-7 monkey kidney cells, CV-1, L cells, C127, 3T3, Chinese hamster ovary (CHO), human embryonic kidney cells, HeLa, 293, 293T and A BHK cell line is mentioned. Purified fibronectin based scaffold proteins are prepared by culturing a suitable host / vector system to express the recombinant protein. For many applications, the small size fibronectin based scaffold proteins disclosed herein are expressed in E. coli as a preferred method for expression. The fibronectin based scaffold protein is then purified from the culture medium or cell extract.
タンパク質生成
宿主細胞は、タンパク質生成のために本明細書に記載される発現またはクローニングベクターを用いて形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に改変された従来の栄養培地で培養される。
Protein production Host cells are transformed with the expression or cloning vectors described herein for protein production to induce a promoter, select transformants, or a gene encoding the desired sequence. It is cultured in a conventional nutrient medium suitably modified for amplification.
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を生成するために用いられる宿主細胞は、種々の培地で培養してもよい。Ham’s F10(Sigma)、最小必須培地((MEM)、(Sigma))、RPMI−1640(Sigma)およびダルベッコ改変イーグル培地((DMEM)、(Sigma))などの市販の培地が、宿主細胞を培養するために適している。さらに、Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980)、米国特許第4,767,704号;同第4,657,866号;同第4,927,762号;同第4,560,655号;または同第5,122,469号;国際公開90/03430;国際公開87/00195;または米国特許第Re.30,985号に記載される培地のいずれかも、宿主細胞のための培養培地として用いてよい。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび/または他の増殖因子(インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子など)、塩(塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびホスフェートなど)、バッファー(HEPESなど)、ヌクレオチド(アデノシンおよびチミジンなど)、抗生物質(GENTAMYCIN商標薬など)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される)およびグルコースまたは同等なエネルギー供給源を用いて補給され得る。任意の他の必要な栄養補助剤を、当業者に公知である適当な濃度で含めてもよい。温度、pH等などの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともにこれまでに使用されたものであり、当業者には明らかであろう。 Host cells used to produce fibronectin based scaffold proteins may be cultured in a variety of media. Commercially available media such as Ham's F10 (Sigma), minimal essential media ((MEM), (Sigma)), RPMI-1640 (Sigma) and Dulbecco's modified Eagle's media ((DMEM), (Sigma)) are host cells. Suitable for culturing. Furthermore, Ham et al. , Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al. , Anal. Biochem. 102: 255 (1980), U.S. Pat. No. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; or 5,122. 469; International Publication No. 90/03430; International Publication No. 87/00195; or US Pat. No. Re. Any of the media described in US Pat. No. 30,985 may be used as a culture medium for host cells. Any of these media may contain hormones and / or other growth factors (such as insulin, transferrin or epidermal growth factor), salts (such as sodium chloride, calcium, magnesium and phosphate), buffers (such as HEPES), as needed. Supplemented with nucleotides (such as adenosine and thymidine), antibiotics (such as GENTAMYCIN trademark ), trace elements (defined as inorganic compounds normally present at final concentrations in the micromolar range) and glucose or equivalent energy source obtain. Any other necessary nutritional supplements may be included at appropriate concentrations known to those skilled in the art. Culture conditions such as temperature, pH, etc., have been used so far with the host cell selected for expression and will be apparent to those skilled in the art.
本明細書に開示されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質はまた、無細胞翻訳系を使用して生成できる。このような目的上、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードする核酸は、インビトロ転写を可能にしてmRNAを生成し、使用されている特定の無細胞系(哺乳類または酵母細胞などの真核細胞を含まない翻訳系または細菌細胞などの原核生物を含まない翻訳系)におけるmRNAの細胞を含まない翻訳を可能にするよう改変されなければならない。 The fibronectin based scaffold proteins disclosed herein can also be produced using a cell-free translation system. For these purposes, nucleic acids encoding fibronectin-based scaffold proteins enable in vitro transcription to produce mRNA and can be used to identify the specific cell-free system used (eukaryotic cells such as mammalian or yeast cells). It must be modified to allow cell-free translation of mRNA in translation systems that do not contain or translation systems that do not contain prokaryotes such as bacterial cells).
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質はまた、化学合成によって(例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, ILに記載される方法によって)生成できる。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質への修飾も化学合成によって生成できる。 Fibronectin based scaffold proteins can also be produced by chemical synthesis (eg, by the method described in Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Modifications to fibronectin based scaffold proteins can also be generated by chemical synthesis.
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、タンパク質化学の分野で一般に知られている、タンパク質の単離/精製法により精製できる。非限定的な例として、抽出、再結晶化、塩析(例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムを用いる)、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分配またはこれらの任意の組合せが挙げられる。精製後、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を、濾過および透析を含むが、これらに限定されるものではない、当技術分野で公知の種々の方法のいずれかにより、異なるバッファーに交換してもよく、かつ/または、濃縮してもよい。 Fibronectin based scaffold proteins can be purified by protein isolation / purification methods commonly known in the field of protein chemistry. Non-limiting examples include extraction, recrystallization, salting out (eg, using ammonium sulfate or sodium sulfate), centrifugation, dialysis, ultrafiltration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, sequential Phase chromatography, reverse phase chromatography, gel filtration, gel permeation chromatography, affinity chromatography, electrophoresis, countercurrent distribution or any combination thereof may be mentioned. After purification, the fibronectin based scaffold protein may be exchanged for a different buffer by any of a variety of methods known in the art, including but not limited to filtration and dialysis. And / or may be concentrated.
精製されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、好ましくは少なくとも85%純粋、より好ましくは、少なくとも95%純粋、最も好ましくは、少なくとも98%純粋である。純度の正確な数値にかかわらず、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は医薬製剤として使用するために十分に純粋である。 The purified fibronectin based scaffold protein is preferably at least 85% pure, more preferably at least 95% pure, and most preferably at least 98% pure. Regardless of the exact figure of purity, fibronectin based scaffold proteins are sufficiently pure for use as pharmaceutical formulations.
例示的な使用
一態様では、本出願は、検出可能な部分で標識されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を提供する。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、種々の診断的適用のために用いてもよい。検出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的のいずれかで生じることができる任意のものであり得る。例えば、検出可能な部分は、H3、C14、C13、P32、S35またはI131などの放射性同位元素;フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリンなどの蛍光もしくは化学発光化合物;またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素であり得る。
Exemplary Uses In one aspect, the application provides a fibronectin based scaffold protein labeled with a detectable moiety. Fibronectin based scaffold proteins may be used for various diagnostic applications. The detectable moiety can be anything that can produce a detectable signal either directly or indirectly. For example, the detectable moiety may be a radioisotope such as H3, C14, C13, P32, S35 or I131; a fluorescent or chemiluminescent compound such as fluorescein isothiocyanate, rhodamine or luciferin; or alkaline phosphatase, β-galactosidase or horseradish It can be an enzyme such as peroxidase.
Hunter, et al., Nature 144:945 (1962); David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974);Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981);およびNygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)によって記載される方法を含む、タンパク質を検出可能な部分にコンジュゲートするための、当技術分野で公知の任意の方法を使用してもよい。インビトロ法は、CysおよびLysなどの特定のアミノ酸のための化学反応などの、タンパク質と適合する化学反応を含む当技術分野で周知であるコンジュゲーション化学を含む。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質に、検出可能な部分を連結するために、連結基または反応性基が用いられる。適した連結基は当技術分野で周知であり、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安的な基、感光基、ペプチダーゼに不安定な基およびエステラーゼに不安的な基が挙げられる。好ましい連結基として、適用に応じて、ジスルフィド基およびチオエーテル基がある。Cysアミノ酸を含まないポリペプチドのために、Cysを、コンジュゲーションのための位置を作り出しながら、タンパク質の活性が存在するのを可能にする位置に操作して入れてもよい。 Hunter, et al. , Nature 144: 945 (1962); David, et al. Biochemistry 13: 1014 (1974); Pain, et al. , J. et al. Immunol. Meth. 40: 219 (1981); and Nygren, J. et al. Histochem. and Cytochem. 30: 407 (1982), any method known in the art for conjugating proteins to detectable moieties may be used. In vitro methods include conjugation chemistry well known in the art, including chemical reactions compatible with proteins, such as chemical reactions for specific amino acids such as Cys and Lys. In order to link the detectable moiety to a fibronectin based scaffold protein, a linking group or reactive group is used. Suitable linking groups are well known in the art and include disulfide groups, thioether groups, acid labile groups, photosensitive groups, peptidase labile groups and esterase labile groups. Preferred linking groups include disulfide groups and thioether groups depending on the application. For polypeptides that do not contain Cys amino acids, Cys may be engineered into a position that allows the activity of the protein to be present while creating a position for conjugation.
検出可能な部分で連結されているフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質はまた、インビボイメージングにとって有用である。ポリペプチドは、対象に、好ましくは、血流中に投与される、放射線を通さない(radio−opaque)物質または放射性同位元素と連結でき、対象における標識されたタンパク質の存在および位置がアッセイされる。このイメージング技術は、例えば、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質が癌に関連する標的に結合する場合、悪性腫瘍のステージ分類および治療において有用である。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、核磁気共鳴、放射線学によってであれ、当技術分野で公知の他の検出手段によってであれ、対象において検出可能である任意の部分を用いて標識してもよい。 Fibronectin based scaffold proteins linked by a detectable moiety are also useful for in vivo imaging. The polypeptide can be linked to a subject, preferably a radio-opaque substance or radioisotope administered in the bloodstream, and the presence and location of the labeled protein in the subject is assayed. . This imaging technique is useful, for example, in the classification and treatment of malignant tumors when fibronectin based scaffold proteins bind to cancer-related targets. Fibronectin based scaffold proteins may be labeled with any moiety that is detectable in a subject, whether by nuclear magnetic resonance, radiology, or by other detection means known in the art. .
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質はまた、アフィニティー精製物質としても有用である。この過程では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、当技術分野で周知の方法を用いて、セファデックス樹脂または濾紙などの適した支持体上に固定化されている。 Fibronectin based scaffold proteins are also useful as affinity purification substances. In this process, the fibronectin based scaffold protein is immobilized on a suitable support such as Sephadex resin or filter paper using methods well known in the art.
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、競合結合実験、直接および間接サンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイなどの、任意の公知のアッセイ法において使用できる(Zola, Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques, pp.147−158(CRC Press, Inc., 1987))。 Fibronectin-based scaffold proteins can be used in any known assay method, such as competitive binding experiments, direct and indirect sandwich assays and immunoprecipitation assays (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Technologies, pp. 147-158). (CRC Press, Inc., 1987)).
特定の態様では、本開示内容は、VEGFR2、IGF−IRまたはEGFRなどのサンプル中の標的分子を検出する方法を提供する。方法は、サンプルを、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質と接触させること、ここに、前記接触は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質−標的複合体形成を可能にする条件下で実施されるものである;および前記複合体を検出し、それによって前記サンプル中の前記標的を検出することを含み得る。検出は、例えば、X線撮影、免疫学的アッセイ、蛍光検出、質量分析または表面プラズモン共鳴などの、当技術分野で公知の任意の技術を用いて実施してもよい。サンプルは、生検、特に、腫瘍、疑わしい腫瘍の生検などの、生物学的サンプルであることが多い。サンプルは、ヒトまたは他の哺乳類に由来するものであり得る。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、放射活性部分、蛍光部分、発色性部分、化学発光部分またはハプテン部分などの標識部分を用いて標識され得る。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、固体支持体上に固定化され得る。 In certain aspects, the present disclosure provides a method of detecting a target molecule in a sample such as VEGFR2, IGF-IR or EGFR. The method comprises contacting a sample with a fibronectin based scaffold protein as described herein, wherein said contacting is under conditions that allow fibronectin based scaffold protein-target complex formation. And detecting the complex, thereby detecting the target in the sample. Detection may be performed using any technique known in the art such as, for example, radiography, immunological assay, fluorescence detection, mass spectrometry or surface plasmon resonance. The sample is often a biological sample, such as a biopsy, particularly a tumor, biopsy of a suspicious tumor. The sample can be from a human or other mammal. Fibronectin based scaffold proteins can be labeled with a labeling moiety such as a radioactive moiety, a fluorescent moiety, a chromogenic moiety, a chemiluminescent moiety or a hapten moiety. Fibronectin based scaffold proteins can be immobilized on a solid support.
一態様では、本出願は、障害の治療において有用であるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を提供する。治療され得る疾病あるいは障害は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の結合特異性により決まるだろう。本出願はまた、対象にフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を投与する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、哺乳類、特に、ヒトにとって医薬上許容される。「医薬上許容される」ポリペプチドとは、相当な有害な医学的結果を伴わずに動物に投与されるポリペプチドを指す。医薬上許容されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の例として、インテグリン結合ドメイン(RGD)を欠く10Fn3ドメインおよび本質的にエンドトキシンを含まない、または極めて低いエンドトキシンレベルを有する10Fn3ドメインが挙げられる。 In one aspect, the application provides fibronectin based scaffold proteins that are useful in the treatment of disorders. The disease or disorder that can be treated will depend on the binding specificity of the fibronectin based scaffold protein. The application also provides a method of administering a fibronectin based scaffold protein to a subject. In some embodiments, the subject is a human. In some embodiments, fibronectin based scaffold proteins are pharmaceutically acceptable to mammals, particularly humans. A “pharmaceutically acceptable” polypeptide refers to a polypeptide that is administered to an animal without appreciable adverse medical consequences. The pharmaceutically acceptable fibronectin Examples of scaffold proteins based free of 10 Fn3 domain and essentially endotoxin lack integrin-binding domain (RGD), or include 10 Fn3 domains with very low endotoxin levels.
特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質、特に、IGF−IR、VEGFR2および/またはEGFRに結合するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、癌などの障害の治療において有用である。特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、IGF−IR、VEGFR2および/またはEGFRの変異または発現レベルに関連する癌の障害の治療において有用である。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の投与は、対象における抗増殖性障害(antiproliferative disorder)を治療する。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の投与は、インビボでの腫瘍細胞増殖を阻害する。腫瘍細胞は、表皮、上皮、内皮、白血病、肉腫、多発性骨髄腫または中胚葉細胞を含む任意の細胞種に由来するものであり得るが、これに限定されない。異種移殖片腫瘍研究において使用するための一般的な腫瘍細胞株の例として、A549(非小細胞肺癌)細胞、DU−145(前立腺)細胞、MCF−7(乳房)細胞、Colo205(結腸)細胞、3T3/]GF−IR(マウス繊維芽細胞)細胞、NCI H441細胞、HEP G2(肝細胞腫)細胞、MDA MB231(乳房)細胞、HT−29(結腸)細胞、MDA−MB−435s(乳房)細胞、U266細胞、SH−SY5Y細胞、Sk−Mel−2細胞、NCI−H929、RPM18226およびA431細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、未処置動物における腫瘍の増殖と比べて、腫瘍細胞増殖を阻害する。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、未処理動物における腫瘍の増殖と比べて、腫瘍細胞増殖を50、60、70、80%以上阻害する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞増殖の阻害は、動物がフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を開始した後、少なくとも7日または少なくとも14日測定される。いくつかの実施形態では、別の抗悪性腫瘍薬がフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質とともに動物に投与される。 In certain embodiments, fibronectin based scaffold proteins, particularly fibronectin based scaffold proteins that bind to IGF-IR, VEGFR2 and / or EGFR are useful in the treatment of disorders such as cancer. In certain embodiments, fibronectin based scaffold proteins are useful in the treatment of cancer disorders associated with IGF-IR, VEGFR2 and / or EGFR mutations or expression levels. In some embodiments, administration of the fibronectin based scaffold protein treats an antiproliferative disorder in the subject. In some embodiments, administration of a fibronectin based scaffold protein inhibits tumor cell growth in vivo. Tumor cells can be derived from any cell type including, but not limited to, epidermis, epithelium, endothelium, leukemia, sarcoma, multiple myeloma or mesoderm cells. Examples of common tumor cell lines for use in xenograft tumor studies include A549 (non-small cell lung cancer) cells, DU-145 (prostate) cells, MCF-7 (breast) cells, Colo205 (colon) Cells, 3T3 /] GF-IR (mouse fibroblast) cells, NCI H441 cells, HEP G2 (hepatoma) cells, MDA MB231 (breast) cells, HT-29 (colon) cells, MDA-MB-435s ( Breast) cells, U266 cells, SH-SY5Y cells, Sk-Mel-2 cells, NCI-H929, RPM18226 and A431 cells. In some embodiments, a fibronectin based scaffold protein inhibits tumor cell growth as compared to tumor growth in an untreated animal. In some embodiments, fibronectin based scaffold proteins inhibit tumor cell growth by 50, 60, 70, 80% or more compared to tumor growth in untreated animals. In some embodiments, inhibition of tumor cell growth is measured at least 7 days or at least 14 days after the animal initiates a fibronectin based scaffold protein. In some embodiments, another antineoplastic agent is administered to the animal along with a fibronectin based scaffold protein.
特定の態様では、本開示内容は、腫瘍および/または腫瘍転移の治療および/または予防のためにフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を投与する方法を提供し、ここで、腫瘍は、脳腫瘍、尿生殖路の腫瘍、リンパ系の腫瘍、胃の腫瘍、咽頭腫瘍、単球性白血病、肺腺癌、小細胞肺癌腫、膵臓癌、膠芽腫および乳癌からなる群から選択されることが特に好ましいが、それに制限されない。 In certain aspects, the present disclosure provides a method of administering a fibronectin based scaffold protein for the treatment and / or prevention of tumors and / or tumor metastases, wherein the tumor is a brain tumor, urogenital Particularly preferred is selected from the group consisting of tract tumor, lymphoid tumor, stomach tumor, pharyngeal tumor, monocytic leukemia, lung adenocarcinoma, small cell lung carcinoma, pancreatic cancer, glioblastoma and breast cancer Not limited to that.
特定の態様では、本開示内容は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を、扁平上皮癌、膀胱癌、胃癌、肝臓癌、腎臓癌、結腸直腸癌、乳癌、頭部癌、頚部癌、食道癌、婦人科の癌、甲状腺癌、リンパ腫、慢性白血病および急性白血病からなる群から選択される癌性疾患の治療のために投与する方法を提供する。 In certain aspects, the present disclosure provides a fibronectin based scaffold protein for squamous cell carcinoma, bladder cancer, gastric cancer, liver cancer, kidney cancer, colorectal cancer, breast cancer, head cancer, cervical cancer, esophageal cancer, Methods of administration are provided for the treatment of cancerous diseases selected from the group consisting of gynecological cancer, thyroid cancer, lymphoma, chronic leukemia and acute leukemia.
他の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、例えば腫瘍壊死因子(TNF)αなどの、炎症反応および/または自己免疫疾患に関与する標的に結合する。このようなフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬および難治性の喘息などの、自己免疫疾患を治療するために有用なものであり得る。 In other embodiments, a fibronectin based scaffold protein binds to a target involved in inflammatory reactions and / or autoimmune diseases, such as, for example, tumor necrosis factor (TNF) α. Such fibronectin based scaffold proteins may be useful for treating autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, Crohn's disease, psoriasis and refractory asthma.
製剤および投与
本出願は、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を含む医薬上許容される組成物をさらに提供し、該組成物は、本質的にエンドトキシンを含まないものである。
Formulation and Administration The application further provides a pharmaceutically acceptable composition comprising a fibronectin based scaffold protein as described herein, wherein the composition is essentially free of endotoxin. .
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を含む治療用製剤は、所望の程度の純度を有する記載されるタンパク質を、所望による生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって、水溶液、凍結乾燥された、または他の乾燥された製剤の形態で、保存のために調製される(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度で受容者(recipient)にとって非毒性であり、リン酸、クエン酸および他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤;保存料(オクタデシイジメチルベンジル(octadecyidimethylbenzyl)塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール;メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;およびm−クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸;単糖、二糖およびグルコース、マンノースまたはデキストランを含む他の炭水化物;EDTAなどのキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成性対イオン;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質複合体);ならびに/あるいはTWEEN商標、PLURONICS商標またはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。 A therapeutic formulation comprising a fibronectin based scaffold protein is prepared by mixing the described protein having the desired degree of purity with an optional physiologically acceptable carrier, excipient or stabilizer. , Lyophilized, or in the form of other dried formulations, prepared for storage (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). Acceptable carriers, excipients or stabilizers are non-toxic to recipients at the dosages and concentrations used, buffers such as phosphate, citrate and other organic acids; ascorbic acid and methionine Preservatives (octadecydimethylbenzyloxychloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride, benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propylparaben; catechol Resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; and m-cresol); low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptide; such as serum albumin, gelatin or immunoglobulin Hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including glucose, mannose or dextran; chelating agents such as EDTA; Sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; metal complexes (eg Zn-protein complexes); and / or non-ions such as TWEEN trademark , PLURONICS trademark or polyethylene glycol (PEG) Surfactants.
また、本明細書における製剤とは、治療されている特定の適応症にとって必要な二以上の活性化合物、好ましくは、互いに有害な影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含み得る。このような分子は、意図される目的上効果的である量の組み合わせで適宜存在する。 The formulation herein may also include more than one active compound as necessary for the particular indication being treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other. Such molecules are suitably present in combinations of amounts that are effective for the purpose intended.
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって、調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中に、コロイドドラッグデリバリーシステム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に封入されてもよい。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。 Fibronectin based scaffold proteins can also be prepared in microcapsules prepared by, for example, coacervation techniques or by interfacial polymerization, for example, hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly- (methyl methacrylate) microcapsules, respectively. May be encapsulated in colloidal drug delivery systems (eg, liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) or in macroemulsions. Such techniques are described in Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. et al. Ed. (1980).
特定の実施形態では、本出願は、pH4.0−6.5を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な組成物を提供する。他の実施形態では、本出願は、pH4.0−5.5を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な組成物を提供する。他の実施形態では、本出願は、pH5.5を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な組成物を提供する。他の実施形態では、本出願は、pH4.0を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な組成物を提供する。特に、本出願は、溶液中での保存の間、低減された断片化および/または低レベルの凝集を有する、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な組成物を提供する。例示の節で実証されるように、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、pH4.0で増大した安定性を有し、一方でそれと同時に、pH5.5と比較してpH4.0で減少した凝集レベルを示した。pH4.0を有するこのような安定で、可溶性の製剤は、特に静脈内投与に適している。いくつかの実施形態では、このような安定な製剤におけるタンパク質濃度は、少なくとも3mg/mLである。例示的な実施形態では、このような安定な製剤におけるタンパク質濃度は、少なくとも5mg/mLである。特定の実施形態では、このような安定な製剤におけるタンパク質濃度は、3−10mg/mL、3−8mg/mL、3−6mg/mL、3−5mg/mL、4−10mg/mL、4−8mg/mL、4−6mg/mL、5−10mg/mL、5−8mg/mLまたは5−6mg/mLの範囲である。例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な組成物は、より高いpHで、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の同等製剤(equivalent formulation)と比べて、低減された凝集を有する。例えば、安定な製剤は、pH5.5以上で4週間の保存の間、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の保存の間に見られる凝集レベルと比べて、pH4.0で4週間の溶液中での保存の間、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%以下の凝集を示し得る。特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な製剤は、少なくとも4週間の25℃での保存の後、10%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%以下の凝集を有する。特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な製剤は、pH4.0かつ25℃で4週間、溶液中での保存で、7%、6%、5%、4%、3.5%、3%、2%未満またはそれ以下の断片化を有する。特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な製剤は、少なくとも4週間の25℃での溶液中での保存の間、5%未満の断片化および5%未満の凝集を有する。例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な製剤は、少なくとも4週間の25℃での溶液中での保存の間、4%未満の断片化および4%未満の凝集を有する。 In certain embodiments, the application provides a stable composition of fibronectin based scaffold proteins having a pH of 4.0-6.5. In other embodiments, the application provides a stable composition of fibronectin based scaffold proteins having a pH of 4.0-5.5. In another embodiment, the application provides a stable composition of fibronectin based scaffold protein having a pH of 5.5. In another embodiment, the application provides a stable composition of a fibronectin based scaffold protein having a pH of 4.0. In particular, the application provides stable compositions of fibronectin based scaffold proteins that have reduced fragmentation and / or low levels of aggregation during storage in solution. As demonstrated in the exemplary section, the fibronectin based scaffold proteins described herein have increased stability at pH 4.0, while at the same time compared to pH 5.5. It showed a reduced aggregation level at pH 4.0. Such a stable and soluble formulation having a pH of 4.0 is particularly suitable for intravenous administration. In some embodiments, the protein concentration in such stable formulations is at least 3 mg / mL. In an exemplary embodiment, the protein concentration in such stable formulations is at least 5 mg / mL. In certain embodiments, the protein concentration in such stable formulations is 3-10 mg / mL, 3-8 mg / mL, 3-6 mg / mL, 3-5 mg / mL, 4-10 mg / mL, 4-8 mg / ML, 4-6 mg / mL, 5-10 mg / mL, 5-8 mg / mL or 5-6 mg / mL. In an exemplary embodiment, a stable composition of fibronectin based scaffold protein has reduced aggregation compared to an equivalent formulation of fibronectin based scaffold protein at higher pH. . For example, a stable formulation can be obtained in a 4 week solution at pH 4.0 compared to the aggregation level seen during storage of fibronectin-based scaffold proteins during storage for 4 weeks at pH 5.5 and above. During storage, it may exhibit at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% or less aggregation. In certain embodiments, a stable formulation of fibronectin based scaffold protein is 10%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% after storage at 25 ° C. for at least 4 weeks. %, 2%, 1% or less agglomeration. In certain embodiments, a stable formulation of a fibronectin based scaffold protein is 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, stored in solution at pH 4.0 and 25 ° C. for 4 weeks. It has 5%, 3%, less than 2% or less fragmentation. In certain embodiments, a stable formulation of a fibronectin based scaffold protein has less than 5% fragmentation and less than 5% aggregation during storage in solution at 25 ° C. for at least 4 weeks. In an exemplary embodiment, a stable formulation of a fibronectin based scaffold protein has less than 4% fragmentation and less than 4% aggregation during storage in solution at 25 ° C. for at least 4 weeks. .
インビボ投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。 Formulations used for in vivo administration must be sterile. This is easily accomplished by filtration through sterile filtration membranes.
持続放出製剤を調製してもよい。持続放出製剤の適した例として、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、ここで、マトリックスは、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L−グルタミン酸およびyエチル−L−グルタミンのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、LUPRON DEPOT商標(乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア)などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマーおよびポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、100日にわたる分子の放出を可能にする一方、特定のヒドロゲルは、より短い期間タンパク質を放出する。被包された本発明のタンパク質が体内に長時間とどまる場合には、それらは、37℃で湿度に対する曝露の結果として変性または凝集し、生物活性の喪失および免疫原性の可能性ある変化をもたらし得る。関与する機序に応じて、安定化のための合理的な戦略を考え出すことができる。例えば、凝集機序がチオ−ジスルフィド交換による分子間S−S結合形成であると見い出される場合には、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥させること、水分含量を制御すること、適当な添加物を用いることおよび特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。 Sustained release formulations may be prepared. Suitable examples of sustained release formulations include solid hydrophobic polymer semipermeable matrices containing fibronectin based scaffold proteins as described herein, wherein the matrix is a molded article, for example, It is in the form of a film or microcapsule. Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels (eg, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) or poly (vinyl alcohol)), polylactides (US Pat. No. 3,773,919), L-glutamic acid and yethyl. Degradable lactic acid-glycolic acid copolymers such as L-glutamine copolymer, non-degradable ethylene-vinyl acetate, LUPRON DEPOT trademark (injectable microspheres comprising lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate) and poly-D- (-)-3-hydroxybutyric acid is mentioned. While polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid allow release of molecules over 100 days, certain hydrogels release proteins for shorter periods of time. If the encapsulated proteins of the invention remain in the body for a long time, they denature or aggregate as a result of exposure to humidity at 37 ° C, resulting in loss of biological activity and possible changes in immunogenicity. obtain. Depending on the mechanism involved, a rational strategy for stabilization can be devised. For example, if the aggregation mechanism is found to be intermolecular S—S bond formation by thio-disulfide exchange, stabilization can be achieved by modifying sulfhydryl residues, lyophilizing from acidic solution, reducing moisture content. It can be achieved by controlling, using appropriate additives and developing specific polymer matrix compositions.
当業者ならば、各フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の投与量は、タンパク質の正体によって変わることは理解するであろうが、好ましい投与量は、約10mg/平方メートルから約2000mg/平方メートル、より好ましくは、約50mg/平方メートルから約1000mg/平方メートルの範囲であり得る。 One skilled in the art will appreciate that the dosage of each fibronectin based scaffold protein will vary depending on the identity of the protein, but a preferred dosage is from about 10 mg / square meter to about 2000 mg / square meter, more preferably , Ranging from about 50 mg / square meter to about 1000 mg / square meter.
治療適用のために、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、医薬上許容される剤形で対象に投与される。それらは、ボーラスとして、または一定時間にわたる連続注入によって静脈内に、筋肉内、皮下、関節内、滑液内、くも膜下腔内、経口、局所または吸入経路によって投与され得る。タンパク質はまた、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内または病変部周囲経路によって投与され、局所ならびに全身治療効果を発揮し得る。適した医薬上許容される担体、希釈剤および賦形剤は周知であり、臨床状況が必要とする際に、当業者によって決定され得る。適した担体、希釈剤および/または賦形剤の例として:(1)約1mg/mlから25 mg/mlのヒト血清アルブミンを含有するダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、pH約7.4、(2)0.9%生理食塩水(0.9% w/v NaCl)および(3)5%(w/v)デキストロースが挙げられる。本発明の方法は、インビトロ、インビボまたはエキソビボ(ex vivo)で実施できる。 For therapeutic applications, fibronectin based scaffold proteins are administered to a subject in a pharmaceutically acceptable dosage form. They can be administered as a bolus or intravenously by continuous infusion over a period of time, intramuscular, subcutaneous, intraarticular, intrasynovial, intrathecal, oral, topical or inhalation route. Proteins can also be administered by intratumoral, peritumoral, intralesional or perilesional routes and exert local as well as systemic therapeutic effects. Suitable pharmaceutically acceptable carriers, diluents and excipients are well known and can be determined by one skilled in the art as the clinical situation requires. Examples of suitable carriers, diluents and / or excipients: (1) Dulbecco's phosphate buffered saline containing about 1 mg / ml to 25 mg / ml human serum albumin, pH about 7.4, (2) 0.9% saline (0.9% w / v NaCl) and (3) 5% (w / v) dextrose. The methods of the invention can be performed in vitro, in vivo, or ex vivo.
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質および一以上のさらなる治療薬の投与は、同時投与されるか、逐次投与されるかにかかわらず、治療適用のために、上記のように起こり得る。同時投与に適した医薬上許容される担体、希釈剤および賦形剤は、当業者によって、同時投与されている特定の治療薬の正体に応じて変わると理解される。 Administration of the fibronectin based scaffold protein and one or more additional therapeutic agents can occur as described above for therapeutic applications, whether coadministered or sequentially administered. It is understood that pharmaceutically acceptable carriers, diluents and excipients suitable for co-administration will vary depending on the identity of the particular therapeutic agent being co-administered by those skilled in the art.
凍結乾燥されているのではなく水性の剤形で存在する場合には、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、通常、約0.1mg/mlから100mg/mlの濃度で製剤されるが、これらの範囲の外側の広い変動も容認される。疾患の治療のための、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の適当な投与量は、上記で定義されるような治療される疾患の種類、疾患の重篤度および経過、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、これまでの治療の経過、患者の病歴およびフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質に対する反応、ならびに主治医の裁量に応じて変わる。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、1回で、または一連の治療にわたって、患者に適宜投与される。 Fibronectin based scaffold proteins are usually formulated at concentrations of about 0.1 mg / ml to 100 mg / ml when present in an aqueous dosage form rather than lyophilized. Wide variations outside the range are acceptable. Suitable dosages of fibronectin based scaffold protein for the treatment of disease include the type of disease being treated, severity and course of the disease, fibronectin based scaffold protein as defined above Is administered for prophylactic or therapeutic purposes, depending on the course of treatment so far, the patient's medical history and response to fibronectin-based scaffold proteins, and the discretion of the attending physician. A fibronectin based scaffold protein is suitably administered to a patient at one time or over a series of treatments.
配列表
WTコア配列
EVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(配列番号:1)
Iコア(配列番号:2)
EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT
Vコア(配列番号:3)
EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT
短いテール(配列番号:4)
EIEK
修飾されたCysテール(配列番号:5)
EGSGC
Cysテール(配列番号:6)
EIEKPCQ
Fnをベースとするリンカー(配列番号:7)
PSTSTST
GS5リンカー(配列番号:8)
GSGSGSGSGS
GS10リンカー(配列番号:9)
GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS
(GGGGS)3(配列番号:10)
GGGGS GGGGS GGGGS
(GGGGS)5(配列番号:11)
GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS
G4SG4SG3SG(配列番号:12)
GGGGSGGGGSGGGSG
GPG(配列番号:13)
GPGPGPG(配列番号:14)
GPGPGPGPGPG(配列番号:15)
PA3リンカー(配列番号:16)
PAPAPA
PA6リンカー(配列番号:17)
PAPAPAPAPAPA
PA9リンカー(配列番号:18)
PAPAPAPAPAPAPAPAPA
MGVSDVPRDL(配列番号:19)
VSDVPRDL(配列番号:20)
GVSDVPRDL(配列番号:21)
DK+VEGFR2/IGF−IRバインダー(配列番号:22)
DK+EGFR/IGF−IRバインダー(配列番号:23)
GSGCテールを備えるDK−EGFR/IGF−IRバインダー(配列番号:24)
EIEKPCQテールを備えるDK−EGFR/IGF−IRバインダー(配列番号:25)
XnSDVPRDL, n=0、1または2アミノ酸であり、n=1の場合、XはMetまたはGlyであり、n=2の場合、XはMet−Glyである(配列番号:26)
XnDVPRDL, n=0、1または2アミノ酸であり、n=1の場合、XはMetまたはGlyであり、n=2の場合、XはMet−Glyである(配列番号:27)
XnVPRDL, n=0、1または2アミノ酸であり、n=1の場合、XはMetまたはGlyであり、n=2の場合、XはMet−Glyである(配列番号:28)
XnPRDL, n=0、1または2アミノ酸であり、n=1の場合、XはMetまたはGlyであり、n=2の場合、XはMet−Glyである(配列番号:29)
XnRDL, n=0、1または2アミノ酸であり、n=1の場合、XはMetまたはGlyであり、n=2の場合、XはMet−Glyである(配列番号:30)
XnDL, n=0、1または2アミノ酸であり、n=1の場合、XはMetまたはGlyであり、n=2の場合、XはMet−Glyである(配列番号:31)
EIEKPSQ(配列番号:32)
EIEKP(配列番号:33)
EIEKPS(配列番号:34)
EIEKPC(配列番号:35)
EGSGS(配列番号:36)
WTフィブロネクチン配列
EIEKテールを備える10Fn3コア
EVVAATPTSLLISW(X)xRYYRITYGETGGNSPVQEFTVP(X)yTATISGLKPGVDYTITVYAVT(X)zPISINYRTEIEK(配列番号:38)
Eコア(配列番号:39)
EVVAATPTSLLISWWAPVDRYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYKPHADGPHTYHESPISINYRT
IGF−IR BCループ(配列番号:40)
SARLKVA
IGF−IR DEループ(配列番号:41)
KNVY
IGF−IR FGループ(配列番号:42)
RFRDYQ
VEGFR2 BCループ(配列番号:43)
RHPHFPT
VEGFR2 DEループ(配列番号:44)
LQPP
VEGFR2 FGループ(配列番号:45)
DGRNGRLLSI
EIDK(配列番号:46)
EIDKPCQ(配列番号:47)
Cysテールを備えるI−Fn−V(2DK−)(配列番号:48)
serテールを備えるI−Fn−V(2DK−)(配列番号:49)
serまたはcysテールを備えるI−GS5−V(2DK−)(配列番号:50)
serまたはcysテールを備えるI−GS10−V(2DK−)(配列番号:51)
serテールを備えるV−Fn−I(2DK−)(配列番号:52)
cysテールを備えるV−Fn−I(2DK−)(配列番号:53)
serまたはcysテールを備えるV−GS5−I(2DK−)(配列番号:54)
serまたはcysテールを備えるV−GS10−I(2DK−)(配列番号:55)
VI(DK+)(配列番号:56)
VI(DK−)(配列番号:57)
I core (SEQ ID NO: 2)
EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITGGETGSGNSPVQEFTVPKNVYTATIGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT
V core (SEQ ID NO: 3)
EVVAATPTSLLISWRHFPFPRYYRIGHTYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATIGLLKPGVDYTITVYAVTDGRNGLRLLSIPISINYRT
Short tail (SEQ ID NO: 4)
EIEK
Modified Cys tail (SEQ ID NO: 5)
EGSGC
Cys tail (SEQ ID NO: 6)
EIEKPCQ
Fn-based linker (SEQ ID NO: 7)
PSTSTST
GS 5 linker (SEQ ID NO: 8)
GSGSGSGSGS
GS 10 linker (SEQ ID NO: 9)
GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS
(GGGGS) 3 (SEQ ID NO: 10)
GGGGS GGGGS GGGGS
(GGGGS) 5 (SEQ ID NO: 11)
GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS
G 4 SG 4 SG 3 SG (SEQ ID NO: 12)
GGGGSGGGGSGGGSGG
GPG (SEQ ID NO: 13)
GPGPGPG (SEQ ID NO: 14)
GPGPGPGPGPG (SEQ ID NO: 15)
PA3 linker (SEQ ID NO: 16)
PAPAPA
PA6 linker (SEQ ID NO: 17)
PAPAPAPAPAPAPA
PA9 linker (SEQ ID NO: 18)
PAPAPAPAPAPAPAPAPAPA
MGVSDVPPRDL (SEQ ID NO: 19)
VSDVPPRDL (SEQ ID NO: 20)
GVSDVPPRDL (SEQ ID NO: 21)
DK + VEGFR2 / IGF-IR binder (SEQ ID NO: 22)
DK + EGFR / IGF-IR binder (SEQ ID NO: 23)
DK-EGFR / IGF-IR binder with GSGC tail (SEQ ID NO: 24)
DK-EGFR / IGF-IR binder with EIEKPCQ tail (SEQ ID NO: 25)
X n SDVPRDL, a n = 0, 1 or 2 amino acids in the case of n = 1, X is Met or Gly, for n = 2, X is Met-Gly (SEQ ID NO: 26)
X n DVPRDL, n = 0, 1 or 2 amino acids, when n = 1, X is Met or Gly, when n = 2, X is Met-Gly (SEQ ID NO: 27)
X n VPRDL, n = 0, 1 or 2 amino acids, when n = 1, X is Met or Gly, and when n = 2, X is Met-Gly (SEQ ID NO: 28)
X n PRDL, n = 0, 1 or 2 amino acids, when n = 1, X is Met or Gly, and when n = 2, X is Met-Gly (SEQ ID NO: 29)
X n RDL, n = 0, 1 or 2 amino acids, when n = 1, X is Met or Gly, and when n = 2, X is Met-Gly (SEQ ID NO: 30)
X n DL, a n = 0, 1 or 2 amino acids in the case of n = 1, X is Met or Gly, for n = 2, X is Met-Gly (SEQ ID NO: 31)
EIEKPSQ (SEQ ID NO: 32)
EIEKP (SEQ ID NO: 33)
EIEKPS (SEQ ID NO: 34)
EIEKPC (SEQ ID NO: 35)
EGSGS (SEQ ID NO: 36)
WT fibronectin sequence
10 Fn3 core EVVAATPTSLLISW (X) with EIEK tail x RYYRITYYGETGGNSPVQEFTVP (X) y TATIGLSKPGVDYTITVYAVT (X) z PISINYRTEIEK (SEQ ID NO: 38)
E core (SEQ ID NO: 39)
EVVAATPTSLLISWWWAPVDRYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRDVYTATIGLSKPGVDYTITVYAVVTDYKPHADGPTYHESPISINYRT
IGF-IR BC loop (SEQ ID NO: 40)
SARLKVA
IGF-IR DE loop (SEQ ID NO: 41)
KNVY
IGF-IR FG loop (SEQ ID NO: 42)
RFRDYQ
VEGFR2 BC loop (SEQ ID NO: 43)
RHPHFPT
VEGFR2 DE loop (SEQ ID NO: 44)
LQPP
VEGFR2 FG loop (SEQ ID NO: 45)
DGRNGRLLSI
EIDK (SEQ ID NO: 46)
EIDKPCQ (SEQ ID NO: 47)
I-Fn-V (2DK-) with Cys tail (SEQ ID NO: 48)
I-Fn-V (2DK-) with ser tail (SEQ ID NO: 49)
I-GS5-V (2DK-) with a ser or cys tail (SEQ ID NO: 50)
I-GS10-V (2DK-) with ser or cys tail (SEQ ID NO: 51)
V-Fn-I (2DK-) with ser tail (SEQ ID NO: 52)
V-Fn-I (2DK-) with cys tail (SEQ ID NO: 53)
V-GS5-I (2DK-) with ser or cys tail (SEQ ID NO: 54)
V-GS10-I (2DK-) with ser or cys tail (SEQ ID NO: 55)
VI (DK +) (SEQ ID NO: 56)
VI (DK-) (SEQ ID NO: 57)
本発明を、以下の実施例を参照することによって説明するが、これは、単に例示的なものであって、本発明を制限しようとするものではない。本発明は、特定の実施形態を参照して詳細に説明されているが、その趣旨および範囲を逸脱することなく、それに種々の変更および改変を行ってもよいということは当業者には明らかであろう。 The invention will now be described by reference to the following examples, which are illustrative only and are not intended to limit the invention. Although the invention has been described in detail with reference to specific embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications can be made thereto without departing from the spirit and scope thereof. I will.
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質
VEGFR2/IGF−IRバインダー(「V/Iバインダー」)およびEGFR/IGF−IRバインダー(「E/Iバインダー」)を含む、様々なフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を生成した。以下の表は、本明細書に記載される構築体およびそれらの対応する配列番号を表す。
Fibronectin based scaffold proteins Generate a variety of fibronectin based scaffold proteins, including VEGFR2 / IGF-IR binder ("V / I binder") and EGFR / IGF-IR binder ("E / I binder") did. The following table represents the constructs described herein and their corresponding SEQ ID NOs.
表1.様々なV/IバインダーおよびE/Iバインダーの概説。
配列番号:22は、国際公開2009/142773に最初に記載されたV/I(DK+)二価構築体のアミノ酸配列である。V/I(DK+)は、IGF−IRおよびVEGFR2に結合するフィブロネクチンドメインを含む。IGF−IR結合フィブロネクチンコアは配列番号:2に示される配列を有し、VEGFR2結合フィブロネクチンコアは配列番号:3に示される配列を有する。2つのドメインは、ヒトフィブロネクチンにおいて第一および第二Fn3ドメインを連結するアミノ酸配列に由来するポリペプチドリンカー(配列番号:7)により連結される。V/I(DK+)のI結合サブユニットは、配列番号:46のアミノ酸配列を有するC末端伸長(C1)を含有する、すなわち、DK部位を含有する。V/I(DK+)のV結合サブユニットは、配列番号:47のアミノ酸配列を有するC末端伸長(C2)を含有する、すなわち、DK部位を含有する。 SEQ ID NO: 22 is the amino acid sequence of the V / I (DK +) bivalent construct first described in WO2009 / 142773. V / I (DK +) contains a fibronectin domain that binds to IGF-IR and VEGFR2. The IGF-IR binding fibronectin core has the sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the VEGFR2 binding fibronectin core has the sequence shown in SEQ ID NO: 3. The two domains are linked by a polypeptide linker (SEQ ID NO: 7) derived from the amino acid sequence linking the first and second Fn3 domains in human fibronectin. The I-binding subunit of V / I (DK +) contains a C-terminal extension (C1) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, ie, contains a DK site. The V-binding subunit of V / I (DK +) contains a C-terminal extension (C2) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, ie, contains a DK site.
配列番号:23は、E/I(DK+)二価構築体のアミノ酸配列である。E/I(DK+)は、IGF−IRおよびEGFRに結合するフィブロネクチンドメインを含む。IGF−IR結合フィブロネクチンコアは配列番号:2に示される配列を有し、EGFR2結合フィブロネクチンコアは配列番号:39に示される配列を有する。2つのドメインは、配列番号:9を有するグリシン−セリンポリペプチドリンカーにより連結される。E/I(DK+)のI結合サブユニットは、配列番号:46のアミノ酸配列を有するC末端伸長(C1)を含有する、すなわち、DK部位を含有する。E/I(DK+)のE結合サブユニットは、配列番号:47のアミノ酸配列を有するC末端伸長(C2)を含有する、すなわち、DK部位を含有する。 SEQ ID NO: 23 is the amino acid sequence of the E / I (DK +) bivalent construct. E / I (DK +) contains a fibronectin domain that binds to IGF-IR and EGFR. The IGF-IR binding fibronectin core has the sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the EGFR2 binding fibronectin core has the sequence shown in SEQ ID NO: 39. The two domains are linked by a glycine-serine polypeptide linker having SEQ ID NO: 9. The I-binding subunit of E / I (DK +) contains a C-terminal extension (C1) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, ie, contains a DK site. The E-binding subunit of E / I (DK +) contains a C-terminal extension (C2) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, ie, contains a DK site.
配列番号:24は、E/I(DK−、C末端無し)二価構築体のアミノ酸配列である。E/I(DK−、C末端無し)は、グリシン−セリンリンカー(配列番号:9)により連結された、IGF−IRコア(配列番号:2)およびEGFRコア(配列番号:39)を含む。IGF−IR結合サブユニットは、配列番号:4のアミノ酸配列を有するC末端伸長(C1)を含有する、すなわち、DK部位よりもEK部位を含有する。EGFR結合サブユニットは、配列番号:5のアミノ酸配列を有するC末端伸長(C2)を含有する、すなわち、DK部位を欠く。 SEQ ID NO: 24 is the amino acid sequence of the E / I (DK-, no C-terminal) bivalent construct. E / I (DK-, no C-terminus) contains an IGF-IR core (SEQ ID NO: 2) and an EGFR core (SEQ ID NO: 39) linked by a glycine-serine linker (SEQ ID NO: 9). The IGF-IR binding subunit contains a C-terminal extension (C1) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, ie, contains an EK site rather than a DK site. The EGFR binding subunit contains a C-terminal extension (C2) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, ie, lacks a DK site.
配列番号:25は、E/I(2DK−)二価構築体のアミノ酸配列である。E/I(2DK−)は、グリシン−セリンリンカー(配列番号:9)により連結された、IGF−IRコア(配列番号:2)およびEGFRコア(配列番号:39)を含む。IGF−IR結合サブユニットは、配列番号:4のアミノ酸配列を有するC末端伸長(C1)を含有する、すなわち、DK部位よりもEK部位を含有する。EGFR結合サブユニットは、配列番号:6のアミノ酸配列を有するC末端伸長(C2)を含有する、すなわち、DK部位よりもEK部位を含有する。 SEQ ID NO: 25 is the amino acid sequence of the E / I (2DK−) bivalent construct. E / I (2DK-) comprises an IGF-IR core (SEQ ID NO: 2) and an EGFR core (SEQ ID NO: 39) linked by a glycine-serine linker (SEQ ID NO: 9). The IGF-IR binding subunit contains a C-terminal extension (C1) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, ie, contains an EK site rather than a DK site. The EGFR binding subunit contains a C-terminal extension (C2) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, ie, contains an EK site rather than a DK site.
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の発現および精製
E/I分子の発現
E/I二価構築体を可溶型で大腸菌細胞中で発現させた。封入体は細胞破壊と遠心分離により回収される。E/Iタンパク質は濾過され、カラムクロマトグラフィーを用いて捕捉される。精製されたタンパク質は、次いで、単一のシステイン残基で、マレイミド化学反応を介して、PEGに共有結合される。PEG化生成物は次いで、カラムクロマトグラフィーを用いて仕上げられ(polish)、タンジェンシャルフロー濾過(tangential flow filtration)を用いて製剤化される。
Expression of fibronectin based scaffold protein and expression of purified E / I molecule The E / I bivalent construct was expressed in soluble form in E. coli cells. Inclusion bodies are recovered by cell disruption and centrifugation. E / I protein is filtered and captured using column chromatography. The purified protein is then covalently attached to PEG via a maleimide chemistry with a single cysteine residue. The PEGylated product is then finished using column chromatography and formulated using tangential flow filtration.
V/I分子の発現
V/I二価構築体の発現のために、構築体をコードするヌクレオチド配列が誘導性発現ベクターにクローニングされ、大腸菌細胞中で細胞内封入体内に発現させた。単一の蒔かれたコロニーから生成した細胞バンクバイアルを用いて、大規模発酵のための接種材料として振盪フラスコ培養に接種した。あるいは、種子発酵(seed fermentor)は最終の発酵容量に応じて、接種原培養に用いられる。大規模発酵は、生物量を蓄積させるための増殖期およびフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を生成するための生成期を含む。一次回収のため、細胞内封入体は、マイクロフルイダイザー(microfluidizer)を用いて、回収された細胞から放出され、遠心分離により回収され、続いてバッファーおよび水で洗浄された。
Expression of the V / I molecule For expression of the V / I bivalent construct, the nucleotide sequence encoding the construct was cloned into an inducible expression vector and expressed in intracellular inclusions in E. coli cells. Cell bank vials generated from single sown colonies were used to inoculate shake flask cultures as inoculum for large scale fermentations. Alternatively, seed fermentation is used for inoculum culture depending on the final fermentation volume. Large-scale fermentation includes a growth phase to accumulate biomass and a production phase to produce a fibronectin based scaffold protein. For primary recovery, intracellular inclusion bodies were released from the recovered cells using a microfluidizer, recovered by centrifugation, and subsequently washed with buffer and water.
二価構築体のための精製工程は、塩酸グアニジンをベースとする封入体の再可溶化、続いてタンパク質のリフォールディングを用いる。リフォールディングされたタンパク質は濾過され、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムの上にロードされる。生成物は次いで、疎水性相互作用カラムを用いて精製され、生じる溶出プールをPEG試薬の添加によりPEG化し、PEG化タンパク質を生成する。 The purification step for the bivalent construct uses resolubilization of inclusion bodies based on guanidine hydrochloride followed by protein refolding. The refolded protein is filtered and loaded onto a cation exchange chromatography column. The product is then purified using a hydrophobic interaction column and the resulting elution pool is PEGylated by the addition of PEG reagent to produce a PEGylated protein.
PEG化タンパク質は次いで、第二の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを渡って精製される。溶出は標的タンパク質濃度に濃縮され、次いで、限外濾過/透析濾過(UF/DF)を用いて、製剤バッファーへ交換される。UF/DF生成物は、0.22μmのファイナルフィルターを用いて濾過される。濾過された生成物は、次いで、バイアル内に満たされ、最終製剤を生成する。 The PEGylated protein is then purified across a second cation exchange chromatography column. The elution is concentrated to the target protein concentration and then exchanged into formulation buffer using ultrafiltration / diafiltration (UF / DF). The UF / DF product is filtered using a 0.22 μm final filter. The filtered product is then filled into vials to produce the final formulation.
V/Iタンパク質の安定性へのタンパク質濃度の影響
精製されたV/I(DK+)(配列番号:22)の物理学的(凝集)および化学的(断片化)安定性へのタンパク質濃度の影響を試験した。V/I(DK+)タンパク質を、pH5.5で、10mMコハク酸、5%ソルビトール中に製剤化した。V/Iタンパク質濃度は、3mg/mLまたは5mg/mlのいずれかであった。サンプルを12ヶ月の期間4℃で保管し、該サンプルを1ヶ月目、6週目、2ヶ月目、3ヶ月目、6ヶ月目、9ヶ月目および12ヶ月目に回収して解析した。
Effect of protein concentration on V / I protein stability Effect of protein concentration on physical (aggregation) and chemical (fragmentation) stability of purified V / I (DK +) (SEQ ID NO: 22) Was tested. V / I (DK +) protein was formulated in 10 mM succinic acid, 5% sorbitol at pH 5.5. The V / I protein concentration was either 3 mg / mL or 5 mg / ml. Samples were stored for 12 months at 4 ° C., and the samples were collected and analyzed at 1st, 6th, 2nd, 3rd, 6th, 9th and 12th months.
凝集量は、経時的に(over time)、(高分子量(「HMW」)種として測定される)凝集を形成した総タンパク質のパーセンテージを評価することにより、測定する。凝集を、サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー(SE−HPLC)解析を用いて測定し、経時的に(over time)HMWのレベルを評価した。SE−HPLC解析は、スーパーデックス200 10/300 GLカラムを用いて、0.2Mリン酸カリウム、0.15M塩化ナトリウム、0.02%アジ化ナトリウム、pH 6.8の移動相で、実行した。280nmでの検出で、流速は0.5mL/分であった。経時的な(over time)(0−12ヶ月)、V/Iタンパク質の凝集へのタンパク質濃度の影響は、図1に表される。V/I(DK+)は、3mg/mLの濃度で0.3%/月の速度で凝集する。より高いタンパク質濃度(5mg/mL)は、より速い凝集速度を導く。 The amount of aggregation is measured by evaluating the percentage of total protein that has formed aggregates (measured as high molecular weight ("HMW") species) over time. Aggregation was measured using size exclusion-high performance liquid chromatography (SE-HPLC) analysis to assess the level of HMW over time. SE-HPLC analysis was performed using a Superdex 200 10/300 GL column with a mobile phase of 0.2 M potassium phosphate, 0.15 M sodium chloride, 0.02% sodium azide, pH 6.8. . With detection at 280 nm, the flow rate was 0.5 mL / min. The effect of protein concentration on V / I protein aggregation over time (0-12 months) is represented in FIG. V / I (DK +) aggregates at a rate of 0.3% / month at a concentration of 3 mg / mL. A higher protein concentration (5 mg / mL) leads to a faster aggregation rate.
断片化は、経時的に(over time)、断片化した、または「クリップ化」した総タンパク質のパーセンテージを評価することにより測定する。クリップ化したタンパク質のレベルは、逆相−高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)を利用することにより、決定した。RP−HPLCは、Varian PLRP−Sカラム(4.6*250mm、細孔径300Å、粒径5μm)を用いて実行された。様々な種の分離は、水/アセトニトリル/トリフルオロ酢酸からなるグラジエントを介して達成される。流速は1.0mL/分であった。二重検出は、(タンパク質関連種のため)280nmで、および蒸発光散乱(ELS、PEG関連種のため)で、実行された。図2は、V/I(DK+)の断片化が、凝集よりも、タンパク質濃度への依存が少ないことが発見されたことを示す。V/I(DK+)についての断片化速度は、4℃で、〜0.1%/月であった。
Fragmentation is measured by evaluating the percentage of total protein fragmented or “clipped” over time. The level of clipped protein was determined by utilizing reverse phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC). RP-HPLC was performed using a Varian PLRP-S column (4.6 * 250 mm, pore size 300 mm,
これらの凝集および断片化データに基づき、凝集を最低限にし、1年間の十分な安定性を確保するためには、3mg/mLのタンパク質濃度を有するV/I(DK+)の製剤が、5mg/mLの濃度よりも、好ましいであろう。 Based on these aggregation and fragmentation data, a formulation of V / I (DK +) with a protein concentration of 3 mg / mL is 5 mg / mL to minimize aggregation and ensure sufficient stability for one year. A concentration of mL would be preferred.
V/Iタンパク質の安定性へのpHの影響
精製されたV/I(DK+)(配列番号:22)の物理学的および化学的安定性へのpHの影響を試験した。V/I(DK+)タンパク質を、20mM酢酸ナトリウム(pH4および5のため)または20mMリン酸ナトリウム(pH6および7のため)であるバッファー組成物と共に、50mM塩化ナトリウム中に製剤化し、25℃で保存した。
Effect of pH on V / I protein stability The effect of pH on the physical and chemical stability of purified V / I (DK +) (SEQ ID NO: 22) was tested. V / I (DK +) protein is formulated in 50 mM sodium chloride with a buffer composition that is 20 mM sodium acetate (for
4週間の期間、一週間に一度、サンプルを回収し、実施例3に記載されるようにSE−HPLCを用いて、凝集の評価を実行した。経時的な(over time)(0−4週間)、V/I(DK+)タンパク質の凝集へのpHの影響は、図3に表される。最も低い凝集率が、試験された最低pH(pH4.0)を有するサンプルにおいて観察された。最も高い凝集率が、試験された最高pH(pH7.0)を有するサンプルにおいて観察された。 Samples were collected once a week for a period of 4 weeks and aggregation assessments were performed using SE-HPLC as described in Example 3. The effect of pH on V / I (DK +) protein aggregation over time (0-4 weeks) is represented in FIG. The lowest aggregation rate was observed in the sample with the lowest pH tested (pH 4.0). The highest aggregation rate was observed in the sample with the highest pH tested (pH 7.0).
4週間の期間、一週間に一度、サンプルを回収し、実施例3に記載されるようにSE−HPLCを用いて、断片化の評価を実行した。V/I(DK+)タンパク質の断片化へのpHの影響は、図4に表される。低pH(pH4.0)でV/I(DK+)タンパク質の経時的な(over time)凝集を阻害することがわかった(図3)一方、低pHはV/I(DK+)タンパク質のタンパク質断片化における増加を引き起こすことがわかった(図4)。 Samples were collected once a week for a period of 4 weeks and fragmentation assessments were performed using SE-HPLC as described in Example 3. The effect of pH on V / I (DK +) protein fragmentation is represented in FIG. Low pH (pH 4.0) was found to inhibit over time aggregation of V / I (DK +) protein (FIG. 3), while low pH was a protein fragment of V / I (DK +) protein. It was found to cause an increase in crystallization (Figure 4).
断片化されたV/I(DK+)タンパク質におけるクリップ部位を同定するために、液体クロマトグラフ−質量分析(LC−MS)が実行された。V/I(DK+)タンパク質を、5mg/mlのタンパク質濃度で、pH5.5、10mM酢酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム中に製剤化した。LC−MSは、実施例3に記載されるRP−HPLC法に従って、続いて、Thermo LTQイオントラップ質量分析計(MS)に結合して実行された。HPLC溶出は、0.2mL/分フローで1:5にスプリットされ、MSに向けられた。280nmでのオンライン検出が継続された。図5は、この実験からのLC−MSデータを表し、断片化が起こる主要な部位であるD95およびD200と、数個のアスパラギン酸(D)残基が断片化に関与することを実証する。V/I(DK+)タンパク質の至る所に数個のD残基が存在する(例えばD5、D9、D110)が、D95およびD200だけが直後にリジン残基が続くことに注目すべきである。「VI des Met」は、熱ストレスの結果としてPEGコンジュゲーションのマレイミド結合で起こる切断事象を示す。 Liquid chromatograph-mass spectrometry (LC-MS) was performed to identify clip sites in the fragmented V / I (DK +) protein. V / I (DK +) protein was formulated in pH 5.5, 10 mM sodium acetate, 150 mM sodium chloride at a protein concentration of 5 mg / ml. LC-MS was performed according to the RP-HPLC method described in Example 3 and subsequently coupled to a Thermo LTQ ion trap mass spectrometer (MS). The HPLC elution was split 1: 5 at 0.2 mL / min flow and directed to MS. Online detection at 280 nm was continued. FIG. 5 presents LC-MS data from this experiment, demonstrating that D95 and D200, the major sites where fragmentation occurs, and several aspartic acid (D) residues are involved in fragmentation. It should be noted that there are several D residues throughout the V / I (DK +) protein (eg D5, D9, D110), but only D95 and D200 are immediately followed by lysine residues. “VI des Met” indicates a cleavage event that occurs at the maleimide bond of the PEG conjugation as a result of thermal stress.
これらの実験に基づいて、凝集および断片化は、pH5.5で製剤を準備することにより、最良のバランスが保たれるが、しかしながら、このpHレベルだけに頼ることによっては、どちらの分解経路(凝集および断片化)も除去することができない。 Based on these experiments, aggregation and fragmentation are best balanced by preparing the formulation at pH 5.5, however, depending on only this pH level, either degradation pathway ( Aggregation and fragmentation) cannot be removed.
E/Iタンパク質での凝集および断片化の評価
V/I(DK+)(配列番号:22)で観察される凝集および断片化の不安定さの問題が、他の構造的に関連した二価構築体に共通している問題であったことを確認するために、E/I(DK+)(配列番号:23)の凝集および断片化特性もまた、数種のpHレベルで評価された。
Assessing aggregation and fragmentation with E / I proteins The problem of aggregation and fragmentation instability observed with V / I (DK +) (SEQ ID NO: 22) is another structurally related bivalent construction. In order to confirm that it was a problem common to the body, the aggregation and fragmentation properties of E / I (DK +) (SEQ ID NO: 23) were also evaluated at several pH levels.
E/I(DK+)を、pH4.0、4.5または5.5で、10mMコハク酸、5%ソルビトール中に製剤化した。E/I(DK+)は、30kD MWCO膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過(TFF)により、所望の製剤に製剤化された。少なくとも6透析容量(dia−volume)のバッファーを交換して、最終製剤を達成した。生じるタンパク質の濃度はA280により確認され、さらなる製剤バッファーで5mg/mLに調節された。製剤化されたE/I(DK+)はラミナーフローフード(laminar flow hood)にて無菌濾過され、安定性監視のため無菌ガラスバイアル中に充填された。バイアルは蓋をされクリンプ(crimp)され、続いて4、25および37℃で温度制御されたインキュベーター内に配置された。 E / I (DK +) was formulated in 10 mM succinic acid, 5% sorbitol at pH 4.0, 4.5 or 5.5. E / I (DK +) was formulated into the desired formulation by tangential flow filtration (TFF) using a 30 kD MWCO membrane. At least 6 dia-volume buffers were changed to achieve the final formulation. The resulting protein concentration was confirmed by A280 and adjusted to 5 mg / mL with additional formulation buffer. The formulated E / I (DK +) was sterile filtered through a laminar flow hood and filled into sterile glass vials for stability monitoring. The vial was capped and crimped and then placed in an incubator temperature controlled at 4, 25 and 37 ° C.
E/I(DK+)の凝集率は、SE−HPLC解析を実行することにより評価された。SE−HPLCは、Shodex KW404−4F HPLCカラム(4.6*250mm、細孔径300Å、粒径5μm)およびpH5.5で10mMコハク酸/3%ソルビトール/0.4Mアルギニンからなる移動相を用いて実行された。流速は0.35mL/分であり、検出は280nmで実行された。図6は、V/I(DK+)と同様に、E/I(DK+)の凝集率は、25℃でより低いpHで保存されたサンプルについてよりも、25℃でより高いpHレベルで保存されたサンプルについて、より高かったことを示す。同一のデータ傾向が、37℃でストレスを加えられたサンプルについても観察された。
The aggregation rate of E / I (DK +) was evaluated by performing SE-HPLC analysis. SE-HPLC uses a Shodex KW404-4F HPLC column (4.6 * 250 mm, pore size 300 mm,
E/I(DK+)の凝集率へのタンパク質濃度の影響もまた評価された。V/I(DK+)と同様に、表2は、4週後、より高い濃度(7mg/ml)のE/I(DK+)が、より高いパーセンテージの凝集形成(より低いパーセンテージの単量体)に関連したことを図示している。表2は、タンパク質濃度とともにpHを低減することにより、凝集のパーセンテージがさらに減少することを実証している。
E/I(DK+)の断片化は、実施例3に記載されるようにRP−HPLC解析を実行することにより、評価された。図7は、V/I(DK+)と同様に、25℃でより高いpHで保存されたサンプルについてよりも、25℃でより低いpHレベルで保存されたサンプルについて、より高かったことを示す。同一のデータ傾向が、37℃でストレスを加えられたサンプルについても観察された。 E / I (DK +) fragmentation was assessed by performing RP-HPLC analysis as described in Example 3. FIG. 7 shows that, similar to V / I (DK +), it was higher for samples stored at a lower pH level at 25 ° C. than for samples stored at a higher pH at 25 ° C. The same data trend was also observed for the sample stressed at 37 ° C.
断片化されたE/I(DK+)タンパク質におけるクリップ部位を同定するために、実施例4に記載されるようにLC−MSが実行された。E/I(DK+)タンパク質が、5mg/mlのタンパク質濃度で、pH4.0、10mMコハク酸、5%ソルビトール中に製剤化され、タンパク質ストレスを誘導するために25℃で維持された。図8は、この実験からのLC−MSデータを表し、D95およびD218(V/I(DK+)におけるD200に相同な位置)を含む、数個のアスパラギン酸(D)残基が断片化に関与することを実証する。断片化はD199でも観察された。D199部位は、EGFR結合領域のFG結合ループに位置するので、これらのE/I分子に特有であり、V/I分子では見られない。 LC-MS was performed as described in Example 4 to identify clip sites in the fragmented E / I (DK +) protein. E / I (DK +) protein was formulated in pH 4.0, 10 mM succinic acid, 5% sorbitol at a protein concentration of 5 mg / ml and maintained at 25 ° C. to induce protein stress. FIG. 8 presents LC-MS data from this experiment, with several aspartic acid (D) residues involved in fragmentation, including D95 and D218 (positions homologous to D200 in V / I (DK +)) Demonstrate that Fragmentation was also observed at D199. Since the D199 site is located in the FG binding loop of the EGFR binding region, it is unique to these E / I molecules and is not found in V / I molecules.
DKマイナスE/I変種での凝集および断片化の評価
様々なE/Iバインダー(配列番号:23−25)が製剤化され、それらの物理学的(凝集)および化学的(断片化)安定性が、同一の条件下で互いに比較された(表1参照)。E/I(DK+)で観察されたD95およびD218クリップ部位の特徴付けに基づき(実施例5)、またこれらのDKクリップ部位が構造的に必須でないC末端テールに位置するという事実に基づき、C末端テールDK部位が除去または置換されている、二つの異なるE/I構築体が生成された。
Evaluation of aggregation and fragmentation with DK-minus E / I variants Various E / I binders (SEQ ID NO: 23-25) were formulated and their physical (aggregation) and chemical (fragmentation) stability Were compared to each other under identical conditions (see Table 1). Based on the characterization of the D95 and D218 clip sites observed with E / I (DK +) (Example 5) and based on the fact that these DK clip sites are located in a structurally non-essential C-terminal tail, C Two different E / I constructs were generated in which the terminal tail DK site was removed or replaced.
E/I(DK+)分子(配列番号:23)は、2つの結合ドメインのそれぞれの後に、DK部位(D95およびD218)を含むC末端テールを含有する、コントロールE/Iバインダーである。この分子の物理学的および化学的安定性は、実施例5で特徴づけられた。E/I(DK−、C末端無し)分子(配列番号:24)は、DK部位を全く含有しない。この分子では、位置95のアスパラギン酸塩がグルタミン酸に変異しており、かつEIDKPCQテール(配列番号:47)がEGSGCテール(配列番号:5)と交換されている。E/I(2DK−)分子(配列番号:25)もまた、DK部位を全く含有しない。この分子では、位置95および218のアスパラギン酸塩がグルタミン酸と交換されている。V/I(DK+)はコントロールとして、この実験に含まれた。 The E / I (DK +) molecule (SEQ ID NO: 23) is a control E / I binder containing a C-terminal tail containing a DK site (D95 and D218) after each of the two binding domains. The physical and chemical stability of this molecule was characterized in Example 5. The E / I (DK-, no C-terminus) molecule (SEQ ID NO: 24) does not contain any DK sites. In this molecule, the aspartate at position 95 is mutated to glutamic acid and the EIDKPCQ tail (SEQ ID NO: 47) is exchanged for the EGSGC tail (SEQ ID NO: 5). The E / I (2DK-) molecule (SEQ ID NO: 25) also does not contain any DK sites. In this molecule, aspartate at positions 95 and 218 has been exchanged for glutamic acid. V / I (DK +) was included in this experiment as a control.
E/Iタンパク質(配列番号:23−25)が、pH4.0で、10mMコハク酸、5%ソルビトール中に製剤化された。さらに、E/I(DK+)(配列番号:23)およびV/I(DK+)(配列番号:22)が、pH5.5で、10mMコハク酸、5%ソルビトール中に製剤化された。予備的な界面活性剤スクリーニングに基づいて、界面活性剤は必要なものとは認められなかった。E/I(DK+)は、30kD MWCO膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過(TFF)により、所望の製剤に製剤化された。少なくとも6透析容量(dia−volume)のバッファーを交換して、最終製剤を達成した。生じるタンパク質の濃度はA280により確認され、さらなる製剤バッファーで5mg/mLに調節された。製剤化された各二価構築体はラミナーフローフード(laminar flow hood)にて無菌濾過され、安定性監視のため無菌ガラスバイアル中に充填された。バイアルは蓋をされクリンプ(crimp)され、続いて4、25および37℃で温度制御されたインキュベーター内に配置された。 E / I protein (SEQ ID NO: 23-25) was formulated in 10 mM succinic acid, 5% sorbitol at pH 4.0. In addition, E / I (DK +) (SEQ ID NO: 23) and V / I (DK +) (SEQ ID NO: 22) were formulated in 10 mM succinic acid, 5% sorbitol at pH 5.5. Based on preliminary surfactant screening, surfactant was not found to be necessary. E / I (DK +) was formulated into the desired formulation by tangential flow filtration (TFF) using a 30 kD MWCO membrane. At least 6 dia-volume buffers were changed to achieve the final formulation. The resulting protein concentration was confirmed by A280 and adjusted to 5 mg / mL with additional formulation buffer. Each formulated bivalent construct was sterile filtered through a laminar flow hood and filled into sterile glass vials for stability monitoring. The vial was capped and crimped and then placed in an incubator temperature controlled at 4, 25 and 37 ° C.
異なるE/I分子の凝集率は、実施例5により記載されるように、SE−HPLCを実行することにより評価され、この実験からの結果は図9に図示される。予想通り、凝集率は、25℃でE/I(DK+)について、pH4.0よりもpH5.5で著しく高い。図9に見られる傾き(slope)に基づき、E/I(DK+)についての凝集率は、25℃で、pH4.0よりもpH5.5でおよそ7倍高い。DK部位を欠く2つのE/I分子について、凝集率はpH4.0で影響を受けなかった。E/I(DK+)およびV/I(DK+)は、pH5.5で同様の凝集率を表した。 Aggregation rates of different E / I molecules were evaluated by performing SE-HPLC as described by Example 5, and the results from this experiment are illustrated in FIG. As expected, the rate of aggregation is significantly higher at pH 5.5 than at pH 4.0 for E / I (DK +) at 25 ° C. Based on the slope seen in FIG. 9, the aggregation rate for E / I (DK +) is approximately 7 times higher at 25.degree. C. than at pH 4.0. For the two E / I molecules lacking the DK site, the aggregation rate was not affected at pH 4.0. E / I (DK +) and V / I (DK +) exhibited similar aggregation rates at pH 5.5.
異なるE/I分子の断片化率は、実施例3に記載されるようにRP−HPLC解析を実行することにより評価され、この実験からの結果は図10に図示される。クリッピング(clipping)に関して、図10は、25℃でE/I(DK+)について、pH4.0よりもpH5.5で、より低いクリップ率(clip rate)を示す。図10で示される分子の間で、最も高いクリップ率は、pH4.0でE/I(DK+)において見られ、それは製剤のpHをpH5.5へ増大させた場合、著しく最小化された。しかしながら、上述の通り、この分子はpH5.5で凝集率が最も高かった。DK部位を欠く他の2つのE/I分子について、pH4.0でのクリップ率は、同じpHでのE/I(DK+)と比較して、およそ3倍減少した。V/I(DK+)は、同じpH(pK5.5)でE/I(DK+)と比較してより高い程度の断片化を示し、V/I(DK+)およびE/I(DK+)分子は類似するが、V/I(DK+)分子は断片化の影響をより受けやすいことを示す。 Fragmentation rates of different E / I molecules were evaluated by performing RP-HPLC analysis as described in Example 3, and the results from this experiment are illustrated in FIG. With respect to clipping, FIG. 10 shows a lower clip rate at pH 5.5 than pH 4.0 for E / I (DK +) at 25 ° C. Among the molecules shown in FIG. 10, the highest clip rate was seen in E / I (DK +) at pH 4.0, which was significantly minimized when the pH of the formulation was increased to pH 5.5. However, as described above, this molecule had the highest aggregation rate at pH 5.5. For the other two E / I molecules lacking the DK site, the clipping rate at pH 4.0 was reduced approximately 3-fold compared to E / I (DK +) at the same pH. V / I (DK +) shows a higher degree of fragmentation compared to E / I (DK +) at the same pH (pK5.5), with V / I (DK +) and E / I (DK +) molecules Although similar, it shows that V / I (DK +) molecules are more susceptible to fragmentation.
E/I(DK+)に対するクリップ化部位と比較して、E/I(DK−、C末端無し)に対するクリップ化部位の特徴付けは、実施例4に記載されるようにLC−MSを用いて実行された。2つの異なるE/Iバインダーが、5mg/mlのタンパク質濃度で、pH4.0、10mMコハク酸、5%ソルビトール中にそれぞれ製剤化され、タンパク質ストレスを誘導するために25℃で維持された。図11は、この実験からのLC−MSデータを表し、断片化プロファイルが2つの異なるE/Iバインダー間で異なることを実証する。E/I(DK+)における断片化に関与する主要なアスパラギン酸(D)残基は、D95、D218およびD199であった。一方、E/I(DK−、C末端無し)における断片化に関与する主要なアスパラギン酸残基は、D199、D82およびD193であった。しかしながら、以下の表3に図示されるように、4週間後のE/I(DK−、C末端無し)における総クリップのパーセンテージは、この同じ期間後のE/I(DK+)と比較して、ほぼ半減していた(7.5%と比べて3.8%)。これらの結果は、E/I(DK+)と比較して、E/I(DK−、C末端無し)が低減された断片化と関連することを示している。 Characterization of the clipping site for E / I (DK−, no C-terminus) compared to the clipping site for E / I (DK +) using LC-MS as described in Example 4 It has been executed. Two different E / I binders were formulated in pH 4.0, 10 mM succinic acid, 5% sorbitol, respectively, at a protein concentration of 5 mg / ml and maintained at 25 ° C. to induce protein stress. FIG. 11 represents the LC-MS data from this experiment and demonstrates that the fragmentation profile is different between the two different E / I binders. The major aspartic acid (D) residues involved in fragmentation in E / I (DK +) were D95, D218 and D199. On the other hand, the main aspartic acid residues involved in fragmentation at E / I (DK-, no C-terminus) were D199, D82 and D193. However, as illustrated in Table 3 below, the percentage of total clips at E / I after 4 weeks (DK−, no C-terminus) is compared to E / I after this same period (DK +). Halved (3.8% compared to 7.5%). These results indicate that E / I (DK−, no C-terminus) is associated with reduced fragmentation compared to E / I (DK +).
E/I(2DK−)に対するクリップ化部位の特徴付けは、実施例4に記載されるようにLC−MSを用いて実行された。E/I(2DK−)が、5mg/mlのタンパク質濃度で、pH4.0、10mMコハク酸、5%ソルビトール中に製剤化され、タンパク質ストレスを誘導するために25℃で維持された。図12は、この実験からのLC−MSデータを表し、E/I(DK−、C末端無し)と同様に、E/I(2DK−)における断片化に関与する主要なアスパラギン酸残基が、D199、D82およびD193であったことを実証する。また、以下の表3に図示されるように、4週間後のE/I(2DK−)における総クリップのパーセンテージは、この同じ期間後のE/I(DK+)と比較して、半減以上であった。(7.5%と比べて3.5%)これらの結果は、E/I(DK+)と比較して、E/I(2DK−)が低減された断片化と関連することを示している。 Characterization of the clipping site for E / I (2DK-) was performed using LC-MS as described in Example 4. E / I (2DK−) was formulated in pH 4.0, 10 mM succinic acid, 5% sorbitol at a protein concentration of 5 mg / ml and maintained at 25 ° C. to induce protein stress. FIG. 12 presents the LC-MS data from this experiment, with the major aspartic acid residues involved in fragmentation in E / I (2DK−) as well as E / I (DK−, no C-terminal). , D199, D82 and D193. Also, as illustrated in Table 3 below, the percentage of total clips in E / I (2DK−) after 4 weeks is more than half compared to E / I (DK +) after this same period. there were. These results indicate that E / I (2DK-) is associated with reduced fragmentation compared to E / I (DK +). .
表3.25℃での保存の4週間後の様々なE/Iバインダーについての断片化の量および位置。
上記のように、D199部位はEGFR結合領域のFG結合ループ内に位置する。そのため、D199はおそらく結合機能のために必要であり、E/I(2DK−)分子またはE/I(DK−、C末端無し)分子から除去することは難しいだろう。 As described above, the D199 site is located within the FG binding loop of the EGFR binding region. Therefore, D199 is probably necessary for the binding function and will be difficult to remove from E / I (2DK-) or E / I (DK-, no C-terminal) molecules.
V/I(DK+)およびE/I(DK+)で観察されたアスパラギン酸部位でのクリッピングの正確な機序は、明らかではない。NMR法により測定される、グルカゴンでの3つのアスパラギン酸の見かけのpKa値に基づき、Joshiら(Journal of Pharmaceutical Sciences, 94 (9), 2005)は、アスパラギン酸部位での切断反応に対するいくつかの機序を提案した。理論に束縛されるものではないが、提案された機序のいくつかは、五員環を形成するためのアスパラギン酸側鎖の環化、続いて、ペプチド結合切断を次いで引き起こす、ペプチドカルボニルへの求核攻撃を含む可能性がある。アスパラギン酸をグルタミン酸で置換することにより、立体障害に起因して容易に環形成が起こらず、それゆえその位置でのペプチド結合切断を阻害する可能性がある。 The exact mechanism of clipping at the aspartic acid site observed with V / I (DK +) and E / I (DK +) is not clear. Based on the apparent pKa values of three aspartic acids at glucagon as measured by NMR methods, Joshi et al. (Journal of Pharmaceutical Sciences, 94 (9), 2005) Proposed mechanism. While not being bound by theory, some of the proposed mechanisms include the cyclization of aspartate side chains to form a five-membered ring, followed by peptide bond cleavage, which then causes peptide bond cleavage. May include nucleophilic attacks. By substituting aspartic acid with glutamic acid, ring formation does not occur easily due to steric hindrance, and thus may inhibit peptide bond cleavage at that position.
DKマイナスV/I変種での凝集および断片化の評価
2つのVEGFR−IGFR(VI)フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定性が比較された。第一の構築体は、VI(DK+)(配列番号:56)であり、第二の構築体VI(DK−)(配列番号:57)は、配列番号:56の位置94および199で、アスパラギン酸のグルタミン酸との置換を含有する。
Assessment of aggregation and fragmentation in DK minus V / I variants The stability of two VEGFR-IGFR (VI) fibronectin based scaffold proteins was compared. The first construct is VI (DK +) (SEQ ID NO: 56) and the second construct VI (DK−) (SEQ ID NO: 57) is an asparagine at positions 94 and 199 of SEQ ID NO: 56. Contains substitution of acid with glutamic acid.
両分子は、pH4.0、4.5および5.5で、10mMコハク酸、5%ソルビトール中に、3mg/mlのタンパク質濃度で製剤化された。これらの製剤の制限された安定性を、SE−HPLCおよびRP−HPLCによる解析のために引かれた定期的な時点で、最長2ヶ月間、4および25℃で実行した。さらに、LC−MSでの特徴付けを、両タンパク質での正確なクリップ部位を決定するために、2ヶ月25℃のサンプルで実行した。
Both molecules were formulated at a protein concentration of 3 mg / ml in 10 mM succinic acid, 5% sorbitol at pH 4.0, 4.5 and 5.5. The limited stability of these formulations was performed at 4 and 25 ° C. for up to 2 months, with periodic time points drawn for analysis by SE-HPLC and RP-HPLC. In addition, LC-MS characterization was performed on 2
VIフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質における凝集率へのpHの影響
過去のフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質での経験に基づき、低pH製剤が、これらの分子に対して最良の生物物理学的安定性(すなわち、より低い凝集)を提供することが認識されている。今回の研究では、2つのVI構築体が、図13に図示されるように、以前見られたものと同じ傾向を明示する。凝集の開始レベルは2つの分子間でわずかに異なるが、安定性期間にわたって観察された率は、所与の各pHで非常に類似しており、両分子についての凝集率は同じ順序、pH5.5>>pH4.5>pH4.0、を示す。
Effect of pH on aggregation rate in VI fibronectin based scaffold proteins Based on past experience with fibronectin based scaffold proteins, low pH formulations have the best biophysical stability for these molecules (Ie, lower aggregation) is recognized to provide. In this study, the two VI constructs demonstrate the same trend as seen previously, as illustrated in FIG. Although the onset level of aggregation is slightly different between the two molecules, the rates observed over the stability period are very similar at each given pH, and the aggregation rates for both molecules are in the same order,
VIフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質におけるクリップ率へのpHの影響
過去のフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質での経験に基づき、クリッピングの影響を受けやすい部位がタンパク質配列に存在する場合、低pH製剤が、これらのタンパク質に対して最低の化学的安定性を提供することが認識されている。VI(DK+)(配列番号:56)に対して実行された過去の安定性研究では、多数のクリップ部位が同定され、最も重度であるD94およびD199でのクリッピングを有していた。今回の研究では、2つのVI構築体が、図14に図示されるように、以前見られたものと同じ傾向を明示し、VI(DK−)に対するよりもVI(DK+)に対する方がより悪い、クリップ率へのpHの影響を有している。クリップ率は、両分子について、pH4.0>pH4.5>pH5.5という一般的な傾向に追随するが、VI(DK−)は、全3種のpH値にわたり、そのクリップ率についてほとんど相違がないことを示す。
Effect of pH on clip rate in VI fibronectin-based scaffold proteins Based on past experience with fibronectin-based scaffold proteins, if the protein sequence contains sites that are susceptible to clipping, low pH formulations It has been recognized that it provides the lowest chemical stability for these proteins. In past stability studies performed on VI (DK +) (SEQ ID NO: 56), a number of clip sites were identified and had the most severe clipping at D94 and D199. In this study, the two VI constructs demonstrated the same trend as previously seen, as illustrated in FIG. 14, and were worse for VI (DK +) than for VI (DK-) , Has an effect of pH on the clip rate. The clip rate follows the general trend of pH 4.0> pH 4.5> pH 5.5 for both molecules, but VI (DK−) is almost different in its clip rate over all three pH values. Indicates that there is no.
図13および14に示される安定性データ傾向から、製剤pHが5.5から4.0に減少した場合、VI(DK+)についての一週間あたりのクリップ率は3.3倍増加するが、他方では、VI(DK−)分子については、2つの位置での主要なクリップ部位の除去により、この率は1.6倍増加した。それゆえ、これらのアミノ酸置換で、VIフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質におけるクリップ率は、pH4製剤を用いる場合、同じ安定性期間にわたり、約50%減少した。一方で、製剤pHが5.5から4.0に減少した場合、VI(DK+)およびVI(DK−)についての一週間あたりの凝集率は、それぞれ86倍および216倍減少する。凝集率へのpH影響は、それゆえ、VIフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質におけるクリップ率への影響よりも劇的である。
From the stability data trends shown in FIGS. 13 and 14, when the formulation pH is reduced from 5.5 to 4.0, the clip rate per week for VI (DK +) increases 3.3-fold, while Now, for the VI (DK-) molecule, removal of the main clip site at two positions increased this rate by a factor of 1.6. Therefore, with these amino acid substitutions, the clip rate in VI fibronectin based scaffold proteins was reduced by approximately 50% over the same stability period when using the
LC−MSによるクリップ部位の同定
VI(DK+)およびVI(DK−)において観察されたクリップ部位の構造的特徴付けが、LC−MSにより実行された。25℃/2ヶ月時点からのクリップ領域の重ね合わせた(overlaid)RP−HPLCクロマトグラムが図15に見られ、ピーク同定が表4に要約される。
Identification of clip sites by LC-MS The structural characterization of clip sites observed in VI (DK +) and VI (DK-) was performed by LC-MS. An overlaid RP-HPLC chromatogram of the clip region from the 25 ° C./2 month time point is seen in FIG. 15 and peak identification is summarized in Table 4.
表4.質量分析によるピーク同定の要約。赤で強調される残基は、VI(DK−)構築体ではグルタミン酸に交換された、本来のVI配列に存在するアスパラギン酸を示す。
いくつかのクリップが2つの分子間で同一のままである一方、VI(DK−)においてD94とD199での主要なクリップ部位は除去され、25℃で2ヶ月のストレスの後、総クリップのレベルを6.9%までもたらす。他方では、VI(DK+)における総クリップは、同じ安定性期間にわたり、16.0%で高いままであった。低レベルの他のクリップもまたVI(DK−)において同定されたが、VI(DK+)では見られなかった。 While some clips remain the same between the two molecules, the major clip sites at D94 and D199 in VI (DK-) were removed, and after 2 months stress at 25 ° C, the level of total clips Up to 6.9%. On the other hand, the total clip in VI (DK +) remained high at 16.0% over the same stability period. Low level of other clips were also identified in VI (DK−) but not in VI (DK +).
表5.VI(DK+)およびVI(DK−)でのクリップ率の比較。
pH4.0でのVI(DK+)のクリップ率は、pH4.5および5.5でのVI(DK+)のクリップ率よりも、それぞれ、1.6倍および3.3倍速かった。pH4.0でのVI(DK−)のクリップ率は、pH4.5および5.5でのVI(DK−)のクリップ率よりも、それぞれ、1.5倍および1.6倍速かった。 The clip rate of VI (DK +) at pH 4.0 was 1.6 times and 3.3 times faster than the clip rate of VI (DK +) at pH 4.5 and 5.5, respectively. The clip rate of VI (DK−) at pH 4.0 was 1.5 and 1.6 times faster than the clip rate of VI (DK−) at pH 4.5 and 5.5, respectively.
表6.VI(DK+)およびVI(DK−)での凝集率の比較。
pH4.5および5.5でのVI(DK+)の凝集率は、pH4.0でのVI(DK+)の凝集率よりも、それぞれ、4.4倍および86倍速かった。pH4.5および5.5でのVI(DK−)の凝集率は、pH4.0でのVI(DK−)の凝集率よりも、それぞれ、4.0倍および216倍速かった。 The aggregation rate of VI (DK +) at pH 4.5 and 5.5 was 4.4 times and 86 times faster than the aggregation rate of VI (DK +) at pH 4.0, respectively. The aggregation rate of VI (DK−) at pH 4.5 and 5.5 was 4.0 times and 216 times faster than the aggregation rate of VI (DK−) at pH 4.0, respectively.
2種類のVIフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質で得られた安定性結果は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質における特定の化学分解を除去する目的で、問題のあるアスパラギン酸のグルタミン酸への選択的置換の有効性および利益を実証する。このアプローチを通じて除去された主要な化学分解で、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質におけるより良い生物物理学的安定性が、低pHでの製剤を介して、これから達成され得る。VIでの本研究からの結果、ならびにEI二重機能的フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質からこれまでに得られたものは、クリッピングされやすいと知られている特定のアスパラギン酸を除去することの必要性を実証し、同様に、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質における生物物理学的安定を最大限にするために、酸性pHでの製剤化が用いられることを可能にする。 The stability results obtained with the two types of VI fibronectin based scaffold proteins show that selective replacement of problematic aspartic acid with glutamic acid in order to eliminate specific chemical degradation in the fibronectin based scaffold protein. Demonstrate the effectiveness and benefits of. With the major chemical degradation removed through this approach, better biophysical stability in fibronectin based scaffold proteins can now be achieved through formulation at low pH. Results from this study at VI, as well as previously obtained from EI dual functional fibronectin based scaffold proteins, are necessary to remove certain aspartic acids known to be prone to clipping In order to demonstrate sex and similarly maximize biophysical stability in fibronectin based scaffold proteins, formulation at acidic pH can be used.
材料および方法
製剤:各分子は、30kD MWCO膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過(TFF)を介して、所望の製剤に製剤化された。少なくとも6透析容量(dia−volume)のバッファーを交換して、最終製剤を達成した。生じるタンパク質の濃度はA280により確認され、さらなる製剤バッファーで3mg/mLに調節された。
Materials and Methods Formulation: Each molecule was formulated into the desired formulation via tangential flow filtration (TFF) using a 30 kD MWCO membrane. At least 6 dia-volume buffers were changed to achieve the final formulation. The resulting protein concentration was confirmed by A280 and adjusted to 3 mg / mL with additional formulation buffer.
バイアル充填および安定性:製剤化された各タンパク質は、ラミナーフローフード(laminar flow hood)にて無菌濾過され、安定性監視のため無菌ガラスバイアル中に充填された。バイアルは蓋をされクリンプ(crimp)され、続いて4および25℃で温度制御されたインキュベーター内に配置された。 Vial Filling and Stability: Each formulated protein was sterile filtered through a laminar flow hood and filled into sterile glass vials for stability monitoring. The vial was capped and crimped and then placed in an incubator temperature controlled at 4 and 25 ° C.
解析方法:
サイズ排除HPLC(SE−HPLC):解析は、Shodex KW404−4F HPLCカラム(4.6*250mm、細孔径300Å、粒径5μm)およびpH5.5で10mMコハク酸/3%ソルビトール/0.4Mアルギニンからなる移動相を用いて実行された。流速は0.35mL/分であり、検出は280nmで実行された。
analysis method:
Size-exclusion HPLC (SE-HPLC): Analysis was performed on a Shodex KW404-4F HPLC column (4.6 * 250 mm, pore size 300 mm,
逆相HPLC(RP−HPLB):解析は、Varian PLRP−Sカラム(4.6*250mm、細孔径300Å、粒径5μm)を用いて実行された。様々な種の分離は、水/アセトニトリル/トリフルオロ酢酸からなるグラジエントを介して達成される。流速は1.0mL/分であった。二重検出は、(タンパク質関連種のため)280nmで、および蒸発光散乱(ELS、PEG関連種のため)で、実行された。
Reversed phase HPLC (RP-HPLB): The analysis was performed using a Varian PLRP-S column (4.6 * 250 mm, pore size 300 mm,
LC−MS:クリップ部位の特徴付けは、Thermo LTQイオントラップ質量分析(MS)に連結された、Jupiter C18カラム(4.6*250mm、細孔径300Å、粒径5μm)を用いて実行された。HPLC溶出は、0.2mL/分フローで1:5にスプリットされ、MSに向けられた。280nmでのオンライン検出が継続された。
LC-MS: Clip site characterization was performed using a Jupiter C18 column (4.6 * 250 mm, pore size 300 mm,
出典明示による組み込み
特許出願文書およびウェブサイトを含む、本明細書に記載される全ての文書および参考文献は、あたかもそれらが全体または一部分において本文書に書かれたのと同程度に、出典明示により本文書に個々に組み込まれる。
Incorporation by explicit reference It is individually incorporated into this document.
Claims (46)
N1およびN2は0−10アミノ酸を独立して含む任意のN末端伸長であり;
D1およびD2は、(i)配列番号:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一性を有する第10フィブロネクチンIII型ドメイン(10Fn3)、ここに、該10Fn3ドメインは500nM未満のKDでIGF−IRに結合するものである、および(ii)配列番号:3に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一性を有する10Fn3ドメイン、ここに、該10Fn3ドメインは500nM未満のKDでVEGFR2に結合するものである、からなる群から独立して選択され;
Lは0−30アミノ酸残基を含むポリペプチドリンカーであり;
C1は配列番号:4のアミノ酸配列を含み;かつ
C2は配列番号:4、5または6のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。 A polypeptide comprising an amino acid sequence having an N1-D1-C1-L-N2-D2-C2 structure,
N1 and N2 are any N-terminal extensions independently containing 0-10 amino acids;
D1 and D2, (i) SEQ ID NO: 10 fibronectin type III domain having 2 amino acid sequence shown in at least 95% identity (10 Fn3), here, the 10 Fn3 domain with a K D of less than 500nM one that binds to IGF-IR, and (ii) SEQ ID NO: 10 Fn3 domain having an amino acid sequence at least 95% identity with shown in 3, where said 10 Fn3 domain with a K D of less than 500 nM VEGFR2 Independently selected from the group consisting of:
L is a polypeptide linker comprising 0-30 amino acid residues;
A polypeptide wherein C1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; and C2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 5 or 6.
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