DE19646372C1 - Conjugates of polypeptide and encoding nucleic acid - Google Patents

Conjugates of polypeptide and encoding nucleic acid

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DE19646372C1 DE1996146372 DE19646372A DE19646372C1 DE 19646372 C1 DE19646372 C1 DE 19646372C1 DE 1996146372 DE1996146372 DE 1996146372 DE 19646372 A DE19646372 A DE 19646372A DE 19646372 C1 DE19646372 C1 DE 19646372C1
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    • C12N15/1062Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently

Abstract

Compound comprises a structural unit A (genotype) and a further structural unit B (phenotype), in which the genotype and phenotype are permanently linked to each other, where structural unit A exhibits, besides other regions, \- 1 region coding for \- 1 polymeric molecule constructed from amino acid units and the coding regions are translatable, and furthermore a first structural subunit (terminator) is located in an untranslated section of structural unit A, which permanently links structural unit B as a translation product of structural A to structural unit A.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung aus einer Struktureinheit A (Genotyp) und einer weiteren Struktureinheit B (Phänotyp) gemäß Oberbegriff des Anspruchs 1 sowie ein Ver fahren zur molekularen Genotyp/Phänotyp Kopplung durch Her stellung eines Fusionsproduktes gemäß der erfindungsgemäßen Verbindung nach Anspruch 12. The present invention relates to a compound of a structural unit A (genotype) and a further structural unit B (phenotype) in accordance with the preamble of claim 1 and a Ver drive for molecular genotype / phenotype coupling by Her position of a fusion product according to the invention compound according to claim 12th

Eine Kopplung von Genotyp und Phänotyp ist insbesondere für die evolutive Biotechnologie wünschenswert, da auf diese Weise nach der Selektion von Polypeptid-Molekülen mit besonderen oder verbesserten Eigenschaften direkt auf deren codierende Sequenz zurückgegriffen werden kann. Coupling of genotype and phenotype is particularly desirable for the evolutive biotechnology, since it can be drawn directly to the coding sequence in this way, after the selection of polypeptide molecules with specific or enhanced properties. Es sind Verfahren beschrieben worden, die eine derartige Kopplung ermöglichen. There have been described methods that enable such a coupling. Es handelt sich hierbei in erster Linie um Verfahren, welche die zu selektieren den Moleküle in vivo auf einer Oberfläche präsentieren z. This is primarily to methods which to select the present the molecules in vivo on a surface z. B. auf einer Phagen-Oberfläche (Phage Display) auf einer Bakterien oberfläche (Bacterial Surface Display) oder auch direkt auf molekularer Ebene (Molecular Display) . Example, on a phage surface (phage display) on a surface bacteria (bacterial surface display) or directly at the molecular level (Molecular display). Diese in vivo Verfahren zeichnen sich jedoch durch gravierende Nachteile aus. This, however, in vivo methods are characterized by serious disadvantages. So ist, z. Thus, for example. B. durch Transformation bedingt, die Repertoire-Größe auf etwa 10⁸ verschiedene Moleküle beschränkt. B. caused by transformation, the repertoire size limited to approximately 10⁸ different molecules. Selbst durch ein in vivo Diversifizierungsverfahren ließe sich das verfügbare Repertoire nur auf etwa 10¹² Moleküle erweitern. Even through an in vivo method diversify the available repertoire could be extended only to about 10¹² molecules. Theoretisch möglich wäre jedoch eine Diversität von < 10¹⁵ Molekülen. However theoretically possible a diversity of <10¹⁵ molecules. Darüberhinaus würden in vivo Systeme die Expression cytotoxischer Gene nicht ge statten. Furthermore, the expression in vivo systems would not cytotoxic genes ge equipped. Zudem erlauben derartige Systeme nur wahlweise den direkten Zugriff auf cytoplasmatische oder auf sekretorische Proteine. In addition, such systems only allow either direct access to cytoplasmic or secretory proteins. Diese in vivo Systeme sind zudem mit einem bio logischen Sicherheitsrisiko behaftet, das in einigen Ländern die Arbeit mit derartigen Systemen nur eingeschränkt zuläßt. This in vivo systems are also subject to a bio logical security risk, which permits only restricted in some countries, working with such systems.

Darüberhinaus ist ein in vitro Verfahren beschrieben, in dem DNA-Moleküle, welche die Sequenz eines Peptides und die eines Streptavidin-Bindungspeptides enthalten, in vitro transkribiert werden. Moreover, it is described an in vitro method, are transcribed in the DNA molecules which contain the sequence of a peptide and a streptavidin binding peptide in vitro. An die Transkripte wird chemisch ein Streptavidin geknüpft, so daß bei der in vitro Translation die codierende RNA-Matrize mit dem entstandenen Peptid verknüpft wird. a streptavidin is chemically linked to the transcripts, so that in the in vitro translation the coding RNA template is linked to the resulting peptide. Dieses Verfahren besitzt jedoch mehrere Nachteile. However, this method has several disadvantages. So sind die Wechsel wirkungen zwischen Streptavidin und dem Streptavidin-Bindungs protein unter bestimmten Assay-Bedingungen nicht stabil. Thus, the changes are interactions between streptavidin and the streptavidin-binding protein under certain assay conditions not stable. Zudem können Wechselwirkungen zwischen dem Streptavidin einer mRNA und dem Streptavidin-Bindungsprotein eines nicht von dieser mRNA codierten Fusionsproteins auftreten. In addition, interactions between the streptavidin and the streptavidin an mRNA-binding protein encoded by this mRNA of a non-fusion protein may occur. Darüber hinaus kann eine Beeinflussung der Faltungsstruktur des zu selektierenden Peptides durch das Streptavidin-Bindungsprotein auftreten. In addition, an influence on the folding structure of the peptide to be selected can occur through the streptavidin binding protein.

Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht darin, ein risikominimiertes Verfahren zur Genotyp-Phänotyp- Kopplung anzugeben, und ein Konstrukt bereitzustellen, welche die bislang erreichbare Diversität übersteigen, die Expression cytotoxischer Gene und auch gleichermaßen die Selektion sowohl von cytoplasmatischen als auch sekretorischen Proteinen er möglichen und zudem nicht auf rekombinante Zellen angewiesen sind. The underlying the invention technical problem is to provide a risk-minimized method for genotype-phenotype coupling, and to provide a construct that exceed the previously achievable diversity, the expression of cytotoxic genes and equally the selection of both cytoplasmic and secretory proteins it possible and also do not rely on recombinant cells. Es sollen zudem insbesondere die Nachteile des oben be schriebenen in vitro Verfahrens vermieden werden. It should also be avoided in vitro procedure in particular, the disadvantages of the above be signed.

Das der Erfindung zugrundeliegende Problem wird gelöst durch eine Verbindung gemäß Anspruch 1 und ein Verfahren gemäß An spruch 12 zur molekularen Genotyp/Phänotyp Kopplung. The problem underlying the invention is solved by a compound according to claim 1 and a method according to entitlement 12 for molecular genotype / phenotype coupling.

Die erfindungsgemäße Verbindung besteht aus einer Struktur einheit A (Genotyp) und einer weiteren Struktureinheit B (Phäno typ), bei der Genotyp und Phänotyp dauerhaft miteinander ver bunden sind, wobei die Struktureinheit A mindestens einen für mindestens ein aus Aminosäureeinheiten aufgebautes, polymeres Molekül codierenden Bereich aufweist und der oder die codieren de(n) Bereich(e) translatierbar ist oder sind, weiterhin in der Struktureinheit A eine erste Strukturuntereinheit (Terminator) in einem nicht translatierten Abschnitt angeordnet ist, die die Struktureinheit B als Translationsprodukt der Struktureinheit A mit der Struktureinheit A dauerhaft verbindet. The compound of the invention consists of a structural unit A (genotype) and a further structural unit B (phenotype), permanently ver each other in the genotype and phenotype are connected, wherein the structural unit A is at least one region coding for at least one built up from amino acid units, polymeric molecule range and said or encoding de (s) field (s) is translatable or are still in the structural unit a is a first structural sub-assembly (terminator) is arranged in an untranslated portion, the structural unit B as a translation product of the structural unit a containing the structural unit A connecting permanently.

Die dauerhafte Verknüpfung der Struktureinheiten A und B kann insbesondere durch Verwendung eines ribosomalen Translations systemes erfolgen. The permanent connection of the structural units A and B can be done in particular by using a ribosomal translation system.

Erfindungsgemäß bezeichnet der Begriff Terminator eine Struktur untereinheit, welche die Struktureinheit B als Translations produkt der Struktureinheit A mit der Struktureinheit A dauer haft verknüpft. According to the invention, the term refers to a structure terminator subunit which product the structural unit B as a translation of the structural unit A permanent adhesive linked to the structural unit A. Als Terminatoren können erfindungsgemäß nucleophile chemische Gruppen, insbesondere organische Amino gruppen, verwendet werden, welche einen Carbonsäureester, insbesondere zwischen einer tRNA und der Struktureinheit B, unter Ausbildung einer dauerhaften, insbesondere kovalenten Bindung zu spalten vermögen. As terminators according to the invention nucleophilic chemical groups, in particular organic amino groups can be used which are capable of a Carbonsäureester, in particular between a tRNA and the structural unit B, to form a permanent, in particular covalent bonding to split. So können zum Beispiel alipha tische, zyklische oder aromatische Verbindungen, mit einer Aminogruppe, natürliche oder nicht natürliche Aminosäuren und Derivate, oder auch Puromycin und Derivate verwendet werden. Thus, for example alipha tables, cyclic or aromatic compounds having an amino group, a natural or unnatural amino acids and derivatives, or puromycin and derivatives. Bei Verwendung eines ribosomalen Translationssystemes enthält der Terminator vorzugsweise zusätzlich eine stabile Molekül gruppe, die die 2′-3′-ortho-Ester-Struktur einer Aminoacyl-tRNA im Komplex mit Elongationsfaktor EF-Tu und GTP imitiert und daher vom Elongationsfaktor gebunden wird. When using a ribosomal translation system of the Terminator preferably additionally contains a stable molecule group that mimics the 2'-3'-ortho-ester structure of an aminoacyl-tRNA in complex with elongation factor EF-Tu and GTP, and is therefore bound by the elongation factor.

Die Kopplungsreaktion kann zufällig erfolgen, jedoch ist es erfindungsgemäß vorteilhaft, die Verknüpfung der Struktureinheit A mit der durch Translation entstandenen Struktureinheit B über eine auf der Struktureinheit A angeordnete zweite Strukturunter einheit wie z. The coupling reaction can be done randomly, but it is advantageous according to the combination of the structural unit A with the resultant by translation of structural unit B via a unit arranged on the structural unit A second sub-structure such. B. ein Terminatorcodon zu steuern. to control as a terminator codon.

Bei dem Terminatorcodon kann es sich um zufällige, auch inner halb eines codierenden Bereiches der Struktureinheit A liegende, bevorzugt jedoch um definierte, am 3′-terminalen Ende des codierenden Bereiches liegende Codons, beispielsweise Nonsense- Codons (UAG, UAA, UGA) oder beliebige Sinn-Codons, bevorzugt jedoch bezüglich des verwendeten Translationssystems seltene Sinn-Codons (z. B. AGA bei Verwendung eines E. coli Translations systems) handeln. In the terminator codon may be situated at random, also, within one coding region of the structural unit A, but preferably defined, lying at the 3'-terminal end of the coding region codons, such as nonsense codons (UAG, UAA, UGA), or any sense codons, but preferably used with respect to the translation system rare sense codons (z. B. AGA when using an E. coli translation system) act.

Die ortsspezifische Kopplung an einem definierten Terminator codon kann vorzugsweise mittels zweier Varianten des erfindungs gemäßen Verfahrens erfolgen: The site-specific coupling to a defined terminator codon can preferably be carried out by means of two variants of the method according contemporary:

  • 1. Die ortsspezifische Kopplung kann erfindungsgemäß unter Verwendung eines Sinn-Codons als Terminatorcodon erfolgen, welches nicht stromaufwärts im codierenden Bereich der Struktur einheit A bereits vorhanden ist. 1. The site-specific coupling can be carried out according to the invention using a sense codons as a terminator codon which is not upstream in the coding region of the structural unit A already exists. Vorzugsweise wird hierfür das seltene AGA-Codon herangezogen, wobei in diesem Fall der Trans lationsansatz keine für das AGA-Codon spezifische tRNA enthalten sollte. For this, the rare AGA codon is used preferably, in which case the transmembrane lationsansatz not for the AGA codon should contain specific tRNA. Am AGA-Codon findet erfindungsgemäß der Peptidyltransfer auf den Terminator statt, welcher in diesem Fall nicht mit den entsprechenden tRNA-Molekülen des Translationsgemisches um die Besetzung der Aminoacyl-Bindungsstelle des Ribosoms konkurriert. At the AGA codon according to the invention of the peptidyl transfer takes place on the terminator, which does not compete in this event with the appropriate tRNA molecules of the translation mixture to the occupation of the aminoacyl-binding site of the ribosome.
  • 2. Die ortsspezifische Kopplung kann erfindungsgemäß auch durch eine Codon-Anticodon-Wechselwirkung erfolgen. 2. Site-specific coupling can be carried out according to the invention by a codon-anticodon interaction. Es ist erfindungsgemäß möglich, den Terminator über einen Spacer mit anderen Bereichen der Struktureinheit A zu verknüpfen. It is inventively possible to link A terminator via a spacer to other areas of the structural unit. Im Falle der ortsspezifischen Kopplung mittels Codon-Anticodon-Wechsel wirkung wird ein Spacer mit tRNA-Struktur gewählt, welcher am Terminatorcodon den Transfer der naszierenden Struktureinheit B auf den Terminator vermittelt. In the case of site-specific coupling efficiency by codon-anticodon change a spacer is chosen with tRNA structure, which mediates the transfer of the nascent structural unit B on the terminator to the terminator codon. Vorzugsweise wird auch hierfür wie oben beschrieben das AGA-Codon herangezogen, so daß das Translationsgemisch entsprechend vorbehandelt werden sollte. Preferably, this will be the AGA codon used as described above, so that the translation mixture should be treated accordingly.

Im allgemeinen können als Spacer erfindungsgemäß beispielsweise natürliche und/oder synthetische Oligomere oder Polymere, wie z. In general, as a spacer according to the invention, for example, natural and / or synthetic oligomers or polymers, such. B. beliebige Nukleinsäuresequenzen, eingesetzt werden. As any nucleic acid sequences are used. Die Verknüpfung des Spacers an weitere Bereiche der Struktureinheit A, wie z. Linking the spacer to other areas of the structural unit A such. B. das 3′-terminale Nukleotid einer mRNA, kann in beliebiger Weise erfolgen, vorzugsweise jedoch über die 3′-Position des terminalen Nukleotids. For example, the 3 'terminal nucleotide of an mRNA can be carried out in any desired manner, but preferably via the 3'-position of the terminal nucleotide. Es ist erfindungsgemäß zweckmäßig, diese Verknüpfung sowie weitere mögliche Ver knüpfungen innerhalb der Struktureinheit A so zu wählen, daß diese unter Assay-Bedingungen nicht spaltbar sind. It is inventively expedient this association as well as other possible United knotting within the structural unit A to be selected so that they are not cleavable under assay conditions. Somit wird auch gewährleistet, daß nach dem Transfer der naszierenden Polypeptidkette auf den Terminator ein weiterer Transfer auf eine neue Aminoacyl-tRNA unterbleibt. Thus, it is also ensured that, after the transfer of the nascent polypeptide chain on the terminator, a further transfer to a new aminoacyl-tRNA omitted. Derartige Verknüpfungen können sowohl kovalenter Natur sein als auch auf molekularen Wechselwirkungen, z. Such links can be both covalent nature as well as on molecular interactions, eg. B. zwischen Streptavidin oder Avidin und Biotin, Nickel-NTA und oligo-Histidin, Protein und Ligand, Antikörper und Antigen, oder auch zwischen zwei hybridisierenden Nukleinsäuren, beruhen. B. between streptavidin or avidin and biotin, nickel-NTA and oligo-histidine, protein and ligand, antibody and antigen, or between two hybridizing nucleic acids is based. Die Verknüpfung des Terminators mit einem Ribonukleinsäure-Spacer kann beispielsweise über die 2′ und/oder 3′-Position erfolgen. The linking of the terminator with a ribonucleic acid spacer may be effected for example via the 2 'and / or 3'-position.

Die erfindungsgemäße Verbindung sowie das erfindungsgemäße Verfahren werden im folgenden beispielhaft anhand von Figuren dargestellt. The inventive compound and method of the invention are illustrated in the following by way of example with reference to figures.

Fig. 1: Allgemeines Prinzip der ribosomal katalysierten Kopp lung eines Polypeptids an seine eigene mRNA in vitro. Fig. 1: General principle of ribosomal Kopp catalyzed lung of a polypeptide at its own mRNA in vitro.

Fig. 2: Kopplung der naszierenden Polypeptidkette an ihre eigene mRNA durch ein aliphatisches Amin. Fig. 2: coupling of the nascent polypeptide to its own mRNA by an aliphatic amine.

Fig. 3: Kopplung der naszierenden Polypeptidkette an ihre eigene mRNA durch ein Puromycin-Molekül. Fig. 3: coupling of the nascent polypeptide to its own mRNA through a puromycin molecule.

Fig. 4: Kopplung der naszierenden Polypeptidkette an ihre eigene mRNA durch eine mit Phenylalanin beladene, modifizierte tRNA. Fig. 4: Coupling of the nascent polypeptide to its own mRNA by a loaded with phenylalanine, modified tRNA.

Fig. 5: Kopplung der naszierenden Polypeptidkette an ihre eigene mRNA durch eine Anthraniloyl-tRNA. Fig. 5: Coupling of the nascent polypeptide to its own mRNA by an anthraniloyl-tRNA.

Fig. 6: Kopplung der naszierenden Polypeptidkette an ihre eigene mRNA durch eine intramolekulare, beladene Nonsense-Suppressor-tRNA. Fig. 6: Coupling of the nascent polypeptide to its own mRNA by an intramolecular laden nonsense suppressor tRNA.

Fig. 7: Kopplung der naszierenden Polypeptidkette an ihre eigene mRNA durch eine intramolekulare, mit Puromycin beladene tRNA. Fig. 7: Coupling of the nascent polypeptide chain at their own mRNA by an intramolecular loaded with puromycin tRNA.

Fig. 8: Kopplung der naszierenden Polypeptidkette an ihre eigene mRNA durch eine beladene tRNA, deren Amino säure mit der mRNA verknüpft ist. Fig. 8: Coupling of the nascent polypeptide chain is linked to its own mRNA by a charged tRNA whose amino acid with the mRNA.

Die Fig. 1 zeigt das allgemeine Prinzip der in vitro Genotyp- Phänotyp Kopplung unter Verwendung eines ribosomalen Trans lationssystems. Fig. 1 shows the general principle of the in vitro genotype phenotype coupling using a ribosomal lationssystems Trans. An den codierenden, translatierbaren Bereich der Struktureinheit A schließt sich ein Terminatorcodon an, welches über einen Spacer mit dem Terminator verknüpft ist. To the coding, translatable region of the structural unit A is a terminator codon follows, which is linked via a spacer to the terminator. Nach Synthese des beschriebenen Konstruktes wird der codierende Bereich in vitro translatiert. After synthesis of the construct described the coding region is translated in vitro. Am Terminatorcodon gelangt der Terminator in die Aminoacyl-Bindungsstelle des translatierenden Ribosoms. At the terminator codon of the Terminator gets into the aminoacyl-binding site of the ribosome be translated. Die naszierende Polypeptidkette (Struktureinheit B) wird katalytisch auf den Terminator transferiert. The nascent polypeptide chain (structural unit B) is catalytically transferred to the terminator. Als Kopplungs produkt entsteht ein Polypeptid, das am C-terminalen Ende über einen Terminator und einen Spacer stabil mit seiner codierenden Nukleinsäure verknüpft ist. As coupling product is produced a polypeptide which is linked to the stable C-terminal end of a terminator and a spacer with its encoding nucleic acid. Die Stabilität der Kopplung gewähr leistet, daß nach Selektion des Polypeptids mit der gewünschten Eigenschaft gleichzeitig der genetische Bauplan zur Verfügung steht. The stability of the coupling guarantees that is, after selection of the polypeptide having the desired property of genetic blueprint simultaneously available. Symbole: A und P, Aminoacyl- bzw. Peptidyl-Bindungsstelle des Ribosoms; Symbols: A and P, aminoacyl or peptidyl-binding site of the ribosome; x Terminator. x terminator.

Die Fig. 2 zeigt die Verwendung eines primären Amins als Terminator. Fig. 2 shows the use of a primary amine as a terminator. Der codierende, translatierbare Bereich der Struktureinheit A ist hier eine mRNA, welche an Stelle eines Stop-Codons ein einziges AGA-Codon enthält, an das sich ein Spacer (hier Ribonukleinsäure) anschließt. The coding, translatable region of the structural unit A is a mRNA containing a single AGA codon in place of a stop codon, which is followed by a spacer (here ribonucleic acid) followed here. Dessen 3′-Ende weist einen 3′-Desoxy-3′-aminoadenosin-Rest auf, der eine aliphatische Aminogruppe trägt. Its 3 'end has a 3'-deoxy-3'-aminoadenosine-radical bearing an aliphatic amino group. Der Translationsansatz enthält keine für das Arginin-Codon AGA spezifischen tRNA-Moleküle, so daß am AGA- Codon das modifizierte 3′-Ende das Spacers in die Aminoacyl- Bindungsstelle des translatierenden Ribosoms gelangen und die naszierende Polypeptidkette auf den Terminator übertragen werden kann. The translation approach does not contain specific for the arginine codon AGA tRNA molecules so that the modified 3'-end of codon AGA arrive at the spacer in the aminoacyl-binding site of the ribosome be translated and the nascent polypeptide can be transferred to the terminator. Als Kopplungsprodukt entsteht ein Polypeptid, das am C-terminalen Ende kovalent mit dem Terminator, der Spacer-RNA und mRNA verknüpft ist. As coupling product is produced a polypeptide which is covalently linked at the C-terminal end with the terminator, the spacer RNA and mRNA.

Die Fig. 3 zeigt die Verwendung eines Puromycin-Moleküls als Terminator. FIG. 3 shows the use of puromycin molecule as a terminator. Die mRNA enthält statt eines Stop-Codons ein einziges AGA-Codon, an das sich ein Spacer (hier Ribonuklein säure) anschließt. The mRNA contains a single AGA codon, which is followed by a spacer (here ribonucleic acid) followed instead of a stop codon. Dessen 3′-Ende weist einen über die 5′-OH- Gruppe gekoppelten Puromycin-Rest auf. Its 3 'end comprises a 5'-OH group on the coupled puromycin moiety. Der Translationsansatz enthält keine für das Arginin-Codon AGA spezifischen tRNA- Moleküle, so daß am AGA-Codon das modifizierte 3′-Ende des Spacers in die Aminoacyl-Bindungsstelle des translatierenden Ribosoms gelangen und die naszierende Polypeptidkette auf den Terminator übertragen werden kann. The translation approach does not contain specific for the arginine codon AGA tRNA molecules so that arrive at the AGA codon, the modified 3 'end of the spacer in the aminoacyl-binding site of the ribosome be translated and the nascent polypeptide can be transferred to the terminator. Als Kopplungsprodukt entsteht ein Polypeptid, das am C-terminalen Ende kovalent mit dem Terminator, der Spacer-RNA und mRNA verknüpft ist. As coupling product is produced a polypeptide which is covalently linked at the C-terminal end with the terminator, the spacer RNA and mRNA.

Die Fig. 4 beschreibt die Kopplung der naszierenden Polypeptid kette an ihre eigene mRNA durch eine mit Phenylalanin beladene, modifizierte tRNA. FIG. 4 describes the coupling of the nascent polypeptide chain at their own mRNA by a loaded with phenylalanine, modified tRNA. Die mRNA enthält statt eines Stop-Codons ein einziges AGA-Codon, an das sich eine beliebige Ribonukleinsäure sequenz anschließt. The mRNA contains a single AGA codon, which is followed by any ribonucleic acid sequence followed instead of a stop codon. Deren 3′-Ende weist einen 3′-Desoxy-3′- aminoadenosin-Rest auf, der kovalent an die X₄₇-Base einer mit Phenylalanin beladenen, am 3′-Ende modifizierten tRNA gekoppelt ist. The 3'-end has a 3'-deoxy-3'-amino adenosine residue on the loaded covalently to the X₄₇ base with a phenylalanine, is coupled at the 3'-end modified tRNA. Der Translationsansatz enthält keine für das Arginin-Codon AGA spezifischen tRNA-Moleküle, so daß am AGA-Codon das modi fizierte 3′-Ende des Spacers in die Aminoacyl-Bindungsstelle des translatierenden Ribosoms gelangen und so die naszierende Polypeptidkette auf den Terminator übertragen werden kann. The translation approach does not contain specific for the arginine codon AGA tRNA molecules, so that the modi fied 3 'end of the spacer arrive at the AGA codon in the aminoacyl-binding site of the be translated ribosome and so the nascent polypeptide can be transferred to the terminator , Als Kopplungsprodukt entsteht ein Polypeptid, das am C-terminalen Ende kovalent mit dem Terminator, der Spacer-RNA und mRNA verknüpft ist. As coupling product is produced a polypeptide which is covalently linked at the C-terminal end with the terminator, the spacer RNA and mRNA.

Die Fig. 5 verdeutlicht die Kopplung der naszierenden Poly peptidkette an ihre eigene mRNA durch eine derivatisierte Anthraniloyl-tRNA. Fig. 5 illustrates the coupling of the nascent poly peptide chain on its own mRNA by a derivatized anthraniloyl-tRNA. Die mRNA enthält statt eines Stop-Codons ein einziges AGA-Codon, an das sich eine beliebige Ribonukleinsäure sequenz anschließt. The mRNA contains a single AGA codon, which is followed by any ribonucleic acid sequence followed instead of a stop codon. Deren 3′-Ende weist einen 3′-Desoxy-3′- aminoadenosin-Rest auf, der kovalent an die X₄₇-Base einer derivatisierten Anthraniloyl-tRNA gekoppelt ist. The 3'-end has a 3'-deoxy-3'-amino adenosine residue, which is covalently coupled to the base of a derivatized X₄₇ anthraniloyl-tRNA. Der Trans lationsansatz enthält keine für das Arginin-Codon spezifischen tRNA-Moleküle, so daß am AGA-Codon das modifizierte 3′-Ende des Spacers in die Aminoacyl-Bindungsstelle des translatierenden Ribosoms gelangen und so die naszierende Polypeptidkette auf den Terminator übertragen werden kann. The Trans lationsansatz contains no specific for the arginine codon tRNA molecules so that the modified 3 'end of the spacer arrive at the AGA codon in the aminoacyl-binding site of the be translated ribosome and so the nascent polypeptide can be transferred to the terminator. Als Kopplungsprodukt entsteht ein Polypeptid, das am C-terminalen Ende kovalent mit dem Terminator, der Spacer-RNA und mRNA verknüpft ist. As coupling product is produced a polypeptide which is covalently linked at the C-terminal end with the terminator, the spacer RNA and mRNA.

Die Fig. 6 verdeutlicht die Kopplung der naszierenden Poly peptidkette an ihre eigene mRNA durch eine intramolekulare, beladene Nonsense-Suppressor-tRNA. Fig. 6 illustrates the coupling of the nascent poly peptide chain on its own mRNA by an intramolecular laden nonsense suppressor tRNA. Die mRNA enthält das Stop- Codon UAG, an das sich ein Spacer (hier Ribonukleinsäure) anschließt. The mRNA contains the stop codon UAG, which is followed by a spacer (here ribonucleic acid) is connected. Der Spacer enthält die Nukleotidsequenz das Vor läufermoleküls einer Nonsense-Suppressor-tRNA und bildet eine entsprechende Tertiärstruktur aus. The spacer contains the nucleotide sequence of the pre runner molecule of a nonsense suppressor tRNA, and forms an appropriate tertiary structure. Das 3′-Ende ist durch eine stabile Amidbindung mit einer beliebigen (natürlichen oder unnatürlichen) Aminosäure verknüpft. The 3 'end is linked by a stable amide bond with any (natural or unnatural) amino acid. Am Nonsense-Codon UAG kann der Spacer, der als beladende Suppressor-tRNA fungiert, in die Aminoacyl Bindungsstelle des translatierenden Ribosoms gelangen und die naszierende Polypeptidkette auf den Terminator über tragen werden. At nonsense codon UAG, the spacer which acts as a suppressor tRNA-loading, enter the aminoacyl binding site of the ribosome be translated and the nascent polypeptide will carry on the terminator on. Als Kopplungsprodukt entsteht ein Polypeptid, das am C-terminalen Ende kovalent mit dem Terminator, der Spacer-RNA und mRNA verknüpft ist. As coupling product is produced a polypeptide which is covalently linked at the C-terminal end with the terminator, the spacer RNA and mRNA.

Die Fig. 7 zeigt die Kopplung der naszierenden Polypeptidkette an ihre eigene mRNA durch eine intramolekulare, mit Puromycin beladene tRNA. Fig. 7 shows the coupling of the nascent polypeptide to its own mRNA by an intramolecular loaded with puromycin tRNA. Die mRNA enthält statt eines Stop-Codons ein einziges AGA-Codon, an das sich ein Spacer (hier Ribonuklein säure) anschließt. The mRNA contains a single AGA codon, which is followed by a spacer (here ribonucleic acid) followed instead of a stop codon. Der Spacer enthält die Nukleotidsequenz des Vorläufermoleküls einer für das AGA-Codon spezifischen tRNA und bildet eine entsprechende Tertiärstruktur aus. The spacer contains the nucleotide sequence of a precursor molecule specific for the AGA codon tRNA and forms a corresponding tertiary structure. Das 3′-terminale Nukleotid des Spacers (A₇₆) weist einen Puromycin-Rest auf. The 3'-terminal nucleotide of the spacer (A₇₆) has a puromycin moiety. Der Translationsansatz enthält keine für das Arginin-Codon AGA spezifischen tRNA-Moleküle, so daß am AGA-Codon der Spacer, der als beladene tRNA fungiert, in die Aminoacyl-Bindungsstelle des translatierenden Ribosoms gelangen und die naszierende Poly peptidkette auf den Terminator übertragen werden kann. The translation approach does not contain specific for the arginine codon AGA tRNA molecules, so that arrive at the AGA codon of the spacer which acts as a charged tRNA to the aminoacyl-binding site of the be translated ribosome and the nascent poly peptide chain to the terminator can be transmitted , Als Kopplungsprodukt entsteht ein Polypeptid, das am C-terminalen Ende kovalent mit dem Terminator, der Spacer-RNA und mRNA verknüpft ist. As coupling product is produced a polypeptide which is covalently linked at the C-terminal end with the terminator, the spacer RNA and mRNA.

Die Fig. 8 verdeutlicht die Kopplung der naszierenden Poly peptidkette an ihre eigene mRNA durch eine beladene tRNA, deren Aminosäure mit der mRNA verknüpft ist. Fig. 8 illustrates the coupling of the nascent poly peptide chain on its own mRNA by a charged tRNA, the amino acid is linked to the mRNA. Die mRNA enthält ein einziges AGA-Codon, an das sich ein Stop-Codon und ein Spacer (hier Ribonukleinsäure) anschließt. The mRNA contains a single AGA codon, which is followed by a stop codon and a spacer (here ribonucleic acid) is connected. Der Spacer ist am 3′-Ende über eine Phosphodiesterbindung mit der Seitenkette des Termina tors kovalent verknüpft. The spacer is covalently attached via a phosphodiester bond with the side chain of Termina tors at the 3 'end. Der Terminator wiederum ist über eine Aminoacylbindung an eine tRNA gebunden. The Terminator in turn attached through an aminoacyl a tRNA. Der Translationsansatz enthält keine für das Arginin-Codon AGA spezifischen tRNA- Moleküle, so daß am AGA-Codon der mit der mRNA gekoppelte Terminator in die Aminoacyl-Bindungsstelle des translatierenden Ribosoms gelangen und die naszierende Polypeptidkette auf den Terminator übertragen werden kann. The translation mixture contains no molecules specific for the arginine codon AGA tRNA, so that arrive at the AGA codon is coupled to the mRNA terminator in the aminoacyl-binding site of the ribosome be translated and the nascent polypeptide can be transferred to the terminator. Der darauffolgende Transfer des Peptidylrestes auf Wasser am Stop-Codon bewirkt die Frei setzung der AGA-spezifischen tRNA. The subsequent transfer of the peptidyl residue on water at the stop codon causes the free translation of the AGA-specific tRNA. Als Kopplungsprodukt entsteht ein Polypeptid, das am C-terminalen Ende kovalent mit dem Terminator, der Spacer-RNA und mRNA verknüpft ist. As coupling product is produced a polypeptide which is covalently linked at the C-terminal end with the terminator, the spacer RNA and mRNA. Weder die tRNA noch die Art der Aminosäure-Verknüpfung ist in dieser Ausführungsform verändert, so daß eine Bindung durch den Elongationsfaktor Tu unter nahezu natürlichen Bedingungen und somit ein effizienter Einbau des Terminatormoleküls ermöglicht werden. Neither the tRNA nor the nature of the amino acid link is changed in this embodiment, so that binding by the elongation factor Tu under near natural conditions, and thus a more efficient incorporation of the terminator molecule are possible.

Die experimentelle Umsetzung der in Fig. 8 dargestellten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann beispiel haft durch folgende Schritte erfolgen: . The experimental implementation of the embodiment of the method according to the invention illustrated in Fig 8 can for example take place by way of the following steps:
Vorbereitende Schritte: (Endprodukt einsetzbar für beliebige Kopplungsreaktionen) Preparatory steps of: (end product used for any coupling reactions)

  • 1. Chemische Aminoacylierung des Diribonukleotids pC₇₅pA₇₆ mit einer Aminosäure, deren Seitenkette R mit einem beliebigen Diribonukleotid oder Didesoxyribonukleotid modifiziert ist [R = -CH₂-3′-pXpXp-5′]; 1. Chemical aminoacylation of Diribonukleotids pC₇₅pA₇₆ with an amino acid whose side chain is modified with any Diribonukleotid or dideoxyribonucleotide R [R = -CH₂-3'-pXpXp-5 '];
  • 2. Ligation des aminoacylierten Diribonukleotids mit einer für das Codon AGA spezifischen tRNA (C₇₄-Ende!) durch T4 -RNA-Ligase; 2. Ligation of the aminoacylated Diribonukleotids having a specific for the codon AGA tRNA (C₇₄ end!) By T4 RNA ligase;
  • 3. Reinigung der korrekten und funktionalen Ligationsprodukte (Aminoacyl-tRNAs) durch immobilisierten Elongationsfaktor EF-TU in Gegenwart von GTP; 3. Purification of the correct and functional ligation products (aminoacyl-tRNAs) by immobilized elongation factor EF-Tu in the presence of GTP;

Weitere Schritte: (abhängig von dem zu selektierenden Ziel molekül); Further steps: (depending on the target molecule to be selected);

  • 4. Diversifizierung des entsprechenden Polypeptid-Strukturgens durch chemische Resynthese (codon-based mutagenesis) oder durch Mutagenese- und/oder Rekombinations-PCR Unter dem Begriff "codon-based mutagenesis" wird im Sinne der Erfindung eine chemische Synthese von DNA verstanden, bei der statt Monomer-Bausteinen Trimere eingesetzt werden, die jeweils für eine bestimmte Aminosäure codieren. 4. diversification of the corresponding polypeptide structural gene by chemical resynthesis (codon-based mutagenesis) or by mutagenesis and / or recombination-PCR, the term "codon-based mutagenesis" is meant a chemical synthesis of DNA according to the invention, in which instead of monomer building blocks trimers are used, which each encode a particular amino acid. Durch Mischen von TrimerBausteinen bei der Synthese kann der Einbau verschiedener Codons im gewünschten Verhältnis an jeder Position erzielt werden. By mixing TrimerBausteinen in the synthesis of installing different codons in the desired ratio at each position can be achieved.
  • Unter dem Begriff "Mutagenese-PCR" wird im Sinne der Erfindung eine in-vitro-Amplifikation von DNA verstanden, bei der durch bestimmte Bedingungen eine fehlerhafte Verdopplung der DNA erzwungen wird. The term "mutagenesis PCR" is an in vitro amplification understood in the sense of the invention of DNA in which an erroneous doubling of the DNA is forced by certain conditions.
  • Unter dem Begriff "Rekombinations-PCR" wird im Sinne der Erfindung eine in-vitro-Amplifikation von DNA verstanden, bei der durch Mischen von zufälligen DNA-Subfragmenten homologer Gene neue, mosaikartige Gene synthetisiert werden. The term "recombinant PCR" is an in vitro amplification of DNA understood, new mosaic genes are synthesized at the homologous by mixing random DNA subfragments genes in the context of the invention. Dieser Prozeß ist mit einer natürlichen Rekom bination vergleichbar; This process is a natural Rekom bination comparable;
  • 5. Erneute Amplifikation (Reamplification) der synthetisierten Strukturgene durch PCR, wobei der 5′-Primer einen Promotor (z. B. T7-Promotor) und eine Translationsinitationsregion (einschließlich ATG-Start- Codon), während der 3′-Primer sechs Histidin-Codons, das Terminatorcodon AGA und das Nonsense-Codon TAG einführt; 5. Re-amplification (reamplification) of the synthesized structural genes by PCR using the 5 'primer, a promoter (eg. B. T7 promoter) and a Translationsinitationsregion (including ATG start codon) while the 3' primer six histidine codon, introduces the terminator codon AGA and the nonsense codon TAG;
  • 6. Präparation einer Spacer-DNA (z. B. chemische Synthese oder durch PCR), deren 5′-terminale Sequenz mit der 3′-termina len Sequenz des reamplifizierten Strukturgens überlappt; 6. Preparation of a spacer DNA (for example, chemical synthesis or by PCR.), The 5'-terminal sequence overlaps with the 3'-termina len sequence of the structural gene reamplified;
  • 7. Verspleißen beider DNA-Fragmente durch SOE-PCR (splicing by overlap extension), wobei der Spacer den 3′ -terminalen Fusionspartner bildet. 7. splicing of both DNA fragments by SOE-PCR (splicing by overlap extension), wherein the spacer is provided by the 3 '-terminal fusion partner.
  • Unter dem Begriff "SOE-PCR" wird im Sinne der Erfindung eine in-vitro-Amplifikation von DNA verstanden, bei der aufgrund überlappender Bereiche zwei DNA-Fragmente mit einander verspleißt werden; The term "SOE-PCR" is an in vitro amplification understood in the sense of the invention of DNA in which two DNA fragments are spliced ​​to each other due to overlapping areas;
  • 8. In-vitro-Transkription des Fusionsgens mit m⁷GpppG (5′- Cap-Struktur) als Primer (z. B. mit T7-DNA-Polymerase); 8. In vitro transcription of the fusion gene with m⁷GpppG (5'-cap structure) as primers (for example, with T7 DNA polymerase.);
  • 9. Reinigung des run-off-Transkriptes durch Polyacrylamidgel elektrophorese; 9. Cleaning of the run-off transcript by polyacrylamide electrophoresis;
  • 10. Ligation der synthetisierten RNA (freies 3′-OH-Ende; 5′-Ende durch Cap-Struktur geschützt) mit der Aminosäure- Seitenkette der aminoacylierten tRNA durch T4-RNA-Ligase; 10. Ligation of synthesized RNA (free 3'-OH end; 5 'end by cap structure protected) with the amino acid side chain of the amino acylated tRNA by T4 RNA ligase;
  • 11. Reinigung des Produktes durch Polyacrylamidgelelektro phorese; 11. Cleaning of the product by Polyacrylamidgelelektro electrophoresis;
  • 12. In-vitro-Translation der mRNA und Kopplung der naszierenden Polypeptidkette durch die für das AGA-Codon spezifische, aminoacylierte tRNA in Gegenwart eines E. coli Trans lationsgemisches, das durch entsprechende Vorbehandlung keine für das Arginin-Codon AGA spezifische tRNA-Moleküle mehr enthält; 12. In vitro translation of the mRNA and coupling of the nascent polypeptide by specific to the AGA codon, aminoacylated tRNA in the presence of E. coli transformants lationsgemisches that by appropriate pretreatment no specific for the arginine codon AGA-tRNA molecules more contains;
  • 13. Abtrennung der Translationsfaktoren und Reinigung der Fusionsmoleküle durch Affinitätschromatographie an einer Nickel -NTA-Matrix. 13, separation of the translation factors and purification of the fusion molecules by affinity chromatography on a nickel-NTA matrix.
  • Unter dem Begriff "Nickel-NTA-Matrix" wird im Sinne der Erfindung eine Matrix verstanden, die aufgrund eines immobilisierten Nickelions die Reinigung von Oligohistidin haltigen Biomolekülen ermöglicht; The term "nickel-NTA matrix" is a matrix is ​​understood within the meaning of the invention, which allows the purification of oligohistidine-containing biomolecules due to an immobilized nickel ion;
  • 14. In-vitro-Selektion von Fusionsmolekülen mit gewünschten Eigenschaften (z. B. durch Panning); 14. In vitro selection of fusion molecules with desired properties (. For example by panning);
  • 15. Reverse Transkription der angereicherten Fusionsmoleküle und Reamplifikation der genetischen Information durch PCR, wobei der 5′-Primer wiederum den Promoter und die Trans lationsinitiationsregion einführt, während der 3′-Primer mit der 3′-terminalen Sequenz des Spacers hybridisiert; 15. Reverse transcription of the enriched fusion molecules and reamplification of the genetic information by PCR using the 5 'primer in turn introduces the promoter and the transformants lationsinitiationsregion, while the 3' primer hybridizes to the 3'-terminal sequence of the spacer;
  • 16. Wiederholung des beschriebenen Verfahrens ab Schritt 8. 16. Repetition of the procedure described at 8.

Die experimentelle Umsetzung des ersten vorbereitenden Schrittes kann insbesondere auch unter Verwendung einer Aminosäure, deren Seitenkette mit einem beliebigen Oligoribonukleotid oder Oligo desoxyribonukleotid modifiziert ist, erfolgen. The experimental implementation of the first preparatory step may in particular also using an amino acid whose side chain is modified deoxyribonucleotide or oligo oligoribonucleotide using any, take place.

Weiterhin kann es bevorzugt sein, wenn die Seitenkette der Aminosäure ein freies 5′-OH-Ende aufweist, welches erst nach Ligation gemäß Schritt 2 5′-phosphoryliert wird. It may further be preferred that the side chain of the amino acid having a free 5'-OH end of which is 5'-phosphorylated after ligation according to step. 2 In vorteil hafter Weise läßt sich somit die Ausbeute von funktionalen Ligationsprodukten erhöhen. Advantageously, the yield of functional ligation products can thus be increased.

In Anlehnung an Fig. 8 befindet sich in einer weiteren Aus führungsform mindestens ein Sinn-Codon zwischen Terminatorcodon und Stop-Codon. Following Fig. 8 is located in a further guide form at least one sense codon between terminator codon and stop codon. Auf diese Weise wird eine Kopplung zwischen Terminator und Polypeptidkette nicht mehr auf deren C-terminale Aminosäure beschränkt. In this way, a coupling between terminator and polypeptide chain is not limited to the C-terminal amino acid.

Claims (13)

1. Verbindung aus einer Struktureinheit A (Genotyp) und einer weiteren Struktureinheit B (Phänotyp), bei der Genotyp und Phänotyp dauerhaft miteinander verbunden sind, wobei die Struktureinheit A neben anderen Bereichen mindestens einen für mindestens ein aus Aminosäureeinheiten aufgebautes, polymeres Molekül codierenden Bereich aufweist und der oder die codierenden Bereich(e) translatierbar ist oder sind, weiterhin in der Struktureinheit A eine erste Struktur untereinheit (Terminator) in einem nicht translatierten Abschnitt angeordnet ist, die die Struktureinheit B als Translationsprodukt der Struktureinheit A mit der Struktur einheit A dauerhaft verbindet. 1. A compound of a structural unit A (genotype) and a further structural unit B (phenotype) are permanently linked in the genotype and phenotype with each other, in addition to other areas of the structural unit A has at least one coding for at least one built up from amino acid units, polymeric molecule range and the one or more coding region (s) is translatable or, further comprising a first structural sub-assembly (terminator) in a non-translated portion is arranged in the structural unit a that connects the structural unit B as a translation product of the structural unit a to the structural unit a permanently ,
2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verknüpfung der Struktureinheit A mit der durch Translation entstandenen Struktureinheit B über eine auf der Struktureinheit A angeordnete zweite Strukturuntereinheit gesteuert wird. 2. A compound according to claim 1, wherein the linkage of the structural unit A is controlled by the incurred by translation of structural unit B via a arranged on the structural unit A second structural subunit.
3. Verbindung nach Anspruch 2, wobei die zweite Strukturunter einheit ein Codon (Terminator-Codon) ist. 3. A compound according to claim 2, wherein the second structural unit is a codon (termination codon).
4. Verbindung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Struktureinheit A eine modifizierte mRNA ist und die Struktureinheit B eine aus der mRNA translatierte Polypeptidkette ist. 4. A compound according to any one of claims 1 to 3, wherein the structural unit A is a modified mRNA and the structural unit B is a translated from the mRNA of the polypeptide chain.
5. Verbindung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Terminator über einen Spacer mit anderen Be reichen der Struktureinheit A verknüpft ist. 5. A compound according to any one of claims 1 to 4, wherein the terminator rich via a spacer to the other loading of the structural unit A is linked.
6. Verbindung nach Anspruch 5, wobei der Spacer mit dem Terminatorcodon der Struktureinheit A in Wechselwirkung tritt. 6. A compound according to claim 5, wherein the spacer with the terminator codon of the structural unit A interacts.
7. Verbindung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Terminator eine nucleophile chemische Gruppe ist, die einen Carbonsäureester unter Ausbildung einer kova lenten Bindung zu spalten vermag. 7. A compound according to any one of claims 1 to 6, wherein the terminator is a nucleophilic chemical group which is capable of cleaving a Carbonsäureester to form a kova Lenten bond.
8. Verbindung nach Anspruch 7, wobei die nucleophile chemische Gruppe eine organische Aminogruppe ist. 8. A compound according to claim 7, wherein the nucleophilic chemical group is an organic amine group.
9. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Terminator einen Carbonsäureester zwischen einer tRNA und der Struktureinheit B spaltet und eine dauerhafte Ver bindung zwischen den Struktureinheiten A und B ausgebildet wird. 9. A compound according to any one of claims 1 to 8, wherein the terminator cleaves a Carbonsäureester between a tRNA and the structural unit B and a permanent Ver bond is formed between the structural units A and B.
10. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Verknüpfung zwischen den Struktureinheiten A und B durch eine kovalente Verbindung erfolgt. 10. A compound according to any one of claims 1 to 9, wherein the linkage between the structural units A and B by a covalent connection is made.
11. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Terminator, insbesondere als nucleophile Gruppe über eine Bindung an einen Spacer mit tRNA Struktur gebunden ist, der mit dem Terminatorcodon der Struktureinheit A, die insbesondere eine mRNA ist, in Wechselwirkung treten kann. 11. A compound according to any one of claims 1 to 10, wherein the terminator, in particular as the nucleophilic group is bonded via a bond to a spacer with tRNA structure, which can interact with the terminator codon of the structural unit A, which in particular is a mRNA.
12. Verfahren zur molekularen Genotyp/Phänotyp Kopplung mittels einer Verbindung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit A mit einem Translationssystem umgesetzt wird in Gegenwart von zur Translation benötigten Substanzen. 12. A method for molecular genotype / phenotype coupling by means of a compound according to any one of claims 1 to 11, characterized in that the structural unit A is reacted with a translation system in the presence of needed for translation substances.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die gekoppelten Genoty pen/Phänotypen isoliert werden. 13. The method of claim 12, wherein the coupled Genoty pen / phenotypes are isolated.
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