JP2013533210A - 黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）感染のための抗グルコサミニダーゼ受動免疫化 - Google Patents

黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）感染のための抗グルコサミニダーゼ受動免疫化 Download PDF

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Abstract

本発明は、黄色ブドウ球菌(Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ)グルコサミニダーゼに特異的に結合し、かつ黄色ブドウ球菌のインビボ増殖を阻害する、モノクローナル抗体を対象とする。また、モノクローナル抗体結合部分、組み換え細胞株またはハイブリドーマ細胞株、本モノクローナル抗体またはその結合部分を含有する薬学的組成物、ならびに黄色ブドウ球菌感染および骨髄炎を治療する方法、ならびに本発明のモノクローナル抗体、結合部分または薬学的組成物を用いる、患者に整形外科用インプラントを導入するための方法も開示する。

Description

本出願は、２０１０年５月３日出願の米国仮特許出願第６１／３３０，５６８号の利益を主張するものであり、かかる出願は、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって授与される認可番号第Ｒ４３ ＡＩ０８５８４４号の下、政府支援によって成された。政府は、本発明における一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、特に、骨髄炎の予防または治療のため、および整形外科用インプラントまたはグラフトの移植のための、黄色ブドウ球菌(Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ)感染に対する受動免疫化に関する。黄色ブドウ球菌グルコサミニダーゼに特異的に結合する抗体、およびそれを含有する薬学的組成物は、これらの目的のために使用することができる。
発明の背景
一件あたり概算で＄１５，０００〜７０，０００の病院費で、米国内で年間約１１２，０００件の整形外科用デバイスに関連する感染が発生しており、慢性骨髄炎（ＯＭ）への新規介入治療法に対する大きなニーズが存在する（Ｄａｒｏｕｉｃｈｅ，"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｉｍｐｌａｎｔｓ，"Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（１４）：１４２２−９（２００４））。外科技術の改善および積極的な抗生物質による予防は整形外科用インプラント手術後の感染率を１〜５％に減少させたが、骨髄炎（ＯＭ）は依然として深刻な問題であり、また低侵襲手術によるものは増加しているようである（Ｍａｈｏｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，"Ｒａｔｅｓ ａｎｄ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｔｏｔａｌ Ｈｉｐ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｍｅｄｉｃａｒｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ，"Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．Ａｍ．８５（Ａ−１）：２７−３２（２００３）、ＷＨＯ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２００１）。この再燃は、８０％が黄色ブドウ球菌によるものであるが、臨床分離株のうち約５０％までもが、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）であるという事実により、その重要性が増幅される。ここ十年間における人工関節および骨折固定デバイスに関する感染率は、各々ほんの０．３〜１１％および５〜１５％の症例ではあるが（Ｌｅｗ ａｎｄ Ｗａｌｄｖｏｇｅｌ，"Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｌａｎｃｅｔ ３６４（９４３１）：３６９−７９ （２００４）、Ｔｏｍｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｒｉ−Ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｏｔａｌ Ｊｏｉｎｔ Ａｒｔｈｒｏｐｌａｓｔｙ，"Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．Ｂｒ．８８（２）：１４９−５５（２００６））、この結末は、切断または死亡につながり得る。さらに、選択的関節全置換術（ＴＪＲ）における「低侵襲手術」が普及しているが、この手術は移植の間に人工関節が皮膚に接触することにより、非常に小さい切開創がしばしば合併症につながることがあり、結果としてＯＭの発生を著しく増加させることとなった（Ｍａｈｏｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，"Ｒａｔｅｓ ａｎｄ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｔｏｔａｌ Ｈｉｐ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｍｅｄｉｃａｒｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ，"Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．Ａｍ．８５（Ａ−１）：２７−３２（２００３）、ＷＨＯ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２００１）。これらの感染は、非常に高価な二段階再置換手術を必要とし、最近の報告では成功率が５０％と低い可能性があることが示唆されている（Ａｚｚａｍ ｅｔ ａｌ．，"Ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ａ Ｓｅｃｏｎｄ Ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ Ｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｐｅｒｉｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ Ｋｎｅｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，"Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．４６７（７）：１７０６−１４（２００９））。しかしながら、最大の懸念は薬剤耐性株、とりわけＭＲＳＡの発生であり、これは、北米における最大の致死性病原体としてＨＩＶをしのぎ、慢性ＯＭの管理をより困難なものにし続け、新規介入治療法を大いに要することとなっている。特に、ＴＪＲの主要なレシピエントである免疫無防備状態の高齢者に対する代替的な介入治療戦略に対する大きなニーズが存在する。
現在、高リスクの患者、とりわけ米国において毎年実施される１５０万件のＴＪＲの大部分を占める年老いた「ベビーブーム世代」をＭＲＳＡから防御することができる予防的治療は存在しない。ＭＲＳＡの発生を５０〜８０％減少させるであろうワクチンは、関節置換術および開放骨折修復手技の一番の合併症を低減するだけでなく、医療負担を同程度に削減するであろう。
研究により、慢性ＯＭの８０％は、黄色ブドウ球菌が原因であることが実証されている。これらの細菌は、破骨細胞活性の増加を通じて（Ｍａｒｒｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｔｈｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｉｎ ａ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ Ｔｉｓｓｕｅ，"Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６４（４）：１３９９−４０６（２００４））、骨吸収を刺激することができる毒素（Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ，"Ｓｕｒｆａｃｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｆｒｏｍ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ Ｐｏｔｅｎｔ Ｂｏｎｅ Ｒｅｓｏｒｂｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，"Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１０（５）：７２６−３４（１９９５））、骨マトリクスへのこれら細菌の結合を促進するいくつかの細胞表面付着分子（Ｆｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，"Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ ｆｏｒ ａ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒｏｍ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，"Ｅｍｂｏ．Ｊ．６（８）：２３５１−７（１９８７））を含む数種の因子を含有し、それら因子によって細菌は骨病原体となる。感染の発生および持続における律速段階は、移植されたデバイス周辺におけるバイオフィルムの形成である（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｂｉｏｆｉｌｍｓ：Ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｃａｕｓｅ ｏｆ Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ２８４（５４１８）：１３１８−２２（１９９９））。移植直後、宿主由来の付着因子（フィブリノゲン、フィブロネクチン、およびコラーゲンを含む）から構成される調節層(conditioning layer)がインプラントの表面上に形成され、その調節層が近接領域（創傷に隣接する皮膚）、骨内への細菌の外科的接種、または関連する軟組織骨膜の著しい破壊に伴う外傷からの感染の広がりを含む、血行性播種に由来する浮遊性細菌の付着を招く（Ｄａｒｏｕｉｃｈｅ，"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｉｍｐｌａｎｔｓ，"Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（１４）：１４２２−９（２００４））。その後数日にわたり、細菌の細胞分裂、さらなるプランクトン様生物のリクルートメント、および細菌産生物（グリコカリックス等）の分泌が、バイオフィルムを生成する。このバイオフィルムは、抗生物質、食細胞、抗体の作用から細菌を保護するための優位な障壁として機能し、リンパ球機能を害する（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，"Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｌｉｍｅ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｆｒｏｍ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，"Ｌａｎｃｅｔ１（８３７３）：３６５−７（１９８４）、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｗｉｔｈ Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｂｙ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ Ｓｌｉｍｅ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５４（１）：１３−２０（１９８６）、Ｎａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，"Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ−Ａｄｈｅｒｅｎｔ Ｃｏａｇｕｌａｓｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｃｏａｇｕｌａｓｅ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ，"Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．２６１：１２６−３３（１９９０））。
最近新たに、黄色ブドウ球菌が骨マトリクスにコロニー形成するだけでなく、骨芽細胞により細胞内移行をすることがインビトロ（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｒｍａｌ Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９（９）：５２３５−４２（２００１））およびインビボ（Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｂｙ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｃｈｉｃｋ Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ，"Ｂｏｎｅ２６（１）：６３−７０（２０００））において確認されている。これはつまり、抗体耐性および抗生物質耐性においてさらに別の重なりをもたらすこととなる。この段階の感染は代謝活性が著しく低下した状態で発生し、時として、持続感染の原因となる可能性が高い、いわゆる小型コロニー変種として現れる（Ｐｒｏｃｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｌａｐｓｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｓｍａｌｌ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，"Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０（１）：９５−１０２（１９９５））。この点で、細菌はさらに抗菌剤治療に対する耐性表現型を発現し、また、短期療法の高い失敗率を説明する（Ｃｈｕａｒｄ ｅｔ ａｌ．，"Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ Ｆｒｏｍ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｂｏｄｙ ｉｎ Ｖｉｖｏ ｔｏ Ｋｉｌｌｉｎｇ ｂｙ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ，"Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６３（６）：１３６９−７３（１９９１））。これらの広範な病原性メカニズムにより、ＯＭは、症状が消失した数年後においてさえ再発しやすいことでよく知られており、完治への転帰をとる見込みは低いと認識されている。（Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｈｏｕｎ，"Ｌｏｎｇ−Ｂｏｎｅ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，"Ｈｏｓｐ．Ｐｒａｃｔ．（Ｏｆｆ Ｅｄ）２９（１０）：７１−６，９，８３ ｐａｓｓｉｍ（１９９４））。
慢性ＯＭの分野における重要な問題のうちの１つは、慢性ＯＭを制御する因子に関する現在の知見が何故これほどわずかなのかということである。おそらく、細菌の病原性遺伝子を解明するために必要な実験ツールは、１世紀以上の間利用が可能であった。この異例の事態に対しては、３つの説が存在する。第１に、骨髄炎の症例の総数は多いが、関節形成再置換術の可能性を除くと、発生率は１〜５％であり、厳密な前向き臨床研究を行うには低すぎること。第２に、インビトロ培養は細胞外被膜を合成しない生物生育を素早く選択してしまうことが良く知られており、このため、バイオフィルムの生態はインビボモデルでのみ研究することができること（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｂｉｏｆｉｌｍｓ：Ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｃａｕｓｅ ｏｆ Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ２８４（５４１８）：１３１８−２２（１９９９））。バイオフィルム形成前の細菌の初期プランクトン増殖期を評価することができる定量的動物モデルが存在しない中、このことは「最大の障壁」となっている。これまでのところ、その病因に関する知見のほとんどが、動物モデルからのものであり（Ｎｏｒｄｅｎ，"Ｌｅｓｓｏｎｓ Ｌｅａｒｎｅｄ Ｆｒｏｍ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１０（１）：１０３−１０（１９８８））、ニワトリ（Ｄａｕｍ ｅｔ ａｌ．，"Ａ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ，Ｓｅｐｔｉｃ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ａｎｄ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｃｈｉｃｋｅｎｓ，"Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．８（６）：８０４−１３（１９９０））、ラット（Ｒｉｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｒａｔｓ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４７（３）：５８１−６（１９８５））、モルモット（Ｐａｓｓｌ ｅｔ ａｌ．，"Ａ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｕｍａｔｉｃ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｇｕｉｎｅａ Ｐｉｇｓ，"Ｊ．Ｔｒａｕｍａ２４（４）：３２３−６（１９８４））、ウサギ（Ｗｏｒｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，"Ａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｕｍａｔｉｃ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ，"Ｂｒ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．６９（２）：２３５−４４（１９８８））、イヌ（Ｖａｒｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，"Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｄｏｇｓ，"Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２７（９）：８１６−９ （１９８９））、ヒツジ（Ｋａａｒｓｅｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｎｅｗ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ Ｗｉｔｈ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｉｎ Ｓｈｅｅｐ，"Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．３３９：２４６−５２（１９９７））、および直近ではマウス（Ｍａｒｒｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｔｈｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｉｎ ａ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ Ｔｉｓｓｕｅ，"Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６４（４）：１３９９−４０６（２００４））に関して動物モデルが開発されている。これらのモデルは、インビトロアッセイ法から導き出された細菌付着の重要性を確認するために使用されている一方で（Ｃｈｕａｒｄ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｇｒｏｗｉｎｇ ｏｎ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−Ｃｏａｔｅｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ｔｏ Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，"Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３７（４）：６２５−３２（１９９３）、Ｂｕｘｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ａ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｂｏｎｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎ ｔｏ Ｔｙｐｅ Ｉ Ｃｏｌｌａｇｅｎ，"Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．８（６）：４４１−８（１９９０）、Ｓｗｉｔａｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，"Ａ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｓｔｒａｉｎｓ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｓｅｐｔｉｃ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，"Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７（１）：９９−１０７（１９９３））、それらは、インビボにおける増殖、細菌量、または骨溶解の結果測定を有さない。それゆえ、動物モデルは、薬物効果、細菌突然変異体、およびトランスジェニックマウスによる宿主因子の役割を評価するために効率的に使用することができない。
ここ１５０年にもわたる研究に基づき、微生物の病原性を説明するための明確なパラダイムが浮かび上がってきた。そのモデルはＯＭにも適用される。感染の初期ステップは単細胞細菌が体内に侵入する時に起こる。このポイントでは、微生物は環境的変化に応答せねばならず、自然免疫を無効化するのを助長したり、宿主に付着するための付着因子受容体をもたらしたりする病原性遺伝子を発現しなければならない。細菌はまた、壊死性組織またはインプラントといった外来性物体からの宿主付着因子の確率論的供給にも依存している。これらのステップの完了の成功は、細菌の対数増殖期をもたらし、その増殖は栄養が枯渇した時点および／または適応免疫が発現した時点で停止する。対数増殖期後、細菌は、バイオフィルム内で、休眠生育条件下で存続せざるを得なくなる。しかしながら、この時点で感染は慢性化し、薬物または宿主免疫によって根絶されることはない。このため、この分野における焦点は、ＭＳＣＲＡＭＭ（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｍａｔｒｉｘ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：付着マトリクス分子を認識する微生物表面構成要素）として知られる細胞外マトリクス構成要素と特異的に相互作用する細胞表面付着因子に当てられている（Ｐａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，"ＭＳＣＲＡＭＭ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｔｏ Ｈｏｓｔ Ｔｉｓｓｕｅｓ，"Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：５８５−６１７（１９９４））。実際に、これまでに開発されている本質的に全ての抗黄色ブドウ球菌ワクチンは、宿主組織コロニー形成および侵入に関して重要なＭＳＣＲＡＭＭを対象としている。これらのワクチンの目標は、これらの表面抗原に結合し、それによって、宿主組織へのそれらの付着を阻害する抗体を生成することである。細菌表面をオプソニン化することによって、これらの抗体はまた、食細胞による黄色ブドウ球菌のクリアランスを介在することができる。残念ながら、黄色ブドウ球菌は多くの付着因子を有し、そのため、１つ以上の阻害では、細菌付着を予防するのに十分ではない可能性がある。さらに、食細胞による細菌クリアランスは無血管組織においては制限されることがあり、したがって、モノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のインビボにおけるプランクトン増殖を有意に低減し、慢性ＯＭまたは全関節再置換手術の間の再感染の確立を予防するために、さらなる抗微生物的な作用メカニズムを必要とし得る。
本発明は、当該技術分野におけるこれらおよび他の欠陥を克服することを対象とする。
本発明の第１の態様は、黄色ブドウ球菌グルコサミニダーゼに特異的に結合し、かつ黄色ブドウ球菌のインビボ増殖を阻害する、モノクローナル抗体またはその結合部分を対象とする。一実施形態において、モノクローナル抗体またはその結合部分は、黄色ブドウ球菌グルコサミニダーゼのＲ３ドメイン内に全体的にまたは部分的に位置するエピトープに特異的に結合する。
本発明の第２の態様は、本発明のモノクローナル抗体または結合部分を発現する細胞株に関する。一実施形態において、細胞株は、ハイブリドーマ細胞株である。別の実施形態において、細胞株は、抗体を発現する組み換え細胞株である。
本発明の第３の態様は、担体と、本発明の１つ以上のモノクローナル抗体または結合部分とを含んでもよい、薬学的組成物に関する。
本発明の第４の態様は、黄色ブドウ球菌感染を有する患者に、本発明のモノクローナル抗体、結合部分または薬学的組成物の有効量を投与する段階を含んでもよい、黄色ブドウ球菌感染を治療する方法に関する。
本発明の第５の態様は、黄色ブドウ球菌の骨感染または関節感染を有する患者に、本発明のモノクローナル抗体、結合部分または薬学的組成物の有効量を投与する段階を含んでもよい、骨髄炎を治療する方法に関する。
本発明の第６の態様は、整形外科用インプラントを必要とする患者に、本発明のモノクローナル抗体、結合部分または薬学的組成物の有効量を投与する段階と、患者に整形外科用インプラントを導入する段階と、を含んでもよい、患者に整形外科用インプラントを導入する方法に関する。本発明の本態様において、モノクローナル抗体、結合部分、または薬学的組成物は、予防剤として作用する。ある実施形態において、本発明の本態様は、全関節再置換手術の間またはその後のＯＭまたは黄色ブドウ球菌再感染を予防することを対象とする。
黄色ブドウ球菌、および特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）といった抗生物質耐性変異株は、ブドウ球菌感染の最も一般的で、かつ困難な原因であるため、本発明の方法は、これらの微生物の増殖サイクルにおける重大なステップを中断させることを目的とする。本発明はまた、患者、例えば、関節全置換術を受ける患者における感染を予防するための受動免疫化に関する。免疫化のために選択された標的は、黄色ブドウ球菌が、有糸分裂の間における細胞の分離である、細胞質分裂を促進するために分泌するグルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）である（Ｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，"Ａ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ ｔｈａｔ ｈａｓ ａｎ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｏｙｌ−Ｌ−Ａｌａｎｉｎｅ Ａｍｉｄａｓｅ Ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ａｎ Ｅｎｄｏ−ｂｅｔａ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ Ｄｏｍａｉｎ：Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，"Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：２８５−９ （１９９５）、Ｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，"Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ Ｇｅｎｅ（ａｔｌ）ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ"Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４２：６５５−９（１９９８）、Ｓｕｇａｉ ｅｔ ａｌ．，"Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ Ｐｅｒｆｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ ｂｙ ａ Ｍａｊｏｒ Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ：ａｔｌ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｏｎｓｅｔ ｏｆ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，"Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７９：２９５８−６２（１９９７）、およびＹａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，"Ａｎ Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ Ｒｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，"Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７８：１５６５−７１（１９９６）、これらは、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）。
黄色ブドウ球菌感染、ＯＭ、および黄色ブドウ球菌感染を対象とした様々な治療法を研究および評価するために、ステンレス鋼ピンを黄色ブドウ球菌で被覆し、脛骨骨幹端を通って皮質間移植する、インプラントに関連するＯＭの新規マウスモデルを使用した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｉｍｐｌａｎｔ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ，Ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｈｕｍｏｒａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，"Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２６（１）：９６−１０５（２００８）、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）。このモデルは、Ｇｒａｍ陽性のバイオフィルム形成、骨溶解、腐骨／被膜形成を伴うＯＭを高い再現性で提供し、そして臨床的ＯＭに酷似している。さらに、細菌のプランクトン増殖期を定量化するためにインビボでのバイオルミネセンスイメージングを使用し、総細菌数を定量するためにリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴＱ−ＰＣＲ）を使用して感染骨組織におけるｎｕｃ遺伝子コピー数を決定し、骨溶解を定量化するためにマイクロＣＴを使用した。
骨髄炎の上記のマウスモデルを使用して、Ｇｍｄに特異的な抗体が、攻撃誘発されたマウスにおいて免疫応答が達成されたことに明白な役割を果たすことが確認されている。加えて、Ｎ末端Ｈｉｓ６を有する組み換えＧｍｄ（Ｇｍｄ−Ｈｉｓ）を含むワクチンは、マウスモデルにおいて、少なくとも部分的免疫を誘発した。抗Ｇｍｄ抗体は、細胞分裂を直接ブロックすることによって、または細胞分裂のサイクルにおける脆弱なポイントにおいて、食細胞もしくは補体といった宿主エフェクタを動員することによってのいずれかで、黄色ブドウ球菌細胞分裂をブロックすることができる。
黄色ブドウ球菌の細胞増殖における、個々のモノクローナル抗体の作用を実証する実験は、添付の実施例において詳細に提示される。具体的な目的は、１種類の抗体が、何らの免疫エフェクタが存在しない状況下で、急速に分裂する黄色ブドウ球菌の増殖を抑制するか、または変化させるかどうかを判定することであった。黄色ブドウ球菌Ｘｅｎ２９株の増殖培養による光散乱計測における増殖に関連した増加率は、５つの選択されたモノクローナル抗体によって低減されたが、それらは、実際にはインビボ増殖率自体を変化させたようではなかった。むしろ、それらは、分裂中の細胞が互いから分離することができない程度までにＧｍｄの活性を低下させたようである。その効果は、用量依存的であり、各抗体とＧｍｄとの間の高いアフィニティーによる相互作用と一致した。これらの効果は、組み換えＧｍｄに対する反応性を上昇させたこれら抗体が、天然型Ｇｍｄとも効果的に反応し、その酵素活性を低下させるということを明らかにする。モノクローナル抗体のうちの１つ、１Ｃ１１は、黄色ブドウ球菌の細胞非依存性溶解を促進する独自の能力を明らかにし、２つのモノクローナル抗体、１Ｃ１１および３Ａ８は、インビボマウスモデルにおける、整形外科用インプラント手術の間のインビボ黄色ブドウ球菌の増殖および感染を阻害する能力を明らかにした。
したがって、本発明内において、いかなる既知の製品、製品を作製するプロセス、または製品を使用する方法も包含しないことが本発明の目的であり、それにより、本出願人は、権利を保有し、かつ本明細書において、いかなるこれまでに既知の製品、プロセス、または方法の免責事項も開示する。本発明は、本発明の範囲内に、ＵＳＰＴＯ（３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２、第１の項）またはＥＰＯ（ＥＰＣの第８３条）の記載および実施可能要件を満たさない、いかなる製品、製品の作製のプロセス、または製品を使用する方法も包含することを意図せず、それにより、本出願人は、権利を保有し、かつ本明細書において、いかなるこれまでに記述された製品、製品を作製するプロセス、または製品を使用する方法の免責事項も開示するということにさらに留意される。
本開示、特に特許請求の範囲および／または項において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等といった用語は、米国特許法において、それに起因する意味を有することができ、例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味することができ、「本質的に〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「本質的に〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」）」といった用語は、米国特許法においてそれらに帰する意味を有することができ、例えば、それらは、明示的に記載されない要素を許容するが、先行技術において見出されるか、または本発明の基本もしくは新規特性に影響する要素を除外するということに留意される。
インプラントに関連する骨髄炎からの骨溶解の定量化を示す。代表的なマウスからの長期的な一連のＸ線写真は、このモデルにおいて、インプラントに関連する骨溶解が時間とともに発生することを示す（図１Ａ）。中間の図は、黄色ブドウ球菌で被覆された下腿ピンを移植され、示された日に殺処理されたマウス（Ｎ＝５）からの代表的な脛骨の再構築μＣΤ（マイクロコンピュータトモグラフィ）画像である（図１Ｂ）。また、黄色ブドウ球菌で被覆された下腿ピンを移植され、非経口ゲンタマイシン（Ｇｅｎｔ）で処理された、または滅菌ピンを移植された対照マウスも示される。ピン周辺の溶骨性領域は、これまでに記述されているように定量化され（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｉｍｐｌａｎｔ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ，Ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｈｕｍｏｒａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，"Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２６（１）：９６−１０５（２００８）、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）、データは、平均＋／−標準偏差（＊ｐ＜０．０５対４日目、＊＊ｐ＜０．０５対Ｇｅｎｔ１８日目）として示される（図１Ｃ）。ゲンタマイシンと滅菌ピン対照との間の骨溶解領域における差は無い。 下腿インプラントに関連するＯＭの組織構造を示す。脛骨皮質（＃）に隣接するピン部位（＊）における組織切片のＨ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオジン染色）（図２Ａ〜Ｃ）、ＴＲＡＰ（酒石酸耐性酸性ホスファターゼ）（図２Ｄ〜Ｆ）、およびグラム染色（図３Ｇおよび３Ｈ）で、滅菌ピン（図２Ａ、２Ｄ、および２Ｇ）、または黄色ブドウ球菌で被覆されたピン（図２Ｂ、２Ｃ、２Ｅ、２Ｆ、および２Ｈ）の移植の９日後である。留意すべきは、滅菌ピン周辺に形成される新たな骨（ｈ）（図２Ａ、２Ｄ、および２Ｇ）に対し、壊死性腐骨（ｓ）、ならびに感染ピンに隣接する被膜（ｉ）である。ＴＲＡＰ＋破骨細胞（黄色の矢印）は、非感染試料においてはほとんど存在しない（図２Ｄ）一方で、多数の破骨細胞が、感染ピンに隣接する皮質を活発に吸収し、被膜を包囲している新たな線維性骨を再形成しているようである（図２Ｅおよび２Ｆ）。グラム染色により、滅菌ピンを用いた標本における細菌の非存在（図２Ｇ）、および感染ピン周辺の壊死性骨内の細菌の存在（黒色矢印）を確認した。 慢性骨髄炎が確立する間の細菌量と、黄色ブドウ球菌抗原に対する液性免疫との間の逆相関を示す。経時的研究を実施し、マウスの脛骨に１×１０６ＣＦＵの黄色ブドウ球菌を含有する感染経皮質ピンを移植し、示された日にマウスを殺処理した。殺処理時、ＤＮＡを感染脛骨から精製し、ＲＴＱ−ＰＣＲを実施して、黄色ブドウ球菌ｎｕｃに対するＣｔ値を決定した。示される標準曲線を使用して、この数値を、脛骨あたりの再現ｎｕｃ遺伝子数に変換した。サンプルの完全性を制御するために、脛骨あたりの再現ｎｕｃ遺伝子数値を、各サンプルのマウスβ−アクチンに対するＣｔ値で標準化した。この変換から、細菌量は、「Ｎｕｃ遺伝子コピー数／脛骨」として導き出された。各マウスからのデータは、個々の点として図３Ａに示され、各時点に対する平均＋／−標準偏差（ｎ＝５）は、図３Ｂに示される。ＯＭ確立の間の抗黄色ブドウ球菌特異的抗体の発現を評価するために、１８日目に殺処置された群の各マウスから、感染前（０日目）、および感染後４、７、１１、１４、および１８日目に血清を採取した。この血清は、図３Ｃに示されるように、黄色ブドウ球菌全抽出物のウエスタンブロットにおける一次抗体として使用し、次いで、マウスＩｇＧ特異的ＨＲＰ修飾抗体でプローブした。データは、宿主が最初に細菌に対する特異的抗体を発現させる０日目から１１日目まで細菌増殖が着実に増加することを示す。抗黄色ブドウ球菌抗体価が増加するにつれて、細菌量が低下する。これは抗体が防御作用を有することを示唆する。ウエスタンブロットはまた、２６、３４、３８、および５６ｋＤａ（矢印）の４つの免疫優勢抗原をはっきりと識別する。さらに、Ｘｅｎ２９株が同じくこれらの同じ２６、３４、３８、および５６ｋＤａタンパク質に対する抗体を誘導するということも示されている。 黄色ブドウ球菌自己分解酵素のグルコサミニダーゼが、５６ｋＤａの免疫優性抗原であることを示す。図３において同定された新規黄色ブドウ球菌抗原の分子属性を解明するために、全細胞抽出物の２Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥのサブトラクティブ免疫ブロット分析を、免疫前および１４日目の免疫血清を用いて実施した。等電点電気泳動の後に、３つの２Ｄゲルを流した（ｐＨ４．０〜１０．０）。１つ目は、クーマシーブルー染色を行った（図４Ａ）。他は、０日目（図４Ｂ）または１４日目の血清（図４Ｃ）のいずれかでウエスタンブロットを行った。バックグラウンド反応に加えて、免疫血清は、特異的ポリペプチド（約５３ｋＤａ、ｐＨ９、矢印）を検出した。５３ｋＤａスポットをクーマシー染色ゲルから取り出し、トリプシンで消化し、ＭＡＬＤＩによって分析した結果、７０個の個々のペプチドピークを決定した。各ペプチドからのアミノ酸配列は、黄色ブドウ球菌自己分解酵素のグルコサミニダーゼの既知の配列と１００％一致し、これは、５３．６ｋＤａであり、９．６６のｐＩを有する。 慢性骨髄炎の確立の間の細菌増殖のバイオルミネセンスイメージング（ＢＬＩ）定量化を示す。図５Ａは、感染部位におけるＢＬＩレベル（ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ）を示し、滅菌下腿ピン（非感染）、またはＸｅｎ２９黄色ブドウ球菌（感染）で被覆されたピンを移植され、示された日に撮像されたマウスにおいて長期的に評価した。左上の画像における円は、各時点、各マウスにおいてＢＬＩで評価された１．５ｃｍ直径の関心領域（ＲＯＩ）をハイライトする。図５Ｂは、非感染であるか、感染した、または感染し非経口抗生物質（ゲンタマイシン）で処理され、かつ、手術後、示された時間に長期的にＢＬＩで評価されたマウス（Ｎ＝５）からのデータを示す。データは、平均＋／−標準偏差として示される（＊０日目に対して有意に上回る、ｐ＜０．０５）。 抗Ｇｍｄ 機能的ＥＬＩＳＡにより、組み換えＧｍｄワクチンの有効性を実証したことを示す。図６Ａは、Ｈｉｓ−Ｇｍｄを抗原として使用し、黄色ブドウ球菌感染マウスより採取された高力価として知られる抗血清から生成されたマウス血清における抗Ｇｍｄ抗体力価を評価するための血清ＥＬＩＳＡを示す。２倍段階希釈血清サンプルの段階希釈率（Ｘ軸）および４５０ｎｍでの吸光度（Ｙ軸）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４ソフトウェアを使用してＸＹ平面にプロットする。機能的力価（１：３６２３）は、希釈曲線の感染点（矢印）から推測される。図６Ｂは、示されるワクチンでの免疫化前、ブースト前、および攻撃誘発前のマウスの血清における、抗Ｇｍｄ抗体の力価判定を行ったＥＬＩＳＡを示す。Ｈｉｓ−Ｇｍｄワクチンで免疫化したマウスのみが、高力価を得たことに留意されたい。 組み換えＨｉｓ−Ｇｍｄワクチンによってインプラントに関連するＯＭからマウスが防御されることを示す。マウス（ｎ＝２０）に、添付の実施例において説明されるように、Ｘｅｎ２９感染下腿ピンで攻撃誘発し、ＢＬＩを３日目に実施し、マウスを、ｎｕｃ ＲＴＱ−ＰＣＲのために１１日目に安楽死させた。群１および３の代表的なマウスからのＢＬＩの画像が示され（図７Ａ）、平均＋／−標準偏差により、ＢＬＩの有意な低減を示すことを提示する（図７Ｂ）。これは、１１日目の増幅可能なｎｕｃ遺伝子（平均＋／−標準偏差）の有意な減少と解釈した（図７Ｃ）。 抗Ｇｍｄモノクローナル抗体（抗Ｇｍｄ ｍＡｂ）の存在下での黄色ブドウ球菌Ｘｅｎ２９のインビトロ増殖を示す。対数増殖期培養からの１００ｃｆｕのＸｅｎ２９を、５０μｇ／ｍＬの抗Ｇｍｄモノクローナル抗体１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、および３Ａ８とともにＬＢ培地にて３７℃でインキュベートした。増殖は、示された間隔で、６７０および４９０ｎｍの両方における光散乱によってモニターした。ＭＯＰＣ２１は、アイソタイプが一致する対照抗体である。 インビトロ黄色ブドウ球菌増殖における、抗Ｇｍｄ ｍＡｂ １Ｃ１１の用量依存的効果を示す。対数増殖期培養からの１００ｃｆｕのＸｅｎ２９を、３７℃で、ＬＢ培地にて、様々な濃度の抗Ｇｍｄ ｍＡｂ １Ｃ１１とともにインキュベートした。増殖は、示された間隔で、６７０および４９０ｎｍの両方における光散乱によってモニターした。 インビトロ黄色ブドウ球菌増殖に対する対照ｍＡｂ ＭＯＰＣ２１の効果を示す。対数増殖期培養からの１００ｃｆｕのＸｅｎ２９を、３７℃で、ＬＢ培地にて、様々な濃度のアイソタイプが一致する対照モノクローナル抗体ＭＯＰＣ２１とともにインキュベートした。増殖は、示された間隔で、６７０および４９０ｎｍの両方における光散乱によってモニターした。５０μｇ／ｍＬ線のわずかな上昇は、温度がより速く平衡化するマイクロタイタープレート上の外側ウェルの使用によるものであることに留意されたい。 ハイブリドーマ２Ｄ１１、３Ｈ６、１Ｅ１２および３Ａ８からのＶＨ配列のＣｌｕｓｔａｌＷアミノ酸配列アラインメントを示す（２Ｄ１１ ＶＨ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３Ｈ６ ＶＨ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１Ｅ１２ ＶＨ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、３Ａ８ ＶＨ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）。ハイライトされた配列は、２Ｄ１１における推定相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す。コンセンサス配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）は、これらのハイブリドーマ配列から得られる。 ハイブリドーマ１Ｅ １２および２Ｄ１１からのＶＬ配列のＣｌｕｓｔａｌＷアミノ酸配列アラインメントを示す（１Ｅ１２ ＶＬ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、２Ｄ１１ ＶＬ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）。コンセンサス配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）は、これらの２つのハイブリドーマ配列から得られる。 ハイブリドーマ２Ｄ１１、３Ｈ６、１Ｅ１２、３Ａ８および１Ｃ１１からのＶＨ配列のＣｌｕｓｔａｌＷアミノ酸配列アラインメントを示す（２Ｄ１１ ＶＨ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３Ｈ６ ＶＨ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１Ｅ１２ ＶＨ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、３Ａ８ ＶＨ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１Ｃ１１ ＶＨ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）。コンセンサス配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）は、これらの５つのハイブリドーマ配列から得られる。 ＶＬ配列のＣｌｕｓｔａｌＷアミノ酸配列アラインメントを示す。図１４Ａは、ハイブリドーマ、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、３Ｈ６および１Ｃ１１のＶＬアラインメントを示す（１Ｅ１２ ＶＬ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、２Ｄ１１ ＶＬ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、３Ａ８ ＶＬ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、３Ｈ６ ＶＬ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１Ｃ１１ ＶＬ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）。コンセンサス配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）は、これらの５つのハイブリドーマ配列から得られる。図１４Ｂは、ハイブリドーマ１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８および３Ｈ６のＶＬアラインメントを示す（１Ｅ１２ ＶＬ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、２Ｄ１１ ＶＬ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；３Ａ８ ＶＬ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、３Ｈ６ ＶＬ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）。コンセンサス配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）は、これらの４つのハイブリドーマ配列から得られる。 ハイブリドーマ３Ａ８および１Ｃ１１からのＶＨ配列のＣｌｕｓｔａｌＷアミノ配列アラインメントを示す（３Ａ８ ＶＨ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１Ｃ１１ ＶＨ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）。コンセンサス配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）は、これらの２つのハイブリドーマ配列から得られる。 ハイブリドーマ３Ａ８および１Ｃ１１からのＶＬ配列のＣｌｕｓｔａｌＷアミノ酸配列アラインメントを示す（３Ａ８ ＶＬ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、１Ｃ１１ ＶＬ＝ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）。コンセンサス配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）は、これらの２つのハイブリドーマ配列から得られる。 図１７Ａは、ヒト遺伝子ＩＧＶ７−８１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＨ３２７３３およびＢＣ０３２７３３を参照し、それら各々は、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる）によってコードされる、同種アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）を有する１Ｃ１１ ＶＨドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）のアラインメントを図解する。ＶＨホモログに対するコンセンサス配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）を示す。図１７Ｂは、ヒト遺伝子ＩＧＶＫ６Ｄ−２１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ５８９１７およびＭ２９４６９を参照し、それら各々は、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる）によってコードされる、同種アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）を有する１Ｃ１１ ＶＬドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアラインメントを図解する。ＶＬホモログに対するコンセンサス配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）を示す。 アイソタイプが一致する陰性対照としてＭＯＰＣ２１を使用し、５つの抗Ｇｍｄモノクローナル抗体による、黄色ブドウ球菌Ｈｉｓ−Ｇｍｄ（Ｇｍｄ）および鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）の阻害を示す。抗体の濃度（μｇ／ｍＬ）をＸ軸に列記し、酵素活性の阻害（パーセンテージ（％））をＹ軸に列記する。全ての５つの抗Ｇｍｄ ｍＡｂ（１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、および３Ｈ６）は、Ｇｍｄ活性を阻害するが、ＨＥＬ活性に対する効果は無く、ＭＯＰＣ２１（陰性対照）は、いずれの酵素も阻害しない。 ５つの抗Ｈｉｓ−Ｇｍｄ ｍＡｂ １Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、および３Ｈ６による天然型Ｇｍｄの阻害を示す。各抗体を、１００μｇ／ｍＬの濃度で添加した。５つ全てが強力な阻害剤であり、それらが組み換えＧｍｄ−Ｈｉｓを阻害するのとほぼ同じ程度まで天然型酵素を阻害する。アイソタイプが一致する（ＩｇＧ１）抗体対照ＭＯＰＣ２１は、Ｇｍｄ酵素活性に対する効果は無かった。 本発明の抗Ｇｍｄモノクローナル抗体の非存在下（図２０Ａ〜Ｂ）、または存在下で増殖させた黄色ブドウ球菌の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。図２０Ｃは、Ｘｅｎ２９黄色ブドウ球菌に対する５０μｇ／ｍｌ ｍＡｂ １Ｅ１２の効果を示し、図２０Ｄは、Ｘｅｎ２９黄色ブドウ球菌に対する５０μｇ／ｍｌ ｍＡｂ １Ｃ１１の効果を示す。代表的な視野の顕微鏡写真は、５０，０００ｘ（ＡおよびＣ）、２，０００ｘ（Ｂ）、ならびに４，０００ｘ（Ｄ）で取得した。抗黄色ブドウ球菌ｍＡｂの補体および免疫エフェクタ細胞非依存的溶解活性は未だ文献において立証されていないのだが、矢印は、溶解が発生した部位を明確にし、本発明の驚くべきかつ予想外の効果を立証している。 モノクローナル抗体３Ａ８を用いた受動免疫化が、黄色ブドウ球菌のインビボ増殖を阻害し、インプラントに関連する骨髄炎からマウスを防御することを示す。マウスは、０、３、５、７、１１、および１４日目に、バイオルミネセンスを評価するために撮像され、各群の代表的な動物からのＢＬＩヒートマップを含む画像を図２１Ａに示す。本研究における各マウスの３日目のＢＬＩ値を、各群に対する平均とともに示す（図２１Ｂ、ｐ＝０．０２）。１４日目に取得した各群における代表的な動物からのＸ線写真により、抗Ｇｍｄ処理動物には存在しなかった、プラセボマウスにおける溶骨性病変（矢印）を図解により示す（図２１Ｃ）。 モノクローナル抗体１Ｃ１１を用いた受動免疫化が、黄色ブドウ球菌のインビボ増殖を阻害し、インプラントに関連する骨髄炎からマウスを防御することを示す。マウスは、０、３、５、７、１０、および１４日目に、バイオルミネセンスを評価するために撮像され、各群の代表的な動物からのＢＬＩヒートマップを含む画像を示す（図２２Ａ）。本研究における各マウスに対する３日目のＢＬＩ値を、各群に対する平均とともに示す（図２２Ｂ）。１４日目に取得した各群における代表的な動物からのＸ線写真が示され、抗Ｇｍｄ処理マウスには存在しなかった、プラセボマウスにおける溶骨性病変（矢印）を図解により示す（図２２Ｃ）。 １Ｃ１１に由来するヒト化キメラモノクローナルと、マウスモノクローナル１Ｃ１１の抗Ｇｍｄ阻害活性を比較するグラフである。１Ｃ１１（ｈ１Ｃ１１）のヒト：マウスキメラＩｇＧ１は、Ｈｉｓ−Ｇｍｄを阻害する能力を保持する。Ｙ軸上のＨｉｓ−Ｇｍｄ活性の阻害率（％）は、Ｘ軸上の抗体調製物希釈の作用として表示される。マウス１Ｃ１１濃度は１０μｇ／ｍＬであり、キメラｈ１Ｃ１１の濃度は、示されるアッセイ法に関しては不明であった。
発明の詳細な説明
一態様において、本発明は、黄色ブドウ球菌グルコサミニダーゼに特異的に結合し、かつ黄色ブドウ球菌のインビボ増殖を阻害する、モノクローナル抗体に関する。本発明のモノクローナル抗体は、メチシリン耐性の黄色ブドウ球菌を標的とするようなものであってもよい。
本明細書に使用される際、用語「抗体」は、天然源由来または組み換え源由来の免疫グロブリン、ならびに免疫グロブリンの免疫反応部分（すなわち、抗原結合部分）を含むように意図される。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、実質的に純粋なモノクローナル抗体、抗体フラグメントまたは結合部分、キメラ抗体、およびヒト化抗体（Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，ＵＳＩＮＧ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を含む、様々な形態で存在してもよく、または単離されてもよい。
本発明のモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌グルコサミニダーゼまたはそのフラグメントに結合する特異性によって特徴付けられる。抗体は、黄色ブドウ球菌自己分解酵素（Ａｔｌ）のグルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）サブユニット中の、免疫優性エピトープに特異的に結合する。これらのモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌のインビボ増殖を阻害する。
免疫優性抗原は、免疫系によって最も容易に認識され、このため、誘導された抗体の特異性に最も影響を与える、抗原決定基の一部である。「免疫優性エピトープ」は、抗原上のエピトープを指し、宿主生命体において、実質的にその抗原上の他のエピトープを除外するような免疫応答を選択的に引き起こす。
通常、免疫優性エピトープを保有する可能性のある抗原は、病原性生命体の外表面上の抗原を選択することによって識別することができる。例えば、真菌類、細菌、およびウイルス等、最も単純な生命体は、病原性生命体の外表面に露出される、１つまたは２つのタンパク質を有する。これらの外表面タンパク質が、適切な抗原を保有する可能性が最も高い。免疫優性エピトープを保有する可能性が最も高いタンパク質は、全タンパク質をゲル上に泳動し、病原性生命体に感染した生命体に由来する血清に対するウエスタンアッセイ法において識別することができる。その血清由来の結合抗体は、例えば、周知のＥＬＩＳＡ技術のうちの１つにおいて、標識化された抗抗体により識別される。免疫優性エピトープは、病原性生命体に感染した宿主生命体からの血清を検査することによって識別することができる。宿主生命体において免疫応答を誘導することができる既知の抗原に結合する抗体の含有量で、その血清を評価する。もし免疫優性エピトープがこれらの抗原中に存在する場合、実質的にその血清中の全抗体が、他の抗原エピトープにほとんど結合することなく、免疫優性エピトープに結合することになる。
Ａｔｌは、黄色ブドウ球菌の独特な触媒活性を有するペプチドグリカン加水分解酵素のうちの１つであり、有糸分裂中における細胞壁の消化に必須である（Ｂａｂａ ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，"Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｍｕｒａｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｓｉｔｅ ｏｆ Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｒｅｐｅａｔ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｒｉｎｇ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，"ＥＭＢＯ．Ｊ．１７（１６）：４６３９−４６（１９９８）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。増殖の必須遺伝子であることに加えて、走査電子顕微鏡により、黄色ブドウ球菌に結合する抗Ａｔｌ抗体が、二分裂中、細菌の細胞壁に覆われていない部位に局在することを明らかにしている（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，"Ａｎ Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ Ｒｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，"Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８（６）：１５６５−７１（１９９６）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
Ａｔｌ酵素は、開裂プロセスを介して同じＡｔｌ前駆タンパク質から産生される、アミダーゼ（６２ｋＤ）およびグルコサミニダーゼ（５３ｋＤ）を含む（Ｂａｂａ ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，"Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｍｕｒａｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｓｉｔｅ ｏｆ Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｒｅｐｅａｔ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｒｉｎｇ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，"Ｅｍｂｏ．Ｊ．１７（１６）：４６３９−４６（１９９８）、Ｋｏｍａｔｓｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍａｊｏｒ Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ，ＡＴＬ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，"Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：４６９−７９（１９９７）、Ｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，"Ａ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ Ｔｈａｔ Ｈａｓ ａｎ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｏｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ Ａｍｉｄａｓｅ Ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ａｎ Ｅｎｄｏ−ｂｅｔａ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ Ｄｏｍａｉｎ：Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２（１）：２８５−９（１９９５）、これらは、全体として参照することによって、本明細書に組み込まれる）。この自己分解酵素は、３つの約１５０アミノ酸の細胞壁結合ドメインＲ１、Ｒ２、およびＲ３によって、細胞壁に保持される。最終の成熟ステップにおいて、タンパク質分解開裂が、アミニダーゼドメインならびにその関連するＲ１およびＲ２ドメインを、グルコサミニダーゼおよびその関連するＮ末端Ｒ３ドメインから分離する。
例示であり限定するものではなく、１つの例示的な黄色ブドウ球菌グルコサミニダーゼは、以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６のアミノ酸配列を含む。
Figure 2013533210
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６において、下線の残基は、コードされた自己分解酵素の７８３〜９３１残基に対応し、Ｒ３ドメインを表す。残りのＣ末端残基（下線なし）は、触媒グルコサミニダーゼドメインに対応する。
ある実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、１０−９Ｍを上回るアフィニティーで、黄色ブドウ球菌グルコサミニダーゼの保存されたエピトープに結合する。本明細書で使用される際、「エピトープ」は、モノクローナル抗体によって認識される、黄色ブドウ球菌グルコサミニダーゼの抗原決定基を指す。本発明の抗体によって認識されるエピトープは、直鎖エピトープ、すなわち、グルコサミニダーゼのアミノ酸配列の一次構造であってもよい。あるいは、本発明の抗体によって認識されるエピトープは、非直鎖または立体配座のエピトープ、すなわち、グルコサミニダーゼの三次構造であってもよい。
ある実施形態において、モノクローナル抗体は、Ｇｍｄの触媒ドメインに特異的に結合することができる。他の実施形態において、モノクローナル抗体は、Ｒ３ドメインに特異的に結合することができる。
本明細書において特定される５つのモノクローナル抗体が結合するエピトープは、Ｒ３ドメイン内に全体的にまたは少なくとも部分的に位置する。例示として、ｍＡｂ ３Ａ８が結合するエピトープは、７７６〜８４２残基を含む領域内に位置し、ｍＡｂ １Ｃ１１が結合するエピトープは、８４２〜８７３残基を含む領域内に位置し、ｍＡｂ ２Ｄ１１および１Ｅ１２が結合するエピトープ（１つまたは複数）は、同じか、または異なり、８４２〜９４８残基を含む領域内に位置し、ｍＡｂ ３Ｈ６が結合するエピトープは、９０７〜９４８残基を含む領域内に位置する。
ある実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌Ｇｍｄ阻害活性を有し、この場合、そのモノクローナル抗体はＧｍｄの活性を少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％阻害する。他の実施形態において、そのモノクローナル抗体はＧｍｄの活性を少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％阻害する。本明細書に記載の５つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ ３Ａ８、１Ｃ１１、２Ｄ１１、１Ｅ１２、および３Ｈ６）は、約７０〜約８０パーセントの抗Ｇｍｄ阻害活性を有する。本発明の抗体が、酵素活性を阻害する触媒ドメインではなく、細胞壁結合ドメインであるとされるＲ３ドメインに結合することは、予想外であり驚くべき結果である。理論に制約されるものではなく、本発明の抗体のＲ３ドメインへの結合は、グルコサミニダーゼの触媒ドメインの立体配座的または静電気的な変化をもたらすと考えられる。
Ｇｍｄ活性の阻害は、インビトロで測定することができる。１つの方法として、最初にＧｍｄの力価を事前測定し、６０分後にＡ４９０において約５０％の低減をもたらす濃度を確定する。次いで、ＰＢＳＴに希釈した５０μＬの抗体を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、続いて、５０μＬの適切に希釈されたＧｍｄを添加し、混合液を５分間以上インキュベートし、最後に１００μＬの０．１５％ｍＬを添加し、開始Ａ４９０を測定する。プレートを３７℃でインキュベートし、Ａ４９０を３０分および６０分において測定する。阻害パーセントを、１００×（１−（Δ６０Α４９０阻害剤／Δ６０Α４９０阻害剤無しの対照））として算出する。
ある実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌の密集もしくは凝集、黄色ブドウ球菌の細胞非依存性溶解、またはその両方をもたらす活性を有する。黄色ブドウ球菌の凝集をもたらす活性を有する抗体の例には、モノクローナル抗体１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、および３Ｈ６が挙げられるが、これらに限定されない。溶解性抗体の一例は、モノクローナル抗体１Ｃ１１である。この抗体は、Ｒ３ドメイン中に存在する特有のエピトープに結合し、約７０〜約８０パーセントのＧｍｄ阻害活性を示し、黄色ブドウ球菌の細胞非依存性溶解を促進する。
本発明のモノクローナル抗体はまた、黄色ブドウ球菌のインビボ増殖を阻害する。黄色ブドウ球菌のインビボ増殖の阻害は、多数の適切な標準法に従って、測定することができる。１つのそのような実施形態において、黄色ブドウ球菌のインビボ増殖は、添付の実施例に記載の種類のバイオルミネセンスアッセイ法に従って評価することができる。具体的には、発光黄色ブドウ球菌（Ｘｅｎ２９、ＡＴＣＣ １２６００）（Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｍｉｃｅ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｎｏｖｅｌ ｌｕｘＡＢＣＤＥ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８（６）：３５９４−６００（２０００）、また、Ｃｏｎｔａｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｈｏｔｏｎｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｈｏｓｔｓ，"Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８（４）：５９３−６０３（１９９５）も参照されたく、これらの各々は、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる）を、使用し、手術による移植の前に、下腿インプラントに５００，０００ＣＦＵで投与する。５週齢のメスＢＡＬＢ／ｃＪマウスに、手術の３日前に、生理食塩水（ｎ＝１０）、または０．２５ｍｌの生理食塩水に溶解した１ｍｇの精製抗体を腹腔内注射してもよい。様々な日にち（例えば、０、３、５、７、１１、および１４）においてマウスを撮像して、発光を評価し、ＢＬＩの比較画像により、生理食塩水対照に対して、抗体が黄色ブドウ球菌のインビボ増殖を阻害するかどうかを比較評価することができる。
一実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、以下のアミノ酸配列のうちの１つを含む、ＶＨドメインを含む：
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸である
Figure 2013533210
、または
Figure 2013533210
、または
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸である
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、図１３を参照）
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、図１１を参照）
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、図１５を参照）
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、図１７Ａを参照）
Figure 2013533210
。
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、以下のアミノ酸配列のうちの１つを含むＶＬドメインを含む：
Figure 2013533210
、または
Figure 2013533210
、または
Figure 2013533210
、または
Figure 2013533210
、または
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、図１４Ａを参照）
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、図１６を参照）
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、図１２を参照）
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、図１４Ｂを参照）
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、図１７Ｂを参照）
Figure 2013533210
。
本発明の抗体はまた、合成抗体であってもよい。合成抗体は、組み換えＤＮＡ技術を使用して作製される抗体、例えば、バクテリオファージによって発現される抗体等である。あるいは、合成抗体は、本発明の抗体をコードもしくは発現させるＤＮＡ分子の合成、または抗体を特定するアミノ酸の合成によって作製され、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当該技術分野で利用可能であり周知の合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られる。
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト化されることができる。ヒト化抗体は、可変領域内に、最小限の非ヒト（例えば、マウス）抗体由来の配列を含む抗体である。このような抗体は、被験者に投与した際の抗原性およびヒト抗マウス抗体の反応を減弱させ、治療に使用される。実際には、ヒト化抗体は、一般的に、最小限から全く無しまでの非ヒト配列を有するヒト抗体である。ヒト抗体は、ヒトにより産生されるか、またはヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。
抗体は、ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、所望の特異性、アフィニティー、および能力を有する非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター等）のものと置換することによって、ヒト化することができる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ａ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｗｉｔｈ Ｔｈｏｓｅ Ｆｒｏｍ ａ Ｍｏｕｓｅ，"Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，"Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｇｒａｆｔｉｎｇ ａｎ Ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、これらは、全体として参照することによって、本明細書に組み込まれる）。ヒト化抗体を、抗体の特異性、アフィニティー、および／または能力をさらに改良するためおよび最適化するために、Ｆｖ構造領域中、および／または置換された非ヒト残基内のいずれかにおける追加の残基の置換によって、さらに修飾することができる。
ヒト化抗体は、当該技術分野で既知の様々な技術を使用して産生することができる。インビトロで免疫化されたか、または免疫個体から単離され、対象とする抗原に対する抗体を産生する不死化ヒトＢリンパ球が作製できる（例えば、Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ ７７（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ ｅｄ．，１９８５）、およびＧａｒｒａｒｄへの米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたく、それらは、全体として参照することによって、本明細書に組み込まれる）。また、ヒト化抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択することもできる。（Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ Ｓｕｂ−Ｎａｎｏｍｏｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ Ｌａｒｇｅ Ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｙ，"Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０９−３１４（１９９６）、Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌａｒｇｅ Ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｙ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｈｕｍａｎ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：６１５７−６１６２（１９９８）、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，"Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｒｏｍ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｏｆ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ＶＨ Ｇｅｎｅ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ Ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，"Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−８（１９９２）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｖ−ｇｅｎｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ Ｐｈａｇｅ，"Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７（１９９１）、これらは、全体として参照することによって、本明細書に組み込まれる）。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスにて作製することもでき、該トランスジェニックマウスは免疫を受けた際に内因性の免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の全レパートリーを産生することができる。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉらに対する米国特許第５，５４５，８０７号、Ｌｏｎｂｅｒｇらに対する同第５，５４５，８０６号、Ｌｏｎｂｅｒｇらに対する同第５，５６９，８２５号、Ｌｏｎｂｅｒｇらに対する同第５，６２５，１２６号、Ｌｏｎｂｅｒｇらに対する同第５，６３３，４２５号、およびＬｏｎｂｅｒｇらに対する同第５，６６１，０１６号に記載され、これらは、全体として参照することによって、本明細書に組み込まれる。
１Ｃ１１のＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列を使用したＧｅｎｂａｎｋのＢＬＡＳＴサーチに基づいて、ヒトゲノム内の同種配列を、それぞれ、ＩＧＶＨ７−８１およびＩＧＶＫ６Ｄ−２１として同定した。これらの同種ＶＨおよびＶＬドメイン（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９および２０）と、対応する１Ｃ１１ ＶＨおよびＶＬドメインとのアラインメントを、それぞれ図１７Ａ〜Ｂに図示する。ＶＨおよびＶＬドメインは、相同領域（すなわち、ＶＨのＣＤＲ３Ｈ領域を除いて）全体で、それぞれ約７５％および６７％もの驚くほどに高度な同一性を共有する。これらのＩＧＶＨ７−８１およびＩＧＶＫ６Ｄ−２１配列は、実質的に純粋な本発明のモノクローナル抗体の調製に使用することができる。ＣＤＲ３Ｈは、ＶＨ遺伝子によってコードされていないため、好適なＤ領域を、欠落したドメイン領域へとスプライスする必要がある。いくつかの対象Ｄ領域候補のうちの任意の１つを使用することができる（例えば、ＩＧＨＤ５−５、１８、または１２＊０１）。
抗体全体に加えて、本発明は、このような抗体の結合部分も包含する。このような結合部分には、一価のＦａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント（例えば、一本鎖の抗体、ｓｃＦｖ）、および単一可変ＶＨおよびＶＬドメイン、ならびに二価のＦ（ａｂ′）２フラグメント、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、二量体、三量体、ミニボディ等が挙げられる。これらの抗体フラグメントは、Ｊａｍｅｓ Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ９８−１１８（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８３）およびＥｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）、Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ：Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｎ Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｎ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ Ｆｖ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３（１９８８）、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６（１９８８）に記載され、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる、タンパク質分解フラグメント化法等の従来法、または当該技術分野で既知の他の方法によって作製することができる。
特に抗体フラグメントの場合においては、血中半減期を増加させるように抗体を修飾することが、さらに望ましい場合がある。これは、例えば、抗体フラグメント中の適切な領域の変異によりサルベージ受容体結合エピトープを抗体フラグメントに組み込むことによって、またはペプチドタグにエピトープ結合部位を組み込み、それが抗体フラグメントの末端または中間のいずれかに融合することによって（例えば、ＤＮＡまたはペプチド合成によって）、達成することができる。
抗体模倣体もまた、本発明による使用に好適である。多数の抗体模倣体が、当該技術分野において既知であり、１０番目のヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）から得られるモノボディとして既知のもの（Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｄｏｍａｉｎ ａｓ ａ Ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４：１１４１−１１５１（１９９８）、Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｒｏｂｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｕｓｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１２５３−１２５８（２００２）、これらの各々は、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる）、およびブドウ球菌プロテインＡの安定アルファへリックス細菌受容体ドメインＺに由来する、アフィボディとして既知のもの（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，"Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ａｎ ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｄｏｍａｉｎ，"Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（８）：７７２−７７７（１９９７）、これは、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる）等が挙げられるが、これらに限定されない。
これらの抗体模倣体の調製において、ＶＨおよび／またはＶＬ鎖のＣＤＲ配列は、これらの抗体模倣体の可変ループ領域へグラフトすることができる（推定ＣＤＲドメインについては、図１１および１７を参照されたい）。グラフトは、少なくとも２つのアミノ酸残基から、ＣＤＲ配列の置換とともに特定のループ領域に現れる１つのアミノ酸残基を除いて実質的に全ての欠失を伴う場合がある。挿入は、例えば、特定のループ領域の１つ以上の位置におけるＣＤＲドメインの挿入であってもよい。本発明の抗体模倣体は、好ましくは、本出願において開示されるＶＨおよび／またはＶＬ鎖配列に対して、少なくとも５０％のホモログであるアミノ酸配列を有する。ポリペプチドにおける、欠失、挿入、および置換は、既知のヌクレオチド配列（以下を参照）から出発する組み換え技術を使用して達成することができる。
モノクローナル抗体産生のための方法は、本明細書に記載の技術または当該技術分野で周知の他の技術を使用して達成することができる（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ−ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ（Ｍａｒｙ Ａ．Ｒｉｔｔｅｒ ａｎｄ Ｈｅａｔｈｅｒ Ｍ．Ｌａｄｙｍａｎ ｅｄｓ．，１９９５）、これは、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる）。一般的に、そのプロセスは、目的の抗原（すなわち、黄色ブドウ球菌グルコサミニダーゼまたはそのペプチドフラグメント）で事前に免疫された哺乳動物の脾臓から、免疫細胞（リンパ球）を得ることを伴う。
抗体分泌リンパ球は、次に、細胞培養において無限に複製することができるミエローマ細胞あるいは形質転換細胞と融合され、このことにより、不死の免疫グロブリン分泌細胞株を産生することができる。哺乳動物のミエローマ細胞との、または細胞培養において無限に複製する能力のある他の融合パートナーとの融合は、標準的な周知の技術、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の融合剤を使用することによって達成される（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｋｏｈｌｅｒ，"Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ Ｌｉｎｅｓ ｂｙ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ，"Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる）。不死の細胞株は、好ましくはマウスではあるが、他の哺乳動物種の細胞に由来してもよい。不死の細胞株は、特定の栄養素の利用に必要な酵素を欠如するよう、急速に増殖できるよう、および良好な融合能力を有するよう選択される。得られる融合細胞、またはハイブリドーマは培養され、その結果として得られるコロニーは、所望のモノクローナル抗体の産生によりスクリーニングされる。このような抗体を産生するコロニーをクローン化し、インビボまたはインビトロいずれかで増殖させ、多量の抗体を産生させる。
したがって、本発明の第２の態様は、本発明のモノクローナル抗体を発現する細胞株に関する。一実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、または３Ｈ６と呼ばれる、ハイブリドーマ細胞株によって産生される。別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体（またはその結合部分）は、組み換え細胞または組み換え細胞株によって産生される。
上述のように、モノクローナル抗体は、Ｃａｂｉｌｌｙらに対する米国特許第４，８１６，５６７号に記載され、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる、組み換えＤＮＡ方法を使用して作製することができる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅させる、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲによって成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞から単離される。重鎖および軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドは、次に、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞に形質移入される際、モノクローナル抗体を発現および分泌する宿主細胞を生成する、好適な発現ベクターにクローニングされる。さらに、所望の種の組み換えモノクローナル抗体またはそのフラグメントを、ファージディスプレイライブラリーから単離することができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ，"Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０）、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｍａｋｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，"Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８（１９９１）、およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｂｙ−Ｐａｓｓｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｖ−Ｇｅｎｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ Ｐｈａｇｅ，"Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、これらは、全体として参照することによって、本明細書に組み込まれる）。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を含む。一実施形態において、核酸はＤＮＡである。このようなＤＮＡ配列の例は、本発明のＶＨおよび／またはＶＬコード配列を含むものである。ハイブリドーマ２Ｄ１１ ＶＨ（最も近似する生殖細胞系列：Ｊ５５８．１８．１０８）をコードするＤＮＡ配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）を有する。
Figure 2013533210
ハイブリドーマ３Ｈ６ ＶＨ（最も近似する生殖細胞系列：Ｊ５５８．１８．１０８）をコードするＤＮＡ配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）を有する。
Figure 2013533210
ハイブリドーマ１Ｅ１２ ＶＨ（最も近似する生殖細胞系列：７１８３．４６ ＶＨ７）をコードするＤＮＡ配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）を有する。
Figure 2013533210
ハイブリドーマ３Ａ８ ＶＨ（最も近似する生殖細胞系列：ＶＨＪ６０６．４．８．２）をコードするＤＮＡ配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）を有する。
Figure 2013533210
ハイブリドーマ１Ｃ１１ ＶＨ（最も近似する生殖細胞系列：ＶＨ ９−１５、ＤＳＴ４−Ｃ５７Ｂ１−６、ＪＨ３）をコードするＤＮＡ配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）を有する。
Figure 2013533210
２Ｄ１１ ＶＬ（最も近似する生殖細胞系列：ａｔ４）をコードするＤＮＡ配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）を有する。
Figure 2013533210
３Ｈ６ ＶＬ（最も近似する生殖細胞系列：ｃｐ９、ＪＫ１）をコードするＤＮＡ配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）を有する。
Figure 2013533210
１Ｅ１２ ＶＬ（最も近似する生殖細胞系列：ａｉ４）をコードするＤＮＡ配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）を有する。
Figure 2013533210
３Ａ８ ＶＬ（最も近似する生殖細胞系列：ＫＶ １９−２５、ＪＫ２）をコードするＤＮＡ配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）を有する。
Figure 2013533210
１Ｃ１１ ＶＬ（最も近似する生殖細胞系列：ＶＫ２３−４３、ＪＫ５）をコードするＤＮＡ配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）を有する。
Figure 2013533210
本発明のなおもさらなる態様は、本発明の抗体または結合部分をコードするＤＮＡ分子、ＤＮＡ分子の５′に操作可能に連結するプロモーター有効性ＤＮＡ分子、およびＤＮＡ分子の３′に操作可能に連結する転写終結ＤＮＡ分子を含む、ＤＮＡ構築物である。本発明はまた、本発明のＤＮＡ構築物が挿入されている発現ベクターを包含する。本発明のポリペプチドの合成遺伝子は、突然変異を容易にするために便利な制限部位を含み、かつ高レベルのタンパク質発現に特定のコドンを使用するように、設計することができる（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ｃｏｄｏｎ Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｌｏｔ：Ｇｒａｐｈｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｄｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，"Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：５３９−５４９ （１９８４）、これは、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる）。
遺伝子は、以下のように組み立てることができる。まず、遺伝子配列は、設計された制限部位の境界で、複数の部分に分割可能であり、各部分に対して、逆鎖をコードして、約１５個の塩基の相補的重複を有する１組のオリゴヌクレオチドを合成することができ、その２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングして、一本鎖領域を、ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントを使用して埋め（ｆｉｌｌ ｉｎ）、二重鎖のオリゴヌクレオチドを、フラグメント末端の制限酵素部位を使用して、たとえばｐＥＴ３ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）等のベクター内にクローニングすることができ、その配列は、ＤＮＡシークエンサーによって確認することができ、これらのステップは、全遺伝子を得るために、各部分で繰り返されてもよい。このアプローチは、１ステップのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法よりも、遺伝子のアセンブルに時間がかかる（Ｓａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，"Ｄｕａｌ Ａｓｙｍｅｔｒｉｃ ＰＣＲ：Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｓ，"ＢｉｏＴｅｃｈ．１２：１４−１６（１９９２）、これは、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる）。Ｔａｑポリメラーゼによる低いフィデリティの複製によって突然変異がもたらされる可能性があり、多大な時間を必要とする遺伝子編集が必要となる。組み換えＤＮＡ操作を、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ＆ ＲＵＳＳＥＬＬ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（２ｄ ｅｄ．１９８９）に従って実行することができ、これは、別段の指定がない限り、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる。当該技術分野で周知のように、１ステップのＰＣＲ中の突然変異の発生を避けるために、高フィデリティ／低エラーのポリメラーゼを採用することができる。
所望の突然変異は、カセット式変異誘発、オリゴヌクレオチド部位指向性変異誘発技術（Ｄｅｎｇ ＆ Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，"Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｖｉｒｔｕａｌｌｙ ａｎｙ Ｐｌａｓｍｉｄ ｂｙ Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ａ Ｕｎｉｑｕｅ Ｓｉｔｅ，"Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００：８１−８８（１９９２）、これは、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる）、またはＫｕｎｋｅｌ変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，"Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：４８８−４９２（１９８５）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，"Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，"Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７−３８２（１９８７）、これらは、全体として参照することによって、本明細書に組み込まれる）のいずれかを使用して、本発明のポリペプチド配列に導入することができる。
カセット式変異誘発および部位指向性変異誘発のいずれも、特に望ましいヌクレオチドコード配列を作製するために使用することができる。カセット式変異誘発は、上述の遺伝子構築と同じプロトコールを使用して実行することができ、新しい配列をコードする二重鎖ＤＮＡフラグメントを、好適な発現ベクター内にクローニングすることができる。多くの変異は、新たな合成鎖（コード変異）と、遺伝子合成のために使用されるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによって行うことができる。本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列へ突然変異を導入するために利用されるアプローチにかかわらず、塩基配列解析を実行して、設計された突然変異（かつ、他の突然変異ではない）が、変異誘発反応によって導入されたことを確認することができる。
対照的に、Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発を利用して、スクリーニング用のポリペプチドの組み合わせライブラリーを作製するために使用可能な、複数の変異型ポリペプチドコード配列をランダムに産生することができる。基本的には、標的化されたループ領域（またはＣ末端もしくはＮ末端のテール領域）は、ＮＮＫコドン（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、およびＣの混合を表し、Ｋは、ＧおよびＴの混合を表す）を使用して、ランダム化することができる（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，"Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，"Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２（１９８７）、これは、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる）。
本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子を調製するために使用するアプローチにかかわらず、核酸は、従来の組み換えＤＮＡ技術を使用して宿主細胞に組み込むことができる。一般的に、これは、ＤＮＡ分子が異種である（すなわち、通常は存在しない）発現系にＤＮＡ分子を挿入することを伴う。異種ＤＮＡ分子を、センス方向および正確なリーディングフレームで、発現系または発現ベクターに挿入する。ベクターは、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素（プロモーター、サプレッサー、オペレーター、転写終結配列等）を含む。組み換え遺伝子または組み換えＤＮＡ構築物は、発現ベクターへのそれの挿入前に調製することができる。例えば、従来の組み換えＤＮＡ技術を使用して、プロモーター有効性ＤＮＡ分子は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子の５′に操作可能に連結可能であり、転写終結（すなわち、ポリアデニル化配列）を、その３′に操作可能に連結させることができる。
本発明の本態様に従い、本発明のポリヌクレオチドは、分子が異種の発現系または発現ベクターに挿入することができる。異種核酸分子は、プロモーターおよび任意の他の５′調節分子に対し適正なセンス（５′→３′）方向、ならびに正確なリーディングフレームで、発現系または発現ベクターに挿入することができる。核酸構築物の調製は、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ＆ ＲＵＳＳＥＬＬ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）によって記載される、当該技術分野で既知の標準的なクローニング方法を使用して実行することができ、それは、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる。ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙｅｒに対する米国特許第４，２３７，２２４号もまた、制限酵素開裂およびＤＮＡリガーゼのライゲーションを使用して、組み換えプラスミドの形態における発現系の作製を記載し、それは、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる。
好適な発現ベクターには、宿主細胞と互換性のある種から誘導されるレプリコンおよび制御配列を含むものが挙げられる。例えば、大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、またはｐＢＲ３２２等のプラスミドを使用することができる。昆虫宿主細胞を使用する場合、昆虫宿主細胞と互換性のある適切な移入ベクターには、所望のタンパク質に融合される分泌シグナルを組み込むｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＡｃＧＰ６７、およびｐＡｃＳｅｃＧ２Ｔ、ならびにＧＳＴおよび６ｘＨｉｓタグ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を含むｐＡｃＧＨＬＴおよびｐＡｃＨＬＴが挙げられる。本発明の本態様の実施における使用に好適なウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクチニアウイルスベクター、ノダウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターが挙げられる。他の好適な発現ベクターは、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ＡＮＤ ＲＵＳＳＥＬＬ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載され、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる。核酸の操作、例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、シークエンシング、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析のための多数の既知の技術およびプロトコールは、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆｒｅｄ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２００３）に詳細に記載され、これは、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる。
異なる遺伝子シグナルおよびプロセッシング事象が、様々なレベルの遺伝子発現（例えば、ＤＮＡ転写およびメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）翻訳）、およびそれに引き続く、宿主細胞によって産生および発現される抗体または抗体フラグメントの量を制御する。ＤＮＡの転写は、プロモーターの存在に依存し、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼの結合対象であり、それによりｍＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列である。プロモーターは、それらの「強度」（すなわち、転写を促進するそれらの能力）が異なる。クローン遺伝子を発現させる目的では、高レベルの転写、したがって、発現を得るために、強力なプロモーターを使用することが望ましい。利用する宿主系に応じて、多数の好適なプロモーターのうちの任意の１つを使用することができる。例えば、大腸菌、そのバクテリオファージ、またはプラスミドを使用する場合、Ｔ７ファージプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、大腸菌ファージλのＰＲおよびＰＬプロモーター、およびｌａｃＵＶ５、ｏｍｐＦ、ｂｌａ、ｌｐｐ等を含むがこれらの限定されないその他のプロモーターを、隣接するＤＮＡセグメントを高レベルに転写させるために使用することができる。さらに、組み換えＤＮＡ技術または他の合成ＤＮＡ技術によって産生される、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５（ｔａｃ）プロモーターまたは他の大腸菌プロモーターを、挿入された遺伝子の転写を提供するために使用することができる。昆虫細胞を使用する場合、好適なバキュロウイルスプロモーターには、３９Ｋタンパク質プロモーターまたは塩基性タンパク質プロモーター等の後期プロモーター、ならびにｐ１０およびポリヘドロンプロモーター等の超後期プロモーターが挙げられる。いくつかの場合においては、複数のバキュロウイルスプロモーターを含む移入ベクターを使用することが望ましい場合がある。哺乳類細胞内で発現させるのに好適な一般的なプロモーターには、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥｌａ、ＣＭＶ、ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ、免疫グロブリン重鎖プロモーターおよびエンハンサー、ならびにＲＳＶ−ＬＴＲが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターは、構造的、または、代替的に、組織特異的または誘発性であってもよい。さらに、いくつかの状況においては、誘発性（ＴｅｔＯｎ）プロモーターが使用されてもよい。
原核生物におけるｍＲＮＡの翻訳は、真核生物のものとは異なる、適切な原核生物シグナルの存在に依存する。原核生物におけるｍＲＮＡの効果的な翻訳は、ｍＲＮＡ上に、シャインダルガーノ（「ＳＤ」）配列と称されるリボソーム結合部位を必要とする。この配列は、開始コドン、通常はＡＵＧ、の前に配置される短いｍＲＮＡヌクレオチド配列であり、タンパク質のアミノ末端メチオニンをコードする。ＳＤ配列は、１６Ｓ ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）の３′末端に相補的であり、ｒＲＮＡとともに二重鎖となることによってリボソームの正確な位置調整を可能にし、ｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進する。遺伝子発現の最大化の概説については、Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｌａｕｅｒ，"Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ａ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｕｓｉｎｇ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，"Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８：４７３−８２（１９７９）を参照し、これは、全体として参照することによって、本明細書に組み込まれる。
本発明はまた、本発明のＤＮＡ構築物で形質転換された宿主細胞を含む。宿主細胞は、原核生物または真核生物であってもよい。本発明のポリペプチドを発現させるのに好適な宿主細胞は、広く入手可能なグラム陰性菌のいずれか１つを含む。好適な微生物には、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ菌性胃腸炎（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）（チフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｉｒｉｕｍ））、チフス菌（Ｓ． ｔｙｐｈｉ）、腸炎菌（Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ソンネ赤痢菌（Ｓ． ｓｏｎｎｉｅ）、志賀赤痢菌（Ｓ． ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｈ． プルロニューモニエ（Ｈ． ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、Ｐ． マルトシダ（Ｐ． ｍｕｌｔｉｌｏｃｉｄａ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、Ｔ． デンティコラ（Ｔ． ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、Ｔ． オラーレ（Ｔ． ｏｒａｌｅｓ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア菌種（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐｐ．）、レプトスピラ・インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｐ． ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、Ｐ． モルガニー（Ｐ． ｍｏｒｇａｎｉｉ）、Ｐ． ミラビリス（Ｐ． ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒ．ｔｙｐｈｉ）、斑点熱リケッチア（Ｒ． ｒｉｃｈｅｔｔｓｉｉ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）（バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ））ジンジバリス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、トラコーマクラミジア（Ｃ． ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、Ｃ． インターメディウス（Ｃ． ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｓ）、Ｃ． フィタス（Ｃ． ｆｅｔｕｓ）、ヘリコバクターピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｉｓｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉｅ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、ブタ流産菌（Ｂ． ｓｕｓｉ）、ヤギ流産菌（Ｂ． ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、イヌ流産菌（Ｂ． ｃａｎｉｓ）、鼠咬症スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍｉｎｕｓ）、鼻疽菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｌｅｉ）、エロモナス・ヒドロフィア（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、Ａ． サルモニシダ（Ａ． ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、およびペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）が挙げられる。
細菌細胞に加えて、動物細胞、特に哺乳類および昆虫細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、または藻細胞もまた、本発明の単離ポリヌクレオチド分子を保有する組み換え発現ベクターの形質移入／形質転換に好適な宿主細胞である。当該技術分野で広く使用される哺乳類細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＣＯＳ細胞、およびその他多数が挙げられる。好適な昆虫細胞株には、Ｓｆ９およびＳｆ２１細胞を含む、バキュロウイルスに感染しやすいものが挙げられる。
発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換／形質移入する方法は、当該技術分野で周知であり、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ＆ ＲＵＳＳＥＬＬ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載のように、選択される宿主系に依存する。細菌細胞については、好適な技術には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを使用した形質移入が挙げられる。真核細胞について、好適な技術には、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介形質移入、およびレトロウイルスまたは任意の他のウイルスベクターを使用した形質導入が挙げられる。昆虫細胞については、本発明のポリヌクレオチド構築物を含む移入ベクターは、ＡｃＮＰＶ等のバキュロウイルスＤＮＡと共に形質移入されて、組み換えウイルスの産生を促進する。その後に続くＳｆ細胞の組み換えウイルス感染は、高い組み換えタンパク質産生率をもたらす。タンパク質産生を促進するために使用される発現系および宿主細胞に関わらず、本発明の発現された抗体、抗体フラグメント、または抗体模倣体は、当該技術分野で既知であり、ＰＨＩＬＩＰ Ｌ．Ｒ．ＢＯＮＮＥＲ，ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ ２００７）に記載され、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる、標準的な精製方法を使用して、容易に精製することができる。
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド（１つまたは複数）は、代替の抗体を作製するために、組み換えＤＮＡ技術を使用して、さらに修飾されてもよい。例えば、軽鎖および重鎖のマウスモノクローナル抗体の定常ドメインを、上述のように、ヒト抗体のそれらの領域に置換し、ヒト化（またはキメラ）抗体を作製することができる。あるいは、軽鎖および重鎖のマウスモノクローナル抗体の定常ドメインを、非免疫グロブリンポリペプチドに置換して、融合抗体を作製することができる。他の実施形態において、定常領域は、モノクローナル抗体の所望の抗体フラグメントを作製するために、切断または除去される。さらに、可変領域の部位特異的または高密度の変異誘発を使用して、モノクローナル抗体の特異性およびアフィニティーを最適化してもよい。
本発明の第３の態様は、担体と、本発明による１つ以上のモノクローナル抗体または１つ以上のそれらの結合部分とを含む薬学的組成物に関する。この薬学的組成物は、２つ以上の抗体または結合フラグメントを含むことができ、この場合において、全ての抗体あるいは結合フラグメントは同じエピトープを認識する。あるいは、本薬学的組成物は、抗体または結合フラグメントの混合物を含んでいても良く、この場合において、１つ以上の抗体または結合フラグメントが、黄色ブドウ球菌Ｇｍｄの１つのエピトープを認識し、１つ以上の抗体または結合フラグメントが、黄色ブドウ球菌Ｇｍｄの異なるエピトープを認識する。例えば、混合物は、黄色ブドウ球菌グルコサミニダーゼのＲ３ドメインに特異的に結合する本発明の１つ以上の抗体と、グルコサミニダーゼに結合する任意の他の抗体、例えば、グルコサミニダーゼの触媒ドメインに結合する抗体との組み合わせで、含んでもよい。本発明の薬学的組成物は、以下に記載のように、薬学的に許容される担体または他の薬学的に許容される構成要素をさらに含む。
一実施形態によると、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に、ｍＡｂ １Ｃ１１、２Ｄ１１、３Ｈ６、１Ｅ１２、および３Ａ８のうちの１つ以上を含む。別の実施形態によると、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に、ｍＡｂ １Ｃ１１、２Ｄ１１、３Ｈ６、１Ｅ１２、および３Ａ８のうちの２つ以上を含む。
本発明のモノクローナル抗体を含有する薬学的組成物は、黄色ブドウ球菌に感染しているか、または黄色ブドウ球菌に感染している危険性がある対象に、投与することができる。種々の送達システムが既知であり、本発明の抗体を投与するために使用可能である。導入方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。治療剤は、例えば、点滴もしくはボーラス注入によって、または上皮もしくは皮膚粘膜の内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜等）を通じた吸収によって投与することができ、他の生物活性剤、例えば、化学療法剤、抗生物質、または他の免疫療法剤とともに投与されてもよい。投与は、全身投与あるいは局所投与、すなわち、ブドウ球菌感染の部位における投与、または手術部位もしくは移植部位に直接的な投与であってもよい。
本発明の薬学的組成物は、患者に第２の治療剤を投与することをさらに含み、第２の治療剤は、抗生物質または免疫療法剤である。例示の抗生物質には、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルフォプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、カルバペネムＣＳ−０２３／ＲＯ−４９０８４６３、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例示の免疫療法剤には、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ１１０、Ａｕｒｅｘｉｓ（商標）、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。抗生物質および免疫療法剤の上記一覧は、非限定的な例を意図し、このため、他の抗生物質または免疫療法剤もまた、考慮される。第２の治療財の組み合わせまたは混合もまた、本発明の目的に使用することができる。これらの薬剤は、同時投与されるか、または単一製剤として投与されてもよい。
本薬学的組成物は、典型的に、１つ以上の薬学的担体（例えば、水または油等の滅菌液であり、油等には石油、動物、植物、もしくは合成由来のものを含み、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等である）を含む。水は、薬学的組成物が、静脈内投与される場合に、より一般的な担体である。食塩水ならびに水性デキストロースおよびグリセリン溶液もまた、特に注入可能溶液の液体担体として採用することができる。好適な薬学的賦形剤には、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、およびエタノール等が挙げられる。本組成物はまた、必要であれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、および徐放性製剤等の形態をとることができる。本組成物は、トリグリセリド等の、従来的な結合剤および担体とともに、座薬として製剤されてもよい。経口製剤は、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の、標準的な担体を含むことができる。好適な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"に記載されている。このような組成物は、患者への適切な投与形態を提供することができるように、好適な量の担体とともに、核酸またはタンパク質の治療有効量を、典型的には精製した形態で含有することになる。製剤は、投与方法に対応する。
上述の細菌感染の治療のための本発明の組成物の有効投与量は、投与方法、標的部位、患者の生理的状態、投与される他の薬物、および治療が予防的であるか治療的であるかを含む、多くの異なる要因によって変化する。予防的適用においては、長期間にわたって、比較的低頻度の間隔で、比較的低用量を投与する。何人かの患者は、一生治療を受け続ける。治療的適用においては、疾患の進行が軽減または終結するまで、好ましくは、患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が時に必要とされる。その後、患者は、予防的レジメンで投与されてもよい。ブドウ球菌の細菌感染の予防的治療において、本発明の薬学的組成物（１つまたは複数）は、個体が細菌に晒される前に投与が可能であり、その結果得られる免疫応答が、細菌感染を阻害するか、またはその重症度を軽減させることが可能であり、それによって細菌を個体から排除することが可能であることが意図される。例えば、モノクローナル抗体または薬学的組成物は、関節置換術または装具移植を伴う任意の手術等の、外科的手術の前、最中、および／または直後に投与することができる。
本発明の抗体または結合フラグメントでの受動免疫化について、投与量は、宿主の体重あたり、約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、より通例的には、約０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇの範囲に及ぶ。例えば、投与量は、約１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは約１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約１〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。例示的な治療レジメンは、２週間に１回、または１ヶ月に１回、または３〜６ヶ月に１回の投与を伴う。いくつかの方法において、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が、同時に投与され、その場合、投与される各抗体の投与量は、示された範囲内にある。抗体は、通常、複数の場合に投与される。単回投与間の間隔は、毎日、毎週、毎月、または毎年であってもよい。いくつかの方法において、投与量は、１〜１０００μｇ／ｍｌ、およびいくつかの方法においては、２５〜３００μｇ／ｍｌの、血漿中の抗体濃度を達成するように調節される。あるいは、抗体は、徐放性製剤として投与することができ、その場合、より頻度の低い投与が必要とされる。投与量および頻度は、患者内での抗体の半減期によって異なる。一般的に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、次にヒト化抗体、キメラ抗体、そして非ヒト抗体へと続く。
本発明のさらなる態様は、担体および黄色ブドウ球菌グルコサミニダーゼの少なくとも１フラグメントを含む抗原分子を含む活性ワクチン（例えば、薬学的組成物）に関する。抗原分子は、（ｉ）グルコサミニダーゼポリペプチドおよびアジュバントポリペプチドを含む融合タンパク質、または（ｉｉ）別の免疫原性分子にコンジュゲートしたグルコサミニダーゼポリペプチドを含む免疫原性コンジュゲートの形態をとることができる。
例示であり限定するものではなく、本発明の好適な融合タンパク質には、フラジェリン、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１またはＬ２タンパク質、単純ヘルペス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）、補体Ｃ４結合タンパク質、トール様受容体−４（ＴＬＲ４）リガンド、およびＩＬ−１βの群から選択される、アジュバントポリペプチドを含有するものが挙げられる。
本発明の融合ポリペプチドまたは融合タンパク質は、当該技術分野で既知の標準的な技術を使用して作製することができる。例えば、融合ポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチド配列と、アジュバントとのインフレーム融合、すなわち、ハイブリッドまたはキメラ遺伝子の翻訳によって調製することができる。融合ポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子は、宿主細胞を形質転換または形質移入するために使用される、発現ベクターに挿入される。あるいは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、アジュバントをコードするポリヌクレオチドが既に存在している発現ベクターに挿入される。融合タンパク質のペプチドアジュバントは、本発明のグルコサミニダーゼポリペプチドのＮ末端、または好ましくは、Ｃ末端に融合することができる。
本発明のポリペプチドとタンパク質アジュバントとの間の融合は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が、アジュバントのアミノ酸配列と直接隣接するようなものであってもよい。あるいは、ポリペプチド部分は、短いリンカー配列によって、アジュバントに連結されてもよい。好適なリンカー配列には、グリシンリッチリンカー（例えば、ＧＧＧＳ２−３）、セリンリッチリンカー（例えば、ＧＳＮ）、または全体として参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｈｕａｎｇらに対する米国特許第５，５１６，６３７号に記載されるような、他の適応可能な免疫ブログリンリンカーが挙げられる。
本発明の好適な免疫原性コンジュゲートには、任意のグルコサミニダーゼポリペプチドに、共有または非共有結合される免疫原性担体分子を含有するものが挙げられるが、これらに限定されない。いずれの好適な免疫原性担体分子も、使用可能である。例示的な免疫原性担体分子には、ウシ血清アルブミン、ニワトリ卵白アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、破傷風毒素、ジフテリア毒素、サイログルブリン、肺炎球菌莢膜多糖体、ＣＲＭ１９７、および髄膜炎菌性外膜タンパク質が挙げられるが、これらに決して限定されない。
活性ワクチンの形態の薬学的組成物はまた、有効量の別個のアジュバントを含んでもよい。本発明における使用に好適なアジュバントには、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水乳化剤、水中油乳化剤、ムラミールジペプチド、細菌内毒素、脂質、Ｑｕｉｌ Ａ、および／または非感染性百日咳菌が挙げられるが、これらに限定されない。
アジュバントの選択は、アジュバントを含有する免疫原性製剤の安定性、投与経路、投与計画、予防接種される種に対するアジュバントの有効性に依存し、ヒトにおいては、薬学的に許容されるアジュバントは、承認されているものか、または関連規制機関によってヒトへの投与が承認できるものである。例えば、アラム、ＭＰＬ、またはフロイント不完全アジュバント（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３２：１７３−１８６（１９９８）、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）単独か、または任意のそれらの組み合わせの全てが、ヒトへの投与に好適である。
予防的適用において、免疫原性グルコサミニダーゼポリペプチドを含有する薬学的組成物は、細菌感染の疑いがあるか、そうでなければその危険性がある患者に、疾患、その合併症および疾患の発症過程で現れる中間病理学的表現型を含む、疾患の危険性の排除もしくは減少、疾患の重症度の軽減、または疾患の発症の遅延に十分な量で投与される。治療的適用において、本発明によるモノクローナル抗体または結合フラグメントを含有する薬学的組成物は、このような疾患の疑いがあるか、または既にそれを患っている患者に、その合併症および疾患の発症中における中間病理学的表現型を含む、疾患の症状（生化学的、組織学的、および／または行動的）を治療するか、または疾患の症状の進行を少なくとも部分的に妨げるのに十分な量で投与される。治療的または予防的治療を達成するのに適切な量は、上記において特定される、治療的または予防的有効用量として定義される。予防的および治療的療法のレジメンにおいて、薬剤は、通常、十分な応答が達成されるまで、いくつかの投与量で投与される。典型的には、応答はモニターされ、応答が減弱し始めた場合には、繰り返された投与が行われる。
治療投与量は、安全性および有効性を最適化するために漸増しなければならない。免疫原の量は、アジュバントも投与されるのかどうかに依存し、アジュバントの非存在下においては、より高い投与量が必要となる。投与のための免疫原の量は、時に、患者１人当たり１〜５００μｇで、より定例的には、ヒトへ投与に対して、注入１回当たり５〜５００μｇである。時には、注入１回当たり１〜２ｍｇの高い投与量が使用される。典型的には、約１０、２０、５０、または１００μｇが、各ヒトへの注入に使用される。免疫原の質量はまた、免疫原内の免疫原性エピトープと、免疫原全体の質量との質量比に依存する。典型的には、１０−３〜１０−５マイクロモルの免疫原性エピトープを、各マイクログラムの免疫原に使用する。注入の時期は、１日１回から、１年に１回まで、１０年に１回まで、大幅に異なってもよい。免疫原の投与が行われるいずれの日においても、投与量は、アジュバントも投与される場合、１μｇ／患者を上回り、通常は１０μｇ／患者を上回り、アジュバントの非存在下においては、１０μｇ／患者を上回り、通常は１００μｇ／患者を上回る。典型的な投与計画では、免疫化に続く、たとえば６週間間隔等の時間間隔でのブースター注射から構成される。別の投与計画では、免疫化に続く、１、２、および１２ヶ月後のブースター注射で構成される。あるいは、ブースター注射は、免疫応答のモニターにより示されるように、定期的または不定期で提供されてもよい。
本発明の第４の態様は、黄色ブドウ球菌感染を有する患者に、本発明のモノクローナル抗体、その結合部分または薬学的組成物の有効量を投与する段階を含む、黄色ブドウ球菌感染を治療する方法に関する。
本発明の本態様の一実施形態において、黄色ブドウ球菌感染を治療する方法は、前記投与を繰り返す段階をさらに含む。黄色ブドウ球菌感染を治療する方法は、該投与が全身に実施されるか、黄色ブドウ球菌感染の部位に直接実施されるようなものであってもよい。
黄色ブドウ球菌感染を治療する方法は、皮膚、筋肉、心臓、呼吸器、胃腸管、眼、腎臓および尿路、ならびに骨または関節の感染を含むが、これらに限定されない部位において、黄色ブドウ球菌感染を治療するために使用することができる。
一実施形態において、本方法は、黄色ブドウ球菌の骨感染または関節感染を有する患者に、本発明のモノクローナル抗体もしくはその結合フラグメントまたは薬学的組成物の有効量を投与することによって、骨髄炎を治療するために実施される。これらの薬剤または組成物の投与は、上記のいずれかの経路を使用して実施することができるが、しかしながら、骨または関節の感染部位への直接の投与が好ましい。
本発明の第６の態様は、整形外科用インプラントを必要とする患者に、本発明のモノクローナル抗体、結合部分または薬学的組成物の有効量を投与する段階と、患者に整形外科用インプラントを導入する段階と、を含む、患者に整形外科用インプラントを導入する方法に関する。
一実施形態において、整形外科用インプラントを導入する方法は、整形外科用インプラントを必要とする患者に、モノクローナル抗体もしくは結合フラグメントまたは同じものを含有する薬学的組成物の有効量を、移植部位に直接投与する段階を含む。あるいは、またはさらに、整形外科用インプラントは、移植部位におけるその移植の前、最中、または直後に、モノクローナル抗体、または結合フラグメント、または同じものを含有する薬学的組成物で被覆または処置することができる。
整形外科用インプラントは、人工関節、グラフト、または合成インプラントであってもよい。例示的な人工関節には、人工膝関節、人工股関節、人工指関節、人工肘関節、人工肩関節、人工側頭下顎関節、および人工足関節が挙げられるが、これらに限定されない。他の人工関節もまた、使用可能である。例示的なグラフトまたは合成インプラントには、人工椎間板、半月板インプラント、または合成もしくは同種移植片の前十字靱帯、内側側副靱帯、外側側副靱帯、後十字靱帯、アキレス腱および回旋筋腱板が挙げられるが、これらに限定されない。他のグラフトまたはインプラントも、使用可能である。
一実施形態において、整形外科用インプラントを導入する方法は、全関節再置換術を設置するプロセスを包含するように意図される。元々の関節置換術に関する感染、特にブドウ球菌の感染が生じる場合、唯一の実行可能な治療は、全関節再置換術である。本実施形態において、まず、感染した人工関節が取り出され、次に、患者は、根本的な感染を治療される。感染の治療は、長期間（すなわち、６ヶ月）にわたって起こり、その期間中、患者は、寝たきり（または、限られた運動性のみを有する）であり、根本的な感染を治療するために、高用量の抗生物質、および任意で本発明の１つ以上のモノクローナル抗体もしくは結合部分、または薬学的組成物を受ける。根本的な感染の治療の上で、新しい人工関節が設置される。新しい人工関節の設置の直前（すなわち、新しい人工関節の設置前２週間以内）、および任意で新しい人工関節設置の後に、患者は、本発明の１つ以上のモノクローナル抗体もしくはその結合部分、または薬学的組成物を投与される。この治療は、設置後の期間中に、１回以上繰り返されてもよい。抗生物質治療は、本発明の１つ以上のモノクローナル抗体もしくは結合部分、または薬学的組成物との組み合わせ、またはそれらと同時に投与することができる。これらの治療は、全関節再置換術の間の感染または再感染を予防するのに効果的である。
本発明による治療の方法は、それを必要とする任意の患者を治療するために使用することができるが、しかしながら、本方法は、特に、免疫力が低下したあらゆる年齢の患者、ならびに、５０歳を超えている年齢の患者に有用である。
本発明は、以下の実施例への参照によって説明される。これらの実施例は、特許請求される発明を制限する意図はない。
実施例１−インプラントに関連する骨髄炎のマウス下腿モデル
整形外科用インプラントに関連するＯＭは、髄内デバイス（すなわち、人工関節）および経皮質インプラント（すなわち、図１Ａの外部固定デバイス）の両方に対して起こる。固定デバイスの感染率が、人工関節のすべてのものより２．５倍高く、そして発生率は８倍を超えているにも関わらず、再置換手術はより単純であるため、深刻であるとは見なされない（Ｄａｒｏｕｉｃｈｅ，"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｉｍｐｌａｎｔｓ，"Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（１４）：１４２２−９（２００４）、これは、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる）。感染経皮質インプラントが関与するほとんどの事例が、１回の手術にて、ピンを再配置し、膿瘍を独立して治療することで解決されるが、感染した人工関節の多くは、２回の置換手術を必要とする（Ｄａｒｏｕｉｃｈｅ，"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｉｍｐｌａｎｔｓ，"Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（１４）：１４２２−９（２００４）、これは、全体として参照することによって本明細書に組み込まれる）。まず１回目は感染を治療するために必要であり、２回目で人工関節を取り替える。このため、臨床的観点の重要性から、本分野では主に、黄色ブドウ球菌のＵＡＭＳ−１（ＡＴＣＣ ４９２３０）株を伴う髄内デバイスに関わるインプラントに関連するＯＭのモデルに焦点を合わせている（Ｄａｕｍ ｅｔ ａｌ．，"Ａ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ，Ｓｅｐｔｉｃ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ａｎｄ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｃｈｉｃｋｅｎｓ，"Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．８（６）：８０４−１３（１９９０）、Ｒｉｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｒａｔｓ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４７（３）：５８１−６（１９８５）、Ｐａｓｓｌ ｅｔ ａｌ．，"Ａ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｕｍａｔｉｃ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｇｕｉｎｅａ Ｐｉｇｓ，"Ｊ．Ｔｒａｕｍａ２４（４）：３２３−６（１９８４）；Ｗｏｒｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，"Ａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｕｍａｔｉｃ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ，"Ｂｒ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．６９（２）：２３５−４４（１９８８）、Ｖａｒｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，"Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｄｏｇｓ，"Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２７（９）：８１６−９（１９８９）、Ｋａａｒｓｅｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｎｅｗ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ Ｗｉｔｈ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｉｎ Ｓｈｅｅｐ，"Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．３３９：２４６−５２（１９９７）、これらは、全体として参照することによって、本明細書に組み込まれる）。残念ながら、このアプローチには大幅な制限があり、最も顕著には、再現可能（時間的および空間的な）病変を作製できないことである。これを克服する目的で、既知のアインホルンデバイス（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ Ｌｉｎｅａｇｅ ａｎｄ ｉｓ Ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｂｏｎｅ Ｒｅｐａｉｒ，"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９（１１）：１４０５−１５（２００２）、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）を使用して、１×１０６ＣＦＵを含有する髄内ピンの挿入直後に脛骨を骨折させることによって、感染の位置を骨幹に導いた。感染経皮質ピンの移植は、常に、ピンの近隣で病変をもたらし、脛骨の他の領域の慢性ＯＭまたはマウス内の血行性拡散を決してもたらさないことが見出された（図１Ａ〜Ｃ）。
骨溶解を定量化するために、感染脛骨をμＣΤによって分析する経時的研究を行った（図１Ｂ〜Ｃ）。これらの結果は腐骨形成と一致し、腐骨形成では、反応性の骨膜の骨形成を伴う破骨細胞の骨吸収が感染インプラント周辺で起こる。
マウスにおけるＯＭの存在を、組織学的に確認した。図２Ａ〜Ｈは、脛骨の経皮質ピンモデルが、腐骨および被膜形成、破骨細胞の皮質骨吸収、ならびにインプラント周囲の壊死骨中に存在するグラム染色された細胞外細菌およびバイオフィルムを含む、慢性ＯＭの顕著な特色の全てを含むことを示す。熱殺菌された黄色ブドウ球菌および非病原性の大腸菌を含む陰性対照で、これらの特徴を示したものはない。
実施例２−骨髄炎のリアルタイムＰＣＲ定量
ＯＭを定量化するための既知の方法は存在しない。感染した骨から生きた細菌を効果的に抽出して、古典的なコロニー形成単位（ＣＦＵ）によって細菌量を判定することが不可能であるため、細菌量のサロゲートな結果測定としてチーズ中（Ｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｑｕａｎｔｉｆｙ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｅｅｓｅ，"Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７（７）：３１２２−６（２００１）、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）、および血中（Ｐａｌｏｍａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｆｒｏｍ Ｂｌｏｏｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＰＣＲ，"Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４５（３）：１８３−９（２００３）、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）において行われているコンタミネーション検査のように、ＤＮＡ試料中の復元可能なｎｕｃ遺伝子の数を定量化するためのリアルタイムＰＣＲ法を開発した。
黄色ブドウ球菌特異性ｎｕｃ遺伝子に対するＲＴＱ−ＰＣＲは、すでに報告のある２６９−ｂｐ作製物を増幅させるプライマー
Figure 2013533210
を使用して行った（Ｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ，"Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｑｕａｎｔｉｆｙ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｅｅｓｅ，"Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７（７）：３１２２−６（２００１）、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）。反応は、０．３μΜのプライマー、１倍Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、および２μｌの精製脛骨ＤＮＡテンプレートで構成された、最終容積２０μｌ中において実施することができる。試料は、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ＲＧ ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｙｄｎｅｙ，ＡＵ）を使用してアッセイすることができる。
ＤＮＡテンプレートの試料間の統合性を制御するために、プライマー
Figure 2013533210
を使用して、１２４ｂｐの作製物を検出するＲＴＱ−ＰＣＲを、マウスβ−アクチン遺伝子に対してさらに実行してもよい。マウスβ−アクチン、黄色ブドウ球菌ｎｕｃ、およびｒＲＮＡゲノムＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを使用することにより、これらのＰＣＲの特異性および予測作製物を増幅する能力が示された（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｉｍｐｌａｎｔ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ，Ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｈｕｍｏｒａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，"Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２６（１）：９６−１０５（２００８）、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）。次いで、ｎｕｃ遺伝子を含む精製プラスミドＤＮＡまたは黄色ブドウ球菌ゲノムＤＮＡを使用して、用量反応性実験を行い、このＲＴＱ−ＰＣＲの検出限界が、約１００コピーであることを判定した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｉｍｐｌａｎｔ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ，Ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｈｕｍｏｒａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，"Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２６（１）：９６−１０５（２００８）、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）。このアッセイ法は、感染の二次的な結果測定としてのインビボ細菌量および受動免疫化の有効性を定量化するために使用されている。
実施例３−骨髄炎確立中における感染および液性免疫の動態
骨髄炎確立中における微生物病因および宿主免疫を定量化するために、マウスの脛骨に感染経皮質ピン移植して経時的研究を行い、細菌量および宿主の液性応答を、それぞれｎｕｃ／β−アクチンＲＴＱ−ＰＣＲおよびウエスタンブロットによって経時的に判定した（図３Ａ〜Ｃ）。結果は、感染と液性免疫との間の明らかな逆相関を示す。古典的な微生物病因および細胞外細菌に対する獲得免疫に一致して、これらの結果は、細菌が即座に自らを確立し、対数増殖期に入ると、それらは中和液性反応により１１日後に認識されることを示す。特定の細菌タンパク質に対する高いアフィニティーのＩｇＧ抗体の発生と、細菌量ピークが一致することに基づくと、これらの「免疫優性」抗原が、ＯＭの確立に対して診断的および防御的の両方において、機能的な免疫応答を誘発することが明らかである。
実施例４−ＯＭ確立中における、特異的ＩｇＧ２ｂ反応を誘発する５６ｋＤａ 免疫優性抗原としての黄色ブドウ球菌自己分解酵素のグルコサミニダーゼサブユニットの同定およびクローニング
ＯＭ確立中の液性応答をさらに特徴付けるために、マウスの血清中のＩｇアイソタイプの陽性率を、ＥＬＩＳＡによって、感染の最初の２週間にわたり判定した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｉｍｐｌａｎｔ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ，Ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｈｕｍｏｒａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，"Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．２６（１）：９６−１０５ （２００８）、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）。その結果、第１週目にマウスは古典的なＩｇＭ反応を開始し、第２週目にそれは、強力なオプソニンおよび黄色ブドウ球菌抗原に対する防御活性を有することが最近示された特定のＩｇＧ２ｂ反応に転換することが示された（Ｍａｉｒａ−Ｌｉｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｏｐｓｏｎｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎａｔｉｖｅ ｏｒ Ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｅｄ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｐｏｌｙ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｂｅｔａ−（１−６）−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３（１０）：６７５２−６２（２００５）、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）。
図３Ｃにおいて同定された免疫優性抗原の分子属性を解明するために、黄色ブドウ球菌全抽出物のサブトラクティブウェスタンブロットを実施し、２Ｄ−ＰＡＧＥによって分離した（図４Ａ〜Ｃ）。この分析により、免疫前血清では検出されなかったあるポリペプチドが、免疫１４日後の血清と強い反応性を有することが明らかになった。そのタンパク質を、分離用クーマシーブルー染色ゲルから単離し、トリプシンで消化し、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法（ＭＡＬＤＩ）によって分析し、７０個の個々のペプチドピークを決定した。全ペプチドからのアミノ酸配列は、黄色ブドウ球菌ＡｌｔのＧｍｄサブユニットの既知の配列と１００％一致した。興味深いことに、他にも、最近、Ａｔｌが、ＭＲＳＡ ＯＭのウサギ脛骨モデルにおいて、免疫優性抗原となることを見出したものがいる（Ｂｒａｄｙ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａ Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４（６）：３４１５−２６（２００６）、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）。
図４Ｃにおいて、２Ｄ−ＰＡＧＥゲルから取り出したスポットが、免疫優性抗原に関連したものであることを確認するために、黄色ブドウ球菌自己分解酵素のグルコサミニダーゼサブユニットの５３ｋＤａ、１，４６５ｂｐのコード領域を、ＩＰＴＧ誘導のためのｌａｃ Ｉプロモーターを含むｐＥＴ−２８ａ（＋）発現プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングすることによって、組み換え６−Ｈｉｓで標識された融合タンパク質を作製した。ＤＮＡシークエンスに続いて、そのプラスミドを使用してＢＬ２１大腸菌に形質転換し、組み換えＨｉｓ−グルコサミニダーゼ（Ｈｉｓ−Ｇｍｄ）の作製に使用した。次に、この組み換えタンパク質を使用して、免疫前血清および免疫血清の反応性を評価した。結果は、ＩＰＴＧ誘導５７ｋＤａ組み換えタンパク質が、免疫血清によってのみ認識されることを示し、このため、Ｇｍｄが、黄色ブドウ球菌免疫優性抗原であることを裏付けた。この実験を、Ｘｅｎ２９に感染したマウスからの抗血清を用いて繰り返し、Ｃ５７Ｂｌ／６もまた、黄色ブドウ球菌のこの生物発光株に対するＧｍｄに特異的な抗体を作製することを裏付けた。
実施例５−ＯＭおよび細菌増殖の長期的な結果測定としてのｌｕｘ形質転換黄色ブドウ球菌のインビボバイオルミネセンスイメージング
マウスモデルにおいてＯＭを定量化するＲＴＱ−ＰＣＲ方法は、非常に有用であるにも関わらず、このアプローチには、３つの主要な制限が存在する。第１に、この分析は、ＤＮＡを採取するためにマウスの殺処理が必要であるため、長期的ではない。第２には、ＤＮＡ単離、ＰＣＲ、およびデータ分析の際に、非常に大きな労働力と高度の注意を要する。第３には、黄色ブドウ球菌ゲノムＤＮＡ（ｎｕｃ遺伝子）の検出は、活動的な増殖期にある細菌と、バイオフィルム中に堅く詰まった休眠中の細菌とを区別することができない。このため、ＲＴＱ−ＰＣＲは、インビボの細菌増殖へのｍＡｂ効果を評価するために容易に使用することができない。
これらの欠点を克服するために、本発明は、バイオルミネセンスイメージングを使用して、インビボでの病原体をモニターするための高度に革新的なアプローチに関する（Ｃｏｎｔａｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｈｏｔｏｎｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｈｏｓｔｓ，"Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８（４）：５９３−６０３（１９９５）、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）。より最近になって、Ｐ．Ｒ．Ｃｏｎｔａｇおよび同僚らが、生物発光性黄色ブドウ球菌（Ｘｅｎ２９；ＡＴＣＣ １２６００）をこの目的のために作製している（Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｍｉｃｅ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｎｏｖｅｌ ｌｕｘＡＢＣＤＥ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８（６）：３５９４−６００（２０００）、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）。図５Ａ〜Ｂは、このアプローチが、どのように本発明のＯＭのモデルに適応されるかを示す。Ｘｅｎ２９を用いた経時的研究では、滅菌ピンを与えられたマウス、または非経口ゲンタマイシンで処理された感染マウスにおいては、バックグラウンドシグナルのみが検出された。対照的に、感染した未治療脛骨のＢＬＩは、４日目にベースラインからちょうど４倍の増加を示し、続く１１日目までにバックグラウンドレベルまで下落した。
実施例６−組み換えＧｍｄワクチンは、インプラントに関連するＯＭからマウスを防御する
ＯＭに対する抗自己分解酵素受動免疫化の可能性を評価するために、初期の活性組み換えＧｍｄワクチン研究を実施し、マウス（ｎ＝２０）を次のように免疫化した：群１（アジュバント中のＰＢＳ（陰性対照））、群２（２０μｇ黄色ブドウ球菌Ｘｅｎ２９全プロテオーム抽出物をアジュバントと同容量で１：１に乳化（陽性対照））、群３（アジュバント中の２０μｇ Ｈｉｓ−グルコサミニダーゼ）。攻撃誘発の２８日前に、各ワクチンの１５０μｌ乳化液を筋肉注射（ｉ．ｍ．）した。ブースター免疫（筋肉注射、フロイント不完全アジュバント中２０μｇ タンパク質）を、攻撃誘発の１４日前に実施した。
これらのマウスにおけるワクチンの有効性を評価するために、抗ＧｍｄのＥＬＩＳＡを展開し（図６Ａ）、初期免疫前、ブースター免疫前、および細菌攻撃誘発前の血清抗体力価の定量化に使用した（図６Ｂ）。注目すべきことに、結果は、組み換えワクチンのみが、高力価の免疫応答を誘発するしたことが示された。これらのワクチンの有効性を評価するために、免疫化マウスを、前述の実施例に記載のように（図５Ａ〜Ｃを参照）、Ｘｅｎ２９感染下腿ピンで攻撃誘発し、３日目にＢＬＩを実施し、１１日目にマウスをｎｕｃ ＲＴＱ−ＰＣＲのために安楽死させた。注目すべきことに、黄色ブドウ球菌の全プロテオームで免疫された２０匹のマウスのうち１８匹が、攻撃誘発の４８時間以内に死亡し、このため、その群からの有効性データは利用不可である。推測的な解釈のみが、この観測（すなわち、他の抗原に対する高度免疫）に提供可能であるが、他の群のいずれにおいても死亡を引き起こさなかった事実、ならびに、死亡が群２の４コホートの５匹のマウスに再現された事実は、結果が正しいものであることを示す。この理由により、この免疫化プロトコールは、今後の研究に陽性対照として使用されるべきではない。それは、活性ワクチンの安全性に対する懸念もまた強調し、精製ｍＡｂまたはその結合フラグメントでの受動免疫化の論理的根拠を支持する。
群１および３からのＢＬＩおよびｎｕｃ ＲＴＱ−ＰＣＲのデータを、図７Ａ〜Ｃに提示する。結果は、Ｈｉｓ−Ｇｍｄ免疫化マウスにおいて検出されるＢＬＩの有意な減少をはっきりと示し（図７Ａ〜Ｂ）、細菌のプランクトン増殖の減少を示す。この発見と一致して、このモデルにおける細菌量のピーク（１１日目）に、ｎｕｃ遺伝子の数に有意な減少があることが観察された。このため、これらのデータは、組み換えＧｍｄワクチンが、本モデルにおけるＯＭからマウスを防御することができることを示す。
実施例７−マウス抗Ｇｍｄモノクローナル抗体の作製およびスクリーニング
実施例６に記載のＨｉｓ−Ｇｍｄ免疫化の成功に基づき、このプロトコールを使用して、マウス抗Ｇｍｄ ｍＡｂを作製した。標準手順を使用して、ｍＡｂを得た。調製したハイブリドーマの初期プールから、第１のサブセットを選択し、抗Ｇｍｄ活性のためのＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、高いアフィニティーを有する第２のサブセットを選択して、ウェスタンドットブロットアッセイ法を行った。
ハイブリドーマ細胞株のうち５つを、Ｇｍｄに対するそれらの明らかに高いアフィニティー（≦１０−９Ｍ）、およびＧｍｄのＲ３ドメイン内に見られるこれらの領域の推定エピトープに基づいて選択した。Ｒ３ドメインは、Ｇｍｄタンパク質の触媒性ドメインではないため、これらのモノクローナル抗体が、抗Ｇｍｄ阻害活性を有することは予想外であった。５つの選択されたハイブリドーマは、１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、および３Ｈ６であった。全てが、マウスＩｇＧ１抗体を分泌した。
実施例８−モノクローナル抗グルコサミニダーゼ抗体による黄色ブドウ球菌Ｘｅｎ２９のインビトロ増殖の変化
各細胞株（１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、および３Ｈ６）の凍結アリコートを、本発明者らの依頼により調製した供給元から直接入手した（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）。凍結細胞を解凍し、次いで、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補ったダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で洗浄した。採取した培養上清を、遠心分離（１０分、１０００×ｇ）によって浄化し、凍結させた。
各細胞株から３０ｍＬの培養上清を３７〜４５℃で解凍し、０．２２μｍのフィルターを通してろ過した。次いで、それぞれを、５ｍＬのベッド体積のプロテインＧ−アガロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ、カタログ番号１７−０４０５−０３、ロット番号１００３６０２１）上で精製した。これらのカラムが合うように設計されたポンプの代わりに、アダプターで固定されるルアーロックシリンジを用いてカラムの上部に液体を添加した。カラムを、まずＰＢＳで洗浄してエタノール防腐剤を除去し、次いで、培養上清を５〜６ｍＬ／分で添加し、続いて６カラム体積分のＰＢＳを添加して未結合タンパク質を洗い流した。吸着した抗体を、２カラム体積分のｐＨ２．７の０．１Ｍ グリシンで、１ｍＬの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を含有する収集容器中に溶出し、溶出産物を中和した。次いで、カラムを次の抗体の調製のために４カラム体積分のＰＢＳで、または保管のために０．０２％ＮａＮ３を含有するＰＢＳで洗浄した。
溶出した抗体を濃縮し、３５００×ｇ、４０分、４℃での継続的な遠心分離によって、Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）濃縮器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ７ｍＬ／２０Ｋ ＭＷＣＯ、カタログ番号８７７５０、ロット番号ＫＨ１３７６３１Ａ）中で、ＰＢＳに透析した。抗体濃度を、標準としてＭＯＰＣ２１またはＰｈｅ１２．１５（いずれもマウスＩｇＧ１）を使用して、ＥＬＩＳＡによって判定した。非標識のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ番号１０３０−０１）を、９６ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレート上で、ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬ、１ウェルあたり１００μＬで、室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。ウェルを、室温で１時間または４℃で一晩、２００μＬのＰＢＳ中３％ＢＳＡの添加によってブロッキングした。ブロッキングしたプレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで２回洗浄し、使用に備えた。試料を、ＰＢＳＴにて段階希釈して調製し、１００μＬを、標準および試料用に指定されたウェルに添加した。試料を、室温で１時間インキュベートし、次いで、噴出瓶(squirt bottle)からのＰＢＳＴで４回洗浄した。捕捉されたマウス抗体を、各ウェルに１００μＬのＨＲＰ修飾ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＨＲＰ−ＧＡＭ；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１０３１−０５）を添加して検出し、ＰＢＳＴ中に１：２０００で希釈し、室温で１時間インキュベートした。プレートを噴出瓶からのＰＢＳＴで４回洗浄した後、発色性ＨＲＰ基剤ＡＢＴＳ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号０４０１−０１）を、ウェル当たり１００μＬ添加した。室温で５〜１０分間、色を発現させた。試料の色値を標準曲線に投影することによって抗体濃度を判定し、次いで希釈を補正した。これらの濃度を滴定研究に使用して、黄色ブドウ球菌の増殖に対するそれらの効果を判定した。
黄色ブドウ球菌Ｘｅｎ２９（Ｋａｄｕｒｕｇａｍｕｗａ ｅｔ ａｌ．，"Ｒａｐｉｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，"Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４７：３１３０−７（２００３）、およびＫａｄｕｒｕｇａｍｕｗａ ｅｔ ａｌ．"Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ Ｅｖａｌｕａｔｅ Ｐｏｓｔａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ，"Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４８：２２８３−７（２００４）、これらは、全体として参照することによって、本明細書に組み込まれる）は、これらの実験に使用した唯一の細菌株である。凍結ストックから１μＬの黄色ブドウ球菌Ｘｅｎ２９を取り出し、２００ｒｐｍの回転台上で、１０ｍＬのＬＢ培地中において、３７℃で１２時間、中間対数期まで増殖させた。次いで、細菌をＬＢ培地中で１０００ｃｆｕ／ｍＬまで希釈し、１００μＬの希釈懸濁液を、抗体および対照の添加を指定される、平底マイクロタイター（蓋付き）のウェルに添加した。抗Ｇｍｄおよび陰性抗体それぞれを、ＰＢＳ中約１ｍｇ／ｍＬのストックからＬＢ中に希釈し、０．２μフィルターを通して滅菌した。１００μＬの各抗体を、指定の４つ組みウェルに添加した。次いで、プレートを３７℃でインキュベートし、光散乱を、４９０および６７０ｎｍにおいて、ｔ＝０、５、７、９、１１、１３、１５時間で、マイクロタイタープレートリーダー上で測定した。最終時点を、２４時間後のある時点でとり、測定したプラトー値を確認した。
５つの抗体を、プロテインＧ−アガロース上でアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、透析して、アッセイ法に干渉する可能性のあるＮａＮ３および抗生物質等の防腐剤を除去した。中間対数期培地からの１００ｃｆｕの黄色ブドウ球菌株Ｘｅｎ２９を、ＬＢ培地中の各マイクロタイターウェルに、５０μｇ／ｍＬ（約３×１０−７Ｍ）の各抗体または対照（同様にＬＢ培地中）１００μＬとともに、セットした。周期的に２６時間以上、４９０および６７０ｎｍでの光散乱を測定することによって、増殖をモニターした。
抗Ｇｍｄモノクローナル抗体により、黄色ブドウ球菌増殖の明らかな減少が観察された。図８に描写されるように、４つの抗体が、Ｘｅｎ２９の光散乱における増殖に関連した増加を押し下げた。光散乱を減少させた４つの抗体の全てが、同程度に押し下げたが、一方で、アイソタイプが一致する対照（ＭＯＰＣ２１）は、いずれの抗体も存在しない状態におけるＸｅｎ２９の増殖と同一であった。第５の抗体３Ｈ６もまた、別個の実験において、類似の挙動を示した。
また、Ｘｅｎ２９の増殖に関連した光散乱の変化が、用量依存的であり、モノクローナル抗体と天然Ｇｍｄとの間の高いアフィニティー相互作用と一致することも観察された。その観察されたＸｅｎ２９増殖変化の用量依存性を検討するにあたり最も重大な決定は、抗体の濃度が低すぎたために、部分的にしかＸｅｎ２９増殖の明らかな減少が解明されなかったのか、または最大効果が既に観察されており、より高い濃度であってもさらなる効果は得られないのかどうかである。
抗体のうちの４つが同程度の効果を有し、また５０μｇ／ｍＬ（３×１０−７Ｍ）は、非常に高い濃度であるため、抗体レベルを、１００．５段階希釈釈で５０μｇ／ｍＬから漸減させた。代表的なデータを図９に提示する。モノクローナル抗体１Ｃ１１は、５０、１６、および５μｇ／ｍＬで、Ｘｅｎ２９の増殖を同程度に、１．６（約１×１０−８Ｍ）で部分的に変化させ、０．５ｕｇ／ｍＬでの無関係な抗体ＭＯＰＣ２１との違いはなかった（図１０）。本質的に、同一の結果が、ｍＡｂ ２Ｄ１１、１Ｅ１２、および３Ａ８に観察された。
アイソタイプが一致する対照抗体ＭＯＰＣ２１の結果を図１０に提示する。増殖曲線は、本質的に、抗体無しの対照と同一であった。５０μｇ／ｍＬサンプルのわずかな上昇は、マイクロタイタープレートの外部ウェルへのそれらの設置のためであった（周縁効果）。
Ｇｍｄの阻害が、高度の抗体結合のためであると仮定すると、約１０倍のＫｄが必要であるという試算が、１ｎＭ近くのＧｍｄに作用するアフィニティーに対して予測される。
これらのデータは、４つの抗Ｇｍｄ ｍＡｂが、Ｇｍｄ活性を阻害し、Ｘｅｎ２９のインビトロ増殖におけるパターンの変化をもたらすが、それらは、倍増するための時間には効果がないことを示す。Ｇｍｄ活性の阻害は、細胞質分裂の失敗をもたらし、すなわち、ゲノムおよび細胞膜は正常に分裂するが、細胞壁は分離に失敗し、凝集細胞の大きな塊となってしまう（Ｓｕｇａｉ ｅｔ ａｌ．"Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｄｏ−ｂｅｔａ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ ａｎｄ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ Ａｍｉｄａｓｅ ａｓ Ｃｌｕｓｔｅｒ−ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，"Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７７：１４９１−６（１９９５）、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）。この変化は光散乱によって検出可能である。なぜならＸｅｎ２９が自由に細胞分裂する場合よりも、少ない（より大きいが）散乱中心が存在することになるからである。
本発明の抗体は、いくつかの重要な基準を満たすことが既に示されている。これらは、ロバストレベル（静置培養において約５０μｇ／ｍＬ）で、親ハイブリドーマによって産生される、高いアフィニティーのＩｇＧ抗体である。それらは、保存されたエピトープを認識し、その結果、いくつかまたはほとんどが、大半の黄色ブドウ球菌株のＧｍｄを認識する。さらに、これらの実験は、これらのモノクローナル抗体が、免疫原として使用された組み換えＨｉｓ−Ｇｍｄだけではなく、天然Ｇｍｄを認識し、Ｇｍｄ阻害剤として機能するという証拠を提供する。モノクローナル抗体全てが、約７０〜約８０％のＧｍｄ阻害剤活性を示す。このレベルのＧｍｄ阻害活性は、５つの選択された抗体が、その触媒ドメインではなく、ＧｍｄのＲ３ドメイン内に位置するエピトープに結合することからすると、非常に予想外のことである。
実施例９−黄色ブドウ球菌由来のグルコサミニダーゼに特異的なモノクローナル抗体は、ＶＨ遺伝子の多様なアレイを使用する
調査中の５つのモノクローナル抗体が特有であることを判定するために、ＶＨおよびＶＬ遺伝子の配列を、前述の実施例で同定された、５つの対象ハイブリドーマ（１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、および３Ｈ６）に対して判定した。
黄色ブドウ球菌グルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）に特異的なモノクローナル抗体の各セットに関する研究には、かなり多くの医学的応用および利点があるため、同一の抗体（ｓｉｂｓ）を発現するハイブリドーマを同定することは有益である。５つのハイブリドーマを、それらのＩｇ重鎖および軽鎖遺伝子のシークエンス解析に用いた。
５つのハイブリドーマ細胞株の凍結アリコートを、本発明者らの指示によりハイブリドーマを調製した供給元であるＡ＆Ｇ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）（９１３０ Ｒｅｄ Ｂｒａｎｃｈ Ｒｏａｄ，Ｓｕｉｔｅ Ｕ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ ２１０４５）から入手した。細胞を解凍し、ゲンタマイシンおよび１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭで洗浄してＤＭＳＯを除去し、次いで、ゲンタマイシンおよび１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中において培養した。数日後、細胞を遠心分離によって採取し、続くＲＮＡ抽出のために凍結ペレットとして−２０℃で保管した。
重鎖ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅を、５つのハイブリドーマにおいて成功させた。シークエンス解析は、３つの異なる生殖細胞系列ＶＨ遺伝子セグメントが使用されたことを明らかにした。ハイブリドーマのうちの２つ（２Ｄ１１および３Ｈ６）は、同じ生殖細胞系列ＶＨおよびＪセグメントであるが異なるＤセグメントを使用し、それぞれ、タンパク質レベルにおいて生殖細胞系列からわずかな配列多様性を示した。第５のハイブリドーマ（１Ｃ１１）からの重鎖は、ごくまれにしか使用されないＶＨ遺伝子セグメントのいくつかを増幅させるように設計されるＰＣＲプライマーを用いてでさえも、当初はＲＴ−ＰＣＲでは増幅しなかった。このことより、それが他とは異なるＩｇ ＶＨ遺伝子を発現したことが示唆された。
新たに増殖中のハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出し、約５マイクログラムのＲＮＡを、ＢｉｏＲａｄ ｉＳｃｒｉｐｔキットを使用して、逆転写した。ｃＤＮＡのアリコートを、定常領域プライマーと組み合わせて、マウスの可変重領域および軽領域の５′末端に対するコンセンサスプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。多数の作製物を、４／５ＶＨおよび５／５ＶＬの遺伝子について得た。ＰＣＲ生成物を、ゲル精製し、ダイレクトシークエンスを行った。４つ全てのＶＨ作製物はきれいなシークエンス結果をもたらしたが、２／４の軽鎖作製物は、混合していた。残りの２つは、良好なシークエンス結果をもたらした。重鎖作製物が得られなかった細胞株から生成された軽鎖は、シークエンスを行わなかった。フレームワーク１のプライマーを使用した最初の実験で増幅に失敗したこれらの抗体の可変領域は、可変遺伝子セグメントの分泌リーダー領域を標的とするように設定された異なるプライマーを使用したところ、増幅に成功した。これらのＰＣＲ生成物は、また、精製後にダイレクトシークエンスを行った。
生殖細胞系列のＶ領域遺伝子のベストマッチを、Ｉｇ ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）を使用して判定した。判定したＤＮＡ配列を、Ｅｘｐａｓｙウェブサイトで利用可能なオンラインプログラムを使用して、タンパク質配列に翻訳した。２Ｄ１１および３Ｈ６配列の配列アラインメントを、目視検査によって実施した。
上述のように、最終的には、５つのＶＨ遺伝子の全てが、増幅およびシークエンスに成功した。５つのハイブリドーマに対する詳細なＤＮＡおよびタンパク質配列結果を、以下に提示する。
ハイブリドーマ２Ｄ１１（最も近似する生殖細胞系列：Ｊ５５８．１８．１０８）は、以下のＶＨヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）を有する。
Figure 2013533210
２Ｄ１１ ＶＬ（最も近似する生殖細胞系列：ａｔ４）は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）を有する。
Figure 2013533210
ハイブリドーマ２Ｄ１１ ＶＨのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）は、以下のとおりである。
Figure 2013533210
２Ｄ１１ ＶＬは、以下のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を有する。
Figure 2013533210
ハイブリドーマ３Ｈ６（最も近似する生殖細胞系列：Ｊ５５８．１８．１０８）は、以下のＶＨヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）を有する。
Figure 2013533210
３Ｈ６ ＶＬ（最も近似する生殖細胞系列：ｃｐ９、ＪＫ１）は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）を有する。
Figure 2013533210
ハイブリドーマ３Ｈ６ ＶＨのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）は、以下のとおりである。
Figure 2013533210
ハイブリドーマ３Ｈ６ ＶＬのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）は、以下のとおりである。
Figure 2013533210
ハイブリドーマ１Ｅ１２（最も近似する生殖細胞系列：７１８３．４６ ＶＨ７）は、以下のＶＨヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）を有する。
Figure 2013533210
１Ｅ１２ ＶＬ（最も近似する生殖細胞系列：ａｉ４）は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）を有する。
Figure 2013533210
ハイブリドーマ１Ｅ１２ ＶＨのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、以下のとおりである。
Figure 2013533210
１Ｅ１２ ＶＬは、以下のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）を有する。
Figure 2013533210
ハイブリドーマ３Ａ８（最も近似する生殖細胞系列：ＶＨＪ６０６．４．８．２）は、以下のＶＨヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）を有する。
Figure 2013533210
３Ａ８ ＶＬ（最も近似する生殖細胞系列：ＫＶ１９−２５、ＪＫ２）は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）を有する。
Figure 2013533210
ハイブリドーマ３Ａ８ ＶＨのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）は、以下のとおりである。
Figure 2013533210
ハイブリドーマ３Ａ８ ＶＬのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）は、以下のとおりである。
Figure 2013533210
ハイブリドーマ１Ｃ１１（最も近似する生殖細胞系列：ＶＨ９−１５、ＤＳＴ４−Ｃ５７Ｂｌ−６、ＪＨ３）は、以下のＶＨヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）を有する。
Figure 2013533210
１Ｃ１１ ＶＬ（最も近似する生殖細胞系列：ＶＫ２３−４３、ＪＫ５）は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）を有する。
Figure 2013533210
ハイブリドーマ１Ｃ１１ ＶＨのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）は、以下のとおりである。
Figure 2013533210
ハイブリドーマ１Ｃ１１ ＶＬのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）は、以下のとおりである。
Figure 2013533210
得られた配列から、生殖細胞系列ＶＨおよびＶＬの遺伝子セグメントに最も近く適合するものを、表１に示されるように判定した。
（表１）配列決定されたハイブリドーマ細胞株についての生殖細胞系列の一致
Figure 2013533210
５つのハイブリドーマのそれぞれが、独自のＶＨ遺伝子を発現した。図１１は、初めに配列決定された４つのＶＨ遺伝子のアラインメントを示し、図１３は、配列決定された５つ全てのＶＨ遺伝子のアラインメントを示す。図１５は、１Ｃ１１および３Ａ８のみの配列決定されたＶＨ遺伝子のアラインメントを示す。
図１２は、初めに得られた２つのＶＬ遺伝子のアラインメントを示す。図１４Ａは、配列決定された５つ全てのＶｌ遺伝子のアラインメントを示し、一方で図１４Ｂは、１Ｃ１１のものを除く５つ全ての配列決定されたＶｌ遺伝子のアラインメントを示す。
１つのハイブリドーマ（１Ｃ１１）が、最も一般的なＶＨ遺伝子を増幅する初めのプライマーを用いてもＰＣＲ生成物を作製できなかったという事実は、それが、本明細書で同定される他のもののうちいずれとも同一でない第４のＶＨ遺伝子セグメントを使用していることを示唆する。ハイブリドーマのうち２つは、同じＶＨ生殖細胞系列を使用するが、同一ではない。ハイブリドーマ２Ｄ１１および３Ｈ６の両方が、生殖細胞系列ＶＨ遺伝子セグメントＪ５５８．１８．１０８を使用した。それらの配列を、図１１において、生殖細胞系列遺伝子と比較する。配列調査によると、ＣＤＲ１には１つだけ、ＣＤＲ２には４つ、ＣＤＲ３には５つ（ギャップを含む）の差異があることが明らかになった。
５つのハイブリドーマは同胞ではなく、それらの間では、少なくとも４つのＶＨ生殖細胞系列が利用された。
実施例１０−ｍＡｂ １Ｃ１１、２Ｄ１１、３Ｈ６、１Ｅ１２、および３Ａ８による黄色ブドウ球菌Ｇｍｄ酵素活性の阻害
Ｇｍｄ酵素活性の測定方法は、本質的に、Ｍａｎｉらの方法（Ｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｏｌｙｓｉｓ−Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｒｅａｔｅｄ ｂｙ Ｔｎ９１７−ｌａｃＺ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ"Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５（５）：１４９３−１４９９（１９９３））である。凍結乾燥および再懸濁した単球菌はＧｍｄ活性によって分解され、その結果、４９０ｎｍでの光散乱が減少した。Ｇｍｄを含有する１００μＬのサンプルを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を加えたリン酸緩衝食塩水中に希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに添加した。１００μＬの０．１５％（ｗ／ｖ）の単球菌懸濁液を、各ウェルに添加し、光散乱を即座に測定して、開始Ａ４９０を概して約０．８と定めた。次いで、プレートを３７℃でインキュベートし、光散乱を３０分および６０分で再測定した。６０分でのＡ４９０における低減を、Ｇｍｄ活性の尺度としてとらえた。わずかなバックグラウンドレート（Ｇｍｄなし）を控除した。この方法は、Ｇｍｄ活性をリゾチーム活性と区別しない。
Ｇｍｄ酵素活性の阻害を測定するために、Ｇｍｄを事前に力価測定し、６０分でＡ４９０の約５０％の低減をもたらす濃度を確定した。次いで、９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに、ＰＢＳＴで希釈した５０μＬの抗体、続いて、５０μＬの適切に希釈したＧｍｄを添加し、混合液を５分間以上インキュベートし、最後に１００μＬの０．１５％単球菌を添加し、開始Α４９０を測定した。次いで、プレートを３７℃でインキュベートし、Ａ４９０を、３０分および６０分で測定した。阻害パーセントを、１００＊（１−（Δ６０Α４９０阻害剤／Δ６０Α４９０阻害剤無しの対照））として算出した。
図１８において、５つの抗体のそれぞれの段階希釈に加え、アイソタイプが一致する陰性対照ＭＯＰＣ２１を、組み換え黄色ブドウ球菌Ｈｉｓ−Ｇｍｄ（Ｇｍｄ）または鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）の触媒活性を阻害する能力について評価した。５つの抗Ｇｍｄモノクローナル抗体のそれぞれは、Ｈｉｓ−Ｇｍｄ活性を７５〜８０％阻害したが、ＨＥＬには阻害活性を示さなかった。ＭＯＰＣ２１は、いずれの酵素にも阻害剤活性を有しなかった。これら５つの抗体によるＨｉｓ−Ｇｍｄの阻害の程度は、８０％を超えることはなかった。高度であるが部分的な阻害は、この群の抗体の特徴の１つである。
黄色ブドウ球菌株ＵＡＭＳ−１によって分泌される天然Ｇｍｄ酵素を阻害する、５つの抗体の能力を、図１９に描写する。組み換えＧｍｄと同様に、天然Ｇｍｄは、各抗体によって約８０％阻害された。酵素阻害測定から判断すると、抗体は、天然および組み換えＧｍｄの両方に同様に反応する。
いくつかのモノクローナル抗体に対する抗Ｇｍｄ活性のＳＥＭ分析を、図２０Ｃ〜Ｄに示す。Ｘｅｎ２９黄色ブドウ球菌を、１２時間、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培養液で増殖させ、中間対数増殖懸濁液を得た。次いで、１０，０００ＣＦＵを、抗体無し（図２０Ａ〜Ｂ）、５０μｇ／ｍｌの１Ｅ１２と共に（図２０Ｃ）、または５０μｇ／ｍｌの１Ｃ１１と共に（図２０Ｄ）、１時間インキュベートした。次いで、試料を無菌シリコンチップ上に設置し、固定し、脱水させ、走査電子顕微鏡法での視覚化のために金でコーティングした。顕微鏡写真（図２０Ｃ〜Ｄ）は、抗Ｇｍｄ抗体の効果として、大きな塊の形成を促進し、さらにおおよそ２０％の細胞における細胞非依存性溶解（矢印）があることを図示する。
実施例１１−抗Ｇｍｄ ｍＡｂを含有する受動ワクチンは、マウスＯＭモデルにおいて、整形外科用インプラント後にインビボで黄色ブドウ球菌を阻害する
下腿ピンを有するＯＭモデル（実施例１および６を参照）を使用して、対象ｍＡｂ １Ｃ１１および３Ａ８の、黄色ブドウ球菌のインビボ増殖を阻害する能力を評価した。簡単にいうと、５週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃＪマウスに、手術の３日前に、生理食塩水（ｎ＝１０）、または０．２５ｍｌの生理食塩水中の１ｍｇの精製３Ａ８抗Ｇｍｄ抗体（ｎ＝５）、または０．２５ｍｌの生理食塩水中の３１Ｃ１１ Ａ８抗Ｇｍｄ抗体（ｎ＝５）の腹腔内投与を行った。手術時に、マウスに、５００，０００ＣＦＵのＸｅｎ２９黄色ブドウ球菌を含有する下腿インプラントを移植した。０、３、５、７、１０または１１、および１４日目において、マウスを撮像してバイオルミネセンスを評価し、各群の代表的な動物からのＢＬＩヒートマップを伴う画像を、図２１Ａおよび２２Ａに示す。注目すべきは、抗体力価が有効濃度未満に減少したと推定される時の、１１日目までの抗Ｇｍｄ３Ａ８動物、および５日目までの１Ｃ１１動物におけるＢＬＩ信号の非存在である。本研究における各マウスに対する３日目のＢＬＩ値を、各群に対する平均とともに示す（図２１Ｂ、ｐ＝０．０２、図２２Ｂ）。興味深いことには、１Ｃ１１については、この治療が、３日目で、５０％の動物を治療したことである。１４日目に取得した各群における代表的な動物からのＸ線写真により、抗Ｇｍｄ処理動物には存在しなかった、プラセボマウスにおける骨溶解領域（矢印）を例示する（図２１Ｃ、２２Ｃ）。
実施例１２−ヒト化抗体の作製
１Ｃ１１抗体の軽鎖および重鎖の可変領域を、実施例９に記載の精製ハイブリドーマＰＣＲ生成物から、プライマーを使用して再増幅させ、Ｔｉｌｌｅｒらによって記載のヒト抗体発現ベクター（"Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｂ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ＲＴ−ＰＣＲ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，"Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２９（１−２）：１１２−２４（２００８）、全体として参照することにより本明細書に組み込まれる）にクローニングした。１Ｃ１１の軽鎖および重鎖の可変領域ならびにヒトκおよびＩｇＧ１定常領域を含むプラスミドを調製し、ＨＥＫ２９３細胞に共形質移入させた。３日後、細胞から培地を除去し、ヒトＩｇＧの存在および固定化Ｇｍｄタンパク質への結合について、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼおよび３，３′，５，５′テトラメチルベンジデン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｅｎｅ）基質と結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して検出した。
ヒト：マウスキメラ１Ｃ１１（ｈ１Ｃ１１）が、親マウス１Ｃ１１と同様にＧｍｄと反応することを証明するために、それぞれ、Ｈｉｓ−Ｇｍｄ酵素活性の阻害能力について試験した。ｈ１Ｃ１１およびマウス１Ｃ１１の両方が、ほぼ同一の阻害活性を示し（図２３）、したがって、キメラＩｇＧ分子が、親の結合活性を保持したことを示された。
図１７Ａ〜Ｂにおいて特定される１Ｃ１１のヒトＣＤＲ１およびＣＤＲ２ホモログ、ならびにＩＧＨＤ５−５、１８、および１２＊０１を含むがこれらに限定されない、１つ以上の対象Ｄ領域からのＣＤＲ３領域を使用して、類似の手順を実施する。
ヒト化１Ｃ１１抗体および１Ｃ１１のヒトＣＤＲ１およびＣＤＲ２ホモログを含有する抗体を、主要な関節全置換術を受ける高齢患者（６５歳を超えている）における第１相臨床試験にて利用することができる。
好ましい実施形態を、本明細書に詳細に示しかつ記載したが、本発明の精神を逸脱しない範囲で、種々の改変、追加、置換等が成されてもよく、したがって、これらは、以下の請求項によって定義される本発明の範囲内であると考えられることが、当業者には明らかであろう。
本開示、特に特許請求の範囲および／または項において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等といった用語は、米国特許法において、それに起因する意味を有することができ、例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味することができ、「本質的に〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「本質的に〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」）」といった用語は、米国特許法においてそれらに帰する意味を有することができ、例えば、それらは、明示的に記載されない要素を許容するが、先行技術において見出されるか、または本発明の基本もしくは新規特性に影響する要素を除外するということに留意される。
[本発明1001]
黄色ブドウ球菌(Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ)グルコサミニダーゼに特異的に結合し、かつ黄色ブドウ球菌のインビボ増殖を阻害する、モノクローナル抗体またはその結合部分。
[本発明1002]
前記黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性である、本発明1001のモノクローナル抗体。
[本発明1003]
前記抗体または前記結合部分が、10 −9 Ｍを上回るアフィニティーでグルコサミニダーゼの保存されたエピトープに結合する、本発明1001のモノクローナル抗体。
[本発明1004]
前記黄色ブドウ球菌グルコサミニダーゼのＲ3ドメイン内に全体的にまたは部分的に位置するエピトープに、前記抗体または前記結合部分が結合する、本発明1001のモノクローナル抗体。
[本発明1005]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：36に示される、自己分解酵素のアミノ酸776〜873位、776〜931位、776〜1016位または842〜948位にわたるグルコサミニダーゼポリペプチドフラグメントに結合する、本発明1001のモノクローナル抗体。
[本発明1006]
以下のアミノ酸配列：
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸である
Figure 2013533210
、または
Figure 2013533210
、または
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸である
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
Figure 2013533210
のうちの1つを含むＶ Ｈ ドメインを含むか、
あるいは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2013533210
、または
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸である
Figure 2013533210
、または
Figure 2013533210
、または
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
Figure 2013533210
のうちの1つを含むＶ Ｌ ドメインを含む、本発明1001のモノクローナル抗体。
[本発明1007]
1Ｃ11、1Ｅ12、2Ｄ11、3Ａ8、または3Ｈ6と呼ばれるハイブリドーマ細胞株によって産生される、本発明1001のモノクローナル抗体。
[本発明1008]
黄色ブドウ球菌の細胞非依存性溶解を促進する、本発明1001のモノクローナル抗体。
[本発明1009]
Ｇｍｄの活性を約70〜約80％阻害する、本発明1001のモノクローナル抗体。
[本発明1010]
前記インビボ増殖阻害が、500，000ＣＦＵの生物発光性黄色ブドウ球菌に感染させた下腿インプラントを移植された動物モデルを使用して測定される、本発明1001のモノクローナル抗体。
[本発明1011]
ヒト化された、本発明1001〜1010のいずれかのモノクローナル抗体。
[本発明1012]
本発明1001のモノクローナル抗体結合部分。
[本発明1013]
Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体、Ｖ Ｈ ドメイン、またはＶ Ｌ ドメインを含む、本発明1012のモノクローナル抗体結合部分。
[本発明1014]
本発明1001〜1011のいずれかのモノクローナル抗体または本発明1012もしくは1013の結合部分を発現する、細胞株。
[本発明1015]
ハイブリドーマ1Ｃ11、1Ｅ12、2Ｄ11、3Ａ8または3Ｈ6である、本発明1014の細胞株。
[本発明1016]
担体と、1つ以上の本発明1001〜1011のいずれかのモノクローナル抗体、または1つ以上の本発明1012のモノクローナル抗体結合部分とを含む、薬学的組成物。
[本発明1017]
前記担体が水溶液である、本発明1016の薬学的組成物。
[本発明1018]
抗生物質または免疫療法剤をさらに含む、本発明1016の薬学的組成物。
[本発明1019]
前記抗生物質が、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルフォプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、およびカルバペネムＣＳ−023／ＲＯ−4908463から成る群より選択される、本発明1018の薬学的組成物。
[本発明1020]
前記免疫療法剤が、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ110、またはＡｕｒｅｘｉｓ（商標）である、本発明1018の薬学的組成物。
[本発明1021]
患者に整形外科用インプラントを導入する方法であって、
整形外科用インプラントを必要とする患者に、本発明1001〜1011のいずれかのモノクローナル抗体、本発明1012のモノクローナル抗体結合部分または本発明1016の薬学的組成物の有効量を投与する段階、
該患者に該整形外科用インプラントを導入する段階
を含む、方法。
[本発明1022]
前記導入する段階の前に、前記投与を繰り返す段階をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記導入する段階の後に、前記投与を繰り返す段階をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1024]
前記投与が全身に実施される、本発明1021の方法。
[本発明1025]
前記投与が移植部位に直接実施される、本発明1021〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記整形外科用インプラントが、人工関節、グラフト、または合成インプラントである、本発明1021の方法。
[本発明1027]
前記人工関節が、人工膝関節、人工股関節、人工指関節、人工肘関節、人工肩関節、人工側頭下顎関節、または人工足関節である、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記グラフトまたは前記合成インプラントが、人工椎間板、半月板インプラント、または、合成もしくは同種移植片の前十字靱帯、内側側副靱帯、外側側副靱帯、後十字靱帯、アキレス腱もしくは回旋筋腱板である、本発明1026の方法。
[本発明1029]
前記患者に第2の治療剤を投与する段階をさらに含み、該第2の治療剤が抗生物質または免疫療法剤である、本発明1021〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記抗生物質が、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルフォプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、およびカルバペネムＣＳ−023／ＲＯ−4908463から成る群より選択される、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記免疫療法剤が、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ110、またはＡｕｒｅｘｉｓ（商標）である、本発明1029の方法。
[本発明1032]
前記整形外科用インプラントが全関節再置換術のための人工関節であり、前記方法が、
前記患者に該整形外科用インプラントを導入する前記段階の前に、感染した人工関節を該患者から取り出し、かつ該感染に関して該患者を治療する段階
をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1033]
前記治療する段階が、抗生物質、本発明1001〜1011のいずれかのモノクローナル抗体、本発明1012のモノクローナル抗体結合部分、本発明1016の薬学的組成物またはそれらの組み合わせの有効量を投与することを含む、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記全関節再置換術の間の感染または再感染を予防するのに効果的である、本発明1032または1033の方法。
[本発明1035]
黄色ブドウ球菌感染を治療する方法であって、
黄色ブドウ球菌感染を有する患者に、本発明1001〜1011のいずれかのモノクローナル抗体、本発明1012のモノクローナル抗体結合部分または本発明1016の薬学的組成物の有効量を投与する段階
を含む、方法。
[本発明1036]
前記投与を繰り返す段階をさらに含む、本発明1035の方法。
[本発明1037]
前記投与が全身に実施される、本発明1035の方法。
[本発明1038]
前記投与が前記黄色ブドウ球菌感染の部位に直接実施される、本発明1035の方法。
[本発明1039]
黄色ブドウ球菌感染の前記部位が、皮膚、筋肉、心臓、呼吸器、胃腸、眼、腎臓および尿路、または骨および関節の感染を含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記患者に第2の治療剤を投与する段階をさらに含み、該第2の治療剤が抗生物質または免疫療法剤である、本発明1035〜1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
前記抗生物質が、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルフォプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、およびカルバペネムＣＳ−023／ＲＯ−4908463から成る群より選択される、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記免疫療法剤が、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ110、またはＡｕｒｅｘｉｓ（商標）である、本発明1040の方法。
[本発明1043]
骨髄炎を治療する方法であって、
黄色ブドウ球菌の骨感染または関節感染を有する患者に、本発明1001〜1011のいずれかのモノクローナル抗体、本発明1012のモノクローナル抗体結合部分または本発明1016の薬学的組成物の有効量を投与する段階
を含む、方法。
[本発明1044]
前記投与を繰り返す段階をさらに含む、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記投与が全身に実施される、本発明1043の方法。
[本発明1046]
前記投与が、前記黄色ブドウ球菌の骨感染または関節感染の部位に直接実施される、本発明1043の方法。
[本発明1047]
前記患者に第2の治療剤を投与する段階をさらに含み、該第2の治療剤が抗生物質または免疫療法剤である、本発明1043〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
前記抗生物質が、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルフォプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、およびカルバペネムＣＳ−023／ＲＯ−4908463から成る群より選択される、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記免疫療法剤が、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ110、またはＡｕｒｅｘｉｓ（商標）である、本発明1047の方法。
[本発明1050]
前記患者が、50歳を超えているか、または免疫無防備状態である、本発明1021〜1049のいずれかの方法。

一実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、以下のアミノ酸配列のうちの１つを含む、ＶＨドメインを含む：
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸である
Figure 2013533210
、または
Figure 2013533210
、または
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸である
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、図１３を参照）
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、図１１を参照）
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、図１５を参照）
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、図１７Ａを参照）
Figure 2013533210
。
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、以下のアミノ酸配列のうちの１つを含むＶＬドメインを含む：
Figure 2013533210
、または
Figure 2013533210
、または
Figure 2013533210
、または
Figure 2013533210
、または
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、図１４Ａを参照）
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、図１６を参照）
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、図１２を参照）
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３、図１４Ｂを参照）
Figure 2013533210
、または
Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である（コンセンサス配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、図１７Ｂを参照）
Figure 2013533210
。

Claims (50)

  1. 黄色ブドウ球菌(Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ)グルコサミニダーゼに特異的に結合し、かつ黄色ブドウ球菌のインビボ増殖を阻害する、モノクローナル抗体またはその結合部分。
  2. 前記黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  3. 前記抗体または前記結合部分が、１０−９Ｍを上回るアフィニティーでグルコサミニダーゼの保存されたエピトープに結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  4. 前記黄色ブドウ球菌グルコサミニダーゼのＲ３ドメイン内に全体的にまたは部分的に位置するエピトープに、前記抗体または前記結合部分が結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  5. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示される、自己分解酵素のアミノ酸７７６〜８７３位、７７６〜９３１位、７７６〜１０１６位または８４２〜９４８位にわたるグルコサミニダーゼポリペプチドフラグメントに結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  6. 以下のアミノ酸配列：
    Figure 2013533210
    、または
    Ｘが任意のアミノ酸である
    Figure 2013533210
    、または
    Figure 2013533210
    、または
    Figure 2013533210
    、または
    Ｘが任意のアミノ酸である
    Figure 2013533210
    、または
    Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
    Figure 2013533210
    、または
    Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
    Figure 2013533210
    、または
    Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
    Figure 2013533210
    、または
    Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
    Figure 2013533210
    のうちの１つを含むＶＨドメインを含むか、
    あるいは、以下のアミノ酸配列：
    Figure 2013533210
    、または
    Figure 2013533210
    、または
    Ｘが任意のアミノ酸である
    Figure 2013533210
    、または
    Figure 2013533210
    、または
    Figure 2013533210
    、または
    Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
    Figure 2013533210
    、または
    Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
    Figure 2013533210
    、または
    Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
    Figure 2013533210
    、または
    Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
    Figure 2013533210
    、または
    Ｘが任意のアミノ酸もしくはその欠失である
    Figure 2013533210
    のうちの１つを含むＶＬドメインを含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  7. １Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、または３Ｈ６と呼ばれるハイブリドーマ細胞株によって産生される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  8. 黄色ブドウ球菌の細胞非依存性溶解を促進する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  9. Ｇｍｄの活性を約７０〜約８０％阻害する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  10. 前記インビボ増殖阻害が、５００，０００ＣＦＵの生物発光性黄色ブドウ球菌に感染させた下腿インプラントを移植された動物モデルを使用して測定される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  11. ヒト化された、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  12. 請求項１に記載のモノクローナル抗体結合部分。
  13. Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを含む、請求項１２に記載のモノクローナル抗体結合部分。
  14. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または請求項１２もしくは１３に記載の結合部分を発現する、細胞株。
  15. ハイブリドーマ１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８または３Ｈ６である、請求項１４に記載の細胞株。
  16. 担体と、１つ以上の請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、または１つ以上の請求項１２に記載のモノクローナル抗体結合部分とを含む、薬学的組成物。
  17. 前記担体が水溶液である、請求項１６に記載の薬学的組成物。
  18. 抗生物質または免疫療法剤をさらに含む、請求項１６に記載の薬学的組成物。
  19. 前記抗生物質が、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルフォプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、およびカルバペネムＣＳ−０２３／ＲＯ−４９０８４６３から成る群より選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
  20. 前記免疫療法剤が、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ１１０、またはＡｕｒｅｘｉｓ（商標）である、請求項１８に記載の薬学的組成物。
  21. 患者に整形外科用インプラントを導入する方法であって、
    整形外科用インプラントを必要とする患者に、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項１２に記載のモノクローナル抗体結合部分または請求項１６に記載の薬学的組成物の有効量を投与する段階、
    該患者に該整形外科用インプラントを導入する段階
    を含む、方法。
  22. 前記導入する段階の前に、前記投与を繰り返す段階をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記導入する段階の後に、前記投与を繰り返す段階をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記投与が全身に実施される、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記投与が移植部位に直接実施される、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記整形外科用インプラントが、人工関節、グラフト、または合成インプラントである、請求項２１に記載の方法。
  27. 前記人工関節が、人工膝関節、人工股関節、人工指関節、人工肘関節、人工肩関節、人工側頭下顎関節、または人工足関節である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記グラフトまたは前記合成インプラントが、人工椎間板、半月板インプラント、または、合成もしくは同種移植片の前十字靱帯、内側側副靱帯、外側側副靱帯、後十字靱帯、アキレス腱もしくは回旋筋腱板である、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記患者に第２の治療剤を投与する段階をさらに含み、該第２の治療剤が抗生物質または免疫療法剤である、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記抗生物質が、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルフォプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、およびカルバペネムＣＳ−０２３／ＲＯ−４９０８４６３から成る群より選択される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記免疫療法剤が、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ１１０、またはＡｕｒｅｘｉｓ（商標）である、請求項２９に記載の方法。
  32. 前記整形外科用インプラントが全関節再置換術のための人工関節であり、前記方法が、
    前記患者に該整形外科用インプラントを導入する前記段階の前に、感染した人工関節を該患者から取り出し、かつ該感染に関して該患者を治療する段階
    をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
  33. 前記治療する段階が、抗生物質、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項１２に記載のモノクローナル抗体結合部分、請求項１６に記載の薬学的組成物またはそれらの組み合わせの有効量を投与することを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記全関節再置換術の間の感染または再感染を予防するのに効果的である、請求項３２または３３に記載の方法。
  35. 黄色ブドウ球菌感染を治療する方法であって、
    黄色ブドウ球菌感染を有する患者に、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項１２に記載のモノクローナル抗体結合部分または請求項１６に記載の薬学的組成物の有効量を投与する段階
    を含む、方法。
  36. 前記投与を繰り返す段階をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記投与が全身に実施される、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記投与が前記黄色ブドウ球菌感染の部位に直接実施される、請求項３５に記載の方法。
  39. 黄色ブドウ球菌感染の前記部位が、皮膚、筋肉、心臓、呼吸器、胃腸、眼、腎臓および尿路、または骨および関節の感染を含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記患者に第２の治療剤を投与する段階をさらに含み、該第２の治療剤が抗生物質または免疫療法剤である、請求項３５〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記抗生物質が、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルフォプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、およびカルバペネムＣＳ−０２３／ＲＯ−４９０８４６３から成る群より選択される、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記免疫療法剤が、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ１１０、またはＡｕｒｅｘｉｓ（商標）である、請求項４０に記載の方法。
  43. 骨髄炎を治療する方法であって、
    黄色ブドウ球菌の骨感染または関節感染を有する患者に、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項１２に記載のモノクローナル抗体結合部分または請求項１６に記載の薬学的組成物の有効量を投与する段階
    を含む、方法。
  44. 前記投与を繰り返す段階をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記投与が全身に実施される、請求項４３に記載の方法。
  46. 前記投与が、前記黄色ブドウ球菌の骨感染または関節感染の部位に直接実施される、請求項４３に記載の方法。
  47. 前記患者に第２の治療剤を投与する段階をさらに含み、該第２の治療剤が抗生物質または免疫療法剤である、請求項４３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記抗生物質が、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルフォプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、およびカルバペネムＣＳ−０２３／ＲＯ−４９０８４６３から成る群より選択される、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記免疫療法剤が、テフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ１１０、またはＡｕｒｅｘｉｓ（商標）である、請求項４７に記載の方法。
  50. 前記患者が、５０歳を超えているか、または免疫無防備状態である、請求項２１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
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