ES2606017T3 - Inmunización pasiva anti-glucosaminidasa para infecciones por Staphylococcus aureus - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal o una porcion de union a antigeno del mismo que se une especificamente a una glucosaminidasa de Staphylococcus aureus e inhibe el crecimiento in vivo de S. aureus, en donde el anticuerpo o la porcion de union a antigeno se unen a un epitopo completa o parcialmente dentro del dominio R3 de glucosaminidasa de Staphylococcus aureus.

Description

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DESCRIPCION

Inmunizacion pasiva anti-glucosaminidasa para infecciones por Staphylococcus aureus

Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos n.° de serie 61/330.568, presentada el 3 de mayo de 2010.

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a la inmunizacion pasiva contra infeccion por Staphylococcus aureus, particularmente para la prevencion o tratamiento de la osteomielitis y para la implantacion de un implante ortopedico o injerto. Pueden usarse para estos fines anticuerpos que se unen especificamente a glucosaminidasa de S. aureus y composiciones farmaceuticas que contienen los mismos.

Antecedentes de la invencion

Hay una gran necesidad de novedosas intervenciones de osteomielitis cronica (OM) dado que se producen aproximadamente 112.000 infecciones al ano en Estados Unidos relacionadas con dispositivos ortopedicos, a un coste hospitalario aproximado de 15.000-70.000 dolares por incidente (Darouiche, "Treatment of Infections Associated With Surgical Implants", N. Engl. J. Med. 350(14): 1422-9 (2004)). A pesar de que las mejoras en la tecnica quirurgica y la profilaxis con antibioticos agresivos han disminuido la tasa de infeccion despues de la cirugia de implante ortopedico en un 1-5 %, la osteomielitis (OM) sigue siendo un problema grave y parece estar en aumento en la cirugia minimamente invasiva (Mahomed et al., "Rates and Outcomes of Primary and Revision Total Hip Replacement in the United States Medicare Population", J. Bone Joint Surg. Am. 85(A-1): 27-32 (2003); WHO Global Strategy for Containment of Antimicrobial Resistance, 2001). La importancia de este resurgimiento, un 80 % del cual se debe a Staphylococcus aureus, se amplifica por el hecho de que ~50 % de los aislados clinicos son S. aureus resistentes a la meticilina (MRSA). Aunque las tasas de infeccion para las protesis articulares y los dispositivos de fijacion de fracturas han sido unicamente del 0,3-11 % y el 5-15 % de los casos, respectivamente, durante la ultima decada (Lew y Waldvogel, "Osteomyelitis", Lancet 364(9431): 369-79 (2004); Toms et al., "The Management of Peri-Prosthetic Infection in Total Joint Arthroplasty", J. Bone Joint Surg. Br. 88(2): 149-55 (2006)), este resultado puede llevar a la amputacion o la muerte. Ademas, la popularizacion de la "cirugia minimamente invasiva" para el reemplazo articular total electivo (TJR) en la que la incision muy pequena a menudo conduce a complicaciones de la protesis en contacto con la piel durante la implantacion, ha aumentado notablemente la incidencia de OM (Mahomed et al., "Rates and Outcomes of Primary and Revision Total Hip Replacement in the United States Medicare Population", J. Bone Joint Surg. Am. 85(A-1): 27-32 (2003); WHO Global Strategy for Containment of Antimicrobial Resistance, 2001). Estas infecciones requieren una cirugia de revision en dos fases muy costosa, e informes recientes sugieren que las tasas de exito podrian ser tan bajas como del 50 % (Azzam et al., "Outcome of a Second Two-stage Reimplantation for Periprosthetic Knee Infection", Clin. Orthop. Relat. Res. 467(7): 1706-14 (2009)). Sin embargo, la mayor preocupacion es la aparicion de cepas resistentes a los farmacos, sobre todo MRSA, que ha superado al VIH como el patogeno mas letal en America del Norte, y continua haciendo la gestion de la OM cronica mas dificil, planteando una gran demanda de intervenciones terapeuticas novedosas. Hay una gran necesidad de estrategias de intervencion alternativas, en particular para ancianos inmunodeprimidos que son los principales receptores de TJR.

En la actualidad, no existen tratamientos profilacticos que puedan proteger a los pacientes de alto riesgo contra MRSA, sobre todo los nacidos durante el "baby boom" que representan la mayor parte de los 1,5 millones de TJR realizados anualmente en Estados Unidos. Una vacuna que disminuira la incidencia de SARM en un 50-80 % no solo reducira la complicacion principal del reemplazo de articulaciones y los procedimientos de reparacion de fracturas abiertas, sino que tambien reducira la carga sanitaria en una cantidad similar.

Los estudios han documentado que el 80 % de la OM cronica es causada por S. aureus. Estas bacterias contienen varios factores que los convierten en patogenos oseos, incluyendo varias moleculas de adhesion que facilitan su union a la matriz osea (Flock et al., "Cloning and Expression of the Gene for a Fibronectin-Binding Protein From Staphylococcus aureus", Embo. J. 6(8): 2351-7 (1987)), toxinas capaces de estimular la resorcion osea (Nair et al., "Surface-Associated Proteins From Staphylococcus aureus Demonstrate Potent Bone Resorbing Activity", J. Bone Miner. Res. 10(5): 726-34 (1995)), a traves de una actividad de osteoclasto aumentada (Marriott et al., "Osteoblasts Express the Inflammatory Cytokine Interleukin-6 in a Murine Model of Staphylococcus aureus Osteomyelitis and Infected Human Bone Tissue", Am. J. Pathol. 164(4):1399-406 (2004)). La etapa limitante de la velocidad en la evolucion y persistencia de la infeccion es la formation de una biopelicula alrededor de los dispositivos implantados (Costerton et al., "Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections", Science 284(5418): 1318-22 (1999)). Poco despues de la implantacion, se forma en la superficie del implante una capa de acondicionamiento compuesta de adhesinas derivadas del huesped (incluyendo fibrinogeno, fibronectina y colageno) e invita a la adherencia de bacterias libremente flotantes derivadas de la siembra hematogena, incluyendo la propagation de la infeccion desde una region contigua (La piel adyacente a una herida), la inoculation quirurgica de bacterias en el hueso o el traumatismo coincidente con una interruption significativa de la envoltura osea de tejido blando asociada (Darouiche, "Treatment of Infections Associated With Surgical Implants", N. Engl. J. Med. 350(14): 1422-9 (2004)).

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En los siguientes dias, la division celular bacteriana, el reclutamiento de organismos planctonicos adicionales y la secrecion de productos bacterianos (como el glicocalix) produce la biopelicula. Esta biopeKcula sirve como una barrera dominante para proteger las bacterias de la accion de antibioticos, celulas fagodticas, anticuerpos y deteriora las funciones de los linfocitos (Gray et al., "Effect of Extracellular Slime Substance From Staphylococcus epidermidis on the Human Cellular Immune Response", Lancet 1(8373): 365-7 (1984); Johnson et al., "Interference With Granulocyte Function By Staphylococcus epidermidis Slime", Infect. Immun. 54(1): 13-20 (1986); Naylor et al., "Antibiotic Resistance of Biomaterial-Adherent Coagulase-Negative and Coagulase-Positive Staphylococci", Clin. Orthop. Relat. Res. 261: 126-33 (1990)).

Otro descubrimiento reciente es que S. aureus no solo coloniza la matriz osea, sino que tambien es internalizada por los osteoblastos in vitro (Ellington et al., "Involvement of Mitogen-Activated Protein Kinase Pathways in Staphylococcus aureus Invasion of Normal Osteoblasts", Infect. Immune. 69(9): 5235-42 (2001)) e in vivo (Reilly et al., "In Vivo Internalization of Staphylococcus aureus by Embryonic Chick Osteoblasts", Bone 26(1): 63-70 (2000)). Esto proporciona otra capa de resistencia a los anticuerpos y a los antibioticos. Esta fase de la infeccion se produce en condiciones de actividad metabolica marcadamente reducida y, a veces, aparece como las denominadas variantes de colonia pequena que probablemente explica su persistencia (Proctor et al., "Persistent and Relapsing Infections Associated with Small-Colony Variants of Staphylococcus aureus", Clin. Infect. Dis. 20(1): 95-102 (1995)). En este punto las bacterias tambien pueden expresar resistencia fenotipica al tratamiento antimicrobiano, explicando tambien la alta tasa de fracaso de cursos cortos de terapia (Chuard et al., "Resistance of Staphylococcus aureus Recovered From Infected Foreign Body in Vivo to Killing by Antimicrobials", J. Infect. Dis. 163(6): 1369-73 (1991)). Debido a estos mecanismos patogenos extensos, OM es notoria por su tendencia a recurrir incluso despues de anos de inactividad, y se acepta que una curacion completa es un resultado poco probable (Mader y Calhoun, "Long-Bone Osteomyelitis Diagnosis and Management", Hosp. Pract. (Off Ed) 29(10): 71-6, 9, 83 passim (1994)).

Una de las preguntas clave en el campo de la OM cronica es por que el conocimiento actual de los factores que regulan la OM cronica es tan limitado. Supuestamente, las herramientas experimentales necesarias para dilucidar la genetica de virulencia bacteriana han estado disponibles durante mas de un siglo. Hay tres explicaciones para esta anomalia. En primer lugar, aunque el numero total de casos de osteomielitis es alto, su incidencia del 1-5 % es demasiado baja para estudios clinicos prospectivos, con la posible excepcion de la artropatia de revision. En segundo lugar, se conoce bien que los cultivos in vitro seleccionan rapidamente el crecimiento de organismos que no elaboran una capsula extracelular, de tal manera que la biologia de biopelicula solo puede estudiarse con modelos in vivo. (Costerton et al., "Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections", Science 284(5418): 1318-22 (1999)). Esto conduce al "mayor obstaculo" en este campo, que es la ausencia de un modelo animal cuantitativo que pueda evaluar la fase inicial de crecimiento planctonico de las bacterias antes de la formation de la biopelicula. Hasta la fecha, gran parte del conocimiento de su patogenesis proviene de modelos animales (Norden, "Lessons Learned From Animal Models of Osteomyelitis", Rev. Infect. Dis. 10(1): 103-10 (1988)), que se han desarrollado para el pollo (Daum et al., "A Model of Staphylococcus aureus Bacteremia, Septic Arthritis, and Osteomyelitis in Chickens", J. Orthop. Res. 8(6): 804-13 (1990)), rata (Rissing et al., "Model of Experimental Chronic Osteomyelitis in Rats", Infect. Immun. 47(3): 581-6 (1985)), cobaya (Passl et al., "A Model of Experimental PostTraumatic Osteomyelitis in Guinea Pigs", J. Trauma 24(4): 323-6 (1984)), conejo (Worlock et al., "An Experimental Model of Post-Traumatic Osteomyelitis in Rabbits", Br. J. Exp. Pathol. 69(2): 235-44 (1988)), perro (Varshney et al., "Experimental Model of Staphylococcal Osteomyelitis in Dogs", Indian J. Exp. Biol. 27(9): 816-9 (1989)), oveja (Kaarsemaker et al., "New Model for Chronic Osteomyelitis With Staphylococcus aureus in Sheep", Clin. Orthop. Relat. Res. 339: 246-52 (1997)) y mucho mas recientemente un raton (Marriott et al., "Osteoblasts Express the Inflammatory Cytokine Interleukin-6 in a Murine Model of Staphylococcus aureus Osteomyelitis and Infected Human Bone Tissue", Am. J. Pathol. 164(4): 1399-406 (2004)). Aunque estos modelos se han utilizado para confirmar la importancia de adhesinas bacterianas identificadas a partir de ensayos in vitro (Chuard et al., "Susceptibility of Staphylococcus aureus Growing on Fibronectin-Coated Surfaces to Bactericidal Antibiotics", Antimicrob. Agents Chemother. 37(4): 625-32 (1993); Buxton et al., "Binding of a Staphylococcus aureus Bone Pathogen to Type I Collagen", Microb. Pathog. 8(6):441-8 (1990); Switalski et al., "A Collagen Receptor on Staphylococcus aureus Strains Isolated From Patients With Septic Arthritis Mediates Adhesion to Cartilage", Mol. Microbiol. 7(1): 99-107 (1993)), no tienen una medida de resultado de crecimiento in vivo, carga bacteriana u osteolisis. Por lo tanto, no pueden utilizarse eficazmente para evaluar los efectos de los farmacos, los mutantes bacterianos y el papel de los factores del huesped con ratones transgenicos.

Basandose en mas de 150 anos de investigation, ha surgido un claro paradigma para explicar la patogenesis microbiana. Este modelo tambien se aplica a OM. El paso inicial de la infeccion se produce cuando una bacteria unicelular invade el cuerpo. En este punto, el microbio debe responder a los cambios ambientales y expresar los genes de virulencia que le ayudaran a derrotar la inmunidad innata y le proporcionara receptores de adhesina para unirse al huesped. La bacteria tambien depende de la disponibilidad estocastica de adhesinas huesped a partir de tejido necrotico o un cuerpo extrano tal como un implante. El exito de estas etapas conduce a una fase de crecimiento exponencial, que cesa en el punto de agotamiento de los nutrientes y/o el desarrollo de la inmunidad adaptativa. Despues de la fase de crecimiento exponencial, las bacterias se ven obligadas a persistir en condiciones de crecimiento latentes dentro de la biopelicula. Sin embargo, en este punto la infeccion es ahora cronica y no puede ser erradicada por los farmacos o la inmunidad del huesped. Por lo tanto, el enfoque en este campo ha sido sobre las adhesinas de superficie celular que interactuan especificamente con componentes de matriz extracelular

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conocidos como MSCRAMM (componentes de superficie microbiana que reconocen moleculas de matriz adhesivas) (Patti et al., "MSCRAMM-Mediated Adherence of Microorganisms to Host Tissues", Annu. Rev. Microbiol. 48: 585617 (1994)). De hecho, esencialmente todas las vacunas anti-S. Aureus que se han desarrollado hasta la fecha se han dirigido contra MSCRAMM que son importantes para la colonization e invasion del tejido huesped. El objetivo de estas vacunas es generar anticuerpos que se unan a estos antigenos de superficie, inhibiendo asi su fijacion al tejido huesped. Mediante la opsonization de la superficie bacteriana, estos anticuerpos tambien pueden mediar la depuration de S. aureus por celulas fagociticas. Desafortunadamente, S. aureus tiene muchas adhesinas, de tal manera que la inhibicion de una o mas puede no ser suficiente para prevenir la union bacteriana. Ademas, la depuracion bacteriana por celulas fagociticas puede estar limitada en el tejido avascular, de modo que el mAb puede necesitar un mecanismo de action anti-microbiano adicional para reducir significativamente el crecimiento planctonico in vivo de S. aureus y prevenir el establecimiento de OM cronica o reinfection durante la cirugia de revision de reemplazo de articulation total.

La presente invention esta dirigida a superar estas y otras deficiencias en la tecnica.

El documento US 2002/0076766 (D1) describe polipeptidos de glucosaminidasa y polipeptidos de glucosaminidasa de codification de ADN(ARN) y metodos para producir dichos polipeptidos mediante tecnicas recombinantes.

El documento WO 2010/0395363 (D2) describe una vacuna protectora contra biopeliculas de Staphylococcus aureus que comprende inmunogenos asociados a la pared celular.

El documento WO 2010/028013 (D3) describe el diagnostico y tratamiento de infecciones por biopelicula in vivo.

Brady et al., 2006 (Infection and Immunity 74(6): 3415; D4) describen la identification de proteinas de Staphylococcus aureus reconocidas por la respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos a una infeccion por biopelicula.

Brady et al., 2011 (Infection and Immunity 79(4): 1797; D5) describen la resolution de una infection por biopelicula de Staphylococcus aureus usando vacunacion y tratamiento antibiotico.

Varrone et al., 2011 (IBMS BoneKEy 8(4): 187; D6) describen anticuerpos monoclonales de anti-glucosaminidasa como una inmunizacion pasiva para infecciones ortopedicas por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA).

Varrone et al., 2011 (57th Annual Meeting of the Orthopedic Research Society; D7) evaluan los anticuerpos monoclonales anti-glucosaminidasa como una inmunizacion pasiva para osteomielitis.

Kates et al., 2011 (European Cells and Materials 21(Supl. 2): 23; D8) describen el desarrollo de una inmunizacion pasiva para osteomielitis por MRSA.

Garcia-Lara and Foster, 2009 (Curr Opin in Pharmacol 9: 552; D9) revisa el estado actual y los prospectos de la inmunoterapia anti-Staphylococcus aureus.

Sumario de la invencion

Un primer aspecto de la presente invencion esta dirigido a un anticuerpo monoclonal o una portion de union a antigeno del mismo que se une especificamente a una glucosaminidasa de Staphylococcus aureus e inhibe el crecimiento in vivo de S. aureus, en donde el anticuerpo monoclonal o la porcion de union a antigeno del mismo se unen especificamente a un epitopo situado completa o parcialmente en un dominio R3 de la glucosaminidasa de S. aureus.

Un segundo aspecto de la presente invencion se refiere a una linea celular que expresa un anticuerpo monoclonal o una porcion de union a antigeno de la presente invencion. En una realization, la linea celular es una linea celular de hibridoma. En otra realizacion, la linea celular es una linea celular recombinante que expresa el anticuerpo.

Un tercer aspecto de la presente invencion se refiere a una composition farmaceutica que puede incluir un vehiculo y uno o mas anticuerpos monoclonales por porciones de union a antigeno de la presente invencion.

Un cuarto aspecto de la presente invencion se refiere a un anticuerpo monoclonal, una porcion de union a antigeno, o una composicion farmaceutica de la presente invencion para su uso en un metodo de tratamiento de infeccion por S. aureus en un paciente que tiene una infeccion por S. aureus.

Un quinto aspecto de la presente invencion se refiere a un anticuerpo monoclonal, una porcion de union a antigeno, o una composicion farmaceutica de la presente invencion para su uso en un metodo de tratamiento de osteomielitis en un paciente que tiene una infeccion osea o articular S. aureus.

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Un sexto aspecto de la presente invention se refiere a un anticuerpo monoclonal, una portion de union a antigeno o una composition farmaceutica de la presente invencion para su uso en un metodo para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cio^a en el que la cirugia comprende introducir un implante ortopedico en un paciente que necesita un implante ortopedico y en el que el implante ortopedico esta revestido o tratado con el anticuerpo monoclonal, la porcion de union a antigeno o la composicion farmaceutica, antes, durante o inmediatamente despues de la implantation. En este aspecto de la presente invencion, el anticuerpo monoclonal, la porcion de union a antigeno o la composicion farmaceutica actua como un agente profilactico. En ciertas realizaciones, este aspecto de la invencion esta dirigido a prevenir la OM o una reinfection por S. aureus durante o posterior a una cirugia de revision de reemplazo de articulation total.

Debido al S. aureus, y en especial las variantes resistentes a los antibioticos, tal como S. aureus resistente a la meticilina (MRSA), son las causas mas comunes y dificiles de las infecciones por Staphylococcus, los usos de la presente invencion tienen el objetivo de alterar etapas criticas en el ciclo de crecimiento de estos microorganismos. La presente invencion tambien se refiere a una inmunizacion pasiva para prevenir las infecciones en los pacientes, por ejemplo, pacientes que se someten al reemplazo articular total. El destino seleccionado para la inmunizacion es la glucosaminidasa (Gmd) que S. aureus secreta para facilitar la citocinesis, la separation de las celulas durante la mitosis (Oshida et al., "A Staphylococcus aureus Autolysin that has an N-acetylmuramoyl-L-Alanine Amidase Domain and an Endo-beta-N-acetylglucosaminidase Domain: Cloning, Sequence Analysis, and Characterization", Proc Natl Acad Sci U S A 92: 285-9 (1995); Oshida et al., "Expression Analysis of the Autolysin Gene (atl) of Staphylococcus aureus", Microbial Immunol 42: 655-9 (1998); Sugai et al., "Localized Perforation of the Cell Wall by a Major Autolysin: atl Gene Products and the Onset of Penicillin-induced Lysis of Staphylococcus aureus", J Bacteriol 179: 2958-62 (1997); y Yamada et al., "An Autolysin Ring Associated with Cell Separation of Staphylococcus aureus", J Bacteriol 178: 1565-71 (1996)). Para estudiar y evaluar infecciones por S. aureus, OM y diversas terapias dirigidas a infecciones por Staphylococcus, se uso un modelo murino novedoso de OM asociado a implante en el que un clavo de acero inoxidable esta revestido con S. aureus e implantado por via transcortical a traves de la metafisica tibial (Li et al., "Quantitative Mouse Model of Implant-Associated Osteomyelitis and the Kinetics of Microbial Growth, Osteolysis, and Humoral Immunity", J. Orthop. Res. 26(1): 96-105 (2008)). Este modelo proporciona OM altamente reproducible con una biopelicula Gram-positiva, osteolisis, formation de secuestro/involucro, y se asemeja estrechamente a la OM clinica. Ademas, se uso formacion de imagenes por bioluminiscencia in vivo para cuantificar la fase de crecimiento planctonicas de las bacterias; se uso PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) para determinar el numero de copias del gen nuc en el tejido oseo infectado para cuantificar la carga bacteriana total; y se uso micro-CT para cuantificar la osteolisis.

Usando el modelo murino que se ha mencionado anteriormente de osteomielitis, se han identificado anticuerpos especificos para Gmd como una parte visible de la respuesta inmune de exito en los ratones estimulados. Ademas, una vacuna que comprende Gmd recombinante con His6 N-terminal (Gmd-His) provoco al menos una inmunidad parcial en el modelo de raton. Los anticuerpos anti-Gmd pueden bloquear la division celular de S. aureus ya sea bloqueando directamente la division celular o reclutando efectores huesped, tales como fagocitos, o complementar en un punto vulnerable en el ciclo de la division celular.

Los experimentos que demuestran la action de los anticuerpos monoclonales individuales en el crecimiento celular de S. aureus se presentan en detalle en los ejemplos adjuntos. El objetivo especifico fue determinar si los anticuerpos individuales, en ausencia de cualquier efector inmune, suprimiran o alteraran el crecimiento de S. aureus de division rapida. El aumento relacionado con el crecimiento en la dispersion de la luz por los cultivos crecientes de S. aureus Xen29 se redujo en cinco anticuerpos monoclonales seleccionados, pero no parecio alterar en realidad la tasa de crecimiento in vitro de por si. Mas bien, parecen haber reducido la actividad de Gmd en un grado tal que las celulas en division no pudieron separarse unas de otras. El efecto fue dependiente de la dosis y compatible con una interaction de alta afinidad entre cada anticuerpo y Gmd. Estos efectos demuestran que estos anticuerpos, dirigidos contra Gmd recombinante, reaccionan eficazmente con la Gmd nativa y disminuyen su actividad enzimatica. Uno de los anticuerpos monoclonales, 1C11, demostro la capacidad unica para promover la lisis independiente de las celulas de S. aureus, y dos anticuerpos monoclonales, 1C11 y 3A8, demostraron una capacidad para inhibir el crecimiento de S. aureus in vivo y la infection durante la cirugia de implante ortopedico en un modelo de raton in vivo.

Se aprecia que en esta divulgation, y particularmente en la reivindicaciones y/o parrafos, los terminos tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado que se le atribuye en la ley de Patentes de Estados Unidos; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye", y similares; y que expresiones tales como "que consiste basicamente en" y "consiste basicamente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de Patentes de Estados Unidos, por ejemplo, permiten elementos no mencionados explicitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la tecnica anterior o que afectan a una caracteristica basica o novedosa de la invencion.

Breve descripcion de los dibujos

Las figuras 1A-C muestran la cuantificacion de la osteolisis de osteomielitis asociada a implante. Una serie

longitudinal de rayos X de un raton representativo demuestra el desarrollo de osteolisis asociada a implante en el

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tiempo en este modelo (figura 1A). Vistas medias de imagenes de |jCT (tomografia microcomputerizada) reconstruidas de tibias representativas de ratones (N = 5) que recibieron un clavo trans-tibial revestido con S. aureus y se sacrificaron el dia indicado (figura 1B). Tambien se muestran ratones de control que recibieron un clavo trans-tibial revestido con S. aureus y tratados con gentamicina parenteral (Gent), o recibieron un clavo esteril. El area osteolitica en torno al clavo se cuantifico como se ha descrito previamente (Li et al., "Quantitative Mouse Model of Implant-Associated Osteomyelitis and the Kinetics of Microbial Growth, Osteolysis, and Humoral Immunity", J. Orthop. Res. 26(1): 96-105 (2008), y los datos se presentan como la media +/- DE (* p<0,05 frente a Dia 4; ** p<0,05 frente a Gent Dia 18) (figura 1C). No habia ninguna diferencia en el area de osteolisis entre los controles de gentamicina y el clavo esteril.

Las figuras 2A-H muestran la histologia de la OM asociada a implante trans-tibial. H&E (Tincion de Hematoxilina y Eosina) (figures 2A-C), TRAP (fosfatasa acida resistente a tartrato) (figuras 2D-F) y secciones tenidas con Gram (figuras 3G y 3H) de histologia en el sitio del clavo (*) adyacente al cortex tibial (#), 9 dias despues del implante de un clavo esteril (figuras 2A, 2D y 2G), o un revestido con S. aureus (figuras 2B, 2C, 2E, 2F y 2H). Ha de apreciarse que el nuevo hueso (h) que se forma en torno al clavo esteril (figura 2A, 2D y 2G) frente al secuestro necrotico (s) e involucro (i) adyacente el clavo infectado. Mientras que muy pocos osteoclastos TRAP+ (puntas de flecha de color amarillo) estaban presentes en las muestras no infectadas (figura 2D), numerosos osteoclastos parecen estar reabsorbiendo activamente el cortex adyacente al clavo infectado, y remodelando el nuevo hueso tejido que reviste el involucro (figuras 2E y 2F). La tincion Gram confirmo la ausencia de bacterias en los especimenes con el clavo esteril (figura 2G) y su presencia (puntas de flecha de color negro) en el hueso necrotico alrededor de los clavos infectados.

Las figuras 3A-C muestran la correlacion inversa entre la carga bacteriana y la inmunidad humoral contra los antigenos de S. aureus durante el establecimiento de la osteomielitis cronica. Se realizo un estudio de transcurso de tiempo en el que a los ratones se les dio un clavo transcortical infectado que contenia 1 x 106 UFC de S. aureus en sus tibias y se sacrificaron el dia indicado. En el sacrificio, el ADN se purifico de la tibia infectada y el analisis por RTQ-PCR se realizo para determinar los valores de Ct para S. aureus nuc. Usando una curva estandar mostrada, este numero se convirtio en los genes nuc recuperables por tibia. Para controlar la integridad de las muestras, el gen nuc recuperable por el valor de la tibia se estandarizo con respecto al valor de Ct para la p-actina de raton para cada muestra. A partir de esta conversion, la carga bacteriana se derivo como "Copias del gen Nuc/Tibia". Los datos de cada raton se muestran en la figura 3A como un punto individual, y la media +/- DE para cada punto temporal (n = 5) se presenta en la figura 3B. Para evaluar el desarrollo de anticuerpos especificos de anti-S. aureus durante el establecimiento de OM, se tomo suero de cada raton en el grupo que se sacrifico el dia 18, antes de la infeccion (dia 0) y los 4, 7, 11, 14 y 18 despues de la infeccion. Este suero se uso como el anticuerpo principal en transferencias Western de extracto de S. aureus total que despues se sondaron con anticuerpos conjugados con HRP que son especificos para IgG de raton como se muestra en la figura 3C. Los datos muestran que hay un aumento estable del crecimiento bacteriano del dia 0 al dia 11, cuando el primer huesped desarrolla anticuerpos especificos contra las bacterias. Segun el titulo de los anticuerpos anti-S. aureus aumenta, la carga bacteriana disminuye, lo que sugiere que los anticuerpos son protectores. Las transferencias de Western tambien identifican claramente cuatro antigenos inmunodominantes de 26, 34, 38 y 56 kDa (flechas). Tambien se ha demostrado que Xen 29 induce anticuerpos contra las mismas proteinas 26, 34, 38 y 56 kDa.

Las figuras 4A-C muestran que la glucosaminidasa de autolisina de S. aureus es el antigeno inmunodominante de 56 kDa. Para elucidar la identidad molecular de los antigenos de S. aureus novedosos identificados en la figura 3, se realizo un analisis de inmunotransferencia sustractivo de 2D-SDS-PAGE de extracto de celula completa con suero pre-inmune e inmune del dia 14. Tres geles 2D se realizaron despues de enfoque isoeletrico (pH 4,0-10,0). El primero se tino en azul de Coomassie (figura 4A). Los otros se sometieron a transferencia Western con suero del dia 0 (figura 4B) o el dia 14 (figura 4C). Ademas de la reactividad de fondo, el suero inmune detecto un polipeptido especifico (~53 kDa; pH 9: flecha). El punto de 53 kDa se elimino del gel de Coomassie, se digirio con tripsina, y se analizo por MALDI, que resolvio 70 picos peptidicos individuales. La secuencia de aminoacido de cada peptido tenia una correspondencia del 100 % con la secuencia conocida de la glucosaminidasa de autolisina de S. aureus, que es de 53,6 kDa y tiene un pi de 9,66.

Las figuras 5A-B muestran la cuantificacion por imagen bioluminiscente (BLI) del crecimiento bacteriano durante el establecimiento de osteomielitis cronica. La figura 5A muestra los niveles de BLI (p/s/cm2/sr) en el sitio de infeccion y se evaluo longitudinalmente en ratones que recibieron un clavo trans-tibial esteril (no infectado), o un clavo revestido con Xen 29 S. aureus (infectado) y se diagnosticaron por imagen el dia indicado. El circulo en la imagen de color izquierda superior destaca la region de interes (ROI) de 1,5 cm de diametro que se evaluo para determinar la BLI en cada raton en cada punto temporal. La figura 5B muestra los datos de ratones (N = 5) que estaban Sin infectar, Infectados o se infectaron y se trataron con antibioticos parenterales (Gentamicina) y se evaluaron para determinar la BLI longitudinalmente en el momento indicado tras la cirugia. Los datos se presentan como la media +/- DE (* Significativamente mayor frente al Dia 0; p<0,05).

Las figuras 6A-B muestran que ELISA anti-Gmd funcional demostro la eficacia de la vacuna de Gmd recombinante. La figura 6A muestra ELISA en suero en el que His-Gmd se uso como el antigeno para ensayar titulos de anticuerpo anti-Gmd en suero de raton que se genero usando un anti-suero de alto titulo conocido de ratones infectados con S. aureus. El factor de dilucion seriada (eje X) y la lectura de absorbancia a 450 nm (eje Y) de las muestras de suero diluidas 2 veces en serie se representan graficamente en el plano XY usando el software GraphPad Prism 4. El titulo funcional (1:3623) se extrapola a partir del punto de inflexion (flecha) de la curva de dilucion. La figura 6B muestra el analisis ELISA usado para determinar los titulos de anticuerpos anti- Gmd en los sueros de pre-inmunizacion de ratones, refuerzo previo y pre-estimulacion con la vacuna indicada.

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Ha de apreciarse que unicamente los ratones inmunizados con la vacuna His-Gmd obtuvieron altos titulos.

Las figuras 7A-C muestran que la vacuna de His-Gmd recombinante protege a los ratones de OM asociada a implante. Los ratones (n = 20) se estimularon con un clavo transtibial infectado con Xen29 como se describe en los Ejemplos adjuntos, BLI se realizo el dia 3, y los ratones se sometieron a eutanasia para analisis RT-qPCR de nuc el dia 11. Se muestra una imagen de la BLI de un raton representativo en el Grupo 1 y 3 (figura 7A), y la media +/- DE se presenta para mostrar la BLI de reduction significativa (figura 7B). Esto se traduce en un descenso significativo en los genes nuc amplificables (media +/- DE) el dia 11 (figura 7C).

La figura 8 muestra el crecimiento in vitro de S. aureus Xen29 en presencia de anticuerpos monoclonales anti- Gmd (mAb anti-Gmd). Se incubaron 100 ufc de Xen29 de un cultivo en crecimiento en fase logaritmica a 37 °C con anticuerpos monoclonales anti-Gmd 1C11, 1E12, 2D11, y 3A8, 50 |jg/ml en medio LB. El crecimiento se monitorizo por dispersion de la luz tanto a 670 como 490 nm en los intervalos indicados. MOPC21 es el anticuerpo de control apareado con isotipo.

La figura 9 muestra el efecto dependiente de la dosis del mAb 1C11 anti-Gmd sobre el crecimiento in vitro de S. aureus. Se incubaron 100 ufc de Xen29 de un cultivo en crecimiento en fase logaritmica a 37 °C con un intervalo de concentraciones de mAb 1C11 anti-Gmd en medio LB. El crecimiento se controlo por dispersion de la luz tanto a 670 como 490 nm a los intervalos indicados.

La figura 10 muestra el efecto del mAb de control MOPC21 sobre el crecimiento in vitro de S. aureus. Se incubaron 100 ufc de Xen29 de un cultivo en crecimiento en fase logaritmica a 37 °C con un intervalo de concentraciones de anticuerpo monoclonal de control apareado con isotipo MOPC21 en medio LB. El crecimiento se monitorizo por dispersion de la luz tanto a 670 como 490 nm a los intervalos indicados. Ha de apreciarse que la ligera elevation de la linea de 50 |jg/ml se debe al uso de pocillos externos en la placa de microtitulacion donde las temperaturas se equilibran mas rapidamente.

La figura 11 muestra un alineamiento de secuencia aminoacidica ClustalW de las secuencias Vh de los hibridomas 2D11, 3H6, 1E12 y 3A8. (2D11 Vh = SEQ ID NO: 1; 3H6 Vh = SEQ ID NO: 2; 1E12 Vh = SEQ ID NO: 3; 3A8 Vh = SEQ ID NO: 4). Las secuencias destacadas indican las supuestas regiones determinantes de complementariedad (CDR) en 2D11. Una secuencia consenso (SEQ ID NO: 31) se deriva de estas secuencias de hibridoma.

La figura 12 muestra un alineamiento de secuencia aminoacidica ClustalW de las secuencias Vl de los hibridomas 1E12 y 2D11 (1E12 Vl = SEQ ID NO: 10; 2D11 Vl = SEQ ID NO: 8). Una secuencia consenso (SEQ ID NO: 32) se deriva de estas dos secuencias de hibridoma.

La figura 13 muestra un alineamiento de secuencia aminoacidica ClustalW de las secuencias Vh de los hibridomas 2D11, 3H6, 1E12, 3A8, y 1C11 (2D 11 Vh = SEQ ID NO: 1; 3H6 Vh = SEQ ID NO: 2; 1E12 Vh = SEQ ID NO: 3; 3A8 Vh = SEQ ID NO: 4; 1C11 Vh = SEQ ID NO: 5). Una secuencia consenso (SEQ ID NO: 6) se deriva de estas cinco secuencias de hibridoma.

Las figuras 14A-B muestran un alineamiento de la secuencia aminoacidica ClustalW de las secuencias Vl. La figura 14A muestra el alineamiento Vl de los hibridomas 1E12, 2D11, 3A8, 3H6, y 1C11 (1E12 Vl = SEQ ID NO: 10; 2D11 Vl = SEQ ID NO: 8; 3A8 Vl = SEQ ID NO: 11; 3H6 Vl = SEQ ID NO: 9; 1C11 Vl = SEQ ID NO: 12). Una secuencia consenso (SEQ ID NO: 13) se deriva de estas cinco secuencias de hibridoma. La figura 14B muestra un alineamiento Vl de los hibridomas 1E12, 2D11, 3A8, y 3H6 (1E12 Vl = SEQ ID NO: 10; 2D11 Vl = SEQ ID NO: 8); 3A8 Vl = SEQ ID NO: 11; 3H6 Vl = SEQ ID NO: 9). Una secuencia consenso (SEQ ID NO: 33) se deriva de estas cuatro secuencias de hibridoma.

La figura 15 muestra un alineamiento de la secuencia amino ClustalW de las secuencias Vh de los hibridomas 3A8 y 1C11 (3A8 Vh = SEQ ID NO: 4; 1C11 Vh = SEQ ID NO: 5). Una secuencia consenso (SEQ ID NO: 7) se deriva de estas dos secuencias de hibridoma.

La figura 16 muestra un alineamiento de secuencia aminoacidica ClustalW de las secuencias Vl de los hibridomas 3A8 y 1C11 (3A8 Vl = SEQ ID NO: 11; 1C11 Vl = SEQ ID NO: 12). Una secuencia consenso (SEQ ID NO: 14) se deriva de estas dos secuencias de hibridoma.

La figura 17A ilustra un alineamiento del dominio Vh 1C11 (SEQ ID NO: 5) con una secuencia aminoacidica homologa (SEQ ID NO: 19) codificada por el gen humano IGV7-81 (vease el Acceso al Genbank AAH32733 y BC032733). Se muestra una secuencia consenso para los homologos Vh (SEQ ID NO: 34). La figura 17B ilustra un alineamiento del dominio 1C11 Vl (SEQ ID NO: 12) con una secuencia aminoacidica homologa (SEQ ID NO: 20) codificada por el gen humano IGVK6D-21 (vease el Acceso al Genbank AAA58917 y M29469). Se muestra una secuencia consenso para los homologos VL (SEQ ID NO: 35).

La figura 18 muestra la inhibition de His-Gmd (Gmd) de S. aureus y despues lisozima de huevo de gallina (HEL) por los cinco anticuerpos monoclonales anti-Gmd con MOPC21 como un control negativo apareado a isotipo. La concentration del anticuerpo en jg/ml se enumera en el eje x; la inhibicion de la actividad enzimatica en el porcentaje (%) se enumera en el eje Y. Los cinco mAb anti-Gmd (1C11, 1E12, 2D11, 3A8, y 3H6) inhiben la actividad de Gmd, pero no tienen ningun efecto sobre la actividad de HEL, y MOPC21 (control negativo) no inhibe ninguna enzima.

La figura 19 muestra la inhibicion de Gmd nativa por los cinco mAb anti-His-Gmd 1C11, 1E12, 2D11, 3A8, y 3H6. Cada anticuerpo se anadio a una concentracion de 100 jg/ml. Los cinco son inhibidores potentes e inhiben la enzima nativa a aproximadamente el mismo grado que inhiben el Gmd-His recombinante. El control del anticuerpo apareado con isotipo (IgG1) MOPC21 no tuvo ningun efecto sobre la actividad enzimatica de Gmd.

Las figuras 20A-D son imagenes de microscopia electronica de barrido (SEM) de S. aureus cultivado en ausencia (figuras 20A-B) o presencia de anticuerpos monoclonales anti-Gmd de la presente invention. La figura 20C muestra los efectos de 50 jg/ml de mAb 1E12 sobre Xen29 S. aureus y la figura 20D muestra los efectos de

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50 jg/ml de mAb 1C11 sobre Xen29 S. aureus. Se obtuvieron micrografos de campos representativos a 50.000 x (A&C), 2.000 x (B) y 4.000 x (D). Las flechas identifican los sitios donde se produjo la lisis y documentan los sorprendentes e inesperados efectos de la presente invencion, ya que la actividad lttica del complemento e independiente de las celulas efectoras inmunes de un mAb anti-S. aureus aun no se ha documentado en la bibliografia.

Las figuras 21A-C muestran que la inmunizacion pasiva con el anticuerpo monoclonal 3A8 inhibe el crecimiento de S. aureus in vivo y protege a los ratones de osteomielitis asociada a implante. Los ratones se sometieron a formacion de imagenes para evaluar la bioluminiscencia los dias 0, 3, 5, 7, 11, y 14, y las imagenes con el mapa de calor de BLI de un animal representativo en cada grupo se muestran en la figura 21A. Las imagenes BLI el dia 3 para cada raton en el estudio se muestran con la media para cada grupo (figura 21B, p = 0,02). Los rayos X de un animal representativo en cada grupo obtenido el dia 14 se muestran para ilustrar la lesion osteolitica (flecha) en el raton de placebo, que no estaba presente en los animales tratados con anti-Gmd (figura 21 C).

Las figuras 22A-C muestran que la inmunizacion pasiva con el anticuerpo monoclonal 1C11 inhibe el crecimiento de S. aureus in vivo y protege a los ratones de osteomielitis asociada a implante. Los ratones se sometieron a formacion de imagenes para evaluar la bioluminiscencia los dias 0, 3, 5, 7, 10, y 14, y las imagenes con el mapa de calor de BLI de un animal representativo en cada grupo se muestran en (figura 22A). Los valores de BLI el dia 3 para cada raton en el estudio se muestran con la media para cada grupo (figura 22B). Los rayos X de un animal representativo en cada grupo obtenidos el dia 14 se muestran para ilustrar la lesion osteolitica (flecha) en el raton de placebo, que no estaba presente en el raton tratado con anti-Gmd (figura 22C).

La figura 23 es un grafico que compara la actividad inhibidora anti-Gmd del 1C11 monoclonal de raton con el monoclonal quimerico humano:raton derivado de 1C11. La IgG1 quimerica humana:raton de 1C11 (h1C11) conserva la capacidad de inhibir His-Gmd. El porcentaje de inhibicion de la actividad de His-Gmd sobre el eje Y se muestra en funcion de la dilucion de la preparation de anticuerpo en el eje X. La concentration de 1C11 de raton era de 10 |jg/ml; la concentracion de h1C11 quimerico no era conocida para el ensayo mostrado.

Descripcion detallada de la invencion

En un aspecto, la presente invencion se refiere a un anticuerpo monoclonal que se une especificamente a una glucosaminidasa de Staphylococcus aureus e inhibe el crecimiento in vivo de S. aureus, en el que el anticuerpo se une a un epitopo completa o parcialmente dentro del dominio R3 de glucosaminidasa de Staphylococcus aureus. El anticuerpo monoclonal de la presente invencion puede ser de tal forma que se dirige a S. aureus que es resistente a la meticilina.

Como se usa en el presente documento, el termino "anticuerpo" pretende incluir inmunoglobulinas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes, asi como porciones inmunorreactivas (es decir, porciones de union a antigeno) de las inmunoglobulinas. Los anticuerpos monoclonales de la presente invencion pueden existir en, o pueden aislarse en diversas formas incluyendo, por ejemplo, anticuerpos monoclonales sustancialmente puros, fragmentos de anticuerpo o porciones de union, anticuerpos quimericos, y anticuerpos humanizados (Ed Harlow y David Lane, USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)).

Los anticuerpos monoclonales de la presente invencion estan caracterizados por la union a glucosaminidasa de S. aureus o fragmentos de la misma. Estos anticuerpos se unen especificamente un epitopo inmunodominante en la subunidad de glucosaminidasa (Gmd) de autolisina de S. aureus (At!). Estos anticuerpos monoclonales inhiben el crecimiento in vivo de S. aureus.

El antigeno inmunodominante es una parte del determinante antigenico que se reconoce mas facilmente por el sistema inmune y, por lo tanto, ejerce la mayor influencia sobre la especificidad del anticuerpo inducido. Un "epitopo inmunodominante" se refiere al epitopo en un antigeno que provoca selectivamente una respuesta inmune en un organismo huesped a la exclusion sustancial de otros epitopos en este antigeno.

Normalmente, el antigeno probablemente lleva un epitopo inmunodominante que puede identificarse seleccionando los antigenos en la superficie exterior del organismo patogeno. Por ejemplo, los organismos mas simples, tales como los hongos, bacterias y virus tienen una o dos proteinas que se exponen en la superficie exterior del organismo patogeno. Estas proteinas de la superficie externa tienen mas probabilidades de llevar el antigeno apropiado. Las proteinas mas propensas a portar un epitopo inmunodominante se pueden identificar en un ensayo Western en el que la proteina total se ejecuta en un gel contra suero de un organismo infectado con el organismo patogeno. Los anticuerpos unidos del suero se identifican mediante anticuerpos marcados, tal como en una de las tecnicas ELISA bien conocidas. El epitopo inmunodominante se puede identificar examinando el suero de un organismo huesped infectado con el organismo patogeno. El suero se evalua por su contenido de anticuerpos que se unen a los antigenos identificados que son propensos a causar una respuesta inmune en un organismo huesped. Si existe un epitopo inmunodominante en estos antigenos, sustancialmente todos los anticuerpos en el suero se uniran al epitopo inmunodominante, con poca union a otros epitopos presentes en el antigeno.

Atl es una de las hidrolasas de peptidoglicano cataliticamente distintas en S. aureus que se requiere para digerir la pared celular durante la mitosis (Baba y Schneewind, "Targeting of Muralytic Enzymes to the Cell Division Site of Gram-Positive Bacteria: Repeat Domains Direct Autolysin to the Equatorial Surface Ring of Staphylococcus aureus",

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EMBO. J. 17(16): 4639-46 (1998)). Ademas de ser un gen esencial para el crecimiento, los estudios de microscop^a electronica de barrido han demostrado que los anticuerpos anti-Atl ligados a S. aureus durante la fision binaria se localizan en regiones de las bacterias que no estan cubiertas por la pared celular (Yamada et al., "An Autolysin Ring Associated With Cell Separation of Staphylococcus aureus", J. Bacteriol. 178(6): l565-71 (1996)).

La enzima Atl se compone de una amidasa (62 kD) y una glucosaminidasa (53 kD), que se producen a partir de la misma protema precursora Atl mediante un proceso de escision (Baba y Schneewind, "Targeting of Muralytic Enzymes to the Cell Division Site of Gram-Positive Bacteria: Repeat Domains Direct Autolysin to the Equatorial Surface Ring of Staphylococcus aureus", Embo. J. 17(16): 4639-46 (1998); Komatsuzawa et al., "Subcellular Localization of the Major Autolysin, ATL and Its Processed Proteins in Staphylococcus aureus", Microbiol Immunol. 41: 469-79 (1997); Oshida et al., "A Staphylococcus aureus Autolysin That Has an N-acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Domain and an Endo-beta-N-acetylglucosaminidase Domain: Cloning, Sequence Analysis, and Characterization", Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 92(1): 285-9 (1995)). La autolisina se mantiene en la pared celular mediante tres dominios R1, R2 y R3 de union a la pared celular de ~150 aminoacidos. En la etapa de maduracion final, la escision proteolitica separa el dominio aminidasa y sus dominios R1 y R2 asociados de la glucosaminidasa y su dominio R3 N-terminal asociado.

A modo de ejemplo, una glucosaminidasa de Staphylococcus aureus a modo de ejemplo contiene la secuencia aminoacidica de la SEQ ID NO: 36 a continuacion.

AYTVTKPQTT QTVSKIAQVK PNNTGIRASV YEKTAKNGAK YADRTFYVTK

ERAHGNETYV LLNNTSHNIP LGWFNVKDLN VQNLGKEVKT TQKYTVNKSN

NGLSMVPWGT KNQVILTGNN IAQGTFNATK QVSVGKDVYL YGTINNRTGW

VNAKDLTAPT AVKPTTSAAK DYNYTYVIKN GNGYYYVTPN SDTAKYSLKA

FNEQPFAVVK EQVINGQTWY YGKLSNGKLA WIKSTDLAKE LIKYNQTGMT

LNQVAQIQAG LQYKPQVQRV PGKWTDANFN DVKHAMDTKR LAQDPALKYQ

FLRLDQPQNI SIDKINQFLK GKGVLENQGA AFNKAAQMYG INEVYLISHA

LLETGNGTSQ LAKGADVVNN KVVTNSNTKY HNVFGIAAYD NDPLREGIKY

AKQAGWDTVS KAIVGGAKFI GNSYVKAGQN TLYKMRWNPA HPGTHQYATD

VDWANINAKI IKGYYDKIGE VGKYFDIPQY

En la SEQ ID NO: 36, los residuos subrayados corresponden a los residuos 783 a 931 de la autolisina codificada, y representan el dominio R3. Los residuos C-terminales restantes (no subrayados) corresponden al dominio de la glucosaminidasa catalitica.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo monoclonal de la presente invencion se une a un epitopo conservado de glucosaminidasa de Staphylococcus aureus con una afinidad superior a 10-9 M. Como se usa en el presente documento, "epitopo" se refiere al determinante antigenico de glucosaminidasa de Staphylococcus aureus que se reconoce por el anticuerpo monoclonal. El epitopo reconocido por el anticuerpo de la presente invencion puede ser un epitopo lineal, es decir, la estructura primaria de la secuencia de aminoacidos de la glucosaminidasa. Como alternativa, el epitopo reconocido por el anticuerpo de la presente invencion puede ser un epitopo no lineal o conformacional, es decir, la estructura terciaria de la glucosaminidasa.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invencion se unen especificamente al dominio R3. En otras divulgaciones, los anticuerpos monoclonales pueden unirse especificamente al dominio catalitico del Gmd.

Los epitopos que estan unidos por cinco de los anticuerpos monoclonales identificados en el presente documento estan enteramente o al menos parcialmente dentro del dominio R3. A modo de ejemplo, un epitopo unido por mAb 3A8 se encuentra dentro de la region que contiene los residuos 776-842; un epitopo unido por mAb 1C11 se encuentra dentro de la region que contiene los residuos 842-873; un epitopo o epitopos unidos por los mAbs 2D11 y 1E12 son iguales o diferentes y se encuentran dentro de la region que contiene los residuos 842-948; y un epitopo unido por mAb 3H6 se encuentra dentro de la region que contiene los residuos 907-948.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo monoclonal de la presente invencion posee la actividad inhibidora de Gmd de S. aureus, por lo que el anticuerpo monoclonal inhibe la actividad de Gmd en al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 % o al menos el 50 %. En otras realizaciones, el anticuerpo monoclonal inhibe la actividad de Gmd en al menos el 60 %, al menos el 70 %, o al menos el 80 %. Cinco anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento (mAbs 3A8, 1C11, 2D11, 1E12 y 3H6) poseen actividad inhibidora de anti-Gmd de aproximadamente el 70 a aproximadamente el 80 por ciento. Es un resultado sorprendente e inesperado que los anticuerpos de la presente invencion se uniran a un supuesto dominio de union a la pared celular, el dominio R3, en lugar de un dominio catalitico para inhibir la actividad enzimatica. Sin desear quedar ligado a la teoria, se cree que la union de los anticuerpos de la presente invencion al dominio R3 puede desencadenar un cambio conformacional o electrostatico en el dominio catalitico de la glucosaminidasa.

La inhibicion de la actividad de Gmd se puede medir in vitro. De acuerdo con un enfoque, Gmd se pretitula en primer

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lugar para determinar la concentracion que producira una reduccion de aproximadamente un 50% en A490 en 60 minutos. Despues, se anaden 50 pl de anticuerpo diluido en PBST a cada pocillo de una placa de microtitulacion de 96 pocillos seguido de 50 pl de Gmd diluida apropiadamente, y la mezcla se deja incubar durante 5 o mas minutos, y finalmente se anadieron 100 pl de 0,15 % ml y se mide el A490 inicial. La placa se incuba a 37 °C y el A490 se mide en 30 y 60 minutos. El porcentaje de inhibition se calcula como 100 ■ (1- (inhibidor A6oA49o/control sin inhibidor A60A490)).

En ciertas realizaciones, el anticuerpo monoclonal de la presente invention posee una capacidad para provocar la agrupacion o agrupamiento de S. aureus, lisis independiente de las celulas de S. aureus, o ambos. Los ejemplos de anticuerpos que poseen una capacidad para producir aglomeracion de S aureus incluyen anticuerpos monoclonales 1C11, 1E12, 2D11, 3A8 y 3H6. Un ejemplo de un anticuerpo litico es el anticuerpo monoclonal 1C11. Este anticuerpo se une a un epitopo unico presente en el dominio R3, muestra entre aproximadamente el 70 a aproximadamente el 80 por ciento de actividad inhibidora de Gmd, y promueve la lisis independiente de las celulas de S. aureus.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invencion tambien inhiben el crecimiento in vivo de S. aureus. La inhibicion del crecimiento in vivo de S. aureus se puede medir de acuerdo con una serie de estandares adecuados. En una de tales realizaciones, el crecimiento in vivo de S. aureus puede evaluarse de acuerdo con un ensayo de bioluminiscencia del tipo descrito en los Ejemplos adjuntos. Especificamente, el S. aureus bioluminiscente (Xen 29; ATCC 12600) (Francis et al., "Monitoring Bioluminescent Staphylococcus aureus Infections in Living Mice Using a Novel luxABCDE Construct", Infect. Immun. 68(6):3594-600 (2000); vease tambien Contag et al., "Photonic Detection of Bacterial Pathogens in Living Hosts", Mol. Microbiol. 18(4):593-603 (1995)) se usa para dosificar un implante transtibial con 500.000 UFC antes del implante quirurgico. Los ratones hembra BALB/cJ de cinco semanas de edad pueden recibir una inyeccion intraperitoneal de solution salina (n = 10) o 1 mg de anticuerpo purificado en 0,25 ml de solution salina 3 dias antes de la cirugia. Los ratones se pueden diagnosticar por imagenes para evaluar la bioluminiscencia en diversos dias (por ejemplo, 0, 3, 5, 7, 11 y 14) y se puede comparar una comparacion de imagenes BLI para evaluar si el anticuerpo inhibe el crecimiento in vivo de S. aureus en relacion con el control de solucion salina.

En una realization, el anticuerpo monoclonal de la presente invencion comprende un dominio Vh que comprende una de las siguientes secuencias aminoacidicas:

EVQLQESGPVLVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLE

WIGVINPYNGDTTYSQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVY

YCARNYDEYFDVWGTGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVT LGCXVKG (SEQ ID NO: 1) donde X es cualquier aminoacido; o

EVQLQESGPVLVKPGASVKLSCKASGYTFTDYFMNWVKQSHGKSLE

WIGVINPFNGGNRYNQNFKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAV

YYCARGDYDSPWFDYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNS MVTLGCLVKGYSXSQ (SEQ ID NO: 2), donde X es cualquier aminoacido; o

EVQLQESGGGFVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYVMSWVRQTPEKRLEW

VATISDGGGHTYYLDNVKGRFTISRDNAKNNLYLHMSHLKSEDTAMY

YCARAYYGSSYDAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQT NSMVTLGCLVKG (SEQ ID NO: 3); o

EVQLQESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLE

WVAEIKDKTNNHATYYAESVKGRFTISRDVSKSRVFLQMNSLRPEDT

GIYYCTSGPYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVT LGCLVKGYFPE (SEQ ID NO: 4); o

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTYGMSWVNQAPGKGLKW MGWINTYSGVPTYADDFKGRFVFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYF CAREEYSSGYAAWFPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 5); o

XXQLXXSGXXXXXPGXXXKXSCXASGXTFXXXXMXWVXQXXXKXL

XWXXXIXXXXXXXXXXYXXXXKGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXLX

XEDXXXYXCXXXXYXXXXXXXXXXWGXGTXXTVSXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX, donde X es cualquier aminoacido o deletion del mismo (secuencia de consenso SEQ ID NO: 6; vease la figura 13); o

EVQLQESGXXXVXPGXSXKXSCXASGXTFXXXXMXWVXQXXXKXL EWXXXIXXXXXXXXXXYXXXXKG XXTXXX DXXXXXXXXXXXX LX

XEDXXXYYCXXXXYXXXXXXXDXWGXGTXXTVSXAKTTPPSVYPL APGSAAQTNSMVTLGCXVKGXXXXX, donde X es cualquier aminoacido o delecion del mismo (secuencia de consenso SEQ ID NO: 31; vease la figura 11), o

XXQLXXSGXXLXXPGXXXKXSCXASGXTFXXXXMXWVXQXPXKGL

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XWXXXIXXXTXXXXXXYAXXXKGRFXXSXXXSXSXXXLQXNXLXX

EDTXXYXCXXXXXXSGXXXXFXYWGQGTXXTVSXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX, donde X es cualquier aminoacido o delecion del mismo (secuencia de consenso SEQ ID NO: 7; vease la figura 15); o

QXQLVQSGXEXKXPGXXVKXSCKASGYXFTTYGMXWVXQAPGXGL

XWMGWXNTYXGXPTYAXXFXGRFVFSXXTSASTAYLQIXXLKXEDX

AXYXCARXXXXXXXXXXXXYWGQGTLVTVSA, donde X es cualquier aminoacido o delecion del mismo (secuencia de consenso SEQ ID NO: 35, vease la figura 17A).

En otra realizacion, el anticuerpo monoclonal de la presente invencion comprende un dominio Vl que comprende una de las siguientes secuencias aminoacidicas:

DIVMTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIY DTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPLT FG (SEQ ID NO: 8); o

QMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYY

TSSLHSGVPSRFSGGGSGTDYSLSISNLEPEDIATYYCQQYSKLPWTFG GGTKLEIK, (SEQ ID NO: 9); o DIVITQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKXWI

YSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPW TFGGGT (SEQ ID NO: 10); o DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLI

YWTSTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAKDLALYYCQQHYTTPY TFGGGTKLEIK, (SEQ ID NO: 11); o DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIEY

ASRSISGIPSRFSGGGSGTDFTLSINSVESEDFGLYFCQQSNSWPLTFGA GTKLELK, (SEQ ID NO: 12); o

DIXXTQXXXXXSXXXGXXVXXXCXASXXXSXXXXXWYQQKXXXXX

XXXIXXXSXXXXGXPXRFXGXGSGTXXXLXIXXXXXXDXXXYXCXQ

DIXXTQXXXXXSXXXGXXVXXXCXASXXXSXXXXXWYQQKXXXXX

XXXIXXXSXXXXGXPXRFXGXGSGTXXXLXIXXXXXXDXXXYXCXQ XXXXPXTFGXGTXXXXX, donde X es cualquier aminoacido o delecion del mismo (secuencia de consenso SEQ ID NO: 13, vease la figura 14A); o

DIVXTQSXXXXSXXXG DXVSXXCXAS QXXSXXXXWYQQKXXXSPXL

LIXXXSXXXXGXPXRFXGXGSGTDFTLXIXSVXXXDXXLYXCQQXXX XPXTFGXGTKLEXK, donde X es cualquier aminoacido o delecion del mismo (secuencia de consenso SEQ ID NO: 14, vease la figura 16); o

DIVXTQSPAIMSASXGEXVTMTCXASSSVSXXYXXWYQQKPGSSPXX

XIYXTSNLASGVPXRFSGSGSGTSYSLTISXMEAEDAATYYCXQXXXX PXTFGXXX, donde X es cualquier aminoacido o delecion del mismo (secuencia de consenso SEQ ID NO: 32, vease la figura 12); o

DIXXTQXXXXXSXSXSXXSXXXSXSSXXXSXXXXXWYQQKPXXXXX

XXIYXTSXXXXGVPPXRFXGXGSGTXXXLXISXXXXXDXAXYYCXQ XXXXPXTFGGGTXXXXX, donde X es cualquier aminoacido o delecion del mismo (secuencia de consenso SEQ ID NO: 33, vease la figura 14B); o

XIVLTQSPXXXSVTPXXXVXXXCRASQSIXXXLHWYQQXXXXSPXLLI

XYASXSXSGXPSRFSGXGSGTDFTLXINSXEXEDXXXYXCXQSXSXPL TFGXGTKXEXK, donde X es cualquier aminoacido o delecion del mismo (secuencia de consenso SEQ ID NO: 37, vease la figura 17B).

Los anticuerpos de la presente invencion tambien pueden ser anticuerpos sinteticos. Un anticuerpo sintetico es un anticuerpo que se genera utilizando tecnologia de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un bacteriofago. Como alternativa, el anticuerpo sintetico se genera mediante la sintesis de una molecula de ADN que codifica y expresa el anticuerpo de la invencion o la sintesis de un aminoacido que especifica el anticuerpo, en el que la secuencia de ADN o aminoacidos se ha obtenido utilizando ADN sintetico o secuencia de aminoacidos, tecnologia que esta disponible y se conoce bien en la tecnica.

El anticuerpo monoclonal de la presente invencion puede ser humanizado. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos que contienen secuencias minimas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) dentro de las regiones variables. Tales anticuerpos se usan terapeuticamente para reducir la antigenicidad y las respuestas de anticuerpos humanos anti-raton cuando se administran a un sujeto humano. En la practica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos con secuencias no humanas minimas. Un anticuerpo humano es un anticuerpo producido por un humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoacidos correspondiente a un anticuerpo producido por un ser humano.

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Se puede humanizar un anticuerpo sustituyendo la region determinate de complementariedad (CDR) de un anticuerpo humano con la de un anticuerpo no humano (por ejemplo, raton, rata, conejo, hamster, etc.) que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas (Jones et al., "Replacing the Complementarity-Determining Regions in a Human Antibody With Those From a Mouse", Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., "Reshaping Human Antibodies for Therapy", Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., "Reshaping Human Antibodies: Grafting an Antilysozyme Activity", Science 239: 1534-1536 (1988)). El anticuerpo humanizado puede modificarse adicionalmente mediante la sustitucion de residuos adicionales en la region de marco Fv y/o dentro de los residuos no humanos sustituidos para refinar y optimizar la especificidad, afinidad y/o capacidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados se pueden producir usando diversas tecnicas conocidas en la tecnica. Pueden generarse linfocitos B humanos inmortalizados inmunizados in vitro o aislados de un individuo inmunizado que producen un anticuerpo dirigido contra un antigeno diana (vease, por ejemplo, Reisfeld et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPy 77 (Alan R. Liss ed., 1985) y la Patente de Estados Unidos n.° 5.750.373 de Garrard). Ademas, el anticuerpo humanizado puede seleccionarse de una biblioteca de fagos, donde dicha biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al., "Human Antibodies with Sub-Nanomolar Affinities Isolated from a Large Non-immunized Phage Display Library", Nature Biotechnology, 14: 309-314 (1996); Sheets et al., "Efficient Construction of a Large Nonimmune Phage Antibody Library: The Production of High-Affinity Human SingleChain Antibodies to Protein Antigens", Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 95: 6157-6162 (1998); Hoogenboom et al., "Bypassing Immunisation. Human Antibodies From Synthetic Repertoires of Germline Vh Gene Segments Rearranged in vitro", J. Mol. Biol. 227:381-8 (1992); Marks et al., "By-passing Immunization. Human Antibodies from V-gene Libraries Displayed on Phage", J. Mol. Biol. 222: 581-97 (1991)). Los anticuerpos humanizados tambien pueden hacerse en ratones transgenicos que contienen loci de inmunoglobulina humana que son capaces tras la inmunizacion de producir el repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de produccion de inmunoglobulina endogena. Este enfoque se describe en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.545.807 de Surani et al.; 5.545.806 de Lonberg et al.; 5.569.825 de Lonberg et al.; 5.625.126 de Lonberg et al.; 5.633.425 de Lonberg et al.; y 5.661.016 de Lonberg et al.

Basandose en una busqueda BLAST de Genbank usando las secuencias aminoacidicas del dominio Vh y Vl 1C11, las secuencias homologas en el genoma humano se identifican como IGVH7-81 e IGVK6D-21, respectivamente. Los alineamientos de estos dominios homologos Vh y Vl (SEQ ID NOS: 19 y 20, respectivamente) con los dominios Vh y Vl 1C11 correspondientes se ilustran en las figuras 17A-B, respectivamente. Los dominios Vh y Vl comparten un grado de identidad sorprendentemente alto, respectivamente aproximadamente el 75 % y el 67 % sobre la region de homologia (es decir, excluyendo la region CDR3H Vh). Estas secuencias IGVH7-81 e IGVK6D-21 pueden usarse para preparar un anticuerpo monoclonal sustancialmente puro de la presente invention. Dado que CDR3H no se codifica por el gen Vh, una region D adecuada necesitara cortarse y empalmarse en la region de dominio faltante. Puede usarse una cualquiera de varias regiones D candidatas (por ejemplo, IGHD5-5, 18 o 12*01).

Ademas de anticuerpos enteros, la presente invencion incluye porciones de union a antigeno de dichos anticuerpos. Tales porciones de union al antigeno incluyen los fragmentos Fab monovalentes, fragmentos Fv (por ejemplo, anticuerpo monocatenario, scFv) y dominios Vh y Vl variables individuales, y los fragmentos F(ab')2 bivalentes, Bis- scFv, diacuerpos, tricuerpos, minicuerpos, etc. Estos fragmentos de anticuerpo pueden fabricarse mediante procedimientos convencionales, tales como procedimientos de fragmentation proteolitica, como se describe en James Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE 98-118 (Academic Press, 1983) y Ed Harlow y David Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988); Houston et al., "Protein Engineering of Antibody Binding Sites: Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced in Escherichia coli", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988); Bird et al, "Single-Chain Antigen-Binding Proteins", Science 242: 423-426 (1988), u otros metodos conocidos en la tecnica. Ademas, puede ser deseable, especialmente en el caso de fragmentos de anticuerpo, modificar el anticuerpo para aumentar su semivida en suero. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante la incorporation de un epitopo de union al receptor de rescate en el fragmento de anticuerpo por mutacion de la region apropiada en el fragmento de anticuerpo o incorporando el sitio de union del epitopo a una etiqueta de peptido que se fusiona despues al fragmento de anticuerpo en un extremo o en el medio (por ejemplo, por ADN o sintesis peptidica).

Los imitadores de anticuerpos tambien son adecuados para su uso de acuerdo con la presente invencion. Se conocen varios imitadores de anticuerpos en la tecnica incluyendo, sin limitation, los conocidos como monocuerpos, que se derivan del decimo dominio de fibronectina de tipo III humano (10Fn3) (Koide et al., "The Fibronectin Type III Domain as a Scaffold for Novel Binding Proteins", J. Mol. Biol. 284: 1141-1151 (1998); Koide et al., "Probing Protein Conformational Changes in Living Cells by Using Designer Binding Proteins: Application to the Estrogen Receptor", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 1253-1258 (2002); y aquellos conocidos como aficuerpos, que se derivan del dominio estable del receptor bacteriano alfa-helicoidal Z de la proteina A estafilococica (Nord et al., "Binding Proteins Selected from Combinatorial Libraries of an alpha-helical Bacterial Receptor Domain", Nature Biotechnol. 15(8): 772777 (1997)).

En la preparation de estos imitadores de anticuerpos, las secuencias CDR de las cadenas Vh y/o Vl pueden injertarse en las regiones de bucle variables de estos imitadores de anticuerpos (veanse las figuras 11 y 17 para dominios CDR putativos). El injerto puede implicar una deletion de al menos dos residuos de aminoacidos hasta

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sustancialmente todos menos un residuo de aminoacido que aparece en una region de bucle particular junto con la sustitucion de la secuencia CDR. Las inserciones pueden ser, por ejemplo, una insercion del dominio CDR en una o mas ubicaciones de una region de bucle particular. Los imitadores de anticuerpos de la presente invencion poseen preferiblemente una secuencia de aminoacidos que es al menos un 50 % homologa a las secuencias de cadenas Vh y/o Vl desveladas en la presente solicitud. Las deleciones, inserciones y reemplazos en los polipeptidos pueden lograrse usando tecnicas recombinantes que comienzan con una secuencia de nucleotidos conocida (vease a continuacion).

Los metodos para la produccion de anticuerpos monoclonales se pueden conseguir usando las tecnicas descritas en el presente documento u otras conocidas en la tecnica (MONOCLONAL ANTIBODIES - PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATIONS (Mary A. Ritter and Heather M. Ladyman eds., 1995)). Generalmente, el proceso implica la obtencion de celulas inmunitarias (linfocitos) del bazo de un mamifero que ha sido previamente inmunizado con el antigeno de interes (es decir, glucosaminidasa de S. aureus o fragmentos peptidicos de los mismos).

Los linfocitos secretores de anticuerpos se fusionan entonces con celulas de mieloma o celulas transformadas, que son capaces de replicarse indefinidamente en cultivo celular, produciendo de este modo una linea celular inmortal, que segrega inmunoglobulina. La fusion con celulas de mieloma de mamifero u otros companeros de fusion capaces de replicarse indefinidamente en cultivo celular se consigue mediante tecnicas estandar y bien conocidas, por ejemplo, utilizando polietilenglicol (PEG) u otros agentes de fusion (Milstein y Kohler, "Derivation of Specific Antibody-Producing Tissue Culture and Tumor Lines by Cell Fusion", Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976)). La linea celular inmortal, que es preferiblemente murina, pero tambien puede derivarse de celulas de otras especies de mamiferos, se selecciona para ser deficiente en enzimas necesariamente para la utilizacion de ciertos nutrientes, para ser capaz de crecer rapido, y tener buena capacidad de fusion. Las celulas fusionadas resultantes, o hibridomas, se cultivan, y las colonias resultantes se criban para la produccion de los anticuerpos monoclonales deseados. Las colonias que producen tales anticuerpos se clonan y crecen in vivo o in vitro para producir grandes cantidades de anticuerpos.

Por lo tanto, un segundo aspecto de la presente invencion se refiere a una linea celular que expresa un anticuerpo monoclonal de la presente invencion. En una realization, el anticuerpo monoclonal de la presente invencion se produce por una linea celular de hibridoma designada como 1C11, 1E12, 2D11, 3A8 o 3H6. En otra realizacion, el anticuerpo monoclonal de la presente invencion (o una portion de union a antigeno del mismo) se produce por una celula o linea celular recombinante.

Como se ha indicado anteriormente, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando metodos de ADN recombinante como se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 4.816.567 de Cabilly et al. Los polinucleotidos que codifican un anticuerpo monoclonal se aislan a partir de celulas B maduras o celulas de hibridoma, por ejemplo, mediante RT-PCR utilizando cebadores de oligonucleotidos que amplifican especificamente los genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo. Los polinucleotidos aislados que codifican las cadenas pesadas y ligeras se clonan a continuacion en vectores de expresion adecuados, que cuando se transfectan en celulas huesped, tales como celulas de E. coli, celulas COS de simio, celulas de ovario de hamster chino (CHO), o celulas de mieloma que no producen de otro modo proteina de inmunoglobulina, generan celulas huesped que expresan y secretan anticuerpos monoclonales. Ademas, los anticuerpos monoclonales recombinantes o fragmentos de los mismos de las especies deseadas se pueden aislar a partir de bibliotecas de presentation de fagos (McCafferty et al., "Phage Antibodies: Filamentous Phage Displaying Antibody Variable Domains", Nature 348: 552-554 (1990); Clackson et al., "Making Antibody Fragments using Phage Display Libraries", Nature 352: 624-628 (1991); y Marks et al., "ByPassing Immunization. Human Antibodies from V-Gene Libraries Displayed on Phage", J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)).

La presente divulgation tambien incluye una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de la presente invencion. En una realizacion, el acido nucleico es ADN. Los ejemplos de tales secuencias de aDn son aquellos que comprenden una secuencia que codifica Vh y/o Vl de la presente invencion. La secuencia de ADN que codifica el hibridoma 2D11 Vh (correspondencia de linea germinal mas cercana: J558.18.108) tiene la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 21) como se indica a continuacion

GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGACCTGTGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCC TGTAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACTATATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGA AAG AG CC T T GAG T G GAT T GG AG T T AT T AAT C C T T AC AAC G G T GAT AC T AC C T AC AGC C AG AAG TTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTTGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAAC AGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAAATTACGACGAGTACTTCGAT GTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTAT CCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCNGGTCAAG GGC

La secuencia de ADN que codifica el hibridoma 3H6 Vh (correspondencia de linea germinal mas cercana: J558.18.108) tiene la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 23) como se indica a continuacion:

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GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGACCTGTGCIGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCC

TGTAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACTTTATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGA

AAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGTTATTAATCCTTTCAACGGTGGTAATAGGTACAACCAGAAC

TTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTTGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAAC

AGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGGGGACTATGACTCCCCCTGG

TTTGATTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCT

GTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTG

GTCAAGGGCTATTCCCNGAGCCAGTG

La secuencia de ADN que codifica el hibridoma 1E12 Vh (correspondencia de tinea germinal mas cercana: 7183.46 VH7) tiene la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 25) como se indica a continuacion:

GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTCGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC

TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATGTCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAA

AAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTGGTCATACTTACTATCTAGACAAT

GTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTGCACATGAGC

CATCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGCTTACTACGGTAGTAGTTAC

GACGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCC

CCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGA

TGCCTGGTCAAGGGC

La secuencia de ADN que codifica el hibridoma 3A8 Vh (correspondencia de linea germinal mas cercana: VHJ606.4.8.2) tiene la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 27) como se indica a continuacion:

GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCT

TGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAG

AAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAAAGACAAAACTAATAATCATGCAACATACTATGCT

GAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGTTTCCAAAAGTCGTGTCTTCCTGCAA

ATGAACAGCTTAAGACCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACGTCTGGGCCATATTTTGAC

TACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTAT

CCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAG

GGCTATTTCCCTGAG

La secuencia de ADN que codifica el hibridoma 1C11 Vh (correspondencia de tinea germinal mas cercana: VH 9-15, DST4-C57B1-6, JH3) tiene la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 29) como se indica a continuacion:

CAGATCCAGTTGGTACAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCC

TGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAACGTATGGAATGAGCTGGGTGAATCAGGCTCCAGGA

AAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACTCTGGAGTGCCAACATATGCTGATGAC

TTCAAGGGACGGTTTGTCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAAC

AACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGAGAGGAGTACAGCTCAGGCTAC

GCGGCCTGGTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

La secuencia de ADN que codifica 2D11 Vl (correspondencia de tinea germinal mas cercana: at4) tiene la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 22) como se indica a continuacion:

GATATTGTGATGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATG

ACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCC

CCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGC

AGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAGGATGCTGCCACT

TATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTTACCCGCTCACGTTCGGT

La secuencia de ADN que codifica 3H6 Vl (correspondencia de tinea germinal mas cercana: cp9, JK1) tiene la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 24) como se indica a continuacion:

CAGATGACACAGACTACGTCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGC

AGTGCAAGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTT

AAACTCCTGATCTATTACACATCAAGTTTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCGGT

GGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCTCCATCAGCAACCTGGAACCTGAAGATATTGCCACTTAC

TATTGTCAGCAGTATAGTAAGCTTCCTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA

La secuencia de ADN que codifica 1E12 Vl (correspondencia de tinea germinal mas cercana: ai4) tiene la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 26) como se indica a continuacion:

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GATATTGTGATCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATG

ACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTACACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGA

TCCTCCCCCAAACTNTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTC

AGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCT

GCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCATGGACGTTCGGTGGAGGCACC

La secuencia de ADN que codifica 3A8 Vl (correspondencia de lmea germinal mas cercana: KV 19-25, JK2) tiene la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 28) como se indica a continuacion:

GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATC

ACCTGCAAGGCCAGTCAGGACGTGAGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAA

TCTCCTAAACTACTGATTTACTGGACATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACA

GGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTAAAGACCTGGCA

CTTTATTACTGTCAGCAACATTATACCACTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAA

ATAAAA

La secuencia de ADN que codifica 1C11 Vl (correspondencia de linea germinal mas cercana: VK23-43, JK5) tiene la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 30) como se indica a continuacion:

GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTT

TCCTGCAGGGCCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAG

TCTCCAAGGCTTCTCATCGAATATGCTTCCCGGTCCATCTCTGGGATCCCCTCTAGGTTCAGT

GGCGGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATTTTGGA

TTGTATTTCTGTCAACAGAGTAACAGCTGGCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAG

CTGAAA

Aun un aspecto adicional de la presente divulgacion es una construccion de ADN que comprende una molecula de ADN que codifica un anticuerpo o porcion de union a antigeno de la presente invencion, una molecula de ADN eficaz para el promotor acoplada al extremo 5' de la molecula de ADN, y una molecula de ADN de termination de transcription acoplada operativamente 3' de la molecula de ADN. La presente divulgacion tambien incluye un vector de expresion en el que se inserta la construccion de ADN de la presente invencion. Un gen sintetico para los polipeptidos de la presente invencion puede disenarse de manera que incluya sitios de restriction convenientes para facilitar la mutagenesis y use codones especificos para la expresion de proteinas de alto nivel (Gribskov et al., "The Codon Preference Plot: Graphic Analysis of Protein Coding Sequences and Prediction of Gene Expression", Nuc. Acids. Res. 12: 539-549 (1984)).

El gen se puede ensamblar como se indica a continuacion: en primer lugar, la secuencia genica se puede dividir en partes con limites en los sitios de restriccion disenados; para cada parte, se puede sintetizar un par de oligonucleotidos que codifican hebras opuestas y tienen superposiciones complementarias de aproximadamente 15 bases; los dos oligonucleotidos pueden hibridarse y las regiones monocatenarias pueden rellenarse utilizando el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa; el oligonucleotido bicatenario puede clonarse en un vector, tal como, el vector pET3a (Novagen) usando sitios de enzimas de restriccion en los extremos del fragmento y su secuencia puede confirmarse mediante un secuenciador de ADN; y estas etapas pueden repetirse para cada una de las partes para obtener el gen completo. Este enfoque tarda mas tiempo para ensamblar un gen que el metodo de reaction en cadena de polimerasa (PCR) de una etapa (Sandhu et al., "Dual Asymetric PCR: One-Step Construction of Synthetic Genes", BioTech. 12: 14-16 (1992)). Las mutaciones probablemente pueden introducirse por la replication de baja fidelidad por la polimerasa Taq y requeriran una edition genica prolongada. Las manipulaciones de ADN recombinante pueden realizarse de acuerdo con SAMBROOK & RUSSELL, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2a ed. 1989), a menos que se indique otra cosa. Para evitar la introduction de mutaciones durante una PCR de una etapa, se pueden emplear polimerasas de alta fidelidad/error bajo como se conoce en la tecnica.

Las mutaciones deseadas pueden introducirse en la secuencia polipeptidica de la presente invencion usando mutagenesis de casete, tecnicas de mutagenesis dirigida a oligonucleotidos (Deng & Nickoloff, "Site-Directed Mutagenesis of Virtually any Plasmid by Eliminating a Unique Site", Anal. Biochem. 200: 81-88 (1992)), o mutagenesis de Kunkel (Kunkel et al., "Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection", Proc. Natl. Acad. Sci. uSa 82: 488-492 (1985); Kunkel et al., "Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection", Methods Enzymol. 154: 367-382 (1987)).

Tanto la mutagenesis de casete como la mutagenesis dirigida a sitio pueden usarse para preparar secuencias codificantes de nucleotidos especificamente deseadas. La mutagenesis de casete puede realizarse usando el mismo protocolo para la construccion genica descrita anteriormente y el fragmento de ADN bicatenario que codifica una nueva secuencia puede clonarse en un vector de expresion adecuado. Muchas mutaciones pueden hacerse combinando una cadena recien sintetizada (mutaciones de codificacion) y un oligonucleotido utilizado para la sintesis genica. Independientemente del enfoque utilizado para introducir mutaciones en la secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de acuerdo con la presente invencion, se puede realizar la secuenciacion para confirmar que las mutaciones disenadas (y ninguna otra mutacion) se introdujeron por reacciones de mutagenesis.

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Por el contrario, la mutagenesis de Kunkel puede utilizarse para producir aleatoriamente una pluralidad de secuencias codificantes de polipeptidos mutados que pueden usarse para preparar una biblioteca combinatoria de polipeptidos para el cribado. Basicamente, las regiones de bucle diana (o las regiones de cola C-terminal o N- terminal) se pueden asignar al azar usando el codon NNK (representando N una mezcla de A, T, G, C, y representando K una mezcla de G y T) (Kunkel et al., "Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection", Methods Enzymol. 154: 367-382 (1987)).

Independientemente del enfoque usado para preparar las moleculas de acido nucleico que codifican el polipeptido de acuerdo con la presente invencion, el acido nucleico puede incorporarse en celulas huesped usando tecnoiogia convencional de aDn recombinante. Generalmente, esto implica la insercion de la molecula de ADN en un sistema de expresion al que la molecula de ADN es heterologa (es decir, normalmente no presente). La molecula de ADN heterologa se inserta en el sistema de expresion o vector en orientacion de sentido y marco de lectura correcto. El vector contiene los elementos necesarios (promotores, supresores, operadores, secuencias de terminacion de transcripcion, etc.) para la transcripcion y la traduccion de las secuencias codificantes de proteinas insertadas. Se puede preparar un gen recombinante o construccion de ADN antes de su insercion en un vector de expresion. Por ejemplo, usando tecnicas convencionales de ADN recombinante, se puede acoplar de forma operativa una molecula de ADN eficaz para promotor 5' de una molecula de ADN que codifica el polipeptido y una terminacion de transcripcion (es decir, secuencia de poliadenilacion) puede acoplarse operativamente 3' de la misma.

De acuerdo con este aspecto de la divulgacion, los polinucleotidos de la presente divulgacion se insertan en un sistema o vector de expresion al que la molecula es heterologa. La molecula de acido nucleico heterologa se inserta en el sistema o vector de expresion en la orientacion de sentido apropiada (5' ^ 3') con relacion al promotor y cualquier otra molecula reguladora 5', y el marco de lectura correcto. La preparation de las construcciones de acido nucleico puede realizarse usando metodos de donation estandar bien conocidos en la tecnica como se describe por SAMBROOK & RUSSELL, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Springs Laboratory Press, 2001). La Patentes de Estados Unidos n.° 4.237.224 de Cohen y Boyer tambien describe la production de sistemas de expresion en forma de plasmidos recombinantes usando escision de enzimas de restriction y ligadura con ADN ligasa.

Los vectores de expresion adecuados incluyen aquellos que contienen secuencias de replicon y de control que se derivan de especies compatibles con la celula huesped. Por ejemplo, si E. coli se usa como celula huesped, pueden usarse plasmidos tales como pUC19, pUC18 o pBR322. Al usar celulas huesped de insecto, los vectores de transferencia apropiados compatibles con celulas huesped de insecto incluyen, pVL1392, pVL1393, pAcGP67 y pAcSecG2T, que incorporan una senal secretora fusionada a la proteina deseada, y pAcGHLT y pAcHLT, que contienen etiquetas GST y 6xHis (BD Biosciences, Franklin Lakes, Nj). Los vectores viricos adecuados para su uso en la realization de este aspecto de la invencion incluyen, vectores adenovirales, vectores viricos adeno-asociados, vectores viricos de vacuna, vectores nodaviricos y vectores retroviricos. Otros vectores de expresion adecuados se describen en SAMBROOK AND RUSSELL, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Springs Laboratory Press, 2001). Muchas tecnicas y protocolos conocidos para la manipulation de acidos nucleicos, por ejemplo en la preparacion de construcciones de acido nucleico, mutagenesis, secuenciacion, introduction de ADN en celulas y expresion genica, y analisis de proteinas, se describen en detalle en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Fred M. Ausubel et al. eds., 2003).

Las diferentes senales geneticas y los eventos de procesamiento controlan muchos niveles de expresion genica (por ejemplo, transcripcion de ADN y traduccion de ARN mensajero ("ARNm")) y posteriormente la cantidad de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se producen y se expresan por la celula huesped. La transcripcion del ADN depende de la presencia de un promotor, que es una secuencia de ADN que dirige la union de la ARN polimerasa, y por lo tanto promueve la sintesis de ARNm. Los promotores varian en su "resistencia" (es decir, su capacidad para promover la transcripcion). Con el fin de expresar un gen clonado, es deseable utilizar promotores fuertes para obtener un alto nivel de transcripcion y, por lo tanto, la expresion. Dependiendo del sistema huesped utilizado, puede usarse uno cualquiera de un numero de promotores adecuados. Por ejemplo, al usar E. coli, sus bacteriofagos, o plasmidos, los promotores, tales como el promotor de fagos T7, el promotor lac, el promotor trp, el recApromotor, el promotor de ARN ribosomal, los promotores Pr y Pl de colifago lambda y otros, incluyendo, pero sin limitation, para lacUV5, ompF, bla, Ipp, y similares, se pueden usar para dirigir altos niveles de transcripcion de segmentos de ADN adyacentes. Adicionalmente, se puede usar un promotor hibrido trp-lacUV5 (tac) u otros promotores de E. coli producidos por ADN recombinante u otras tecnicas de ADN sintetico para proporcionar la transcripcion del gen insertado. Cuando se usan celulas de insecto, los promotores de baculovirus adecuados incluyen promotores tardios, tales como promotor de proteina 39K o promotor de proteina basica, y promotores muy tardios, tales como los promotores p10 y poliedro. En algunos casos, puede ser deseable utilizar vectores de transferencia que contienen multiples promotores de baculovirus. Los promotores comunes adecuados para dirigir la expresion en celulas de mamiferos incluyen, sin limitacion, SV40, MMTV, metalotioneina-1, adenovirus Ela, CMV, promotor y potenciador de cadena pesada de inmunoglobulina, inmediata temprana, y RSV-LTR. Los promotores pueden ser constitutivos o, como alternativa, especificos de tejido o inducibles. Ademas, pueden usarse en algunas circunstancias promotores inducibles (TetOn).

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La traduccion de ARNm en procariotas depende de la presencia de las senales procariotas propias, que difieren de las de eucariotas. La traduccion eficiente de ARNm en procariotas requiere un sitio de union al ribosoma denominado la secuencia Shine-Dalgarno ("SD") en el ARNm. Esta secuencia es una secuencia nucleotidica corta de ARNm que esta situada antes del codon de inicio, normalmente AUG, que codifica la metionina amino-terminal de la proteina. Las secuencias SD son complementarias al extremo 3' del ARNr 16S (ARN ribosomico) y promueven la union de ARNm a ribosomas por duplexacion con el ARNr para permitir el posicionamiento correcto del ribosoma. Para una revision sobre la maximizacion de la expresion genica, vease Roberts y Lauer, "Maximizing Gene Expression on a Plasmid Using Recombination In Vitro", Methods in Enzymology, 68: 473-82 (1979).

La presente invencion tambien incluye una celula huesped transformada con la construccion de ADN de la presente divulgacion. La celula huesped puede ser un procariota o un eucariota. Las celulas huesped adecuadas para expresar los polipeptidos de la presente invencion incluyen una cualquiera de las bacterias gram negativas mas comunmente disponibles. Los microorganismos adecuados incluyen Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella gastroenteritis (typhimirium), S. typhi, S. enteriditis, Shigella flexneri, S. sonnie, S. dysenteriae, Neisseria gonorrhoeae, N. meningitides, Haemophilus influenzae, H. pleuropneumoniae, Pasteurella haemolytica, P. multilocida, Legionella pneumophila, Treponema pallidum, T. denticola, T. orales, Borrelia burgdorferi, Borrelia spp., Leptospira interrogans, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, P. morganii, P. mirabilis, Rickettsiaprowazeki, R.typhi, R. richettsii, Porphyromonas (Bacteriodes) gingivalis, Chlamydia psittaci, C. pneumoniae, C. trachomatis, Campylobacter jejuni, C. intermedis, C. fetus, Helicobacter pylori, Francisella tularenisis, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Bordetella pertussis, Burkholderie pseudomallei, Brucella abortus, B. susi, B. melitensis, B. canis, Spirillum minus, Pseudomonas mallei, Aeromonas hydrophila, A. salmonicida, y Yersinia pestis.

Ademas de las celulas bacterianas, las celulas animales, en particular las celulas de mamiferos y de insectos, las celulas de levadura, celulas de hongos, celulas de plantas o las celulas de algas son tambien celulas huesped adecuadas para la transfeccion/transformacion del vector de expresion recombinante que lleva una molecula de polinucleotido aislada de la presente invencion. Las lineas celulares de mamifero usadas habitualmente en la tecnica incluyen celulas de ovario de hamster chino, celulas HeLa, celulas de rinon de hamster bebe, celulas COS y muchas otras. Las lineas celulares de insectos adecuadas incluyen aquellas susceptibles a infeccion baculoviral, incluyendo celulas Sf9 y Sf21.

Los metodos para transformar/transfectar celulas huesped con vectores de expresion se conocen bien en la tecnica y dependen del sistema huesped seleccionado, tal como se describe en SAMBROOK & RUSSELL, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Springs Laboratory Press, 2001). Para las celulas bacterianas, las tecnicas adecuadas incluyen la transformacion de cloruro calcico, la electroporacion y la transfeccion usando bacteriofago. Para las celulas eucariotas, las tecnicas adecuadas incluyen transfeccion con fosfato calcico, DEAE- Dextrano, electroporacion, transfeccion mediada por liposomas y transduccion usando retrovirus o cualquier otro vector virico. Para las celulas de insecto, el vector de transferencia que contiene la construccion de polinucleotido de la presente invencion se cotransfecta con ADN de baculovirus, tal como AcNPV, para facilitar la produccion de un virus recombinante. La infeccion virica recombinante posterior de las celulas Sf da como resultado una alta tasa de produccion de proteina recombinante. Independientemente del sistema de expresion y de la celula huesped utilizados para facilitar la produccion de proteinas, los anticuerpos expresados, fragmentos de anticuerpos o imitadores de anticuerpos de la presente invencion pueden purificarse facilmente usando metodos de purificacion convencionales conocidos en la tecnica y descritos en PHILIP L.R. BONNER, PROTEIN PURIFICATION (Routledge 2007).

El polinucleotido o polinucleotidos que codifican un anticuerpo monoclonal puede modificarse adicionalmente usando tecnologia de ADN recombinante para generar anticuerpos alternativos. Por ejemplo, los dominios constantes de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo monoclonal de raton pueden sustituirse por aquellas regiones de un anticuerpo humano para generar un anticuerpo humanizado (o quimerico), como se ha discutido anteriormente. Como alternativa, los dominios constantes de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo monoclonal de raton pueden sustituirse por un polipeptido no inmunoglobulina para generar un anticuerpo de fusion. En otras realizaciones, las regiones constantes se truncan o se eliminan para generar el fragmento de anticuerpo deseado de un anticuerpo monoclonal. Ademas, la mutagenesis dirigida a sitio o de alta densidad de la region variable puede usarse para optimizar la especificidad y la afinidad de un anticuerpo monoclonal.

Un tercer aspecto de la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un vehiculo y uno o mas anticuerpos monoclonales o una o mas porciones de union a antigeno del mismo de acuerdo con la presente invencion. Esta composicion farmaceutica puede contener dos o mas anticuerpos o fragmentos de union donde todos los anticuerpos o fragmentos de union reconocen el mismo epitopo. Como alternativa, la composicion farmaceutica puede contener un anticuerpo o mezcla de fragmentos de union donde uno o mas anticuerpos o fragmentos de union reconocen un epitopo de Gmd de S. aureus y uno o mas anticuerpos o fragmentos de union reconocen un epitopo diferente de Gmd S. aureus. Por ejemplo, la mezcla puede contener uno o mas anticuerpos de la presente invencion que se unen especificamente a un dominio R3 de glucosaminidasa de Staphylococcus aureus en combinacion con cualquier otro anticuerpo que se une a glucosaminidasa, tal como un anticuerpo que se une al dominio catalitico de la glucosaminidasa. La composicion farmaceutica de la presente invencion contiene ademas un vehiculo farmaceuticamente aceptable u otros componentes farmaceuticamente aceptables como se describe mas

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adelante.

De acuerdo con una realizacion, la composicion farmaceutica incluye uno o mas de los mAb 1C11,2D11, 3H6, 1E12 y 3A8 en un vehiculo farmaceuticamente aceptable. De acuerdo con otra realizacion, la composicion farmaceutica incluye dos o mas de los mAb 1C11,2D11, 3H6, 1E12 y 3A8 en un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

Una composicion farmaceutica que contiene los anticuerpos monoclonales de la presente invencion se puede administrar a un sujeto que tiene o esta en riesgo de tener una infeccion por Staphylococcus. Se conocen diversos sistemas de administracion y se pueden usar para administrar los anticuerpos de la presente invencion. Los metodos de introduccion incluyen, pero sin limitacion, las vias intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutanea, intranasal, epidural y oral. El agente terapeutico se puede administrar, por ejemplo, por infusion o inyeccion en bolo, por absorcion a traves de revestimientos epiteliales o mucocutaneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, y similares) y puede administrarse junto con otros agentes biologicamente activos, tales como agentes quimioterapeuticos, agentes antibioticos u otros agentes inmunoterapeuticos. La administracion puede ser sistemica o local, es decir, en un sitio de infeccion por Staph o directamente a un sitio quirurgico o de implante.

La composicion farmaceutica de la presente invencion puede comprender ademas la administracion de un segundo agente terapeutico al paciente, en la que el segundo agente terapeutico es un agente antibiotico o un agente inmunoterapeutico. Los ejemplos de agentes antibioticos incluyen, sin limitacion, vancomicina, tobramicina, cefazolina, eritromicina, clindamicina, rifampina, gentamicina, acido fusidico, minociclina, co-trimoxazol, clindamicina, linezolida, quinupristina-dalfopristina, daptomicina, tigeciclina, dalbavancina, telavancina, oritavancina, ceftobiprol, ceftarolina, iclaprim, el carbapenem CS-023/RO-4908463, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de agentes inmunoterapeuticos incluyen, sin limitacion tefibazumab, BSYX-A110, Aurexis™, y combinaciones de los mismos. Las listas anteriores de agentes antibioticos y agentes inmunoterapeuticos pretenden ser ejemplos no limitantes; por lo tanto, tambien se contemplan otros agentes antibioticos o agentes inmunoterapeuticos. Las combinaciones o mezclas del segundo agente terapeutico tambien pueden usarse para los fines de la presente invencion. Estos agentes se pueden administrar simultaneamente o como una unica formulacion.

La composicion farmaceutica incluye normalmente uno o mas vehiculos farmaceuticos (por ejemplo, liquidos esteriles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen petrolifero, animal, vegetal o sintetico, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares). El agua es un vehiculo mas tipico cuando la composicion farmaceutica se administra por via intravenosa. Tambien se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehiculos liquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmaceuticos adecuados incluyen, por ejemplo, almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de silice, estearato sodico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sodico, leche desnatada seca, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. La composicion, si se desea, puede contener tambien cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes de pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pildoras, capsulas, polvos, formulaciones de liberacion sostenida y similares. La composicion se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y vehiculos tradicionales, tales como trigliceridos. Las formulaciones orales pueden incluir vehiculos estandar tales como grados farmaceuticos de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Los ejemplos de vehiculos farmaceuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Dichas composiciones contendran una cantidad terapeuticamente eficaz del acido nucleico o proteina, normalmente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehiculo para proporcionar la forma para la administracion apropiada al paciente. Las formulaciones corresponden al modo de administracion.

Las dosis eficaces de las composiciones de la presente invencion, para el tratamiento de las infecciones bacterianas que se han descrito anteriormente varian dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo el modo de administracion, el sitio diana, el estado fisiologico del paciente, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profilactico o terapeutico. En aplicaciones profilacticas, se administra una dosificacion relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo periodo de tiempo. Algunos pacientes continuan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapeuticas, a veces se requiere una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que la progresion de la enfermedad se reduce o se termina, y preferiblemente hasta que el paciente muestra una mejoria parcial o completa de los sintomas de la enfermedad. Posteriormente, se puede administrar al paciente un regimen profilactico. Para el tratamiento profilactico contra la infeccion bacteriana por Staphylococcus, se pretende que la composicion o composiciones farmaceuticas de la presente invencion se puedan administrar antes de la exposicion de un individuo a la bacteria y que la respuesta inmune resultante pueda inhibir o reducir la gravedad de la infeccion bacteriana de tal forma que las bacterias pueden ser eliminadas del individuo. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal o la composicion farmaceutica puede administrarse antes, durante y/o inmediatamente despues de un procedimiento quirurgico, tal como la sustitucion de una articulacion o cualquier cirugia que implique un implante protesico.

Para la inmunizacion pasiva con un anticuerpo o fragmento de union de la presente invencion, los intervalos de dosificacion varian de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 100 mg/kg, y mas normalmente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 mg/kg, del peso corporal del huesped. Por ejemplo, las dosificaciones

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pueden ser de aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal o aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, o dentro del intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/kg. Un regimen de tratamiento a modo de ejemplo implica la administracion una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. En algunos metodos, dos o mas anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de union se administran simultaneamente, en cuyo caso la dosificacion de cada anticuerpo administrado esta dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo se administra normalmente en multiples ocasiones. Los intervalos entre dosis individuales pueden ser diarios, semanales, mensuales o anuales. En algunos metodos, la dosificacion se ajusta para conseguir una concentration de anticuerpo plasmatico de 1-1000 |jg/ml y en algunos metodos 25-300 |jg/ml. Como alternativa, el anticuerpo se puede administrar como una formulation de liberation sostenida, en cuyo caso se requiere una administracion menos frecuente. La dosificacion y la frecuencia varian dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la semivida mas larga, seguida de anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos y anticuerpos no humanos.

Un aspecto adicional de la divulgation se refiere a una vacuna activa (por ejemplo, composition farmaceutica) que incluye un vehiculo y una molecula antigenica que comprende al menos un fragmento de la glucosaminidasa de S. aureus. La molecula antigenica puede estar en forma de (i) una proteina de fusion que incluye el polipeptido de glucosaminidasa y un polipeptido adyuvante o (ii) un conjugado inmunogenico que incluye el polipeptido de glucosaminidasa conjugado con otra molecula inmunogenica.

A modo de ejemplo, las proteinas de fusion adecuadas de la presente divulgacion incluyen aquellas que contienen un polipeptido adyuvante seleccionado del grupo de la flagelina, las proteinas L1 o L2 del virus del papiloma humano (HPV), la glicoproteina D del herpes simplex (gD), la proteina de union del complemento C4, un ligando del receptor 4 tipo toll (TLR4), e IL-1 p.

El polipeptido o proteina de fusion de la presente divulgacion se puede generar usando tecnicas estandar conocidas en la tecnica. Por ejemplo, el polipeptido de fusion puede prepararse mediante la traduction de una fusion en el marco de las secuencias de polinucleotidos de la presente divulgacion y el adyuvante, es decir, un gen hibrido o quimerico. El gen hibrido que codifica el polipeptido de fusion se inserta en un vector de expresion que se usa para transformar o transfectar una celula huesped. Como alternativa, la secuencia polinucleotidica que codifica el polipeptido de la presente divulgacion se inserta en un vector de expresion en el que ya esta presente el polinucleotido que codifica el adyuvante. El adyuvante peptidico de la proteina de fusion puede fusionarse con el extremo N, o preferiblemente, con el extremo C-terminal del polipeptido de glucosaminidasa de la presente divulgacion.

Las fusiones entre los polipeptidos de la presente divulgacion y el adyuvante de proteina pueden ser tales que la secuencia de aminoacidos del polipeptido de la presente divulgacion sea directamente contigua con la secuencia de aminoacidos del adyuvante. Como alternativa, la portion de polipeptido se puede acoplar al adyuvante por medio de una secuencia enlazadora corta. Las secuencias de enlazador adecuadas incluyen enlazadores ricos en glicina (por ejemplo, GGGS2-3), enlazadores ricos en serina (por ejemplo, GSn), u otros enlazadores de inmunoglobulina flexible como se desvela en la Patente de Estados Unidos n.° 5.516.637 de Huang et al.

Los conjugados inmunogenicos adecuados de la presente divulgacion incluyen, pero sin limitation, aquellos que contienen una molecula portadora inmunogenica unida de forma covalente o no covalente a cualquier polipeptido de glucosaminidasa. Puede usarse cualquier molecula portadora inmunogenica adecuada. Las moleculas portadoras inmunogenicas incluyen albumina de suero bovino, ovoalbumina de huevo de pollo, hemocianina de lapa californiana, toxoide tetanico, toxoide difterico, tiroglobulina, un polisacarido capsular neumococico, CRM 197 y una proteina de membrana externa meningococica.

La composicion farmaceutica en forma de una vacuna activa tambien puede incluir una cantidad eficaz de un adyuvante separado. Los adyuvantes adecuados para su uso en la presente divulgacion incluyen hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio y potasio, sulfato de berilio, silice, caolin, carbono, emulsiones de agua en aceite, emulsiones de aceite en agua, dipeptido de muramilo, endotoxina bacteriana, lipido, Quil A, y/o Bordetella pertussis no infecciosa.

La election de un adyuvante depende de la estabilidad de la formulacion inmunogenica que contiene el adyuvante, la via de administracion, el programa de dosificacion, la eficacia del adyuvante para la especie que se vacuna y, en seres humanos, un adyuvante farmaceuticamente aceptable es uno que se ha aprobado o puede aprobarse para su administracion en seres humanos por los organos reguladores pertinentes. Por ejemplo, el alumbre, MPL o adyuvante de Freund incompleto (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32: 173-186 (1998)) en solitario u opcionalmente todas las combinaciones de los mismos son adecuados para su administracion en seres humanos.

En aplicaciones profilacticas, las composiciones farmaceuticas que contienen los polipeptidos de glucosaminidasa inmunogenica se administran a un paciente susceptible a, o en riesgo de otro modo, de la infection bacteriana en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar el inicio de la enfermedad, incluyendo sintomas bioquimicos, histologicos y/o de comportamiento de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patologicos intermedios presentados durante el desarrollo de la enfermedad. En aplicaciones terapeuticas,

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las composiciones farmaceuticas que contienen un anticuerpo monoclonal o un fragmento de union al antigeno de acuerdo con la presente invencion se administran a un paciente sospechoso de, o que ya sufre, tal enfermedad en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los smtomas de la enfermedad (bioquimicos, histologicos y/o de comportamiento), incluyendo sus complicaciones y fenotipos patologicos intermedios en el desarrollo de la enfermedad. Una cantidad adecuada para realizar un tratamiento terapeutico o profilactico se define como una dosis terapeuticamente o profilacticamente eficaz, que se ha identificado anteriormente. Tanto en los regimenes profilacticos como terapeuticos, los agentes se administran normalmente en varias dosis hasta que se ha conseguido una respuesta suficiente. Normalmente, se controla la respuesta y se dan dosificaciones repetidas si la respuesta comienza a disminuir.

Las dosis de tratamiento deben ser tituladas para optimizar la seguridad y la eficacia. La cantidad de inmunogeno depende de si tambien se administra adyuvante, siendo necesarias dosificaciones mas altas en ausencia de adyuvante. La cantidad de un inmunogeno para la administracion varia a veces de 1-500 |jg por paciente y mas normalmente de 5-500 jg por inyeccion para administracion en seres humanos. Ocasionalmente, se usa una dosis mas alta de 1-2 mg por inyeccion. Normalmente se utiliza aproximadamente 10, 20, 50 o 100 |jg para cada inyeccion humana. La masa de inmunogeno tambien depende de la relacion de masa del epitopo inmunogeno dentro del inmunogeno con respecto a la masa del inmunogeno en su conjunto. Normalmente, se usan de 10-3 a 10-5 micromoles de epitopo inmunogenico para cada microgramo de inmunogeno. El momento de las inyecciones puede variar significativamente de una vez al dia, a una vez al ano, a una vez una decada. En cualquier dia dado que se administre una dosis de inmunogeno, la dosificacion es mayor de 1 jg/paciente y normalmente mayor de 10 jg/paciente si se administra tambien adyuvante, y mayor de 10 jg/paciente y normalmente mayor de 100 jg/paciente en ausencia de adyuvante. Un regimen tipico consiste en una inmunizacion seguida de inyecciones de refuerzo a intervalos de tiempo, tales como intervalos de 6 semanas. Otro regimen consiste en una inmunizacion seguida de inyecciones de refuerzo 1, 2 y 12 meses despues. Como alternativa, las inyecciones de refuerzo pueden proporcionarse sobre una base regular o irregular, como se indica por la monitorizacion de la respuesta inmune.

Un cuarto aspecto de la presente invencion se refiere a un anticuerpo monoclonal o fragmento de union a antigeno del mismo, o una composition farmaceutica de la presente invencion para su uso en un metodo de tratamiento de una infection por S. aureus en un paciente que tiene una infection por S. aureus.

En una realization de este aspecto de la invencion, el uso comprende repetir la administracion al paciente de un anticuerpo monoclonal o fragmento de union a antigeno del mismo o una composicion farmaceutica de la presente invencion. El uso puede ser tal que la administracion se realice sistematicamente o se realice directamente a un sitio de la infeccion por S. aureus

El uso puede ser para tratar la infeccion por S. aureus en sitios que incluyen infeccion de la piel, musculo, cardiaco, tracto respiratorio, tracto gastrointestinal, ojo, rinon y tracto urinario, e infecciones oseas o articulares

En una realizacion, el uso es tratar la osteomielitis mediante la administracion de una cantidad eficaz del anticuerpo monoclonal o fragmento de union a antigeno del mismo o la composicion farmaceutica de la presente invencion a un paciente que tiene una infeccion osea o articular por S. aureus. La administracion de estos agentes o composiciones puede realizarse utilizando cualquiera de las vias que se han descrito anteriormente; sin embargo, se prefiere la administracion directamente al sitio de la infeccion osea o articular.

Un sexto aspecto de la presente invencion se refiere a un anticuerpo monoclonal, una portion de union a antigeno, o una composicion farmaceutica de la presente invencion para su uso en un metodo para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugia en el que la cirugia comprende introducir un implante ortopedico en un paciente que necesita un implante ortopedico y en el que el implante ortopedico esta revestido o tratado con el anticuerpo monoclonal, la porcion de union a antigeno o la composicion farmaceutica antes, durante o inmediatamente despues de la implantacion.

En una divulgation, el metodo de introduction de un implante ortopedico incluye administrar al paciente que necesita el implante ortopedico una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal o fragmento de union o una composicion farmaceutica que contiene el mismo, directamente al sitio del implante. En la presente invencion, o ademas, el implante ortopedico esta revestido o tratado con el anticuerpo monoclonal o el fragmento de union a antigeno, o una composicion farmaceutica que contiene el mismo antes, durante o inmediatamente despues del implante del mismo en el sitio de implante.

El implante ortopedico puede ser una protesis articular, un injerto o implante sintetico. La protesis articular a modo de ejemplo incluye, sin limitation, una protesis de rodilla, protesis de cadera, protesis de dedo, protesis de codo, protesis de hombro, protesis temperomandibular y protesis de tobillo. Tambien pueden usarse otras protesis. Los injertos o implantes sinteticos a modo de ejemplo incluyen un disco intervertebral artificial, implante de menisco, o un ligamento cruzado anterior sintetico o de aloinjerto, ligamento colateral tibial, ligamento colateral lateral, ligamento cruzado posterior, tendon de Aquiles, y un manguito rotador. Tambien pueden usarse otros injertos o implantes.

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En una realization, el metodo de introduction de un implante ortopedico esta disenado para incluir el proceso de instalar una revision de reemplazo de articulation total. Cuando se produce una infection, particularmente una infection por Staph de un reemplazo de articulacion original, el unico tratamiento viable es una revision de reemplazo de articulacion total. En esta realizacion, la protesis articular infectada se extrae en primer lugar y despues el paciente se trata para la infeccion subyacente. El tratamiento de la infeccion tiene lugar durante un extenso periodo de tiempo (es decir, 6 meses), tiempo durante el cual el paciente esta inmovil (o tiene unicamente una movilidad limitada) y recibe altas dosis de antibioticos para tratar la infeccion subyacente y opcionalmente uno o mas anticuerpos monoclonales o porciones de union, o composiciones farmaceuticas de la presente invention. Tras el tratamiento de la infeccion subyacente, se instala la nueva protesis articular. Inmediatamente antes (es decir, en las dos semanas que preceden a la instalacion de la nueva protesis articular) y opcionalmente posterior a la instalacion de la nueva protesis articular, se administra al paciente uno o mas anticuerpos monoclonales o porciones de union a antigeno, o composiciones farmaceuticas de la presente invencion. Este tratamiento puede repetirse una o mas veces durante el periodo posterior a la instalacion. Puede administrarse un tratamiento antibiotico en combination con o concurrentemente con el uno o mas anticuerpos monoclonales o porciones de union a antigeno, o composiciones farmaceuticas de la presente invencion. Estos tratamientos son eficaces para prevenir una infeccion o reinfection durante la revision de reemplazo de articulacion total.

Los usos de acuerdo con la presente invencion pueden ser tratar a cualquier paciente que lo necesite, sin embargo, los usos son particularmente utiles para pacientes inmunodeprimidos de cualquier edad, asi como pacientes que tienen mas de 50 anos.

Ejemplos

La presente invencion se ilustra por referencia a los siguientes ejemplos. En la medida en que cualquiera de los ejemplos este dentro del alcance de la presente invencion, se incluyen simplemente para fines de referencia.

Ejemplo 1 - Un modelo transtibial murino de osteomielitis

La OM asociada a implante ortopedico se produce tanto para dispositivos intramedulares (es decir, protesis articulares) como para implantes transcorticales (es decir, dispositivos de fijacion externos, figura 1A). Aunque la tasa de infeccion de los dispositivos de fijacion es 2,5 veces mayor, y tiene una incidencia de mas de 8 veces la de las protesis articulares totales, no se considera que sea tan grave porque la cirugia de revision es mucho mas sencilla (Darouiche, "Treatment of Infections Associated With Surgical Implants", N. Engl. J. Med. 350(14): 1422-9 (2004)). Si bien la mayoria de los casos que involucran un implante transcortical infectado pueden resolverse en una unica cirugia para reubicar el clavo y tratar el absceso de forma independiente, la mayoria de las protesis infectadas deben someterse a dos cirugias de revision (Darouiche, "Treatment of Infections Associated With Surgical Implants", N. Engl. J. Med. 350(14): 1422-9 (2004)). La primera es necesaria para curar la infeccion, y la segunda reemplaza la protesis. Por lo tanto, desde el punto de vista de la importancia clinica, el campo se ha centrado principalmente en modelos de OM asociada a implante que implican un dispositivo intramedular con la cepa UAMS-1 (ATCC 49230) de S. aureus (Daum y col., "A Model of Staphylococcus aureus Bacteremia, Septic Arthritis, and Osteomyelitis in Chickens", J. Orthop. Res. 8(6): 804-13 (1990); Rissing et al., "Model of Experimental Chronic Osteomyelitis in Rats", Infect. Immun. 47(3): 581-6 (1985); Passl et al., "A Model of Experimental Post-Traumatic Osteomyelitis in Guinea Pigs", J. Trauma 24(4): 323-6 (1984); Worlock et al., "An Experimental Model of Post-Traumatic Osteomyelitis in Rabbits", Br. J. Exp. Pathol. 69(2): 235-44 (1988); Varshney et al., "Experimental Model of Staphylococcal Osteomyelitis in Dogs", Indian J. Exp. Biol. 27(9): 816-9 (1989); Kaarsemaker et al., "New Model for Chronic Osteomyelitis With Staphylococcus aureus in Sheep", Clin. Orthop. Relat. Res. 339: 246-52 (1997)). Desafortunadamente, este enfoque tiene limitaciones significativas, sobre todo la incapacidad de generar lesiones (temporales y espaciales) reproducibles. En un esfuerzo por superar esto, la localization de la infeccion fue guiada a la diafisis por la fractura de la tibia inmediatamente despues de la insertion de un clavo intramedular que contiene 1 x 106 UFC, usando un dispositivo Einhorn como se ha descrito previamente (Zhang et al., "Cyclooxygenase-2 Regulates Mesenchymal Cell Differentiation Into the Osteoblast Lineage and is Critically Involved in Bone Repair", J. Clin. Invest. 109(11): 1405-15 (2002)). Se descubrio que la implantation de un clavo transcortical infectado siempre produce lesiones adyacentes al clavo, y nunca da lugar a una OM cronica en otras regiones de la tibia o la propagation hematogena en ratones (figuras 1A-C).

Para cuantificar la osteolisis, se realizo un estudio en el tiempo en el que las tibias infectadas se analizaron por |jCT (figuras 1B-C). Estos resultados son consistentes con la formation de secuestros en la que la resorcion osea osteoclastica en torno al implante infectado se produce con la formacion de hueso periostico reactivo concomitante.

La presencia de OM en los ratones se confirmo histologicamente. Las figuras 2A-H demuestran que el modelo de clavo transcortical tibial contiene todas las caracteristicas sobresalientes de la OM cronica, incluyendo: formacion de secuestro e involucro, resorcion osteoclastica del hueso cortical y bacterias extracelulares tenidas con Gram y biopelicula que residen en el hueso necrotico que rodea al implante. Ninguno de los controles negativos, incluyendo S. aureus muerto por calor y E. coli no patogeno, demostro estas caracteristicas.

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Ejemplo 2 - Cuantificacion por PCR en tiempo real de osteomielitis

No existen metodos conocidos para cuantificar la OM. Dado que es imposible extraer eficazmente bacterias vivas de hueso infectado para determinar la carga bacteriana por unidades formadoras de colonias (UFC) clasicas, se desarrollo un metodo de PCR en tiempo real para cuantificar el numero de genes nuc recuperables en muestras de ADN, como se hace para ensayar la contaminacion en el queso (Hein et al., "Comparison of Different Approaches to Quantify Staphylococcus aureus Cells by Real-Time Quantitative PCR and Application of This Technique for Examination of Cheese", Appl. Environ. Microbiol. 67(7): 3122-6 (2001)) y la sangre (Palomares et al., "Rapid Detection and Identification of Staphylococcus aureus From Blood Culture Specimens Using Real-Time Fluorescence PCR", Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 45(3): 183-9 (2003)), como medida de resultado sustitutiva de la carga bacteriana.

El analisis por RTQ-PCR para el gen nuc especifico de S. aureus puede realizarse usando los cebadores 5'- GCGATTGATGGTGATACGGTT -3' (SEQ ID NO: 15) y 5'-AGCCAAGCCTTGACGAACTAA -3' (SEQ ID NO: 16) que amplifican un producto de 269 pb que se ha descrito previamente (Hein et al., "Comparison of Different Approaches to Quantify Staphylococcus aureus Cells by Real-Time Quantitative PCR and Application of This Technique for Examination of Cheese", Appl. Environ. Microbiol. 67(7): 3122-6 (2001)). Las reacciones pueden realizarse en un volumen final de 20 |jl que consistia en cebadores de 0,3 |jM, 1 x Sybr Green PCR Super Mix (BioRad, Hercules, CA), y 2 jl de la plantilla de ADN de tibia purificada. Las muestras pueden ensayarse usando un Rotor-Gene RG 3000 (Corbett Research, Sydney, AU).

Para controlar la integridad de la plantilla de ADN entre las muestras, tambien puede realizarse un analisis por RTQ- PCR para el gen p-actina de raton que detecta un producto de 124 pb usando los cebadores 5'- AGATGTGAATCAGCAAGCAG-3' (SEQ ID NO: 17) y 5'-GCGCAAGTTAGGTTTTGTCA-3' (SEQ ID NO: 18). Usando los cebadores de PCR especificos para p-actina murina, S. aureus nuc, y ADN genomico de ARNr, se demostro la especificidad de estas pCr y la capacidad de amplificar los productos predichos (Li et al., "Quantitative Mouse Model of Implant-Associated Osteomyelitis and the Kinetics of Microbial Growth, Osteolysis, and Humoral Immunity", J. Orthop. Res. 26(1): 96-105 (2008)). Despues, usando el ADN plasmidico purificado que contenia el gen nuc, o ADN genomico de S. aureus, se realizo un experimento de dosis-respuesta y se determino que el limite de deteccion para esta RTQ-PCR es de ~100 copias (Li et al., "Quantitative Mouse Model of Implant-Associated Osteomyelitis and the Kinetics of Microbial Growth, Osteolysis, and Humoral Immunity", J. Orthop. Res. 26(1): 96-105 (2008)). Se ha usado este ensayo para cuantificar la carga bacteriana in vivo como una medida de resultado secundaria de infeccion y eficacia de la inmunizacion pasiva.

Ejemplo 3 - Cinetica de la infeccion e inmunidad humoral durante el establecimiento de la osteomielitis

Para cuantificar la patogenesis microbiana y la inmunidad del huesped durante el establecimiento de la osteomielitis, se realizo un estudio de tiempo en el que a los ratones se les puso un implante de clavo transcortical infectado en su tibia, y la carga bacteriana y la respuesta humoral del huesped se determinaron con el tiempo mediante RTQ-PCR y transferencia Western de nuc/p-actina, respectivamente (figuras 3A-C). Los resultados indican una clara correlacion inversa entre la infeccion y la inmunidad humoral. De acuerdo con la patogenesis microbiana clasica y la inmunidad adquirida a las bacterias extracelulares, estos resultados indican que las bacterias se establecen inmediatamente y entran en una fase de crecimiento exponencial, que se extingue por una respuesta humoral neutralizante despues de 11 dias. Basandose en la coincidencia de la carga bacteriana maxima con la genesis de anticuerpos IgG de alta afinidad contra proteinas bacterianas especificas, es evidente que estos antigenos "inmuno-dominantes" provocan una respuesta inmune funcional que es tanto diagnostica como protectora frente al establecimiento de OM.

Ejemplo 4 - Identificacion y clonacion de la subunidad de glucosaminidasa de autolisina de S. aureus como un antigeno inmunodominante de 56 kDa que provoca una respuesta de IgG2b especifica durante el establecimiento de OM

Para caracterizar adicionalmente la respuesta humoral durante el establecimiento de OM, se determino la prevalencia de isotipos de Ig en el suero de ratones durante las primeras dos semanas de infeccion por ELISA (Li et al., "Quantitative Mouse Model of Implant-Associated Osteomyelitis and the Kinetics of Microbial Growth, Osteolysis, and Humoral Immunity", J. Orthop. Res. 26(1): 96-105 (2008)). Los resultados mostraron que los ratones inician una respuesta de IgM clasica en la primera semana que se convierte en una respuesta de IgG2b especifica en la segunda semana, que recientemente ha demostrado tener potentes actividades opsonicas y protectoras contra los antigenos de S. aureus (Maira-Litran et al., "Comparative Opsonic and Protective Activities of Staphylococcus aureus Conjugate Vaccines Containing Native or Deacetylated Staphylococcal Poly-N-acetyl-beta-(1-6)-glucosamine", Infect. Immun. 73(10): 6752-62 (2005)).

Para elucidar la identidad molecular de los antigenos inmuno-dominantes identificados en la figura 3C, se realizo una transferencia Western sustractiva de extracto total de S. aureus que se separo mediante 2D-PAGE (figuras 4A- C). Este analisis revelo un polipeptido que no se detecto por el suero preinmune, pero tenia una fuerte reactividad con el suero post-inmune del dia 14. La proteina se aislo a partir de un gel tenido de azul de Coomassie preparativo, se digirio con tripsina y se analizo por desorcion/ionizacion laser asistida por matriz (MALDI), que resolvio 70 picos

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peptidicos individuales. La secuencia aminoaddica de cada peptido era una coincidencia del 100 % con la secuencia conocida de la subunidad Gmd de S. aureus Alt. Curiosamente, otros tambien han descubierto recientemente que Atl es un antigeno inmuno-dominante en un modelo de tibia de conejo de OM MRSA (Brady et al., "Identification of Staphylococcus aureus Proteins Recognized by the Antibody-Mediated Immune Response to a Biofilm Infection", Infect. Immun. 74(6): 3415-26 (2006)).

Para confirmar que el punto escogido del gel 2D-PAGE en la figura 4C era el antigeno inmuno-dominante relevante, se genero una proteina de fusion marcada con 6-His recombinante clonando la region codificante de 1.465 pb de la subunidad de glucosaminidasa de 53 kDa de autolisina de S. aureus en el sitio XhoI-BamHI del plasmido de expresion pET-28a(+) (Novagen), que contiene el promotor lac I para la induccion de IPTG. Despues de la secuenciacion del ADN, se uso el plasmido para transformar E. coli BL21, que se uso para producir His- glucosaminidasa (His-Gmd) recombinante. Despues, esta proteina recombinante se utilizo para evaluar la reactividad de sueros pre-inmunes e inmunes. Los resultados mostraron que la proteina recombinante de 57 kDa inducida por IPTG solo es reconocida por el suero inmune, confirmando asi que Gmd es un antigeno inmuno- dominante de S. aureus. Este experimento se repitio con anti-sueros de ratones infectados con Xen 29, y se confirmo que C57B1/6 tambien generan anticuerpos especificos de Gmd contra esta cepa bioluminiscente de S. aureus.

Ejemplo 5 - Formacion de imagenes por bioluminiscencia in vivo de S. aureus transformado por lux como una medida de resultado longitudinal de OM y crecimiento bacteriano

Aunque el metodo por RTQ-PCR de cuantificacion de OM en un modelo de raton es muy util, hay tres limitaciones principales a este enfoque. En primer lugar, no es longitudinal, ya que el analisis requiere el sacrificio de los ratones para cosechar el ADN. En segundo lugar, es muy laborioso y requiere un gran cuidado durante el aislamiento del ADN, el analisis por PCR y el analisis de datos. En tercer lugar, la detection del ADN genomico de S. aureus (genes nuc) no puede distinguir entre las bacterias que estan en una fase de crecimiento activo frente a las bacterias latentes empaquetadas de forma estanca en una biopelicula. Por lo tanto, el analisis por RTQ-PCR no se puede usar facilmente para evaluar el efecto de mAb sobre el crecimiento bacteriano in vivo.

Para superar estos inconvenientes, la presente invention se refiere a un enfoque altamente innovador para controlar patogenos in vivo usando imagenes de bioluminiscencia (Contag et al., "Photonic Detection of Bacterial Pathogens in Living Hosts", Mol. Microbiol. 18(4): 593-603 (1995)). Mas recientemente, P. R. Contag y col. han generado S. aureus bioluminiscente (Xen 29, ATCC 12600) para este fin (Francis et al., "Monitoring Bioluminescent Staphylococcus aureus Infections in Living Mice Using a Novel luxABCDE Construct", Infect. Immun. 68(6): 3594-500 (2000)). Las figuras 5A-B demuestran como este enfoque se adapta en el modelo de OM de la presente invencion. En estudios de transcurso de tiempo con Xen29, solo se detecto la senal de fondo en ratones que recibieron un clavo esteril o ratones infectados tratados con gentamicina parenteral. Por el contrario, el BLI de tibias infectadas no tratadas demostro un fuerte aumento de 4 veces desde el inicio en el dia 4, que posteriormente descendio a niveles de fondo por el dia 11.

Ejemplo 6 - La vacuna de Gmd recombinante protege a los ratones de OM asociada a implante

Para evaluar el potencial de una inmunizacion pasiva anti-autolisina para OM, se realizo un estudio de la vacuna de Gmd recombinante activa inicial en el que se inmunizaron ratones (n = 20) como se indica a continuation: Grupo 1 (PBS en adyuvante (control negativo)); Grupo 2 (20 |jg de extracto de proteoma total de S. aureus Xen 29 emulsificado 1:1 con un volumen igual de adyuvante (control positivo)); Grupo 3 (20 jg de His-glucosaminidasa en adyuvante). Una emulsion de 150 jl de cada vacuna se inyecto por via intramuscular (i.m.) 28 dias antes de la exposition. Se realizaron inmunizaciones de refuerzo (i.m.; 20 jg de proteina en adyuvante incompleto de Freund) 14 dias antes de la estimulacion.

Para evaluar la eficacia de la vacuna en estos ratones, se desarrollo un ELISA anti-Gmd (figura 6A) y se uso para cuantificar los titulos de anticuerpos sericos antes de la inmunizacion inicial, antes de la inmunizacion de refuerzo, y antes de la estimulacion bacteriana (figura 6B). Sorprendentemente, los resultados demostraron que solo la vacuna recombinante provoco una respuesta inmune de alto titulo. Para evaluar la eficacia de estas vacunas, los ratones inmunizados se estimularon con un clavo transtibial infectado con Xen29 como se ha descrito en el Ejemplo anterior (vease la figura 5A-C), se realizo BLI el dia 3, y los ratones se sometieron a eutanasia para RTQ-PCR nuc el dia 11. Sorprendentemente, 18 de los 20 ratones inmunizados con proteoma total de S. aureus murieron a las 48 horas de la estimulacion; por lo tanto, los datos de eficacia de ese grupo no estan disponibles. Aunque solo se pueden proporcionar explicaciones especulativas para esta observation (es decir, hiperinmunidad frente a otros antigenos), el hecho de que no se haya producido muerte en ninguno de los otros grupos y de que las muertes se hayan reproducido en las 4 cohortes de 5 ratones del Grupo 2 indica que los resultados son reales. Por esta razon, este protocolo de inmunizacion no debe usarse como un control positivo para futuros estudios. Tambien destaca las preocupaciones de seguridad con las vacunas activas, y apoya la razon de una inmunizacion pasiva con mAb purificado o fragmentos de union del mismo.

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Los datos de BLI y RTQ-PCR nuc de los Grupos 1 y 3 se presentan en las figuras 7A-C. Los resultados demuestran claramente una reduction significativa de bLi detectada en los ratones inmunizados His-Gmd (figuras 7A-B), que muestra una disminucion en el crecimiento planctonico de las bacterias. De acuerdo con este hallazgo, se observo que hubo una reduccion significativa en el numero de genes nuc en el pico de la carga bacteriana en este modelo (dia 11). Por lo tanto, estos datos demuestran que la vacuna de Gmd recombinante puede proteger a ratones de OM en el modelo.

Ejemplo 7 - Generacion y cribado de anticuerpos monoclonales Anti-Gmd de raton

Basandose al exito de la inmunizacion His-Gmd que se ha descrito en el Ejemplo 6, este protocolo se uso para generar mAb anti-Gmd de raton. Se usaron procedimientos estandar para generar el mAb. A partir de un grupo inicial de hibridomas que se prepararon, se selecciono un primer subconjunto seleccionado por ELISA para la actividad anti-Gmd y se selecciono un segundo subconjunto que poseia mayor afinidad despues de un ensayo de transferencia Western.

Cinco de las lineas celulares de hibridoma se seleccionaron basandose en su aparente alta afinidad por Gmd (<109 M) y el supuesto epitopo para estas regiones que se encuentra dentro del dominio R3 de Gmd. Debido a que el dominio R3 no es el dominio catalitico de la proteina Gmd, era inesperado que estos anticuerpos monoclonales poseyeran una actividad inhibidora significativa anti-Gmd. Los cinco hibridomas seleccionados eran 1C11, 1E12, 2D11, 3A8 y 3H6. Todos anticuerpos de IgG 1 de raton secretados.

Ejemplo 8 - Alteracion de crecimiento in vitro de Xen29 de Staphylococcus aureus por anticuerpos monoclonales anti-glucosaminidasa

Se obtuvieron alicuotas congeladas de cada linea celular (1C11, 1E12, 2D11, 3A8 y 3H6) directamente del proveedor que las preparo a petition nuestra (Precision Antibodies, Inc., Columbia, MD). Las celulas congeladas se descongelaron y despues se lavaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con 50 |jg/ml de gentamicina y suero fetal bovino al 10 % (FBS). El sobrenadante del cultivo cosechado se aclaro por centrifugation (10 min, 1000 x g) y se congelo.

Se descongelaron 30 ml de sobrenadante de cultivo de cada linea celular a 37-45 °C y se filtraron a traves de un filtro de 0,22 jm. Despues, cada uno se purifico en una columna de proteina G-agarosa de volumen de lecho de 5 ml (GE Healthcare HiTrap™ Protein G HP, Cat. N.° 17-0405-03, Lote N.° 10036021). En el lugar de la bomba para la que se disenan estas columnas, se anadieron fluidos por medio de jeringas luer-lock montadas por adaptadores en la parte superior de la columna. La columna se lavo en primer lugar con PBS para eliminar el conservante de etanol y despues se anadieron sobrenadantes de cultivo a 5-6 ml/min seguido de seis volumenes de columna de PBS para lavar la proteina no unida. El anticuerpo adsorbido se eluyo con dos volumenes de columna de glicina 0,1 M, pH 2,7, en un recipiente de recogida que contenia 1 ml de Tris 1,0 M, pH 8,0, para neutralizar el producto eluido. Despues, la columna se lavo con cuatro volumenes de columna de PBS en preparation para el siguiente anticuerpo, o con PBS que contenia NaN3 al 0,02 % para el almacenamiento

Los anticuerpos eluidos se concentraron y se dializaron en PBS en concentradores Pierce® (Thermo Scientific 7 ml/20K MWCO, Cat. N.° 87750, lote n.° kH137631A) mediante centrifugaciones sucesivas a 3500 x g, 40 min, 4 °C. La concentration de anticuerpos se determino mediante ELISA usando MOPC21 o Phe12.15 (ambas IgG 1 de raton) como patrones. Se adsorbio IgG anti-raton de cabra no marcada (Southern Biotechnology Cat. N.° 1030-01) en placas de microtitulacion NUNC Maxisorp de 96 pocillos a 5 jg/ml en PBS, 100 jl por pocillo, una hora TA o durante una noche a 4 °C. Los pocillos se bloquearon mediante la adicion de 200 jl de BSA al 3 % en PBS durante una hora a TA o durante una noche a 4 °C. Las placas bloqueadas se lavaron dos veces con PBS que contenia Tween 20 al 0,05 % (PBST) y listos para usar. Las muestras se prepararon como diluciones en serie en PBST y se anadieron 100 jl a los pocillos designados para patrones y muestras. Las muestras se incubaron durante una hora, TA, y despues se lavaron 4 veces con PBST de una botella rociadora. El anticuerpo de raton capturado se detecto mediante la adicion a cada pocillo de 100 jl de IgG de cabra anti-raton conjugado con HRP (HRP-GAM, Southern Biotechnology, Cat. N.° 1031-05), diluido a 1:2000 en PBST, e incubado durante una hora, TA. Despues de lavar las placas 4 veces con PBST de una botella de chorros, se anadio el substrato de HRP cromatografico ABTS (Southern Biotechnology, Cat. N.° 0401-01), 100 jl por pocillo. Se dejo que el color se desarrollara durante 5-10 minutos, TA. Las concentraciones de anticuerpos se determinaron proyectando valores de color de muestra sobre las curvas estandar y despues corrigiendo la dilution. Estas concentraciones se utilizaron para estudios de titulacion para determinar su efecto sobre el crecimiento de S. aureus.

Xen29 de S. aureus (Kadurugamuwa et al., "Rapid Direct Method for Monitoring Antibiotics in a Mouse Model of Bacterial Biofilm Infection", Antimicrob Agents Chemother 47: 3130-7 (2003) y Kadurugamuwa et al., "Noninvasive Optical Imaging Method to Evaluate Postantibiotic Effects on Biofilm Infection In Vivo", Antimicrob Agents Chemother 48: 2283-7 (2004)) era la unica cepa bacteriana usada en estos experimentos. Se recogio 1 pl de Xen29 de S. aureus de una reserva congelada y se cultivo en 10 ml de medio LB a 37 °C en una plataforma giratoria a 200 rpm durante 12 horas con respecto a una fase semi-logaritmica. Despues, las bacterias se diluyeron en medio lB a 1000 ufc/ml y se anadieron 100 pl de la suspension diluida a los pocillos de una microtitulacion de fondo plano (con

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cubierta) disenada para la adicion de los anticuerpos y controles. Cada anticuerpo anti-Gmd y de control se diluyo en LB de reservas de aproximadamente 1 mg/ml en PBS y se esterilizo a traves de un filtro de 0,2 |j. Se anadieron 100 jl de cada anticuerpo a los pocillos cuadruplicados designados. Despues, las placas se incubaron despues a 37 °C y se midio la dispersion de la luz a 490 y 670 nm a t = 0, 5, 7, 9, 11, 13, 15 horas en un lector de placas de microtitulacion. Se tomo un punto de tiempo final despues de 24 horas para confirmar los valores de meseta medidos.

Los cinco anticuerpos se purificaron por cromatografia de afinidad sobre Proteina G-Agarosa, se concentraron a 1 mg/ml en PBS y se dializaron para eliminar conservantes tales como NaN3 y antibioticos que podrian interferir en el ensayo. Se pusieron 100 ufc de la cepa Xen29 de S. aureus de un cultivo en fase semi-logaritmica en cada pocillo de microtitulacion en medio LB junto con 100 jl de cada anticuerpo o control (tambien en medio LB) a 50 jg/ml (~3 x 10-7 M). El crecimiento se controlo midiendo la dispersion de la luz a 490 y 670 nm a intervalos de mas de 26 horas.

La reduction aparente en el crecimiento de S. aureus se observo mediante anticuerpos monoclonales anti-Gmd. Como se representa en la figura 8, cuatro de los anticuerpos deprimieron el aumento relacionado con el crecimiento en la dispersion de la luz de Xen29. Los cuatro anticuerpos que redujeron la dispersion de la luz lo hicieron en el mismo grado mientras que el control apareado de los isotipos (MOPC21) era identico al Xen29 cultivado en ausencia de cualquier anticuerpo. El quinto anticuerpo, 3H6, tambien demostro un comportamiento similar en un experimento separado.

Tambien se observo que la alteration de la dispersion de luz relacionada con el crecimiento de Xen29 es dependiente de la dosis y consistente con la interaction de alta afinidad entre anticuerpos monoclonales y Gmd nativo. La decision critica para abordar la dependencia de la dosis de la alteracion del crecimiento observada de Xen29 fue si la reduccion aparente en el crecimiento de Xen29 se revelo solo parcialmente debido a que la concentracion de anticuerpo era demasiado baja o el efecto maximo ya se observo y concentraciones mas altas no tendrian ningun efecto adicional

Debido a que cuatro de los anticuerpos tenian la misma magnitud de efecto y 50 jg/ml (3 x 10-7 M) era una concentration muy alta, los niveles de anticuerpos se redujeron a partir de 50 jg/ml en diluciones seriadas de 1005 Los datos representativos se presentan en la figura 9. El anticuerpo monoclonal 1C11 altero el crecimiento de Xen 29 al mismo grado a 50, 16 y 5 jg/ml, parcialmente a 1,6 (~1 x 10-8 M), y no fue diferente del anticuerpo irrelevante MOPC21 a 0,5 jg/ml (figura 10). Se obtuvieron resultados esencialmente identicos para los mAbs 2D11, 1E12 y 3A8.

Los resultados para el anticuerpo de control apareado al isotipo MOPC21 se presentan en la figura 10. Las curvas de crecimiento eran basicamente identicas al control sin anticuerpo. La ligera elevation de las muestras de 50 jg/ml se debio a su colocation en pocillos externos en la placa de microtitulacion (efecto de borde).

Suponiendo que la inhibition de Gmd se debe a un alto grado de union a anticuerpo, entonces una estimation que asume que se requiere aproximadamente diez veces el Kd pone la afinidad operativa para la Gmd en la proximidad de 1 nM.

Estos datos indican que los cuatro mAb anti-Gmd inhiben la actividad de Gmd, conduciendo a un cambio en el patron de crecimiento in vitro de Xen29, pero no tienen efecto sobre el tiempo de duplication. La inhibicion de la actividad de Gmd conduce a una citocinesis fallida, es decir, el genoma y las membranas celulares se dividen normalmente, pero las paredes celulares no se separan conduciendo a grandes grupos de celulas agregadas (Sugai et al., "Identification of Endo-beta-N-acetylglucosaminidase and N-acetylmuramyl-L-alanine Amidase as Cluster- dispersing Enzymes in Staphylococcus aureus", J Bacteriol 177: 1491-6 (1995)). Este cambio es detectable por dispersion de luz porque hay menos centros de dispersion (aunque mayores) que cuando las celulas Xen29 se dividen libremente.

Ya se ha demostrado que los anticuerpos de la presente invention satisfacen varios criterios clave. Estos son anticuerpos de IgG de alta afinidad producidos por los hibridomas parentales a niveles robustos (~50 jg/ml en cultivo estatico). Reconocen los epitopos conservados y, en consecuencia, algunos o la mayoria reconoceran Gmd de la mayoria de cepas de S. aureus. Ademas, estos experimentos proporcionan evidencia de que estos anticuerpos monoclonales reconocen Gmd nativo y no meramente la His-Gmd recombinante que se uso como le inmunogeno, y que actuan como inhibidores de Gmd. Todos los anticuerpos monoclonales muestran una actividad inhibidora de Gmd de entre aproximadamente el 70 a aproximadamente el 80 por ciento. Este nivel de actividad inhibidora de Gmd es bastante sorprendente dado que los cinco anticuerpos seleccionados se unen a epitopes situados dentro del dominio R3 de Gmd en lugar de su dominio catalitico.

Ejemplo 9 - Los anticuerpos monoclonales especificos para glucosaminidasa de Staphylococcus aureus usan una matriz diversa de genes Vh

Para determinar que los cinco anticuerpos monoclonales bajo investigation eran unicos, se determinaron las secuencias de los genes Vh y Vl para los cinco hibridomas candidatos (1C11, 1E12, 2D11, 3A8 y 3H6) identificados

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en el ejemplo anterior.

Debido a que existen considerables aplicaciones y ventajas medicas en el estudio de cada uno de un conjunto de anticuerpos monoclonales espedficos para la glucosaminidasa de S. aureus (Gmd), es beneficioso identificar hibridomas que expresan anticuerpos identicos (sibs). Se seleccionaron cinco hibridomas para el analisis de secuencia de sus genes de cadena pesada y ligera de Ig.

Se obtuvieron alicuotas congeladas de cinco lineas celulares de hibridoma del proveedor A&G Precision Antibody™ (9130 Red Branch Road, Suite U, Columbia, MD 21045), que prepararon los hibridomas en nuestra direccion. Las celulas se descongelaron, se lavaron en DMEM con gentamicina y FBS al 10 % para eliminar el DMSO, y despues se cultivaron en DMEM con gentamicina y FBS al 10 %. Despues de unos pocos dias, las celulas se cosecharon por centrifugacion y se almacenaron a -20 °C como un sedimento congelado para una extraccion de ARN posterior.

La amplificacion por RT-PCR del ARNm de cadena pesada fue exitosa en los cinco hibridomas. El analisis secuencial revelo que se usaron tres segmentos genicos de Vh de linea germinal diferentes. Dos de los hibridomas (2D11 y 3H6) usaron los mismos segmentos Vh y J de la linea germinal, pero los diferentes segmentos D y cada uno mostraron solo una diversificacion de secuencia modesta a partir de la linea germinal a nivel de proteina. La cadena pesada del quinto hibridoma (1C11) no se amplifico inicialmente en RT-PCR incluso con cebadores de PCR disenados para amplificar algunos de los segmentos genicos de Vh mas raramente utilizados. Se puede inferir que expreso un gen Vh de Ig distinto de los otros.

Se extrajo ARN total de celulas de hibridoma crecientes frescas y ~5 microgramos de ARN se transcribieron de forma inversa usando el kit BioRad iScript. Las alicuotas de ADNc se amplificaron por PCR con cebadores de consenso para los extremos 5' de regiones de cadena pesada y ligera variables de murino emparejadas con cebadores de region constante. Se obtuvieron fuertes productos para genes 4/5 Vh y 5/5 Vl. Los productos de PCR se purificaron en gel y se secuenciaron directamente. Los 4 productos Vh dieron una secuencia limpia, pero se mezclaron 2/4 productos de cadena ligera. Las dos restantes dieron buenas secuencias. La cadena ligera derivada de la linea celular que no proporciono un producto de cadena pesada no se secuencio. Las regiones variables para los anticuerpos que no pudieron amplificar en los experimentos iniciales utilizando cebadores de marco 1 se amplificaron satisfactoriamente usando un conjunto de cebadores diferente que se dirige a las regiones lider secretoras de los segmentos genicos variables. Estos productos de PCR tambien se secuenciaron directamente despues de la purificacion.

Los mejores apareamientos para los genes de la region V de la linea germinal se determinaron usando BLAST Ig (NCBI). La secuencia de AdN determinada se tradujo en secuencia proteica usando un programa en linea disponible en el sitio web de Expasy. La alineacion de secuencias de las secuencias 2D11 y 3H6 se realizo mediante inspeccion visual.

Como se ha indicado anteriormente, eventualmente los cinco genes Vh se amplificaron y se secuenciaron con exito. Los resultados detallados de la secuencia de ADN y de proteina para los cinco hibridomas se presentan a continuacion.

El hibridoma 2D11 (correspondencia de linea germinal mas cercana: J558.18.108) tiene la secuencia nucleotidica Vh (SEQ ID NO: 21) como se indica a continuacion:

GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGACCTGTGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCC

TGTAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACTATATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGA

AAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGTTATTAATCCTTACAACGGTGATACTACCTACAGCCAGAAG

TTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTTGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAAC

AGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAAATTACGACGAGTACTTCGAT

GTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTAT

CCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCNGGTCAAG

GGC

VL 2D11 (correspondencia de linea germinal mas cercana: at4) tiene la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 22) como se indica a continuacion:

GATATTGTGATGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATG

ACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCC

CCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGC

AGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAGGATGCTGCCACT

TATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTTACCCGCTCACGTTCGGT

La secuencia aminoacidica de 2D11 Vh de hibridoma (SEQ ID NO: 1) es como se indica a continuacion:

5

10

15

20

25

30

35

EVQLQESGPVLVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGVINPYNGDTTYSQK

FKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCARNYDEYFDVWGTGTTVTVSSAKTTPPSVY

PLAPGSAAQTNSMVTLGCXVKG

La 2D11 Vl tiene la secuencia aminoacidica (SEQ ID NO: 8) como se indica a continuacion:

DIVMTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSG

SGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFG

El hibridoma 3H6 (correspondencia de lmea germinal mas cercana: J558.18.108) tiene la secuencia nucleotidica Vh (SEQ ID NO: 23) como se indica a continuacion:

GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGACCTGTGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCC

TGTAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACTTTATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGA

AAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGTTATTAATCCTTTCAACGGTGGTAATAGGTACAACCAGAAC

TTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTTGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAAC

AGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGGGGACTATGACTCCCCCTGG

TTTGATTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCT

GTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTG

GTCAAGGGCTATTCCCNGAGCCAGTG

La 3H6 Vl (correspondencia de linea germinal mas cercana: cp9, JK1) tiene la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 24) como se indica a continuacion:

CAGATGACACAGACTACGTCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGC

AGTGCAAGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTT

AAACTCCTGATCTATTACACATCAAGTTTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCGGT

GGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCTCCATCAGCAACCTGGAACCTGAAGATATTGCCACTTAC

TATTGTCAGCAGTATAGTAAGCTTCCTTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA

La secuencia aminoacidica del hibridoma 3H6 Vh (SEQ ID NO: 2) es como se indica a continuacion:

EVQLQESGPVLVKPGASVKLSCKASGYTFTDYFMNWVKQSHGKSLEWIGVINPFNGGNRYNQN

FKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCARGDYDSPWFDYWGQGTLVTVSAAKTTPPS

VYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYSXSQ

La secuencia aminoacidica del hibridoma 3H6 Vl (SEQ ID NO: 9) es como se indica a continuacion:

QMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGG

GSGTDYSLSISNLEPEDIATYYCQQYSKLPWTFGGGTKLEIK

El hibridoma 1E12 (correspondencia de linea germinal mas cercana: 7183.46 VH7) tiene la secuencia nucleotidica Vh (SEQ ID NO: 25) como se indica a continuacion:

GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTCGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC

TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATGTCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAA

AAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTGGTCATACTTACTATCTAGACAAT

GTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTGCACATGAGC

CATCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGCTTACTACGGTAGTAGTTAC

GACGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCC

CCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGA

TGCCTGGTCAAGGGC

La 1E12 Vl (correspondencia de linea germinal mas cercana: ai4) tiene la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 26) como se indica a continuacion:

GATATTGTGATCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATG

ACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTACACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGA

TCCTCCCCCAAACTNTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTC

AGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCT

GCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCATGGACGTTCGGTGGAGGCACC

La secuencia aminoacidica del hibridoma 1E12 Vh (SEQ ID NO: 3) es como se indica a continuacion:

EVQLQESGGGFVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYVMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGGHTYYLDN VKGRFTIS RDNAKNNLYLHMSHLKSE DTAMYYCARAYYGSS YDAMDYWGQGTSVTVS SAKTTP PSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKG

5

10

15

20

25

30

35

40

El 1E12 Vl tiene la secuencia aminoacidica (SEQ ID NO: 10) como se indica a continuacion:

DIVITQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKXWIYSTSNLASGVPARF

SGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPWTFGGGT

El hibridoma 3A8 (correspondencia de linea germinal mas cercana: VHJ606.4.8.2) tiene la secuencia nucleotidica Vh (SEQ ID NO: 27) como se indica a continuacion:

GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCT

TGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAG

AAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAAAGACAAAACTAATAATCATGCAACATACTATGCT

GAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGTTTCCAAAAGTCGTGTCTTCCTGCAA

ATGAACAGCTTAAGACCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACGTCTGGGCCATATTTTGAC

TACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTAT

CCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAG

GGCTATTTCCCTGAG

El 3A8 Vl (correspondencia de linea germinal mas cercana: KV 19-25, JK2) tiene la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 28) como se indica a continuacion:

GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATC

ACCTGCAAGGCCAGTCAGGACGTGAGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAA

TCTCCTAAACTACTGATTTACTGGACATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACA

GGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTAAAGACCTGGCA

CTTTATTACTGTCAGCAACATTATACCACTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAA

ATAAAA

La secuencia aminoacidica del hibridoma 3A8 Vh (SEQ ID NO: 4) es como se indica a continuacion:

EVQLQESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIKDKTNNHATYYA

ESVKGRFTISRDVSKSRVFLQMNSLRPEDTGIYYCTSGPYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVY

PLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPE

La secuencia aminoacidica del hibridoma 3A8 Vl (SEQ ID NO: 11) es como se indica a continuacion:

DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTSTRHTGVPDRFT

GSGSGTDFTLTISSVQAKDLALYYCQQHYTTPYTFGGGTKLEIK

El hibridoma 1C11 (correspondencia de linea germinal mas cercana: VH 9-15, DST4-C57B1-6, JH3) tiene la secuencia nucleotidica Vh (SEQ ID NO: 29) como se indica a continuacion:

CAGATCCAGTTGGTACAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCC

TGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAACGTATGGAATGAGCTGGGTGAATCAGGCTCCAGGA

AAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACTCTGGAGTGCCAACATATGCTGATGAC

TTCAAGGGACGGTTTGTCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAAC

AACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGAGAGGAGTACAGCTCAGGCTAC

GCGGCCTGGTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

El 1C11 Vl (correspondencia de linea germinal mas cercana: VK23-43, JK5) tiene la secuencia nucleotidica (SEQ ID NO: 30) como se indica a continuacion:

GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTT

TCCTGCAGGGCCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAG

TCTCCAAGGCTTCTCATCGAATATGCTTCCCGGTCCATCTCTGGGATCCCCTCTAGGTTCAGT

GGCGGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATTTTGGA

TTGTATTTCTGTCAACAGAGTAACAGCTGGCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAG

CTGAAA

La secuencia aminoacidica del hibridoma 1C11 VH (SEQ ID NO: 5) es como se indica a continuacion:

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTYGMSWVNQAPGKGLKWMGWINTYSGVPTYADD

FKGRFVFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAREEYSSGYAAWFPYWGQGTLVTVSA

La secuencia aminoacidica del hibridoma 1C11 Vl (SEQ ID NO: 12) es como se indica a continuacion:

DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIEYASRSISGIPSRFS

GGGSGTDFTLSINSVESEDFGLYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELK

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

A partir de las secuencias obtenidas, el ajuste mas cercano para los segmentos genicos de la lmea germinal Vh y Vl se determino como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1: Correspondencias de lmea germinal para lineas celulares de hibridoma Hibridoma______Linea germinal Vh______Linea germinal Vl

1C11

VH 9-15, DST4-C57B1-6, JH3 VK23-43, JK5

1E12

7183.46 VH7 ai4

2D11

J558.18.108 at4

3A8

VHJ606.48.2 KV 19-25, JK2

3H6

J558.18.108 cp9, JK1

secuenciado

Cada uno de los cinco hibridomas expreso un gen Vh unico. La figura 11 muestra la alineacion de los cuatro genes Vh inicialmente secuenciados, y la figura 13 muestra la alineacion de los cinco genes Vh secuenciados. La figura 15 muestra la alineacion de los genes Vh secuenciados para 1C11 y 3A8 solamente.

La figura 12 muestra la alineacion de los dos genes Vl obtenidos inicialmente. La figura 14A muestra la alineacion de los cinco genes Vi secuenciados, mientras que los cinco genes Vi secuenciados de la figura 14B excepto el de 1C11.

El hecho de que un hibridoma (1C11) no produjo un producto de PCR con los cebadores iniciales que amplifican los genes VH mas comunes sugiere que utiliza un cuarto segmento de gen Vh no identico a ninguno de los otros identificados aqui. Dos de los hibridomas utilizaron el mismo gen de la linea germinal Vh, pero no son identicos. Los hibridomas 2D11 y 3H6 utilizaron ambos el segmento genico VH de la linea germinal J558.18.108. Sus secuencias se comparan con el gen de la linea germinal en la figura 11. La inspeccion de la secuencia revela que existe solo una diferencia en CDR1, cuatro en CDR2 y cinco en CDR3 (incluyendo vacios).

Los cinco hibridomas no son diferentes y entre ellos se utilizaron al menos cuatro genes de linea germinal Vh.

Ejemplo 10 - Inhibicion de actividad enzimatica de Gmd de S. aureus por los mAb 1C11, 2D11, 3H6, 1E12 y 3A8.

El metodo de medicion de la actividad enzimatica de Gmd es basicamente el metodo de Mani et al. (Mani et al., "Isolation and Characterization of Autolysis-Defective Mutants of Staphylococcus aureus Created by Tn917-lacZ Mutagenesis" J. Bacteriol. 175(5): 1493-1499 (1993)). Los Micrococcus lysodeikticus liofilizados y resuspendidos se degradaron por la accion de la Gmd, dando como resultado una reduccion en la dispersion de la luz a 490 nm. Se anadieron 10o pl de muestra que contenia Gmd diluida en solucion salina tamponada con fosfato con Tween 20 al 0,05 % (PBST) a los pocillos de una placa de microtitulacion de 96 pocillos. Se anadieron 100 pl de una suspension al 0,15 % (p/v) de Micrococcus lysodeikticus a cada pocillo y se midio inmediatamente la dispersion de la luz para establecer el A490 inicial, normalmente aproximadamente 0,8. Despues, la placa se incubo a 37 °C y la dispersion de la luz se midio de nuevo en 30 y 60 minutos. La reduction en A490 a 60 minutos se tomo como la medida de la actividad de Gmd. La modesta tasa de fondo (no Gmd) se resto. Este metodo no distingue la actividad de Gmd de la actividad de lisozima.

Para medir la inhibicion de la actividad enzimatica de Gmd, se pretitulo la Gmd para determinar la concentration que producira una reduccion de aproximadamente un 50 % en A490 en 60 minutos. Despues, se anadieron 50 pl de anticuerpo diluido en PBST a cada pocillo de una placa de microtitulacion de 96 pocillos seguido de 50 pl de Gmd diluida apropiadamente, y se dejo que las mezclas se incubaran durante 5 o mas minutos, y finalmente se anadieron 100 pl de Micrococcus lysodeikticus al 0,15 % y se midio la A490 inicial. Despues, la placa se incubo a 37 °C y se midio el A490 a los 30 y 60 minutos. El porcentaje de inhibicion se calculo como 100*(1-(inhibidor A6oA49o/control sin inhibidor A60A490)).

En la figura 18, se evaluaron las diluciones en serie de cada uno de los cinco anticuerpos mas el control negativo apareado a isotipo MOPC21 para determinar su capacidad de inhibir la actividad catalitica de His-Gmd (Gmd) de S. aureus recombinante o lisozima de huevo de gallina (HEL). Cada uno de los cinco anticuerpos monoclonales anti- Gmd inhibio la actividad His-Gmd en un 75-80 %, mientras que no mostro actividad inhibidora con HEL. MOPC21 no tenia actividad inhibitoria con ninguna de las enzimas. El grado de inhibicion de His-Gmd no se ha observado que supere el 80 % por estos cinco anticuerpos. La inhibicion alta, aunque parcial, es una de las caracteristicas de este grupo de anticuerpos.

La capacidad de los cinco anticuerpos para inhibir la enzima Gmd nativa secretada por la cepa de S. aureus UAMS- 1 se representa en la figura 19. Como con la Gmd recombinante, la Gmd nativa se inhibio aproximadamente un 80 % por cada anticuerpo. Mediante la medida de la inhibicion enzimatica, los anticuerpos reaccionan de forma similar tanto con las Gmd nativas como con las recombinantes.

En las figuras 20C-D se muestra un analisis SEM de la actividad anti-Gmd para varios anticuerpos monoclonales. Xen29 S. aureus se cultivo durante 12 horas en caldo Luria-Bertani para conseguir una suspension de crecimiento

5

10

15

20

25

30

35

40

45

de semi-logaritmica y despues se incubaron con 10.000 UFC: (Figuras 20A-B) sin anticuerpo, (figura 20C) 50 |jg/ml de 1E12, o (figura 20D) 50 jg/ml de 1C11 durante 1 hora. Despues, las muestras se pusieron en placas de silicio esteriles, se fijaron, se deshidrataron y se revistieron con oro para su visualizacion mediante microscopia electronica de barrido. Las micrografias (figuras 20C-D) ilustran el efecto del anticuerpo anti-Gmd, promoviendo la formacion de grandes grupos y la lisis independiente de celulas (flechas) de aproximadamente el 20 % de las celulas.

Ejemplo 11 - La vacuna pasiva que contiene mAb anti-Gmd inhibe Staphylococcus aureus in vivo tras el implante ortopedico en modelo OM de raton

El modelo OM con clavo trans-tibial (veanse Ejemplos 1 y 6) se uso para evaluar la capacidad de los mAb candidatos 1C11 y 3A8 para inhibir el crecimiento de S. aureus in vivo. En resumen, ratones hembra de cinco semanas BALB/cJ recubrieron una inyeccion intraperitoneal de solucion salina (n = 10) o 1 mg de anticuerpo anti- Gmd 3A8 purificado (n = 5) en 0,25 ml de solucion salina o anticuerpo anti-Gmd A8 31C11 (n = 5) en 0,25 ml de solucion salina 3 dias antes de la cirugia. En la cirugia, los ratones recibieron un implante transtibial que contenia 500.000 UFC de Xen29 S. aureus. Los ratones se diagnosticaron por imagen para evaluar la bioluminiscencia los dias 0, 3, 5, 7, 10 u 11, y 14, y las imagenes con el mapa de calor de BLI de un animal representativo en cada grupo se muestran en las figuras 21A y 22A. Destaca la ausencia de una senal de BLI en el animal 3A8 anti-Gmd hasta el dia 11 y el animal 1C11 hasta el dia 5, presumiblemente cuando la valoracion de anticuerpo disminuyo por debajo de la concentracion eficaz. Los valores de BLI el dia 3 para cada raton en el estudio se muestran con la media para cada grupo (figura 21B, p = 0,02; figura 22B). Para 1C11, resulta interesante apreciar que esta terapia curo al 50 % de los animales el dia 3. Los rayos X de un animal representativo en cada grupo obtenido el dia 14 se muestran para ilustrar la lesion osteolitica (flecha) en el raton de placebo, que no estaba presente en los animales tratados con anti- Gmd (figuras 21C, 22C).

Ejemplo 12 - Generacion de anticuerpo humanizado

Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 1C11 se reamplificaron a partir del producto de PCR de hibridoma purificado descrito en el ejemplo 9 usando cebadores para permitir la clonacion en los vectores de expresion de anticuerpo humano descritos por Tiller et al. ("Efficient Generation of Monoclonal Antibodies from Single Human B Cells by Single Cell RT-PCR and Expression Vector Cloning", J. Immunol. Methods 329(1-2): 11224 (2008)). Los plasmidos que contenian las regiones variables de la cadena ligera y pesada 1C11 y las regiones constantes kappa e IgG 1 humanas se prepararon y se co-transfectaron en celulas HEK293. Despues de 3 dias, se retiro el medio de las celulas y se ensayo para determinar la presencia de IgG humana y para la union a la proteina Gmd inmovilizada mediante ELISA. El anticuerpo unido se detecto usando un anticuerpo de IgG anti-Humano de cabra acoplado a peroxidasa de rabano picante y sustrato de 3,3', 5, 5' tetrametilbenzideno.

Para establecer que el 1C11 humano:raton quimerico (h1C11) reacciono con Gmd, asi como el raton parental 1C11, cada uno se ensayo para determinar su capacidad para inhibir la actividad enzimatica de His-Gmd. Tanto h1C11 como 1C11 de raton mostraron una actividad inhibidora casi identica (figura 23), demostrando asi que la molecula de IgG quimerica retuvo la actividad de union del precursor.

Se realizara un procedimiento similar usando los homologos CDR1 y CDR2 humanos de 1C11 identificados en las figuras 17A-B, y una region CDR3 de una o mas regiones D candidatas incluyendo, sin limitacion, IGHD5-5, 18, y 12*01.

El anticuerpo 1C11 humanizado y el anticuerpo que comprende los homologos CDR1 y CDR2 humanos de 1C11 pueden utilizarse en un ensayo clinico de fase I en pacientes ancianos (>65 anos) sometidos a un reemplazo de articulacion total primario.

Claims (22)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

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   40

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   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo monoclonal o una porcion de union a antigeno del mismo que se une espedficamente a una glucosaminidasa de Staphylococcus aureus e inhibe el crecimiento in vivo de S. aureus, en donde el anticuerpo o la porcion de union a antigeno se unen a un epitopo completa o parcialmente dentro del dominio R3 de glucosaminidasa de Staphylococcus aureus.
2. 2. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union a antigeno de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el S. aureus es resistente a la meticilina.
3. 3. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union a antigeno de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo o la porcion de union a antigeno comprenden los dominios Vh y Vl seleccionados entre los siguientes pares de secuencias aminoacidicas:

   (i) qiqlvqsgpelkkpgetvkisckasgytfttygmswvnqapgkglkw mgwintysgvptyaddfk-

   GRFVFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYF CAREEYSSGYAAWFPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 5), y

   divltqspatlsvtpgdsvslscrasqsisnnlhwyqqkshesprlliey

   ASRSISGIPSRFSGGGSGTDFTLSINSVESEDFGLYFCQQSNSWPLTFGA GTKLELK (SEQ ID NO: 12); o

   (ii) evqlqesgpvlvkpgasvkmsckasgytftdyymnwvkqshgksle wigvinpyngdttysqkfkg- katltvdkssstaymelnsltsedsavy ycarnydeyfdvwgtgttvtvssakttppsvyplapg-

   SAAQTNSMVT LGCXVKG (SEQ ID NO: 1) donde X es cualquier aminoacido, y DIVMTQSPAIMSASPGEKVTMTC-

   sasssvsymywyqqkpgssprlliy dtsnlasgvpvrfsgsgsgtsysltisrmeaedaatyycqqwssy-

   PLT FG (SEQ ID NO: 8); o

   (iii) evqlqesgpvlvkpgasvklsckasgytftdyfmnwvkqshgksle wigvinpfnggnrynqnfkg- katltvdkssstaymelnsltsedsav yycargdydspwfdywgqgtlvtvsaakttppsvyplapg-

   SAAQTN SMVTLGCLVKGYSXSQ (SEQ ID NO: 2), donde X es cualquier aminoacido y

   qmtqttsslsaslgdrvtiscsasqgisnylnwyqqkpdgtvklliyy tsslhsgvpsrfsgggsgtdys-

   LSISNLEPEDIATYYCQQYSKLPWTFG GGTKLEIK (SEQ ID NO: 9); o

   (iv) evqlqesgggfvkpggslklscaasgftfstyvmswvrqtpekrlew vatisdggghtyyldnvk-

   GRFTISRDNAKNNLYLHMSHLKSEDTAMY YCARAYYGSSYDAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPG SAAQT NSMVTLGCLVKG (SEQ ID NO: 3), y

   divitqspaimsaslgervtmtctasssvsssylhwyqqkpgsspkxwi ystsnlasgvparfsgsgsgt-

   SYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPW TFGGGT (SEQ ID NO: 10), donde X es cualquier aminoacido; o

   (v) evqlqesggglvqpggsmklscaasgftfsdawmdwvrqspekgle wvaeikdktnnhatyyaesvk- grftisrdvsksrvflqmnslrpedt giyyctsgpyfdywgqgttltvssakttppsvyplapgsaaqtns-

   MVT LGCLVKGYFPE (SEQ ID NO: 4), y

   divmtqshkfmstsvgdrvsitckasqdvstavawyqqkpgqspklli ywtstrhtgvpdrftgsgs-

   GTDFTLTISSVQAKDLALYYCQQHYTTPY TFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 11).
4. 4. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union a antigeno de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo monoclonal o la porcion de union a antigeno promueve lisis independiente de las celulas de S. aureus.
5. 5. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union a antigeno de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo monoclonal o la porcion de union a antigeno inhibe la actividad de Gmd en aproximadamente el 70 a aproximadamente el 80 %.
6. 6. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union a antigeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo monoclonal esta humanizado.
7. 7. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union a antigeno de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la porcion de union a antigeno comprende un fragmento Fab, un fragmento Fv, un anticuerpo monocatenario, un dominio Vh o un dominio Vl.
8. 8. Una linea celular que expresa un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una porcion de union a antigeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, opcionalmente en donde la linea celular es un hibridoma.
9. 9. Una composicion farmaceutica que comprende un vehiculo y uno o mas anticuerpos monoclonales de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una o mas porciones de union a antigeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; opcionalmente en donde el vehiculo es una solucion acuosa.
10. 10. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 9 que comprende adicionalmente un agente antibiotico o un agente inmunoterapeutico,

    opcionalmente en la que el agente antibiotico se selecciona entre el grupo que consiste en vancomicina, tobramicina, cefazolina, eritromicina, clindamicina, rifampina, gentamicina, acido fusidico, minociclina, co-trimoxazol, clindamicina, linezolida, quinupristina-dalfopristina, daptomicina, tigeciclina, dalbavancina, telavancina, oritavancina,

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    ceftobiprol, ceftarolina, iclaprim y el carbapenem CS-023/RO-4908463, y opcionalmente en la que el agente inmunoterapeutico es tefibazumab.
11. 11. Una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, una porcion de union a antigeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composition farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 para su uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugia en donde la cirugia comprende introducir un implante ortopedico en un paciente que necesita un implante ortopedico y en donde el implante ortopedico esta revestido o tratado con el anticuerpo monoclonal, la porcion de union a antigeno o la composicion farmaceutica, antes, durante o inmediatamente despues del implante.
12. 12. Uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, una porcion de union a antigeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 en la preparation de un medicamento para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugia en donde la cirugia comprende introducir un implante ortopedico en un paciente que necesita un implante ortopedico y en donde el implante ortopedico esta revestido o tratado con el anticuerpo monoclonal, la porcion de union a antigeno o la composicion farmaceutica, antes, durante o inmediatamente despues del implante.
13. 13. El anticuerpo monoclonal, la porcion de union a antigeno o la composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 11, o el uso de acuerdo con la reivindicacion 12, en donde la administration del anticuerpo monoclonal, la porcion de union a antigeno o la composicion farmaceutica se repite antes de o despues de introducir el implante ortopedico; o en donde dicha administracion se realiza sistematicamente.
14. 14. El anticuerpo monoclonal, la porcion de union a antigeno o la composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 11 o la reivindicacion 13, o el uso de acuerdo con la reivindicacion 12 o la reivindicacion 13, en donde el anticuerpo monoclonal, la porcion de union a antigeno o la composicion farmaceutica se administran directamente a un sitio de implante.
15. 15. El anticuerpo monoclonal, la porcion de union a antigeno o la composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 11, o el uso de acuerdo con la reivindicacion 12, en donde el implante ortopedico es una protesis articular, un injerto o un implante sintetico,

    opcionalmente en donde la protesis articular es una protesis de rodilla, una protesis de cadera, una protesis de dedo, una protesis de codo, una protesis de hombro, una protesis temperomandibular o una protesis de tobillo, opcionalmente en donde el injerto o el implante sintetico son un disco intervertebral artificial, un implante de menisco, o un ligamento cruzado anterior sintetico o de aloinjerto, un ligamento colateral tibial, un ligamento colateral lateral, un ligamento cruzado posterior, un tendon de Aquiles o un manguito rotador.
16. 16. El anticuerpo monoclonal, la porcion de union a antigeno o la composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 11, o el uso de acuerdo con la reivindicacion 12, en donde el implante ortopedico es una protesis articular para una revision de reemplazo de articulation total, y en donde una protesis articular infectada se extrae del paciente y se trata el paciente para la infection antes de introducir dicho implante ortopedico en el paciente,

    opcionalmente en donde dicho tratamiento comprende administrar una cantidad eficaz de un agente antibiotico, un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, una porcion de union a antigeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, una composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 o una combination de los mismos, y

    opcionalmente en donde dicho uso es eficaz para impedir la infeccion o la reinfection durante la revision de un reemplazo de articulacion total.
17. 17. Una cantidad eficaz de anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, una porcion de union a antigeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 para su uso en el tratamiento de una infeccion por S. aureus en un paciente que tiene una infeccion por S. aureus.
18. 18. Una cantidad eficaz de anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, una porcion de union a antigeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 para su uso en el tratamiento de la osteomielitis en un paciente que tiene una infeccion osea o articular por S. aureus.
19. 19. Uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, una porcion de union a antigeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de una infeccion por S. aureus en un paciente que tiene una infeccion por S. aureus.
20. 20. Uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, una porcion de union a antigeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composition farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 en la preparation de un medicamento para el tratamiento de osteomielitis en un paciente que tiene una infection osea o articular por S.

    5 aureus.
21. 21. El anticuerpo monoclonal, la porcion de union a antigeno o la composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11, 17 o 18, o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12, 19 o 20, en donde un segundo agente terapeutico se administra al paciente, y en donde el

    10 segundo agente terapeutico es un agente antibiotico o un agente inmunoterapeutico,

    opcionalmente en donde el agente antibiotico se selecciona entre el grupo que consiste en vancomicina, tobramicina, cefazolina, eritromicina, clindamicina, rifampina, gentamicina, acido fusidico, minociclina, co-trimoxazol, clindamicina, linezolida, quinupristina-dalfopristina, daptomicina, tigeciclina, dalbavancina, telavancina, oritavancina, ceftobiprol, ceftarolina, iclaprim y el carbapenem CS-023/RO-4908463,

    15 opcionalmente en donde el agente inmunoterapeutico es tefibazumab.
22. 22. El anticuerpo monoclonal, la porcion de union a antigeno o la composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 o 13 a 18, o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 o 19 a 21, en donde el paciente es mayor de 50 anos o esta inmunodeprimido.

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