JP2013528356A - ヒト人工多能性幹細胞の選択方法 - Google Patents
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Abstract
Description
。
[1] 分化抵抗性が低減したヒト人工多能性幹(iPS)細胞を選択する方法であって、以下の工程を含む方法
(1)ヒトiPS細胞を分化誘導する工程、
(2)工程(1)の後に残存する未分化細胞を検出する工程、および
(3)工程(2)で検出された残存未分化細胞の値が、対照細胞の値と同等もしくはそれ以下であるヒトiPS細胞を選択する工程。
[2] 前記の分化誘導する工程が、ヒトiPS細胞をフィーダー細胞を用いないで培養する工程である、[1]に記載の方法。
[3] 前記の分化誘導する工程が、ヒトiPS細胞をN2B27培地を用いて培養する工程である、[2]に記載の方法。
[4] 前記の分化誘導する工程が、ヒトiPS細胞をN2B27培地を用いて5日間培養する工程である、[3]に記載の方法。
[5] 前記の残存未分化細胞の検出は、未分化維持条件で培養した後に形成されるコロニーの数を測定することによって行われる、[1]に記載の方法。
[6]工程(1)における分化誘導が神経細胞への誘導である、[1]に記載の方法。
[7]神経細胞への誘導が、ヒトiPS細胞を、無血清条件で胚様体を形成させながら培養することによって行われる、[6]に記載の方法。
[8]神経細胞への誘導が、ヒトiPS細胞を、BMP阻害剤とTGFβファミリー阻害剤を含む培地で培養することによって行われる、[7]に記載の方法。
[9] BMP阻害剤がDorsomorphinまたは LDN-193189であり、TGFβファミリー阻害剤がSB431542またはA-83-01である、[8]に記載の方法。
[10]対照細胞が、ヒト胚性幹細胞である、[1]に記載の方法。
[11]対照細胞が、分化抵抗性の低減が既知であるヒトiPS細胞である、[1]に記載の方法。
人工多能性幹 (iPS) 細胞は、ある特定の核初期化物質を、DNAまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007) Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007) Science, 318: 1917-1920; M. Nakagawa et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 101-106; 国際公開WO 2007/069666)。核初期化物質は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えば、Oct3/4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc, N-Myc, TERT, SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Lin28, Lin28b, Nanog, Sall1, Sall4, Glis1、Esrrb、Esrrg、Nr5a2 および Tbx3が例示される。これらの初期化物質は、iPS細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば、上記初期化物質を、少なくとも1つ、2つもしくは3つ含む組み合わせであり、好ましくは4つを含む組み合わせである。
遺伝子名 マウス ヒト
L-Myc NM_008506 NM_001033081
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
Glis1 NM_147221 NM_147193
Nr5a2 NM_030676 NM_205860
Tbx3 NM_011535 NM_005996
現阻害剤など]、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、p53阻害剤(例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA)(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling activator(例えばsoluble Wnt3a)(Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008))、LIF、SCFまたはbFGFなどの増殖因子、ALK5阻害剤(例えば、SB431542)(Nat Methods, 6: 805-8 (2009))、mitogen-activated protein kinase signalling阻害剤、glycogen synthase kinase-3阻害剤(PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))、miR-291-3p、miR-294、miR-295などのmiRNA (R.L. Judson et al., Nat. Biotech., 27:459-461 (2009))、等を使用することができる。
上皮細胞)、およびそれらの前駆細胞 (組織前駆細胞) 等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞 (体性幹細胞も含む) であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞)が挙げられる。
本発明において「分化誘導」とは、特定の臓器細胞やその前駆細胞への分化だけでなく、内胚葉細胞、中胚葉細胞および外胚葉細胞などの多種類の細胞を含む細胞群への分化も含む。また、本発明が対象とする臓器は、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに限定されない。この分化誘導方法は、当業者に周知の方法を用いることができ、特に限定されないが、例えば、神経幹細胞への分化誘導法としては、特開2002-291469、膵幹様細胞への分化誘導法としては、特開2004-121165、造血細胞への分化誘導法としては、特表2003-505006に記載される方法などがそれぞれ例示される。この他にも、胚様体の形成による分化誘導法としては、特表2003-523766に記載の方法などが例示される。
そのような特性を有するBMP阻害剤の例としては、転写因子SMAD1, SMAD5, または SMAD8を活性化することのできるBMP2, BMP4, BMP6またはBMP7を阻害する化合物が挙げられ、例えば、Dorsomorphin (すなわち、6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine) およびその誘導体が挙げられる (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116: II_60; P.B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4: 33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE (www. plozone. org), 3 (8): e2904)。Dorsomorphinは例えば、Sigma-Aldrichより購入することができる。 DorsomorphinはBMPのBMP受容体への結合を阻害することによって、上記のBMPシグナルを阻害する生物活性を有する。それらに加え、BMP I型受容体キナーゼ阻害剤の例はLDN-193189 (すなわち、4-(6-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline) およびその誘導体を含む (Yu PB et al. Nat Med, 14: 1363-9, 2008)。TGF-β ファミリー阻害剤の例はSB431542, SB202190 (R. K. Lindemann et al., Mol. Cancer 2: 20 (2003)), SB505124 (GlaxoSmithKline), NPC30345, SD093, SD908, SD208 (Scios), LY2109761, LY364947, LY580276 (Lilly Research Laboratories), および A-83-01(WO 2009146408)を含む。その中ではSB431542またはA-83-01が好ましい。ROCK阻害剤の例はY-27632 (Calbiochem; 水溶性) およびFasudil (HAl 077: Calbiochem)を含む。
分化誘導に用いるヒトiPS細胞の細胞密度は、特に限定されないが、1000000〜3000000個/
33.5mm-dish(6well-plate)であり、例えば、2500000個/33.5mm-dish、2000000個/33.5mm-dish、1500000個/33.5mm-dishまたは1000000個/33.5m m-dishである。好ましくは、2500000個/ 33.5mm-dish(6well-plate)である。分化培養期間は、特に限定されないが、2〜14日(例えば14日、12日、10日、8日、6日、4日、2日)が挙げられる。N2B27培地を用いる場合、好ましくは、5日である。
BMP阻害剤とTGF-βファミリー阻害剤を含む培地を用いる他の実施形態においては、分化培養期間は好ましくは約14日である。
続いて分化抵抗性を検出するために、上記のように分化させた細胞を再び、未分化維持条件で培養を行う。本発明における、未分化維持条件とは、ヒトiPS細胞が多能性を維持したまま増殖ができる条件であり、例えば、フィーダー細胞とともに細胞を培養する条件である。培地は、限定されないが、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ヌクレオシド、2−メルカプトエタノール等を加えた20%のKSRを含む最小必須培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI1640培地、199培地、F12培地もしくはこれらの組み合わせなどが挙げられる。この時、培地へは、適宜、LIF、SCFまたはbFGFや2i(mitogen-activated
protein kinase signallingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))などを加えてもよい。
未分化細胞を直接検出する場合は、この未分化維持条件で培養する工程は省略可能である。
上記のように分化誘導後、残存未分化細胞は、未分化細胞に特異的な性質を利用して検出することができる。この特異的な性質として、上述したような未分化維持条件での培養後のコロニーの形成、未分化特異的抗原の発現、未分化特異的遺伝子の発現などが挙げられる。ここで、未分化特異的抗原は、限定されないが、例えば、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60およびTRA1-81からなる群より選択される。また、未分化特異的遺伝子は、Oct3/4、Nanog、Rex1などWO2007/069666に挙げられる遺伝子が例示される。残存未分化細胞の検出は、未分化細胞の数と全細胞数を測定することによって行うことができる。より好ましくは、全細胞数に対する、未分化細胞数の割合をもって検出することができる。
る。未分化特異的遺伝子の発現は、特に限定されないが、例えば、PCR法、LAMP法、ノザンハイブリダイゼーション法などによって、転写産物(hnRNA、mRNAなど)を検出してもよく、RIA法、IRMA法、EIA法、ELISA法、LPIA法、CLIA法,あるいはイムノブロット法などによって、翻訳産物(ペプチド、修飾ペプチドなど)を検出してもよい。
(A)絶対的評価による選択方法
上記のように分化誘導後、未分化細胞は、コロニーの形成数、未分化特異的抗原陽性細胞数または未分化特異的遺伝子の発現している細胞数、もしくは一定の細胞数に対する未分化特異的抗原量または未分化特異的遺伝子の発現量として、評価されることが望ましい。
分化抵抗性が低減したヒトiPS細胞の選択に際しては、残存未分化細胞の値が、ES細胞を分化誘導後に未分化維持条件で培養したときの未分化細胞の値以下であるヒトiPS細胞を、分化抵抗性が低減したヒトiPS細胞として選択することができる。
細胞
ヒトES細胞(KhES1およびKhES3)は、京都大学再生医科学研究所(京都、日本)より受領し、従来の方法で培養した(Suemori H, et al. Biochem Biophys Res Commun. 345:926-32, 2006)。
ヒトES細胞、ヒトiPS細胞およびヒトES細胞由来のiPS細胞は、0.1 mg/ml collagenase IV (Invitrogen)、0.25% trypsin (Invitrogen)、0.1 mM CaCl2(ナカライテスク)および20% KSR (Invitrogen)を含有するPBSから成るCTK溶液およびAccutaseを用いて分離し、BDマトリゲル(BD)でコーティングした6−well plateへ2 x 106個/wellの密度で播種した。続いて、N2B27培地を用いて5日間接着培養を行った。ここで、N2B27培地は、Ying QL,
et al, Nature Biotechnology 21:183-186, 2003に記載の方法で作成した。
上記の方法で分化誘導された細胞は、CTK溶液を用いて分離し、SNL細胞上へ1.5 x 106個/10cm dishの密度で播種した。続いて、0.1mM 2-mercaptoethanol (Sigma)、non-essential amino acids (Invitrogen)、5ng/ml recombinant human basic FGF (Upstate)および20% KSR を含有するDMEM/F12から成るヒトES培地を用いて14日間接着培養した。以上の培養工程を図1に示す。
未分化条件培養後、クリスタルバイオレットで染色し(図2)、コロニー数を計測した。4因子法で作成したiPS細胞における計測結果を表2および図3aに示し、3因子法で作製したiPS細胞における計測結果を表3および図3bに示した。さらにiPS-KhES1-Fib-4Fの計測結果を表4および図3cに示した。
細胞
KhES-1, KhES-3 (Suemori H, et al. Biochem Biophys Res Commun. 345:926-32, 2006) およびH9 (Thomson,J.A.,et al.,Science 282:1145-1147,1998) をヒトES細胞として使用した。
(i) エピソーマルベクター(Okita K,et al. Nat Methods. 8:409-12, 2011)を用いて6因子(OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc、LIN28およびp53shRNA)を導入することにより、臍帯血に含まれるCD34陽性細胞(WO2010/131747)からCB-EP6Fの4クローンを調製した。
(ii) レトロウイルス(WO2010/1317477)を用いて4因子(OCT3/4、SOX2, KLF4およびc-MYC)を導入することにより、臍帯血に含まれるCD34陽性細胞からCB-RE4Fの3クローンを調製した。
(iii) センダイウイルス(Seki T, et al. Cell Stem Cell. 7:11-4, 2010)を用いて4因子(OCT3/4、SOX2, KLF4およびc-MYC)を導入することにより、臍帯血に含まれるCD34陽性細胞(WO2010/131747)からCB-SV4Fの5クローンを調製した。
(iv) エピソーマルベクター(Okita K,et al. Nat Methods. 8:409-12, 2011)を用いて6因子(OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc、LIN28およびp53shRNA)を導入することにより、歯髄幹細胞からDP-EP6Fの3クローンを調製した。
(v) エピソーマルベクター(Okita K,et al. Nat Methods. 8:409-12, 2011)を用いて6因子(OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc、LIN28およびp53shRNA)を導入することにより、皮膚線維芽細胞(Takahashi K, et al. Cell. 131:861-72, 2007)からFB-EP6Fの3クローンを調製した。
(vi) レトロウイルス(Nakagawa M, et al. Nat Biotechnol. 26:101-6, 2007)を用いて3因子(OCT3/4、SOX2およびKLF4)を導入することにより、皮膚線維芽細胞からFB-RV3Fの4クローンを調製した。
(vii) レトロウイルス(Takahashi K, et al. Cell. 131:861-72, 2007)を用いて4因子(OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYC)を導入することにより、皮膚線維芽細胞からFB-RV4Fの9クローンを調製した。
(viii) エピソーマルベクター(Okita K,et al. Nat Methods. 8:409-12, 2011)を用いて6因子(OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc、LIN28およびp53shRNA)を導入することにより、末梢血単核球細胞(PBMC)に含まれるT細胞(Seki T, et al. Cell Stem Cell. 7:11-4, 2010)からPM-EP6Fの4クローンを調製した。
(ix) センダイウイルス(Seki T, et al. Cell Stem Cell. 7:11-4, 2010)を用いて4因子(
OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYC)を導入することにより、末梢血単核球細胞(PBMC)に含まれるT細胞からPM-SV4Fの4クローンを調製した。
下記の工程を含む改変型SFEBq法にて、ヒトES細胞およびヒトiPS細胞を神経細胞に分化誘導した。
(i) ES細胞またはiPS細胞をY27632(WAKO)を含む培地で培養した;
(ii) フィーダー細胞を除くために、CTK 解離液 (0.25% Trypsin, 1 mg/ml Collagenase、KSR 20%および1 mM CaCl2) を培養皿に加え、全細胞をゼラチンコートされた皿に移した;
(iii) 残存するES細胞またはiPS細胞の塊はAccumax (Innovate cell technologies)を用いて解離させた;
(iv) 解離したES細胞またはiPS細胞をLIPIDURE-COAT PLATE (NOF Corporation)に移して胚様体を形成させ、分化培地(5% KSR(Invitrogen), 2mM L-glutamine(Invitrogen), MEM-non-essential amino acids solution(Invitrogen), 1μM 2-mercaptoethanol (2-ME), 10μM Y27632, 2μM Dorsomorphin (Sigma) および10μM SB431542 (Sigma)を含むDMEM/Ham's F12) を用いて3または4日間培養した;
(v) 3または4日ごとに、培地を半量ずつY27632、DorsomorphinおよびSB431542を含まない新しい分化培地に交換しながら、細胞培養を10または11日以上続けた。
得られた神経細胞を解離させ、Oct3/4抗体を用いて免疫染色した。次に、Oct3/4陽性細胞の含有率をフローサイトメトリーにて分析した。結果を表5および図4に示す。これらの結果から、ヒトiPS細胞の5クローン(CB-RV4F-2, DP-EP6F-1, FB-RV3F-3, FB-RV3F-4およびFB-RV4F-5) が分化抵抗性クローンとして選択できたことが分かった。一方、最大含有率1%以下の分化抵抗性の低い25クローンが存在した。
細胞
KhES-1, KhES-3 (Suemori H, et al. Biochem Biophys Res Commun. 345:926-32, 2006) およびH9 (Thomson,J.A.,et al.,Science 282:1145-1147,1998) をヒトES細胞として使用した。
改変SFEBq法において神経分化抵抗性を示したヒトiPSクローン (CB-RV4F-2, DP-EP6F-1, FB-RV3F-4およびFB-RV4F-5) をそれぞれ15クローン、15クローン、10クローン、12クローンにサブクローン化した(表6〜9)。
Claims (11)
- 分化抵抗性が低減したヒト人工多能性幹(iPS)細胞を選択する方法であって、以下の工程を含む方法
(1)ヒトiPS細胞を分化誘導する工程、
(2)工程(1)の後に残存する未分化細胞を検出する工程、および
(3)工程(2)で検出された残存未分化細胞の割合が、対照細胞における残存未分化細胞の割合と同等もしくはそれ以下であるヒトiPS細胞を選択する工程。 - 前記の分化誘導する工程が、ヒトiPS細胞をフィーダー細胞を用いないで培養する工程である、請求項1に記載の方法。
- 前記の分化誘導する工程が、ヒトiPS細胞をN2B27培地を用いて培養する工程である、請求項2に記載の方法。
- 前記の分化誘導する工程が、ヒトiPS細胞をN2B27培地を用いて5日間培養する工程である、請求項3に記載の方法。
- 前記の残存未分化細胞の検出は、未分化維持条件で培養した後に形成されるコロニーの数を測定することによって行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程(1)における分化誘導が神経細胞への誘導である、請求項1に記載の方法。
- 神経細胞への誘導が、ヒトiPS細胞を、無血清条件で胚様体を形成させながら培養することによって行われる、請求項6に記載の方法。
- 神経細胞への誘導が、ヒトiPS細胞を、BMP阻害剤とTGFβファミリー阻害剤を含む培地で培養することによって行われる、請求項7に記載の方法。
- BMP阻害剤がDorsomorphinまたは LDN-193189であり、TGFβファミリー阻害剤がSB431542またはA-83-01である、請求項8に記載の方法。
- 対照細胞が、ヒト胚性幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 対照細胞が、分化抵抗性の低減が既知であるヒトiPS細胞である、請求項1に記載の方法。
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