JP2013523778A

JP2013523778A - 治療用ｃｃｎ３ペプチドおよびそれらの類似体

Info

Publication number: JP2013523778A
Application number: JP2013502918A
Authority: JP
Inventors: ライザー，ブルース
Original assignee: ロザリンドフランクリンユニバーシティーオブメディスンアンドサイエンス
Priority date: 2010-04-02
Filing date: 2011-04-04
Publication date: 2013-06-17
Anticipated expiration: 2031-04-04
Also published as: WO2011123858A2; ES2561437T3; WO2011123858A3; JP5939584B2; US8518395B2; EP2552462A4; CN102947326A; EP2552462B1; DK2552462T3; EP2552462A2; US20110250180A1; CN102947326B

Abstract

本発明は、ＣＣＮｐ３７、ＣＣＮｐ３８（ヒト）、ＣＣＮＰ３８（マウス）、システイン置換ＣＣＮｐ３７、システイン置換ＣＣＮｐ３８（ヒト）またはシステイン置換ＣＣＮｐ３８（マウス）として同定されたアミノ酸配列を有する、それを必要とする患者を治療するためのＣＣＮ３模倣ペプチドを提供する。
【選択図】図１

Description

関連出願への相互参照
本願は、２０１０年４月２日に出願された米国特許仮出願第６１／３４１，６９４号の優先権を主張し、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれ、その一部を構成する。

連邦政府の支援による研究または開発
該当せず。

本発明は、線維症、創傷治癒および癌など（これらには限定されない）の、ＣＣＮ２の過剰発現に関連する疾患におけるＣＣＮ３の役割を開示する。さらに詳しくは、本発明は、抗線維化活性を促進し、それにより線維化およびまたは瘢痕の発達を阻止するのに使用するための、また、癌や、ＣＣＮ３およびＣＣＮ２が重要である他の疾患プロセスを治療するための、完全長ＣＣＮ３タンパク質の機能を目標に設計されたＣＣＮ３ペプチドおよびその類似体を開示する。単離され精製された、または合成されたＣＣＮ３ペプチド、および特定の類似体は、ＣＣＮ２、ＣＣＮ３および他のＣＣＮ関連タンパク質、ならびにコラーゲンおよび他の細胞外基質タンパク質の発現および／または活性を調節することにより、疾患の予防および／または治療に有用である可能性を有している。

ＣＣＮファミリーの遺伝子およびタンパク質
現在、ＣＣＮ遺伝子ファミリーは、細胞の増殖、付着、移動、胚形成、分化、創傷治癒、血管新生などの基本的な生物学的プロセス、ならびに線維化および腫瘍化などのいくつかの病理に関与するタンパク質をコードする、明らかに異なる６つのメンバーからなる。ＣＣＮ遺伝子ファミリーのメンバーによりコードされるタンパク質は、主に３０〜４０ｋＤａのタンパク質であり、システインに極めて富んでいる（１０質量％）（ＰｅｒｂａｌＢ．，ＮＯＶａｎｄｔｈｅＣＣＮｆａｍｉｌｙｏｆｇｅｎｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｓｕｅｓ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰａｔｈｏｌｏｇｙ５４：５７−７９，２００１）。最近になって、いくつかの形態のＣＣＮタンパク質（ＣＣＮ３を含む）が、３５〜５５ｋＤａの範囲にあることが報告されている。これらは、システインリッチ６１（ＣＹＲ−６１）タンパク質、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）タンパク質、腎芽腫過剰発現（ＮＯＶ）タンパク質、Ｗｎｔ誘導分泌タンパク質−１（ＷＩＳＰ−１）、Ｗｎｔ誘導分泌タンパク質−２（ＷＩＳＰ−２）およびＷｎｔ誘導分泌タンパク質−３（ＷＩＳＰ−３）と呼ばれている。最近、このファミリーの遺伝子とタンパク質に対する新たな命名法が提案されている（表１参照）。

図１に、ＣＣＮタンパク質のモジュール構造を、非常に単純化し、かつ線形化した形で示す。これらは、完全に保存されたマルチモジュール構成、すなわち、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＣ）、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ１）およびシステインノット（ＣＴ）を含有する増殖制御因子ファミリーと同一性を共有する４つのモジュールを有するものの、ＣＣＮタンパク質は、特有の生物学的特性を有し、制御も異なり、そして、アミノ酸配列を比較すると、互いに１００％完全な相同性は有さない。これらの関与は多数の器官系で示されている。多数の研究で注目されてきた１つの器官は、腎臓である。ＣＣＮタンパク質の基本的な作用機構は、未だ完全には理解されていない。独特の、特異性を有する、親和性が高いシグナル伝達受容体を同定する試みは困難であった。（ＢｒｉｇｓｔｏｃｋＤ．Ｒ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｆｕｎｃｔｉｏｎｂｙｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ．ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ３２７：１２５−１３０，２００３）。しかしながら、今では、それぞれが異なる活性または機能をおそらくは担っているであろう多くの潜在的シグナル受容体が暫定的に同定されている（Ｍａｓｏｎ，Ｒ．，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＣＣＮ２），ａｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆａｃｔｏｒｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ．Ｗｈａｔｄｏｅｓｉｔｄｏ？Ｈｏｗｄｏｅｓｉｔｄｏｉｔ？Ｊ．ＣｅｌｌＣｏｍｍｕｎ．Ｓｉｇｎａｌ３：９５−１０４，２００９）。

ＣＣＮ２遺伝子およびそれによりコードされるタンパク質
ＣＣＮファミリーの６つの全メンバーの中で、ＣＣＮ２が、骨格成長および胎盤の血管新生で重要なある種の細胞機能の調節において、また、線維症（腎線維症および糖尿病に伴う線維症など）、血管硬化症、アテローム性動脈硬化症、骨疾患、血管抵抗、腫瘍化および／または癌細胞の増殖を含むある種の疾患において、重要な役割を担っていることが明らかになってきた。

ＣＣＮ２は、今や、腎線維症を引き起こす要因であることがわかってきており、肝臓、肺、心臓、皮膚、血管系および腹膜で発生するものを含む（しかし、これらに限定されない）他の線維症においても、類似の方法で作用するものと考えられる（ＤｅａｎＲ．Ｇ．，ＢａｌｄｉｎｇＬ．，ＣａｎｄｉｄｏＲ．，ＢｕｒｎｓＷ．Ｃ．，ＣａｏＺ．，ＴｗｉｇｇＳ．Ｍ．，ＢｕｒｒｅｌｌＬ，Ｍ．Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａｎｄｃａｒｄｉａｃｆｉｂｒｏｓｉｓａｆｔｅｒｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．５３（１０）：１２４５−５６，２００５；Ｓｈｉ−ｗｅｎＸ．，ＰｅｎｎｉｎｇｔｏｎＤ．，ＨｏｌｍｅｓＡ．，ＬｅａｓｋＡ．，ＢｒａｄｈａｍＤ．，ＢｅａｕｃｈａｍｐＪ．Ｒ．，ＦｏｎｓｅｃａＣ．，ｄｕＢｏｉｓＲ．Ｍ．，ＭａｒｔｉｎＧ．Ｒ．，ＢｌａｃｋＣ．Ｍ．，ＡｂｒａｈａｍＤ．Ｊ．ＡｕｔｏｃｒｉｎｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＴＧＦｍａｉｎｔａｉｎｓｆｉｂｒｏｓｉｓ：ＲＤＡａｎａｌｙｓｉｓｏｆｆｉｂｒｏｓｉｓｇｅｎｅｓｉｎｓｙｓｔｅｍｉｃｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ．２５９（１）：２１３−２４，２０００；ＯｚａｋｉＳ．，ＳａｔｏＹ．，ＹａｓｏｓｈｉｍａＭ．，ＨａｒａｄａＫ．，ＮａｋａｎｕｍａＹ．Ｄｉｆｆｕｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｅｐａｒａｎｓｕｌｆａｔｅｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎａｎｄｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｉｎｆｉｂｒｏｕｓｓｅｐｔａｗｉｔｈｍａｎｙｍａｓｔｃｅｌｌｓｒｅｌａｔｅｔｏｕｎｒｅｓｏｌｖｉｎｇｈｅｐａｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓｏｆｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｈｅｐａｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓ．ＬｉｖｅｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．２５（４）：８１７−２８，２００５；ＳａｋａｍｏｔｏＮ．，ＳｕｇｉｍｕｒａＫ．，ＫａｗａｓｈｉｍａＨ．，ＴｓｕｃｈｉｄａＫ．，ＴａｋｅｍｏｔｏＹ．，ＮａｇａｎｕｍａＴ．，ＴａｔｓｕｍｉＳ．，ＮａｋａｔａｎｉＴ．ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓｏｎＴＧＦ−ｂｅｔａ１ａｎｄＣＴＧＦｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｎｈｕｍａｎｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ．１５（６）：９０７−１１，２００５；ＺａｒｒｉｎｋａｌａｍＫ．Ｈ．，ＳｔａｎｌｅｙＪ．Ｍ．，ＧｒａｙＪ．，ＯｌｉｖｅｒＮ．，ＦａｕｌｌＲ．Ｊ．Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａｎｄｉｔｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｃａｖｉｔｙｏｆｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｄｉａｌｙｓｉｓｐａｔｉｅｎｔｓ．ＫｉｄｎｅｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．６４（１）：３３１−８，２００３．）。例えば、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、高グルコース濃度、機械的ストレス、最終糖化産物（ＡＧＥ）によってアップレギュレートされたこのＣＣＮ２は、大量に発現すると、（とりわけ）細胞外基質（ＥＣＭ）分子（例えば、コラーゲンの形態およびトロンボスポンジン（ＴＳＰ））の過剰蓄積を引き起こし、また、ときに不適切に組織化されたそれらの分子を誘導する。このＥＣＭは、組織化されると、スペース分離細胞を形成し、膜、結合組織を含み、そして骨さえも含む。この異常なＥＣＭの産生／蓄積／組織化は、瘢痕の形成および線維症／硬化症をもたらす。

腎臓系に関する研究により、慢性腎疾患（ＣＫＤ）の多くのモデルで、線維症／硬化症の重要な病原因子としてのＣＣＮ２の役割に関する証拠が提供されている。初期の報告は、皮膚線維症および皮膚硬化症における、ＣＣＮ２とＴＧＦ−βとの相互作用的役割の可能性を示唆するものであった（ＢｒａｄｈａｍＤＭｅｔａｌ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ：ａｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈｍｉｔｏｇｅｎｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙｈｕｍａｎｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｉｓｒｅｌａｔｅｄｔｏＳＣＲ−ｉｎｄｕｃｅｄｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔＣＥＦ−１０．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，１１４：１２８５−１２９４，１９９１）。

腎臓の硬化または線維化の生成は、重症または慢性形態の障害に共通の応答である。慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）では、３つの有力な要因：代謝、遺伝子および血流力学があると考えられている。これらの因子は全て、相互に作用しあうことでき、特に糖尿病性腎障害（ＤＮ）において病状を進行させる。今では、ＣＣＮ２はこれら３つの要素の効果の中心的な下流メディエーターであると考えられている。例えば、糸球体内高血圧から生じる病理学的剪断力または伸長力は、ＣＣＮ２を含むサイトカインの産生を刺激するようである。この同じ力は、タンパク尿、ならびにアンジオテンシン（ＡＧ）ＩＩおよびエンドセリンなどの血管作用性ホルモンの産生の増加の両方をもたらす、血管透過性の増大を引き起こす原因となるようであり、これが、今度はまた、ＣＣＮ２を亢進させ、機械的な力を一層増加させる。ＤＮにおいてグルコース代謝の変化と共に引き起こされる最終糖化産物（ＡＧＥ）の異常蓄積は、細胞外基質（ＥＣＭ）の架橋および蓄積の両者を増加させることにも直接寄与し得るとともに、ＣＣＮ２の増加にも寄与し得る。個体の遺伝的背景は、血流力学および代謝の要素に影響を及ぼすことができ、次いで、説明したような経路が形成される。さらに、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性および血管作用性ホルモンの産生には、遺伝的影響があるようである。あらゆる場合に、ＣＣＮ２活性の慢性的アップレギュレーションは、ＥＣＭターンオーバーの変化およびＥＣＭ蓄積の増加をもたらしやすく、線維症または硬化症を引き起こす（ＣｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙＤｉａｂｅｔｅｓ：ＴｈｅＤｉａｂｅｔｉｃＫｉｄｎｅｙ，ＣＥＭｏｇｅｎｓｅｎ＆Ｐ．Ｃｏｒｔｅｓ（ｅｄｓ），ＨｕｍａｎａＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，Ｊｕｎｅ２００６，Ｒｉｓｅｒ，ＢＬｅｔａｌ．ＣＣＮ２（ＣＴＧＦ）ｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｎａｌｄｉｓｅａｓｅ：Ａｔａｒｇｅｔｆｏｒｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎの中に）。これらの知見は、ＣＣＮ２が硬化症の進行において中心的な下流の要素であり、そのため、診断および治療の両目的のために、妥当でかつ新規の標的を提供するという仮説を支持するものである。腎臓のＣＣＮ２の濃度および／または尿へ移動するそれは、測定することが可能であり、腎疾患および／または線維症の発症の予測、ならびに病期を知るために使用できることを示すヒトのデータからも、腎線維症におけるこの仮説が支持される。このことは、腎糸球体に存在するＣＣＮ２の濃度が、または尿に移行するその濃度でさえ、将来の発症を予測し、かつ腎疾患（線維症を含む）の病期を決定することを示す、多くの報告によって支持されてきている（ＫｉｄｎｅｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，６４：４５１−４５８，２００３．Ｒｉｓｅｒ，ＢＬｅｔａｌ，ＣＣＮ２（ＣＴＧＦ）：ａｓａｐｏｓｓｉｂｌｅｐｒｅｄｉｃｔｏｒｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ：Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｒｅｐｏｒｔ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，４７，１：３７−４２２００９，ＦＫＴａｍ，ｅｔａｌ，Ｕｒｉｎａｒｙｍｏｎｏｃｙｔｅｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＭＣＰ−１）ａｎｄｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＣＣＮ２）ａｓｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）

ＣＣＮ２はエストロゲン誘導性であり、ステロイド依存性の乳腺または子宮の腫瘍で過剰発現する（Ｔｓａｉｅｔａｌ．，ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＣＹＲ６１，ａｎａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｆａｃｔｏｒ，ｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓａｎｄｔｕｍｏｒｂｉｏｐｓｉｅｓ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ６０：５６０２−５６０７，２０００；Ｔｓａｉｅｔａｌ．，ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＣｙｒ６１ｉｎｈｕｍａｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２１：９６４−９７４，２０００；Ｓａｍｐａｔｈｅｔａｌ．Ｃｙｒ６１，ａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅＣＣＮｆａｍｉｌｙ，ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒＭＣＦ−７ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｂｙ１７ｂｅｔａ−ｅｓｔｒａｄｉｏｌａｎｄｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４２：２５４０−２５４８，２００１；Ｓａｍｐａｔｈｅｔａｌ．，ＡｂｅｒｒａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣｙｒ６１，ａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅＣＣＮｆａｍｉｌｙ（ｉ．ｅ．ＣＣＮ１），ａｎｄｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｂｙ１７ｂｅｔａ−ｅｓｔｒａｄｉｏｌａｎｄｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｉｎｈｕｍａｎｕｔｅｒｉｎｅｌｅｉｏｍｙｏｍａｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８６：１７０７−１７１５，２００１；Ｓａｍｐａｔｈｅｔａｌ，ＴｈｅａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｆａｃｔｏｒＣｙｒ６１ｉｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｐｒｏｇｅｓｔｉｎＲ５０２０ａｎｄｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｆｏｒｍａｍｍａｒｙａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｒｍａｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ，１８：１４７−１５０，２００２；Ｘｉｅｅｔａｌ．，Ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ，Ｃｙｒ６１ｉｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ，ａｎｄａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｍｏｒｅａｄｖａｎｃｅｄｄｉｓｅａｓｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７６：１４１８７−１４１９４，２００１；Ｘｉｅｅｔａｌ．，Ｅｌｅｖａｔｅｄｌｅｖｅｌｓｏｆｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＷＩＳＰ−１，ａｎｄＣＹＲ６１ｉｎｐｒｉｍａｒｙｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｍｏｒｅａｄｖａｎｃｅｄｆｅａｔｕｒｅｓ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，６１：８９１７−８９２３，２００２）。ＣＣＮ２および他のＣＣＮファミリーのメンバーは、エストロゲンおよびプロゲステロン調節細胞増殖の重要な下流メディエーターである。ＣＣＮ２および他のＣＣＮタンパク質はまた、乳癌細胞の他の増殖調節経路に影響を及ぼし得る。尿ＣＣＮ２はエストロゲンおよびプロゲステロンの両者によって調節され、間質性のＥＣＭの維持または再構築に重要であると考えられる（Ｒａｇｅｈｅｔａｌ．，Ｓｔｅｒｏｉｄａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＣＣＮ２；ＣＴＧＦ）ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｔｈｅｍｏｕｓｅｕｔｅｒｕｓ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰａｔｈｏｌｏｇｙ，５６：８０−８５，２００１；Ｃｈｅｏｎｅｔａｌ．，Ａｇｅｎｏｍｉｃａｐｐｒｏａｃｈｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｎｏｖｅｌｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｅｄｐａｔｈｗａｙｓｉｎｔｈｅｕｔｅｒｕｓｄｕｒｉｎｇｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１６：２８５３−２８７１，２００２）。卵巣では、ＣＣＮ２はゴナドトロピンまたは形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）により調節され、包膜細胞の漸加および有糸分裂、ならびに黄体の維持に関係する（Ｗａｎｄｊｉｅｔａｌ．，ＭｅｓｓｅｎｇｅｒｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｆｏｒＭＡＣ２５ａｎｄｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＣＴＧＦ）ａｒｅｉｎｖｅｒｓｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｄｄｕｒｉｎｇｆｏｌｌｉｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｅａｒｌｙｌｕｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＫｉｄｎｅｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，６０：９６−１０５，２０００；Ｓｌｅｅｅｔａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａｎｄｌｙｓｙｌｏｘｉｄａｓｅｍｅｓｓｅｎｇｅｒｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｉｎｒａｔｇｒａｎｕｌｏｓｅｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４２：１０８２−１０８９，２００１；Ｈａｒｌｏｗ＆Ｈｉｌｌａｒ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｉｎｔｈｅｏｖａｒｉａｎｐａｒａｃｒｉｎｅｓｙｓｔｅｍ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１８７：２３−２７，２００２；Ｈａｒｌｏｗｅｔａｌ．，ＦＳＨａｎｄＴＧＦ−ｂｅｔａｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓｒｅｇｕｌａｔｅｇｒａｎｕｌｏｓｅｃｅｌｌｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４３：３３１６−３３２５，２００２；Ｌｉｕｅｔａｌ．，Ｇｏｎｏｄｏｔｒｏｐｈｉｎｓｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ−２ｍＲＮＡｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｈｕｍａｎｇｒａｎｕｌｏｓｅ−ｌｕｔｅａｌｃｅｌｌｓ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＨｕｍａｎＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，８：１３６−１４１；２００２）。

ＲｉｓｅｒおよびＤｅＮｉｃｈｉｌｏの米国特許第７．７８０，９４９号明細書には、細胞外基質（ＥＣＭ）を産生する際のＣＣＮ２の役割とともに、サンプル中のＣＣＮ２濃度を測定することによって、ＥＣＭ成分の蓄積を特徴とする病態の存在および進行を診断する方法が開示されている。この方法は腎線維症、および関連する腎疾患、特に糖尿病、高血糖症および高血圧症と関連する合併症の診断を目指したものである。

ＣＣＮ３遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質
ＣＣＮ３はＣＣＮファミリーの他のメンバーである。ＣＣＮ３は各種の形態で存在することが報告されている。レトロウイルスコンピテントなオビアン（ｏｖｉａｎ）組換え体を構築する研究で、ＣＣＮ３タンパク質が、約５０ｋＤａの分子量を有する完全長タンパク質か、または完全長タンパク質のフラグメントである、より小さい切断タンパク質として発現し得ることが示されている（ＰｅｒｂａｌＢ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ：ＭｏｌＰａｔｈｏｌ．５４：５７−７９，２００１）。他の形態のＣＣＮ３タンパク質も報告されている。例えば、ＣＣＮ３関連タンパク質が、ＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ細胞の核膜で検出されており、他のＣＣＮ３関連タンパク質は、ヒトプラスミノーゲン活性化抑制因子２型（ＰＡＩ−２）のプロモーターと結合する（ＰｅｒｂａｌＢ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ：ＭｏｌＰａｔｈｏｌ．５４：５７−７９，２００１）。ＣＣＮ３のＣ末端１９アミノ酸ペプチドに対するＫ１９Ｍ−ＡＦ抗体は、ネイティブなＣＣＮ３タンパク質が少なくとも２つの立体構造を有することを明らかにした（ＫｙｕｒｋｃｈｉｅｖＳ．ｅｔａｌ．，ＰｏｔｅｎｔｉａｌｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＣＣＮ３（ＮＯＶ）ｐｒｏｔｅｉｎ．ＣｅｌｌｕｌａｒＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎａｎｄＳｉｇｎａｌｉｎｇ，２：９−１８，２００４）。細胞質膜および細胞膜に結合したＣＣＮ３は、露出Ｃ末端を有するが、分泌したＣＣＮ３は、他のタンパク質またはそれ自身との相互作用（二量体化）に起因したであろう封鎖されたＣ末端を有する。

ヒトを含む様々の種由来の完全長ＣＣＮ３タンパク質のアミノ酸配列は、完全にキャラクタライズされており、Ｌｉらによって開示されている（Ｌｉ，Ｃ．Ｌ．ｅｔａｌ．，ＡｒｏｌｅｆｏｒＣＣＮ３（ＮＯＶ）ｉｎｃａｌｃｉｕｍｓｉｇｎａｌｉｎｇ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＰａｔｈｏｌｏｇｙ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰａｔｈｏｌｏｇｙ，５５：２５０−２６１，２００２）。１つの完全長ＣＣＮ３タンパク質は約３５７のアミノ酸を有する。

Ｒｉｓｅｒによる米国特許第７，７８０，９４９号明細書には、完全長ＣＣＮ３分子が、腎線維症の生体外モデルにおいて、ＣＣＮ２の線維化促進活性を自身の能力によって少なくとも部分的にダウンレギュレートさせることにより、線維化を阻止することが開示されている。それ以前は、ＣＣＮ３が、正または負の因子として、線維化または創傷治癒／瘢痕形成に活性を有していることは知られておらず、ＣＣＮ２に対して調節作用を有することも知られていなかった。米国特許第７，７８０，９４９号明細書には、完全長ＣＣＮ３タンパク質が、ＣＣＮ２の産生および作用を阻害し、したがって、多くの器官で線維化の特徴である細胞外基質の過剰産生を抑制できることが示されている。上記特許出願にも、他の特許または刊行物にも、ＣＣＮ３全体のより小さい部分、すなわちペプチドがこの活性を有するか否かについては開示されていない。線維化は種々の傷害によって開始されるが、一旦開始されれば、要因としてＴＧＦ−ベータおよびＣＣＮ２の一方または両方が常に明白に関与する共通の経路を辿ることは、今では理解されている。したがって、ＣＣＮ３が、腎細胞および腎疾患における、線維化、およびＥＣＭ、例えばコラーゲンの異常な生成／蓄積を予防およびまたは治療するために使用され得ることが示されたのであるから、他の器官のそうした疾患、および異なる刺激または傷害から始まった疾患に対してさえ、それが有用であろうと妥当性をもって仮定することができる。米国特許第７，７８０，９４９号明細書には、腎疾患の診断および予後のためのＣＣＮ３濃度の測定についてもさらに開示されている。

本発明は、同じか、またはより良好な抗ＣＣＮ２活性および抗線維化活性を得るために、完全長ＣＣＮ３の代替としての、新たに記述され、新たに生成された、特定の有効なＣＣＮ３由来のペプチドを単離し、また、新規な製造および送達上の利点を創出しようとするものである。本発明の好ましい形態では、驚いたことに、１４個のアミノ酸を有する比較的少数のペプチド（ＣＣＮｐ３７、ＣＣＮｐ３８（ヒトおよびマウス）およびこれらのペプチドのシステイン置換体）が、細胞外基質タンパク質の過剰蓄積、ターンオーバーの調節異常、または組成の変化に関連する病態の治療に有効であることがわかった。これらの短いペプチドは、完全長ＣＣＮ３タンパク質と比べてはるかに小さく、より簡単に合成し製剤化して、それを必要とする患者に送達できるであろう。以下の図面および添付の明細を参照しながら、本発明のこれらおよび他の態様および属性について説明する。

図１は、ＣＣＮタンパク質の一般的なマルチモジュール構造を非常に単純化して示す。ＣＴ、増殖調節因子様ドメインのシステインノット含有ファミリー；ＩＧＦＢＰ、インスリン様増殖因子結合タンパク質様ドメイン；ＴＳＰ１、トロンボスポンジン様ドメイン；およびＶＷＣ、フォン・ウィルブランド因子様ドメイン。図２は、ペプチドの設計に使用されたマウスのＣＣＮ３の公開されている配列（上の配列）と、天然には存在しない、システインをセリンで置換した我々の修飾配列（下の配列）を示す。図３は、その後、活性試験用の小さいペプチドを生成するために使用した特定のＣＣＮ３配列を示す。図４は、ヒトＣＣＮ（ｈＣＣＮ）の全体構造および配列アライメントを示すもので、コンピュータがそれらをアライメントしたままのｈＣＣＮ２とｈＣＣＮ３を示しており、ＩＧＦ−ＢＤ、ＶＷＦ、ＴＳＰおよびｃ−末端繰り返し成分を含む、説明した４つのモジュールの概略図が、図の上部に示されている。図の下部には、２つの分子（ｈＣＣＮ２およびｈＣＣＮ３）の配列アライメント（星印が付されている）が、ここではシステインが未変化の状態で示されている。図５は、マウスＣＣＮ３配列上において、合成したＣＣＮペプチド（ＣＣＮｐ）の位置を示すもので、ｎ−末端を起点としてｃ−末端に至る３５個の構築されたオーバーラップ配列（ＣＣＮｐ１−３５）が黒字で、また５個の特別に設計されたペプチドＣＣＮｐ３６−４０が太字で示されている（ここではまた全てで、システインがセリンで置換されている）。図６は、分子内の位置と、ＣＣＮ２との配列相同性に基づき狙いを定めた、ペプチド設計のために選択したＣＣＮ３配列を示す。最終的には、システインの電荷によって起こり得る環状構造の形成を避けるため、したがって、我々が求めている正常な、または目標とする機能の喪失を避けるため、システインをセリンで置換した。しかしながら、我々はまた、この変更によって求めている機能が完全に喪失することになるか否かもわからなかった。これらのペプチドは同時にヒトとマウスの間のそれらの高い相同性からも選択されたため、マウスモデルで試験され、有効であることが示された任意の配列は、ヒトにおいても同じレベルの効果があると考えられるであろう。図７Ａは、システイン残基をセリン残基で置換して合成され、試験された特定のＣＣＮ３ｐ３７およびＣＣＮ３ｐ３８ペプチドを示す。図７Ｂは、ＣＣＮ３ｐ３７およびＣＣＮ３ｐ３８が誘導されたマウスとヒトの天然の配列間の相同性の程度を示す比較である。ＣＣＮｐ３７はヒトとマウスで同じである。ＣＣＮ３ｐ３８ペプチドは、ヒトとマウスで１個のアミノ酸のみが異なる。図７Ｃは、天然のヒトのＣＣＮ２配列とＣＣＮ３配列の、ＣＣＮ３ｐ３７およびＣＣＮ３ｐ３８が選択された領域における比較を示す。選択されたＣＣＮｐ３７配列では、ＣＣＮ２およびＣＣＮ３はともに、領域のこれらの配列にわたって異常に高い相同性を有しており、１４個の中で１個のアミノ酸のみが異なっている。これとは極めて対照的に、選択されたＣＣＮ３ｐ３８配列では、ＣＣＮ２およびＣＣＮ３は異常に低いアミノ酸相同性を有しており、１４個のアミノ酸のうち４個のみが同じである。図７Ｄは、天然のマウスのＣＣＮ２配列とＣＣＮ３配列の、ＣＣＮ３ｐ３７およびＣＣＮ３ｐ３８領域での比較を示す。ＣＣＮ３ｐ３７では、ヒトとマウスで違いがないため、上の７Ｃに示されたものと違いがない。ＣＣＮ３ｐ３８では、天然の配列においてＣＣＮ２の配列に合致するのは、１４個のアミノ酸のうちの４個である。図８は、ＣＣＮ３ｐ３７およびＣＣＮ３ｐ３８がＴＧＦ−βによるコラーゲンプロモータの活性化を低下させることを示す。ペプチド３８（上）は、５００ｎｇ／ｍＬでコラーゲンプロモータの活性を抑制することができた。ペプチド３７は、ＴＧＦ−βの直前に添加すると、ＴＧＦ−βにより活性化されるコラーゲンプロモータの活性を全面的に遮断する能力を示した（下の図の右３本の棒グラフ）。この抑制作用は、ＴＧＦ−βの２４時間前に添加した時でさえも認められた（より低いレベルではあったが）。その他の調製し試験した３８個のペプチドは、この試験では活性を示さず、したがってそのデータは示していない。上の図のＹ軸は、下の図でも示されているように、コントロールの形質移入効率を基準にした（ＣＭＶプロモータ活性）、コラーゲンプロモータの活性レベル（任意の単位）である。図９は、ＣＣＮ３ｐ３７およびＣＣＮ３ｐ３８がＣＣＮ２コーティングプレートへの細胞の接着を用量に応じて遮断することを示す。コントロールプレートは単なるプラスチック（無コーティング）のプレートへの糸球体間質細胞の接着を示す。左から２番目の棒グラフ「ＣＴＧＦ」、すなわちＣＣＮ２は、無コーティングのプラスチック上で起こったこととは反対に、ＣＣＮ２コーティングプレートに結合した受容体によって仲介された接着が顕著に増加したことを示している。ＴＧＦ−β処理の直前に加えた完全長ヒトＣＣＮ３（ＮＯＶ）（２７ｎＭ）は、予想されたように、この結合に対していくらかの抑制を示した。しかしながら、ＣＣＮｐ３７およびＣＣＮｐ３８ペプチドは、ＣＣＮ２へと仲介される受容体結合を用量に応じて遮断し、試験した最高濃度（５００ｎＭ）で約６０％〜７０％の抑制を示した。このことは、２つのペプチドが結合部位で相互作用し得ることを示すものである。試験した他の３８個のペプチドは（紙面を考慮して、ここではそのうちのｐ３５、ｐ３６、ｐ３７およびｐ４０のみを示した）、いずれも結合を十分に遮断できなかった。この試験でＣＣＮｐ３７およびＣＣＮｐ３８ペプチドが示した特異的な活性が、ＣＣＮ２に結合し、かつある種の特異的活性に必要であろう細胞上の受容体を遮断する能力であることを示している。図１０Ａは、ＣＣＮ２の免疫局在性（タンパク質特異性抗体との反応性）およびＣＣＮ３ｐ３７ペプチドの抑制効果を示す。ここで示しているのは、ＴＧＦ−β処理によって、既に作られ細胞膜に局在化しているＣＣＮ２（暗い赤茶色）の劇的な損失（分泌）がもたらされるが、この時点で細胞質に認められる新たなＣＣＮ２（明るい赤茶色）の合成も開始されていることである。これと並行して、線維症に見られる特徴である、より延伸され角ばった線維芽タイプの細胞への表現型の変化が起きている。５０ｎＭのＣＣＮ３ｐ３７で処理すると、この表現型の転移が遮断され、ＣＣＮ２の排除および新しいＣＣＮ２の新規な合成が大幅に減少する。図１０Ｂは、ＣＣＮ２の免疫局在性およびＣＣＮｐ３８ペプチドの抑制効果を示す。未処理のコントロール細胞は、細胞境界に広範囲に存在するＣＣＮ２（茶色）を示している。ＴＧＦ−βによる処理は、細胞膜におけるＣＣＮ２の劇的な損失（分泌）と、この時点で細胞質内全体に認められる新たな合成の開始をもたらす。これと並行して、表現型が、線維症に特徴的な線維芽タイプの細胞と見られるものへと変化する。ＣＣＮ３ｐ３８による処理は、この表現型の転移、ＣＣＮ２の排除、およびＣＣＮ２の新たな合成を遮断する。低濃度では用量応答効果が現れ、最適な効果は５０ｎＭであるようである。他のペプチドはこの効果を示さなかった（図示せず）。図１１Ａは、コラーゲンＩの免疫局在性とＣＣＮｐ３７ペプチドの抑制効果を示す。ＴＧＦ−β（コラーゲン蓄積および線維化の強力な刺激物質）による処理は、細胞膜における大量のコラーゲンＩの劇的な損失または分泌（コントロールの枠内に茶色または赤茶色で示す）、および（ＴＧＦ処理された）細胞質内全体に認められるいくらかの新たな合成の開始をもたらす。これと並行して、表現型は、線維症に特徴的な、細長く立方体様の程度がより低い線維芽タイプの細胞と見られるものへと変化する。０．５ｎＭの低濃度ＣＣＮｐ３７による処理は、この表現型の転移、ＣＣＮ２の排除、およびＣＣＮ２の新たな合成を遮断する。より高い用量は、同じかまたは類似の効果を示す。他のペプチドはこの効果を示さなかった（図示せず）。図１１ｂは、コラーゲンＩの免疫局在性およびＣＣＮｐ３８ペプチドの抑制効果を示す。ＴＧＦ−β（線維化促進剤として知られている）による処理は、細胞膜における大量のコラーゲンＩの劇的な損失（分泌）（コントロールの枠内に示す）、および（ＴＧＦ処理された）細胞質内全体に認められるいくらかの新たな合成の開始をもたらす。これと並行して、表現型は、細長く立方体様の程度がより低い線維芽タイプの細胞と見られるものへと変化する。０．５ｎＭの低濃度ＣＣＮ３ｐ３８による処理では、殆ど効果がない。しかしながら、５〜５０ｎＭの用量では、ＴＧＦ−βに応答して生じる表現型の転移、いくらかの既存コラーゲンの排除、および新たなコラーゲンの合成を遮断する。他のペプチドはこの効果を示さなかった（図示せず）。図１２は、ヒト慢性骨髄性白血病の未処理細胞（コントロール）の細胞増殖棒グラフを示し、また、一定量の市販の組み換えＣＣＮ３（ｒＣＣＮ３ｃ）、我々の研究所で調製した完全長ＣＣＮ３タンパク質、ｒＣＣＮ３８、ｒＣＣＮ３９、ｒＣＣＮ３１０、ｒＣＣＮ３１１またはＣＣＮ３ｐ３７もしくはＣＣＮ３ｐ３８とともに事前にインキュベートしたものと比較したものである。ＣＭＬ細胞を増殖させ、その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙにより、コントロールの未処理細胞、または細胞の増殖を測定した。後者は、代謝的に活性な細胞の尺度であるＡＴＰ存在量の定量に基づき、培養物中の生存細胞の数を測定する均質的方法である。商業的に製造された完全長ＣＣＮ３では、試験期間中に増殖および／または生存率が約３５％減少した。ＣＣＮ３ｐ３７では１５〜２０％抑制され、ＣＣＮ３ｐ３８では約４０％抑制された。

本発明では、多くの様々な形態の実施形態を採り得るが、それらの中の特定の実施形態が図示され、本明細書で詳細に説明されるであろう。それは、本開示が本発明の原理を例示するものと考えられるべきであって、説明された特定の実施形態に本発明を限定することを意図するものではないという理解のもとに行われるものである。

ＣＣＮ３ペプチドの選択
本発明は、線維症、創傷治癒および癌細胞／腫瘍の増殖に繋がり得る、ヒト患者の細胞外基質分子の過剰蓄積、ターンオーバーの調節不全または組成変化に関連する疾患における、ＣＣＮ３由来ペプチドの役割を開示する。本発明のある種のＣＣＮ３ペプチドは、完全長ＣＣＮ３タンパク質の代替として、同等またはそれを超える抗線維化活性を達成するために使用することができる。本開示で使用する用語「線維化」は、用語「硬化」および瘢痕形成と同義に使用されるが、それは、それらが、線維性または線維症様組織の過成長、ならびに／またはコラーゲンなどの細胞外基質分子の異常な沈着の増加および／もしくは集合／組織と関係する類似のプロセスであって、それらの全てが少なくとも１つの原因因子としてＣＣＮ２を有することが明らかとなっているからである。

ＣＣＮ３ペプチドを単離するために、一連の３６個の短いオーバーラップするペプチド配列（ＣＣＮ３のｎ−末端領域から始まり、その領域で定義され、ｃ−末端までを対象とする）を作成した。本明細書では、短いオーバーラップ配列を、サイズが約１０〜１８個のアミノ酸、より好ましくは１２〜１７個のアミノ酸、より一層好ましくは１３〜１５個のアミノ酸、最も好ましくは１４個のアミノ酸の範囲（または、それらの中の任意の範囲、もしくは範囲の組み合わせ）であって、完全長タンパク質配列上で互いに約３〜７個のアミノ酸がオーバーラップした配列と定義する。線維化活性を検証するために線維症マウスモデルが使用されたので、マウスＣＣＮ３配列が使用された。当該技術分野でよく知られているように、ヒトＣＣＮ３はマウスと強い相同性を有している。実際、ＣＣＮ３ｐ３７ペプチドで選択した領域のマウスの配列とヒトの配列は同一であり、ＣＣＮ３ｐ３８については、ヒトとマウスでは１つのアミノ酸が異なるのみである。図２に、公開されているマウスＣＣＮ３配列と、ペプチドの環状化および活性の損失を強力に防止するために、セリン残基によって置換されたシステイン残基の位置を示す。負の側面では、この置換は、特に、ＣＣＮ３が「システインリッチの分子」として知られ、したがってその知られている機能はシステインの存在に依存している可能性があることから、ＣＣＮ３に帰する全ての生物学的活性を除去してしまう可能性もあり得る。我々の研究以前に、この変更の影響を予測することは不可能であろう。セリン修飾ペプチド配列を、ＣＣＮ３ペプチド配列の類似体またはセリン類似体と称することがあろう。図３に、合成し、試験したオーバーラップペプチドの配列を示す（ペプチド１〜３５）。

ＣＣＮ２およびＣＣＮ３は同じファミリーのメンバーであっても、明らかに異なる生物学的機能を有する（コラーゲンに対する作用では、反対の活性が見られた）ので、このことは、観察されたＣＣＮ２の遮断活性（そして、後にはコラーゲンの生成）の少なくとも１つのメカニズムが、受容体の競合によるものであり得ることを我々に示唆するものであった。すなわち、ＣＣＮ３はＣＣＮ２受容体と相互に作用し合うことができ、ＣＣＮ２が仲介するシグナル伝達を阻止し得るのであろう。ＣＣＮ３はＣＣＮ２受容体に認識される配列を有し、結合すれば、基質の生成または蓄積を増大させる信号を送らせない、すなわち、自然の競合物として振る舞い得るのであろう。しかしながら、ＣＣＮ３がまたＣＣＮ２の合成を強く抑制することも我々は見出しており、その活性が受容体の遮断によるものではなく、ＣＣＮ２産生の抑制によるものであるという可能性も依然残されているため、このことは明確ではない。それにもかかわらず、ヒトの配列から始めた図４に示すように、コンピュータの計算によって「最もよく合う」アライメントを作成後、２つのタンパク質、ＣＣＮ３およびＣＣＮ２のアミノ酸配列（構造）における類似性と相違性を調べた。上で仮定した理由により、非常に高い相補性を有するアミノ酸配列の４つの領域（すなわち、ＣＣＮ２とＣＣＮ３間で）を、ＴＳＰ様成分（ＣＣＮ３ｐ３９、ＣＣＮ３ｐ４０およびＣＣＮ３ｐ３６と称する）およびＣ末端モジュール（ＣＣＮ３ｐ３７と称する）の両方から選択した（図４および５）。また、ＣＣＮｐ３８と称する、ＣＣＮ３のインスリン様増殖因子結合ドメイン内の１つの領域も選択したが、そこでは、ＣＣＮ３とＣＣＮ２が比較的広い範囲にわたって異常に低い相補性（１０％）を有することが観察された（図４および５に示す）。発見されたこの独特の相違が、ＣＣＮ２とＣＣＮ３の作用の違いの原因であり得るとすることは可能であった。全てのペプチド配列、すなわち、ＣＣＮ３ｐ３９、ＣＣＮ３ｐ４０、ＣＣＮ３ｐ３６、ＣＣＮ３ｐ３７およびＣＣＮ３ｐ３８は、システイン残基をセリン残基で置換してさらに変化させた。したがって、そのようなセリン修飾ペプチド配列はＣＣＮ３ペプチド配列の類似体であり、我々が完全長タンパク質で観察したのと類似の抗線維化活性を多分に有するものと考えられる。システイン残基はまた、アラニン、グリシン、Ｓ−メチル化システイン、またはこれらの組み合わせ（セリンを含む）で置換できるとも考えられる。

本発明は、ＣＣＮ３ペプチド配列と、発見したそれらの類似体が、完全長タンパク質と比べて、同一であるか、類似であるか、またはより大きいＣＣＮ２抑制活性を有することを考慮している。後で詳しく説明するが、驚いたことに我々は、ＣＣＮ３ｐ３７とＣＣＮ３ｐ３８の２つの小さなペプチドが顕著なＣＣＮ２抑制活性を示す一方で、スクリーニングした３８種の別のペプチドは、ＣＣＮ２発現の抑制に有効でないことを見出した。したがって、これらのペプチドは、患者の細胞外基質分子の過剰蓄積、ターンオーバーの調節不全または組成変化と関連する病態の治療に有用である。

図６は、４つの特別に設計され、調製されるペプチド（３６〜４０）用に選択された配列を示すとともに、ＣＣＮ２配列のベストマッチに対する近似相同性を記したものである。３つはＣＣＮ２配列に対する高い相同性（ｐ３７，３９，４０）を有するために、１つは低い相同性（ｐ３８）のために、そして１つは平均的（５０％）相同性（ｐ３６）のために選択された。より詳しくは、図７Ａは、分子の環状化および活性の喪失を防止できるように、選択し、かつセリンでシステイン残基を置換することにより合成した、ＣＣＮ３ｐ３７およびＣＣＮ３ｐ３８のペプチド配列を示す。上述したように、マウスペプチドは、図７Ｂに示すように、ヒトとの高度の相同性のために、また効能を実証し、ヒトの応答を予測できるマウスモデルを使用するために、試験用として選択された。最後に、図７Ｃおよび図７Ｄは、ＣＣＮｐ３７のペプチド配列でＣＣＮ２とＣＣＮ３の間に強い相同性が存在するが、ペプチド配列ＣＣＮｐ３８では同じ相同性が存在しないことを示している。

選択したＣＣＮ３ペプチドのスクリーニング結果上で選択し、図５に示したペプチドを合成し、３種類の生体外試験法で試験した。これらの試験法は、抗線維化活性用として生体内で線維症または線維症関連病理をモデル化するよう構築されたものである。これらの試験法は、我々によっても他者によっても広く使用されてきており、ヒトに生じるものを含む、生体内の関連する応答に対し、高い予測性を有している。１つの生体外試験法、すなわち、生体外細胞接着試験法を使用した。創傷治癒および線維症において、他の重要な活動のための受容体へのＣＣＮ２の結合に応答している細胞の接着には、要件がある。細胞の付着および受容体との結合の変化はまた、本出願で前に名付けた他の非線維症疾患にも関係する。この接着試験法では、培養プレートのウェルをＣＣＮ２タンパク質でコーティングし、その後、所定の時間、ラットの糸球体間質細胞を加えた。糸球体間質細胞はＣＣＮ２受容体を有しているため、特定の受容体を介してプレートに堅固に結合し、したがって、この受容体を介した接着は測定することができる。標準的な時間、インキュベーションした後、細胞を洗浄して、接着していない細胞を除去する。次に、これらの付着細胞を除去し、計数して、全接着細胞のパーセントを決定する。この結合を遮断する各ペプチドの能力を、対象のペプチドと共に細胞を事前にインキュベートすることにより調べた。ＣＣＮコーティングのないコントロールを比較のために使用した。第２の試験法では、ＴＧＦ−ベータによるコラーゲンタイプＩプロモータの活性化を遮断するペプチドの能力を試験した。コラーゲンタイプＩのアップレギュレーションは線維症の特徴であり、終点決定用としてしばしば使用される。ＴＧＦ−ベータは、線維化応答の状態にある糸球体間質細胞および他の細胞が、コラーゲンおよび他の基質分子の生成および蓄積をアップレギュレートすることによって応答する、よく調べられた線維化促進因子またはサイトカインである。ＴＧＦ−ベータの活性を標的とする新規の抗線維化療法がいくつか開発中である。本発明に関連して使用される試験法では、コラーゲンプロモータ活性を、コラーゲン関連線維化活性の迅速な初期の指標として測定した。培養物中の細胞は、選択したペプチドの存在下および非存在下の両方で、ＴＧＦ−ベータによる刺激を受けたり受けなかったりした。ペプチドが抑制活性を有するならば、ＴＧＦ−ベータ刺激下のプロモータ活性は、ある値まで低下し、コントロールの、ＴＧＦ−ベータ未処理の細胞に近づくであろう。コラーゲンプロモータ試験法は、ルシフェラーゼに結合したＣＯＬ１ａ２プロモータの糸球体間質細胞への形質移入に基づいている。したがってプロモータが活性化されると、ルシフェラーゼの単位で測定することができる（Ｒｉｓｅｒｅｔａｌ，ＣＣＮ３ｉｓａｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆＣＣＮ２ａｎｄａｎｏｖｅｌｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｔｈｅｆｉｂｒｏｔｉｃｐａｔｈｗａｙｉｎａｎｉｎｖｉｔｒｏｍｏｄｅｌｏｆｒｅｎａｌｄｉｓｅａｓｅ，ＡｍｅｒｉｃａｎＪＰａｔｈｏｌｏｇｙ，１７４，５，２００９）。コラーゲンプロモータの活性化の程度（任意の単位）は、下方の図にも示されているように、形質移入効率のコントロール（ＣＭＶプロモータの活性化）に基づく。

第３の試験法では、ＴＧＦ−ベータの刺激に応答した、ＣＣＮ２およびコラーゲンタイプＩ（線維症、アテローム性動脈硬化症、血管石灰化、骨疾患および他の関連疾患で変化したＥＣＭ分子の原型）の量と分布の両方の細胞変化を測定できる免疫化学的染色が開発された。この試験法ではまた、細胞の表現型の変化、特に、より線維芽様の細胞への変化の有無を知ることができる。この変化は、腎線維症での糸球体間質細胞のみならず、線維症を引き起こし得る他の細胞における線維化の特徴である。したがって、この試験法は合成ペプチドの作用を試験するために用いることができる（Ｒｉｓｅｒｅｔａｌ，ＣＣＮ３ｉｓａｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆＣＣＮ２ａｎｄａｎｏｖｅｌｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｔｈｅｆｉｂｒｏｔｉｃｐａｔｈｗａｙｉｎａｎｉｎｖｉｔｒｏｍｏｄｅｌｏｆｒｅｎａｌｄｉｓｅａｓｅ，ＡｍｅｒｉｃａｎＪＰａｔｈｏｌｏｇｙ，１７４，５，２００９）。

コラーゲンプロモータ試験法またはＣＣＮ２仲介接着試験法のいずれかで行ったペプチドスクリーニングの結果では、３６個のオーバーラップペプチドのいずれも、ＣＣＮ２仲介結合またはコラーゲンプロモータ抑制活性の顕著な抑制は示さなかった。高い（ほぼ１００％）相補性を有するｃ末端モジュール内の特定の領域に対して設計されたペプチド３７（ＣＣＮ３ｐ３７）では、ＴＧＦ−ベータ刺激コラーゲンプロモータの活性抑制（図８）および受容体結合（ＣＣＮ２への接着）の抑制（図９）がともに見られた。ＣＣＮ３ｐ３７は、コラーゲンプロモータ活性の抑制においてＣＣＮ３ｐ３８より強力なようであり、ＴＧＦ−ベータの直前処理が最も有効であったが、しかし、２４時間前の暴露でさえいくらかの活性を示すことができた。ＣＣＮ３ｐ３７およびｐ３８は、ＣＣＮ２へのＴＧＦ−ベータの刺激による接着を抑制することにおいて類似の効力を有した。他のオーバーラップペプチドまたは特別に設計したペプチドはいずれも、一貫した抑制活性を示さなかった。いくつかのペプチドではプロモータ活性の促進さえも観察された。ＣＣＮ３ｐ３８はＣＣＮ２に対する相補性は極めて低く、ＩＧＦＢＤドメイン中に見出される。このＣＣＮ３ｐ３７とＣＣＮ３ｐ３８の正の効果はまた、免疫組織学的染色検査法で検査したときも見られた。ＣＣＮ３ｐ３７（図１０Ａ）およびＣＣＮ３ｐ３８（図１０Ｂ）は、用量に応じてＣＣＮ２の再分布および新規合成を阻止することができ、産生と活性の両方に作用することを示しているが、線維芽タイプ細胞への移行を遮断するようでもあり、ある表現型への細胞の移行で重要な因子は、多くの器官系の線維症の発症と進行において重要であると考えられた。コラーゲンタイプＩに対しても、ＣＣＮｐ３７（図１１Ａ）およびＣＣＮｐ３８（図１１Ｂ）の両方で、類似の作用が観察され、引き起こされた。したがって、本発明は、完全長ＣＣＮ３タンパク質の非常に制限された選択領域からの独特の小さいペプチドを使用して、ＣＣＮ２の合成および活性、ＣＣＮ２への細胞結合または接着、コラーゲンの蓄積、糸球体間質細胞の線維芽タイプ細胞への移行、そして、ひいては線維化を遮断する方法を初めて示すものである。したがって、本発明のＣＣＮ３ペプチドはまた、ＣＣＮ２が仲介する癌細胞増殖刺激を遮断し、また瘢痕の形成を最小にする創傷治癒を促進するために使用し得る。ＣＣＮ２は多くの疾患の進行の鍵となる因子としてよく知られているため、そのようなペプチドのこの因子に対する遮断能力は、広範囲に及ぶ治療への適用性を有している。ほぼ完全な相補性を有する１つの領域、および殆どまたは全く相補性を有さない他の１つの領域がともに、接着、ＣＣＮ２活性、接着およびコラーゲン活性の遮断に有効であったことは予期できない知見であった。このことは予見できなかった。

本発明の方法の可能性がある使用の１つは、線維症の治療である。本開示で使用される用語「線維症」は、線維症および／または硬化症および瘢痕形成を含む。これは、それらが類似のプロセスであり、それらの全てが少なくとも１つの原因因子としてＣＣＮ２を有することが明らかになっているからである。本開示では、「線維症」、「硬化症」および「瘢痕形成」は同義語として使用され得る。線維症は、腎臓、心臓、肝臓、肺臓、血管系（皮膚硬化症、冠状動脈など）、皮膚、頚部、眼、歯茎、脳および腹膜など（これらに限定されない）の、線維症を引き起こし得る任意の器官と関係し得る。線維症はまた、腎疾患、腹膜透析、黄斑変性、歯周病、うっ血性心不全、脳卒中および関連する虚血性および再潅流傷害、外科および内科的介入処置（例えば、バルーン血管形成、ステントの挿入、カテーテル、移植片（動脈および静脈フィステルなど）および臓器移植）、ならびに望ましくない術後の組織または臓器癒着および瘢痕形成など（これらに限定されない）の病態の１つの結果でもあり得る。線維症はまた、細胞増殖の亢進、例えば、糸球体増殖性疾患や、細胞増殖によって引き起こされる血管硬直、中間および内膜の石灰化に付随し得る。他の適応症としては、異常な細胞増殖、例えば、癌、特に増殖または転移がＣＣＮ２発現と関連している場合の癌、アテローム性動脈硬化症、骨疾患、骨粗しょう症、腎性骨ジストロフィー、骨軟骨異形成症、線維性骨形成異常、破骨細胞形成症、血管抵抗、血管石灰化、腫瘍形成、および細胞外基質調節不全が挙げられる。病態は、ＴＧＦ−ベータの生成／分泌および／または活性の増加、創傷治癒、慢性腎障害、糸球体内高血圧、癌細胞の増殖、糖尿病、高血糖症、高血圧症、腎増殖性疾患、細胞外基質調節不全症、または結合組織病に続発し得る。

ヒト慢性骨髄性白血病細胞の増殖に対するＣＣＮ３ペプチドの作用に関する研究結果

図１２は、ヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２）の細胞増殖を、未処理のコントロールの増殖に対するパーセントとして棒グラフで示す。未処理細胞（コントロール）、および一定量の市販の組み換えＣＣＮ３（ｒＣＣＮ３ｃ）、または数種の調製物ｒＣＣＮ３８、ｒＣＣＮ３９、ｒＣＣＮ３１０、ｒＣＣＮ３１１で代表される我々の研究所で調製した完全長ＣＣＮ３、またはＣＣＮｐ３７ペプチドもしくはＣＣＮｐ３８ペプチドと共に事前にインキュベートした細胞を増殖させ、その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙにより、コントロールの未処理細胞、または細胞の増殖を測定した（ＭｃＣａｌｌｕｍ，Ｌｅｔａｌ，ＣＣＮ３：ａｋｅｙｇｒｏｗｔｈｒｅｇｕｌａｔｏｒｉｎＣｈｒｏｎｉｃＭｙｅｌｏｉｄＬｅｕｋａｅｍｉａ，ＪＣｅｌｌＣｏｍｍｕｎＳｉｇｎａｌ．２００９Ｊｕｎｅ；３（２）：１１５−１２４）。後者は、代謝的に活性な細胞の尺度であるＡＴＰ存在量の定量に基づき、培養物中の生存細胞の数を測定する均質的方法である。我々の結果によれば、商業的に製造された完全長ＣＣＮ３で、試験期間中に増殖および／または生存率が約３５％減少した。それに比べて、ＣＣＮ３ｐ３７では１５〜２０％、ＣＣＮ３ｐ３８では約４０％、細胞増殖が抑制された。このように、活性は完全長ＣＣＮ３より大きかった。

追加の態様として、本発明は、患者への投与のためにそれらを容易に使用できるようにパッケージ化した、ＣＣＮ３ペプチドを患者に投与するための１種以上の医薬製剤を含むキットを含む。１つの実施形態では、そのようなキットは、本明細書に記載した医薬製剤（例えば、ＣＣＮ３ペプチドを含む組成物）を含む。その医薬製剤は、封をした瓶または容器などのコンテナにパッケージングされ、この方法を実施する際にこの化合物または組成物の使用について説明するラベルが、コンテナに貼付されるか、またはパッケージに含められる。１つの実施形態では、医薬製剤は、コンテナの上部空間量（例えば、液体製剤とコンテナの上端との間の空気の量）が非常に小さくなるように、コンテナにパッケージングされる。上部空間量は無視できる程度である（すなわち、殆どなし）ことが好ましい。１つの実施形態では、キットは、ＣＣＮ３ペプチド組成物を含有する第１のコンテナと、この組成物の再構成に使用される生理学的に許容可能な溶液を含有する第２のコンテナを含む。１つの態様では、医薬製剤は単位用量の形態でパッケージングされる。キットは、特定の投与経路で医薬製剤を投与するのに適した装置をさらに含んでもよい。キットは医薬製剤の使用について説明するラベルを含むことが好ましい。

本発明は、静脈内、筋肉内、鼻腔内、局所、膣内、肛門内、経皮、吸入、経口、口腔、腹腔内、骨内およびこれらの組み合わせを含む経路による、ヒトの患者へのＣＣＮ３ペプチドの投与をさらに提供する。経皮投与の経路は、経皮パッチまたは経皮電気泳動を含む。ＣＣＮ３ペプチドは、当該技術分野でよく知られているように、ペプチドが分解されないよう保護するため、ヒトの目的の部位をペプチドの標的とさせるため、送達速度を制御するために、担体分子または本体との結合により修飾され得ることもまた理解されるべきである。適切な担体分子としては、グリコール類、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、血清タンパク質を含むタンパク質が挙げられるが、特にこれらに限定されない。本発明は、上述した所定の送達経路のために、医薬品工業で使用されている賦形剤の使用を考慮に入れている。本発明は、ＣＣＮ３ペプチドの安定性、保存期間、生体内半減期、体内での標的への到達性を高めるため、対象細胞への結合性または対象細胞内への移行性を改善するために、それを修飾することを考慮に入れている。

本発明の１つの好ましい形態では、生体外で治療用幹細胞を生成するために、このペプチドを臍帯血または骨髄単離物に加えることにより、ＣＣＮ３ペプチドを幹細胞処理製剤中で使用することができる。また、生体内でのそのような処理により、とりわけ、虚血性心疾患、線維症、心不全および肝不全などの重篤な傷害からのより良好な回復のため、天然起源幹細胞の活性が促進され得ることが推測できるであろう。

本発明は、ＣＣＮ３ペプチドの有効量の送達を提供するものであって、この有効量は、用量漸増法または当業者に知られた他の方法などで決定することができ、また、それは、０．１ナノモル濃度〜１マイクロモル濃度、すなわち１ミリリットル当たり約０．１ナノグラムから１ミリリットル当たり１マイクログラムの範囲内の用量を含み得る。使用する送達形態によっては、濃縮された量も必要とされ得る。

本発明の実施には、他に指示がなければ、当該技術分野の技能の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、遺伝子工学および免疫学における従来からの技術が利用され、組み込まれるであろう。本発明は、現時点で最も実際的で好ましい実施形態であると考えられたものに関連して説明されているが、本発明が開示した実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲の精神と範囲に含まれる様々な修正と等価な変更を包覆することを意図するものであることは認識されるべきである。本発明の修正と変更は、特許請求の範囲で定義されている本発明の新規の態様から逸脱することなく行われ得る。添付の特許請求の範囲は、広く、かつ本明細書における本発明の精神と範囲に矛盾しない方法で解釈されるべきである。

連邦政府の支援による研究または開発
該当せず。

配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂによって、ＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含むものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１１年５月６日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーの名称は、１１２４６１９６．ｔｘｔであり、サイズは２５，１５４バイトである。

図１は、ＣＣＮタンパク質の一般的なマルチモジュール構造を非常に単純化して示す。ＣＴ、増殖調節因子様ドメインのシステインノット含有ファミリー；ＩＧＦＢＰ、インスリン様増殖因子結合タンパク質様ドメイン；ＴＳＰ１、トロンボスポンジン様ドメイン；およびＶＷＣ、フォン・ウィルブランド因子様ドメイン。図２は、ペプチドの設計に使用されたマウスのＣＣＮ３の公開されている配列（上の配列）と、天然には存在しない、システインをセリンで置換した我々の修飾配列（下の配列）を示す。図３は、その後、活性試験用の小さいペプチドを生成するために使用した特定のＣＣＮ３配列（配列番号１〜４０として開示されたペプチド１〜４０）を示す。図４は、ヒトＣＣＮ（ｈＣＣＮ）の全体構造および配列アライメントを示すもので、コンピュータがそれらをアライメントしたままのｈＣＣＮ２とｈＣＣＮ３を示しており、ＩＧＦ−ＢＤ、ＶＷＦ、ＴＳＰおよびｃ−末端繰り返し成分を含む、説明した４つのモジュールの概略図が、図の上部に示されている。図の下部には、２つの分子（ｈＣＣＮ２およびｈＣＣＮ３）の配列アライメント（星印が付されている）が、ここではシステインが未変化の状態で示されている。図５は、マウスＣＣＮ３配列上において、合成したＣＣＮペプチド（ＣＣＮｐ）の位置を示すもので、ｎ−末端を起点としてｃ−末端に至る３５個の構築されたオーバーラップ配列（ＣＣＮｐ１−３５）が黒字で、また５個の特別に設計されたペプチドＣＣＮｐ３６−４０が太字で示されている（ここではまた全てで、システインがセリンで置換されている）。図６は、分子内の位置と、ＣＣＮ２との配列相同性に基づき狙いを定めた、ペプチド設計のために選択したＣＣＮ３配列を示す。最終的には、システインの電荷によって起こり得る環状構造の形成を避けるため、したがって、我々が求めている正常な、または目標とする機能の喪失を避けるため、システインをセリンで置換した。しかしながら、我々はまた、この変更によって求めている機能が完全に喪失することになるか否かもわからなかった。これらのペプチドは同時にヒトとマウスの間のそれらの高い相同性からも選択されたため、マウスモデルで試験され、有効であることが示された任意の配列は、ヒトにおいても同じレベルの効果があると考えられるであろう。図６は、配列番号４５〜４９をそれぞれ出現順に開示する。図７Ａは、システイン残基をセリン残基で置換して合成され、試験された特定のＣＣＮ３ｐ３７（配列番号３７）およびＣＣＮ３ｐ３８（配列番号３８）ペプチドを示す。図７Ｂは、ＣＣＮ３ｐ３７およびＣＣＮ３ｐ３８が誘導されたマウスとヒトの天然の配列間の相同性の程度を示す比較である。ＣＣＮｐ３７はヒト（配列番号５０）とマウス（配列番号４８）で同じである。ＣＣＮ３ｐ３８ペプチドは、ヒト（配列番号５１）とマウス（配列番号４９）で１個のアミノ酸のみが異なる。図７Ｃは、天然のヒトのＣＣＮ２配列とＣＣＮ３配列の、ＣＣＮ３ｐ３７およびＣＣＮ３ｐ３８が選択された領域における比較を示す。選択されたＣＣＮｐ３７配列では、ＣＣＮ２およびＣＣＮ３はともに、領域のこれらの配列にわたって異常に高い相同性を有しており、１４個の中で１個のアミノ酸のみが異なっている。これとは極めて対照的に、選択されたＣＣＮ３ｐ３８配列では、ＣＣＮ２およびＣＣＮ３は異常に低いアミノ酸相同性を有しており、１４個のアミノ酸のうち４個のみが同じである。図７Ｃは配列番号５２、５０、５３および５１をそれぞれ出現順に開示する。図７Ｄは、天然のマウスのＣＣＮ２配列とＣＣＮ３配列の、ＣＣＮ３ｐ３７およびＣＣＮ３ｐ３８領域での比較を示す。ＣＣＮ３ｐ３７では、ヒトとマウスで違いがないため、上の７Ｃに示されたものと違いがない。ＣＣＮ３ｐ３８では、天然の配列においてＣＣＮ２の配列に合致するのは、１４個のアミノ酸のうちの４個である。図７Ｄは配列番号５４、４８、５５および４９をそれぞれ出現順に開示する。図８は、ＣＣＮ３ｐ３７およびＣＣＮ３ｐ３８がＴＧＦ−βによるコラーゲンプロモータの活性化を低下させることを示す。ペプチド３８（上）は、５００ｎｇ／ｍＬでコラーゲンプロモータの活性を抑制することができた。ペプチド３７は、ＴＧＦ−βの直前に添加すると、ＴＧＦ−βにより活性化されるコラーゲンプロモータの活性を全面的に遮断する能力を示した（下の図の右３本の棒グラフ）。この抑制作用は、ＴＧＦ−βの２４時間前に添加した時でさえも認められた（より低いレベルではあったが）。その他の調製し試験した３８個のペプチドは、この試験では活性を示さず、したがってそのデータは示していない。上の図のＹ軸は、下の図でも示されているように、コントロールの形質移入効率を基準にした（ＣＭＶプロモータ活性）、コラーゲンプロモータの活性レベル（任意の単位）である。図９は、ＣＣＮ３ｐ３７およびＣＣＮ３ｐ３８がＣＣＮ２コーティングプレートへの細胞の接着を用量に応じて遮断することを示す。コントロールプレートは単なるプラスチック（無コーティング）のプレートへの糸球体間質細胞の接着を示す。左から２番目の棒グラフ「ＣＴＧＦ」、すなわちＣＣＮ２は、無コーティングのプラスチック上で起こったこととは反対に、ＣＣＮ２コーティングプレートに結合した受容体によって仲介された接着が顕著に増加したことを示している。ＴＧＦ−β処理の直前に加えた完全長ヒトＣＣＮ３（ＮＯＶ）（２７ｎＭ）は、予想されたように、この結合に対していくらかの抑制を示した。しかしながら、ＣＣＮｐ３７およびＣＣＮｐ３８ペプチドは、ＣＣＮ２へと仲介される受容体結合を用量に応じて遮断し、試験した最高濃度（５００ｎＭ）で約６０％〜７０％の抑制を示した。このことは、２つのペプチドが結合部位で相互作用し得ることを示すものである。試験した他の３８個のペプチドは（紙面を考慮して、ここではそのうちのｐ３５、ｐ３６、ｐ３７およびｐ４０のみを示した）、いずれも結合を十分に遮断できなかった。この試験でＣＣＮｐ３７およびＣＣＮｐ３８ペプチドが示した特異的な活性が、ＣＣＮ２に結合し、かつある種の特異的活性に必要であろう細胞上の受容体を遮断する能力であることを示している。図１０Ａは、ＣＣＮ２の免疫局在性（タンパク質特異性抗体との反応性）およびＣＣＮ３ｐ３７ペプチドの抑制効果を示す。ここで示しているのは、ＴＧＦ−β処理によって、既に作られ細胞膜に局在化しているＣＣＮ２（暗い赤茶色）の劇的な損失（分泌）がもたらされるが、この時点で細胞質に認められる新たなＣＣＮ２（明るい赤茶色）の合成も開始されていることである。これと並行して、線維症に見られる特徴である、より延伸され角ばった線維芽タイプの細胞への表現型の変化が起きている。５０ｎＭのＣＣＮ３ｐ３７で処理すると、この表現型の転移が遮断され、ＣＣＮ２の排除および新しいＣＣＮ２の新規な合成が大幅に減少する。図１０Ｂは、ＣＣＮ２の免疫局在性およびＣＣＮｐ３８ペプチドの抑制効果を示す。未処理のコントロール細胞は、細胞境界に広範囲に存在するＣＣＮ２（茶色）を示している。ＴＧＦ−βによる処理は、細胞膜におけるＣＣＮ２の劇的な損失（分泌）と、この時点で細胞質内全体に認められる新たな合成の開始をもたらす。これと並行して、表現型が、線維症に特徴的な線維芽タイプの細胞と見られるものへと変化する。ＣＣＮ３ｐ３８による処理は、この表現型の転移、ＣＣＮ２の排除、およびＣＣＮ２の新たな合成を遮断する。低濃度では用量応答効果が現れ、最適な効果は５０ｎＭであるようである。他のペプチドはこの効果を示さなかった（図示せず）。図１１Ａは、コラーゲンＩの免疫局在性とＣＣＮｐ３７ペプチドの抑制効果を示す。ＴＧＦ−β（コラーゲン蓄積および線維化の強力な刺激物質）による処理は、細胞膜における大量のコラーゲンＩの劇的な損失または分泌（コントロールの枠内に茶色または赤茶色で示す）、および（ＴＧＦ処理された）細胞質内全体に認められるいくらかの新たな合成の開始をもたらす。これと並行して、表現型は、線維症に特徴的な、細長く立方体様の程度がより低い線維芽タイプの細胞と見られるものへと変化する。０．５ｎＭの低濃度ＣＣＮｐ３７による処理は、この表現型の転移、ＣＣＮ２の排除、およびＣＣＮ２の新たな合成を遮断する。より高い用量は、同じかまたは類似の効果を示す。他のペプチドはこの効果を示さなかった（図示せず）。図１１ｂは、コラーゲンＩの免疫局在性およびＣＣＮｐ３８ペプチドの抑制効果を示す。ＴＧＦ−β（線維化促進剤として知られている）による処理は、細胞膜における大量のコラーゲンＩの劇的な損失（分泌）（コントロールの枠内に示す）、および（ＴＧＦ処理された）細胞質内全体に認められるいくらかの新たな合成の開始をもたらす。これと並行して、表現型は、細長く立方体様の程度がより低い線維芽タイプの細胞と見られるものへと変化する。０．５ｎＭの低濃度ＣＣＮ３ｐ３８による処理では、殆ど効果がない。しかしながら、５〜５０ｎＭの用量では、ＴＧＦ−βに応答して生じる表現型の転移、いくらかの既存コラーゲンの排除、および新たなコラーゲンの合成を遮断する。他のペプチドはこの効果を示さなかった（図示せず）。図１２は、ヒト慢性骨髄性白血病の未処理細胞（コントロール）の細胞増殖棒グラフを示し、また、一定量の市販の組み換えＣＣＮ３（ｒＣＣＮ３ｃ）、我々の研究所で調製した完全長ＣＣＮ３タンパク質、ｒＣＣＮ３８、ｒＣＣＮ３９、ｒＣＣＮ３１０、ｒＣＣＮ３１１またはＣＣＮ３ｐ３７もしくはＣＣＮ３ｐ３８とともに事前にインキュベートしたものと比較したものである。ＣＭＬ細胞を増殖させ、その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙにより、コントロールの未処理細胞、または細胞の増殖を測定した。後者は、代謝的に活性な細胞の尺度であるＡＴＰ存在量の定量に基づき、培養物中の生存細胞の数を測定する均質的方法である。商業的に製造された完全長ＣＣＮ３では、試験期間中に増殖および／または生存率が約３５％減少した。ＣＣＮ３ｐ３７では１５〜２０％抑制され、ＣＣＮ３ｐ３８では約４０％抑制された。

Claims

それを必要とする患者を治療するためのＣＣＮ３ペプチドにおいて、ＣＣＮｐ３７、ＣＣＮｐ３８（ヒト）、ＣＣＮｐ３８（マウス）、システイン置換ＣＣＮｐ３７、システイン置換ＣＣＮｐ３８（ヒト）またはシステイン置換ＣＣＮｐ３８（マウス）として同定されたアミノ酸配列を有することを特徴とするＣＣＮ３ペプチド。
請求項１に記載のＣＣＮ３ペプチドにおいて、前記システイン置換ＣＣＮｐ３７は、システインアミノ酸が、セリン、アラニン、グリシン、Ｓ−メチル化システインまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたＣＣＮｐ３７配列を含むことを特徴とするＣＣＮ３ペプチド。
請求項１に記載のＣＣＮ３ペプチドにおいて、前記システイン置換ＣＣＮｐ３７は、システインアミノ酸がセリンで置換されたＣＣＮｐ３７配列を含むことを特徴とするＣＣＮ３ペプチド。
請求項１に記載のＣＣＮ３ペプチドにおいて、前記システイン置換ＣＣＮｐ３８（ヒト）は、システインアミノ酸が、セリン、アラニン、グリシン、Ｓ−メチル化システインまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたＣＣＮｐ３８（ヒト）配列を含むことを特徴とするＣＣＮ３ペプチド。
請求項１に記載のＣＣＮ３ペプチドにおいて、前記システイン置換ＣＣＮｐ３８（ヒト）は、システインアミノ酸がセリンで置換されたＣＣＮｐ３８（ヒト）配列を含むことを特徴とするＣＣＮ３ペプチド。
請求項１に記載のＣＣＮ３ペプチドにおいて、前記システイン置換ＣＣＮｐ３８（マウス）は、システインアミノ酸が、セリン、アラニン、グリシン、Ｓ−メチル化システインまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたＣＣＮｐ３８（マウス）配列を含むことを特徴とするＣＣＮ３ペプチド。
請求項１に記載のＣＣＮ３ペプチドにおいて、前記システイン置換ＣＣＮｐ３８（マウス）は、システインアミノ酸がセリンで置換されたＣＣＮｐ３８（マウス）配列を含むことを特徴とするＣＣＮ３ペプチド。
請求項１に記載のＣＣＮ３ペプチドにおいて、前記ＣＣＮ３ペプチドを含有する幹細胞製剤をさらに含むことを特徴とするＣＣＮ３ペプチド。
細胞外基質分子の過剰蓄積、ターンオーバーの調節不全または組成の変化に関連するヒト患者の病態を治療または予防する方法において、
ＣＣＮｐ３７、ＣＣＮｐ３８（ヒト）、ＣＣＮｐ３８（マウス）、システイン置換ＣＣＮｐ３７、システイン置換ＣＣＮｐ３８（ヒト）またはシステイン置換ＣＣＮｐ３８（マウス）として同定されたアミノ酸配列を有するＣＣＮ３ペプチドの有効量を前記患者に投与するステップ
を含むことを特徴とする方法。
請求項９に記載の方法において、前記病態は、瘢痕形成、線維症、硬化症、アテローム性動脈硬化症、骨疾患、腎性骨ジストロフィー、骨軟骨異形成症、線維性骨形成異常、破骨細胞形成症、血管抵抗、血管石灰化、腫瘍化、癌細胞増殖および細胞外基質調節不全からなる群から選択されることを特徴とする方法。
請求項９に記載の方法において、前記病態は、ＴＧＦ−βの生成／分泌または活性の増加、創傷治癒、慢性腎疾患、糸球体内高血圧、癌細胞の増殖、糖尿病、高血糖症、高血圧症、腎臓増殖性疾患、細胞外基質調節不全症または結合組織病に続発することを特徴とする方法。
請求項９に記載の方法において、前記線維症は、腎臓、心臓、肝臓、肺臓、血管系、頚部、眼、歯茎、皮膚、脳および腹膜を含む、線維症を引き起こし得る任意の器官と関係することを特徴とする方法。
請求項９に記載の方法において、前記投与するステップは、静脈内、筋肉内、鼻腔内、局所、膣内、肛門内、経皮、吸入、経口、口腔、腹腔内、骨内およびこれらの組み合わせからなる群から選択される投与経路により、ＣＣＮ３ペプチドをヒト患者に送達するステップを含むことを特徴とする方法。
請求項１３に記載の方法において、前記経皮投与の経路は、経皮パッチまたは経皮電気泳動を含むことを特徴とする方法。
請求項９に記載の方法において、前記ＣＣＮ３ペプチドは、担体分子によって修飾されることを特徴とする方法。
請求項１５に記載の方法において、前記担体分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリコール類、タンパク質、血清タンパク質からなる群から選択されることを特徴とする方法。
請求項９に記載の方法において、前記ＣＣＮ３ペプチドを修飾して、その安定性、保存期間、生体内半減期、標的性、または対象細胞への結合もしくは前記対象細胞内への移行性を改善する工程をさらに含むことを特徴とする方法。
請求項９に記載の方法において、前記システイン置換ＣＣＮｐ３７は、システインアミノ酸が、セリン、アラニン、Ｓ−メチル化システインまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたＣＣＮｐ３７配列を含むことを特徴とする方法。
請求項９に記載の方法において、前記システイン置換ＣＣＮｐ３７は、システインアミノ酸がセリンで置換されたＣＣＮｐ３７配列を含むことを特徴とする方法。
請求項９に記載の方法において、前記システイン置換ＣＣＮｐ３８（ヒト）は、システインアミノ酸が、セリン、アラニン、グリシン、Ｓ−メチル化システインまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたＣＣＮｐ３８（ヒト）配列を含むことを特徴とする方法。
請求項９に記載の方法において、前記システイン置換ＣＣＮｐ３８（ヒト）が、システインアミノ酸がセリンで置換されたＣＣＮｐ３８（ヒト）配列を含むことを特徴とする方法。
請求項９に記載の方法において、前記システイン置換ＣＣＮｐ３８（マウス）は、システインアミノ酸が、セリン、アラニン、グリシン、Ｓ−メチル化システインまたはこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたＣＣＮｐ３８（マウス）配列を含むことを特徴とする方法。
請求項９に記載のＣＣＮ３ペプチドにおいて、前記システイン置換ＣＣＮｐ３８（マウス）は、システインアミノ酸がセリンで置換されたＣＣＮｐ３８（マウス）配列を含むことを特徴とするＣＣＮ３ペプチド。
請求項９に記載の方法において、幹細胞含有製剤へのＣＣＮ３ペプチドの添加をさらに含むことを特徴とする方法。
細胞外基質分子の過剰蓄積、ターンオーバーの調節不全または組成の変化に関連するヒト患者の病態を治療する溶液を形成するためのキットにおいて、
ＣＣＮｐ３７、ＣＣＮｐ３８（ヒト）、ＣＣＮｐ３８（マウス）、システイン置換ＣＣＮｐ３７、システイン置換ＣＣＮｐ３８（ヒト）またはシステイン置換ＣＣＮｐ３８（マウス）として同定されたアミノ酸配列を有するＣＣＮ３ペプチドを含有するバイアル；および
前記ＣＣＮ３ペプチドの使用について説明するラベル
を含むことを特徴とするキット。
請求項２５に記載のキットにおいて、前記ＣＣＮ３ペプチドは凍結乾燥されており、かつ前記キットは前記凍結乾燥されたＣＣＮ３ペプチドを再構成するための希釈剤を含有するバイアルをさらに含むことを特徴とするキット。
請求項２５に記載のキットにおいて、前記ＣＣＮ３ペプチドは、液体製剤であることを特徴とするキット。
請求項２５に記載のキットにおいて、前記ＣＣＮ３ペプチドを、それを必要としているヒト患者に送達する装置をさらに含むことを特徴とするキット。