JP2013523082A - Ect2ペプチドおよびそれを含むワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2010年4月2日に出願された米国仮出願第61/320,577号の恩典を主張し、それらの内容はその全体が、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明はさらに、本発明のいずれかのペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを範囲に含む。これらのポリヌクレオチドは、CTL誘導能を有するAPCを誘導もしくは調製するために用いることができ、または本発明の上記のペプチドと同じように、がんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与することができる。
本発明の適用範囲は、例として膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、CML、結腸直腸がん、食道がん、NSCLC、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびSCLCが含まれるがこれらに限定されないがんのような、ECT2過剰発現と関係があるかまたはそれに起因する数多くの疾患の任意のものにも拡張される。
[1] SEQ ID NO:42のアミノ酸配列またはその免疫学的活性断片からなる単離されたペプチドであって、HLA抗原と結合して細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を誘導する、単離されペプチド。
[2] HLA抗原がHLA−A2である、[1]記載の単離されたペプチド。
[3] SEQ ID NO:1〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、[1]または[2]記載の単離されたペプチド。
[4](a)HLA抗原と結合して細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を誘導し、かつSEQ ID NO:42のアミノ酸配列またはその免疫学的活性断片からなる、単離されたペプチド、
(b)HLA抗原がHLA−A2である、(a)の単離されたペプチド、
(c)SEQ ID NO:1〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、(a)または(b)の単離されたペプチド、および
(d)改変ペプチドが元のペプチドのCTL誘導能を保持することを条件として、1個、2個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたSEQ ID NO:1〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、(a)または(b)の単離されたペプチド
からなる群より選択される、単離されたペプチド。
[5] SEQ ID NO:1〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列からなり、以下の特徴の一方または両方を有する、[4]記載の単離されたペプチド:
(a)N末端から2番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンからなる群より選択される;および
(b)C末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンからなる群より選択される。
[6] ノナペプチドまたはデカペプチドである、[1]〜[5]のいずれか一項記載の単離されたペプチド。
[7] [1]〜[6]のいずれか一項記載のペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
[8] [1]〜[6]のいずれか一項記載の1つもしくは複数のペプチドまたは[7]記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、CTLを誘導するための組成物。
[9] [1]〜[6]のいずれか一項記載の1つもしくは複数のペプチドまたは[7]記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、がんの治療および/または予防および/または術後再発の予防のための薬学的組成物。
[10] HLA抗原がHLA−A2である対象への投与のために製剤化される、[9]記載の薬学的組成物。
[11] がんの治療のために製剤化される、[9]または[10]記載の薬学的組成物。
[12](a)インビトロ、エクスビボまたはインビボで、APCを[1]〜[6]のいずれか一項記載のペプチドと接触させる段階、および
(b)[1]〜[6]のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階
からなる群より選択される段階を含む、CTL誘導能を有する抗原提示細胞(APC)を誘導するための方法。
[13](a)HLA抗原と[1]〜[6]のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を表面上に提示するAPCと、CD8陽性T細胞を共培養する段階;
(b)HLA抗原と[1]〜[6]のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を表面上に提示するエキソソームと、CD8陽性T細胞を共培養する段階;および
(c)[1]〜[6]のいずれか一項記載のペプチドと結合したT細胞受容体(TCR)サブユニットのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を、T細胞に導入する段階
からなる群より選択される段階を含む方法によって、CTLを誘導するための方法。
[14] HLA抗原と[1]〜[6]のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を表面上に提示する、単離されたAPC。
[15] [12]記載の方法によって導入される、[14]記載のAPC。
[16] [1]〜[6]記載のペプチドのいずれかを標的とする、単離されたCTL。
[17] [13]記載の方法によって誘導される、[16]記載のCTL。
[18] がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、[1]〜[6]のいずれか一項記載のペプチド、その免疫学的活性断片、またはそのペプチドもしくは断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を該対象に投与する段階を含む、方法。
[19] [1]〜[6]記載のペプチドのいずれかに対する抗体またはその免疫学的活性断片。
[20] [1]〜[6]記載のペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
[21] [1]〜[6]記載のペプチド、[7]記載のヌクレオチド、または[19]記載の抗体のいずれかを含む、診断キット。
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等のいかなる方法および材料も用いることができるが、好ましい材料、方法、および装置をここに記載する。しかし、本発明の材料および方法について記載する前に、これらの記載が説明のためだけのものであり、限定することを意図していないことが理解されるべきである。同様に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣例的な実験法および/または最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。さらに、本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図しない。
別段の定めのない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている用語と同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および例は、単に例証するためのものであり、限定することは意図しない。
本明細書で用いる「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という単語は、特に別段の指定のない限り「少なくとも1つ」を意味する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、1個または複数個のアミノ酸残基が、修飾された残基、すなわち対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であってよいアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。
本明細書で時として用いる「オリゴペプチド」という用語は、長さが20残基またはそれ未満、典型的には15残基またはそれ未満の本発明のペプチド、および典型的には約8〜約11残基、しばしば9または10残基から構成される本発明のペプチドを指すのに用いられる。
アミノ酸は、本明細書において、IUPAC−IUB生化学命名法委員会(Biochemical Nomenclature Commission)の推奨する、一般に公知の3文字表記または1文字表記により参照されてもよい。
「剤」、「物質」、および「組成物」という用語は本明細書で互換的に用いられ、特定量の特定成分を含む生成物、ならびに特定量の特定成分の組み合わせから直接または間接的に生じる任意の生成物を指す。「薬学的」という修飾語句に関して用いる場合のそのような用語は(例えば「薬学的な剤」および「薬学的組成物」)、有効成分と担体を構成する任意の不活性成分とを含む生成物、ならびに任意の2つもしくはそれ以上の成分の組み合わせ、複合体形成、もしくは凝集から、1つもしくは複数の成分の解離から、または1つもしくは複数の成分の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。したがって、本発明との関連において、「薬学的な剤」および「薬学的組成物」という用語は、本発明の分子または化合物と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合することにより作製される任意の産物を指す。
本明細書における「有効成分」という用語は、生物学的活性または生理的活性のある、剤または組成物中の物質を指す。特に、薬学的な剤または組成物の文脈において、「有効成分」という用語は、目的の薬理学的効果を示す物質を指す。例えば、がんの治療または予防に用いるための薬学的な剤または組成物の場合、剤または組成物中の有効成分は、がん細胞および/または組織に対して直接的または間接的に、少なくとも1つの生物学的作用または生理的作用をもたらし得る。好ましくは、そのような作用には、がん細胞増殖の低下または阻害、がん細胞および/または組織の損傷または殺傷などが含まれ得る。典型的には、有効成分の間接的効果は、がん細胞を認識または殺傷するCTLの誘導である。製剤化される前には、「有効成分」は「バルク(bulk)」、「原薬(drug substance)」、または「原体 (technical product)」とも称される場合がある。
別段の定めのない限り、「細胞傷害性Tリンパ球」、「細胞傷害性T細胞」、および「CTL」という用語は本明細書において互換的に用いられ、特に別段の指定のない限り、非自己細胞(例えば、腫瘍/がん細胞、ウイルス感染細胞)を認識し、そのような細胞の死滅を誘導することができるTリンパ球のサブグループを指す。
対象または患者との関連において、本明細書で用いる「HLA−A2陽性」という語句は、その対象または患者がHLA−A2抗原遺伝子をホモ接合的またはヘテロ接合的に保有し、HLA−A2抗原が対象または患者の細胞においてHLA抗原として発現していることを指す。
別段の定めのない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が共通に理解しているのと同じ意味を有する。
ECT2由来のペプチドがCTLによって認識される抗原として機能することを実証するために、ECT2(SEQ ID NO:42)由来のペプチドを解析して、それらが、通常見られるHLAアリルであるHLA−A2によって拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定した(Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996;Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995;Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994)。
ECT2−A2−9−34(SEQ ID NO:1)、
ECT2−A2−9−619(SEQ ID NO:2)、
ECT2−A2−9−664(SEQ ID NO:3)、
ECT2−A2−9−662(SEQ ID NO:4)、
ECT2−A2−9−634(SEQ ID NO:5)、
ECT2−A2−9−145(SEQ ID NO:6)、
ECT2−A2−9−561(SEQ ID NO:7)、
ECT2−A2−9−98(SEQ ID NO:8)、
ECT2−A2−9−575(SEQ ID NO:9)、
ECT2−A2−9−240(SEQ ID NO:10)、
ECT2−A2−9−292(SEQ ID NO:11)、
ECT2−A2−9−823(SEQ ID NO:12)、
ECT2−A2−9−220(SEQ ID NO:13)、
ECT2−A2−9−755(SEQ ID NO:14)、
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ECT2−A2−9−438(SEQ ID NO:16)、
ECT2−A2−9−874(SEQ ID NO:17)、
ECT2−A2−9−568(SEQ ID NO:18)、
ECT2−A2−9−166(SEQ ID NO:19)、
ECT2−A2−9−443(SEQ ID NO:20)、
ECT2−A2−10−33(SEQ ID NO:21)、
ECT2−A2−10−633(SEQ ID NO:22)、
ECT2−A2−10−144(SEQ ID NO:23)、
ECT2−A2−10−701(SEQ ID NO:24)、
ECT2−A2−10−754(SEQ ID NO:25)、
ECT2−A2−10−557(SEQ ID NO:26)、
ECT2−A2−10−191(SEQ ID NO:27)、
ECT2−A2−10−774(SEQ ID NO:28)、
ECT2−A2−10−428(SEQ ID NO:29)、
ECT2−A2−10−618(SEQ ID NO:30)、
ECT2−A2−10−97(SEQ ID NO:31)、
ECT2−A2−10−20(SEQ ID NO:32)、
ECT2−A2−10−574(SEQ ID NO:33)
ECT2−A2−10−461(SEQ ID NO:34)、
ECT2−A2−10−664(SEQ ID NO:35)、
ECT2−A2−10−575(SEQ ID NO:36)、
ECT2−A2−10−430(SEQ ID NO:37)、
ECT2−A2−10−511(SEQ ID NO:38)、
ECT2−A2−10−471(SEQ ID NO:39)、および
ECT2−A2−10−87(SEQ ID NO:40)。
ECT2−A2−9−34(SEQ ID NO:1)、
ECT2−A2−9−664(SEQ ID NO:3)、および
ECT2−A2−10−33(SEQ ID NO:21)。
樹立されたこれらのCTLは、各ペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的CTL活性を示した。これらの結果は、ECT2がCTLによって認識される抗原であること、および試験したそれらのペプチドがHLA−A2拘束性ECT2のエピトープペプチドであることを実証している。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、トレオニン(T);および
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照)。
(i)1個、2個または数個のアミノ酸が置換されているSEQ ID NO:1〜20からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、そのペプチドがHLA抗原と結合して細胞傷害性Tリンパ球を誘導する、アミノ酸配列、ならびに
(ii)以下の特徴のうち一方または両方を有する、(i)のアミノ酸配列:
(a)前記SEQ ID NOのN末端から2番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンからなる群より選択される;および
(b)前記SEQ ID NOのC末端アミノ酸がバリンまたはロイシンからなる群より選択される。
(i)1個、2個または数個のアミノ酸が置換されているSEQ ID NO:21〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、そのペプチドがHLA抗原と結合して細胞傷害性Tリンパ球を誘導する、アミノ酸配列、ならびに
(ii)以下の特徴のうち一方または両方を有する、(i)のアミノ酸配列:
(a)前記SEQ ID NOのN末端から2番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンからなる群より選択される;および
(b)前記SEQ ID NOのC末端アミノ酸がバリンまたはロイシンからなる群より選択される。
これらのペプチドがAPCと接触するかまたはその中に導入されると、これらのペプチドはAPCにおいてプロセシングを受けて(i)、(ii)、(i')および(ii')のペプチドがその表面に提示される。
HLAクラスIおよびHLAクラスII結合ペプチドの例は当業者に公知であり(例えば、Coulie, Stem Cells 13:393-403, 1995を参照)、本明細書に開示したものと同様の様式で本発明に関連して用いることができる。当業者は、1つもしくは複数のECT2ペプチドおよび1つもしくは複数の非ECT2ペプチドを含むポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸を、従来の分子生物学の手順を用いて調製することができる。
直接的にまたはポリトープを形成する隣接配列の使用を介して、このようなペプチドを1つに結びつけることができ、ポリトープのワクチンとしての使用は当技術分野において周知である(例えば、Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849, 1995;Gilbert et al., Nature Biotechnol. 15(12):1280-1284, 1997;Thomson et al., J Immunol. 157(2):822-826, 1996;Tarn et al., J Exp. Med. 171(1):299-306, 1990を参照)。さまざまな数および組み合わせのエピトープを含むポリトープを調製して、CTLによる認識、および免疫応答を増大させる効力に関して試験することができる。
例えば、ポリペプチドのインビボ安定性を高めるために、D−アミノ酸、アミノ酸模倣物、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野では公知である;この考え方を本ポリペプチドに取り入れてもよい。ポリペプチドの安定性は、さまざまな方法でアッセイしてもよい。例えば、ペプチダーゼ、ならびにヒト血漿および血清などのさまざまな生体媒質を用いて、安定性を試験することができる(例えば、Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302を参照)。
a:本発明のペプチドの少なくとも1つのアミノ酸残基の置換、挿入、欠失、または付加を行う段階;
b:前記ペプチドの活性を決定する段階;および
c:元のものと比較して同じまたはより高い活性を有するペプチドを選択する段階。
本明細書において、このような活性には、MHC結合活性、APCまたはCTLの誘導能、および細胞傷害活性が含まれ得る。
本明細書において、本発明のペプチドが「ECT2ペプチド」または「ECT2ポリペプチド」と記載される場合もある。
本発明のペプチドは、周知の手法を用いて調製することができる。例えば、本ペプチドを、組換えDNA技術または化学合成によって合成的に調製してもよい。本発明のペプチドは、個別にまたは2つもしくはそれ以上のペプチドを含むより長いペプチドとして合成してもよい。本ペプチドを単離してもよく、すなわち、天然に存在する他の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片も、いかなる他の化学物質も実質的に含まないように精製または単離してもよい。
(i)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
(ii)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;
(iii)「ペプチド合成」(日本語), 丸善., 1975;
(iv)「ペプチド合成の基礎と実験」(日本語), 丸善, 1985;
(v)医薬品の開発(第2版)(日本語), 丸善, 第14巻 (ペプチド合成), 広川書店, 1991;
(vi)WO99/67288号;および
(vii)Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
本発明はまた、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供する。これらには、天然のECT2遺伝子(GenBankアクセッション番号AY376439(例えば、SEQ ID NO:41))に由来するポリヌクレオチド、およびそれらの保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するものが含まれる。本明細書において、「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一または本質的に同一なアミノ酸配列をコードする配列のことを指す。遺伝暗号の縮重性のために、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。このため、あるコドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを変化させずに、そのコドンを記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は、当技術分野において「サイレント変異」と称され、保存的に改変された変異の一種を表すものである。ペプチドをコードすると本明細書中に記載されたあらゆる核酸配列は、その核酸のあらゆる可能なサイレント変異についても述べている。当業者は、核酸内の各コドン(通常はメチオニンの唯一のコドンであるAUG、および通常はトリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除く)を改変して、機能的に同一な分子を作製し得ることを容易に理解するであろう。したがって、開示されたペプチドをコードする各ヌクレオチド配列は、それに付随するサイレント変異の非明示的な開示でもある。
本発明のポリヌクレオチドは、DNA、RNAおよびそれらの誘導体で構成され得る。当技術分野において周知であるように、DNA分子は天然の塩基A、T、C、およびGなどの塩基で適切に構成され、RNAではTがUに置き換えられる。当業者は非天然塩基も同様にポリヌクレオチドの中に含まれることを認識しているであろう。
本発明はさらに、本発明のペプチドとHLA抗原との間で形成された複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと呼ばれる細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば公表特許公報 特表平11−510507号およびWO99/03499号に詳述された方法を用いることによって調製してもよく、治療および/または予防の対象となる患者から得られたAPCを用いて調製してもよい。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様に、ワクチンとして接種することができる。
A2型のHLA抗原を本発明のエキソソーム用に用いる場合には、SEQ ID NO:1〜40のいずれか1つの配列を有するペプチドが特に有用である。
本発明はまた、HLA抗原と本発明のペプチドとによって形成された複合体を自身の表面上に提示する、単離されたAPCも提供する。APCは、治療および/または予防の対象となる患者由来のものであってよく、単独で、または本発明のペプチド、エキソソームもしくはCTLを含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与してもよい。
これらのAPCは特定の種類の細胞には限定されず、これには、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている、樹状細胞(DC)、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、B細胞および活性化T細胞が含まれる。DCはAPCの中で最も強力なCTL誘導活性を有する代表的なAPCであるため、DCは本発明のAPCとして利用される。
a:第1の対象からAPCを収集する段階;
b:段階aのAPCを本ペプチドと接触させる段階;および
c:段階bのAPCを第2の対象に投与する段階。
本発明はまた、APCを誘導するための薬学的組成物を製造するための方法または工程も提供し、本方法は、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含む。
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導されたCTLは、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を増強させ、それ故にペプチドと同様にワクチンとして用いることができる。したがって、本発明はまた、本ペプチドのいずれかによって特異的に誘導または活性化された、単離されたCTLも提供する。
そのようなCTLは、(1)本発明のペプチドを対象に投与すること、または(2)対象由来のAPC、およびCD8陽性細胞、もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させる(本発明のペプチドで刺激する)こと、または(3)CD8陽性細胞もしくは末梢血単核白血球を、HLA抗原と前記ペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するAPCもしくはエキソソームとインビトロで接触させること、または(4)本発明のペプチドと結合するT細胞受容体(TCR)サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入すること、によって得てもよい。そのようなAPCまたはエキソソームは上記の方法によって調製してもよく、(4)の方法の詳細は、以下の「VIII.T細胞受容体(TCR)」の項で説明する。
本発明はまた、T細胞受容体(TCR)のサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、およびそれを用いる方法も提供する。TCRサブユニットは、ECT2を提示する腫瘍細胞に対する特異性をT細胞に付与するTCRを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を用いることによって、本発明の1つまたは複数のペプチドで誘導されたCTLのTCRサブユニットとしてα鎖およびβ鎖の核酸を同定することができる(WO2007/032255号、およびMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003))。例えば、TCRを分析するためにはPCR法が好ましい。分析のためのPCRプライマーは、例えば、5'側プライマーとして、5'−Rプライマー(5'−gtctaccaggcattcgcttcat−3')(SEQ ID NO:43)、および3'側プライマーとして、TCRα鎖C領域に対して特異的な3−TRa−Cプライマー(5'−tcagctggaccacagccgcagcgt−3')(SEQ ID NO:44)、TCRβ鎖C1領域に対して特異的な3−TRb−C1プライマー(5'−tcagaaatcctttctcttgac−3')(SEQ ID NO:45)、またはTCRβ鎖C2領域に対して特異的な3−TRβ−C2プライマー(5'−ctagcctctggaatcctttctctt−3')(SEQ ID NO:46)であってよいが、これらには限定されない。派生TCRは、ECT2ペプチドをディスプレイする標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ任意で、ECT2ペプチドを提示する標的細胞の効率的な死滅をインビボおよびインビトロで媒介することができる。
また、本発明は、HLA−A2との関連においてECT2ペプチド、例えばSEQ ID NO:1〜40などと結合するTCRサブユニットポリペプチドをコードする核酸による形質導入によって調製されるCTLも提供する。
形質導入されたCTLは、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、かつ周知の培養法によってインビトロで増殖させることができる(例えば、Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989))。本発明のCTLは、治療または防御を必要とする患者において、がんを治療または予防する上で有用な免疫原性組成物を形成するために用いてもよい(WO2006/031221号)。
ECT2の発現は、正常組織と比較して、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、CML、結腸直腸がん、食道がん、NSCLC、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびSCLCなどのがんで特異的に増大しているため、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドは、がんの治療および/もしくは予防のため、ならびに/またはその術後再発の予防のために用いることができる。したがって、本発明は、がんの治療および/もしくは予防、ならびに/またはその術後再発の予防のための薬学的物質または組成物を提供し、そのような剤、物質、または組成物は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの1つまたは複数を有効成分として含む。あるいは、薬学的物質または組成物として用いるために、前記のエキソソームまたはAPCなどの細胞のいずれかの表面上に、本ペプチドを発現させることもできる。加えて、本発明のペプチドのいずれかを標的とする前述のCTLを、本薬学的物質または組成物の有効成分として用いることもできる。
本発明の薬学的な剤、物質、または組成物は、ヒト、ならびにマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含む任意の他の哺乳動物を含むがこれに限定されない対象または患者において、がんを治療および/もしくは予防するため、ならびに/または術後のその再発を予防するために用いることができる。
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸;
(c)本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸;
(c)本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸;
(c)本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸;
(c)本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
本薬学的物質または組成物は、前述の有効成分に加えて、がん性細胞に対するCTLを誘導する能力を有する他のペプチド、そのような他のペプチドをコードする他のポリヌクレオチド、そのような他のペプチドを提示する他の細胞なども含み得る。本明細書において、がん性細胞に対するCTLを誘導する能力を有する他のペプチドは、がん特異的抗原(例えば、同定されたTAA)によって例示されるが、それらには限定されない。
本明細書において特に言及した成分に加えて、本発明の薬学的物質または組成物は、当該の製剤の種類を考慮した上で、当技術分野において慣例的な他の物質または組成物も含み得ることが理解されるべきである。
薬学的組成物を、必要に応じて、有効成分を含む1つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置の中に提供することができる。パックは、例えば、ブリスターパックのように金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する指示書を添付することができる。
本発明のペプチドは、薬学的物質もしくは組成物として直接投与することができ、または必要であれば、従来の製剤化法によって製剤化してもよい。後者の場合には、本発明のペプチドに加えて、薬物用に通常用いられる担体、添加剤などを特に限定せずに適宜含めることができる。そのような担体の例には、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液などがある。その上、薬学的物質または組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存料、界面活性剤などを含み得る。本発明の薬学的物質または組成物は、抗がん目的に用いることができる。
さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤を好都合に用いてもよい。
本発明の薬学的な剤、物質、または組成物はまた、本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸を含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現することを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドには、標的細胞のゲノムへの安定した挿入が達成されるように、必要なものを備えさせることができる(相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8;米国特許第5,580,859号;第5,589,466号;第5,804,566号;第5,739,118号;第5,736,524号;第5,679,647号;およびWO98/04720も参照されたい)。DNAに基づく送達技術の例には、「裸のDNA」、促進された(ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性)送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性(「遺伝子銃」)または圧力媒介性の送達が含まれる(例えば、米国特許第5,922,687号を参照されたい)。
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて、APCおよびCTLを調製または誘導することができる。本発明のエキソソームおよびAPCを用いて、CTLを誘導することもできる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびAPCは、CTL誘導能を他の化合物が阻害しない限り、該化合物と組み合わせて用いることができる。したがって、前述の本発明の薬学的な物質または組成物のいずれかを用いてCTLを誘導することができる。それに加えて、前記ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものを用いて、以下に説明するように、APCを誘導することもできる。
本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、高いCTL誘導能を有するAPCを誘導する方法を提供する。
本発明の方法は、APCを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階を含む。例えば、APCを該ペプチドとエクスビボで接触させる方法は、以下の段階を含み得る:
a:対象からAPCを回収する段階;および
b:段階aのAPCを該ペプチドと接触させる段階。
a:対象からAPCを収集する段階:および
b:本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階。
段階bは、「VI.抗原提示細胞」の項に上述した通りに行うことができる。
(a)インビトロ、エクスビボ、またはインビボで、APCを本発明のペプチドと接触させる段階;および
(b)本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階。
本発明はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、またはAPCを用いて、CTLを誘導するための方法も提供する。
本発明はまた、本発明のペプチドとHLA抗原との複合体を認識するT細胞受容体(TCR)サブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いてCTLを誘導するための方法も提供する。好ましくは、CTLを誘導するための方法は、以下の中から選択される少なくとも1つの段階を含んでもよい:
(a)HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞および/またはエキソソームと、CD8陽性T細胞を接触させる段階、ならびに
(b)本発明のペプチドとHLA抗原との複合体を認識するTCRサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、CD8陽性細胞に導入する段階。
a:対象からAPCを収集する段階;
b:段階aのAPCをペプチドと接触させる段階;および
c:段階bのAPCをCD8陽性細胞と共培養する段階。
上記の段階cにおいてCD8陽性細胞と共培養するAPCを、上記の「VI.抗原提示細胞」の項に記載されているように、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子をAPCに移入することによって調製することもできるが、本発明はそれらには限定されず、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を表面上に有効に提示するあらゆるAPCを範囲に含む。
加えて、本発明は、CTLを誘導する薬学的物質または組成物を製造するための方法または工程を提供し、本方法は、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含む。
さらに、本発明は、ECT2と関係のある疾患に対して免疫応答を誘導する方法を提供する。適した疾患にはがんが含まれてよく、その例には、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、CML、結腸直腸がん、食道がん、NSCLC、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびSCLCが含まれるが、これに限定されない。
本発明はまた、免疫応答を誘導する薬学的物質または組成物を製造するための方法または工程も提供し、本方法は、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含み得る。
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸;
(c)本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPCもしくはエキソソーム;または
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
i)治療しようとするがんを有する対象から得られた細胞または組織におけるECT2の発現レベルを決定する段階;
ii)ECT2の発現レベルを正常対照と比較する段階;および
iii)上記の(a)〜(d)から選択される少なくとも1つの構成成分を、正常対照と比較してECT2を過剰発現するがんを有する対象に投与する段階。
本発明によれば、対象から得られた細胞または組織におけるECT2の発現レベルを測定することができる。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写(核酸)産物レベルで測定することができる。例えば、ECT2のmRNAを、ハイブリダイゼーション法(例えば、ノーザンハイブリダイゼーション)によって、プローブを用いて定量することができる。検出は、チップ、アレイなどの上で行うことができる。アレイの使用は、ECT2の発現レベルを検出するのに好ましいと考えられる。当業者は、ECT2の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ECT2のcDNAをプローブとして用いることができる。必要であれば、プローブを、色素、蛍光物質および同位体といった適した標識で標識してもよく、遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
さらに、増幅に基づく検出法(例えば、RT−PCR)により、プライマーを用いて、ECT2の転写産物(例えば、SEQ ID NO:42)を定量してもよい。そのようなプライマーは、遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。
がん細胞における標的遺伝子、例えばECT2遺伝子の発現レベルは、そのレベルが、標的遺伝子の対照レベル(例えば、正常細胞におけるレベル)から、例えば10%、25%、もしくは50%増大しているか;または1.1倍を上回って、1.5倍を上回って、2.0倍を上回って、5.0倍を上回って、10.0倍を上回って、もしくはそれ以上に増大している場合に、増大していると判定することができる。
ECT2遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、またはがん性対照レベルと類似している/同等である場合、該対象は治療すべきがんを有すると診断され得る。
(a)治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた細胞または組織中のECT2の発現レベルを決定する段階;
(b)ECT2の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階;
(c)ECT2の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階;および
(d)段階(c)において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
(a)治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた細胞または組織中のECT2の発現レベルを決定する段階;
(b)ECT2の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階;
(c)ECT2の発現レベルががん性対照レベルと類似しているか、または同等である場合に、該対象を治療すべきがんを有すると診断する段階;および
(d)段階(c)において対象が治療すべきがんを有すると診断される場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
(a)ECT2遺伝子のmRNAを検出するための試薬;
(b)ECT2タンパク質またはその免疫学的断片を検出するための試薬;および
(c)ECT2タンパク質の生物活性を検出するための試薬。
本発明の部分ペプチドの例には、本発明のタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも8個、好ましくは15個、およびより好ましくは20個の連続したアミノ酸から構成されるポリペプチドが含まれる。本発明のタンパク質またはペプチド(ポリペプチド)を用いて試料(例えば、血液、組織)中の抗体を検出することにより、がんを診断することができる。本発明のタンパク質およびペプチドを調製するための方法は、上記の通りである。
詳細には、公知の方法に従って(例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6を参照されたい)、放射標識HLA分子と本発明のペプチドとの四量体などのオリゴマー複合体を調製することができる。この複合体を用いて、例えば、がんに罹患している疑いのある対象に由来する末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的CTLを定量することにより、診断を行うことができる。
(a)免疫原を、該免疫原に対して特異的なCTLの誘導に適した条件下で免疫担当細胞と接触させる段階;
(b)段階(a)で誘導されたCTLの誘導レベルを検出または決定する段階;および
(c)対象の免疫学的応答をCTL誘導レベルと相関させる段階。
いくつかの態様において、ペプチドがん療法によって治療される対象の免疫学的応答をモニターまたは評価する段階は、治療前、治療中、および/または治療後に行うことができる。一般に、がん療法プロトコール中、免疫原性ペプチドは、治療される対象に繰り返し投与される。例えば、免疫原性ペプチドを3〜10週間にわたって毎週投与してもよい。したがって、対象の免疫学的応答は、がん療法プロトコール中に評価またはモニターされ得る。あるいは、がん療法に対する免疫学的応答を評価またはモニターする段階が、療法プロトコールの完了時であってもよい。
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は本発明のペプチドに特異的に結合し、本発明のペプチドではないものには結合しない(または弱く結合する)。あるいは、抗体は本発明のペプチドおよびその相同体に結合する。本発明のペプチドに対する抗体は、がんの診断および予後診断のアッセイ、ならびに画像化方法論において使用され得る。同様に、そのような抗体は、ECT2ががん患者において同じく発現または過剰発現する限り、他のがんの治療、診断、および/または予後診断において使用され得る。さらに、細胞内で発現する抗体(例えば、一本鎖抗体)は、ECT2の発現が関与するがんの治療において治療上の使用を見出すことができ、そのようながんの例には、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、CML、結腸直腸がん、食道がん、NSCLC、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびSCLCが含まれるが、これらに限定されない。
本発明はまた、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの任意の形態で用いることができ、これには、ウサギなどの動物を本発明のペプチドで免疫することにより得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組換えにより作製されたヒト化抗体が含まれる。
本発明によれば、免疫抗原として用いられるペプチドは、完全なタンパク質または該タンパク質の部分ペプチドであってよい。部分ペプチドは、例えば、本発明のペプチドのアミノ(N)末端断片またはカルボキシ(C)末端断片を含み得る。
任意の哺乳動物を抗原で免疫することができるが、細胞融合に用いられる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯目(Rodentia)、ウサギ目(Lagomorpha)、または霊長目(Primate)科の動物を使用することができる。齧歯目科の動物には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目科の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目科の動物には、例えばカニクイザル(Macaca fascicularis)、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目(Catarrhini)(旧世界ザル)のサルが含まれる。
公知の方法、例えば、Milstein et al.(Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981))の方法に従って、上記の免疫細胞と骨髄腫細胞とを融合させることができる。
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技法を用いて組換えにより調製することもできる(例えば、MacMillan Publishers LTD (1990)により英国で刊行された、Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodiesを参照されたい)。例えば、抗体をコードするDNAを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製された組換え抗体を提供する。
抗体は、ポリエチレングリコール(PEG)などの様々な分子との結合によって修飾することができる。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾法は、当技術分野で慣例的である。
本発明によるペプチドを検出または測定する方法はペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法は、該ペプチドを使用する種々の実験において使用され得る。
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドが導入されたベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明のベクターは、宿主細胞中に本発明のヌクレオチド、特にDNAを保持するため、本発明のペプチドを発現させるため、または遺伝子治療用に本発明のヌクレオチドを投与するために使用することができる。
以下の実施例は、本発明を説明するため、ならびに本発明の作製および使用において当業者を支援するために提示される。本実施例は、本発明の範囲を別に限定することを決して意図するものではない。
細胞株
ヒトBリンパ芽球様細胞株であるT2(HLA−A2)およびアフリカミドリザル腎細胞株であるCOS7は、ATCCから購入した。
HLA−A*0201分子と結合するECT2由来の9merおよび10merペプチドを、結合予測ソフトウエア「BIMAS」(www−bimas.citdcrt.nih.gov/cgi−bin/molbio/hla_bindken_parker_comboform)(Parker et al.(J Immunol 1994, 152(1): 163-75)、Kuzushima et al.(Blood 2001, 98(6): 1872-81)を用いて予測した。これらのペプチドを、BioSynthesis(Lewisville, Texas)により、標準的な固相合成法によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製した。該ペプチドの純度(>90%)および同一性を、それぞれ分析用HPLCおよび質量分析によって決定した。ペプチドをジメチルスルホキシドに20mg/mlで溶解し、−80℃で保存した。
単球由来の樹状細胞(DC)を抗原提示細胞として用いて、ヒト白血球抗原(HLA)上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘導した。他所に記載されているように、DCをインビトロで作製した(Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8)。具体的には、Ficoll−Plaque(Pharmacia)溶液によって健常なボランティア(HLA−A*0201陽性)から単離した末梢血単核細胞(PBMC)を、プラスチック製の組織培養ディッシュ(Becton Dickinson)へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。2%の加熱非動化した自己血清(AS)を含むAIM−V培地(Invitrogen)中、1000U/mlの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(R&D System)および1000U/mlのインターロイキン(IL)−4(R&D System)の存在下で、単球が濃縮された集団を培養した。7日間の培養後、サイトカインで誘導したDCに、AIM−V培地中で37℃で3時間、3μg/mlのβ2−ミクログロブリンの存在下で20μg/mlの各合成ペプチドをパルスした。作製された細胞は、自身の細胞表面上に、CD80、CD83、CD86、およびHLAクラスIIなどのDC関連分子を発現しているようであった(データは示さず)。次いで、ペプチドパルスしたこれらのDCをX線照射(20Gy)により不活化し、CD8 Positive Isolation Kit(Dynal)を用いた陽性選択によって得られた自己CD8+T細胞と、1:20の比率で混合した。これらの培養物を48ウェルプレート(Corning)中に準備し、各ウェルは、0.5mlのAIM−V/2%AS培地中に、1.5×104個のペプチドパルスしたDC、3×105個のCD8+T細胞、および10ng/mlのIL−7(R&D System)を含んだ。3日後、これらの培養物に、IL−2(CHIRON)を最終濃度20IU/mlまで添加した。7日目および14日目に、ペプチドパルスした自己DCでT細胞をさらに刺激した。
DCは上記と同じ方法によって毎回調製した。21日目に、3回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたT2細胞に対してCTLを試験した(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9;Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7;Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9;Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。
Riddellら(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44;Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23)によって記載されている方法と類似の方法を用いて、CTLを培養下で増殖させた。40ng/mlの抗CD3モノクローナル抗体(Pharmingen)の存在下で、マイトマイシンCによって不活化した2種類のヒトBリンパ芽球様細胞株と共に、合計5×104個のCTLを25mlのAIM−V/5%AS培地中に懸濁した。培養開始1日後に、120IU/mlのIL−2を該培養物に添加した。5、8、および11日目に、30IU/mlのIL−2を含む新たなAIM−V/5%AS培地を、該培養物に供給した(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9;Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7;Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9;Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。
96丸底マイクロタイタープレート(Nalge Nunc International)においてCTL0.3個、1個、および3個/ウェルとなるように、希釈を行った。CTLを、1×104個細胞/ウェルの2種類のヒトBリンパ芽球様細胞株、30ng/mlの抗CD3抗体、および125U/mlのIL−2と共に、合計150μl/ウェルの5%AS含有AIM−V培地中で培養した。10日後、50μl/ウェルのIL−2を、IL−2の最終濃度が125U/mlに到達するように該培地に添加した。14日目にCTL活性を試験し、上記と同じ方法を用いてCTLクローンを増殖させた(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9;Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。
特異的CTL活性を調べるために、インターフェロン(IFN)−γ酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイおよびIFN−γ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を行った。具体的には、ペプチドパルスしたT2(1×104個/ウェル)を刺激細胞として調製した。48ウェル中の培養細胞を応答細胞として使用した。IFN−γ ELISPOTアッセイおよびIFN−γ ELISAアッセイは、製造業者の手順に従って行った。
標的遺伝子またはHLA−A*0201のオープンリーディングフレームをコードするcDNAをPCRによって増幅した。PCR増幅産物をベクターにクローニングした。製造業者の推奨する手順に従ってリポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いて、標的遺伝子およびHLA−A*0201ヌル細胞株であるCOS7に該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから2日後、トランスフェクトした細胞をベルセン(Invitrogen)を用いて回収し、CTL活性アッセイのための標的細胞(5×104個細胞/ウェル)として使用した。
がんにおけるECT2発現の増強
cDNA−マイクロアレイを用いてさまざまながんから得られた包括的な遺伝子発現プロファイルデータにより、ECT2(GenBankアクセッション番号AY376439;例えば、SEQ ID NO:41)の発現が増大していることが明らかになった。ECT2発現は、膀胱がん19例中17例、乳がん12例中5例、子宮頸がん14例中14例、胆管細胞がん13例中13例、CML 5例中5例、結腸直腸がん8例中7例、食道がん16例中12例、NSCLC 16例中6例、リンパ腫10例中8例、膵がん1例中1例、前立腺がん13例中10例、腎がん6例中3例、およびSCLCがん13例中12例において、対応する正常組織と比較して、確かに増大していた(表1)。
表2aおよび2bは、ECT2のHLA−A02結合性9merおよび10merペプチドを、結合親和性の高い順に示している。エピトープペプチドを判定するために、HLA−A02結合能を有する可能性のある合計40種のペプチドを選択して検討した。
ECT2に由来するペプチドに対するCTLを、「材料および方法」に記載されたプロトコールに従って作製した。ペプチド特異的CTL活性をIFN−γ ELISPOTアッセイによって決定した(図1a〜c)。ECT2−A02−9−34(SEQ ID NO:1)で刺激したウェル番号#6(a)、ECT2−A02−9−664(SEQ ID NO:3)で刺激したウェル#5(b)、およびECT2−A02−10−33(SEQ ID NO:21)で刺激したウェル#1(c)は、対照ウェルと比較して強いIFN−γ産生を明らかに示した。その結果として、ECT2に由来するECT2−A02−9−34(SEQ ID NO:1)(a)、ECT2−A02−9−664(SEQ ID NO:3)(b)、およびECT2−A02−10−33(SEQ ID NO:21)(c)が、強力なCTLを誘導する可能性のあるペプチドとしてスクリーニングされたことが示された。
ECT2−A02−9−34(SEQ ID NO:1)で刺激したウェル番号#6(a)、ECT2−A02−9−664(SEQ ID NO:3)で刺激したウェル番号#5(b)、およびECT2−A02−10−33(SEQ ID NO:21)で刺激した#1(c)においてIFN−γ ELISPOTアッセイによって検出されたペプチド特異的CTL活性を示した細胞を、上記の「材料および方法」の項に記載された通りに増殖させ、限界希釈によってCTL株を樹立した。これらのCTL株のCTL活性をIFN−γ ELISAアッセイによって決定した(図2a〜c)。これらのCTL株は、ペプチドパルス刺激を受けていない標的細胞と比較して、対応するペプチドでパルス刺激された標的細胞に対する強いIFN−γ産生を明らかに示した。さらに、「材料および方法」の項に記載された通りに、CTL株から限界希釈によってCTLクローンを樹立し、ペプチドでパルス刺激された標的細胞に対するCTLクローンからのIFN−γ産生をIFN−γ ELISAアッセイによって決定した。図3では、ECT2−A02−9−34(SEQ ID NO:1)(a)およびECT2−A02−9−664(SEQ ID NO:3)(b)で刺激されたCTLクローンから強いIFN−γ産生が明らかにされた。
これらのペプチドに対して生じた、樹立されたCTL株およびクローンを、ECT2およびHLA−A*0201分子を外因性に発現する標的細胞を認識する能力に関して調べた。完全長のECT2およびHLA−A*0201分子の遺伝子の両方がトランスフェクトされたCOS7細胞(ECT2およびHLA−A*0201遺伝子を外因性に発現する標的細胞の具体的モデルの1つ)に対する特異的CTL活性を、対応するペプチドによって生じたCTL株およびクローンをエフェクター細胞として用いて検査した。完全長のECT2またはHLA−A* 0201のいずれかをトランスフェクトしたCOS7細胞を、対照として調製した。図4において、ECT2−A02−9−34(SEQ ID NO:1)で刺激されたCTLクローン(a)およびECT2−A02−10−33(SEQ ID NO:21)で刺激されたCTL株(b)は、ECT2およびHLA− A* 0201の両方を発現するCOS7細胞に対して強力なCTL活性を示した。一方、対照に対する有意な特異的CTL活性は検出されなかった。したがって、これらのデータにより、ECT2−A02−9−34(SEQ ID NO:1)(a)、ECT2−A02−10−33(SEQ ID NO:21)(b)が、標的細胞上にHLA−A*0201分子とともに自然下で発現され、CTLによって認識されたことが明らかに実証された。これらの結果は、ECT2に由来するECT2−A02−9−34(SEQ ID NO:1)(a)およびECT2−A02−10−33(SEQ ID NO:21)(b)が、ECT2を発現する腫瘍を有する患者を治療するためのがんワクチンとして適している可能性を示している。
ECT2−A02−9−34(SEQ ID NO:1)、ECT2−A02−9−664(SEQ ID NO:3)およびECT2−A02−10−33(SEQ ID NO:21)で刺激されたCTLは、有意かつ特異的なCTL活性を示した。この結果は、ECT2−A02−9−34(SEQ ID NO:1)、ECT2−A02−9−664(SEQ ID NO:3)、およびECT2−A02−10−33(SEQ ID NO:21)の配列が、ヒト免疫系を感作させることが知られている他の分子に由来するペプチドと相同的であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を否定するために、これらのペプチド配列に関する相同性解析を、それをクエリーとしてBLASTアルゴリズム(www.ncbi.nlm.nih.gov /blast/blast.cgi)を用いて行ったところ、有意な相同性を有する配列は認められなかった。この相同性解析の結果は、ECT2−A02−9−34(SEQ ID NO:1)、ECT2−A02−9−664(SEQ ID NO:3)、およびECT2−A02−10−33(SEQ ID NO:21)の配列が固有のものであること、およびしたがって、本発明者らの知る限りでは、これらの分子が何らかの非関連分子に対して意図しない免疫学的応答を引き起こす可能性はほとんどないことを示している。
本発明は、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導することができ、かつ幅広いがんの種類に対する適用可能性を有し得る、新たなTAA、特にECT2に由来するものを提供する。そのようなTAAは、ECT2と関連のある疾患、例えばがん、より詳細には膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、CML、結腸直腸がん、食道がん、NSCLC、リンパ腫、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびSCLCに対するペプチドワクチンとして使用することができる。
Claims (22)
- SEQ ID NO:42のアミノ酸配列またはその免疫学的活性断片からなる単離されたペプチドであって、HLA抗原と結合して細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を誘導する、ペプチド。
- HLA抗原がHLA−A2である、請求項1記載の単離されたペプチド。
- SEQ ID NO:1〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1または2記載の単離されたペプチド。
- (a)HLA抗原と結合して細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を誘導し、かつSEQ ID NO:42のアミノ酸配列またはその免疫学的活性断片からなる、単離されたペプチド、
(b)HLA抗原がHLA−A2である、(a)の単離されたペプチド、
(c)SEQ ID NO:1〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、(a)または(b)の単離されたペプチド、および
(d)改変ペプチドが元のペプチドのCTL誘導能を保持することを条件として、1個、2個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたSEQ ID NO:1〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、(a)または(b)の単離されたペプチド
からなる群より選択される、単離されたペプチド。 - SEQ ID NO:1〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列からなり、以下の特徴の一方または両方を有する、請求項4記載の単離されたペプチド:
(a)N末端から2番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンからなる群より選択される;および
(b)C末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンからなる群より選択される。 - ノナペプチドまたはデカペプチドである、請求項1〜5のいずれか一項記載の単離されたペプチド。
- 請求項1〜6のいずれか一項記載のペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項1〜6のいずれか一項記載の1つもしくは複数のペプチドまたは請求項7記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、CTLを誘導するための組成物。
- 請求項1〜6のいずれか一項記載の1つもしくは複数のペプチドまたは請求項7記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、がんの治療および/または予防および/または術後再発の予防のための薬学的組成物。
- HLA抗原がHLA−A2である対象への投与のために製剤化される、請求項9記載の薬学的組成物。
- がんの治療のために製剤化される、請求項9または10記載の薬学的組成物。
- (a)インビトロ、エクスビボ、またはインビボで、APCを請求項1〜6のいずれか一項記載のペプチドと接触させる段階、および
(b)請求項1〜6のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階
からなる群より選択される段階を含む、CTL誘導能を有する抗原提示細胞(APC)を誘導するための方法。 - (a)HLA抗原と請求項1〜6のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を表面上に提示するAPCと、CD8陽性T細胞を共培養する段階;
(b)HLA抗原と請求項1〜6のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を表面上に提示するエキソソームと、CD8陽性T細胞を共培養する段階;および
(c)請求項1〜6のいずれか一項記載のペプチドと結合したT細胞受容体(TCR)サブユニットのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を、T細胞に導入する段階
からなる群より選択される段階を含む方法によって、CTLを誘導するための方法。 - HLA抗原と請求項1〜6のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を表面上に提示する、単離されたAPC。
- 請求項12記載の方法によって導入される、請求項14記載のAPC。
- 請求項1〜6記載のペプチドのいずれかを標的とする、単離されたCTL。
- 請求項13記載の方法によって誘導される、請求項16記載のCTL。
- がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、請求項1〜6のいずれか一項記載のペプチド、その免疫学的活性断片、または該ペプチドもしくは断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を該対象に投与する段階を含む、方法。
- 請求項1〜6記載のペプチドのいずれかに対する抗体またはその免疫学的活性断片。
- 請求項1〜6記載のペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
- 請求項1〜6記載のペプチド、請求項7記載のヌクレオチド、または請求項19記載の抗体のいずれかを含む、診断キット。
- SEQ ID NO:1、3、および21からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項1〜6のいずれか一項記載の単離されたペプチドまたは請求項7記載のポリヌクレオチドによってコードされるペプチド。
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