JP2013512665A - ポリ(A)RNA及びmRNAを検出及び定量するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
i) ポリ(A)RNAを含有する試料及び/又はmRNAを含有する試料を、蛍光色素及び消光剤を含むポリ(dT)オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、上記消光剤は、上記蛍光色素の発光波長においてポリ(dT)オリゴヌクレオチドにおける蛍光をハイブリダイズ状態及び非ハイブリダイズ状態の両者において同程度で有意に消光する消光剤である、上記工程;
ii) 蛍光シグナルが変化しない状態で、上記ポリ(dT)オリゴヌクレオチドをポリ(A)RNA及び/又はmRNAにハイブリダイズさせる工程;
iii) 工程ii)で得られたハイブリダイゼーション混合物を、一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触させる工程であって、蛍光標識されたヌクレオチドが、ポリ(A)RNA及び/又はmRNAとハイブリダイズしていないポリ(dT)オリゴヌクレオチドから放出され、その結果、蛍光シグナルの増加が生じる、上記工程;
iv) 生じた蛍光シグナルを測定する工程。
ポリ(dT)オリゴヌクレオチドを用いたRNAの検出及び定量
ヒト・ヒーラ(HeLa)細胞培養系から予め単離した、種々の量のトータルRNA(0μg、0.5μg、1μg、2μg)を、5'末端がFAMで標識され、かつ3'末端がTAMRAで標識された、22個のヌクレオチドのポリ(dT)オリゴヌクレオチド0.2μMとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション混合物は、総量20μLのオムニスクリプト(OmniScript)RTバッファー(キアゲン(QIAGEN))中、室温で調製した。次に、20UのエキソヌクレアーゼI(エピセントレ(Epicentre))を氷上のハイブリダイゼーション反応物に直ちに添加し、ロータージーン(Rotorgene)6000リアルタイムPCRサイクラー(キアゲン)において25℃、60分間で、エキソヌクレアーゼ反応を実施した。生じた蛍光シグナルを、励起波長470nm及び検出波長510nmで毎分測定した。
Claims (14)
- 以下の手順工程を含む、ポリ(A)RNA及び/又はmRNAを特異的に検出及び/又は定量するための方法:
i) ポリ(A)RNAを含有する試料及び/又はmRNAを含有する試料を、蛍光色素及び消光剤を含むポリ(dT)オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、上記消光剤は、上記蛍光色素の発光波長においてポリ(dT)オリゴヌクレオチドにおける蛍光をハイブリダイズ状態及び非ハイブリダイズ状態の両者において同程度で有意に消光する消光剤である、上記工程;
ii) 蛍光シグナルが変化しない状態で、上記ポリ(dT)オリゴヌクレオチドをポリ(A)RNA及び/又はmRNAにハイブリダイズさせる工程;
iii) 工程ii)で得られたハイブリダイゼーション混合物を、一本鎖特異的ヌクレアーゼと接触させる工程であって、蛍光標識されたヌクレオチドが、ポリ(A)RNA及び/又はmRNAとハイブリダイズしていないポリ(dT)オリゴヌクレオチドから放出され、その結果、蛍光シグナルの増加が生じる、上記工程;
iv) 生じた蛍光シグナルを測定する工程。 - 上記ポリ(dT)オリゴヌクレオチドが(dT)ヌクレオチドのみで構成されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 上記ポリ(dT)オリゴヌクレオチドが、異なる種類の ポリ(dT)含有オリゴヌクレオチドの混合物であって、それら異なる種類のポリ(dT)含有オリゴヌクレオチドは、それらの3’末端に、(dT)ヌクレオチドではない少なくとも1つのさらなるヌクレオチドを有することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 上記ポリ(dT)オリゴヌクレオチドが、10個から100個のヌクレオチド範囲の長さを有することを特徴とする、請求項1から3の何れか1項に記載の方法。
- 上記ポリ(dT)オリゴヌクレオチドが、18個から25個のヌクレオチド範囲の長さを有することを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 上記ポリ(dT)オリゴヌクレオチドにおける蛍光色素と消光剤との間の距離が、最大で30ヌクレオチドであることを特徴とする、請求項1から4の何れか1項に記載の方法。
- 上記ポリ(dT)オリゴヌクレオチドにおける蛍光色素及び消光剤が、当該オリゴヌクレオチドの各反対側の末端に結合していることを特徴とする、請求項1から6の何れか1項に記載の方法。
- 上記蛍光色素が、6−FAM、6−JOE、アレクサ・フロー(Alexa Fluor)568、アレクサ・フロー(Alexa Fluor)633、アレクサ・フロー(Alexa Fluor)680、ボディピィ(Bodipy)、CALフロー(CAL Fluor)、CALフロー・レッド(CAL Fluor Red)610、TAMRA、HEX、オレゴン・グリーン(Oregon Green)、TET、テキサス・レッド(Texas Red)、マリーナ・ブルー(Marina Blue)、エダンズ・ボセル・ブルー(Edans Bothell Blue)、フルオレセイン、ヤキマ・イエロー(Yakima Yellow)、グロッド(Glod)540、Cy3.5及びCy5を含む群から選択されることを特徴とする、請求項1から7の何れか1項に記載の方法。
- 上記消光剤が、DABCYL、BHQ1、BHQ2及びTAMRAを含む群から選択されることを特徴とする、請求項1から7の何れか1項に記載の方法。
- 上記一本鎖特異的ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 上記一本鎖特異的ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼT及びRecJを含む群から選択されるか、又はこれらヌクレアーゼの混合物であることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 上記一本鎖特異的エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼI若しくはエキソヌクレアーゼTであるか、又はこれらエキソヌクレアーゼの混合物であることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 上記一本鎖特異的ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 上記一本鎖特異的エンドヌクレアーゼが、S1ヌクレアーゼ若しくはマング・ビーン・ヌクレアーゼ(mung bean nuclease)、又はこれらエンドヌクレアーゼの混合物であることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
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