JP2013511987A - ヒト胚性および人工多能性幹細胞の分化 - Google Patents

Abstract

本発明は、多能性未分化ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣを軟骨形成細胞系譜の細胞に段階的かつ均一に分化させることができる培養系、培養方法および培養条件に関する。

Description

本発明は一般的に、ヒト胚性および人工多能性幹細胞の分化を軟骨系譜に誘導する方法に関する。

米国で最も多く見られる消耗性の慢性健康障害の１つに軟骨の変性疾患、たとえば、変形性関節症がある。軟骨変性疾患の処置は、組織の自己修復能が乏しいため特に臨床上の課題になっている。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、複数の細胞型に分化する能力および無限の自己複製能を有するので、軟骨欠損を修復する強力なツールになる可能性がある。ｈＥＳＣが病変および損傷軟骨を修復する可能性を実現するには、ｈＥＳＣの軟骨形成細胞系譜（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ）への分化を誘導する方法を開発する必要がある。

ＥＳＣ由来の細胞が様々な程度で軟骨細胞に分化するいくつかの培養系が開発されているが、これらの系では軟骨細胞分化（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）が均一ではなく、軟骨細胞は、分化する細胞の亜集団のみであり、軟骨修復のために細胞集団を利用することが難しくなっている。以下に記載する本発明の以前には、軟骨細胞分化のプロトコルは、ＥＳＣ由来の胚様体（ＥＢ）の細胞を利用していた。こうした従来の方法の欠点は、ＥＢ由来の細胞の細胞の不均一性により、軟骨修復に使用し得る軟骨形成細胞の均質な集団が得にくくなることである。

本発明は、こうした従来の方法に伴う問題の多くを解決するものであり、１つには、前もってＥＢ形成を形成せずに、幹細胞、たとえば未分化多能性ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣまたはｉＰＳ細胞）が軟骨形成細胞系譜へと段階的に実質的に均一に分化するのを迅速かつ直接誘導する培養系および培養条件に基づくものである。また、この方法では臍帯血または羊水から採取した幹細胞も使用する。この方法を用いて作製される、規定の分化段階の実質的に純粋な軟骨形成細胞は、従来の方法に伴う細胞不均一性（組織型および分化の段階に関する）の問題および欠点に対する解決策となる。本明細書に記載の細胞集団は、非軟骨形成細胞を実質的に含まない。たとえば、この集団は、軟骨形成細胞を少なくとも８５％、９５〜９８％、および最大９９％または１００％含む。本発明はまた、ＥＳＣの軟骨形成細胞系譜への分化の進行を促進し、かつ軟骨細胞分化の均一性の達成に寄与する高密度培養条件、および追加手順も提供する。

胚様体は、ＥＳＣまたはｉＰＳＣ由来の細胞の凝集塊である。こうした凝集塊、すなわちＥＢは、培養物の目視検査で確認される。凝集（ＥＢの形成）すると、分化が開始される。ＥＢは、成人生体に存在する細胞型の全部を生じさせる胚の３胚葉すべてに由来する複数の細胞型に分化する。本発明の以前、ｈＥＳＣ由来の軟骨形成前駆細胞の集団を産生する従来の方法の欠点は、非軟骨形成細胞の混入、すなわち、ＥＢが所望の標的系譜（軟骨形成細胞系譜）以外の系譜に分化して産生された非軟骨形成細胞の混入であった。本明細書に記載の方法はＥＢ形成を回避するため、得られる軟骨形成前駆細胞には、実質的に他の系譜の細胞が混入しない。この方法は、培養中のＥＢが非軟骨形成組織／細胞に分化するという問題を解決する。従来の方法は、混入している望ましくない細胞を除去する必要があったため、本明細書に記載のプロセスは、従来の方法に比べより効率的かつ高速であるうえ、費用効果に優れている。

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を軟骨形成細胞に直接分化させる方法は、ＥＢを実質的に含まないｈＥＳＣの集団を支持体上に用意し、ｈＥＳＣを前記支持体から剥離して前記ｈＥＳＣを分離し、ｈＥＳＣの高密度マイクロマス培養を樹立し、集団を骨形成タンパク質と接触させることにより、ｈＥＳＣが軟骨形成細胞の実質的に均一な集団に直接分化することにより行われる。同様に、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を軟骨形成細胞に直接分化させる方法は、ＥＢを実質的に含まないｉＰＳＣの集団を支持体上に用意し、ｉＰＳＣを支持体から剥離してｉＰＳＣを分離し、ｉＰＳＣの高密度培養を樹立し、ｉＰＳＣを骨形成タンパク質と接触させてｉＰＳＣの軟骨形成細胞系譜への分化を誘導することにより行われる。ｉＰＳＣは軟骨形成細胞の実質的に均一な集団に直接分化する。

一態様では、本明細書に記載の培養系および培養条件は、実質的に均一な軟骨分化を約１週間または２週間未満の内に、たとえば、約２日〜約３日未満、約３日〜約４日未満、約５日〜約６日未満、約６日〜約７日未満、約７日〜約８日未満、約８日〜約９日未満、約９日〜約１０日未満、約１０日〜約１１日未満、約１１日〜約１２日未満、約１２日〜約１３日未満、または約１３日〜約１４日未満の内に促進する。別の態様では、本発明の培養系および培養条件は、未分化多能性ヒト胚性幹細胞の少なくとも約５０〜１００％が軟骨形成細胞系譜に分化するように、たとえば、未分化多能性ヒト胚性幹細胞の少なくとも約５０〜６０％、少なくとも約６０〜７０％、少なくとも約７０〜８０％、少なくとも約８０〜９０％、または少なくとも約９０〜１００％が軟骨形成細胞系譜に分化するように非常に均一な分化を促進する。好ましくは、この集団は、軟骨形成細胞を９５％含み、一層好ましくは、集団は軟骨形成細胞を９８％含む。

分化の段階は、時間的に、あるいは、一連の遺伝子マーカーの発現により説明される。時間（日数）は、ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣの高密度培養の樹立後の期間を示すものである。ゼロ時は、細胞濃度または密度を１０μｌ当たり少なくとも１×１０５細胞に調節する時点である。「２日」の細胞は、高密度コロニーの樹立後２日間培養した細胞である。高密度培養は、１０μｌ当たり少なくとも１×１０５の濃度で細胞を含む。たとえば、２〜３日の細胞は、軟骨系譜（すなわち、軟骨前駆体）に入ったばかりであることを特徴とし、４日目の細胞は、軟骨細胞分化の初期相（すなわち、初期の軟骨細胞）にあり、７〜１４日の細胞は、軟骨細胞への明らかな分化を均一に示すものの、肥大成熟化を示していない（すなわち、細胞は、十分に分化した軟骨細胞であることを特徴とする）（図１４）。

本発明は、軟骨形成細胞系譜に入ったばかりの細胞から、明らかに分化した軟骨細胞に及ぶ様々な相の軟骨形成細胞系譜におけるｈＥＳＣ由来の前駆体細胞の特徴付けについて記載する。様々な相の軟骨形成細胞系譜におけるｈＥＳＣ由来の前駆体細胞について、細胞ベースの組織工学治療により軟骨を修復する能力を解析する。

ｈＥＳＣの軟骨細胞分化を促進する条件は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の均一な軟骨分化も促進する。本発明はまた、患者由来のｉＰＳＣの軟骨細胞分化を誘導する方法も提供する。たとえば、患者個人を考慮した治療アプローチにｉＰＳＣ由来の軟骨形成前駆細胞（自家細胞）を使用する。別の例では、本方法を用いて細胞および細胞株を作製して、疾患のメカニズムを研究するため、軟骨異形成症などの軟骨の遺伝子性障害の基本的なメカニズムを解明する研究ツールとして使用するほか、細胞を使用して治療薬のスクリーニングも行う。

上記で論じたように、ｈＥＳＣの軟骨細胞分化を促進する条件は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、すなわち、再プログラム化されて多能性状態にある体細胞の均一な軟骨分化も促進する。ｉＰＳＣが軟骨形成細胞系譜に信頼性高く直接かつ均一に分化すれば、患者特異的な自家細胞治療が可能になる。したがって、軟骨欠損の修復には、ｈＥＳＣ由来の
前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）だけでなく、ｉＰＳＣ由来の軟骨形成前駆体細胞も使用される。

本発明の培養系および培養条件は、胚様体（ＥＢ）由来の細胞を細胞ベースの軟骨修復治療に使用しにくくしている細胞の不均一性を回避する。この方法は直接かつ均一な分化を促進し、ＥＢ段階を回避するため、規定の分化段階、すなわち、初期と後期の細胞集団を確実に生じさせる。遺伝子発現プロファイリングを行えば、軟骨形成細胞系譜に入ったばかりの細胞から、明らかに分化した軟骨細胞に及ぶ様々な段階の軟骨形成細胞系譜におけるｈＥＳＣ由来の前駆体細胞を同定することができる。初期相の軟骨形成細胞系譜の細胞（たとえば、Ｓｏｘ９などの初期軟骨マーカーを含む）は、分化を続けるだけでなく、移植患者に移植された後にｉｎ ｓｉｔｕで局所微小環境のシグナルに応答するため、系譜の後期の細胞と比べ、軟骨修復に関与するのに望ましい。軟骨形成細胞系譜の後期の細胞（たとえば、細胞がより明らかに分化したことを示すマーカー、アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）などの軟骨マーカーを含む）は、軟骨修復／再建手順に好適である。このため、本方法は、様々な分化の段階および異なる系譜の不均一な細胞集団を生じる従来の方法と異なり、段階的に生じた細胞の供給源を提供し、処置される病状に最も適した分化の段階に基づき治療を個々に合わせることを可能にする。

本発明はまた、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの軟骨形成細胞系譜への分化の進行を促進し、かつ軟骨細胞分化の均一性の達成に寄与する条件および追加手順も提供する。こうした改変には、（１）高密度培養から分離したｈＥＳＣの維持（ＥＢは存在しない）、（２）増殖因子、特にＢＭＰ−２およびＴＧＦβ−１を含む培養物の補充、（３）マウス胚性線維芽細胞のフィーダー層上ではなく、高分子もしくはゼラチン支持体またはスキャフォールド上、あるいは高分子もしくはゼラチン支持体またはスキャフォールド内でのｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの培養、（４）マイクロマス培養物を調製する前にトリプシンではなく、Ａｃｃｕｔａｓｅ、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔまたは他の酵素を使用してｈＥＳＣを分離すること、ならびに、（５）マイクロマス培養の樹立において分離に伴うアポトーシスを減弱するＲｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の適用が含まれる。好適な高分子もしくはゼラチン支持体またはスキャフォールド材料として、基底膜支持体（たとえばマトリゲル、Ｃｈｏｎｄｒｏｇｉｄｅ）、コラーゲンもしくはゼラチン、ヒアルロナン（たとえばＨｙａｆｆｌ １またはＨｙＳｔｅｍＣ）もしくはキトサンを含むヒドロゲルまたはスポンジ、またはＰＥＧ（ポリエチレングリコール）もしくはＰＬＧＡ（ポリラクチカシドグリオリト酸）スキャフォールド、あるいは細胞外マトリックス成分を含む任意の支持体が挙げられる。

具体的には、本発明は、無血清培地を用いてｈＥＳＣを支持体上で培養し、ｈＥＳＣを支持体から剥離してｈＥＳＣを分離し、無血清培地を用いてｈＥＳＣを高密度培養（マイクロマスまたはペレット）として培養し、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２；ＮＧ＿０２３２３３（ＧＩ：３０００６８９２０））、参照によって本明細書に援用する）をマイクロマス培養基に投与することにより、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の軟骨形成細胞系譜への分化を誘導する方法を提供する。ｈＥＳＣは、ＥＢを実質的に含まない。好ましくは、ｈＥＳＣは、ＥＢをまったく含まない。ＢＭＰ２は、ｈＥＳＣの高密度マイクロマス培養から１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、または９６時間後に投与する。好ましくは、増殖因子（単数または複数）は、高密度細胞培養の樹立から４８時間後に加える。あるいは、ＢＭＰ−２およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ；ＮＭ＿０００６６０（ＧＩ：２６０６５５６２１））、参照によって本明細書に援用する）を一緒に加える。ＢＭＰ２の濃度は、２５〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲であり、ＴＦＧβ１の濃度は、２．５〜２０ｎｇ／ｍｌの範囲である。ＢＭＰとＴＧＦとの比率は約５：１〜２０：１であり、好ましくは約１０：１である。

ｈＥＳＣは、高密度マイクロマス培養としてｈＥＳＣを培養する前にトリプシン、ＴｒｙｐＬＥ ＳｅｌｅｃｔまたはＡｃｃｕｔａｓｅなどの分離剤と接触させる。任意に、ｈＥＳＣ培養の支持体は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を含むフィーダー層である。あるいは、ｈＥＳＣ培養の支持体は、人工基底膜材料（たとえば、マトリゲル）などのゼラチン組成物、または他の好適な支持体またはスキャフォールドである。一態様では、この方法は、トランスフォーミング増殖因子β−１（ＴＧＦβ１）をマイクロマス培養基に投与することをさらに含む。任意に、この方法は、Ｒｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の投与をさらに含む。

一態様では、ｈＥＳＣは、軟骨形成細胞系譜の細胞に約１４日以内に、たとえば、約１０日以内、約７日以内、約４日以内または約３日以内に分化する。本明細書に記載の方法は、ｈＥＳＣの少なくとも約８５％、たとえば、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％が軟骨形成細胞系譜の細胞に分化するように細胞の分化を誘導する。分化は、好ましくはウシ関節軟骨細胞、たとえば、分化したウシ関節軟骨細胞の非存在下で行われる。また、このプロセスは、肝細胞の癌細胞株などの細胞または細胞株の条件培地の非存在下でも行われる。

本発明はまた、無血清培地を用いてｉＰＳＣを支持体上で培養し、ｉＰＳＣを支持体からしてｉＰＳＣを分離し、無血清培地を用いてｉＰＳＣを高密度マイクロマス培養として培養し、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）をマイクロマス培養に投与することにより、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の軟骨形成細胞系譜への分化を誘導する方法も提供する。ｉＰＳＣは、ＥＢを実質的に含まない。好ましくは、ｉＰＳＣはＥＢをまったく含まない。一態様では、ｉＰＳＣは、軟骨障害の患者由来である。一態様では、軟骨障害は軟骨異形成症である。

上述の方法は、規定の分化の段階にあり、かつＥＢ由来の細胞、たとえば、非軟骨形成細胞系譜の細胞を含まないことを特徴とする軟骨形成細胞を生じさせる。たとえば、軟骨形成細胞の集団は非軟骨形成細胞を実質的に含まず、集団は、上記のようにＥＳＣまたはｉＰＳＣから分化している。別の例では、細胞集団は、同調的に生じるか、または段階的に生じる。均一に分化した軟骨形成細胞の集団は、細胞の少なくとも８５％（もしくは９８％、９９％、または１００％）が単一の規定の分化の段階にあることを特徴とする。一部の臨床応用では、分化の段階は比較的初期であり、たとえば、集団は十分に分化した軟骨細胞を実質的に含まない。たとえば、この段階は、３日目の軟骨形成細胞または４日目の軟骨形成細胞からなる群から選択される。系譜の初期相の細胞を利用すると、移植後に関節軟骨の修復を促進する局所環境シグナルに応答しやすくなる。以上のように、軟骨を修復または再建する方法は、損傷または病変軟骨を上述の細胞集団のいずれかと接触させることにより行われる。同様に、関節炎を予防または処置する方法は、個体（ヒトまたは他の動物、たとえば、イヌ、ネコ、ウマ）の関節接合部（ａｒｔｉｃｕｌａｔｉｎｇ ｊｏｉｎｔ）または関節腔に、記載した軟骨形成細胞の集団のいずれかを投与することにより行われる。

本発明は、傷害または変性に起因するような軟骨障害または欠損を処置する方法を含む。処置される障害として、関節接合部の外傷性障害（たとえば、前十字靭帯（ＡＣＬ）または他の靭帯を含む膝の損傷または断裂、半月板の損傷または骨折）、肘の外傷性障害、肩の外傷性障害（たとえば、回旋筋腱板損傷）、顎の外傷性障害（顎関節、すなわちＴＭＪ疾患）、または手指の外傷性障害、および他の軟骨または骨格損傷のほか、変形性関節症（ＯＡ）など加齢に伴い発症する関節炎、または関節リウマチ（ＲＡ）など炎症を伴う関節炎、または外傷性障害による関節炎などの慢性状態、および関節接合部のいずれかが侵される慢性状態が挙げられる。この細胞は、傷害または慢性疾患による関節軟骨の損傷の予防に有用である。また、この細胞は、線維軟骨、靭帯（ｌｉｇｍｅｎｔ）もしくは半
月板の障害または変性の修復にも有用である。治療方法は、本明細書の方法により産生された細胞を、軟骨障害、たとえば、軟骨傷害または変形性関節症などの関節炎の患者に投与するステップを含む。また、治療には、本方法により産生された細胞を導入して、傷害または疾患による慢性関節軟骨変性の発症を遅延させるかまたは予防することも含まれる。本方法により産生された軟骨形成細胞で軟骨を修復する方法は、移植、注射または注入により関節接合部または他の標的部位に細胞を投与することを含んでいた。たとえば、細胞は、関節鏡視下で投与する。場合によっては、関連する欠損または状態を修復する外科的または関節鏡視下手順の前、その後、またはその最中に細胞を投与または移植する。たとえば、ＡＣＬ修復手順、半月板修復、回旋筋腱板修復、または他の手順と併用して関節腔に細胞を投与する。また、細胞は、事故もしくは軍事衝突が原因の外傷性障害、または先天性欠損症により失われた手指または四肢を再生する方法にも有用である。

本方法の大きな利点は、規定の分化の段階で、たとえば、細胞が分化し始めたばかり（たとえば、２日目の細胞、３日目の細胞もしくは４日目の細胞）、または十分に分化した軟骨細胞（たとえば、７日目〜１４日目の細胞）の段階で細胞の実質的に純粋な集団を単離することを可能にすることである。十分に分化した軟骨細胞は、多くの軟骨修復および再建治療に有用である。分化の初期段階の細胞は、同じ目的で使用されるか、または他の目的で使用され、その場合、コロニー形成し、さらに分化するだけでなく、ｉｎ ｓｉｔｕで局所環境シグナルに応答するという別の利点が存在する。

また、上述の方法を用いて産生された細胞は、疾患の遺伝学的基盤の判定、および処置に使用される治療薬のスクリーニング、または軟骨障害の重症度の軽減にも有用である。たとえば、軟骨障害の発生に関係する遺伝子を同定する方法は、既知の分化の段階（たとえば、十分に分化した細胞の２日目〜３日目の細胞、４日目の細胞）の実質的に均一な細胞集団を用意し、正常対照細胞と比較した遺伝子発現の増加または減少を検出することにより行う。遺伝子発現の増加または減少から、差次的に発現する遺伝子は、軟骨障害の発生に関係することが示される。たとえば、この細胞は、軟骨異形成症または軟骨無形成症と診断された患者から採取されたｉＰＳＣである。

軟骨障害の重症度を処置または軽減する治療薬（たとえば、軟骨促進剤）を同定する例示的なスクリーニング方法は、既知の分化の段階（たとえば、十分に分化した細胞の２日目〜３日目の細胞、４日目の細胞）の実質的に均一な細胞集団を用意し、集団を候補化合物と接触させ、軟骨形成を検出することにより行う。前記化合物の存在下での軟骨形成が化合物の非存在下と比較して増加すれば、化合物が軟骨の形成を促進することが示される。軟骨形成が減少すれば、化合物が軟骨の形成を阻害することが示される。

本発明の他の特徴と利点については、以下のその好ましい実施形態の説明、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。他に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味を持つ。本発明の実施または試験には、本明細書に記載したのと類似または同等の方法および材料を使用してもよいが、以下に好適な方法および材料について記載する。本明細書に引用する公開された外国特許および特許出願はすべて、参照によって本明細書に援用する。本明細書に引用する、受託番号で表されるＧｅｎＢａｎｋおよびＮＣＢＩの寄託物（ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎｓ）は、参照によって本明細書に援用する。本明細書に引用する他の公表された参考文献、文書、原稿および科学文献はすべて、参照によって本明細書に援用する。矛盾がある場合、定義を含め本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および例は、単に例示のためのものであり、限定的であることを意図するものではない。

本発明の他の特徴と利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる
であろう。

Ａ：放射線照射マウス胚性線維芽細胞のフィーダー層上で培養された未分化多能性Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）のコロニーを示す顕微鏡写真、Ｂ：形成された翌日のｈＥＳＣコロニーに由来する胚様体（ＥＢ）を示す顕微鏡写真。 Ａ：ＥＢの細胞から樹立されて２１日目のアルシアンブルー染色されたマイクロマス培養物について、未処理の対照培養物を示す顕微鏡写真、Ｂ：ＥＢの細胞から樹立されて２１日目のアルシアンブルー染色されたマイクロマス培養物について、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）処理した培養物を示す顕微鏡写真、Ｃ：ＥＢの細胞から樹立されて２１日目のアルシアンブルー染色されたマイクロマス培養物について、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）処理した培養物を示す顕微鏡写真、Ｄ：ＥＢの細胞から樹立されて２１日目のアルシアンブルー染色されたマイクロマス培養物を示す顕微鏡写真について、ＢＭＰ２とＴＧＦβ１との両方で処理された培養物を示す顕微鏡写真。 Ａ：ＢＭＰ２とＴＧＦβ１との両方で処理したＥＢ細胞マイクロマス培養物のアルシアンブルー基質の蓄積の経時的変化を示す顕微鏡写真、Ｂ：ＢＭＰ２とＴＧＦβ１との両方で処理したＥＢ細胞マイクロマス培養物のアルシアンブルー基質の蓄積の経時的変化を示す顕微鏡写真、Ｃ：ＢＭＰ２とＴＧＦβ１との両方で処理したＥＢ細胞マイクロマス培養物のアルシアンブルー基質の蓄積の経時的変化を示す顕微鏡写真、Ｄ：ＢＭＰ２とＴＧＦβ１との両方で処理したＥＢ細胞マイクロマス培養物のアルシアンブルー基質の蓄積の経時的変化を示す顕微鏡写真。 Ａ：未分化多能性ｈＥＳＣから直接樹立されたマイクロマス培養物におけるアルシアンブルー軟骨基質およびＩＩ型コラーゲンの蓄積に対するＢＭＰ２の作用について、アルシアンブルー染色された１４日目の未処理の対照培養物を示す顕微鏡写真、Ｂ：未分化多能性ｈＥＳＣから直接樹立されたマイクロマス培養物におけるアルシアンブルー軟骨基質およびＩＩ型コラーゲンの蓄積に対するＢＭＰ２の作用について、アルシアンブルー染色された１４日目のＢＭＰ２処理培養物を示す顕微鏡写真、Ｃ：未分化多能性ｈＥＳＣから直接樹立されたマイクロマス培養物におけるアルシアンブルー軟骨基質およびＩＩ型コラーゲンの蓄積に対するＢＭＰ２の作用について、ＩＩ型コラーゲン抗体で免疫染色した１４日目のＢＭＰ２処理培養物の矢状断面。 Ａ：２日目にＢＭＰ２を含む「軟骨形成培地」を培養物に補充した、未分化多能性ｈＥＳＣから樹立されたＢＭＰ２処理マイクロマス培養物のアルシアンブルー基質の蓄積の経時的変化を示す顕微鏡写真、Ｂ：２日目にＢＭＰ２を含む「軟骨形成培地」を培養物に補充した、未分化多能性ｈＥＳＣから樹立されたＢＭＰ２処理マイクロマス培養物のアルシアンブルー基質の蓄積の経時的変化を示す顕微鏡写真、Ｃ：２日目にＢＭＰ２を含む「軟骨形成培地」を培養物に補充した、未分化多能性ｈＥＳＣから樹立されたＢＭＰ２処理マイクロマス培養物のアルシアンブルー基質の蓄積の経時的変化を示す顕微鏡写真、Ｄ：２日目にＢＭＰ２を含まない「軟骨形成培地」を培養物に供給し、その後３日目にＢＭＰ２を補充した未分化多能性ｈＥＳＣから樹立されたＢＭＰ２処理マイクロマス培養物のアルシアンブルー基質の蓄積の経時的変化を示す顕微鏡写真、Ｅ：２日目にＢＭＰ２を含まない「軟骨形成培地」を培養物に供給し、その後３日目にＢＭＰ２を補充した未分化多能性ｈＥＳＣから樹立されたＢＭＰ２処理マイクロマス培養物のアルシアンブルー基質の蓄積の経時的変化を示す顕微鏡写真、Ｆ：２日目にＢＭＰ２を含まない「軟骨形成培地」を培養物に供給し、その後３日目にＢＭＰ２を補充した未分化多能性ｈＥＳＣから樹立されたＢＭＰ２処理マイクロマス培養物のアルシアンブルー基質の蓄積の経時的変化を示す顕微鏡写真。 Ａ：未分化多能性ｈＥＳＣから樹立され、アルシアンブルー染色された１４日目のマイクロマス培養物について、未処理の対照培養物を示す顕微鏡写真、Ｂ：図未分化多能性ｈＥＳＣから樹立され、アルシアンブルー染色された１４日目のマイクロマス培養物について、ＢＭＰ２処理培養物を示す顕微鏡写真、Ｃ：未分化多能性ｈＥＳＣから樹立され、アルシアンブルー染色された１４日目のマイクロマス培養物について、ＴＧＦβ１処理培養物を示す顕微鏡写真、Ｄ：未分化多能性ｈＥＳＣから樹立され、アルシアンブルー染色された１４日目のマイクロマス培養物について、ＢＭＰ２とＴＧＦβ１との両方で処理された培養物を示す顕微鏡写真。 Ａ：培養から４８時間でＢＭＰ２を供給し、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した３日目（Ｄ３）、４日目（Ｄ４）、７日目（Ｄ７）、および１４日目（Ｄ１４）のｈＥＳＣマイクロマス培養物におけるＳｏｘ９転写物の発現、アグリカン転写物の発現、Ｃｏｌ２ａ１転写物の発現、Ｃｏｌ１０ａ１転写物の発現およびオステオポンチン（ＯＰＮ）転写物の発現（Ａ）を示す棒グラフ。発現レベルは、内部対照としてＧＡＰＤＨを用いてΔΔＣｔ法により判定した。相対量は、−２ΔΔＣｔとして計算し、２日目の発現レベルに対して補正して、これを値１に設定した。各値は、３つの測定値の平均値（±ＳＥＭ）（４日目、７日目、および１４日目）、または２つの測定値の平均（±ｒａｎｇｅ）（３日目）である、Ｂ：培養から４８時間でＢＭＰ２を供給し、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した３日目（Ｄ３）、４日目（Ｄ４）、７日目（Ｄ７）、および１４日目（Ｄ１４）のｈＥＳＣマイクロマス培養物におけるＢｒａｃｈｙｕｒｙ転写物の発現（Ｂ）を示す棒グラフ。発現レベルは、内部対照としてＧＡＰＤＨを用いてΔΔＣｔ法により判定した。相対量は、−２ΔΔＣｔとして計算し、２日目の発現レベルに対して補正して、これを値１に設定した。各値は、３つの測定値の平均値（±ＳＥＭ）（４日目、７日目、および１４日目）、または２つの測定値の平均（±ｒａｎｇｅ）（３日目）である、Ｃ：３日目（Ｄ３）、４日目（Ｄ４）、および７日目（Ｄ７）の未処理の対照（ＢＴ−、青）、ＢＭＰ２処理（Ｂ＋、赤）、ＢＭＰ２とＴＧＦβ１とにより処理（ＢＴ＋、緑）、およびＴＧＦβ１処理（Ｔ＋、紫）ｈＥＳＣマイクロマス培養物におけるＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現レベルＤ：３日目（Ｄ３）、４日目（Ｄ４）、および７日目（Ｄ７）の未処理の対照（ＢＴ−、青）、ＢＭＰ２処理（Ｂ＋、赤）、ＢＭＰ２とＴＧＦβ１とにより処理（ＢＴ＋、緑）、およびＴＧＦβ１処理（Ｔ＋、紫）ｈＥＳＣマイクロマス培養物におけるＳｏｘ９の発現レベル、Ｅ：３日目（Ｄ３）、４日目（Ｄ４）、および７日目（Ｄ７）の未処理の対照（ＢＴ−、青）、ＢＭＰ２処理（Ｂ＋、赤）、ＢＭＰ２とＴＧＦβ１とにより処理（ＢＴ＋、緑）、およびＴＧＦβ１処理（Ｔ＋、紫）ｈＥＳＣマイクロマス培養物におけるアグリカンの発現レベル。 アグリカンの球間ドメインに対する抗体で免疫染色した１４日目のＢＭＰ２処理培養物の断面の顕微鏡写真。細胞内アグリカン染色を示す細胞が培養物の全体に存在する。これは、ＩＩ型コラーゲン細胞外マトリックスで囲まれた細胞の実質的にすべてが（図４のＡ〜Ｃに示す）、細胞自律性（ｃｅｌｌ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ）マーカーを用いた免疫染色によるアッセイされる軟骨マーカー、アグリカンを発現していることを示す。 Ａ：ＢＭＰ２で処理された１４日目のｈＥＳＣマイクロマス培養物のアルシアンブルー染色およびＮｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ染色矢状断面を示す顕微鏡写真。アルシアンブルーで染色可能な細胞外マトリックスで囲まれた細胞は、ＢＭＰ２処理培養物の断面の実質的に全範囲にわたり存在し、さらに、少数の管状構造物も存在する（矢印）、Ｂ：ＢＭＰ２およびＴＧＦ−β１の両方で処理されたｈＥＳＣマイクロマス培養物の断面を示す顕微鏡写真。細胞の実質的にすべてがアルシアンブルー軟骨基質で囲まれており、非軟骨形成組織は、ほとんどあるいはまったく検出できない、Ｃ：ＢＭＰ２とＴＧＦ−β１とで処理されたｈＥＳＣ培養物の断面を示す顕微鏡写真。広範囲の軟骨組織に加えて小管（矢印）も存在する。こうした管は、ＢＭＰ２とＴＧＦ−β１とで処理された培養物の非常に小さな割合を占めるだけであり、培養物の大部分は軟骨分化を示す。図９Ｃの下のテーブル１は、図９Ａに示した１４日目のＢＭＰ２処理培養物の断面中に存在する細胞の８８％がアルシアンブルー陽性基質で囲まれていることを示す。図９Ｂおよび図９Ｃに示したＢＭＰ２およびＴＧＦβ１処理培養物の断面では、細胞の９７．３％がアルシアンブルー陽性基質で囲まれている。これらの結果から、本方法のＢＭＰ２処理、およびＢＭＰ２／ＴＧＦβ１処理ｈＥＳＣ培養による軟骨細胞分化の実質的な均一性が明らかにされる。 胚様体（ＥＢ）細胞から樹立され、ＢＭＰ２とＴＧＦ−β１とで処理されたマイクロマス培養物のアルシアンブルー染色およびＮｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ染色矢状断面を示す顕微鏡写真。アルシアンブルー染色された軟骨形成組織だけでなく、大量の脂肪組織（Ａｄ）、さらには管（矢印）も存在する。 本明細書に記載の方法に供されたヒト包皮線維芽細胞に由来するｉＰＳ細胞株の軟骨基質をアルシアンブルー染色することによりアッセイされる軟骨細胞分化を示す顕微鏡写真。図１１の（Ａ）は、ＢＭＰ２を補充せずに維持したｉＰＳＣの１４日目の対照マイクロマス培養物を示す。アルシアンブルー陽性基質はほとんど存在しない。図１１の（Ｂ）は、１４日目のＢＭＰ２処理ｉＰＳＣマイクロマス培養物を示す。強く広範囲のアルシアンブルー染色が培養物の全体に存在する。 Ａ：アルシアンブルー染色によりアッセイされるマイクロマス培養物の軟骨細胞分化に対するｉＰＳＣ分離法の作用を示す顕微鏡写真。トリプシン（Ａ）で予め分離し、培養から７日後にアルシアンブルーでホールマウント染色したＢＭＰ２補充ｉＰＳＣのマイクロマス培養物を示す。各培養物では、アルシアンブルー蓄積が同程度に顕著である、Ｂ：アルシアンブルー染色によりアッセイされるマイクロマス培養物の軟骨細胞分化に対するｉＰＳＣ分離法の作用を示す顕微鏡写真。ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｂ）で予め分離し、培養から７日後にアルシアンブルーでホールマウント染色したＢＭＰ２補充ｉＰＳＣのマイクロマス培養物を示す。各培養物では、アルシアンブルー蓄積が同程度に顕著である、Ｃ：アルシアンブルー染色によりアッセイされるマイクロマス培養物の軟骨細胞分化に対するｉＰＳＣ分離法の作用を示す顕微鏡写真である。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｃ）で予め分離し、培養から７日後にアルシアンブルーでホールマウント染色したＢＭＰ２補充ｉＰＳＣのマイクロマス培養物を示す。各培養物では、アルシアンブルー蓄積が同程度に顕著である、Ｄ：アルシアンブルー染色によりアッセイされるマイクロマス培養物の軟骨細胞分化に対するｉＰＳＣ分離法の作用を示す顕微鏡写真。ＢＭＰ２の非存在下で維持されたｉＰＳＣ培養物を示し、使用した分離法を問わず、アルシアンブルー陽性基質がほとんど存在しない、Ｅ：アルシアンブルー染色によりアッセイされるマイクロマス培養物の軟骨細胞分化に対するｉＰＳＣ分離法の作用を示す顕微鏡写真。ＢＭＰ２の非存在下で維持されたｉＰＳＣ培養物を示し、使用した分離法を問わず、アルシアンブルー陽性基質がほとんど存在しない、Ｆ：アルシアンブルー染色によりアッセイされるマイクロマス培養物の軟骨細胞分化に対するｉＰＳＣ分離法の作用を示す顕微鏡写真。ＢＭＰ２の非存在下で維持されたｉＰＳＣ培養物を示し、使用した分離法を問わず、アルシアンブルー陽性基質がほとんど存在しない。 Ａ：ＢＭＰ２およびＴＧＦＢ１の組み合わせに応答したｉＰＳＣマイクロマス培養物の軟骨細胞分化を示す顕微鏡写真。ＢＭＰ２の存在下で維持されたｉＰＳＣの１４日目のマイクロマス培養物を示す。ＢＭＰ２を補充した培養物は、強く広範囲のアルシアンブルー陽性基質が同程度に蓄積する、Ｂ：ＢＭＰ２およびＴＧＦＢ１の組み合わせに応答したｉＰＳＣマイクロマス培養物の軟骨細胞分化を示す顕微鏡写真。ＢＭＰ２とＴＧＦβ１との組み合わせの存在下で維持された１４日目のｉＰＳＣマイクロマス培養物を示す。ＢＭＰ２とＴＧＦβ１との組み合わせを補充した培養物は、強く広範囲のアルシアンブルー陽性基質が同程度に蓄積する、Ｃ：ＢＭＰ２およびＴＧＦＢ１の組み合わせに応答したｉＰＳＣマイクロマス培養物の軟骨細胞分化を示す顕微鏡写真。ＢＭＰ２またはＴＧＦβ１の非存在下で維持された１４日目のｉＰＳＣマイクロマス培養物を示す。ＢＭＰ２、またはＢＭＰ２とＴＧＦβ１との組み合わせを補充した培養物は、強く広範囲のアルシアンブルー陽性基質が同程度に蓄積するのに対し、ＢＭＰ２補充を受けなかったｉＰＳＣマイクロマス培養物は、アルシアンブルー陽性基質がほとんど蓄積されない。 Ａ：マウス関節軟骨損傷モデルを示す顕微鏡写真。対照無手術マウス膝の前額断を示す。内側半月（ｍｍ）が確認される。靭帯の外科的切除および部分的な半月板切除（ｍｅｎｉｓｃｅｔｏｍｙ）による膝の不安定化から８週後のマウス膝の前額断を示す、Ｂ：マウス関節軟骨損傷モデルを示す顕微鏡写真。靭帯の外科的切除および部分的な半月板切除（ｍｅｎｉｓｃｅｔｏｍｙ）による膝の不安定化から８週後のマウス膝の前額断を示す。内側半月が存在しないことをアスタリスクで示す。関節軟骨損傷の局在化した領域が存在する（矢印）、Ｃ：Ａの拡大図、Ｄ：Ｂの拡大図。 Ａ：マウス指先再生モデルを示す顕微鏡写真。骨がアリザリンレッドで染色されている対照無手術マウスの指先を示す、Ｂ：マウス指先再生モデルを示す顕微鏡写真。６週間前に切断されたマウス指先を示す。すべての構造が完全かつ自然に再生されている、Ｃ：マウス指先再生モデルを示す顕微鏡写真。軟組織および硬組織の存在を示す対照指先の断面を示す、Ｄ：マウス指先再生モデルを示す顕微鏡写真。６週間前に切断されたマウス指先を示す。すべての構造が完全かつ自然に再生されている。 Ａ：遺伝性軟骨障害（軟骨異形成症）の患者のヒト線維芽細胞からのｉＰＳＣの誘導を示す顕微鏡写真。未分化多能性幹細胞に特徴的な外観を持つコロニーを含む生きている培養物を示す（１０×）、Ｂ：遺伝性軟骨障害（軟骨異形成症）の患者のヒト線維芽細胞からのｉＰＳＣの誘導を示す顕微鏡写真。ｉＰＳＣの多能性幹細胞のマーカー（ＳＳＥＡ−４およびＮａｎｏｇ）に対する免疫細胞化学的染色を示す。 未分化ヒト胚性幹細胞または人工ヒト多能性幹細胞から軟骨形成細胞を作製するためのステップを示すフロー図。

軟骨の変性疾患、たとえば、変形性関節症は、多く見られる消耗性の慢性健康障害であり、成人の生活の質を低下させる主な原因の１つである（Ｍａｇｎｅ Ｄ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１：５１９−５２６）。変形性関節症（ＯＡ）は、関節軟骨の分解および変性を特徴とする非炎症性の変性関節疾患である。ＯＡは、６５歳を超える大部分の人が罹患し、４０歳を超える集団の９０％が、関節に何らかの形で痛みおよび不動を引き起こす軟骨変性を呈すると推定される（Ｓｏｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，６：５９６−６０１）。軟骨変性疾患は、組織の自己修復能および再生能が乏しいため、その処置は特別な課題であり、軟骨病変の処置は、主要な臨床上の問題になっている。胚盤胞の内細胞塊に由来するヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、無限の自己複製能を有しつつも、複数の細胞型に分化する能力を維持しているため、細胞ベースの組織工学治療により軟骨欠損を修復する強力なツールになる。実際、下記のように、ｈＥＳＣは、軟骨修復のための前駆体細胞を無限に供給する。

軟骨修復にｈＥＳＣを使用するには、病変軟骨の修復に関与し得る前駆体細胞へのｈＥＳＣの分化を十分に誘導する必要がある。本発明の以前に、ＥＳＣ由来の細胞が様々な程度で軟骨細胞に分化するいくつかの培養系が開発されてきた（；Ｅｌｉｓｓｅｅｆｆ Ｊ
ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｏｒｔｈｏｄ Ｃｒａｎｉｏｆａｃ Ｒｅｓ，８：１５０−１６１；Ｈａｒｋｎｅｓｓ Ｌ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ
５；３５３−３６８；Ｈｅｎｇ ＢＣ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２２：１１５２−１１６７；Ｈｏｂｅｎ ＧＭ ｅｔ ａｌ ２００９ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ １８：２８３−２９２；Ｈｗａｎｇ ＮＳ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２４：２８４−２９１；Ｈｗａｎｇ ＮＳ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ，１２：２６９５−２７０６；Ｊｕｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔ Ａ，１４：１３５−１４７；Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｂｏｎｅ，３６：７５８−７６９；Ｋｏａｙ ＥＪ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５：２１８３−２１９０；Ｋｏａｙ ＥＪ ａｎｄ Ａｔｈａｎａｓｉｏｕ ＫＡ ２００９ ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ａ １５：２２４９−２２５７；Ｋｒａｍｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，９２：１９３−２０５；Ｋｒａｍｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２９：１３９−１４６；Ｋｒａｍｅｒ Ｊ ｅｔ ａ
ｌ．，２００５ Ａｎａｔ Ｅｍｂｒｙｏｌ，２１０：１７５−１８５；Ｏｆｅｋ Ｇ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｊ Ｂｉｏｍｅｃｈ Ｅｎｇ １３１：０６１０１１；Ｓｕｉ
ＹＰ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，７１：５７８−５８５；Ｔｏｈ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２５：９５０−９６０；Ｔｏｈ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １３Ｂ：３５７０−３５９０；Ｖａｔｓ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ １２：１６８７−１６９７；ｚｕｒ Ｎｉｅｄｅｎ ＮＩ ｅｔ ａｌ．，２００５
ＢＭＣ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，５：５−１５）。しかしながら、これらの系では軟骨細胞は、分化する細胞の亜集団のみであり、軟骨修復のために細胞集団を利用することが難しくなっている。

さらに、軟骨細胞分化プロトコルの大部分は、ＥＳＣ由来の胚様体（ＥＢ）の細胞を利用する（Ｅｌｉｓｓｅｅｆｆ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｏｒｔｈｏｄ Ｃｒａｎｉｏｆａｃ Ｒｅｓ，８：１５０−１６１；Ｈａｒｋｎｅｓｓ Ｌ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ ５：３５３−３６８；Ｈｅｎｇ ＢＣ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２２：１１５２−１１６７；Ｈｏｂｅｎ ＧＭ ｅｔ ａｌ ２００９ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ １８：２８３−２９２；Ｈｗａｎｇ ＮＳ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２４：２８４−２９１；Ｈｗａｎｇ ＮＳ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ，１２：２６９５−２７０６；Ｊｕｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｐａｒｔ Ａ，１４：１３５−１４７；Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｂｏｎｅ，３６：７５８−７６９；Ｋｏａｙ ＥＪ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５：２１８３−２１９０；Ｋｏａｙ ＥＪ ａｎｄ Ａｔｈａｎａｓｉｏｕ ＫＡ ２００９ ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ａ １５：２２４９−２２５７；Ｋｒａｍｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，９２：１９３−２０５；Ｋｒａｍｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２９：１３９−１４６；Ｋｒａｍｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ａｎａｔ Ｅｍｂｒｙｏｌ，２１０：１７５−１８５；Ｏｆｅｋ Ｇ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｊ Ｂｉｏｍｅｃｈ Ｅｎｇ
１３１：０６１０１１；Ｓｕｉ ＹＰ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，７１：５７８−５８５；Ｔｏｈ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２５：９５０−９６０；Ｔｏｈ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １３Ｂ：３５７０−３５９０；Ｖａｔｓ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ １２：１６８７−１６９７；ｚｕｒ Ｎｉｅｄｅｎ
ＮＩ ｅｔ ａｌ．，２００５ ＢＭＣ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，５：５−１５；Ｗａｅｓｅ ａｎｄ Ｓｔａｎｆｏｒｄ ２０１０ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｓｅｐｔ ６）。ＥＢは、未分化なＥＳＣまたはコロニーの懸濁液を非接着性支持体上でインキュベートすることにより形成される細胞の三次元凝集塊である。ＥＢの細胞は、胚の３胚葉に由来するすべての細胞型で構成される半ば系統化された組織（ｓｅｍｉ−ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ）に分化することができる。ＥＢで生じる細胞環境および相互作用は、正確に制御することが難しく、細胞の不均一性を助長している。このため、ＥＢ由来の細胞を利用すると、組織修復に使用することができる軟骨形成細胞の均質な集団を得にくくなる。

前もってＥＢ形成せずにｈＥＳＣの軟骨細胞分化が試みられた、いくつかのプロトコルが報告されている。１つのプロトコルは、分化したウシ関節軟骨細胞とｈＥＳＣを長期間（数週間）共培養するものであった（Ｈｗａｎｇ ＮＳ ｅｔ ａｌ．，２００８ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，３：１−１０）。別のプロトコルは、明確に定義されていない肝細胞の癌細胞株の条件培地でＥＳＣを前培養するものであった（Ｈｗａｎｇ ＹＳ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ，１７：９７１−９７８）が、この研究では
、軟骨細胞分化が限定的であり、非均一であった（Ｈｗａｎｇ ＮＳ ｅｔ ａｌ．，２００８ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，３：１−１０）。

別の研究では、前もってＥＢ形成せずにマウスＥＳ細胞のマイクロマス培養物を利用して軟骨分化を獲得しようとした（Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １６：２７８−２８６）。Ｙａｍａｓｈｉｔａのプロトコルは、培養開始時に増殖因子を加え、その結果かなりの細胞死が引き起され、その後培養支持体からの剥離が行われるものであった。さらに、この培養物は、斑状の非均一なアルシアンブルー染色のみを示し、ＲＴ−ＰＣＲで検出可能な信頼できる軟骨マーカー、アグリカンをほとんど発現しないか、まったく発現しない。培養物は、肥大軟骨マーカー１０型コラーゲンを発現し、石灰化が起こることが報告されており、培養中の細胞が培養期間の初期に肥大軟骨細胞に成熟したことが示された。肥大軟骨細胞の成熟は変形性関節症と関連するため、これらの特徴は、この方法の大きな欠点である。また、この培養物は、血管マーカーｆｌｋ１を発現することも報告されたことから、培養の不均一性が示された。形成される比較的少量の軟骨形成組織が肥大成熟化し、軟骨形成組織を軟骨修復に不適切なものにする。実際、同じ著者らによる第２の研究（Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ａ ｅｔ ａｌ．，２０１０ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５：ｅｌ０９９８）では、培養物がインビトロでさらに肥大し、最終的に骨様組織を形成することが報告された。

これに対し、本明細書に記載の方法は、組織学的解析および分子解析によりアッセイされる実質的に均一な軟骨細胞分化を生じさせる。この方法は、アグリカンおよび他の軟骨マーカーの高レベルの発現を示す細胞を生じさせる。これらの培養物が示す段階的な分化により、軟骨修復に使用してもよい、個々の分化段階の比較的純粋な細胞の集団を得ることができる。さらに、この細胞は肥大成熟化を起こさないことから、軟骨修復に特に好ましい。

こうした相違は、１つには増殖因子を加えるタイミングに関係している。Ｙａｍａｓｈｉｔａは増殖因子を高密度培養の開始時（ゼロ時）に加えたのに対し、本明細書に記載の方法では、増殖因子を培養物に加えるのは高密度培養の樹立から２４時間後または４８時間後である。マイクロマス培養の軟骨形成前駆体を培養の開始時（０時）にＢＭＰで処理すると、細胞死が引き起こされ、軟骨細胞分化が阻害されるため、増殖因子を補充するタイミングは、軟骨細胞分化にとって重要である（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ ２００７）。他の研究者は、インビボでＢＭＰにより軟骨形成前駆体を処理すると、大量の細胞死が引き起こされることを明らかにしている（Ｍａｃｉａｓ ｅｔ ａｌ １９９７）。また、ｈＥＳＣの生存を促進するには、培養物にＲＯＣＫ阻害剤を加える（Ｗａｔａｎａｂｅ
Ｋ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｌｉ Ｘ ２００９）。好適な阻害剤として、Ｙ２７６３２およびＨ１１５２（どちらもＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手可能）、ＡＲ−１２２８６（Ａｅｒｉｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のほか、ＨＡ−１１００．ＨＣｌ（［ヒドロキシファスジル；１−ヒドロキシ−５−イソキノリンスルホニル）ホモ−ピペラジン］、３−（４−ピリジル）−１Ｈ−インドール、Ｈ−１１５２．２ＨＣｌ（［Ｈ−１１５２Ｐ；（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］ホモピペラジン、およびＮ−（４−ピリジル）−Ｎ’−（２，４，６−トリクロロフェニル）尿素（これらのうち最後の４つは、Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｔｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能）が挙げられる。

また、間葉系幹細胞様中間体（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）を利用してｈＥＳＣを軟骨細胞に間接的に分化するプロトコルも報告されている。しかしながら、これらのプロトコルの一部は、ＥＢを利用して間葉系幹細胞様中間体を産生する（Ｌｅｅ ＥＪ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｔｉｓｓｕ
ｅ Ｅｎｇ Ａ １６：７０５−７１７；Ｂｒｏｗｎ ＳＥ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓ Ｏｒｇ １８９：２５６−２６０；Ｍａｈｍｏｏｄ Ａ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ Ｒｅｓ ２５：１２１６−１２３３；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ ２００８；Ｃｏｈｅｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｔｉｓｓｕｅ
Ｅｎｇ Ａ １６：３１１９−３１３９；Ｈａｒｋｎｅｓｓ Ｌ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ ５：３５３−３６８）ため、上記で論じたように、細胞の不均一性が生じる。同様に、ヒト生殖隆起から単離したヒト幹細胞由来の間葉系幹細胞中間体からの軟骨細胞分化を報告したプロトコルでも、ＥＢのステップを使用している（ｈＥＧ細胞、Ｖａｒｇｈｅｓｅ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２８：７６５−７７４）。他のプロトコルでは、間葉系中間体を産生するため、マウス骨髄由来間質細胞株であるＯＰ９細胞との共培養（Ｂａｒｂｅｒｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，２００５ ＰＬｏＳ Ｍｅｄ ２ ｅ１６１）、あるいはヒト関節軟骨細胞との共培養（Ｂｉｇｄｅｌｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２７：１８１２−１８２１）を必要とした。いくつかのプロトコルでは、紡錘形の線維芽細胞／間葉系様細胞を産生させ、その後様々な軟骨細胞分化プロトコルに付すため、間葉系幹細胞マーカーを発現しているｈＥＳＣの亜集団を同定すべくＦＡＣＳソーティングを使用する（Ｌｉａｎ Ｑ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５：４２５−４３６；Ｋｏｐｈｅｒ ＲＡ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｂｏｎｅ ４７：７１８−７２８；Ｓｔａｖｒｏｐｏｕｌｏｓ ＭＥ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔ Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９：１Ｆ．８．１−１Ｆ．８．１０；Ｂａｒｂｅｒｉ Ｔ ｅｔ
ａｌ．，２００５ ＰＬｏＳ Ｍｅｄ ２ ｅｌ６１；Ｂａｒｂｅｒｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ １３：６４２−６５１）か、あるいは、継代の繰り返し、および低密度でのｈＥＳＣの大規模かつ長期的（数週間）培養を行う（Ｎａｋａｇａｗａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ６０：３６８６−３６９２；Ａｒｐｏｒｎｍｅａｋｌｏｎｇ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ １８：９５５−９６８；Ｂｏｙｄ ＮＬ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ａ １５：１８９７−１９０８）ことにより、間葉系幹細胞様中間体の細胞集団を得た。しかしながら、これらのプロトコルで得られた軟骨細胞分化は、ＩＩ型コラーゲンの斑状の免疫染色に示されるように不均一なものであり（Ａｒｐｏｒｎｍｅａｋｌｏｎｇ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ １８：９５５−９６８）、組織に均一性がなく（Ｋｏｐｈｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１０）、不均一にＩＩ型コラーゲンおよびＳｏｘ９が分布し（Ｂａｒｂｅｒｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ １３：６４２−６５１；Ｓｔａｖｒｏｐｏｕｌｏｓ ＭＥ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９：１Ｆ．８．１−１Ｆ．８．１０）、アルシアンブルー染色をほとんど示さない不均一な組織が形成され（Ｌｉａｎ Ｑ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５：４２５−４３６）、培養プレートから剥離した、特徴付けが十分になされていない集団が産生された（Ｂｏｙｄ ＮＬ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ａ １５：１８９７−１９０８）。また、ＢＭＰ７の存在下でｈＥＳＣ由来の間葉系線維芽細胞様細胞をペレット培養に供したプロトコル（Ｎａｋａｇａｗａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ６０：３６８６−３６９２）でも不均一な軟骨形成の分化が起こり、培養物は広範囲に及び未分化な中核を示し、軟骨細胞分化は、ペレットの周辺の細胞に限定されていた。また、ＢＭＰ７とＴＧＦβ１とで処理したペレットの軟骨細胞分化（Ｎａｋａｇａｗａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ６０：３６８６−３６９２）も均一ではなく、未分化な中核があり、周辺のＩＩ型コラーゲン免疫染色が全体として弱かった。これらの培養物での、信頼できる軟骨マーカー、アグリカンの発現は、未処理対照ペレットと比較して大きく増加しなかった。

これらの従来の方法の結果は、実質的に均一な細胞を段階的に直接生じさせる、本明細
書に記載の方法を用いたｈＥＳＣによる軟骨細胞分化とは異なる。もう１つの利点として、本発明の方法は、分化の個々の段階で同調的に細胞を生じさせる。たとえば、軟骨前駆体（２〜３日の細胞、軟骨系譜に入ったばかりであることを特徴とする）、初期の軟骨細胞（４日目の細胞、軟骨細胞分化の初期相にあることを特徴とする）、または十分に分化した軟骨細胞（７〜１４日の細胞、軟骨細胞への明らかな分化を均一に示すものの、肥大成熟化を示していない）を採取するため、別々の時点で細胞が回収される。

上述の各細胞集団は、理想的には特定の臨床状態の処置に適している。たとえば、軟骨前駆体（ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｇｅｎｔｏｒ）（２日目〜３日目の細胞）は、四肢または手指の再生、半月板（ｍｅｎｓｉｃａｌ）または靭帯の修復、および骨折修復に優先的に使用される。初期の軟骨細胞（４日目の細胞）は、傷害による関節軟骨欠損の修復、慢性変性疾患（ＯＡまたはＲＡ）による関節軟骨の修復または予防、外傷または先天性欠損により失われた軟骨組織の再生および置換、半月板または骨折の修復、ならびに顎関節の線維軟骨および軟骨の修復に使用される。十分に分化した軟骨細胞は、急性もしくは外傷性障害後の関節軟骨の修復、または慢性ＯＡもしくはＲＡによる関節軟骨損傷の修復もしくは予防のほか、内軟骨性骨化による骨折修復に使用される。各段階は、軟骨発生および分化のモデリングに有用であり、ｉＰＳＣ由来の細胞は、患者個人を考慮した修復および再生のほか、ヒト疾患のモデリング、標的治療の設計および試験、ならびに遺伝的に傷害された軟骨組織の疾患特異的修復に特に有用である。

ｉＰＳＣの軟骨細胞分化については、既に報告されている（Ｍｅｄｖｅｄｅｖ ＳＰ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ Ｏｃｔ １７；Ｌｉａｎ Ｑ
ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １２１：１１１３−１１２３）。しかしながら、一方のプロトコルは、ｉＰＳＣからのＥＢの形成を必要とし（Ｍｅｄｖｅｄｅｖ ＳＰ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ Ｏｃｔ １７）、もう一方のプロトコルは、間葉系幹細胞様中間体の細胞集団を採取するため、軟骨細胞分化を誘導する前に蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によりｉＰＳＣを分取して間葉系幹細胞マーカーを発現している亜集団を同定する必要がある（Ｌｉａｎ Ｑ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １２１：１１１３−１１２３）。このプロトコルを用いた軟骨細胞分化の結果、ＩＩ型コラーゲンに免疫反応を示す細胞は、約６０％に過ぎなかった（Ｌｉａｎ Ｑ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １２１：１１１３−１１２３）。さらに本方法のもう１つの利点は、ＦＡＣＳ（時間がかかるうえ、混入のリスクが生じ得る）の使用が回避されることである。

本明細書に記載の方法は、ＥＢを利用しない。本方法は、ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣと、分化したウシ関節軟骨細胞、ヒト関節軟骨細胞、またはマウスＯＰ９細胞との共培養を必要としない。本方法は、肝細胞の癌細胞由来の培地との前培養もしくは共培養も必要としない。さらに、本方法は、単層（ｍｏｎｏｌｏａｙｅｒ）での長期の継代および培養、またはＦＡＣＳによる細胞分取も必要としない。本方法は、より高速である（３週間未満、
２週間未満または１週間未満、たとえば、細胞は、高密度細胞培養の樹立から２〜３日後という短期間で軟骨形成細胞系譜に入る）。本方法により、実質的に均一な軟骨細胞分化が段階的に起こり、軟骨修復および他の使用に合わせて別々の分化の段階で細胞の集団を産生することが可能になる。

前もって胚様体（ＥＢ）を形成せずに、未分化多能性ｈＥＳＣの軟骨形成細胞系譜への段階的かつ均一な分化を迅速に直接促進する本発明の培養系および培養条件について、以下に記載する。未分化多能性ｈＥＳＣ、およびｈＥＳＣ由来の胚様体（ＥＢ）の細胞を高密度マイクロマス培養条件に付し、胚の肢芽間葉系細胞の軟骨細胞への分化が誘導された（Ｇａｙ ＳＷ ａｎｄ Ｋｏｓｈｅｒ ＲＡ，１９８４ Ｊ Ｅｘｐ Ｚｏｏｌ，２３２：３１７−３２６；Ｋｏｓｈｅｒ ＲＡ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，１１８：１１２−１１７；Ｋｏｓｈｅｒ ＲＡ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１０２：１１５１−１１５６；Ｋｕｌｙｋ ＷＭ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｍａｔｒｉｘ，１１：２８２−２８８）。この高密度マイクロマス培養系は、胚の四肢の発生において間葉系前駆体細胞の軟骨細胞分化の開始を特徴付ける細胞の密な並列、および細胞間相互作用を刺激する。ＢＭＰ２単独で処理（またはＢＭＰ２とＴＧＦβとを組み合わせて一緒に投与）した未分化多能性ｈＥＳＣのマイクロマス培養物は、前もってＥＢ形成をせずに軟骨形成細胞系譜への段階的かつ実質的に均一な（たとえば、少なくとも８８％）分化を直接示す。

ＢＭＰ２およびＴＧＦβ１を補充する別のアプローチとして、骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４、ＮＧ＿００９２１５（ＧＩ：２１９５２１８１４）、参照によって本明細書に援用する）、骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ７、ＮＭ＿００１７１９（ＧＩ：１８７６０８３１９）、参照によって本明細書に援用する）、増殖分化因子−５（ＧＤＦ５、ＮＧ＿００８０７６（ＧＩ：１９３０８３１６９）、参照によって本明細書に援用する）、トランスフォーミング増殖因子β−３（ＴＧＦβ３、ＮＧ＿０１１７１５（ＧＩ：２２５７３５５６３）、参照によって本明細書に援用する）、またはインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−Ｉ、ＮＧ＿０１１７１３（ＧＩ：２２５７３５５６２）、参照によって本明細書に援用する）などの他の増殖因子を培養物に補充する。これらの各因子は、軟骨形成細胞系譜への分化を促進する（Ｗａｅｓｅ ＥＹ ａｎｄ Ｓｔａｎｆｏｒｄ ＷＬ ２０１０
Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｓｅｐｔ ６；Ｎａｋａｇａｗａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ６０：３６８６−３６９２；Ａｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ａｎｎ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ３８：１６４７−１６５４；Ｍｏｏｒｅ ＹＲ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ ３７：２８８−２９８）。

マイクロマス培養の別のアプローチとしては、ｈＥＳＣをペレット培養に付す。この方法では、分離したｈＥＳＣまたはｉＰＳＣ（約１×１０５〜１×１０７細胞）をマイクロフュージチューブでペレット状にする。次いでマイクロマス培養のため、このペレットを上記と同じ軟骨細胞分化プロトコルに付す。ペレットに増殖因子（単数または複数）を加え、ペレットに拡散させて細胞の分化を誘導する。その後治療のため、ペレットそのものを、関節もしくは関節腔または他の修復組織への移植、注入、または他の投与手段に使用する。このプロトコルによっても、ＥＢを形成せずに、ｈＥＳＣの段階的かつ実質的に均一な軟骨細胞分化が直接達成される。また、このペレット培養プロトコルは、ｉＰＳＣの軟骨形成細胞系譜への分化の誘導にも使用される。

細胞培養系：系Ｉおよび系ＩＩ
細胞は、２つの系の１つを用いて調製される。系Ｉでは、高密度培養を樹立し、２４時間培養し、この時点で細胞にＢＭＰ２またはＢＭＰ２とＴＧＦβとの組み合わせを含む軟骨形成培地を加える。系ＩＩでは、高密度培養を樹立し、２４時間培養し、この時点で増
殖因子（単数または複数）を用いずに細胞に軟骨形成培地を加える。３日目の初めに、細胞にＢＭＰ２またはＢＭＰ２とＴＧＦβとの組み合わせを加える。１日後（３日目の終わりに）、遺伝子発現プロファイルおよび物理的特性／組織学的特徴から明らかなように、細胞は、実質的に均一に軟骨形成細胞系譜に入る。培養の時期、増殖因子の添加、および分化の段階を図示するフローチャートを図１７に示す。

下記のように、分化の進行過程の様々な時期に回収されたｈＥＳＣ由来の細胞の遺伝子発現プロファイルを用いることで、軟骨形成細胞系譜に入ったばかりの細胞から、明らかに分化した軟骨細胞に至る様々な相の軟骨形成細胞系譜の細胞を同定することができる。本明細書に記載の方法を用いれば、様々な相の軟骨形成細胞系譜のｈＥＳＣ由来の前駆体細胞が、細胞ベースの組織工学治療により軟骨を修復する能力を解析することができる。また、均一かつ段階的な軟骨細胞分化が起これば、軟骨形成細胞系譜に分化することが決定した前駆体細胞への未分化多能性ｈＥＳＣの段階的な変化に関係する遺伝子、シグナル、および制御ネットワークを同定しやすくなる。

治療方法
細胞を投与するアプローチとして、自家軟骨細胞移植の場合（ＡＣＩ，Ｚａｚｌａｖ Ｋ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ａｍ Ｊ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ，３７：４２−５５）、またはスキャフォールドフリーアプローチにより関節鏡視下の場合（Ｊｕｂｅｌ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ａｍ Ｊ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ ３６：１５５５−１５６４；Ｅｒｇｇｅｌｅｔ Ｃ ｅｔ ａｌ ２００３ Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ １９：１０８−１１０）には、膝を開く手術などの外科的手段により、マイクロマス培養物またはペレット培養物を損傷部位に直接移植する。一部の手順では、培養物をコラゲナーゼ消化または他の手段によりさらに分離し、細胞をスキャフォールドまたは他の支持体に播種する。こうした支持体として、コラーゲン膜（たとえばＣｈｏｎｄｒｏｇｉｄｅ）、ヒアルロナン含有マトリックス（たとえばＨｙａｆｆ−１１）、ポリグラクチンフリース、または他のマトリックスがある。次いで細胞を播種したマトリックスを、マトリックス誘導自家軟骨細胞修復の場合（ＭＡＣＩ：ｍａｔｒｉｘ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｒｅｐａｉｒ）（Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ，２０１０ Ａｍ Ｊ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ，３８：１２５９−１２７１）、またはＨｙａｌｇｒａｆｔＣの場合（Ｇｏｂｂｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００６：Ａｍ Ｊ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ ３４：１７６３−１７７３）には、外科的に移植するか（Ｋｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ａｍ Ｊ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ ３７：１５６Ｓ−１６６Ｓ）、あるいは、関節鏡視下で移植する（Ｇｉａｎｎｉ Ｅ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ａｍ Ｊ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ ３６：８７３−８８０；Ｎｉｘｏｎ ＡＪ ２００２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｅｃｈ Ｅｑｕｉｎｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ １：２５７−２６９）。また、分離した細胞を、コラーゲン、キトサン、アガロースまたはヒアルロナンを含むゲル中に封入し、その細胞−ゲル混合物を用いて、外科的手順で損傷領域に充填する（Ｆｕｎａｙａｍａ Ａ ｅｔ
ａｌ．，２００８ Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ １３：２２５−２３２；Ｈｏｅｍａｎｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００５ ＯｓｔｅｏＡｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔ １３：３１８−３２９；Ｅｍａｎｓ ＰＪ ｅｔ ａｌ．，２０１０ ＰＮＡＳ １０７：３４１８−３４２３）。これらの方法では、使用する細胞の濃度は、（１×１０６〜２×１０７細胞／ｍｌ）である。

あるいは、非侵襲的に関節内注射により、分離した細胞を膝に直接注射または注入する。導入される細胞数は、（１×１０６〜２×１０７細胞／ｍｌ）である。自家間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を傷害された膝または関節炎の膝に導入する場合（Ｃｅｎｔｅｎｏ ＣＪ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｐａｉｎ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ １１：３４３−３５３）、またはＭＳＣを軟骨が損傷したラット、ブタおよびヤギの関節に注射する場合（Ｈｏｒｉｅ
Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２７：８７８−８８７；Ｌｅｅ
ＫＢ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５：２９６４−２９７１；Ｍｕｒｐｈｙ ＪＭ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４８：３４６４−３４７４）には、細胞は食塩水を用いて注射する。別のアプローチでは、細胞は、臨床的関節炎痛および不動（ｉｍｍｍｏｂｉｌｉｔｙ）を軽減する関節内補充療法に使用されるヒアルロナン調製物（たとえばＳｙｎｖｉｓｃ、Ｓｕｐａｒｔｚ）などの他の物質と併用して（Ｐｅｔｒｅｌｌａ ＲＪ ａｎｄ Ｐｅｔｒｅｌｌａ Ｍ ２００６，Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ３３：９５１−９５６；Ｂｒａｎｄｅｒ ＶＡ ａｎｄ Ｓｔａｄｌｅｒ ＴＳ ２００９ Ｐｈｙｓ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ ３７：３８−４８）、あるいは、骨関節炎の進行を遅らせるＢＭＰ７などの増殖因子と併用して（Ｈｕｎｔｅｒ ＤＪ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＢＭＣ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ Ｄｉｓｏｒｄ １１：２３２；Ｈａｙａｓｈｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ ２８：１５０２−１５０６）注射する。

細胞送達の１つのアプローチは、関節鏡視下での投与である。場合によって、関連する欠損または状態を修復する外科的手順または関節鏡視下手順の前、その後、またはその最中に細胞を投与または移植する。たとえば、ＡＣＬ修復手順、半月板修復、回旋筋腱板修復、または他の手順と併用して関節腔に細胞を投与する。このアプローチは、動物における間葉系幹細胞の半月板損傷の修復を評価するために使用されており（Ｈｏｒｉｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２７：８７８−８８７）、ヒトに好適である（Ｃｅｎｔａｎｏ ＣＪ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ ７１：９００−９０８．）。

本細胞および方法は、スポーツ関連、戦闘関連、および他の骨、軟骨および四肢の外傷性障害の修復を支援するのに有用である（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ２００６ Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ １４：Ｓ１５２−１５６；Ｓｕｎｄｅｌａｃｒｕｚ Ｓ ａｎｄ Ｋａｐｌａｎ ＤＬ ２００９ Ｓｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２０：６４６−６５５）。本細胞は、長骨骨折の修復に有用であり、内軟骨性骨化、すなわち軟骨を鋳型に骨化形成が起こり正常な一連の発生現象（ｎｏｒｍａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を再現させるプロセスにより修復を行う（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ ＨＭ ２００３ Ｎａｔｕｒｅ ４２３：３３２−３３６）。間葉系幹細胞を利用する方法に記載したように、細胞は、注射または移植により骨折の領域に導入されると、リモデリングが起こり修復のための骨を形成する（Ｋａｌｌａｉ Ｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｊ Ｂｉｏｍｅｃｈ ４３：２３１５−２３２０；Ｓｃｏｔｔｉ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００９ ＰＮＡＳ １０７：７２５１−７２５６）。

また、細胞は、事故もしくは軍事衝突が原因の外傷性障害または先天性欠損症により失われた手指または四肢を再生する方法にも有用である。イモリおよびカエルなどの下等動物は、四肢を再生する能力を有するものの、成体哺乳動物では、再生反応を行うのに必要な細胞およびシグナルが不十分であるため（Ｇｕｒｔｎｅｒ ＧＣ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｍｅｄ ５８：２９９−３１２；Ｍｕｎｅｏｋａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｓｃｉ Ａｍ ２９８：５６−６３）、この能力の大部分が失われている（Ｍｕｌｌｅｒ ＴＬ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｓｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １０：４０５−４１３）。

マウスの四肢再生モデルが樹立された。このモデルでは、切断された指尖部は自然な再生反応を示すのに対し、切断された指基部は再生することができない（Ｈａｎ Ｍ ｅｔ
ａｌ．，２００８ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ３１５：１２５−１３５）。このモデルは、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣ由来の軟骨前駆体細胞、特に骨格および軟骨形成細胞系譜（たとえば、２日目、３日目または４日目の細胞）に入ったばかりの細胞が哺乳動物の四肢再生に関与または促進する能力を試験する系となる。四肢（腕もしくは脚、手もしくは足）また
は指（手指もしくは足指）の再生治療のための送達方法は、本方法により産生された細胞を指または四肢に注射または移植により導入することを含む。細胞は、増殖因子を使用してあるいは使用せずにスキャフォールドまたはゲルを用いて導入する。この指再生モデルを図１５のＡ〜Ｄに示す。

疾患モデル
ヒト疾患のインビトロでのモデリングに際して、さらに標的治療法の設計および試験のための系として、遺伝性疾患の患者から採取したｉＰＳＣが使用される（Ａｍａｂｉｌｅ
Ｇ ａｎｄ Ｍｅｉｓｓｎｅｒ Ａ ２００９ Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌｅｃ Ｍｅｄ １５：５９−６８；Ｌａｕｓｔｒｉａｔ Ｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｂｉｏｃｈｅｍ
Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３８：１０５１−１０５７）。本発明も、遺伝性軟骨疾患のインビトロでのモデリング、および治療法の設計および試験に有用である。軟骨異形成症および軟骨無形成症（ａｃｈｏｎｄｏｐｌａｓｉａ）を含むこれらの障害は、外観が変形して障害を生み出す低身長、さらには死を引き起こす（Ｋｒａｋｏｗ Ｄ ａｎｄ Ｒｉｍｏｉｎ Ｄ ２０１０ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ １２：３２７−３４１）。このため、軟骨に影響を与える遺伝子性障害（たとえば、軟骨異形成症、軟骨無形成症または他の症状）のある個体から採取した線維芽細胞または他の細胞型からｉＰＳＣを得て、本明細書に記載の方法を適用して軟骨細胞分化を誘導する。このｉＰＳＣ由来の軟骨形成細胞は、インビトロで疾患プロセスを再現し、疾患の病理学的変化の機構研究、ならびに標的治療法（ｔｈｅｒａｐｕｅｕｔｉｃｓ）の設計および試験を可能にする。このアプローチは、たとえば細胞外マトリックスタンパク質の合成または硫酸化；代謝酵素、イオンチャネルもしくはトランスポーター；分子のフォールディング、プロセシングもしくは分解；ホルモン、増殖因子、受容体もしくはシグナル伝達物質；転写因子；ＲＮＡプロセシング；または細胞骨格タンパク質の欠損などにより引き起こされるような、メカニズムの大部分が不明である軟骨異形成症に適用される（Ｋｒａｋｏｗ Ｄ ａｎｄ Ｒｉｍｏｉｎ Ｄ ２０１０ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ １２：３２７−３４１）。このアプローチは、正常もしくは異常な軟骨機能に重要な新規な遺伝子または治療の新規な標的を同定するための遺伝子プロファイリングにも適用される（Ｐｏｇｕｅ Ｒ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｍａｔｒｉｘ
Ｂｉｏｌ ２３：２９９−３０７）。このアプローチを遺伝子ターゲティングと組み合わせて単一遺伝子（ｍｏｎｇｅｎｉｃ）軟骨異形成症の患者特異的細胞による治療を試みてもよい（Ｗｏｎｇ ＧＫ ａｎｄ Ｃｈｉｕ ＡＴ ２０１０ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
Ａｄｖ Ｊｕｌｙ ２４）。

軟骨修復の評価には、大型および小型動物の実験モデルを使用する（Ｃｈｕ ＣＲ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ｂ １６：１０５−１１５）。あるモデルでは、外科的な膝靭帯の切断および／または部分的な半月板切除（ｍｅｎｉｓｃｅｔｏｍｙ）により膝関節を不安定にして、荷重を不適切に集中させ、限局性の関節軟骨の破壊を引き越す。このモデルで起こる軟骨欠損は非常に再現性がよく、その軟骨破壊の発生および進行において、慢性ヒト変形性関節症で見られる状態が忠実に再現される。このモデルは、様々な動物の関節に間葉系幹細胞を注射することにより、損傷した関節軟骨の細胞による修復を評価するのに使用されている（たとえばＭｕｒｐｈｙ ＪＭ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４８：３４６４−３４７４；Ｋｕｂｏ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ６０：１５５−１６５）。このモデルは、齧歯動物にも応用されている（Ｋａｍｅｋｕｒａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔ １３：６３２−６４１；Ｇｌａｓｓｏｎ ＳＳ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔ １５：１０６１−１０６９；Ｗｅｌｃｈ ＩＤ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ １１：Ｒ１４）。このモデルは現在、免疫能が低下したマウスで樹立され、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣ由来の軟骨形成細胞による修復のインビボ試験に使用されている（図１４のＡ〜Ｄ）。

軟骨修復の評価に使用される別のモデルは、外科的に作製した関節軟骨欠損を利用する（Ａｈｅｒｎ ＢＪ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔ １７：７０５−７１３）。このモデルでは、大腿骨膝蓋溝の非荷重部を露出させ、大腿骨を切除するか、または軟骨表面から軟骨下骨に及ぶ穴を開けて全層欠損を機械的に作製する。このアプローチは大型動物に使用され、ラット（Ｄａｕｓｓｅ Ｙ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｔｉｓ Ｃａｒｔ １１：１６−２８）、およびマウス（Ｅｌｔａｗｉｌ ＮＭ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ
Ｃａｒｔ １７：６９５−７０４；Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔ ６：６９５−７０４）にも適合されている。このモデルは、急性傷害後の関節軟骨損傷を刺激し、ヒトの場合と同様に、欠損を治癒できないと、損傷部位の外側で軟骨変性がさらに起こり、明らかなＯＡに至る。

実施例１：ｈＥＳＣの培養および胚様体形成
ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで作製されたＨ９ ｈＥＳＣ株（Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：１１４５−１１４７）。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｏｒｅにより標準的なプロトコルを用いて調製された放射線照射ＣＦ１マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）をフィーダー層とし、以前に記載された無血清ｈＥＳＣ培地（Ｔｏｈ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２５：９５０−９６０）でＨ９細胞を培養した（図１のＡを参照）。１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理してから４〜６日ごとにコロニーを継代した。本研究では、継代数３６〜４５のｈＥＳＣを使用した。

ＥＢを作製するため、０．１％ディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃にて２０〜３０分間処理してｈＥＳＣのコロニーをＭＥＦフィーダー層から剥離し、Ｔ７５ Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｆｌａｓｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）中のＥＢ形成培地に懸濁し（Ｔｏｈ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌｓ，２５：９５０−９６０）、５日間インキュベートした。培地は、４８時間ごとに交換した。図１のＢに示すように、懸濁されたｈＥＳＣコロニーは、細胞の三次元凝集塊からなるＥＢを形成する。

ＥＢ細胞および未分化ｈＥＳＣ由来のマイクロマス培養物の調製
５日目のＥＢ（図１のＢ）および未分化ｈＥＳＣコロニー（図１のＡ）から分離した両方の細胞からマイクロマス培養物を調製した。分離の前に、ｈＥＳＣコロニーを上記のようにＭＥＦフィーダー層から剥離した。剥離したｈＥＳＣコロニーおよびＥＢを０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理することにより単細胞に分離し、続いて細胞懸濁液を４０μｍのセルストレーナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に通した。分離した細胞を、１０％ＦＢＳ（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ）および１０％＞ＫＳＲを補充した高グルコースＤＭＥＭに２×１０７細胞／ｍｌで懸濁した。マイクロマス培養物は、１０μｌの細胞懸濁液（２×１０５細胞）を２４ウェル組織培養ディッシュ（Ｎｕｎｃ；Ｆｉｓｈｅｒ）の各ウェルにスポットして調製した。細胞接着を促進するため加湿５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて２時間インキュベートした後、０．５ｍｌの同じ培地を各ウェルに加えた。２４時間後（培養の２日目の開始）、培地を除去し、培養物に無血清軟骨形成培地を供給した（Ｔｏｈ ＷＳ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２５：９５０−９６０）。軟骨形成培地は、ＩＴＳ（６．２５μｇ／ｍｌのインスリン、６．２５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、６．２５μｇ／ｍｌのセレン）、１．２５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、５．３５μｇ／ｍｌのリノール酸（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１％ＫＳＲ、４０μｇ／ｍｌのＬ−プロリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０μｇ／ｍｌのアスコル
ビン酸２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０−７Ｍ デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１００単位／１００μｇのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した高グルコースＤＭＥＭを含む。次いで細胞を、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＢＭＰ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、あるいは、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＢＭＰ２と１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦ−β１との組み合わせのいずれかの存在下または非存在下で培養する。一部の実験では、ｈＥＳＣのマイクロマス培養物を、増殖因子を含まない軟骨形成培地で２４時間（２日目を通して）培養し、その後（培養の３日目の始めに）、培養物に、上記のような増殖因子を補充した新鮮な軟骨形成培地を供給した。増殖因子を含む培地は、培養期間を通して４８時間ごとに交換した。

アルシアンブルー染色、ＩＩ型コラーゲンおよびアグリカンの免疫染色
マイクロマス培養物をアルシアンブルー、ｐＨ１．０で以前に記載されたように染色して、軟骨基質の蓄積を組織化学的にモニターした（Ｇａｙ ＳＷ ａｎｄ Ｋｏｓｈｅｒ
ＲＡ，１９８４ Ｊ Ｅｘｐ Ｚｏｏｌ，２３２：３１７−３２６）。ＩＩ型コラーゲンの免疫染色では、４％パラホルムアルデヒドを含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３０分間マイクロマス培養物を固定し、ＰＢＳで洗浄し、組織培養プレートから掻き取り、脱水し、パラフィンに包埋し、７μｍの矢状断切片を作製した。免疫組織化学的検査については、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と、ＩＩ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体（抗ＩＩ型コラーゲン、クローン６Ｂ３；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、および軟骨マーカー、アグリカンの球間ドメインに対するモノクローナル抗体（６−Ｂ−４；Ａｂｅａｍ）とを用いて行った。切片を脱パラフィンし、０．５％Ｈ２Ｏ２メタノール溶液で１５分間クエンチし、ペプシン（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ）とインキュベートすることにより抗原賦活化を行った。切片を、５％正常ウマ血清を含むＴＢＳでブロッキングしてから、１：２００希釈ＩＩ型コラーゲン抗体と１時間インキュベートした。次いでこの切片を、１：２００希釈ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧと室温にて１時間インキュベートし、アビジン−ビオチン西洋わさびペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット）で処理し、ジアミノベンジジン／Ｈ２Ｏ２（Ｖｅｃｔｏｒ）で発色させた。陰性対照は、一次抗体とインキュベートしないものであり、ほとんど、あるいはまったく染色を示さなかった。

リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いてマイクロマス培養物から全ＲＮＡを抽出し、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）で処理して混入する恐れがあるゲノムＤＮＡを除去した。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、２０μｌの反応容量に対して２μｇのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、Ｓｏｘ９（アッセイＩＤ Ｈｓ００１６５８１４＿ｍｌ）、アグリカン（アッセイＩＤ Ｈｓ００１５３９３６＿ｍｌ）、ＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ２ａ１）（アッセイＩＤ Ｈｓ００２６４０５１＿ｍｌ）、Ｘ型コラーゲン（Ｃｏｌ１０ａ１）（アッセイＩＤ Ｈｓ００１６６６５７＿ｍｌ）、オステオポンチン（ｏｐｎ）（アッセイＩＤ Ｈｓ００９６０９４２＿ｍｌ）、Ｉｎｄｉａｎ ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｉｈｈ）（アッセイＩＤ Ｈｓ０１０８１８０１＿ｍｌ）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（アッセイＩＤ Ｈｓ００６１００８０＿ｍｌ）、およびグリエルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）（ＧＡＰＤＨ）（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍｌ）について、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、およびＴａｑＭａｎ
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。遺伝子発現レベルは、内部標準遺伝子としてＧＡＰＤＨを用いてΔΔＣｔ法により判定した。各遺伝子の相対量は、解析対象の各処理および時点ごとに２〜３つの独立したマイクロマス培養物それぞれから調製したサンプル２つずつの−２ΔΔＣｔとして計算した。サーマルサイクリング条件は、５０℃で２分、９５℃で１０分、その後９４℃で１５秒の変性を４０サイクル、６０℃で１分の伸長反応であった。

実施例２：未分化多能性ｈＥＳＣの直接かつ段階的な軟骨細胞分化
ＥＢの特徴を示す細胞環境および固有の細胞多様性が明確に定義されていないため、未分化多能性Ｈ９ ｈＥＳＣ（図１のＡ）が高密度培養に供されたときに軟骨形成細胞系譜に直接分化する能力を調べた。高密度培養物は、濃度が培地の１０μｌ当たり１×１０５細胞を超える。たとえば、細胞の濃度は、１０μｌ当たり１〜４×１０５細胞、たとえば、１０μｌ当たり２×１０５細胞である。より大規模な培養が望ましい場合、体積を増やすが、細胞密度／比率は、上述の範囲内にとどめるものとする。

分離したＨ９細胞のマイクロマス培養の樹立の翌日、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ２の存在下および非存在下で無血清「軟骨形成培地」を補充した。図４のＡに示すように、分離した未分化なＨ９ ｈＥＳＣ細胞から直接樹立した１４日目の未処理のマイクロマス培養では、ごくわずかな小さなアルシアンブルー染色領域のみが存在した。外来性のＢＭＰ２の存在下では、１４日目のＢＭＰ２処理ｈＥＳＣマイクロマス培養物中に実質的に均一で強く染色されたアルシアンブルー陽性基質が蓄積する（図４のＢ）。均一なアルシアンブルー染色だけでなく、コラーゲン抗体を用いた免疫染色により検出可能で軟骨に特徴的なＩＩ型コラーゲンＩＩ型が、ＢＭＰ２処理培養物の全体に存在した（図４のＣ）。

上記のように培養した未分化なＨ９細胞マイクロマス培養物でアルシアンブルー基質の蓄積が進行するのを図５のＡ〜Ｃに示す。培養から３日後では、検出可能なアルシアンブルー染色はほとんど認められなかったが（図５のＡ）、７日目には、比較的均一なアルシアンブルー染色が培養物全体で検出可能であった（図５のＢ）。１４日目では、より強く染色されたアルシアンブルー陽性基質が培養物全体に存在した（図５のＣ）。これらの結果から、未分化多能性ｈＥＳＣは、適切な細胞環境（高密度マイクロマス培養）、およびＢＭＰ２などの外来性のシグナル伝達分子が供給されると、ＥＢ段階を経ずに直接かつ極めて均一な軟骨形成を示すことが示唆される。

上述の軟骨細胞分化プロトコルを改変すると、ｈＥＳＣの軟骨形成細胞系譜への分化の進行がさらに促進される。この改変プロトコルでは、ｈＥＳＣマイクロマス培養の樹立の翌日、ＢＭＰ２を含まない無血清「軟骨形成培地」を補充し、次いで２４時間後に１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ２を補充する。図５のＤ〜Ｆに示すように、３日目の培養物では検出可能なアルシアンブルー陽性基質がほとんど認められないが、７日目には、培養物の全体に均一でかなり強いアルシアンブルー基質が存在した。１４日目には、培養物の全体に非常に強く染色されたアルシアンブルー基質が存在した（図５のＦ）。外来性のＢＭＰ２を３日目に供給したこの改変プロトコルを利用すると（図５のＤ〜Ｆ）、ＢＭＰ２を２日目にｈＥＳＣ培養物に補充したプロトコルと比較して（図５のＡ〜Ｃ）、アルシアンブルー染色の範囲および強さが大きくなった。

実施例３：ｈＥＳＣマイクロマス培養物における様々な相の軟骨形成細胞系譜の細胞に関する遺伝子発現プロファイリングによる特徴付け
多能性ｈＥＳＣの軟骨形成細胞系譜への分化の進行を確認および定量し、さらに様々な相の系譜の前駆体細胞の特徴付けを行うため、軟骨形成細胞系譜の様々な段階に特徴的なマーカー遺伝子の発現をリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲにより調べた。上記の図５のＤ〜Ｆに示すようなアルシアンブルー基質染色によりアッセイされる段階的な軟骨細胞分化を
誘導するように改変した軟骨細胞分化プロトコルを行った多能性ｈＥＳＣのＢＭＰ２処理マイクロマス培養物における遺伝子発現パターンについて、何回も解析した。

図７のＡに示すように、外来性のＢＭＰ２の添加から２４時間後の培養の３日目の終了時に、軟骨形成の転写因子Ｓｏｘ９の発現が７倍と著しくアップレギュレートされる。Ｓｏｘ９は、軟骨分化の「マスター制御遺伝子」として特徴付けられており、軟骨形成の実質的にすべての初期相の決定的なレギュレーターである（Ａｋｉｙａｍａ Ｈ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １６：２８１３−２８２８；Ｌｅｆｅｂｖｒｅ Ｖ ａｎｄ Ｓｍｉｔｓ Ｐ，２００５ Ｂｉｒｔｈ Ｄｅｆｅｃｔｓ Ｒｅｓ Ｃ Ｅｍｂｒｙｏ Ｔｏｄａｙ，７５：２００−２１２）。したがって、３日目の培養物におけるＳｏｘ９発現の著しいアップレギュレーションは、細胞が軟骨形成細胞系譜に入ったことと整合する。また、３日目の培養物で転写因子Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現が２４倍のアップレギュレーションを示すことも注目に値する（図７のＢ）。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは、中胚葉系譜のマーカーであり、発生中の四肢に軟骨を形成する前軟骨形成中胚葉細胞にも発現する（Ｈｅｒｒｍａｎｎ ＢＧ，１９９５ Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６：３８５−３９４；Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，１１５：７６９−７８１；Ｌｉｕ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３０：１３２７−１３３７）。したがって、Ｓｏｘ９と共にＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現がアップレギュレートされたことは、３日目の培養が軟骨形成細胞系譜に入ったことをさらに示唆する。３日目の培養物はＳｏｘ９およびＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現のアップレギュレーションを示すものの、この培養物は、軟骨マーカー、アグリカンの発現のアップレギュレーションを示さない（図７のＡ）。３日目の培養物では、アグリカンは２日目と同じ低い基準レベルで発現する。アグリカンは、軟骨基質の主要な硫酸化プロテオグリカンであり、明らかに分化した軟骨細胞の信頼できる高度に特異的な分子マーカーである（Ｈａｎ Ｙ ａｎｄ Ｌｅｆｅｂｖｒｅ Ｖ，２００８ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８：４９９９−５０１３）。これらの結果から、３日目の培養物は軟骨形成細胞系譜に入っているものの、まだ軟骨細胞への明らかな分化を示していないことが示唆される。また、３日目の培養物はアグリカン発現のアップレギュレーションを示していないが、軟骨に特徴的なＩＩ型コラーゲンをコードするＣｏｌ２ａ１の転写物の発現が約４倍のアップレギュレーションを示すことにも留意されたい（図７のＡ）。しかしながら、Ｃｏｌ２ａ１は、アグリカンと異なり、発生中の四肢の軟骨形成細胞系譜にある初期の前軟骨形成間葉系細胞だけでなく、分化した軟骨細胞にも発現する（Ｈａｎ Ｙ
ａｎｄ Ｌｅｆｅｂｖｒｅ Ｖ，２００８ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８：４９９９−５０１３；Ｎａｈ ＨＤ ａｎｄ Ｕｐｈｏｌｔ ＷＢ，１９９１ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６６：２３４４６−２３４５２；Ｓａｋａｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ，１９：７６１−７６７）。この遺伝子発現パターンからは、３日目の培養物が軟骨形成細胞系譜には入っているものの、まだ軟骨細胞への明らかな分化を示していないことが示唆される。

図７のＡおよびＢに示すように、４日目の培養物は、転写制御因子Ｓｏｘ９およびＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現のさらなるアップレギュレーションを示す。４日目の培養物では、３日目の培養物よりＳｏｘ９発現が２倍を超えて高く、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現は５倍高くなっている（図７のＡおよびＢ）。さらに、４日目の培養物は、信頼できる軟骨マーカー、アグリカンの発現の４倍を超えるアップレギュレーションを示す（図７のＡ）。アグリカンの発現のアップレギュレーションから、４日目の培養物が軟骨細胞への明らかな分化の初期相にあることが示唆される。

培養の７日目には、Ｓｏｘ９およびＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現が著しくダウンレギュレートされる（図７のＡおよびＢ）。７日目では４日目と比較して、Ｓｏｘ９の発現が約１
０倍（図７のＡ）低下し、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現が約２４倍低下する（図７のＢ）。１４日目には、Ｓｏｘ９の発現は低下し続けて非常に低レベルになり、１４日目のＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現は無視できる程度である（図７のＡおよびＢ）。７日目および１４日目のＳｏｘ９およびＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現のダウンレギュレーションは、軟骨マーカー、アグリカンおよびＣｏｌ２ａ１の発現の約８倍のアップレギュレーションと同時に起こる。上記のような、７日目および１４日目のアグリカンおよびＣｏｌ２ａ１発現のアップレギュレーションは、免疫染色により検出可能なアルシアンブルー陽性基質およびＩＩ型コラーゲンの均一な蓄積と相関する。これらの遺伝子発現および染色のパターンから、７日目および１４日目の培養物は、軟骨細胞への非常に明らかな分化を均一に示していることが示唆される。

注目されるのは、明らかな軟骨分化を示した７日目および１４日目の培養物が肥大軟骨細胞成熟のマーカーを発現していないことである。７日目または１４日目の培養物では、肥大軟骨細胞の信頼できる分子マーカーＣｏｌ１０ａ１の発現が検出されず、最終肥大成熟化のマーカー、オステオポンチン（ＯＰＮ）の発現が無視できる程度である（図７のＡ）。また、７日目および１４日目の培養物は、成熟を開始させる前肥大軟骨細胞のマーカーＩｎｄｉａｎ ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｉｈｈ）の発現も無視できる程度である。これらの結果から、７日目および１４日目の培養物を構成する軟骨細胞は肥大軟骨細胞への成熟を示していないことが示唆される。

不適切な肥大成熟化は変形性関節症の特徴であるため、ヒト（または他の哺乳動物）の治療に使用される細胞集団にこの表現型が存在することは、望ましくない。一部の系では、ＢＭＰにより誘導される軟骨形成培養物が、Ｘ型コラーゲン（ＣＯＬ）およびＩｎｄｉａｎ ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＩＨＨ）など軟骨細胞肥大に関連する遺伝子の高い発現を示す。こうした肥大関連の変化は、変形性関節症などの病状に見られる。こうした肥大関連マーカーが非存在であるか、またはその発現が無視できる程度であることは、本明細書に記載の細胞が他の調製物に対して利点を有しており、理想的には病変または損傷した関節軟骨組織への治療投与に適していることが示唆される。

図７のＣ〜Ｅに示すように、ＢＭＰ２単独で処理したｈＥＳＣマイクロマス培養物の軟骨系譜マーカーの発現を、ＴＧＦβ１単独処理した培養物、またはＴＧＦβ１とＢＭＰ２との組み合わせで処理した培養物の発現と比較した。ＴＧＦβ１は、ＢＭＰ２と異なり単独では軟骨マーカーの発現を刺激しない。実際、ＴＧＦβ１処理培養物および未処理の対照培養物は、アグリカン、Ｓｏｘ９、およびＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現が同程度の低レベルを示す（図７のＣ〜Ｅ）。

実施例４：様々な相の軟骨形成細胞系譜における未分化多能性ｈＥＳＣの分化／未分化多能性ｈＥＳＣの前駆体細胞への直接かつ段階的な分化
変形性関節症などの軟骨の変性疾患を処置するためのｈＥＳＣを実現するには、ｈＥＳＣの軟骨形成細胞系譜への分化を誘導する方法を開発する必要がある。ｈＥＳＣの軟骨形成細胞系譜への段階的かつ均一な分化を可能にする培養系および培養条件については上述した。上記のように、ＢＭＰ２（またはＢＭＰ２とＴＧＦβとの両方）の存在下で未分化多能性ｈＥＳＣをマイクロマス培養に供すと、前もってＥＢ形成をせずに軟骨形成細胞系譜への段階的かつ非常に均一な分化が直接起こる。

多能性未分化ｈＥＳＣが示す直接かつ段階的な軟骨細胞分化により、軟骨形成細胞系譜の様々な相にある前駆体細胞の特徴付けが可能になり、細胞ベースの組織工学治療を用いて損傷または病変したヒト軟骨を修復する能力を試験および比較することができるようになった。培養の様々な時期に得られた、ＢＭＰ２処理ｈＥＳＣマイクロマス培養物の遺伝子発現プロファイリングにより、軟骨形成細胞系譜に入ったばかりの細胞（３日目の培養
物、すなわち、軟骨前駆体）、明らかな軟骨細胞分化の初期相にある細胞（４日目の培養物、すなわち、初期の軟骨細胞）、および軟骨細胞への明らかな分化を均一に示すが、肥大成熟化を示していない細胞（７日目および１４日目の培養物、すなわち、十分に分化した軟骨細胞）を同定した。

特に、３日目のｈＥＳＣマイクロマス培養物は転写制御因子Ｓｏｘ９およびＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現のアップレギュレーションを特徴とするが、明らかに分化した軟骨細胞の信頼できる高度に特異的な分子マーカー、アグリカンの発現のアップレギュレーションを示さず、アルシアンブルー陽性基質もほとんど、またはまったく示さない。このため、３日目の培養物は、軟骨形成細胞系譜に入ってはいるものの、まだ軟骨細胞への明らかな分化を示してない。こうした軟骨形成細胞系譜の初期でのこの前駆体細胞の特徴は、軟骨欠損の修復に有用である。非常に初期相の軟骨形成細胞系譜の細胞は、系譜の後期の細胞と比較して修復への関与を促進するシグナルにより応答しやすい。

発生の特定の段階にある細胞集団は、ある種の臨床徴候に好ましい。たとえば、２日目〜４日目の細胞（軟骨形成前駆体または初期の軟骨細胞）は、損傷した組織および軟骨に融合しやすく、より優れた長期にわたる修復を誘発する。

軟骨前駆体（２日目〜３日目の細胞）は、四肢または手指の再生、半月板（ｍｅｎｓｉｃａｌ）または靭帯の修復、および骨折修復に優先的に使用される。初期の軟骨細胞（４日目の細胞）は、傷害による関節軟骨欠損の修復、慢性疾患（ＯＡまたはＲＡ）による関節軟骨損傷の修復または予防、外傷または先天性欠損により失われた軟骨組織の再生および置換、半月板の修復、ならびに顎関節の線維軟骨の修復に使用される。より十分に分化した軟骨細胞は、急性もしくは外傷性障害後の関節軟骨の修復、または疾患（ＯＡまたはＲＡ）による関節軟骨の修復もしくは予防のほか、内軟骨性骨化による骨折修復などへの適用に好適である。各段階は、軟骨発生および分化のモデリングに有用であり、ｉＰＳＣ由来の細胞は、患者個人を考慮した修復および再生のほか、ヒト疾患のモデリング、標的治療の設計および試験、ならびに遺伝的に傷害された軟骨組織の疾患特異的修復に特に有用である。

４日目のＢＭＰ２処理ｈＥＳＣマイクロマス培養物は、Ｓｏｘ９およびＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現のさらなるアップレギュレーションを示し、信頼できる軟骨マーカー、アグリカンの発現の４倍を超えるアップレギュレーションを示すことから、４日目の培養物が軟骨細胞への明らかな分化の初期相にあることが示唆される。７日目および１４日目の培養物は、Ｓｏｘ９およびＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現のダウンレギュレーションが、軟骨マーカー、アグリカンおよびＣｏｌ２ａ１の発現の約８倍のアップレギュレーションと同時に起こることを特徴とする。また、均一なアルシアンブルー陽性基質も７日目および１４日目の培養物の全体に存在し、免疫染色により検出可能なＩＩ型コラーゲンも培養物の全体に存在する。７日目および１４日目の培養物は、Ｃｏｌ１０ａ１、Ｉｈｈもしくはオステオポンチンなどの肥大軟骨細胞成熟のマーカーを発現しない。このため、７日目および１４日目の培養物は、軟骨細胞への明らかな分化を示しているが、肥大成熟化を示していない。このことは、関節軟骨を構成する軟骨細胞が肥大成熟化を示さないのが通常であり、実際に関節軟骨細胞の不適切な肥大成熟化は変形性関節症に特徴的なものであるため、関節軟骨の修復に細胞を利用することを考慮する際に重要である。７日目および／または１４日目の培養物の軟骨細胞が肥大成熟化を示していないということにより、これらの細胞は軟骨欠損の修復の好ましい候補となる。

前駆体細胞を軟骨形成細胞系譜に誘導する決定プロセスに関係する因子を同定するためのｈＥＳＣのマイクロマス培養物
軟骨分化の開始を制御するＳｏｘ９など一部の制御遺伝子が同定されているとはいえ、
胚性前駆体細胞の軟骨形成細胞系譜への段階的な決定またはコミットメントに関係する遺伝子および他の因子についてはほとんど知られていない。ＢＭＰ２の存在下でのマイクロマス培養におけるｈＥＳＣの段階的分化は、こうした初期の決定現象に関係する因子を明らかにする好適な系となる。未分化多能性ｈＥＳＣから軟骨細胞への系譜進行の様々な段階における細胞のトランスクリプトームを解析すれば、初期の軟骨形成細胞系譜のコミットメント現象を制御する遺伝子、シグナル伝達分子、および制御ネットワークを同定し、決定プロセスに関係する未知の遺伝子を明らかにしやすくなる。

上述の遺伝子発現プロファイリングからは、細胞を軟骨形成細胞系譜に誘導する際の転写因子Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの役割が示される。これまでの研究から、Ｔボックス転写因子であるＢｒａｃｈｙｕｒｙは、原腸形成において高度に発現し、初期の（ｐｒｉｍａｒｙ）中胚葉形成で不可欠な役割を果たしていることが明らかになっている（Ｈｅｒｒｍａｎｎ ＢＧ，１９９５ Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６：３８５−３９４）。発生の後期には、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは、肢芽形成の開始時に側部中胚葉に発現し、その後発生中の四肢に軟骨を形成する前軟骨形成間葉系細胞に発現する（Ｌｉｕ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３０：１３２７−１３３７）。上記のように、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現は、ＢＭＰ２で処理したｈＥＳＣマイクロマス培養物が、軟骨形成の転写因子Ｓｏｘ９の発現のアップレギュレーションによりアッセイされる軟骨形成細胞系譜に入ったばかりのときにアップレギュレートされる（２４倍）。ＢｒａｃｈｙｕｒｙおよびＳｏｘ９の発現のアップレギュレーションは、信頼できる軟骨マーカー、アグリカンの発現のアップレギュレーションの前に同時に起こる。次いでＢＭＰ２処理ｈＥＳＣマイクロマス培養物でアグリカンの発現のアップレギュレーションが開始されると、ＢｒａｃｈｙｕｒｙおよびＳｏｘ９の発現が同時にさらに増加する。軟骨形成の開始後、明らかな軟骨分化が起こると、ＢｒａｃｈｙｕｒｙおよびＳｏｘ９の発現は同時に無視できるレベルまで低下する。ＢＭＰ２処理未分化多能性ｈＥＳＣの軟骨細胞への段階的分化におけるこの発現パターンから、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙが中胚葉性前駆体細胞の軟骨形成細胞系譜への初期コミットメントの調節に関係していることが示唆される。

Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現は、ＢＭＰ２シグナル伝達に応答して間葉系細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２の軟骨細胞分化の開始時にアップレギュレートされ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，１１５：７６９−７８１）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの強制発現によりＳｏｘ９の発現およびＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の軟骨細胞分化が促進される（Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，１１５：７６９−７８１）ことが明らかになっている。さらに、ドミナントネガティブ型のＢｒａｃｈｙｕｒｙは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞のＢＭＰ２刺激による軟骨細胞分化を障害する（Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，１１５：７６９−７８１）。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは、Ｃ３Ｈ１０１／２細胞などの前軟骨形成前駆体細胞にＢＭＰ２に応答して軟骨細胞分化を示す能力を与える可能性があることが示唆されている（Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，１１５：７６９−７８１）。上述の結果は、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現が、ＢＭＰ２に応答してｈＥＳＣが軟骨形成細胞系譜に入るとアップレギュレートされることを示唆し、以前の研究と整合している。これらの研究は、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙが、前駆体細胞を軟骨形成細胞系譜に誘導する決定プロセスに関係していることを示す。

実施例５：ヒト胚性幹細胞の軟骨形成細胞系譜への分化
図４のＣに示すように、ＢＭＰ２処理ｈＥＳＣマイクロマス培養物全体に細胞外軟骨に特徴的なＩＩ型コラーゲンが存在することが、培養物の矢状断面をＩＩ型コラーゲン抗体で免疫染色することにより検出される。さらに、軟骨マーカー、アグリカンの球状ドメインに対するモノクローナル抗体で細胞質が染色される細胞も、ＢＭＰ−２処理ｈＥＳＣマ
イクロマス培養物全体に存在する（図９）ことから、ＩＩ型コラーゲン細胞外マトリックスで囲まれた細胞の実質的にすべてが、細胞自律性（ｃｅｌｌ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ）マーカーで免疫染色することによりアッセイされる軟骨マーカー、アグリカンを発現していることが示される。

培養物における軟骨基質の蓄積は通常、基質の硫酸化プロテオグリカンを染色するアルシアンブルー、ｐＨ１．０を用いたインタクトな培養物のホールマウント染色によりモニターする。ＢＭＰ２単独、またはＢＭＰ２とＴＧＦ−β１とにより処理したｈＥＳＣマイクロマス培養物ではホールマウント染色により、アルシアンブルーで染色可能な基質の非常に均一な蓄積が検出可能である（図４〜図６）。軟骨分化の程度を組織学的に評価するため、ｈＥＳＣマイクロマス培養物の矢状断面をアルシアンブルーで染色し、核染色のＮｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄで対比染色した。アルシアンブルーにて染色可能な細胞外マトリックスで囲まれた細胞は、ＢＭＰ２の単独処理（図１０Ａ）、あるいはＢＭＰ２とＴＧＦ−β１とで処理（図１０Ｂおよび図１０Ｃ）したｈＥＳＣマイクロマス培養物の組織学的切片の実質的に全範囲にわたり存在する。ＢＭＰ２処理ｈＥＳＣ培養物は、広範囲に及ぶ軟骨組織に加えて少数の管状構造物を含んでいた（図１０Ａ；矢印）。培養物にＴＧＦ−β１およびＢＭＰ２を供給すると、検出可能な管の数はかなり減少し、管は培養物の非常に小さな割合を占めるだけである。したがって、ＢＭＰ２およびＴＧＦ−β１の両方で処理したｈＥＳＣマイクロマス培養物では、軟骨細胞分化が、完全には均質ではないが非常に均一に起こり、以前に報告された他の培養系の場合よりかなり安定して広範囲に及ぶようになる。実際、胚様体（ＥＢ）細胞から樹立された、ＢＭＰ２＋ＴＧＦ−β処理マイクロマス培養物は、非常に不均一であり、軟骨形成組織だけでなく、大量の脂肪組織、さらには管からなる（図１１）。

実施例６：再生医療およびヒト疾患モデリングのためのｉＰＳＣ由来軟骨細胞
ｉＰＳＣは患者自身の細胞から採取されるため、患者特異的細胞を用いた治療および再生医療の手段となる（Ａｍａｂｉｌｅ Ｇ ａｎｄ Ｍｅｉｓｓｎｅｒ Ａ ２００９ Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １５：５９−６８）。図１１、図１２、および図１３に示すように、ｉＰＳＣは、本明細書に記載の方法により誘導され軟骨形成細胞系譜への段階的な分化を示す。

図１１（Ａ）は、ＢＭＰ２を補充せずに１４日間維持されたｉＰＳＣの対照マイクロマス培養物を示し、アルシアンブルー陽性基質の蓄積をほとんど示していない。図１１（Ｂ）は、１４日目のＢＭＰ２処理ｉＰＳＣマイクロマス培養物を示し、培養物全体に強くて広範囲のアルシアンブルー染色が存在することを示す。

ＢＭＰ２補充ｉＰＳＣ由来マイクロマス培養物による軟骨細胞分化の進行を確認するため、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｓｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１およびアグリカンなど軟骨形成細胞系譜に特徴的なマーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現のリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを使用した。これらのマーカー遺伝子のレベルは、培養期間中、ＢＭＰ２を補充したｈＥＳＣマイクロマス培養物の場合と同様のアップレギュレーションを示した。さらに、ＢＭＰ２補充ｉＰＳＣマイクロマス培養物では、肥大軟骨細胞のマーカー、オステオポンチンｍＲＮＡの発現が無視できる程度であった。したがって、本方法を用いたｉＰＳＣのマイクロマス培養物は、インビトロで軟骨形成細胞系譜への段階的分化を示し、さらに肥大を示さない。

３種の酵素的アプローチ、トリプシン−ＥＤＴＡ、ＡｃｃｕｔａｓｅまたはＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔによって単細胞に分離したｉＰＳＣから樹立したマイクロマス培養物別に軟骨細胞分化を比較する研究を行った。図１２に示すように、７日後、トリプシン−ＥＤＴＡ（図１２のＡ）、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（図１２のＢ）、あるいはＡｃｃｕｔａｓｅ（図１２のＣ）のいずれかで予め分離したｉＰＳＣから樹立したＢＭＰ２補充マ
イクロマス培養物はそれぞれ、強く染色された広範囲のアルシアンブルー陽性基質の蓄積を同程度に示すことから、各分離方法は、ＢＭＰ２に応答してこのプロトコルで軟骨細胞分化をうまく示すことができる単一のｉＰＳＣを作製するのに同等に有効である。ＢＭＰ２を補充せずに維持した培養物には、アルシアンブルー陽性基質がほとんど存在しない（図１２のＤ〜Ｆ）。

図１３に示すように、ｉＰＳＣマイクロマス培養物は、ＢＭＰ２（図１３のＡ）、およびＢＭＰ２とＴＧＦβ１との組み合わせ（図１３のＢ）に応答して培養から１４日後に広範囲の強いアルシアンブルー染色によりアッセイされる軟骨細胞分化を同程度に示す。これに対し、ＢＭＰ２補充を受けなかったｉＰＳＣマイクロマス培養物は、アルシアンブルー陽性基質がほとんど蓄積されない（図１３のＣ）。

したがって、本方法は、上述のアプローチを用いて、傷害またはＯＡもしくはＲＡなどの慢性疾患による関節の関節軟骨欠損修復、および四肢再生、半月板もしくは靭帯欠損の修復、および骨折修復などの患者個人を考慮した軟骨修復および再建治療のためのｉＰＳＣの作製に有用である。

遺伝子性障害の個体から採取されたｉＰＳＣは、疾患モデリングと、標的治療の設計および試験のスクリーニングとの手段となる（Ｌａｕｓｔｒｉａｔ Ｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３８：１０５１−１０５７；Ｌｅｎｇｎｅｒ ＣＪ ２０１０ Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１９２：３８−４４）。ｉＰＳＣを遺伝子ターゲティングと組み合わせると、単一遺伝子疾患を処置するアプローチとなる（Ｗｏｎｇ ＧＫＹ ａｎｄ Ｃｈｉｕ ＡＴ ２０１０ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
Ａｄｖ ２８：７１５−７２４）。

図１６に示すようなｉＰＳＣを、軟骨異形成症のヒト患者から作製した。遺伝性軟骨障害のヒト患者由来のｉＰＳＣは、本明細書に記載の方法を用いて軟骨形成細胞系譜に分化するように誘導される。ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの軟骨細胞分化の誘導に使用した高密度マイクロマスアプローチなどの高密度培養法は、毒性試験として（Ｐｉｅｒｓｍａ ＡＨ
２００４ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｌｅｔｔ １４９：１４７−１５３；Ｐｏｎｃｅ ＲＡ ２００１ Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｔｏｘｉｃｏｌ １３：１３．３）、軟骨発生の新規な遺伝子制御因子を同定するためのゲノムスクリーニングとして（Ｊａｍｅｓ ＣＧ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １６：５３１６−５３３３）、軟骨形成に影響を与えるデベロプメンタルトキシン（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｔｏｘｉｎ）の検出のため（Ｈａｎｓｅ ｅｔ ａｌ ２００１ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ３１：１５８２−１５９２）、および有望な骨格形成異常治療法の機構評価のため（Ｗｏｏｄｓ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １４８：５０３０−５０４１）に使用するのに好適である。軟骨の遺伝子性障害（たとえば、軟骨異形成症または軟骨無形成症）の患者に由来し、本明細書に記載の方法により軟骨細胞分化を示すように誘導されたｉＰＳＣは、疾患プロセスのモデリングと、薬物療法の設計および試験とに有用である。軟骨異形成を示すｉＰＳＣ由来の軟骨形成細胞の遺伝子プロファイリングを用いれば、疾患プロセスに関わり、治療介入のための疾患特異的な標的となるキー遺伝子および因子が同定される。疾患の標的治療剤については、インビトロでのその薬に対する、本方法により産生された病変したｉＰＳＣ由来の軟骨形成細胞の応答を判定することにより、インビトロで試験される。また、遺伝的に病変した患者に正常な軟骨構造または機能を再建するアプローチとして、本方法により産生されたｉＰＳＣ由来の疾患特異的な軟骨形成細胞を遺伝子治療と併用する。

本明細書に言及した特許および科学文献は、当業者に入手可能な知識を明らかにするものである。本明細書に引用する米国特許、および公開もしくは未公開米国特許出願はすべ
て、参照によって援用する。本明細書に引用する公開された外国特許および特許出願はすべて、参照によって本明細書に援用する。本明細書に引用する他の公表された参考文献、文書、原稿および科学文献についても、参照によって本明細書に援用する。

本発明についてその好ましい実施形態を参照しながら詳細に図示して記載してきたが、本発明添付の特許請求の範囲により包含される範囲から逸脱しない範囲で、本発明の形式および細部に様々な変更が可能であることが当業者には理解されよう。

Claims (41)

1. ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を軟骨形成細胞に直接分化させる方法であって、
   胚様体（ＥＢ）を実質的に含まないｈＥＳＣの集団を支持体上に用意する工程と、
   前記ｈＥＳＣを前記支持体から剥離し、前記ｈＥＳＣを分離する工程と、
   前記ｈＥＳＣの高密度マイクロマス培養を樹立する工程と、
   前記集団を骨形成タンパク質と接触させる工程と
   を含み、
   前記ｈＥＳＣは軟骨形成細胞の実質的に均一な集団に直接分化する
   方法。
2. 前記支持体はマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を含むフィーダー層である、請求項１に記載の方法。
3. 前記支持体はマトリゲル、あるいは、他の高分子もしくはゼラチン支持体またはスキャフォールドである、請求項１に記載の方法。
4. 前記ｈＥＳＣにトランスフォーミング増殖因子βを投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記ＢＭＰはＢＭＰ−２を含み、前記ＢＭＰ−２は前記高密度マイクロマス培養の樹立から約２４時間後に投与される、請求項１に記載の方法。
6. 前記ＢＭＰはＢＭＰ−２を含み、前記ＢＭＰ−２は前記高密度マイクロマス培養の樹立から約４８時間後に投与される、請求項１に記載の方法。
7. 前記ｈＥＳＣは約１４日以内に十分に分化した軟骨細胞に分化する、請求項１に記載の方法。
8. 前記ｈＥＳＣは約７日以内に十分に分化した軟骨細胞に分化する、請求項１に記載の方法。
9. 前記ｈＥＳＣは約２〜３日以内に軟骨前駆体細胞に分化する、請求項１に記載の方法。
10. 前記ｈＥＳＣは約４日以内に初期の軟骨細胞に分化する、請求項１に記載の方法。
11. 前記ｈＥＳＣの少なくとも約８５％は軟骨形成細胞系譜の細胞に分化する、請求項１に記載の方法。
12. 前記ｈＥＳＣの少なくとも約９５％は軟骨形成細胞系譜の細胞に分化する、請求項１に記載の方法。
13. 前記ｈＥＳＣはトリプシン、ＴｒｙｐＬＥ ＳｅｌｅｃｔまたはＡｃｃｕｔａｓｅによって分離される、請求項１に記載の方法。
14. Ｒｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
15. 人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を軟骨形成細胞に直接分化させる方法であって、
    ＥＢを実質的に含まないｉＰＳＣの集団を支持体上に用意する工程と、
    前記ｉＰＳＣを前記支持体から剥離し、前記ｉＰＳＣを分離する工程と、
    前記ｉＰＳＣの高密度培養を樹立する工程と、
    前記ｉＰＳＣを骨形成タンパク質と接触させることにより、ｉＰＳＣの軟骨形成細胞系譜への分化を誘導する工程と
    を含む方法。
16. ｈＥＳＣはマイクロマス懸濁液培養またはペレット培養の形態である、請求項１または１５に記載の方法。
17. 非軟骨形成細胞を実質的に含まず、かつ請求項１に記載の方法によりＥＳＣから分化した軟骨形成細胞の集団。
18. 非軟骨形成細胞を実質的に含まず、かつ請求項１５に記載の方法によりｉＰＳＣから分化した軟骨形成細胞の集団。
19. 均一に分化した軟骨形成細胞の集団であって、前記細胞の少なくとも９５％は単一の規定の分化の段階にあり、前記集団は十分に分化した軟骨細胞を実質的に含まない軟骨形成細胞の集団。
20. 前記段階は２日目もしくは３日目の軟骨形成細胞（軟骨前駆体）、または４日目の軟骨形成細胞（初期の軟骨細胞）からなる群から選択される、請求項１９に記載の集団。
21. 損傷または病変軟骨を請求項１７、１８、１９、２０に記載の集団と接触させる工程を含む、軟骨を修復または再建する方法。
22. 請求項１７、１８、１９、２０に記載の集団を関節接合部に投与する工程を含む、関節炎を予防または処置する方法。
23. 骨折部位を請求項１７、１８、１９、２０に記載の集団と接触させる工程を含む、骨折修復を処置する方法。
24. 請求項１９または２０に記載の集団を関節接合部に投与する工程を含む、損傷もしくは断裂した靭帯または半月板を処置または修復する方法。
25. 請求項１９または２０に記載の集団によって手指または四肢を再生する方法。
26. 軟骨障害の発生に関係する遺伝子を同定する方法であって、請求項１８、１９、２０に記載の集団を用意する工程と、正常対照細胞と比較した遺伝子発現の増加または減少を検出する工程とを含み、前記増加または減少から前記遺伝子が前記軟骨障害の発生に関係することが示唆される方法。
27. 前記軟骨障害は軟骨異形成症または軟骨無形成症を含む、請求項２６に記載の方法。
28. 軟骨促進剤を同定する方法であって、請求項１８、１９または２０に記載の集団を候補化合物と接触させる工程と、軟骨形成を検出する工程とを含み、前記化合物の非存在下と比較した前記前記化合物の存在下での軟骨形成の増加から前記化合物が軟骨の形成を促進することが示唆される方法。
29. 前記支持体はマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を含むフィーダー層である、請求項１５に記載の方法。
30. 前記支持体はマトリゲル、あるいは、他の高分子もしくはゼラチン支持体またはスキャフォールドである、請求項１５に記載の方法。
31. 前記ｈＥＳＣにトランスフォーミング増殖因子βを投与する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
32. ＢＭＰ−２はｉＰＳＣの高密度マイクロマス培養の樹立から約２４時間後に投与される、請求項１５に記載の方法。
33. ＢＭＰ−２は前記ｉＰＳＣの高密度マイクロマス培養の開始から４８時間後に投与される、請求項１５に記載の方法。
34. 前記ｉＰＳＣは約１４日以内に十分に分化した軟骨細胞に分化する、請求項１５に記載の方法。
35. 前記ｉＰＳＣは７日以内に十分に分化した軟骨細胞に分化する、請求項１５に記載の方法。
36. 前記ｉＰＳＣは約２〜３日以内に軟骨前駆体細胞に分化する、請求項１５に記載の方法。
37. 前記ｉＰＳＣは約４日以内に初期の軟骨細胞に分化する、請求項１５に記載の方法。
38. 前記ｉＰＳＣの少なくとも約８５％は軟骨形成細胞系譜の細胞に分化する、請求項１５に記載の方法。
39. 前記ｉＰＳＣの少なくとも約９５％は軟骨形成細胞系譜の細胞に分化する、請求項１５に記載の方法。
40. 前記ｉＰＳＣはトリプシン、ＴｒｙｐＬＥ ＳｅｌｅｃｔまたはＡｃｃｕｔａｓｅによって分離される、請求項１５に記載の方法。
41. Ｒｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を投与する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。