JP2013502417A - Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイト及び肝臓段階抗原 - Google Patents

Abstract

本発明は、マラリア生活環の前赤血球段階で発現する新規マラリアポリペプチドを提供する。この抗原は、該抗原含むワクチン製剤を投与すること、又は、該抗原をＤＮＡ又はその他の核酸発現系でワクチン製剤として運ばれるよう発現することにより、哺乳類においてマラリアに対する免疫応答を誘導するために利用することができる。
【選択図】なし

Description

本発明の主題は、抗マラリアワクチン成分として用いるためのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来ＤＮＡ配列及びポリペプチド、並びに、これらの抗原に対する免疫応答を誘導する方法に関する。

マラリアの原因はベクター媒介性生物であるマラリア原虫である。この寄生虫は、段階特異的なタンパク質の発現を必要とする複雑な生活環を有している。これらのタンパク質は、異なる段階で発現する可能性もあるし、段階に特異的である可能性もある。マラリアの流行地域には３０億人以上の人々が生活しているため、マラリアは極めて重要な疾患である。マラリアに起因する死者数は年間１０億人以上にのぼる。薬剤耐性種の出現により、本疾患の治療上の問題が増大してきている。しかし、ＦＤＡに認可されたワクチンは存在しない。

Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの全ゲノム配列は既に決定されている（非特許文献１、非特許文献２）。齧歯類のマラリア原虫であるＰ．ｙｏｅｌｉｉについても既に配列は決定されている（非特許文献３）。しかし、こうした状況にも関わらず、効果的な抗マラリアワクチンの開発は、有望な抗原が見つからないため、著しく阻害されていた。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉのゲノムの配列同定により、当該ゲノム中の５２００以上の遺伝子が同定された。しかし、多数の潜在的遺伝子標的にも関わらず、こうしたデータセットを利用するのみでは、新しいワクチンコンストラクトを得られる可能性は低かった。結果として、臨床試験が行われたのは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのプロテオームのうち僅か０．２％である。さらに、これらのワクチン候補の抗原は、ボランティアにおいては高い予防率を誘導することはできなかった。しかし、放射線照射弱毒化スポロゾイトによるマウス及びヒトの免疫付与が、高い免疫率（＞９０％）をもたらすことから、効果的な抗マラリアワクチン開発の可能性が示唆される。こうした防御免疫は、スポロゾイト及び肝臓段階抗原の複数を対象としているようであった。

Ｂｏｗｍａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ、１９９９年、第４００巻、５３２−５３８頁 Ｇａｒｄｎｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、第４１９巻、４９８−５１１頁 Ｃａｒｌｔｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、第４１９巻、５１２−５１９頁

本発明は、組み換えＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍタンパク質をコードするＤＮＡ配列に関する。本タンパク質は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの大規模パネルから同定した。本タンパク質を、多数の基準に基づき評価し、マラリア予防に関係するか判定した。本配列は、サブユニット免疫原性抗原として用いるために、それにコードされたタンパク質を発現するために利用してもよいし、免疫応答を誘導するために、生体内での発現に適したベクターに組み込んでもよい。本タンパク質は、免疫原性製剤中において、組み合わせて又は単独で利用することができる。

ある実施形態では、化合物は免疫原性タンパク質として用いることができる。この実施形態では、本タンパク質は、まず、該タンパク質をコードするＤＮＡを適切な発現系に組み込むことにより、製造することができる。発現及び精製されたタンパク質は、次に、ヒト等の哺乳動物に１回以上投与することができる。この実施形態では、精製タンパク質は、個別に発現されてもよいし、あるいは、特定タンパク質をコードするＤＮＡが１つの免疫原性組成物を形成するよう組み換えによりまとめられていてもよい。これらの免疫原性組成物は、次に、免疫応答を誘導するため、１回以上投与することができる。

別の実施形態では、本タンパク質をコードするＤＮＡは、適切なベクター発現系に挿入することができる。こうした系としては、例えば、アデノウィルスに基づく系（例えば、２００８年１０月９日に公開された米国特許出願公開第２００８／０２４８０６０号に記載のＢｒｕｄｅｒ等の系）、又は、ＤＮＡプラスミド系が挙げられる。

表記のインサートを含むＤＮＡ−Ｐ．ｙｏｅｌｉｉベクター１００μｇを接種（初回接種）したマウスの予防率を示す。１種類より多くのインサートを受けたマウスは複数の投与を受けたものとして（即ち、ｄｏｓｅ＝１Ｘ〜３Ｘと）示した。４０日目に、初回投与と同様のインサートを含むワクシニア−Ｐ．ｙｏｅｌｉｉベクターをマウスに追加接種した。５０日目に、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトをマウスに攻撃接種し、６１〜６８日目に、寄生虫血症を評価した。これらの実験で、Ｎ＝１４。 図１と同様の接種を行ったマウスの予防率を示す。これらの実験で、Ｎ＝１４。１種類より多くのインサートを受けたマウスは複数の投与を受けたものとして（即ち、ｄｏｓｅ＝１Ｘ又は３Ｘと）示した。 ＨＬＡ特異的ペプチドプールを刺激剤として用いたＰＦ１０６抗原のＥＬＩＳｐｏｔ法によるスクリーニングの結果（ＩＦＮ−γスポット形成細胞（ｓｐｏｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ，ＳＦＣ）／末梢血中の単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ，ＰＢＭＣ）１００万個）を示す。最大のＩＦＮ−γ誘導を星印で示す。 ＨＬＡ特異的ペプチドプールを刺激剤として用いたＰＦ６１抗原のＥＬＩＳｐｏｔ法によるスクリーニングの結果（ＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）／ＰＢＭＣ１００万個）を示す。最大のＩＦＮ−γ誘導を星印で示す。 ＨＬＡ特異的ペプチドプールを刺激剤として用いたＰＦ５６抗原のＥＬＩＳｐｏｔ法によるスクリーニングの結果（ＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）／ＰＢＭＣ１００万個）を示す。最大のＩＦＮ−γ誘導を星印で示す。 ＨＬＡ特異的ペプチドプールを刺激剤として用いたＰＦ１２１抗原のＥＬＩＳｐｏｔ法によるスクリーニングの結果（ＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）／ＰＢＭＣ１００万個）を示す。最大のＩＦＮ−γ誘導を星印で示す。 ＨＬＡ特異的ペプチドプールを刺激剤として用いたＰＦ１４４抗原のＥＬＩＳｐｏｔ法によるスクリーニングの結果（ＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）／ＰＢＭＣ１００万個）を示す。最大のＩＦＮ−γ誘導を星印で示す。 ＨＬＡ（Ａ２、Ａ３及びＢ７）拘束性ペプチドプールを刺激剤として用いたＰＦ１４４抗原のＥＬＩＳｐｏｔ法によるスクリーニングの結果（ＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）／ＰＢＭＣ１００万個）を示す。ＰＢＭＣは、照射スポロゾイトワクチン（ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ， ＩＳＶ）接種の前又は後に採取した。

本発明の実施形態の１つは、マラリア（即ち、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の生活環のうち前赤血球段階において発現する単離タンパク質に関する。本単離タンパク質は、免疫応答を誘導するために、免疫原性製剤中に組み込むことができる。本実施形態では、本タンパク質は単独で又は組み合わせて組み込むことができる。また、本発明の免疫原性組成物は、ポリペプチドにより惹起される免疫応答を改善又は増強するための賦活剤を含む。本発明のさらなる態様は、本タンパク質の体液性及び／又はＴ細胞性免疫応答誘導能である。

本明細書では、「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸からなるポリマーを指すものであり、特定の長さの生産物を指すものではない。タンパク質は、ポリペプチドの本定義内に包含される。「ｍｅｒ」という用語は、数字と組み合わせて、例えば、１５ｍｅｒというように用いて、アミノ酸の数で表したポリプチドの長さを指すものである。

ポリプチド内のＴ細胞エピトープ又はＨＬＡ結合領域の予測を含む免疫原性領域の予測法は、当分野で周知である。「モチーフ」という用語は、ＨＬＡ分子に関連又は結合すると予測されてきた特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドを指すものである。

本明細書では、本タンパク質は、本明細書に記載の１種以上のポリペプチドを免疫原性組成物に有効量含有させるために、分子学的手法により、例えば、プラスミドによる発現あるいはウィスル系などのその他の発現系により、適切な遺伝子断片を発現させ、その後、単離することで、製造される。

本発明のある実施形態は、ポリペプチドをコードするＤＮＡを、免疫応答を誘導するためにヒトなどの哺乳類宿主細胞内で１種以上のポリペプチドの発現を可能とするようなベクター発現系に組み込むことである。こうした発現系は、ＤＮＡプラスミド又はウィルス系であってもよい。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍタンパク質を発現するＤＮＡワクチンを製造及び投与する方法は、当分野では周知であり、文献（Ｄｏｏｌａｎ及びＨｏｆｆｍａｎ、２００１年、Ｉｎｔ Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、第３１巻、７５３−６２頁；米国特許出願公開第２００８／０２４８０６０号（２００８年１０月９日））に既に記載されている。これらの文献を参照により本明細書に取り込む。

別の実施形態では、本タンパク質の誘導体を免疫原性組成物に用いることができる。この実施形態の変形例では、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍタンパク質の免疫原性誘導体は、配列番号２，４，６，８，１０，１２及び１４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる全長ポリペプチドの連続する少なくとも１０アミノ酸からなるアミノ酸配列を含む。ポリペプチドの免疫原性誘導体は、適切な遺伝子断片の発現により、あるいは、ペプチド合成法などのその他の手段により、製造することができる。また、誘導体は、配列番号２，４，６，８，１０，１２及び１４からなる群より選択されるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍポリペプチドの１種以上のエピトープをコードする追加の配列を含む融合ポリペプチドであってもよい。これらの実施形態では、本タンパク質は、免疫原性製剤に直接組み込むこともできるし、ＤＮＡプラスミド又はウィルス発現系で発現させることもできる。

いくつかの実施形態では、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍポリペプチドは、配列番号２，４，６，８，１０，１２及び１４からなる群より選択される配列と８０％より大きいアミノ酸配列相同性を有する免疫原性誘導体を含む。この文脈において、「相同（性）」という用語は、最大一致で整列したときに、２つ以上の配列又は部分配列が、一致すること、又は、所定の割合で一致するアミノ酸配列を有することを指すものである。配列の差異が、保存的置換、即ち、同じ性質を有する残基の置換による場合、配列相同性の割合を置換の保存的性質に合うよう上方補正してもよい。

照射弱毒化スポロゾイトによるマウスの免疫付与は強い防御免疫を惹起する（Ｃｌｙｄｅ等、１９７３年ａ、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ、第２６６巻、３９８−４０１頁；Ｃｌｙｄｅ等、１９７３年ｂ、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ、第２６６巻、１６９−１７７頁；Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ等、１９６７年、Ｎａｔｕｒｅ、第２１６号、１６０−１６２頁）。照射スポロゾイトワクチン（ＩＳＶ）を接種されたボランティアにおいてＣＰＳを除く前赤血球段階抗原に対する遺伝的に制限された応答が同定されていることから明らかなように、ワクチンの近似手段として、照射弱毒化スポロゾイトの使用は、その多くが前赤血球段階である複数の抗原を対象とするものと思われる（Ｋｒｙｚｃｈ等、１９９５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１５５巻、４０７２−４０７７頁；Ｗｉｚｅｌ等、１９９５年ａ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１５５巻、７６６−７７５頁；Ｗｉｚｅｌ等、１９９５年ｂ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１８２巻、１４３５−１４４５頁）。照射弱毒化ワクチンにより前赤血球段階抗原を対象とすることは、スポロゾイト又は感染肝細胞に対する免疫につながり、ひいては、初代メロゾイトの血流への放出を防止することで血液への感染を防止する。

前赤血球段階タンパク質は、マラリアに対する防御免疫を付与するために重要である可能性がある。マラリア寄生虫ゲノムの配列同定後、比較的多数のマラリア遺伝子が同定されているにも関わらず、抗マラリア剤クチン候補の同定は、マラリア寄生虫の比較的複雑な生活環により、大幅に妨げられていた。さらに、マラリア寄生虫の遺伝子の多くは、抗原性についても、また、機能性についても、きちんとは定義されていない。そこで、潜在的防御応答を解析するため、多数の遺伝子によりコードされた抗原のハイスループット解析を行った。こうした応答に基づき、特定の遺伝子を潜在的ワクチン製剤として選択した。

［実施例１：Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍタンパク質の同定及び発現］
同定配列の解析は、効率的なタンパク質発現プラットフォームを必要とする。この制限は、これまで、抗マラリアワクチンの開発の問題であった。この制限を回避するため、組み換えタンパク質の発現とスクリーニングとを平行して行うことのできる改変コムギ胚芽無細胞系を用いた。生体情報学的解析、並びに、スポロゾイト及び肝臓段階寄生虫のトランスクリプトーム及びプロテオーム発現データベースに基づき、１５０種類の推定Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ前赤血球段階遺伝子からなるパネルを開発した。このリストにある遺伝子の多くは、機能未知の仮想タンパク質をコードしている。このパネルの遺伝子のいくつかは、照射スポロゾイトワクチン（ＩＳＶ）接種ボランティアから得られた血清への免疫反応から明らかなように、ワクチン抗原として機能することができるだろうとの仮説を立てた。その他の発現系では、さらに必要な下流の分析及び解析が困難であることが明らかとなっていた。そこで、発現を改善するため、改変コムギ胚芽無細胞発現系を利用した。この系は、評価クローンのうち約９０％での発現を可能とした。さらなる発現及び解析のために選択された遺伝子を、前赤血球段階でのそれらの発現により、プロテオーム及び／又はトランスクリプトームデータセットに基づき、同定した。合計１５５種類のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ遺伝子を用い、ＧＳＴ融合タンパク質及び６ｘＨｉｓ融合タンパク質として、タンパク質発現ＤＮＡコンストラクトを作成した。ＧＳＴ融合タンパク質及び６ｘＨｉｓ融合タンパク質には、それぞれ、ｐＥ−Ｅ０１−ＧＳＴ−ＴＥＶ−ＧＷ及びｐＥＵ−Ｅ０ｌ−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＧＷプラスミドを用いた（Ｔｓｕｂｏｉ等、２００８年）。

（組み換えタンパク質の発現）
組み換えタンパク質の発現は、コムギ胚芽無細胞系を用いて行った。インビトロの翻訳反応のテンプレートとして用いるための遺伝子特異的ＲＮＡを２つの規模で合成した。
ａ）小規模
ＲＮＡｓｅフリーのＰＣＲ ＤＮＡを作成し、その後、それをテンプレートとして翻訳反応を行うことで、全てのクローンについて、小規模のバッチ反応を行った。各遺伝子を、ｐＥＵ−Ｅ０１特異的プライマーとアダプターとを用い、プラスミドミニプレップＤＮＡからＰＣＲで増幅した。用いたプライマーは、
ＳＰ６：５’ＡＧＡＧＣＧＣＧＣＡＡＧＡＣＧＣＧＣＡＧＧＡＣＣＧ３’；
Ｅ０１：５’ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＣＡＡＡＣＡ３’
である。翻訳反応は、ＰＣＲ ＤＮＡテンプレート２μｌ、ｄＮＴＰｓ２５ｍＭ、ＲＮＡｓｅ阻害剤１Ｕ／μｌ、ＳＰ６ポリメラーゼ１．２Ｕ／μｌ、及び、転写バッファーを用い、３７℃、６時間の条件で行った。遺伝子特異的転写産物のサイズはアガロースゲル電気泳動により確認した。ＲＮＡは、エタノール沈殿により不要な転写反応試薬を取り除いた後、ＲＮＡｓｅフリーの水に溶かし、タンパク質発現反応に用いた。
ｂ）大規模
大規模タンパク質発現に用いるＲＮＡの合成は、ＲＮＡｓｅフリープラスミドＤＮＡをテンプレートとして用い行った。該プラスミドＤＮＡは、標準的なＤＮＡ単離キットにより精製し、転写反応液に直接添加した。具体的には、プラスミドＤＮＡ２５μｇを、上記の転写バッファー中で、ＮＴＰｓ２．５ｍＭ、ＲＮＡｓｉｎ１Ｕ／μｌ、ＳＰ６ポリメラーゼ１Ｕ／μｌと混和した。合計反応液量は２５０μｌであり、３７℃で６時間インキュベートした。翻訳反応を準備する前に、発現ＲＮＡ全ての質をアガロースゲル電気泳動により分析した。

本研究では、ＲＮＡ合成と同様に、組み換えタンパク質も２つの規模で発現させた。
ａ）小規模
文献（Ｓａｗａｓａｋｉ等、２００２年ｂ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、第５１４巻、１０２−１０５頁）に記載のプロトコルを用いて、９６ウェルのＵ底プレート内に、バッチ反応を準備した。簡単に説明すると、反応は、基質混合物（クレアチンキナーゼ０．４５ｍｇ／ｍｌ、ＲＮａｓｉｎ ２０Ｕ、Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ ｐＨ７．８ ２４ｍＭ、ＫＯＡｃ １００ｍＭ、Ｍｇ（ＯＡｃ） ２．７ｍＭ、スペルミジン０．４ｍＭ、ＤＴＴ ２．５ｍＭ、ＡＴＰ １．２ｍＭ、ＧＴＰ ０．２５ｍＭ、クレアチンホスフェート１６ｍＭ、ＮａＮ３ ０．００５％、及び、［１４Ｃ］ロイシン（２μＣｉ／ｍｌ）を含有する各アミノ酸 ０．３ｍＭ）４０μｌを、各ＲＮＡ２μｌ及びＯＤ２４０（終濃度ではＯＤ６０）のコムギ胚芽抽出物８μｌを含む翻訳混合物１０μｌに重層することで組み立てた。抽出物はＣＦＳｃｉｅｎｃｅｓ（日本、横浜）から購入した。しかし、他の同種の供給源を利用することもできる。プレートを、パラフィルムで覆い、２６℃で１６時間インキュベートした。
ｂ）大規模
大規模量の組み換えタンパク質を、コムギ麦芽抽出物の製造元（即ち、ＣＦＳｃｉｅｎｃｅｓ、日本、横浜）の推奨する一般的ガイドラインに従って合成した。各タンパク質の個別の必要量に応じて、可変数の反応を、平底６ウェルプレートを用いて準備した。各翻訳反応は、２種の混合物の二重層を含んでいる。下層は、転写ＲＮＡとコムギ胚芽抽出物とを合計で５００μｌを含み、上層は、透析バッファー５．５ｍｌからなる。簡単に説明すると、下層の反応混合物は、ＲＮＡ反応液２５０μｌ、クレアチンキナーゼ４０ｍｇ／ｍｌ、及び、コムギ胚芽抽出物１２０ＯＤ／ｍｌ（ＷＧＥ ＯＤ２４０、ＣＦＳｃｉｅｎｃｅｓ、日本、横浜）を混和することで調整した。この下層混合物を、６ウェルプレートに移し、二重層の反応液を形成するために、慎重に、製造元（ＣＦＳｃｉｅｎｃｅｓ、日本、横浜）の提供するＳｕｂ−ａｄｍｉｘに重層した。プレートを、パラフィルムで覆い、室温で一晩翻訳を行った。

（タンパク質の精製）
ＧＳＴタグ組み換えタンパク質は、文献（Ｔｓｕｂｏｉ等、２００８年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、第７６巻、１７０２−１７０８頁）に記載の手順を用いて、アフィニティー精製した。翻訳反応の完了後、タンパク質を含有する混合物において、タバコエッチウィルスプロテアーゼ（ＡｃＴＥＶ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールズバッド）２０Ｕ及びＤＴＴ１ｍＭでタンパク質を溶出させた後に、グルタチオンセファロース４Ｂ樹脂（ＧＥヘルスケア、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）に吸収させた。溶出させたタンパク質は、クマシー・ブルー又は銀染色により染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。精製したタンパク質の濃度は、ブラッドフォードタンパク質分析キット及び分光光度計の両方で決定し、μｇ／ｍｌ単位で示した。

発現タンパク質を、さらに、インビトロ及びインビボの分析により解析した。インビトロ解析は、抗体ベースの及びＴ細胞媒介性のアッセイを含む。選択した遺伝子の解析は以下の方法論に基づいて行った。

［実施例２：前赤血球段階遺伝子産物解析のアッセイ法］
（間接蛍光抗体アッセイ法（ＩＦＡ））
全種のタンパク質で接種を行ったマウス及びウサギの両方から採取した血清について、スポロゾイト段階、４日齢及び６日齢赤血球外段階、並びに、無性及び有性赤血球段階のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍへの免疫応答性を試験した。スポロゾイト段階及び赤血球段階に対する血清の試験のためのＩＦＡプロトコルは、Ａｇｕｉａｒ等、２００１年、Ｖａｃｃｉｎｅ、第２０巻、２７５−２８０頁の記載に従った。

肝臓段階の寄生虫は、２種の異なる方法で生育し試験した。第１の方法では、５×１０^４ＨＣ０４ヘパトサイト（Ｓａｔｔａｂｏｎｇｋｏｔ等、２００６年、Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．、第７４巻、７０８−７１５頁）に５×１０^５Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトを感染させることによりインビトロで生育した肝臓段階を用いた。４〜６時間の短いインキュベーション期間の後、寄生虫は残して、細胞を洗い流し、２日、４日、又は、６日の間成長させた。感染させる前に、幹細胞をＩＦＡ法で試験し、製造元のプロトコルに従って細胞をリソトラッカー（登録商標）（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールズバッド）で染色しアセトンで固定した。第２の方法では、この新規の方法を詳述している研究（Ｓａｃｃｉ等、２００６年、Ｉｎｔ Ｊ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．、第３６巻、３５３−３６０頁）で報告されているとおり、キメラマウスで生育したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染肝臓段階寄生虫を用いた。

簡単に説明すると、マウスに１．５×１０^６Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトを感染させ、その肝臓を感染後３〜８日の間に採取し、低温切開片の作成に用いた。選んだ肝葉は、ティシュー・テック・Ｏ．Ｃ．Ｔ．（登録商標）コンパウンド（Ｍｉｌｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国イリノイ州ネーパービル）に包埋後、イソペンタン／液体窒素槽で凍結した。Ｌｅｉｃａ ＣＭ１９００（登録商標）（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国イリノイ州ディアフィールド）上で凍結切片（７μｍ）を薄切した後、無水メタノールで固定し、使用するまで−８０℃で保存した。両方の感染肝細胞について、ＩＦＡ法は、マウス及びウサギのポリクローナル抗体血清を１：１００に１回希釈して用いて行った。ポジティブコントロールとして、抗熱ショックタンパク質７０抗体を用いた。次に、ＩＦＡ法を、ＦＩＴＣを結合した抗マウス又は抗ウサギＩｇＧで細胞を培養し、その核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８ペンタハイドレートで染色することで進めた。スライドを、抗退色性Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｐｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）中に置き、共焦点顕微鏡法により可視化した。

（免疫電子顕微鏡法）
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ抗原発現の電顕的局在を免疫電子顕微鏡法により調べた。簡単に説明すると、赤血球細胞に感染させたＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、及び、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉに感染させた唾液腺Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍを、１％のパラホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドを含むＰＢＳ中、室温、２４時間、固定した。ＬＲ−Ｗｈｉｔｅ（登録商標）樹脂（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社、米国ペンシルベニア州ウォリントン）に埋め込んだ超薄切片を、切断しニッケル格子上に配置した。格子上の切片は、新鮮な飽和メタ過ヨウ素酸ナトリウムで５分間インキュベートした後、脱イオン水で３回洗い、エッチングした。格子は、自由アルデヒド基が一次抗体に結合しないように、０．１Ｍグリシンを含有するホスフェートバッファーで２０分間クエンチした。格子は１％ＢＳＡ、５％フィッシュゼラチンのＰＢＳ中で３０分間インキュベートしてブロックした。

格子を、湿潤環境中で一次抗体（希釈率１：５０）とともに２時間インキュベートし、その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）を含有するＰＢＳ中で５回洗った。その後、格子を、１０ｎｍの金粒子を結合したヒツジ抗マウス又はウサギ抗体で３０分間インキュベートした。格子を、上記のように洗浄した後、２％酢酸ウラニルで後染色し、水で洗った。

切片を透過型電子顕微鏡で調べた。ネガティブコントロールは、未感染細胞、及び、非特異的で無関係の抗体を一次抗体として用いることを含む。

（ウェスタンブロッティング）
組み換えタンパク質を、２種の方法を用いたウェスタンブロッティングで分析した。２種の方法を簡単にまとめると以下のとおりである。
ａ）ハイスループット発現用に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより［^４Ｃ］ロイシンラベルタンパク質を３つの分画、全量２μｌの翻訳反応液（Ｔ）、９６ウェルプレートを遠心した後の２μｌの上澄み（Ｓ）分画、そして、最後に、沈殿（Ｐ）をサンプルバッファーに再懸濁し分離した沈殿分画、に分離した。組み換えタンパク質は、画像分析器を用いてオートラジオグラフィーにより同定した。
ｂ）精製した組み換えタンパク質を、通常のウェスタンブロットのプロトコルに従ってスクリーニングした。各タンパク質１０μｇを、予め成型しておいた４−２０％勾配のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に電気移動させた。タンパク質又はヒト免疫血清で免疫付与したウサギ抗血清の１：５００希釈物でウェスタンブロットした。２次抗体として、ペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗ウサギ又はヒトＩｇＧ抗体を、１：１００００の希釈率で用いた。次に、反応を、製造元の指示に従い、ＥＬＣ−Ｐｌｕｓ（登録商標）（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）ウェスタンブロット検出システムを用いて進めた。

（酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ））
ＩＳＶ接種ボランティアから採取したヒト血清を１：１００の希釈率で試験し、抗原特異的反応性を、実施例１に記載したように小規模及び大規模の両方の方法で発現した組み換えタンパク質を用いたＥＬＩＳＡにより測定した。ネガティブ（ＧＳＴ及びコムギ胚芽抽出物）及びポジティブ（ＣＳＰ及びＳＳＰ２／Ｔｒａｐ）コントロールのタンパク質も、同様の規模で発現させた。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ ＩＩ（登録商標）ＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、米国バージニア州シャンティイー）に２〜５μｌの組み換えタンパク質及びコムギ胚芽抽出物を含有するＰＢＳを塗布し、室温で一晩放置した。ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）を含有するＰＢＳ（洗浄バッファー）で３回洗い、５％脱脂粉乳ＰＢＳ溶液１００μｌ（ブロッキングバッファー）で、４℃、２時間、ブロックした。３回の洗浄の後、ウェルを被験対象のヒト血清の１：１００希釈物５０μｌで２時間インキュベートした。ウェルを、再び３回洗浄し、ペルオキシダーゼでラベルしたヒツジ抗ヒトＩｇＧ（ＫＰＬ）で１時間インキュベートした。３回の洗浄後、ウェルを、ＡＢＴＳ基質［２，２’−アジノ−ジ−（３エチルベンゾチアゾリン スルホネート］及びＨ_２Ｏ_２を含有する溶液１００μｌで２０分間インキュベートした。呈色反応は、マイクロＥＬＩＳＡ自動読み取り機中ＯＤ４１０ｎｍで測定した。ＥＬＩＳＡデータは、被験対象の血清希釈物毎のＯＤ読み取り値の平均として表した。これらのヒト血清中のスポロゾイト特異的抗体は、前述のとおり、間接蛍光抗体試験（ＩＦＡＴ）により評価した。結果は、終点希釈率（蛍光がポジティブであると記録された血清希釈率のうち最後のもの）で示した。

（インターフェロンγＥＬＩｓｐｏｔアッセイ法）
マルチスクリーンＭＡＩＰＳ４５１０（登録商標）プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州ビルリカ）に、抗ヒトＩＮＦγ ｍＡｂ １−Ｄ１Ｋ（Ｍａｂｔｅｃｈ、米国オハイオ州シンシナティ、より購入）１５μｇ／ｍｌを含有する殺菌済みカーボネート／バイカーボネートバッファー１００μｇ／ウェルを塗布し、４℃で一晩放置した。プレートを、２５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー及びＬ−グルタミン酸を含有するＲＰＭＩ培地１００μｌ／ウェルで５回洗浄した。

プレートを、以下を１％含有するＨＲ−１０培地２００μｌ／ウェルでブロックした；Ｌ−グルタミン酸２００ｍＭ、ＰＥＮ／Ｓｔｒｅｐ、ＭＥＭ１０ｍＭ、ヒトＡＢ血清１０％、及び、ＲＰＭＩ培地８７％。プレートを、ブロッキング溶液で、４℃、２４時間、インキュベートした。ＰＢＭＣ（２０×１０^６）を、３７℃で解凍し、１０％のＦＢＳ、１％の２００ｍＭのＬ−グルタミン酸、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、及び、８８％のＲＰＭＩを含有する１０ｍｌのＲ−１０培地に再懸濁した。この細胞を、１２００ｒｐｍ、２５℃、１０分で２回洗い、再び、１０ｍｌのＲ−１０に投入し、１０００ｒｐｍ、２５℃、１０分で沈殿させた。細胞を、適当な用量のＨＲ−１０に再懸濁して、計数した。細胞懸濁液の容量はＨＲ−１０で嵩増し、３７℃／５％ＣＯ^２インキュベーターで一晩休ませた。回復率及び生存率を計算するために、細胞を再び計測した。プレートから、ブロック溶液を、ＲＰＭＩ培地で６回洗浄し、プレートを、刺激剤と細胞懸濁液が準備できるまで、室温で放置した。刺激剤は、ＨＲ−１０で、至適濃度まで希釈した。細胞懸濁液は、ＨＲ−１０で、至適濃度まで希釈した。ＩＦＮ−γを塗布したウェル中に、まず、刺激剤１００μｌ／ウェルを４箇所添加し、その後、細胞懸濁液１００μｌ／ウェルを１０００００、２０００００、及び、４０００００細胞／ウェルの終濃度で添加した。刺激剤を含まないウェルはＨＲ−１０培地を含み、細胞懸濁液をバックグラウンドコントロールとして用いた。プレートを、３７℃／５％ＣＯ_２で３６時間インキュベートし、その後、１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）溶液で６回洗浄した。次に、ＥＬＩｓｐｏｔを、１μｇ／ｍｌビオチニル化α−ＩＦＮ−γ ｍＡｂ ７−Ｂ６−１（Ｍａｂｔｅｃｈ、米国オハイオ州シンシナティ、より購入）を添加し、室温で３時間インキュベートすることで進めた。プレートを、１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）溶液で６回洗浄した。次に、１：１０００ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを１００μｌ添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを、１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）溶液で６回洗浄し、その後、１×ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。アルカリホスファターゼ標識を１：２５の希釈率で添加し、室温で１５分間インキュベートした。発色反応を、水でプレートを全体的に洗浄することで停止させた。乾燥させた後、ＡＩＤ（登録商標）ＥＬＩｓｐｏｔプレート読み取り機（Ｓｔｒａｓｓｂｅｒｇ、ドイツ）を用いて、スポットを計数した。

［実施例３：前赤血球段階Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ遺伝子の免疫原性及び生活環での発現］
表１に、２２種類の遺伝子の発現及び反応性の概要を示す。表１のタンパク質の重要な点は、これらがＩＶＳを接種されたボランティアから採取したヒト抗体及び／又はＴ細胞により認識されるという点である。そこで、マラリアスポロゾイトに対する生来の免疫応答の範疇で認識されることから、これらのタンパク質はマラリアに対する免疫を付与する際に価値があるものと考えられる。

表１の遺伝子の全ての発現タンパク質は、ＩＳＶ接種ヒト血清を用いたＥＬＩＳＡ及び／又はウェスタンブロット分析により認識された。さらに、いくつかの抗原は、免疫Ｔ細胞によっても認識された。これは、ＩＳＶ接種に用いられたマラリアスポロゾイトの自然構造内に新規の抗原が存在することを示している。さらに、こうした抗原は、人体に異物として認識されるため、予防的免疫応答を誘発する可能性がある。また、血清の反応性も、これらの抗原がボランティアでのマラリア感染に対する完全予防に関連することを示している。また、このことはさらに、これらの抗原が潜在的ワクチン候補抗原であることを示している。表１に示した遺伝子は、ＩＦＡにより、前赤血球（スポロゾイト及び肝臓）寄生段階で発現することを確認済みである。また、電子顕微鏡法（ＥＭ）により、抗原の細胞内局在も調べた。

クローン配列から発現した表１のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍタンパク質は、ＩＳＶを接種されたボランティアから採取したヒト抗体及び／又はＴ細胞により認識された。このように、これらの新規タンパク質は、マラリアスポロゾイトに対する生来の免疫応答の範疇で認識される。そこで、これらのタンパク質はマラリアに対する免疫において重要であるものと考えられる。

［実施例４：Ｐ．ｙｏｅｌｉｉオルソログ遺伝子による免疫原性予防］
表１に列記したＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ遺伝子にオルソロガスなＰ．ｙｏｅｌｉｉ遺伝子について、マウスを攻撃接種から予防する能力を評価した。予防効果研究のため、ＣＤ１マウスに、前脛骨筋での筋肉注射で、１００μｌのワクチン（各脚で５０μｌ）を注射した。ＤＮＡワクチンベクターは、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で調整し、ワクチン接種に適した濃度まで１×ＰＢＳで希釈した。ワクシニアワクチンベクターは、１ｍＭ Ｔｒｉｓ（９．０）で調整し、ワクチン接種に適した濃度まで１×ＰＢＳで希釈した。マウスへの攻撃接種は３００匹のＰ．ｙｏｅｌｉｉ（１７ＸＮＬ）スポロゾイトを尾の血管に静脈注射することで行った。スポロゾイトは、感染蚊の唾液腺から手作業で摘出し、攻撃接種のために５％の正常マウス血清を含有するＭ１９９培地で希釈した。

１番目の研究では、各群１４匹のマウスを、０日目に１００μｇのＤＮＡ−Ｐ．ｙｏｅｌｉｉワクチンベクターで初回刺激し、４０日目に同じＰ．ｙｏｅｌｉｉインサートを含むワクシニア−Ｐ．ｙｏｅｌｉｉワクチンベクター５×１０^７プラーク形成単位（ｐｆｕ）で追加刺激した。ＰＹ０３０１１、ＰＹ０３４２４、及び、ＰＹ０３６６１を発現するベクターの組み合わせで免疫付与したマウスは、合計で３００μｇのＤＮＡ−Ｐ．ｙｏｅｌｉｉベクターで初回刺激され、合計で１．５×１０^８ｐｆｕのワクシニア−Ｐ．ｙｏｅｌｉｉベクターで追加刺激されたこととなる。５０日目に、マウスから採血し、血清を準備した。５４日目に、３００匹のＰ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトでマウスに攻撃接種を行った。６１〜６８日目に、ギムザ染色した血液スメアにより可視化することで寄生虫血症を評価した。寄生虫がいずれかのサンプルで観察された場合、マウスをポジティブであるとみなした。攻撃接種の重症度を測るため、４群のネイティブなＣＤ１マウスに１００，３３．３，１１．１，又は，３．７匹のＰ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトで攻撃接種を行った。こうした伝染性をコントロールしたマウスの結果から、３００匹のＰ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトを注射したマウスは、ＩＤ_５０投与量の７倍に相当する投与量で攻撃接種を受けたことが分かった。

Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ遺伝子を、上記のように、ＤＮＡ及びオルソポックスウィルス内でクローニングした。ＤＮＡワクチンを作るために、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉオルソログ遺伝子をプラスミドにクローニングした。Ｐ．ｙｏｅｌｉｉオルソログを発現するポックスウイルス及びアデノウィルスベクターも作成した。ＤＮＡ、ポックスウイルス、及び、アデノウィルスに基づくワクチンコンストラクトを、初回−追加免疫スケジュールに従って、マウスにＰ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトを攻撃接種して予防率を評価することで、試験した。

２番目の研究では、各群１４匹のマウスを、０日目に１００μｇのＤＮＡ−Ｐ．ｙｏｅｌｉｉワクチンベクター及び３０μｇのマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｍＧＭ−ＣＳＦ）を発現するＤＮＡベクターで初回刺激し、４２日にワクシニア−Ｐ．ｙｏｅｌｉｉワクチンベクター３．３×１０^７で追加刺激した。２種又は３種のＤＮＡ−Ｐ．ｙｏｅｌｉｉベクターで免疫付与したマウスは、それぞれ、合計で２００又は３００μｇのＤＮＡ−Ｐ．ｙｏｅｌｉｉベクター及び３０μｇのＤＮＡ−ｍＧＭ−ＣＳＦベクターで初回刺激され、合計で６．６×１０^７ｐｆｕ又は１×１０^８ｐｆｕのワクシニア−Ｐ．ｙｏｅｌｉｉベクターで追加刺激されたこととなる。ネガティブコントロールマウスの異なる３群には、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ抗原を発現しないＤＮＡ及びワクシニアベクターを３種の異なる投与量で接種した。第１群は、１００μｇの『空』ＤＮＡベクター及び３０μｇのＤＮＡ−ｍＧＭ−ＣＳＦベクターにより初回刺激し、３．３×１０^７ｐｆｕの『空』ワクシニアベクターで追加刺激した。第２群は、２００μｇの『空』ＤＮＡベクター及び３０μｇのＤＮＡ−ｍＧＭ−ＣＳＦベクターにより初回刺激し、６．６×１０^７ｐｆｕの『空』ワクシニアベクターで追加刺激した。第３の群は、３００μｇの『空』ＤＮＡベクター及び３０μｇのＤＮＡ−ｍＧＭ−ＣＳＦベクターにより初回刺激し、１×１０^８ｐｆｕの『空』ワクシニアベクターで追加刺激した。５２日目に、マウスから採血し、血清を準備した。５７日目に、３００匹のＰ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトでマウスに攻撃接種を行った。６４〜７１日目に、ギムザ染色した血液スメアにより可視化することで寄生虫血症を評価した。寄生虫がいずれかのサンプルで観察された場合、マウスをポジティブであるとみなした。攻撃接種の重症度を測るため、４群のネイティブなマウスに１００，３３．３，１１．１，又は，３．７匹のＰ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトで攻撃接種を行った。こうした伝染性をコントロールしたマウスの結果から、３００匹のＰ．ｙｏｅｌｉｉスポロゾイトを注射したマウスは、ＩＤ_５０投与量の１３．６倍に相当する投与量で攻撃接種を受けたことが分かった。

上記２つの予防効果研究の投与スケジュールが若干異なることに注意すべきである。例えば、各ワクシニア−Ｐ．ｙｏｅｌｉｉベクターの投与量は、予防効果研究１（５×１０^７ｐｆｕ）のほうが予防効果研究２（３．３×１０^７ｐｆｕ）よりも若干高かった。結果として、三重ワクチンの合計投与量は、予防効果研究１では１．５×１０^８ｐｆｕであり、予防効果研究２では１×１０^８ｐｆｕであった。さらに、予防効果研究２では、ＤＮＡベクターは、ＤＮＡ−ｍＧＭ−ＣＳＦプラスミドと混合された。これまでの研究では、ＤＮＡ−ＰｙＣＳＰベクターをＤＮＡ−ｇＧＭ−ＣＳＦプラスミドと同時投与することで、ＤＮＡ−ワクシニアの初回−追加投与スケジュールの免疫原性及び効き目を増強できることが示されてきていたが、予防効果研究１と比べて予防効果研究２では、ＤＮＡ−ｍＧＭ−ＣＳＦプラスミドは、ＰｙＣＳＰ又は三重Ｐ．ｙｏｅｌｉｉワクチンの効き目を増強するようには見えなかった。

表１及び図１（パネルＡ）に示すように、ＰＹ０３０１１又はＰＹ０３６６１を発現するベクターを接種した１４匹のマウスはいずれも無菌的感染予防を示さなかった（即ち、予防率０％）。さらに、ＰＹ０３４２４を接種した１４匹のマウスのうち２匹で感染が予防された（即ち、１４％）。しかし、３種の抗原全て（即ち、ＰＹ０３０１１、ＰＹ０３４２４及びＰＹ０３６６１）を用いると、５７％の予防率が観察された。これは、ＰｙＣＳＰで観察されたものより大きかった。

図１（パネルＢ）の第２の研究の結果は、さらに、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉポリペプチドの相加的予防効果を確かにするものである。表１及び図１（パネルＢ）に示すように、ＰＹ０３６６１を発現するベクターを接種したマウスはいずれも感染が予防されず、ＰＹ０３０１１又はＰＹ０３４２４を発現するベクターを接種した１４匹のマウスのうち１匹のみで感染が予防された（予防率７％）。しかし、ＰＹ０３０１１及びＰＹ０３４２４を接種した１４匹のマウスのうち６匹で感染が予防され（即ち、４３％）、ＰＹ０３４２４及びＰＹ０３６６１を接種した１４匹のマウスのうち３匹で感染が予防され（即ち、予防率２１％）、そして、３種類のＰ．ｙｏｅｌｉｉ抗原全てを接種した１４匹のマウスのうち６匹で感染が予防された（即ち、予防率４３％）。この研究において、ＰＹ０３０１１及びＰＹ０３４２４により惹起された予防率は、統計的に有為であった（ＰＹ０３０１１／ＰＹ０３４２４（ｄｏｓｅ＝２Ｘ）対ネイティブコントロール（ｄｏｓｅ＝２Ｘ）、ｐ＝０．０１５９）。これまでの研究同様に、ＰＹ０３０１１及びＰＹ０３４２４の組合せ又は３種の抗原全ての組合せにより惹起される予防率は、ＰｙＣＳＰにより惹起される予防率よりも大きかった（即ち、４３％対１４％）。

別の研究として、図２に示すように、ＣＤ１マウス１４匹に、再び、ＤＮＡ／アデノウィルス初回−追加免疫スケジュールを用いて、接種を行った。この研究では、ＰＹ３０１１又はＰＹ３４２４を単独で用いた場合に大きな反応が観察された。実際、ＰＹ３４２４への応答はＰＹＣＳＰについて観察されていた応答と同程度であった。３番目の抗原であるＰＹ４７４８では、１４匹のマウスのうち１匹のみで感染が予防される結果となった。興味深いことに、ＣＤ１マウスに接種するために３種の抗原全て（即ち、ＰＹ３０１１、ＰＹ３４２４及びＰＹ４７４８）を用いると、感染予防効果が観察されなかった。この結果の原因は明らかではない。

この研究の結果は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉに対する免疫を付与するにあたっての、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉタンパク質の潜在的価値を示している。興味深いことに、複数のタンパク質の相加的効果は、しばしば、単一のタンパク質のみを接種したマウスから予測される効果を上回るものであった。例えば、図１のパネルＡにおいて、ＰＹ０３０１１又はＰＹ０３６６１は感染予防効果を示さなかった。同様に、ＰＹ０３４２４の接種はわずか１４％の予防率を示すのみであった。しかし、これらの遺伝子を組み合わせて接種した場合、３種類すべてを同時に投与したため投与量が嵩増されてはいるものの、ＰｙＣＰＳよりも高い予防率が示された。

こうした分析から、これらにオルソロガスなＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ遺伝子は、マラリアに対する免疫を誘導するための組成物に含まれるべき重要な候補であるものと考えられる。表１に、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのオルソログを列記した。上記のマウスの予防効果研究で試験したＰ．ｙｏｅｌｉｉ遺伝子産物の全てについて、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのオルソログは、免疫ヒト血清及び／又はＴ細胞のいずれかとポジティブに反応した。表２に、ＤＮＡ及びタンパク質配列のまとめを示す。

［実施例５：Ｐ．ｙｏｅｌｉｉにオルソロガスなＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの免疫認識］
Ｐ．ｙｏｅｌｉｉの感染予防データから、オルソロガスなＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ遺伝子を同定し、さらに、それらの細胞性免疫を付与する能力を評価した。図３に示すのは、ＰＹ３４２４に対するＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍオルソログＰＦ１０６をＴ細胞応答誘導のための抗原として利用した場合の結果を、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ法におけるＰＢＭＣでのＩＦＮ−γ誘導能により明らかにしたものである。結果はスポット形成細胞（ＳＰＣ）／１００万で示した。

図３では、『プール』は、１０ｍｅｒずつ重複しながら、ＰＦ１０６タンパク質全長を網羅する、１５ｍｅｒのペプチド群を示す。さらに、ＨＬＡクラスＩ特異的１５ｍｅｒペプチドプールを開発し抗原としても用いた。ＨＬＡクラスＩ特異的プールは、特定のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子のＨＬＡクラスＩ結合モチーフをそれぞれ備える１２〜１５種のペプチドを含む。表３に、ＰＢＭＣのＨＬＡ遺伝子型を示す。全てのボランティアにＩＳＶを接種したが、そのうち幾人かが予防的免疫応答を示した。こうした研究の結果を図３に示す。

図３に示すように、ペプチドプールは、概ね、接種後のボランティアから採取したＰＢＭＣにおいて、接種前のＰＢＭＣと比較して、顕著なＴ細胞応答を誘導した。数名の個体、例えば、ＧＢ２１、ＤＦ００３０から採取した接種後のＰＢＭＣは、比較的高いＩＦＮ−γ誘導を示した。実際に、ボランティアＧＢ２１は、マラリアに対する予防的免疫応答を示した。さらに、ＨＬＡクラスＩ結合モチーフを含むペプチド抗原は、概ね、顕著なＩＦＮ−γ誘導を示した。興味深いことに、全体で最大のＩＦＮ−γ誘導を示したＧＢ２１から採取したＰＢＭＣは、Ａ１１ＨＬＡプールを抗原として用いたときに、１５ｍｅｒのプールで観察されたのと同程度のＩＦＮ−γＳＰＣの水準を示した。このことは、ＦＰ１０６が、抗Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍエピトープを含んでいるのみならず、いくつかのエピトープがマラリアに対する免疫に重要であり得ることを示唆している。さらに、ＰＦ１０６の領域は、ＨＬＡ拘束性に働き、クラスＩ Ｔ細胞免疫を誘導する。

ＰＦ１０６に加えて、他のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍタンパク質も、ＨＬＡクラスＩ特異的ＩＦＮ−γ誘導をもたらすＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイ法の抗原として利用した。これらのタンパク質は、ＰＦ６１、ＰＦ５６、ＰＦ１２１、及び、ＰＦ１４４を含む。こうした研究の結果を図３〜７に示す。さらに、表１に結果をまとめた。表２に、ＤＮＡ及びタンパク質の配列番号をまとめた。

ＰＦ１４４により惹起されたＴ細胞応答は特に顕著であった。図７に示すように、ＰＦ１４４に暴露された４ヒトから採取したＰＢＭＣは、高いＩＦＮ−γ分泌細胞水準を示した。注意すべき点は、４人のうち３人がこれまでにマラリアに対する予防的免疫応答を惹起することが示されていることから、感染予防におけるこのタンパク質の重要性が示唆される点である。さらに、クラスＩ対立遺伝子に対するＨＬＡ結合モチーフを含むペプチドは、ＩＦＮ−γ応答を誘導し、場合によっては、例えば、ＧＢ２１、ＷＷ５８、及び、ＤＦ３０などの場合は、１５ｍｅｒのペプチドからなるプールを用いた場合に観察されるのと同等又はさらに多くのＩＦＮ−γ応答を誘導した。

ＰＦ１４４がマラリアに対する免疫付与において重要なＴ細胞エピトープを含んでいることからさらに発想を広げ、Ｂ７に関連するモチーフを含むポリペプチドのＩＦＮ−γ誘導能をさらに詳しく分析した。図８に示すように、ＷＷ５８から採取したＰＢＭＣにおいて、ペプチドプールに対するＩＦＮ−γ応答を分析した。図８から分かるように、Ａ２及びＡ３プールを用いた結果は、図７に示した結果と一致した。しかし、Ｂ７プールを抗原として用いた場合、特に、Ｂ７結合モチーフを含むペプチド、ＬＲＨＦＦＳＩＬＬＫＳＬＶＩが、免疫ＰＢＭＣにおいて高いＩＦＮ−γ応答を誘導した。このことは、ＢＦ１４４に対するクラスＩ Ｔ細胞免疫におけるＢ７対立遺伝子の潜在的重要性を示唆している。

図１〜８のデータは、タンパク質抗原であるＰＦ１０６，６１，５６，１２１及び１４４が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリアに対する予防効果を付与するために重要なエピトープを含んでいることを強く示唆している。さらに、これらのタンパク質は、特定のＨＬＡクラスＩエピトープ結合モチーフを含む抗原に対するＴ細胞応答を誘導する能力を有することから分かるように、クラスＩ特異的応答を誘導する能力を有している。

［実施例６：発現系への組み込み］
この実施例は、表２の抗原の１つ以上又は該抗原をコードする核酸をワクチン製剤に組み込むことによる、新規抗原をコードする組み換え遺伝子の理論的な使用例を例示する。表２の抗原の免疫原性断片又は抗原の誘導体を代わりに利用することもできる。抗原はＤＮＡワクチンの成分として発現することもできるしその他のプラットフォーム系の成分として発現することもできると考えられる。考えられる発現系の例としては、これらに限定されるものではないが、複製性のベクターあるいは非複製性のベクターを含むウィルス系などが挙げられる。考えられるウィルスベクターの例としては、アデノウィルス、アルファウィルス、ポックスウイルス、サイトメガロウィルス、イヌジステンパーウィルス、及び、黄熱病ウィルスが挙げられる。抗原は、単一又は複数プロモーターに由来する単一抗原又は複数抗原発現システムのいずれかであるＤＮＡ又はその他のワクチン発現系のインサートとして組み込むことができる。

考えられる発明として、ヒトを含む哺乳類において免疫応答を誘導する方法が挙げられる。この実施例では、抗原は、ポリペプチドとして、又は、ＤＮＡあるいはウィルス系などの核酸発現系に組み込まれて、１回又は複数回投与される。また、この方法は、初回−追加免疫スケジュールを用いた免疫応答誘導を意図するものである。この実施形態では、１回以上の初回免疫付与の後に、１回以上の追加免疫付与を行うことになるだろう。

初回及び追加免疫付与は、配列番号２，４，６，８，１０，１２あるいは１４、又は、これらの免疫原性誘導体のアミノ酸配列を含む１種又は複数種のマラリアポリペプチドを含有する組成物からなる。免疫原性誘導体は、代わりに、ポリペプチドを発現することのできる発現系から構成することもできる。この実施形態では、配列番号１，３，５，７，９，１１又は１１の核酸配列を有している上記のポリペプチドをコードする核酸分子を、ＤＮＡプラスミド又はウィルス発現ベクターに挿入することもできる。ウィルス発現ベクター系の例としては、アルファウィルス（及びアルファウィルスレプリコン）、アデノウィルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウィルス、サイトメガロウィルス、イヌジステンパーウィルス、黄熱病ウィルス、及び、レトロウィルスなどが挙げられる。

考えられる方法としては、初回免疫付与は、ＤＮＡプラスミド発現ベクター又はアデノウィルスから発現されたマラリアペプチドからなり、追加免疫付与は、アデノウィルス、初回免疫付与のアデノウィルスとは異種のアデノウィルス、ポックスウイルス、又は、１種以上のマラリアポリペプチドのいずれかから発現されたマラリアペプチドを含む方法が挙げられる。マラリアポリペプチドは、配列番号２，４，６，８，１０，１２あるいは１４、又は、これらの免疫原性誘導体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

引用した全ての引用文献、例えば、刊行物、特許出願及び特許を、参照により本明細書に取り込む。

以上本発明について記載してきたが、当業者であれば、上記の教示に従って、添付の請求項において、本願発明の種々の修正例及び変形例が可能であることを理解できるであろう。従って、添付の請求項の範囲において、本発明を、本明細書に具体的に記載した方法以外の方法で実践することができるものと理解すべきである。

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年１１月５日に出願された米国特許仮出願第６１／２７２，８０９号の利益を主張するものである。当該仮出願を参照して本願明細書に取り込む。

Claims (18)

1. １種以上の単離ポリペプチド及び薬理学的に許容可能な担体からなり、
   前記単離ポリペプチドは、配列番号２，４，６，８，１０，１２及び１４、並びに、それらの免疫原性誘導体からなる群より選択されるアミノ酸配列を備えることを特徴とする免疫原性組成物。
2. １種以上のポリペプチドをコードする１種以上の単離核酸分子からなり、
   前記ポリペプチドは、配列番号１，３，５，７，９，１１及び１３からなる群より選択される核酸配列によりコードされていることを特徴とする免疫原性組成物。
3. 前記ポリペプチドはＨＬＡクラスＩエピトープを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
4. 前記核酸配列はＨＬＡクラスＩエピトープをコードする１種以上の領域を含む、請求項２に記載の免疫原性組成物。
5. 前記核酸配列及び前記ポリペプチドは、ＤＮＡプラスミド又はウィルス発現系により、挿入及び発現され、
   このとき、前記ウィルス発現系は、複製性又は非複製性である、
   請求項２に記載の免疫原性組成物。
6. 前記ウィルス発現系は、アルファウィルスレプリコン、アデノウィルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウィルス、サイトメガロウィルス、イヌジステンパーウィルス、黄熱病ウィルス、及び、レトロウィルスからなる群より選択される、請求項５に記載の免疫原性組成物。
7. 単離マラリアポリペプチドをコードしており、適切な発現ベクターに挿入されている１種以上の単離核酸分子からなる組成物を哺乳動物に投与することを含み、
   前記単離核酸分子は請求項２に記載されたものであることを特徴とする哺乳動物においてマラリアに対する免疫応答を誘導する方法。
8. 前記適切な発現ベクターは、ＤＮＡプラスミド、あるいは、複製性又は非複製性ウィルスベクターである、請求項７に記載の方法。
9. 前記単離核酸分子のエンコードはＨＬＡクラスＩエピトープを含む、請求項７に記載の方法。
10. １回以上の初回免疫付与及び１回以上の追加免疫付与をさらに含む方法であって、
    前記初回免疫付与は、請求項１に記載の１種以上のマラリアポリペプチドからなり、又は、適切な発現ベクターに挿入された請求項２に記載の１種以上の前記単離核酸分子からなる組成物からなり、
    前記追加免疫付与は、請求項１に記載のマラリアペプチドからなり、又は、適切な発現ベクターに挿入された請求項２に記載の１種以上の単離核酸分子からなる組成物からなる、請求項７に記載の方法。
11. 前記適切な発現ベクターは、ＤＮＡプラスミド、アルファウィルスレプリコン、アデノウィルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウィルス、サイトメガロウィルス、イヌジステンパーウィルス、黄熱病ウィルス、及び、レトロウィルスからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
12. 前記適切な発現ベクターは、ＤＮＡプラスミド、アルファウィルスレプリコン、アデノウィルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウィルス、サイトメガロウィルス、イヌジステンパーウィルス、黄熱病ウィルス、及び、レトロウィルスからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
13. 前記初回免疫付与のベクターはアルファウィルスベクターであり、且つ、前記追加免疫付与のベクターは非アルファウィルスベクターである、請求項１０に記載の方法。
14. 前記初回免疫付与は、ＤＮＡプラスミド又はアデノウィルスである発現ベクターからなり、
    前記追加免疫付与は、アデノウィルス、前記初回アデノウィルスとは異種のアデノウィルス、ポックスウイルス、及び、請求項１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
15. アルファウィルスレプリコンのプリパレーションは、ＲＮＡレプリコン、ＤＮＡレプリコン、及び、アルファウィルスレプリコン粒子からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
16. 前記アルファウィルスは、ベネズエラ馬脳炎ウィルス、セムリキ森林ウィルス、及び、シンドビスウィルスからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
17. 前記非アルファウィルスのウィルス発現系は、ポックスウイルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、及び、レトロウィルスからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
18. 前記ポックスウイルスは、牛痘、カナリア痘、ワクシニア、改変ワクシニアアンカラ、又は、鶏痘からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。

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