JP2013255445A - 微生物検査方法および検査システム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、
薬剤および/または代謝基質が添加された培地を含む、微生物を培養するための培養容器を備えた培養部と、
前記培地の成分を分析するための質量分析装置と、
前記質量分析装置により決定された前記培地中の前記微生物に由来する代謝産物の種類および量に基づいて、前記微生物の種類を同定する、あるいは前記薬剤および/または代謝基質の前記微生物に与える影響を判定する解析部と
を備えることを特徴とする微生物検査システムに関する。
【選択図】図2
Description
薬剤および/または代謝基質を添加した培地において微生物を培養し、
該培地に含まれる該微生物が生成し細胞外に排出した代謝産物に対して質量分析を行い、
該質量分析により決定した該代謝産物の種類および量に基づいて、該微生物の種類を同定する。
薬剤および/または代謝基質を添加した培地において微生物を培養し、
該培地に含まれる該微生物が生成し細胞外に排出した代謝産物に対して質量分析を行い、
該質量分析により決定した該代謝産物の種類および量に基づいて、該薬剤および/または代謝基質の該微生物に与える影響を判定する。
薬剤および/または代謝基質が添加された培地を含む、微生物を培養するための培養容器を備えた培養部と、
前記培地の成分を分析するための質量分析装置と、
前記質量分析装置により決定した前記培地中の前記微生物に由来する代謝産物の種類および量に基づいて、前記微生物の種類を同定する、あるいは前記薬剤および/または代謝基質の前記微生物に与える影響を判定する解析部と
を備える。
まず、本検査方法について、実施の形態を説明する。本検査方法に基づいて、大腸菌Escherichia coli ATCC 25922株を材料として、培地中のグルコース代謝産物であるピルビン酸および乳酸を測定することにより、抗生物質クロラムフェニコールが増殖に与える影響を判定し、最小発育阻止濃度(MIC)を決定することが可能であることを示す。
次に、実施例1と同様の方法により、黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus ATCC 6538株を材料として、培地中のグルコース代謝産物であるピルビン酸および乳酸を測定することにより、抗生物質アンピシリンが増殖に与える影響を判定し、MICを決定することが可能であることを示す。
次に、実施例1の検査方法に基づいて、これを本微生物検査システムにおいて微生物の薬剤感受性試験を実施する場合について、図1で示した本微生物検査方法および微生物検査システムのフローの具体的な実施の形態を説明する。また、微生物検査システムの具体的な構成例を図3に示す。細菌や真菌などの微生物に対する薬剤の効果の判定を薬剤感受性試験という。本微生物検査システムを用いた薬剤感受性試験は、次のような手順に従って行う。
細菌を検査対象とする場合、患者から採取した臨床検体を所定の寒天平板培地上で一次培養して得られた細菌のコロニーについて、その1個または同じ外観・形状の複数個のコロニーを採取し、液体培地に細菌を懸濁する。拾うコロニーの数は、1個であることが望ましいが、菌量が足りない場合には複数個のコロニーを拾って使用する。細菌の場合、通常は1個のコロニーには107〜108個の細菌が含まれているので、1個のコロニーを10 mLの液体培地に懸濁した場合には、懸濁液中の細菌の濃度は106〜107 CFU/mLとなる。細菌の濃度は、それよりも低い濃度または高い濃度でも構わないが、細菌の濃度が高い方が培地中に排出される代謝産物の濃度が高くなり、より短時間の培養で検査結果を得ることが期待できる。例えば、10 mLの菌懸濁液を調製した場合、100μLの培養を100個行うことが可能となる。真菌に対する感受性試験も、菌体数は異なるが、基本的には同等の手順で行う。
培地に関しては、天然成分を含む培地、化学合成培地、化学合成培地に天然成分を添加した半合成培地などを用いることが可能である。天然成分を含む培地とは、肉エキスや酵母抽出物などを組成とする培地であり、ミューラー・ヒントン培地やLB培地などが該当する。化学合成培地とは、化学物質の純品を混合して調製される培地であり、全ての成分とその濃度が明らかな培地であり、例えば、大腸菌の培養に用いるLeMaster培地やM9培地などが該当する。質量分析法による測定のためには培地成分が完全に分かっており、イオン化を妨げるような夾雑物が少ない化学合成培地が望ましい。ただし、微生物の種によっては増殖のために天然成分を必要とする場合があるので、その場合には、化学合成培地に微生物の増殖のために必要最小限の天然成分を添加した半合成培地を使用する。
上記培地には、安定同位体標識をした化合物を添加し、その化合物から生成される代謝産物を測定することが可能である。例えば、6個の炭素原子の全てが13Cになった13C6グルコースを炭素源として培地に添加した場合には、それから生成される代謝産物には13Cが含まれる。例えば、ピルビン酸の場合には、13C3ピルビン酸が生成する。したがって、13C3ピルビン酸を通常の炭素原子から構成される12C3ピルビン酸と区別して測定することにより、グルコース代謝系の働きのみをモニターすることが可能となる。グルコース代謝系は微生物の増殖と密接に結びついていると考えられるので、より厳密に微生物増殖を計測することが可能になる。また、培地成分としてピルビン酸、乳酸、クエン酸などが予め培地に含まれている場合がある。そのような場合には、培地成分として含まれているピルビン酸、乳酸、クエン酸などとグルコースからの代謝によって生成した代謝産物とを区別することが可能となり、グルコース代謝系の働きをモニターすることが可能となる。13C6グルコースでは、6個の炭素原子の全てが13Cになっているが、13Cの数が5個以下のグルコースの使用も可能である。ただし、13C6グルコースを使用した場合、生成する2分子のピルビン酸の両方が13C3ピルビン酸になり、分析が容易である。また、通常の12C3ピルビン酸とは分子量も違うので、質量分析での区別が容易である。グルコース以外の分子に関しても、安定同位体標識したものを利用することが可能である。ただし、13C6グルコースは、他の安定同位体標識化合物に比べると安価で、安定して供給されるので、本微生物検査法および微生物検査システムを実用化する際には、コストや品質保証の点で有利である。
本微生物検査方法および微生物検査システムにおいて検査の対象とするのは、一般的に病院の検査室などで検査対象となる、細菌や真菌などの微生物である。微生物種に関しては、あらかじめ定めずに検査を行うことが可能である。また、患者の症状や染色標本の顕微鏡観察の結果、一次培養に用いた寒天平板培地の種類、コロニーの外観・形状、微生物の遺伝子の塩基配列情報などに基づいて、微生物種を推定または同定することが可能である。さらに、MALDI-TOF質量分析装置を用いた検査方法で種同定することも可能である。微生物種が推定または同定できる場合には、対象微生物種に適した薬剤に対象を絞って薬剤感受性試験を行うことが可能である。検査対象とするのは、ヒトに感染する微生物だけでなく、家畜やペットの動物などに感染する微生物も含まれる。
準備した菌懸濁液を本微生物検査システムにセットした後に、例えば図3に示されるように、菌懸濁液導入口311より菌懸濁液が各培養容器302に送られる。各培養容器には、あらかじめ異なる量の薬剤が含まれており、異なった濃度の薬剤を含む試料が準備される。これを複数種類の薬剤について準備する。同時に、対照として薬剤を含まない試料(標準培養と呼ぶ)も準備する。薬剤の種類と濃度に関しては、検査対象となる微生物またはその候補種に応じて選択するものとする。薬剤の濃度は、希釈系列を用いることも可能であるし、薬剤耐性菌の判定などのために所定の濃度のみに限定することも可能である。なお、薬剤を添加した後に、各培養容器に送ることも可能である。このように異なった濃度の薬剤を含む複数の試料を準備し、濃度に応じた薬剤感受性情報を取得すれば、当該菌に対する薬剤の影響を濃度に応じて評価することが可能となる。
準備した試料について培養装置301において一定の温度で培養を行う。温度に関しては、必要に応じて設定を行うが、臨床検体の場合例えば32〜40℃、通常は37℃で行うことが多い。培養および質量分析による代謝産物の測定に関しては、培養を行いながら適宜培地を採取して行うことが可能である。また、一定の時間培養の後に行うことも可能である。培養する時間は、検査対象とする微生物種に応じて予め定めておくことが可能である。また、薬剤を含まない標準培養における増殖から判定することも可能である。その場合には、一定時間ごとに培地を採取し、本微生物検査システムで測定を行い、所定の成分(代謝産物)が所定の濃度に達した時点をもって培養を終了することが可能である。
微生物を培養した後に、培地を採取し、前処理部303にて試料調製を行った後に、質量分析装置304で測定を行う。培地の採取に当たっては、孔径0.22μmまたは0.45μmのメンブレンフィルターを用いて培養液から微生物を除去し、培地のみを採取する。ただし、質量分析装置304におけるイオン化および測定の妨げにならない場合には、微生物を除去せずに、微生物を含む培養液を用いて測定することも可能である。
薬剤が微生物の増殖に及ぼす影響は、次のような手順で行う。各培養液から採取した培地の質量分析により、培地中の所定の微生物代謝産物の濃度を測定する。測定の対象とする微生物由来の代謝産物は、微生物の種類に応じて選ぶものとする。例えば、培地にグルコースを添加し、グルコースの代謝によって生成し、菌体外に排出されるピルビン酸、乳酸、クエン酸、酢酸、エタノールなどを利用することが可能である。その他の糖類でも、菌種によって代謝されるか否かが異なるが、代謝される場合には、代謝産物としてピルビン酸、乳酸、クエン酸、酢酸、エタノールなどが生成される場合がある。また、それ以外の代謝産物も利用可能である。なお、代謝産物の濃度に関しては、絶対定量が望ましいが、必ずしもその必要はなく、異なる試料間で代謝産物の量の比較が行えればよく、質量分析の結果得られるスペクトルのピーク面積などの相対定量でもよい。
質量分析で得られた代謝産物濃度からデータ解析部305において薬剤の効果を判定するプロトコールの具体的な例を図6A〜Cに示す。大腸菌におけるクロラムフェニコールの効果を本検査システムで測定した場合について、実施例1で測定した大腸菌におけるクロラムフェニコール濃度に対する培地中のピルビン酸濃度のデータに基づいて、MICの判定を行った。なお、ピルビン酸以外の代謝産物(例えば、乳酸やクエン酸など)を用いても、同様の操作が可能であり、様々な代謝産物から適したものを選択して、判定を行うものとする。
以上の判定結果は、表示部308に表示される。図7にその表示画面のインターフェースを示す。標準培養におけるピルビン酸濃度を100とした場合の、クロラムフェニコールを異なる濃度で添加した各試料におけるピルビン酸の相対濃度を算出し、図7のAに示すような5段階に分けて表示を行った。それぞれの段階は、相対濃度0以上5未満を段階1、5以上10未満を段階2、10以上20未満を段階3、20以上50未満を段階4、50以上を段階5とし、それぞれを異なる色や形でインターフェース上に表示する。これを図7のBに示すようなインターフェースで表示する。また、大腸菌ATCC 25922におけるクロラムフェニコールのMICの結果として、「試料4」とその薬剤濃度「2μg/mL」を表示する。なお、この段階区分に関しては、段階の数を多くしたり、区切りとなる数値を変えたりすることが可能である。
次に、安定同位体標識された13C6グルコースを炭素源として用いた場合の具体的な効果を示す。実施例1ではLeMaster培地には1%のグルコースが含まれているが、このグルコースとして通常の12C6グルコースと、6個の炭素原子の全てが安定同位体13Cで標識された13C6グルコースを使用した場合とを比較した。実施例1と同様の方法で、炭素源として通常の12C6グルコースを含む培地と、安定同位体標識13C6グルコースを含む培地を用いて、それぞれで大腸菌ATCC 25922株を培養し、菌体濃度と培地中のピルビン酸および乳酸の濃度の経時変化を測定した。12C6グルコースを用いた場合には、12C3ピルビン酸と12C3乳酸とが生成するので、12C3ピルビン酸と12C3乳酸を測定した。ただし、この場合には、グルコース以外に由来する12C3ピルビン酸と12C3乳酸も測定される。一方、13C6グルコースを用いた場合には、13C3ピルビン酸と13C3乳酸とが生成するので、13C3ピルビン酸と13C3乳酸を測定した。この場合には、グルコースに由来するピルビン酸と乳酸のみが測定される。
次に、本微生物検査システムにおいて微生物の生化学性状試験を行って微生物種を同定する場合について、図1で示した本発明の微生物検査方法のフローの具体的な実施の形態を説明する。また、微生物検査システムの具体的な構成例を図3に示す。本微生物検査システムを用いた生化学性状試験は、次のような手順に従って行う。
生化学性状試験において、質量分析で得られた代謝産物濃度からデータ解析によって各代謝基質の効果を判定するプロトコールの具体的な例を次に示す。
102:培養試料準備ステップ
102-1:薬剤感受性試験用培養試料調製ステップ
102-2:生化学性状試験用培養試料調製ステップ
103:培養ステップ
104:培養液(培地)採取ステップ
105:前処理(質量分析用試料調製)ステップ
106:質量分析ステップ
107:データ解析ステップ
108:検査結果表示・出力ステップ
109:検査対象微生物
110:薬剤を添加していない標準培養用試料
111:それぞれ異なる濃度の薬剤を添加した試料
112:それぞれ異なる代謝基質を添加した試料
201、301:培養装置
202、303:前処理部
203、304:質量分析装置
203-1:質量分析装置イオン化部
203-2:質量分析装置質量分析部
204、305:データ解析部
205、317:菌種同定用データベース
206、306:制御部
207、307:入力部
208、308:表示部
209、309:出力部
210、310:記憶装置
302:培養容器
311:菌懸濁液導入口
312:送液系
313:送液系バルブ
314:洗浄液タンク
315:システム液タンク
316:廃液タンク
Claims (15)
- 薬剤および/または代謝基質を添加した培地において微生物を培養し、該培地に含まれる該微生物が生成し細胞外に排出した代謝産物に対して質量分析を行い、該質量分析により決定した該代謝産物の種類および量に基づいて、該微生物の種類を同定する、あるいは該薬剤および/または代謝基質の該微生物に与える影響を判定することを特徴とする微生物検査方法。
- 前記薬剤の添加量がそれぞれ異なる複数の培地において前記微生物を培養し、該複数の培地に含まれる代謝産物に対してそれぞれ質量分析を行い、該複数の培地の間で代謝産物の種類および量を比較し、その比較結果に基づいて、該薬剤の該微生物に与える抗菌特性を判定することを特徴とする請求項1に記載の微生物検査方法。
- 分離培養された微生物に、被検薬剤を無添加の試料と、被検薬剤をそれぞれ異なる濃度で添加した複数の試料を、1種類または複数種類の被検薬剤について準備する工程と、
前記試料を培養する工程と、
培養された前記各試料から前記微生物を除去した培地を採取して質量分析のための前処理を行う工程と、
前処理された前記培地の成分を質量分析する工程と、
前記質量分析で得られたスペクトルデータを解析し、前記微生物に由来する代謝産物の種類および量を決定し、前記複数の試料の間で比較することによって異なる濃度の前記被検薬剤が前記微生物に与える影響を判定する工程と
を含むことを特徴とする請求項1に記載の微生物検査方法。 - 分離培養された微生物に、それぞれに異なる代謝基質を添加した複数の試料を準備する工程と、
前記試料を培養する工程と、
培養された前記各試料から前記微生物を除去した培地を採取して質量分析のための前処理を行う工程と、
前処理された前記培地の成分を質量分析する工程と、
前記質量分析で得られたスペクトルデータを解析し、前記微生物に由来する代謝産物の種類および量を決定し、前記複数の試料の間で比較することによって前記微生物種を同定する工程と
を含むことを特徴とする請求項1に記載の微生物検査方法。 - 前記各試料には、安定同位体標識化合物が代謝基質として含まれており、前記安定同位体標識化合物より生成され前記微生物の細胞外に排出される安定同位体で標識された代謝産物を、質量分析することを特徴とする請求項3または4に記載の微生物検査方法。
- 前記質量分析を行う代謝産物が、ピルビン酸、乳酸、クエン酸、酢酸およびエタノールからなる群より選択される1つまたは複数であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の微生物検査方法。
- 前記質量分析を行って得られたスペクトルデータを、各種微生物で得られたスペクトルデータから構成されるデータベースと照合し、その結果から前記微生物種を同定することを特徴とする請求項1または4に記載の微生物検査方法。
- 薬剤および/または代謝基質が添加された培地を含む、微生物を培養するための培養容器を備えた培養部と、
前記培地の成分を分析するための質量分析装置と、
前記質量分析装置により決定された前記培地中の前記微生物に由来する代謝産物の種類および量に基づいて、前記微生物の種類を同定する、あるいは前記薬剤および/または代謝基質の前記微生物に与える影響を判定する解析部と
を備えることを特徴とする微生物検査システム。 - 前記培養部が、前記薬剤の添加量がそれぞれ異なる複数の培地および/または前記代謝基質の種類がそれぞれ異なる複数の培地を含む複数の培養容器を備えるものであり、前記質量分析装置が、前記複数の培地について分析するものであり、前記解析部が、前記複数の培地の間で前記代謝産物の種類および量を比較し、前記微生物の種類を同定する、あるいは前記薬剤および/または代謝基質の前記微生物に与える抗菌特性を判定することを特徴とする請求項8に記載の微生物検査システム。
- 分離培養された微生物を培養するための、被検薬剤を無添加の試料と、1種類または複数種類の被検薬剤をそれぞれ異なる濃度で添加された複数の試料を含む培養容器を備えた培養部と、
前記培養部の前記各培養容器から前記微生物を除去した培地を採取して質量分析のための前処理を行う前処理部と、
前記前処理部で処理した前記培地の成分を分析する質量分析装置と、
前記培養部と前記前処理部と前記質量分析装置の間で前記試料および前記培地を運ぶ機構と、
前記質量分析装置で得られたスペクトルデータを解析し、前記微生物に由来する代謝産物の種類および量を決定し、前記複数の試料の間で前記代謝産物の種類および量を比較することによって異なる濃度の前記被検薬剤が前記微生物に与える影響を判定する解析部と、
システム全体を制御および運用するための制御部と
を備えることを特徴とする請求項8に記載の微生物検査システム。 - 分離培養された微生物を培養するための、それぞれに異なる代謝基質を添加した複数の試料を含む培養容器を備えた培養部と、
前記培養部の前記各培養容器から前記微生物を除去した培地を採取して質量分析のための前処理を行う前処理部と、
前記前処理部で処理した前記培地の成分を分析する質量分析装置と、
前記培養部と前記前処理部と前記質量分析装置の間で前記試料および前記培地を運ぶ機構と、
前記質量分析装置で得られたスペクトルデータを解析し、前記微生物に由来する代謝産物の種類および量を決定し、前記複数の試料の間で前記代謝産物の種類および量を比較することによって前記微生物種を同定する解析部と、
システム全体を制御および運用するための制御部と
を備えることを特徴とする請求項8に記載の微生物検査システム。 - 前記培養部が、安定同位体標識化合物を代謝基質として含む培地を含む培養器を備えるものであり、前記質量分析装置が、前記安定同位体標識化合物より生成され前記微生物細胞外に排出される安定同位体で標識された代謝産物を質量分析することを特徴とする請求項10または11に記載の微生物検査システム。
- 代謝産物が、ピルビン酸、乳酸、クエン酸、酢酸、エタノールからなる群より選択される1つまたは複数であることを特徴とする請求項8〜11のいずれか1項に記載の微生物検査システム。
- 前記解析部が、質量分析装置で得られたスペクトルデータを、各種微生物で得られたスペクトルデータから構成されるデータベースと照合し、その結果から前記微生物種を同定することを特徴とする請求項8または11に記載の微生物検査システム。
- 前記解析部で得られた結果を表示、出力または記憶する手段をさらに備えることを特徴とする請求項8〜11のいずれか1項に記載の微生物検査システム。
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