JP2013201975A - 細胞挙動解析装置、細胞挙動解析方法、およびプログラム - Google Patents

Abstract

【課題】特定の培養環境に応じて、細胞挙動の指標を算出することが可能な細胞挙動解析装置等を提供する。
【解決手段】特定培養環境指定部３２は、タイムラプス画像取得部３１で取得されたタイムラプス画像から、解析したい細胞の領域の指定を受け付けるとともに、解析したい細胞の指定領域での滞在時間の入力を受け付ける。細胞自動トラッキング部３３は、タイムラプス画像取得部３１で取得されたタイムラプス画像から、個々の細胞を識別し、自動トラッキングする。特定培養環境下細胞自動選出部３４は、細胞自動トラッキング部３３で検出した細胞軌跡情報から、特定培養環境指定部３２で指定された領域に指定時間滞在した細胞を選出する。細胞挙動算出部３５は、特定培養環境下細胞自動選出部３４で選出された細胞のトラッキング情報を用いて、各種細胞挙動指標を算出する。
【選択図】図３

Description

本発明は、タイムラプス画像から細胞挙動を解析する細胞挙動解析装置等に関するものである。

従来、体外受精、新薬開発、再生医療等の分野において、一定間隔ごとに細胞を撮影した画像（以下、「タイムラプス画像」という）に基づいて、コンピュータによって細胞の挙動を解析する技術が利用されている。このような分野では、細胞数や細胞の移動速度等の解析を行う為に、個々の細胞を自動的に追跡したいというニーズがある。

例えば、特許文献１には、注目細胞の終焉に位置する細胞を周辺細胞として、注目細胞に対する周辺細胞の速度の統計量を算出して、注目細胞に関する各周辺細胞の相互作用の状態を判断可能にする技術が提案されている。

また例えば、特許文献２には、細胞培養の観測画像の記録された複数の細胞領域を自動で識別し、識別した各細胞領域を視覚的に容易に判別可能にするために各細胞領域に対して異なる描画色を自動的に設定する技術が提案されている。

特開２００９−２２９２７６号公報 特許第４５２１５７２号公報

ところで、タイムラプス画像の細胞に係る経時的変化の統計的特徴量を検出する細胞画像の評価方法において、培養ディッシュ上において場所や時間による環境が異なる場合がある。例えば、培養ディッシュ上の特定領域に成長因子（細胞の成長を促進するための化学物質）をプリントして、その領域の細胞と他の領域の細胞に係る細胞挙動指標を算出して差異を比較したいというニーズがある。

このように、異なる環境が存在する培養ディッシュ上において、特定の環境に一定時間存在している細胞のみから細胞挙動指標を算出したい場合、特許文献１および特許文献２で、培養環境に応じた細胞に着目した解析を行うようにするには、ユーザが画像上から目視で細胞の状態を確認し、注目細胞を複数選択する必要があり負荷が高いという課題があった。

本発明は、前述した問題点に鑑みてなされたもので、その目的とすることは、特定の培養環境に応じて、細胞挙動の指標を算出することが可能な細胞挙動解析装置等を提供することである。

前述した目的を達成するために、第１の発明は、複数フレームのタイムラプス画像を取得する画像取得手段と、特定培養環境を指定する指定手段と、前記複数フレームのタイムラプス画像から、細胞の挙動をトラッキングする細胞トラッキング手段と、前記細胞トラッキング手段によるトラッキング結果から、前記指定手段により指定された前記特定培養環境に含まれる前記細胞を選出する選出手段と、前記選出手段により選出された前記細胞の挙動指標を算出する算出手段と、を備えることを特徴とする細胞挙動解析装置である。
第１の発明によって、特定培養環境における細胞の挙動指標を算出することが可能となる。

前記指定手段は、前記タイムラプス画像中における所定領域、および、前記複数フレーム中における滞在時間を前記特定培養環境として指定する。
これにより、異なる環境が存在する培養ディッシュ上において、特定の環境を指定することが可能となる。

前記指定手段は、前記タイムラプス画像中の所定領域における細胞密度、および、時間を前記特定培養環境として指定する。
これにより、特定の細胞密度範囲の細胞を指定することが可能となる。

第２の発明は、コンピュータが、複数フレームのタイムラプス画像を取得する画像取得ステップと、特定培養環境を指定する指定ステップと、前記複数フレームのタイムラプス画像から、細胞の挙動をトラッキングする細胞トラッキングステップと、前記細胞トラッキングステップの処理によるトラッキング結果から、前記指定ステップで指定された前記特定培養環境に含まれる前記細胞を選出する選出ステップと、前記選出ステップで選出された前記細胞の挙動指標を算出する算出ステップと、を実行することを特徴とする細胞挙動解析方法である。
第２の発明によって、特定培養環境における細胞の挙動指標を算出することが可能となる。

第３の発明は、コンピュータを、複数フレームのタイムラプス画像を取得する画像取得手段と、特定培養環境を指定する指定手段と、前記複数フレームのタイムラプス画像から、細胞の挙動をトラッキングする細胞トラッキング手段と、前記細胞トラッキング手段によるトラッキング結果から、前記指定手段により指定された前記特定培養環境に含まれる前記細胞を選出する選出手段と、前記選出手段により選出された前記細胞の挙動指標を算出する算出手段と、を備える細胞挙動解析装置として機能させるためのプログラムである。
第３の発明に係るプログラムをコンピュータにインストールすることで、第１の発明に係る細胞挙動解析装置を得ることができる。

第４の発明は、複数フレームのタイムラプス画像を取得する画像取得手段と、特定細胞指標を指定する指定手段と、前記複数フレームのタイムラプス画像から、細胞の挙動をトラッキングする細胞トラッキング手段と、前記細胞トラッキング手段によるトラッキング結果から、前記指定手段により指定された前記特定細胞指標に含まれる前記細胞を選出する選出手段と、前記選出手段により選出された前記細胞の挙動指標を算出する算出手段と、を備えることを特徴とする細胞挙動解析装置である。
第４の発明によって、特定細胞指標における細胞の挙動指標を算出することが可能となる。

前記指定手段は、前記タイムラプス画像中の所定領域における細胞形状、および、時間を前記特定細胞指標として指定する。
これにより、特定の細胞形状の細胞を指定することが可能となる。

第５の発明は、コンピュータが、複数フレームのタイムラプス画像を取得する画像取得ステップと、特定細胞指標を指定する指定ステップと、前記複数フレームのタイムラプス画像から、細胞の挙動をトラッキングする細胞トラッキングステップと、前記細胞トラッキングステップの処理によるトラッキング結果から、前記指定ステップで指定された前記特定細胞指標に含まれる前記細胞を選出する選出ステップと、前記選出ステップで選出された前記細胞の挙動指標を算出する算出ステップと、を実行することを特徴とする細胞挙動解析方法である。
第５の発明によって、特定細胞指標における細胞の挙動指標を算出することが可能となる。

第６の発明は、コンピュータを、複数フレームのタイムラプス画像を取得する画像取得手段と、特定細胞指標を指定する指定手段と、前記複数フレームのタイムラプス画像から、細胞の挙動をトラッキングする細胞トラッキング手段と、前記細胞トラッキング手段によるトラッキング結果から、前記指定手段により指定された前記特定細胞指標に含まれる前記細胞を選出する選出手段と、前記選出手段により選出された前記細胞の挙動指標を算出する算出手段と、を備える細胞挙動解析装置として機能させるためのプログラムである。
第６の発明に係るプログラムをコンピュータにインストールすることで、第４の発明に係る細胞挙動解析装置を得ることができる。

本発明により、特定の培養環境に応じて、細胞挙動の指標を算出することが可能な細胞挙動解析装置、細胞挙動解析方法、およびプログラムを提供することができる。

本発明の実施の形態に係る細胞挙動解析装置の構成例を示す図である。 複数フレームのタイムラプス画像群の拡大模式図である。 細胞挙動解析装置内の機能構成例を示すブロック図である。 細胞挙動解析処理を説明するフローチャートである。 細胞解析結果画面の初期画面の表示例を示す図である。 細胞解析結果画面におけるタイムラプス画像の表示例を示す図である。 解析したい細胞の領域の範囲指定、および、解析したい細胞の指定領域での滞在時間の入力例を説明するための図である。 トラッキング結果に基づく動画エリアの表示例を示す図である。 細胞挙動指標算出結果の表示例を示す図である。 細胞挙動指標算出結果の他の表示例を示す図である。 第２の実施の形態における細胞挙動解析処理を説明するフローチャートである。 設定ウィンドウを説明するための図である。 特定の細胞に係る細胞密度の時系列変化の一例を示す図である。 「１」の細胞ＩＤの細胞に係る細胞密度の時系列変化のグラフを示す図である。 「２」の細胞ＩＤの細胞に係る細胞密度の時系列変化のグラフを示す図である。 第３の実施の形態における細胞挙動解析処理を説明するフローチャートである。 トラッキング結果により得られた任意の細胞に係るフレーム毎の細胞領域の一例を示している。 細胞形状の時系列変化の一例を示す図である。 「１」の細胞ＩＤの細胞に係る細胞サイズの時系列変化のグラフを示す図である。 「２」の細胞ＩＤの細胞に係る細胞サイズの時系列変化のグラフを示す図である。

以下、図面に基づいて、本発明の実施形態を詳細に説明する。

［本発明の実施の形態］
図１は、本発明の実施の形態に係る細胞挙動解析装置１を実現するコンピュータのハードウエア構成図である。尚、図１のハードウエア構成は一例であり、用途、目的に応じて様々な構成を採ることが可能である。

細胞挙動解析装置１は、制御部１１、記憶部１２、メディア入出力部１３、通信制御部１４、入力部１５、表示部１６、周辺機器Ｉ／Ｆ部１７等が、バス１８を介して接続される。

制御部１１は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ ＯｎｌＹ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）等で構成される。

ＣＰＵは、記憶部１２、ＲＯＭ、記録媒体等に格納されるプログラムをＲＡＭ上のワークメモリ領域に呼び出して実行し、バス１８を介して接続された各装置を駆動制御し、細胞挙動解析装置１が行う後述する処理を実現する。ＲＯＭは、不揮発性メモリであり、コンピュータのブートプログラムやＢＩＯＳ等のプログラム、データ等を恒久的に保持している。ＲＡＭは、揮発性メモリであり、記憶部１２、ＲＯＭ、記録媒体等からロードしたプログラム、データ等を一時的に保持するとともに、制御部１１が各種処理を行う為に使用するワークエリアを備える。

記憶部１２は、ＨＤＤ（ハードディスクドライブ）等であり、制御部１１が実行するプログラム、プログラム実行に必要なデータ、ＯＳ（オペレーティングシステム）等が格納される。プログラムに関しては、ＯＳ（オペレーティングシステム）に相当する制御プログラムや、後述する処理をコンピュータに実行させるための細胞挙動解析プログラムが格納されている。これらの各プログラムコードは、制御部１１により必要に応じて読み出されてＲＡＭに移され、ＣＰＵに読み出されて各種の手段として実行される。また記憶部１２には、図２を参照して後述する、複数フレームのタイムラプス画像群（一定間隔ごとに撮影した細胞培養画像群）が記憶されている。

メディア入出力部１３（ドライブ装置）は、データの入出力を行い、例えば、ＣＤドライブ（−ＲＯＭ、−Ｒ、−ＲＷ等）、ＤＶＤドライブ（−ＲＯＭ、−Ｒ、−ＲＷ等）等のメディア入出力装置を有する。通信制御部１４は、通信制御装置、通信ポート等を有し、コンピュータとネットワーク間の通信を媒介する通信インタフェースであり、ネットワークを介して、他の装置間との通信制御を行う。ネットワークは、有線、無線を問わない。

入力部１５は、データの入力を行い、例えば、キーボード、マウス等のポインティングデバイス、テンキー等の入力装置を有する。入力部１５を介して、コンピュータに対して、操作指示、動作指示、データ入力等を行うことができる。表示部１６は、ＣＲＴモニタ、液晶パネル等のディスプレイ装置、ディスプレイ装置と連携してコンピュータのビデオ機能を実現するための論理回路等（ビデオアダプタ等）を有する。尚、入力部１５及び表示部１６は、タッチパネルディスプレイのように、一体となっていても良い。

周辺機器Ｉ／Ｆ（インタフェース）部１７は、コンピュータに周辺機器を接続させるためのポートであり、周辺機器Ｉ／Ｆ部１７を介してコンピュータは周辺機器とのデータの送受信を行う。周辺機器Ｉ／Ｆ部１７は、ＵＳＢやＩＥＥＥ１３９４やＲＳ−２３５Ｃ等で構成されており、通常複数の周辺機器Ｉ／Ｆを有する。周辺機器との接続形態は有線、無線を問わない。バス１８は、各装置間の制御信号、データ信号等の授受を媒介する経路である。

図２は、複数フレームのタイムラプス画像群の拡大模式図である。本実施の形態におけるタイムラプス画像は、細胞２の細胞周期に伴う挙動を観察するために、光学顕微鏡等により一定間隔ごとに撮影される画像である。一般に、細胞２の細胞周期とは、細胞分裂によって生じる娘細胞が、再び母細胞となって再び細胞分裂を行い、新しい娘細胞になるまでの過程を言う。細胞周期は、Ｍ期（Mitotic phase）と間期（interphase）に分けられる。

第１の実施形態における細胞挙動解析装置１は、培養環境（範囲と滞在時間）を指定し、タイムラプス画像から、個々の細胞をトラッキングし、指定範囲内を指定滞在時間通過した細胞を選出し、選出された細胞のトラッキング結果のみを使用して細胞挙動指標を算出する。

図３は、細胞挙動解析装置１内の機能構成例を示すブロック図である。図３に示す機能部のうちの少なくとも一部は、図１の細胞挙動解析装置１の制御部１１により細胞挙動解析プログラムが実行されることによって実現される。

タイムラプス画像取得部３１は、記憶部１２に記憶されている複数フレームのタイムラプス画像群を取得する。

特定培養環境指定部３２は、タイムラプス画像取得部３１で取得されたタイムラプス画像から、解析したい細胞の領域の指定を受け付けるとともに、解析したい細胞の指定領域での滞在時間の入力を受け付ける。

細胞自動トラッキング部３３は、タイムラプス画像取得部３１で取得されたタイムラプス画像から、個々の細胞を識別し、自動トラッキング（挙動解析）する。この細胞自動トラッキングの処理により、少なくとも、フレーム番号、細胞ＩＤ、親細胞ＩＤ（分裂前の細胞ＩＤ）、属性情報、細胞サイズ、細胞領域情報（重心の座標、細胞領域の輪郭情報）を含むトラッキング結果情報（細胞情報）が検出され、例えば、XML（Extensible Markup Language）の形式で記述される。

個々の細胞をトラッキングする手法は、様々なものが考えられる。本実施の形態では、例えば、下記の文献に記載されている手法を用いる。
＜非特許文献１＞
Kang Li, Mei Chen, and Takeo Kanade. “Cell Population Tracking and Lineage Construction with
Spatiotemporal Context”

特定培養環境下細胞自動選出部３４は、細胞自動トラッキング部３３で検出した細胞軌跡情報から、特定培養環境指定部３２で指定された領域に指定時間滞在した細胞を選出する。

細胞挙動算出部３５は、特定培養環境下細胞自動選出部３４で選出された細胞のトラッキング情報を用いて、各種細胞挙動指標を算出する。細胞挙動指標としては、例えば、細胞スピード、細胞サイズ、細胞分裂、細胞死数、細胞分裂間隔等である。

表示制御部３６は、細胞挙動算出部３５で算出された各種細胞挙動指標を表示部１６に表示させる。

図４は、細胞挙動解析装置１が実行する、細胞挙動解析処理を説明するフローチャートである。図４の説明に当たり、図５〜図１０を参照し、具体的な処理内容も説明する。この処理は、ユーザによって細胞挙動解析プログラムが起動されることによって開始される。

ユーザによって細胞挙動解析プログラムが起動されると、図５に示すような細胞解析結果画面Ｗの初期画面が表示部１６に表示される。

図５に示す細胞解析結果画面Ｗの初期画面には、複数の時系列画像を管理するとともに、細胞の自動解析処理を実行するためのデータ管理エリア４０、タイムラプス画像を再生させるための動画エリア４１、動画エリア４１に表示されたタイムラプス画像に含まれる細胞の時系列情報を表示するためのタイムラインエリア４２、動画エリア４１に表示されたタイムラプス画像の再生、早送り、早戻し等の操作を行う操作ボタン群４３が表示されている。

ユーザは、表示部１６に表示された細胞解析結果画面Ｗの初期画面において、所望のタイムラプス画像の自動解析処理の実行を指示する。

ステップＳ１において、細胞挙動解析装置１のタイムラプス画像取得部３１は、記憶部１２から、ユーザによって選択された複数フレームのタイムラプス画像群を取得する。これにより、細胞解析結果画面Ｗの動画エリア４１は、図６に示すような表示に切り替わる。

図６の例の場合、細胞解析結果画面Ｗの動画エリア４１には、ユーザによって選択されたタイムラプス画像が表示されている。またタイムラプス画像上には、細胞５１〜５８が可視表示されている。領域Ａ１、Ａ２は、培養ディッシュ上にプリントされた成長因子である。つまり、細胞５７、細胞５８は、成長因子Ａ１、Ａ２がそれぞれプリントされた培養ディッシュ上に存在する細胞であることが示されている。

ステップＳ２において、細胞挙動解析装置１の特定培養環境指定部３２は、解析したい細胞の領域の範囲指定、および、解析したい細胞の指定領域での滞在時間の入力を受け付ける。

図７は、解析したい細胞の領域の範囲指定、および、解析したい細胞の指定領域での滞在時間の入力例を説明するための図である。

例えば、ユーザは、図７に示す細胞解析結果画面Ｗの動画エリア４１に表示されているタイムラプス画像において、入力部１５を用いて、解析したい領域６１を範囲指定する。図７の例では、成長因子Ａ１、Ａ２がプリントされた培養ディッシュ上に存在する細胞５７、５８を含む長方形の領域６１が範囲指定されている。

なお、指定領域は、長方形に限らず、ユーザが、例えば、円、楕円、自由曲線等をＧＵＩ上で自由に選択できるようにしても良い。またマスク画像を用いて、指定された領域とそれ以外の領域を視認可能にしても良い（例えば、指定領域を白、それ以外を黒とする）。さらに、成長因子のプリント領域が予めわかっている場合には、成長因子のプリント領域をマスク画像として準備することで、ユーザによる領域指定を省略することができる。

続いて、ユーザは、図７に示す細胞解析結果画面Ｗの動画エリア４１に表示されているタイムラプス画像において、入力部１５を用いて、指定された細胞の領域６１での、解析したい滞在時間Ｔを入力エリア６２に入力する。

なお、滞在時間は、フレーム数で指定しても良い。また、時間で指定したとしてもフレームレート（例えば、３０フレーム／秒）でフレーム数に変換にしても良い。

このように、ユーザは、解析したい領域６１の指定、および、指定された領域６１での滞在時間Ｔを入力し、容易に特定の培養環境を指定することができる。なお、滞在時間Ｔは、領域６１内に連続して滞在している時間（連続滞在時間）でも良いし、累計滞在時間でも良い。つまり、細胞は、領域６１を一度出て再び領域６１内に滞在する場合もあるため、そのような挙動にも対応させるようにしても良い。例えば、細胞１が、領域Ａに２時間滞在した後、一旦、領域Ａに出て暫くしてから再び領域Ａに入り、２時間滞在したとする。この場合、ユーザが、「連続滞在時間３時間」で指定した場合、細胞１は選択されない。一方、ユーザが、「累積滞在時間３時間」で指定した場合、細胞１は選択される。

図４の説明に戻る。ステップＳ３において、細胞挙動解析装置１の細胞自動トラッキング部３３は、ステップＳ１の処理で取得した複数フレームのタイムラプス画像群から、個々の細胞を識別し、細胞自動トラッキング処理を行う。

ステップＳ４において、細胞挙動解析装置１の表示制御部３６は、ステップＳ３の細胞自動トラッキング処理による結果を細胞解析結果画面Ｗの動画エリア４１に表示させる。

図８は、トラッキング結果に基づく動画エリア４１の表示例を示す図である。

図８の例の場合、細胞解析結果画面Ｗの動画エリア４１には、細胞自動トラッキング処理により検出された細胞に「１」〜「８」の細胞ＩＤが付与され、可視表示されている。また、ユーザによって指定された領域６１内で、滞在時間Ｔに滞在した細胞の細胞軌跡が可視化されている。つまり、「２」の細胞ＩＤの細胞がＰ１からＰ２まで移動した軌跡が示され、「７」の細胞ＩＤの細胞がＰ３からＰ４まで移動した軌跡が示され、「８」の細胞ＩＤの細胞がＰ５からＰ６まで移動した軌跡が示されている。この図からもわかる通り、「２」の細胞ＩＤの細胞は、最初のフレームでは指定された領域６１に滞在していないが、途中のフレームから領域６１に移動しており、「７」、「８」の細胞ＩＤの細胞は、最初のフレームでは指定された領域Ｂに滞在しているが、途中のフレームから領域６１の外に移動している。

ステップＳ５において、細胞挙動解析装置１の特定培養環境下細胞自動選出部３４は、ステップＳ３の細胞自動トラッキング処理で検出された細胞軌跡情報から、ステップＳ２の処理で指定された領域６１で、滞在時間Ｔに滞在した細胞を選出する。図８の例では、「７」の細胞ＩＤ、「８」の細胞ＩＤの細胞が選出される。また、「１」〜「６」の細胞ＩＤの細胞は選出外細胞とされる。なお、「２」の細胞ＩＤの細胞は、領域６１に一時的に滞在したものの、その滞在時間が短いため、選出外細胞とされている。

ステップＳ６において、細胞挙動解析装置１の細胞挙動算出部３５は、ステップＳ５の処理により選出された細胞と選出外細胞のトラッキング情報を解析対象とし、各種細胞挙動指標（細胞スピード、細胞サイズ、分裂、細胞死、細胞分裂間隔等）を算出する。ステップＳ７において、細胞挙動解析装置１の表示制御部３６は、ステップＳ６の算出結果を、表示部１６に表示させる。

図９は、細胞挙動指標算出結果７１の表示例を示す図である。図９において、縦軸は、細胞移動スピードであり、横軸は、選出細胞の滞在時間である。

図９の例では、解析したい領域６１および指定時間Ｔに滞在していた選出細胞（「７」の細胞ＩＤの細胞）の挙動指標が示されている。

図１０は、細胞挙動指標算出結果８１の表示例を示す図である。図１０において、縦軸は、細胞移動スピードであり、横軸は、選出外細胞の滞在時間である。

図１０の例では、選出外細胞（「１」の細胞ＩＤの細胞）の挙動指標が示されている。

以上のように、特定培養環境（範囲および滞在時間）を指定することで、特定培養環境における細胞の挙動指標のみを算出し、算出結果を表示することが可能となる。

なお、図９および図１０に示したように、ひとつの細胞に係る挙動指標を算出結果として出力するだけでなく、例えば、選出細胞（または選出外細胞）の各フレームまたは全てのフレームにおける挙動指標の平均値を算出し、それをグラフに出力しても良い。

また、分裂、細胞死の挙動指標を算出する場合、選出細胞（または選出外細胞）のうち、分裂した細胞の個数や細胞死の状態となった細胞の個数を計数し、各フレームにおける個数をグラフに出力しても良いし、あるいは、累積個数をグラフに出力してもよい。

以上の処理では、範囲および滞在時間を指定した後で、細胞自動トラッキング処理するようにしたが、これに限らず、例えば、全ての細胞に対して自動トラッキング処理した後で範囲および滞在時間を指定することも勿論可能である。

また、以上においては、１つの培養環境を指定するようにしたが、複数の培養環境を指定することも可能である。複数の培養環境を指定する場合、それぞれの環境下毎の細胞毎に指標を算出すれば良い。

［本発明の第１の実施の形態における効果］
第１の実施の形態により、特定培養環境（範囲および滞在時間）を指定し、個々の細胞を自動トラッキング処理し、指定範囲内を指定時間滞在した細胞を選出し、選出細胞（選出外細胞）のトラッキング結果のみを用いて細胞挙動指標を算出することが可能となる。これにより、ユーザは、特定培養環境における細胞の解析結果のみを目視で確認することが可能となる。

［本発明の第２の実施の形態］
次に、本発明の第２の実施の形態について説明する。

第２の実施の形態において、基本的な細胞挙動解析装置１の構成（図１）、記憶部１２に記憶されるタイムラプス画像群（図２）、および細胞挙動解析装置１の機能構成（図３）は、第１の実施の形態と同様である。第２の実施の形態では、細胞密度の指定を行うことで、細胞密度が高い場所（あるいは低い場所）に一定時間滞在している細胞を解析対象とすることを特徴とするものである。

図１１は、細胞挙動解析装置１が実行する、第２の実施の形態における細胞挙動解析処理を説明するフローチャートである。図１１の説明に当たり、図１２〜図１５を参照し、具体的な処理内容も説明する。なお、図４のフローチャートで説明した処理と同様の処理は、その説明を適宜省略する。

この処理も、ユーザによって細胞挙動解析プログラムが起動されることによって開始され、表示部１６に細胞解析結果画面Ｗの初期画面（図５）が表示され、その画面において、所望のタイムラプス画像の自動解析処理の実行が指示される。

ステップＳ１１において、細胞挙動解析装置１のタイムラプス画像取得部３１は、記憶部１２から、ユーザによって選択された複数フレームのタイムラプス画像群を取得する。これにより、細胞解析結果画面Ｗの動画エリア４１は、図６に示すような表示に切り替わる。

ステップＳ１２において、細胞挙動解析装置１の細胞自動トラッキング部３３は、ステップＳ１１の処理で取得した複数フレームのタイムラプス画像群から、個々の細胞を識別し、細胞自動トラッキング処理を行う。

ステップＳ１３において、細胞挙動解析装置１の特定培養環境下細胞自動選出部３４は、ステップＳ１２の細胞自動トラッキング処理による結果から、フレーム毎に、タイムラプス画像のすべての座標の細胞密度を算出し、密度マップを生成する。任意の点（ｘ，ｙ）の細胞密度（ｘ，ｙ）は、次式（１）に従って算出される。なお、ユーザは、予め、図１２に示すように、点（ｘ，ｙ）を中心としたウィンドウ１０１のサイズを設定する。
細胞密度（ｘ，ｙ）＝細胞領域／ウィンドウ領域 ・・・（１）

例えば、フレーム数が「１０」、画像サイズが「２００×２００（横方向の画素数×縦方向の画素数）」の場合、４０，０００個の細胞密度の値が算出されることになる。

つまり、細胞挙動解析装置１の特定培養環境下細胞自動選出部３４は、フレーム毎に全ての座標から、時刻および座標を引数とする細胞密度関数Ｄ（ｆｒａｍｅ，ｘ，ｙ）の値を導出することができる。

図１３は、特定の細胞に係る細胞密度の時系列変化の一例を示す図である。

各細胞の位置は、重心位置（１点の座標）によって定義されるので、細胞挙動解析装置１の特定培養環境下細胞自動選出部３４は、細胞密度関数Ｄ（ｆｒａｍｅ，ｘ，ｙ）によって、各細胞の位置に対する各フレームの細胞密度を求めることができる。

図１３の例の場合、「０」のフレームでは、細胞の重心位置が（ｘ０，ｙ０）であり、細胞密度関数Ｄ（０，ｘ０，ｙ０）の値が、この細胞の細胞密度となる。また、「１」のフレームでは、細胞の重心位置が（ｘ１，ｙ１）であり、細胞密度関数Ｄ（１，ｘ１，ｙ１）の値が、この細胞の細胞密度となる。また、「ｔ」のフレームでは、細胞の重心位置が（ｘｔ，ｙｔ）であり、細胞密度関数Ｄ（ｔ，ｘｔ，ｙｔ）の値が、この細胞の細胞密度となる。このように、細胞ごとに、細胞密度の時系列変化が求められる。

ステップＳ１４において、細胞挙動解析装置１の特定培養環境指定部３２は、解析したい細胞密度の細胞密度閾値、および、解析したい指定時間（フレーム数閾値）の入力を受け付ける。

ステップＳ１５において、細胞挙動解析装置１の特定培養環境下細胞自動選出部３４は、ステップＳ１３で導出された細胞密度関数Ｄ（ｆｒａｍｅ，ｘ，ｙ）によって求められる細胞密度の時系列変化のうち、ステップＳ１４で入力された細胞密度閾値を超えたフレームを抽出する。

図１４は、「１」の細胞ＩＤの細胞に係る細胞密度の時系列変化のグラフ１１１を示す図である。図１４において、縦軸は、細胞密度であり、横軸は、時間（フレーム）である。

図１４の例では、時刻ｔ１から時刻ｔ２までのフレームが、細胞密度閾値を超えていることが分かる。

図１５は、「２」の細胞ＩＤの細胞に係る細胞密度の時系列変化のグラフ１２１を示す図である。図１５において、縦軸は、細胞密度であり、横軸は、時間（フレーム）である。

図１５の例では、時刻ｔ１１から時刻ｔ１２までのフレームが、細胞密度閾値を超えていることが分かる。

図１１の説明に戻る。ステップＳ１６において、細胞挙動解析装置１の特定培養環境下細胞自動選出部３４は、ステップＳ１５で抽出された細胞密度閾値を超えたフレーム数が、ステップＳ１４で入力されたフレーム数閾値を超えた細胞を選出する。つまり、全ての細胞に対して、細胞密度閾値を超えたフレーム数がフレーム数閾値を超えたか否かの判定が行われる。

図１４の例では、細胞密度閾値を超えたフレーム数がフレーム数閾値を超えているため、図１４の例における「１」の細胞ＩＤの細胞は選出される。一方、図１５の例では、細胞密度閾値を超えたフレーム数がフレーム数閾値を下回っているため、図１５の例における「２」の細胞ＩＤの細胞は選出されない。

ステップＳ１７おいて、細胞挙動解析装置１の細胞挙動算出部３５は、ステップＳ１６の処理により選出された細胞と、選出外細胞のトラッキング情報を解析対象とし、各種細胞挙動指標を算出する。ステップＳ１８において、細胞挙動解析装置１の表示制御部３６は、ステップＳ１７の算出結果を、表示部１６に表示させる。

［本発明の第２の実施の形態における効果］
第２の実施の形態により、個々の細胞を自動トラッキングし、トラッキング結果から各フレーム、各領域における細胞密度を算出し、ユーザによって指定された細胞密度範囲の領域に指定時間滞在した細胞を選出し、選出された細胞のトラッキング結果のみを用いて細胞挙動指標を算出することが可能となる。これにより、ユーザは、特定培養環境における細胞の解析結果のみを目視で確認することが可能となる。

［本発明の第３の実施の形態］
次に、本発明の第３の実施の形態について説明する。

第３の実施の形態において、基本的な細胞挙動解析装置１の構成（図１）、記憶部１２に記憶されるタイムラプス画像群（図２）、および細胞挙動解析装置１の機能構成（図３）は、第１の実施の形態と同様である。第３の実施の形態では、細胞形状情報による指定を行うことで、細胞形状が一定時間、所定の形状を維持している細胞を解析対象とすることを特徴とするものである。

図１６は、細胞挙動解析装置１が実行する、第３の実施の形態における細胞挙動解析処理を説明するフローチャートである。図１６の説明に当たり、図１７〜図２０を参照し、具体的な処理内容も説明する。なお、図１１のフローチャートで説明した処理と同様の処理は、その説明を適宜省略する。この処理も、ユーザによって細胞挙動解析プログラムが起動されることによって開始され、表示部１６に表示された細胞解析結果画面Ｗの初期画面（図５）において、所望のタイムラプス画像の自動解析処理の実行が指示される。

ステップＳ２１において、細胞挙動解析装置１のタイムラプス画像取得部３１は、記憶部１２から、ユーザによって選択された複数フレームのタイムラプス画像群を取得する。ステップＳ２２において、細胞挙動解析装置１の細胞自動トラッキング部３３は、ステップＳ２１の処理で取得した複数フレームのタイムラプス画像群から、個々の細胞を識別し、細胞自動トラッキング処理を行う。

ステップＳ２３において、細胞挙動解析装置１の特定培養環境下細胞自動選出部３４は、ステップＳ２２の細胞自動トラッキング処理による結果から、フレーム毎、および細胞毎に細胞領域を得る。つまり、トラッキング処理によって細胞の重心位置を算出する際、細胞の輪郭もフレーム毎に抽出される。

図１７は、トラッキング結果により得られた任意の細胞に係るフレーム毎の細胞領域の一例を示している。図１７の例では、「１」の細胞ＩＤの細胞に係るフレーム毎の細胞領域Ｐ０〜Ｐｔ＋２・・・が示されている。

細胞挙動解析装置１の特定培養環境下細胞自動選出部３４は、得られた細胞領域から、細胞サイズや真円度等の形状に関する細胞形状情報を、フレーム毎に算出する。

図１８は、細胞形状の時系列変化の一例を示す図である。

図１８の例の場合、「０」のフレームでは、「ＩＤ１」の細胞の重心位置が（ｘ０，ｙ０）であり、真円度がＲ（０，ＩＤ１）、細胞サイズがＳ（０，ＩＤ１となる。「１」のフレームでは、「ＩＤ１」の細胞の重心位置が（ｘ１，ｙ１）であり、真円度がＲ（１，ＩＤ１）、細胞サイズがＳ（１，ＩＤ１）となる。「ｔ」のフレームでは、「ＩＤ１」の細胞の重心位置が（ｘｔ，ｙｔ）であり、真円度がＲ（ｔ，ＩＤ１）、細胞サイズがＳ（ｔ，ＩＤ１）となる。

このように、細胞挙動解析装置１の特定培養環境指定部３２は、細胞毎に、真円度や細胞サイズなどの細胞形状に関する時系列変化を求めることができる。

ステップＳ２４において、細胞挙動解析装置１の特定培養環境指定部３２は、解析したい細胞形状の細胞サイズ閾値（あるいは真円度閾値）、および解析したい指定時間（フレーム数閾値）の入力を受け付ける。

ステップＳ２５において、細胞挙動解析装置１の特定培養環境下細胞自動選出部３４は、ステップＳ２３で算出された細胞形状情報から、各細胞の各フレームの細胞サイズ（あるいは真円度閾値）の時系列変化のうち、ステップＳ２４で入力された細胞サイズ閾値を超えたフレームを抽出する。

図１９は、「１」の細胞ＩＤの細胞に係る細胞サイズの時系列変化のグラフ１３１を示す図である。図１９において、縦軸は、細胞サイズであり、横軸は、時間（フレーム）である。

図１９の例では、時刻ｔ２１から時刻ｔ２２までのフレームが、細胞サイズ閾値を超えていることが分かる。

図２０は、「２」の細胞ＩＤの細胞に係る細胞サイズの時系列変化のグラフ１４１を示す図である。図２０において、縦軸は、細胞サイズであり、横軸は、時間（フレーム）である。

図２０の例では、時刻ｔ３１から時刻ｔ３２までのフレームが、細胞サイズ閾値を超えていることが分かる。

図１６の説明に戻る。ステップＳ２６において、細胞挙動解析装置１の特定培養環境下細胞自動選出部３４は、ステップＳ２５で抽出された細胞サイズ閾値（あるいは真円度閾値）を超えたフレーム数が、ステップＳ２４で入力されたフレーム数閾値を超えた細胞を選出する。つまり、全ての細胞に対して、細胞サイズ閾値（あるいは真円度閾値）を超えたフレーム数がフレーム数閾値を超えたか否か（活性度が高い細胞か否か）の判定が行われる。

図１９の例では、細胞サイズ閾値を超えたフレーム数がフレーム数閾値を超えているため、図１９の例における「１」の細胞ＩＤの細胞は選出される。一方、図２０の例では、細胞サイズ閾値を超えたフレーム数がフレーム数閾値を下回っているため、図２０の例における「２」の細胞ＩＤの細胞は選出されない。

ステップＳ２７において、細胞挙動解析装置１の細胞挙動算出部３５は、ステップＳ２６の処理により選出された細胞と、選出外細胞のトラッキング情報を解析対象とし、各種細胞挙動指標を算出する。ステップＳ２８において、細胞挙動解析装置１の表示制御部３６は、ステップＳ２７の算出結果を、表示部１６に表示させる。

［本発明の第３の実施の形態における効果］
第３の実施の形態により、個々の細胞を自動トラッキングし、トラッキング結果から各フレーム、各領域における細胞形状情報を算出し、ユーザによって指定された細胞形状範囲に指定時間滞在した細胞を選出し、選出された細胞のトラッキング結果のみを用いて細胞挙動指標を算出することが可能となる。これにより、ユーザは、活性度が高い細胞の解析結果のみを目視で確認することが可能となる。

なお、以上においては、細胞サイズが細胞サイズ閾値を超え、かつ、細胞サイズ閾値を超えたフレーム数が、フレーム数閾値を超えた細胞を選出するか、あるいは、真円度が真円度閾値を超え、かつ、真円度閾値を超えたフレーム数が、フレーム数閾値を超えた細胞を選出するようにしたが、複数の指標（細胞サイズ、真円度等）を組み合わせて細胞を選出することも可能である。

以上、添付図面を参照しながら、本発明に係る細胞挙動解析装置等の好適な実施形態について説明したが、本発明はかかる例に限定されない。当業者であれば、本願で開示した技術的思想の範疇内において、各種の変更例又は修正例に想到し得ることは明らかであり、それらについても当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。

１………細胞挙動解析装置
１１………制御部
１２………記憶部
１５………入力部
１６………表示部
３１………タイムラプス画像取得部
３２………特定培養環境指定部
３３………細胞自動トラッキング部
３４………特定培養環境下細胞自動選出部
３５………細胞挙動算出部
３６………表示制御部

Claims (9)

1. 複数フレームのタイムラプス画像を取得する画像取得手段と、
   特定培養環境を指定する指定手段と、
   前記複数フレームのタイムラプス画像から、細胞の挙動をトラッキングする細胞トラッキング手段と、
   前記細胞トラッキング手段によるトラッキング結果から、前記指定手段により指定された前記特定培養環境に含まれる前記細胞を選出する選出手段と、
   前記選出手段により選出された前記細胞の挙動指標を算出する算出手段と、
   を備えることを特徴とする細胞挙動解析装置。
2. 前記指定手段は、前記タイムラプス画像中における所定領域、および、前記複数フレーム中における滞在時間を前記特定培養環境として指定する
   ことを特徴とする請求項１に記載の細胞挙動解析装置。
3. 前記指定手段は、前記タイムラプス画像中の所定領域における細胞密度、および、時間を前記特定培養環境として指定する
   ことを特徴とする請求項１に記載の細胞挙動解析装置。
4. コンピュータが、
   複数フレームのタイムラプス画像を取得する画像取得ステップと、
   特定培養環境を指定する指定ステップと、
   前記複数フレームのタイムラプス画像から、細胞の挙動をトラッキングする細胞トラッキングステップと、
   前記細胞トラッキングステップの処理によるトラッキング結果から、前記指定ステップで指定された前記特定培養環境に含まれる前記細胞を選出する選出ステップと、
   前記選出ステップで選出された前記細胞の挙動指標を算出する算出ステップと、
   を実行することを特徴とする細胞挙動解析方法。
5. コンピュータを、
   複数フレームのタイムラプス画像を取得する画像取得手段と、
   特定培養環境を指定する指定手段と、
   前記複数フレームのタイムラプス画像から、細胞の挙動をトラッキングする細胞トラッキング手段と、
   前記細胞トラッキング手段によるトラッキング結果から、前記指定手段により指定された前記特定培養環境に含まれる前記細胞を選出する選出手段と、
   前記選出手段により選出された前記細胞の挙動指標を算出する算出手段と、
   を備える細胞挙動解析装置として機能させるためのプログラム。
6. 複数フレームのタイムラプス画像を取得する画像取得手段と、
   特定細胞指標を指定する指定手段と、
   前記複数フレームのタイムラプス画像から、細胞の挙動をトラッキングする細胞トラッキング手段と、
   前記細胞トラッキング手段によるトラッキング結果から、前記指定手段により指定された前記特定細胞指標に含まれる前記細胞を選出する選出手段と、
   前記選出手段により選出された前記細胞の挙動指標を算出する算出手段と、
   を備えることを特徴とする細胞挙動解析装置。
7. 前記指定手段は、前記タイムラプス画像中の所定領域における細胞形状、および、時間を前記特定細胞指標として指定する
   ことを特徴とする請求項６に記載の細胞挙動解析装置。
8. コンピュータが、
   複数フレームのタイムラプス画像を取得する画像取得ステップと、
   特定細胞指標を指定する指定ステップと、
   前記複数フレームのタイムラプス画像から、細胞の挙動をトラッキングする細胞トラッキングステップと、
   前記細胞トラッキングステップの処理によるトラッキング結果から、前記指定ステップで指定された前記特定細胞指標に含まれる前記細胞を選出する選出ステップと、
   前記選出ステップで選出された前記細胞の挙動指標を算出する算出ステップと、
   を実行することを特徴とする細胞挙動解析方法。
9. コンピュータを、
   複数フレームのタイムラプス画像を取得する画像取得手段と、
   特定細胞指標を指定する指定手段と、
   前記複数フレームのタイムラプス画像から、細胞の挙動をトラッキングする細胞トラッキング手段と、
   前記細胞トラッキング手段によるトラッキング結果から、前記指定手段により指定された前記特定細胞指標に含まれる前記細胞を選出する選出手段と、
   前記選出手段により選出された前記細胞の挙動指標を算出する算出手段と、
   を備える細胞挙動解析装置として機能させるためのプログラム。

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