JP2013193987A

JP2013193987A - Ｐｐａｒ活性組成物

Info

Publication number: JP2013193987A
Application number: JP2012062435A
Authority: JP
Inventors: Nobuhiko Yamashita; 信彦山下; Kazuyuki Sawadaishi; 一之澤田石; Chiwa Kataoka; 千和片岡
Original assignee: Osaka Gas Co Ltd
Current assignee: Osaka Gas Co Ltd
Priority date: 2012-03-19
Filing date: 2012-03-19
Publication date: 2013-09-30

Abstract

【課題】簡易な手法で効率よく得ることができるペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）を提供すること。
【解決手段】サトウキビ、ソルガムから選ばれるいずれかのイネ科植物の梢頭部抽出物を主成分とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、本発明は、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲ）活性組成物に関する。

ＰＰＡＲは、ステロイド受容体、レチノイド受容体やサイロイド受容体等と同様、核内受容体スーパーファミリーに属するリガンド依存性の転写因子であり、これまでに組織分布を異にする三種のアイソフォーム（α型、δ（またはβ）型、γ型）がヒトをはじめ種々の動物種で同定されている（非特許文献１を参照）。この内ＰＰＡＲαは、脂肪酸の異化能の高い肝臓や腎臓、骨格筋等に発現しており、特に肝臓において高発現が認められ（非特許文献２を参照）、脂肪酸の代謝や細胞内輸送に関連する遺伝子（たとえば、アシルＣｏＡ合成酵素、脂肪酸結合タンパク質やリポ蛋白リパーゼなど）およびコレステロールや中性脂質の代謝に関連するアポリポ蛋白（ＡＩ、ＡＩＩ、ＣＩＩＩ）遺伝子の発現を正または負に制御している。ＰＰＡＲδは、神経細胞を中心として生体内各組織に普遍的に発現している。現時点ではＰＰＡＲδの生理的意義については不明である。ＰＰＡＲγは、脂肪細胞に高発現していて脂肪細胞の分化に関与している（非特許文献３を参照）。このようにＰＰＡＲの各アイソフォームは特定の臓器や組織において特異的な機能を果たしている。

このようなＰＰＡＲ活性組成物が、イネ科植物に含有されていることは知られており、具体的にモロコシ属植物に含まれているＰＰＡＲ活性組成物の抽出物は特許文献１に記載されているが、その他のイネ科植物について具体的に調査された例はなかった。

２００４−１６１６５６号公報

ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，１９９２年，８９巻，４６５３〜４６５７頁Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９９６年，１３７巻，３５４〜３６６頁ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｉｐｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９６年，３７巻，９０７〜９２５頁

一般に、同じ科に属する植物であっても、属が異なる植物が、同種の活性物質を生産するとしても、その活性物質が、他の属の植物から得られた活性物質と同等の活性を有するとは限らず、また、何らかの要因で活性が阻害されている場合もありえる。そのため、このような活性物質を探索する場合には、植物ごとに特有の抽出手法、分離手法を開発しなければならないことも多く、容易に活性物質を開発することができるわけではない。

したがって、本発明は上記実状に鑑み、簡易な手法で効率よく得ることができるペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）活性組成物を提供することを目的とする。

また他方、サトウキビは、茎部分に相当量の糖分を含んでおり、茎部分は有効活用されているものの、茎以外の部分は茎に比べて糖分含有率が低いという理由から廃棄され、その廃棄に要するコストも嵩むため、有効利用の途が求められていた。

そこで、本発明の別の側面からの目的は、本来廃棄されるサトウキビ等のバイオマス廃棄物を有効利用して有価物を得る点にもある。

上記目的のため本発明者等は、鋭意研究の結果、サトウキビおよびソルガムに充分高いＰＰＡＲ活性物質が含まれていることを明らかにした。特に、サトウキビでは、製糖過程で捨てられている梢頭部から抽出した抽出液にＰＰＡＲ活性を見出した。

〔構成１〕
そこで、上記課題を解決するための本発明の特徴構成は、サトウキビ、ソルガムから選ばれるいずれかのイネ科植物の梢頭部抽出物を主成分とする点にある。

〔作用効果１〕
イネ科植物として、サトウキビ、ソルガムを対象としてＰＰＡＲ活性物質を抽出する場合、その梢頭部を抽出することによってＰＰＡＲ活性物質が有効に抽出できる。この梢頭部は、たとえばサトウキビにおいては精糖工程で最初に廃棄される部分であり、資源としては容易に確保することができるものである。また、単純に廃棄される廃棄物から、ＰＰＡＲ活性組成物を抽出することができれば、廃棄物の有効利用を図ることができるとともに、廃棄にかかるエネルギーコストの節約につながる。

なお、梢頭部とは、植物の成長する尖端部で、サトウキビであれば、先端から二節程度の糖度の低い部分をさす。サトウキビの梢頭部は、通常廃棄処分されている。

この構成において抽出されるＰＰＡＲ活性物質は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ、ＰＰＡＲγいずれも含むことがわかっている。ＰＰＡＲβの生理活性が現状でわかっていないとしても、これら物質は医薬品、機能性食品成分として有効に機能すると考えられるもので、利用性が高い。

なお、本発明でいうＰＰＡＲ活性物質とは、ＰＰＡＲのリガンド結合領域に結合する能力（活性）を有する化合物を含む物質であり、ＰＰＡＲ活性組成物とは、このような物質を成分として含有し、上記活性を備えた組成物をさす。ＰＰＡＲリガンド活性は、たとえば、ＰＰＡＲリガンド結合領域とＧＡＬ４との融合タンパクに対する結合をルシフェラーゼの発現で評価するレポーター・アッセイ（Ｃｅｌｌ，１９９５年，８３巻，８０３〜８１２頁）や、ＰＰＡＲリガンド結合領域を含むタンパクを用いたコンペティション・バインディング・アッセイ（Ｃｅｌｌ，１９９５年，８３巻，８１３〜８１９頁）などにより測定することができる。これらのアッセイにおいて、サンプルの活性は一般に溶媒対照と比較し、溶媒対照よりも高い活性を示し、なおかつ用量依存性が認められるサンプルを「ＰＰＡＲ活性あり」と評価する。

また、抽出方法は、特に限定されないが、溶媒抽出、水蒸気蒸留、超臨界抽出技術を用いた二酸化炭素による抽出など種々抽出操作を用いることができる。さらに、当該抽出物は、精製して用いることもできるが、飲食品や医薬品として不適当な不純物を含有しない限り、抽出液のまま、または粗抽出物あるいは半精製抽出物のような形態で使用できる。

〔構成２〕
また、上記構成において前記イネ科植物の梢頭部をアセトンを含む抽出溶媒により抽出してもよい。

〔作用効果２〕
上記ＰＰＡＲ活性物質は、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ、ＰＰＡＲγいずれも含むが、現状で最も用途が確立している物質がＰＰＡＲα活性物質である。そこで、後述の実施形態より、サトウキビ、ソルガムから選ばれるいずれかのイネ科植物の梢頭部をアセトンを含む抽出溶媒により抽出した場合に、特にＰＰＡＲα活性物質が効率よく抽出される。

〔構成３〕
また、上記抽出物としてＰＰＡＲα活性を有する画分を得ることができる。

〔作用効果３〕
ＰＰＡＲα活性を有する画分を得ることにより、ＰＰＡＲα活性物質を単離同定し、より活性を高めて利用することができる可能性があり、物質単位にまで単離するまでもなく、ＰＰＡＲ活性組成物として、より活性の高い状態で使用することが可能となる。

〔構成４〕
また、前記抽出物のＰＰＡＲα活性を有する画分が、クロマトグラフ法により分離され、ＰＰＡＲα活性阻害物質を除去された画分であることが好ましい。

〔作用効果４〕
前記イネ科植物の梢頭部をアセトンを含む抽出溶媒により抽出した場合、前記ＰＰＡＲα活性物質とともにＰＰＡＲα活性阻害成分を含んでいることも明らかになった。そこで、前記抽出物のＰＰＡＲα活性を有する画分を、クロマトグラフ法により分離することにより、ＰＰＡＲα活性組成物を活性阻害のない高活性な状態で利用することができるようになる。

〔構成５〕
具体的には、前記抽出物がＰＰＡＲα活性を有する画分が、クロロホルム、メタノール混合溶媒を溶出液としたクロマトグラフ法により分離された、高メタノール溶媒抽出画分とすることができる。

〔作用効果５〕
ＰＰＡＲα活性阻害成分は、クロロホルム、メタノール混合溶媒を溶出液としたクロマトグラフ法により比較的初期の画分に含まれていることがわかり、高メタノール溶媒抽出画分を使用することにより、ＰＰＡＲα活性物質をより精製した状態で使用することができ、活性の高いＰＰＡＲα活性組成物を提供することができる。

したがって、サトウキビ廃材から少量で有効となるＰＰＡＲ活性成分を得ることができ、メタボリックシンドローム改善の健康食品や飲料および医薬品としての活用が可能となる。

サトウキビの梢頭部から抽出した検体のＰＰＡＲα活性を示すグラフサトウキビの梢頭部から抽出した検体のＰＰＡＲβ活性を示すグラフサトウキビの梢頭部から抽出した検体のＰＰＡＲγ活性を示すグラフ種々原料から７０％アセトン抽出したエーテル可溶物の検体のＰＰＡＲα活性を示すグラフ種々原料から７０％アセトン抽出したエーテル可溶物の検体のＰＰＡＲβ活性を示すグラフ種々原料から７０％アセトン抽出したエーテル可溶物の検体のＰＰＡＲγ活性を示すグラフサトウキビの梢頭部から抽出・カラム分離後した検体のＰＰＡＲα活性を示すグラフ

以下に、本発明のＰＰＡＲ活性組成物を説明する。なお、以下に好適な実施例を記すが、これら実施例はそれぞれ、本発明をより具体的に例示するために記載されたものであって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々変更が可能であり、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。

〔ＰＰＡＲ活性組成物の抽出〕
サトウキビの梢頭部をアセトンを含む抽出溶媒、熱水により抽出し、得られた抽出成分をクロロホルム、メタノール混合溶媒を溶出液としたクロマトグラフ法により分離することにより、高メタノール溶媒抽出画分として、ＰＰＡＲ活性組成物を抽出することができることがわかった。

＜抽出溶媒の検討＞
まず、ＰＰＡＲ活性組成物を抽出するのに適した抽出溶媒を検討した。

〔検体の調整〕
（熱水抽出）
サトウキビ梢頭部を風乾後、細断し、さらにミキサーで粉砕した。粉砕した試料２０ｇを蒸留水１００ｍｌに懸濁し、撹拌下、９０℃で４０分間加熱後、ろ過した。残渣を蒸留水１００ｍｌに再懸濁した後、ろ過し、先のろ液と合わせ、抽出液とした。抽出液を減圧下で濃縮した後、１００ｍｌに定容した。抽出液１０ｍｌ（試料１ｇ相当分）を減圧下で濃縮し、抽出物を得た。抽出物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２．０ｍｌに溶解し検体Ａを得た。

（７０％アセトン抽出のエーテル可溶物）
試料を風乾後、細断し、さらにミキサーで粉砕した。粉砕した試料１０ｇを７０％アセトン１５０ｍｌに懸濁し、室温で１６時間撹拌した後、ろ過した。残渣を７０％アセトン１００ｍｌに再懸濁した後、ろ過し、先のろ液と合わせ、抽出液とした。抽出液を減圧下で濃縮し、粗抽出物を得た。粗抽出物に蒸留水１００ｍｌを加え、ジエチルエーテル５０ｍｌで２回抽出し、抽出液を減圧下で濃縮した後、ジエチルエーテル１０ｍｌに定容した。抽出液１ｍｌ（試料１ｇ相当分）を減圧下で濃縮し、抽出物を得た。抽出物をＤＭＳＯ１．０ｍｌに溶解し検体Ｂを得た。

（７０％アセトン抽出のエーテル可溶物）
上記粗抽出物に蒸留水１００ｍｌを加え、ジエチルエーテル５０ｍｌで２回抽出した際の水層を減圧下で濃縮した後、蒸留水１０ｍｌに定容した。水溶液１ｍｌ（試料１ｇ相当分）を減圧下で濃縮し、抽出物を得た。抽出物をＤＭＳＯ１．０ｍｌに溶解し検体Ｃを得た。

〔活性の測定〕
ヒト由来ＰＰＡＲα／β／γに対する応答性（アゴニスト作用）は、サル腎臓由来ＣＯＳ−７細胞を用いたレポーター遺伝子アッセイ法により測定した。
９６穴マイクロプレートにＣＯＳ−７細胞（１０，０００個）を播種し３７℃で一晩培養した後、ＰＰＡＲαあるいはβあるいはγの各発現プラスミド、ＰＰＲＥレポータープラスミドおよびコントロールプラスミドをロッシュ社製ＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬により細胞内に導入した。３時間培養後、陽性対照物質（１０^-5Ｍ）および検体Ａ，Ｂ，Ｃの希釈試料（終濃度；１０，０００倍、３，０００倍、１，０００倍、３００倍）を添加後、２４時間培養した。細胞内ルシフェラーゼ誘導活性についてプロメガ社製ルシフェラーゼアッセイシステムによりＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製ルミノメーター（Ｗａｌｌａｃ１４２０ＡＲＶＯＳＸ）を用いて測定した。また、細胞毒性等を補正するためのコントロールプラスミド由来β−ガラクトシダーゼ活性について、蛍光法により測定した。ルシフェラーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性で除した値をＰＰＡＲアゴニスト活性とし、試験検体のアゴニスト活性は、陽性対照物質（１０^-5Ｍ）の活性を１００とした場合の相対活性（％）で表した。なお、陽性対照物質として、ＰＰＡＲαアッセイの場合はＣｉｐｒｏｆｉｂｒａｔｅ（化１）、ＰＰＡＲβアッセイの場合はＬ−６５１，０４１（化２）、ＰＰＡＲγアッセイの場合はＰｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ（化３）をそれぞれ使用した。

その結果、図１〜３のようになり、アセトン、熱水、いずれの抽出成分についてもＰＰＡＲ活性物質が抽出されていることが読み取れた。また、ＰＰＡＲ活性成分としてＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ、ＰＰＡＲγがいずれも抽出された。特に、ＰＰＡＲα活性成分が検体Ｂに多く含まれていることがわかった。また、検体ＢにおけるＰＰＡＲα活性は、１０００倍希釈よりも３００倍希釈のほうが活性が下がっており、何らかの活性阻害物質が含まれていることも明らかになった。すなわち、ＰＰＡＲα活性成分は、アセトンを含む抽出溶媒により効率よく抽出されるが、阻害物質も併せて抽出されるため、さらなる精製工程が必要となることが示唆された。

＜試料の種類＞
次に、サトウキビ梢頭部のどの部分にＰＰＡＲ活性成分が含まれているのかを調べた。また、サトウキビ以外イネ科植物としてソルガムからＰＰＡＲ活性組成物を抽出することができるか調べた。

〔検体の調製〕
下記表１に示す試料Ｓ１、Ｓ２，Ｔ１，Ｔ２を試料としてＰＰＡＲ活性組成物の抽出を行った。抽出方法は、７０％アセトン抽出のエーテル可溶物の項に準じて行った。その結果、各試料から、試料Ｓ１：１６ｍｇ、試料Ｓ２：８ｍｇ、試料Ｔ１：２１ｍｇ、試料Ｔ２：１３ｍｇの抽出物が得られた。抽出物をＤＭＳＯ１．０ｍｌに溶解し検体Ｓ１、Ｓ２，Ｔ１，Ｔ２として先と同様に活性を測定した。

その結果図４〜６のようになり、サトウキビの梢頭部においては、葉部にも幹部にもＰＰＡＲ活性成分が含まれており、通常は廃棄処分されている梢頭部からの抽出によりＰＰＡＲ活性組成物を得ることができることがわかった。また、サトウキビ以外では、ソルガムにもＰＰＡＲ活性成分が含まれており、抽出によりＰＰＡＲ活性組成物を得ることができることがわかった。

＜阻害物質について＞
上記試験例において、ＰＰＡＲα活性成分には、阻害物質が混入することが明らかになったことから、ＰＰＡＲα活性成分と、阻害物質との分離を試みた。

〔検体の調製〕
先の試料Ｓ１について、粗抽出物に、蒸留水１００ｍｌを加え、ジエチルエーテル５０ｍｌで２回抽出し、抽出液を減圧下で濃縮した後、ジエチルエーテル１０ｍｌに定容した。抽出液１ｍｌ（試料１ｇ相当分）を減圧下で濃縮し、抽出物をクロロホルム１．０ｍｌに溶解した。これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：φ１２ｍｍ×３ｃｍ、シリカゲル：２．０ｇ、充填溶媒：クロロホルム）にて分画し、画分は濃縮乾固後、ＤＭＳＯ０．４ｍｌに溶解し、測定試料とした。

クロマトグラフィーは、試料１．０ｍｌをカラムに添加し、さらにクロロホルム１．０ｍｌを添加した後、下記表２に示す溶媒で順次行った。

得られた画分Ｆ１〜Ｆ６を、それぞれ検体Ｆ１〜Ｆ６として、前と同様に活性の測定を行ったところ、図７のようになった。

図７より、前記検体Ｆ３、Ｆ４の活性は希釈により活性が高くなる現象が見られたことから、画分Ｆ３、Ｆ４に阻害物質が含まれていることが示唆された。そこで、Ｆ５，Ｆ６の２０％メタノール含有クロロホルムのように、高メタノール画分を得ることにより、より阻害物質を含まず、活性の高いＰＰＡＲ活性組成物を得ることができることがわかった。また、検体Ｆ５のＰＰＡＲ活性は精製前に比べて充分高いものと読み取れる。

したがって、サトウキビ廃材から少量で有効となるＰＰＡＲ活性成分を得ることができ、たとえば、メタボリックシンドローム改善の健康食品や飲料および医薬品としての活用が可能となる。

Claims

サトウキビ、ソルガムから選ばれるいずれかのイネ科植物の梢頭部抽出物を主成分とするＰＰＡＲ活性組成物。
前記イネ科植物の梢頭部をアセトンを含む抽出溶媒により抽出するＰＰＡＲ活性組成物の抽出方法。
アセトンを含む抽出溶媒により抽出された抽出物がＰＰＡＲα活性を有する画分である請求項２に記載のＰＰＡＲ活性組成物の抽出方法。
前記抽出物のＰＰＡＲα活性を有する画分が、クロマトグラフ法により分離され、ＰＰＡＲα活性阻害物質を除去された画分である請求項３に記載のＰＰＡＲ活性組成物の抽出方法。
前記抽出物がＰＰＡＲα活性を有する画分が、クロロホルム、メタノール混合溶媒を溶出液としたクロマトグラフ法により分離された、高メタノール溶媒抽出画分である請求項３に記載のＰＰＡＲ活性組成物の抽出方法。