JP2013129676A - 癌の画像化および処置 - Google Patents

Abstract

【課題】癌の画像化および処置の提供。
【解決手段】ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４に対するリガンドと検出可能な標識とを含む化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであり、当該リガンドは、^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の存在下でＩＣ_５０として測定した場合、ＣＸＣＲ４受容体に対して２５０ｎＭ以下の結合親和性を有し、当該リガンドは、その環状部分内にモチーフＢ−ＡｒｇまたはモチーフＢ−（Ｍｅ）Ａｒｇを有する環状オリゴペプチド部分を含み、かつＢは、塩基性アミノ酸、その誘導体、またはフェニルアラニンであり、ただし、Ｂが塩基性アミノ酸のＮα−メチル誘導体である場合には、当該モチーフはＢ−Ａｒｇである。当該化合物は、診断用画像化および／または治療の目的に有用である。
【選択図】図３

Description

本発明は、癌の画像化および治療に関する。特に、限定的ではないが、本発明は、ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ４を発現する細胞の画像化および治療の目的で、そのような細胞を放射性核種の標的にするのに適した組成物に関する。

腫瘍の転移の可能性および転移性の広がりを早期に評価するための方法は、治療法を予測および制御するために役立つ道具となるであろう。最近、ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ４が、転移における１つの重要な役割を担っているとされた（非特許文献１）。乳癌および前立腺癌等の多様な腫瘍において、ＣＸＣＲ４が、腫瘍細胞のホーミングの間に優勢な役割を担うことが見出されており、原発性腫瘍および転移の両方において発現することが示された。

ストロマ細胞由来因子１α（ＳＤＦ−１α）は、ＣＸＣＲ４に対する内因性のリガンドである（非特許文献２）。ＣＰＣＲ４（ＦＣ１３１としても知られ、ｃｙｃｌｏ［Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｇｌｙ］の配列を有する）（非特許文献３を参照）をはじめとする、ＣＸＣＲ４に対するペプチドに基づくアンタゴニストが記載されている。ＣＸＣＲ４は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に対する共受容体であり、これらのウイルスの細胞への侵入を可能にする。ＥＰ１５４１５８５は、組織学的研究のための放射性標識したＳＤＦ−１αを記載している。また、この文書は、いくつかの比較的かさ高い合成ペプチドのＣＸＣＲ４のアンタゴニストも開示している。特許文献１は、ビオチンで標識されているＣＸＣＲ４アンタゴニストを開示している。そのような化合物を検出するには、第２のストレプトアビジンを有するレポーター化合物の添加が必要である。特許文献１に例示されているアンタゴニストは、４位のＣｙｓ残基と１３位のＣｙｓ残基との間のジスルフィド結合によって環化されている１４個のアミノ酸のペプチドである。Ａｒｇ−Ａｒｇモチーフが１位および２位、すなわち、環状部分の外に存在する。

国際公開第０４／０８７６０８号パンフレット

Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（２００１年）４１０巻５０頁 Ｎａｇａｓａｗａ Ｔ．ら、ＰＮＡＳ．（１９９４年）９１巻２３０５頁 Ｆｕｊｉｉ Ｎ．ら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ、（２００３年）４２巻３２５１頁

現在まで、ＣＸＣＲ４に対するアンタゴニスト（ペプチドおよび非ペプチドの両方）を用いた研究は、本質的に、転移過程またはＨＩＶ感染の阻害剤としての潜在的使用に限られている。

したがって、本発明の第１の態様は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４に対するリガンドと検出可能な標識とを含む化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを提供し、当該リガンドは、^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の存在下でＩＣ５０として測定した場合、ＣＸＣＲ４受容体に対して２５０ｎＭ以下の結合親和性を有し、当該リガンドは、その環状部分内にモチーフＢ−ＡｒｇまたはモチーフＢ−（Ｍｅ）Ａｒｇを有する環状オリゴペプチド部分を含み、かつＢは、塩基性アミノ酸、その誘導体、またはフェニルアラニンであり、ただし、Ｂが塩基性アミノ酸のＮ^α−メチル誘導体である場合には、当該モチーフはＢ−Ａｒｇである。

特定の実施形態では、ＣＸＣＲ４に対するリガンドは、好ましくは合成である。リガンドが、ＣＸＣＲ４に、２００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下、最も好ましくは５０ｎＭ以下の親和性（ＩＣ５０）で結合することが現在のところ好ましい。「ＩＣ５０」という用語は、放射性標識参照ペプチドである^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４のＣＸＣＲ４発現細胞に対する結合を、最大結合の５０％まで減少させるのに必要である試験化合物の濃度を指す。当業者であれば、所与の化合物のＩＣ５０を決定することが容易にできるであろうし、そのための方法を以下に記載する。本発明の化合物は、ＣＸＣＲ４受容体に、受容体を活性化することなく結合することができる（すなわち、アンタゴニスト性）。あるいは、本発明の化合物は、内因性のリガンドと受容体について競合するが、受容体をより低い程度で活性化することができる（すなわち、部分アゴニスト性）。さらに別には、本発明の化合物は、ＣＸＣＲ４受容体に結合し、その後のシグナル伝達をベースラインの非活性化のレベル未満に減少させることができる（すなわち、負の効力またはインバースアゴニスト性）。特定の好ましい実施形態では、本発明の化合物は、ＣＸＣＲ４受容体に、受容体を活性化することなく結合する。その他の好ましい実施形態では、本発明の化合物は、ＣＸＣＲ４における完全アゴニスト性を有するリガンドを含まない。

本明細書で使用する場合、「（Ｍｅ）Ｘａａ」という表現は、アミノ酸のＮ^α−メチル誘導体を意味する。「Ｘａａ（置換基）」という表現は、アミノ酸の側鎖が、表示されている置換基で誘導体化されていることを意味する。「Ｘａａ／（Ｍｅ）Ｘａａ」という表現は、言及されているアミノ酸が、メチル化されていなくてもよいし、Ｎ^α−メチル基を有していてもよいことを意味する。本明細書で使用するアミノ酸の略語は、Ｄ鏡像異性体を表示する「Ｄ−Ｘａａ」という表現を使用しない限り、それぞれのアミノ酸のＬ−鏡像異性体を指す。本明細書で使用する場合、「塩基性アミノ酸」という用語は、正常な生理的条件下で、水素イオンを受け取って、正電荷をもつようになることができる側鎖を有する、自然に存在するまたは合成の（好ましくは、自然に存在する）アミノ酸を意味する。したがって、塩基性アミノ酸として、リジン、アルギニン、シトルリン、オルニチン、ヒスチジン、Ｄａｐ（２，３−ジアミノプロピオン酸）、およびＤａｂ（２，４−ジアミノ酪酸）が挙げられる。好ましい塩基性アミノ酸は、リジン、アルギニン、シトルリン、オルニチン、およびヒスチジンであり、より好ましいアミノ酸は、アルギニンおよびオルニチンである。

本発明の化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＣＸＣＲ４ケモカイン受容体を標的にする、効率的なプローブを提供することができる。当該化合物は、高い親和性および特異性で、それらの結合部位に結合して、（多様な方法による）即時の画像化、したがって、ＣＸＣＲ４陽性腫瘍（および何らかのそれに伴う転移）のｉｎ ｖｉｖｏにおける明確な描写を可能にする。この新しいクラスのプローブ／トレーサーは、腫瘍の転移の可能性の調査、ならびに転移過程の早期の画像化および潜在的には放射性核種による治療法のために極めて役立つ道具を提供することができる。

検出可能な標識は、好ましくは、蛍光性部分、磁性もしくは常磁性の部分、または放射性核種から選択される。多くの適用例では、放射性核種が好ましい。標識は、さらなる試薬の添加なしに、標識自体からの検出可能な電磁放射線もしくはその他の放射線の出力によって、またはその磁性もしくは常磁性の特性の結果として検出することができる。リガンドと検出可能な標識とを、共有結合によって相互に結合させることができる。

環状オリゴペプチド部分は、好ましくは２０個以下のアミノ酸残基、より好ましくは９個以下の残基を含む。好ましい実施形態では、環状オリゴペプチドは、ペンタペプチドである。環状オリゴペプチドは、好ましくは、ペプチド結合を介して環化されており、ペプチド結合は、そのＮ末端とＣ末端との間に存在することができ、または環状オリゴペプチドは、２個のシステイン残基が存在する場合には、それらの間のジスルフィド結合を介して環化されていてもよい。化合物は、環状オリゴペプチド部分および検出可能な標識に加えて、その他の部分を含むことができる。したがって、追加のペプチド配列、あるいは化合物の薬物動態学的および／または生理化学的な特性を変化させることができる基（例えば、糖またはポリエチレングリコール鎖等の親水性の基）を結合させることができる。リガンドは、環状オリゴペプチド部分に、追加の成分を含むことができる。あるいは、リガンドは、環状オリゴペプチド部分からなることができる。

特定の好ましい実施形態では、環状オリゴペプチド部分は、配列：

を有し、
式中、
Ｂは、上記で規定され；
Ｚは、側鎖中に芳香族基を含有するアミノ酸であり；
ｎは、１または０であり、ただし、環状部分配列中の先行する４個のアミノ酸が、Ｄ−Ｔｙｒ／（Ｍｅ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌであり、Ｎａｌが、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンである場合にのみ、ｎは１であり；かつ
Ｘは、Ｇｌｙ、（Ｍｅ）Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄａｐ、Ｄａｐ（ＦＰ）（（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノプロピオン酸）、Ｄａｂ、Ｄａｂ（ＦＰ）（（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノ酪酸）、Ｄａｂ（ＦＢ）（（Ｎ−フルオロベンゾイル）−ジアミノ酪酸）、およびＤａｐ（ＦＢ）（（Ｎ−フルオロベンゾイル）−ジアミノプロピオン酸）から選択される。

Ｚは、Ｎａｌ、Ｄａｐ（ＦＢ）、ＡＭＳ（ＦＢ）（アミノオキシセリン（Ｏ−アミノセリン）と４−フルオロベンズアルデヒドとのオキシム）、およびＢが（Ｍｅ）Ａｒｇである場合の（Ｍｅ）Ｎａｌから選択される。Ｚは、好ましくはＮａｌである。

Ｘは、好ましくは、Ｇｌｙ、（Ｍｅ）Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄａｐ（ジアミノプロピオン酸）、およびＤａｐ（ＦＰ）（（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノプロピオン酸）から選択される。Ｘは、好ましくは、ＧｌｙまたはＤａｐ（ＦＰ）である。

Ｂは、好ましくは、塩基性アミノ酸である。塩基性アミノ酸は、好ましくは、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、ＣｉｔおよびＨｉｓ、またはそれらのＮ−置換誘導体から選択される。最も好ましくは、Ｂは、ＡｒｇまたはＯｒｎである。オルニチン残基は、誘導体化するのが比較的容易である、アミノ含有側鎖の利点を与える。特定の実施形態では、Ｂは、Ｍｅ基でＮ^α−置換することができる。好ましくは、環状オリゴペプチド部分中の１個の残基のみが、Ｍｅ基でＮ^α−置換されている。

Ｂが、ＯｒｎまたはＤ−Ｏｒｎである場合には、フルオロベンゾイル（ＦＢ）スペーサー部分、フルオロプロピオニル（ＦＰ）スペーサー部分、アセチル（Ａｃ）スペーサー部分、アミド（Ａｍ）（すなわち、尿素型の部分を形成するため）スペーサー部分、メチル（Ｍｅ）スペーサー部分、１−ナフチルメチル（Ｎ１）スペーサー部分、２−ナフチルメチル（Ｎ２）スペーサー部分、ベンジル（Ｂｚ）スペーサー部分およびアシルスペーサー部分から選択することができる、１個または２個の基で、Ｎ^δにおいて、オルニチン残基を置換することができる。好ましくは、アシルスペーサー部分は、１〜１４個の炭素の鎖を含有し、所望によりヘテロ原子によって中断され、好ましくはオルニチンのＮ^δより遠位の末端に求核性の官能基を有するアシル基である。求核性の官能基は、例えば、アミノ基またはヒドロキシル基であることができる。この基によって、さらなる部分を、スペーサーの末端に付加することが可能となり、スペーサーの目的は、何らかの追加の基が環状オリゴペプチドのＣＸＣＲ４結合能に及ぼす効果を最小化することである。アシルスペーサー部分は、アミノヘキサノイル（Ａｈｘ）、トリエチレングリコールアミノアシル（ＴＧＡＳ、すなわち、−ＣＯＣＨ_２（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＮＨ_２）、（Ａｈｘ）_２、（Ａｈｘ）_３、（ＴＧＡＳ）_２、および（ＴＧＡＳ）_３から選択することができる。これらのスペーサーの多量体が存在する場合には、繰り帰し単位は、アミド結合によって結合している。現在のところ、好ましいスペーサー基は、Ａｈｘ、ＴＧＡＳ、（Ａｈｘ）_３、（ＴＧＡＳ）_２、および（ＴＧＡＳ）_３である。また、Ｂが、Ｌｙｓ、ＤａｐまたはＤａｂである場合には、アシルスペーサー部分をはじめとする、オルニチンに関して記載した置換基も利用することができる。そのような場合には、スペーサー部分は、好ましくは、オリゴペプチドにスペーサー部分が結合している点より遠位の末端に求核性の官能基を有する（すなわち、ＢがＬｙｓの場合のＮ^ε）。

特定の実施形態では、Ｂは、Ｎ^αにおいてＭｅ基で置換された、ＯｒｎまたはＤ−Ｏｒｎ，好ましくはＤ−Ｏｒｎである。ＢがＯｒｎである場合には、Ｂは、Ｎ^δにおいて、ＦＢ、ＦＰ、Ａｃ、Ａｍ、Ｎ１、Ｎ２、ＭｅおよびＮ１、ＭｅおよびＮ２、Ｂｚ、ＢｚおよびＦＢ、ＢｚおよびＦＰ、ＭｅおよびＦＢ、ＭｅおよびＦＰ、またはＭｅで置換することができる。

さらにその他の実施形態では、Ｂは、Ｎ^δにおいて、ＦＢ、ＦＰ、ＭｅおよびＦＢ、またはＭｅおよびＦＰ、ならびに所望によりＮ^αにおいてＭｅ基で置換された、ＯｒｎまたはＤ−Ｏｒｎ，好ましくはＤ−Ｏｒｎである。この場合の好ましい置換基は、所望によりＮ^αのＭｅ基での置換と併せた、ＦＢ、ならびにＭｅおよびＦＢである。

環状オリゴペプチド部分は、配列：

を有することができ、式中、Ｂ、ＺおよびＸは、上記に列挙した選択肢から選択され、ただし、当該配列中の１個の残基のみが、Ｎ^α−メチル化可能である。好ましくは、そのような実施形態では、ＢはＡｒｇである。あるいは、環状オリゴペプチド部分は、配列：

を有することができ、式中、ＺおよびＸは、上記に列挙した選択肢から選択され、Ｂは、Ａｒｇ、（Ｍｅ）Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｃｉｔ、Ｏｒｎ（ＦＢ）、Ｏｒｎ（ＦＰ）、Ｏｒｎ（Ａｃ）、Ｏｒｎ（Ａｍ）、Ｏｒｎ（Ｎ１）、Ｏｒｎ（Ｎ２）、Ｏｒｎ（Ｍｅ，Ｎ１）、Ｏｒｎ（Ｍｅ、Ｎ２）、Ｏｒｎ（Ｍｅ）、Ｏｒｎ（Ｂｚ）、Ｏｒｎ（Ｂｚ，ＦＢ）、Ｏｒｎ（Ａｈｘ）、Ｏｒｎ（Ａｈｘ_２）、Ｏｒｎ（Ａｈｘ_３）、Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ）、Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ_２）、Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ_３）、Ｏｒｎ（Ｍｅ，ＦＢ）、Ｄ−Ｏｒｎ（ＦＢ）、（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ（ＦＢ）、（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ（Ｍｅ，ＦＢ）、Ｈｉｓ、およびＰｈｅから選択され、ただし、当該配列中の１個の残基のみが、Ｎ^α−メチル化可能である。そのような実施形態では、第１残基は、好ましくはＤ−Ｔｙｒである。また、そのような実施形態では、Ｚは、好ましくはＮａｌである。また、そのような実施形態では、Ｘは、好ましくはＧｌｙである。また、そのような実施形態では、第３残基は、好ましくはＡｒｇである。

特異的な好ましい実施形態では、環状オリゴペプチド部分は、

から選択された配列を有する。

より好ましい環状オリゴペプチド部分として、以下の配列を有するものが挙げられる。

特に好ましい環状オリゴペプチド部分として、

から選択された配列を有するものが挙げられる。

好ましい実施形態では、標識は、放射性標識である。標識は、共有結合によってリガンドに直接結合させることもできれば、（例えば、金属放射性標識の場合には）共有結合によってリガンドに結合している錯体形成剤によって結合させることもできる。上記したように、スペーサー基を使用する場合には、錯体形成剤は、スペーサーより遠位の末端において求核基を介して結合させることができる。リガンドと標識との間の間接的な結合を促進するその他の中間の基は、当業者には明らかであろう。

環状ペンタペプチド

（ＣＰＣＲ４またはＦＣ１３１としても知られる）は、高い親和性でＣＸＣＲ４に結合する。また、これは、例えば、チロシン残基に結合しているヨウ素放射性核種を使用することによって、放射性標識することが比較的容易でもある。予備的な動物研究は、ＣＸＣＲ４＋腫瘍中における放射性標識ＣＰＣＲ４の蓄積量の増加が、対照腫瘍と比較して約１０倍であることを示した。ＣＰＣＲ４の薬物動態学的特性およびその他の特性を、アミノ酸残基の改変によって変化させることができる。特に、Ａｒｇ残基のＮ−メチル化、Ａｒｇ^１の別のカチオン性アミノ酸（例えば、オルニチン）による置換、ＮａｌとＧｌｙとの間へＡｒｇを挿入し、得られたヘキサペプチド中のＴｙｒをＮ−メチル化することは、いずれも、受容体に対する有用な親和性を維持する、改変ＣＸＣＲ４アンタゴニストをもたらす。

好ましくは、化合物は、その構造の一部として、抗体およびその断片を含まない。

本発明の特定の化合物の場合、放射性標識は、^１８Ｆ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉおよび^１２５Ｉから選択することができる。化合物を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）研究のために使用しようとする場合には、^１２３Ｉが、特に有用である。化合物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで使用する場合には、^１２５Ｉが、好ましい場合がある。ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）による画像化を使用するｉｎ ｖｉｖｏでの研究には、^１８Ｆおよび^１２４Ｉが、特に有用である。

本発明の化合物が、１個以上のＤａｐ（ＦＢ）基、Ｄａｐ（ＦＰ）基、Ｄａｂ（ＦＢ）基、Ｄａｂ（ＦＰ）基、ＦＢ基またはＦＰ基を含有する場合、フッ素置換基は^１８Ｆであってよい。これは、そのような化合物を放射性標識するための好都合な手段を提示する。この型の好ましい化合物の場合、ＯｒｎまたはＤ−ＯｒｎのＮ^δにおけるＦＢ置換基またはＦＰ置換基上に、^１８Ｆが存在する。

あるいは、放射性標識は、^２１１Ａｔ、^２２５Ａｃ、^２１１Ｂｉおよび^２１２Ｂｉから選択することができる。これらの放射性核種は、いずれも、本発明の化合物を標的放射線療法のために使用することを可能にする、比較的低飛程のα放射体である。低飛程の放射体は、転移に対して、より安全な放射線療法的なアプローチを提供する。本発明の化合物を使用する原発性腫瘍の放射線療法のためには、より長飛程の放出を有する放射性核種を使用することが好ましい場合があり、したがって、この場合には、放射性標識は、低飛程およびより高飛程のβ放射体、例えば、^１７７Ｌｕまたは^９０Ｙ、^１８８Ｒｅおよび^１３１Ｉのそれぞれから選択することができる。

一般に、本発明による使用に有用な診断用アイソトープ（ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴに基づいた検出および画像化に用いる）として、^１８Ｆ、^４７Ｓｃ、^５１Ｃｒ、^５２Ｆｅ、^５２ｍＭｎ、^５６Ｎｉ、^５７Ｎｉ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^８２Ｂｒ、^８９Ｚｒ、^９４ｍＴｃ、^９７Ｒｕ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１３１Ｉ、^１９１Ｐｔ、^１９７Ｈｇ、^２０１Ｔｌ、^２０３Ｐｂ、^１１０ｍＩｎ、^１２０Ｉが挙げられる。

一般に、本発明による使用に有用な治療用アイソトープとして、^３２Ｐ、^６７Ｃｕ、^７７Ａｓ、^９０Ｙ、^９９Ｍｏ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１１１Ａｇ、^１１４ｍＩｎ、^１１７ｍＳｎ、^１２１Ｓｎ、^１２７Ｔｅ、^１３１Ｉ、^１４０Ｌａ、^１４０Ｎｄ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１４９Ｔｂ、^１４９Ｐｍ、^１５１Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^１５９Ｇｄ、^１６１Ｔｂ、^１６６Ｈｏ、^１６６Ｄｙ、^１６９Ｅｒ、^１６９Ｙｂ、^１７２Ｔｍ、^１７５Ｙｂ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２１１Ａｔ、^２１１Ｂｉ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２２５Ａｃが挙げられる。

本発明の特定の化合物の場合、放射性標識は、有機錯体形成剤（ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）と放射性核種との間の錯体によってリガンドに結合させ、錯体は、リガンドのＣＸＣＲ４受容体における結合特性を損なうことがない様式で、リガンドに結合させる。そのような実施形態では、錯体形成剤は、好ましくは、リガンドに共有結合によって結合させ、一方、放射性標識は、錯体形成剤に、共有結合または非共有結合によって結合させることができる。

錯体形成剤を使用すると、本発明の化合物に結合させることができる放射性核種の範囲が広がる。好ましい錯体形成剤として、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”−四酢酸）およびその誘導体、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ならびにＨＹＮＩＣ（ヒドラジノニコチンアミド）が挙げられる。錯体形成剤は、本発明の環状オリゴペプチドのアミノ酸の適切な側鎖に、または本発明の環状オリゴペプチドのアミノ酸の適切な側鎖に結合しているリンカー基に、すなわち、当該化合物のＣＸＣＲ４結合特性の混乱を最小化するように結合させることができる。あるいは、上記したように、介在するスペーサー基も利用することができる。

また、本発明の化合物を、１個以上の親水性部分（例えば、炭水化物またはポリエチレングリコール鎖）を付加させることによって改変することも可能である。そのような改変を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでの当該化合物の薬物動態を改良することができる。例えば、本発明の炭水化物改変ペプチドに基づく化合物は、肝臓の取込みの低下を示すことが期待され、したがって、投与後に、親油性ペプチドと比較した場合、血中クリアランスの若干の遅れ、および腎臓の排泄の圧倒的な遅れを示すはずである。その結果、投与後しばらくしてから得ることができ、ＣＸＣＲ４陽性組織とＣＸＣＲ４陰性組織との間のコントラストが高まると予想される画像が得られる。

本発明の第２の態様によって、細胞障害性部分とケモカイン受容体ＣＸＣＲ４に対するリガンドとを含む化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供され、当該リガンドは、^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の存在下でＩＣ５０として測定した場合、ＣＸＣＲ４受容体に対して２５０ｎＭ以下の結合親和性を有し、当該リガンドは、その環状部分内にモチーフＢ−ＡｒｇまたはモチーフＢ−（Ｍｅ）Ａｒｇを有する環状オリゴペプチド部分を含み、かつＢは、塩基性アミノ酸、その誘導体、またはフェニルアラニンであり、ただし、Ｂが塩基性アミノ酸のＮ^α−メチル誘導体である場合には、当該モチーフはＢ−Ａｒｇである。

また、本発明の第１の態様の化合物の所望によるおよび好ましい特徴は、この第２の態様の化合物においても、必要に応じて、好ましいと理解されたい。特に、細胞障害性部分は、リガンドに直接結合させることもできれば、スペーサー基を介して結合させることもできる。転移の可能性を有する腫瘍およびそれらに伴う転移の標的化学療法に、そのような組織によるＣＸＣＲ４の比較的高い発現の結果として、本発明のこの態様の化合物を使用することができる。好ましい細胞障害性部分は、関係している腫瘍の化学療法に一般的に使用される細胞障害性化合物のうちのいずれかから選択することができる。

本発明の第３の態様によって、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４に対するリガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供され、当該リガンドは、^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の存在下でＩＣ５０として測定した場合、ＣＸＣＲ４受容体に対して２５０ｎＭ以下の結合親和性を有し、当該リガンドは、その環状部分内にモチーフＢ−ＡｒｇまたはモチーフＢ−（Ｍｅ）Ａｒｇを有する環状オリゴペプチド部分を含み、かつＢは、塩基性アミノ酸、その誘導体、またはフェニルアラニンであり、ただし、Ｂが塩基性アミノ酸のＮ^α−メチル誘導体である場合には、当該モチーフはＢ−Ａｒｇであり、ただし、環状オリゴペプチド部分は、配列

も、配列

も有しない。

本発明の第３の態様の化合物は、診断法および画像化における使用のために標識するのに有用である。また、これらの化合物は、ＣＸＣＲ４陽性腫瘍の標的化学療法のために、細胞障害性部分を結合させることもできる。さらにまた、これらの化合物は、ＣＸＣＲ４受容体においてアンタゴニスト性であることができることから、それら単独でも化学療法のために使用することができる。また、本発明の第１の態様の化合物の所望によるおよび好ましい特徴は、この第３の態様の化合物においても、必要に応じて、好ましいと理解されたい。

本発明の第４の態様によって、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４に対するリガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルが提供され、当該リガンドは、配列：

を有する環状オリゴペプチド部分を含み、
式中、
Ｂは、上記で規定され；
Ｚは、側鎖中に芳香族基を含有するアミノ酸であり；
ｎは、１または０であり；かつ
Ｘは、Ｇｌｙ、（Ｍｅ）Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄａｐ、Ｄａｐ（ＦＰ）、Ｄａｂ、Ｄａｂ（ＦＰ）、Ｄａｂ（ＦＢ）、およびＤａｐ（ＦＢ）から選択され、当該化合物は、所望により、検出可能な標識を含み、ただし、当該化合物が検出可能な標識を含まない場合には、環状オリゴペプチド部分は、配列

も、配列

も有しない。

この第４の態様では、Ｚは、Ｎａｌ、Ｄａｐ（ＦＢ）、ＡＭＳ（ＦＢ）、および（Ｍｅ）Ｎａｌから選択することができる。Ｚは、好ましくはＮａｌである。好ましくは、環状部分配列中の先行する４個のアミノ酸が、Ｄ−Ｔｙｒ／（Ｍｅ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌである場合にのみ、ｎは１である。好ましくは、Ｂが、Ｍｅ（Ａｒｇ）である場合にのみ、Ｚは、Ｍｅ（Ｎａｌ）である。また、本発明の第１、第２および第３の態様のその他の好ましいおよび所望による特徴も、この第４の態様に、必要に応じて、適用可能である。特に、Ｂが、ＯｒｎまたはＤ−Ｏｒｎである場合には、フルオロベンゾイル（ＦＢ）スペーサー部分、フルオロプロピオニル（ＦＰ）スペーサー部分、アセチル（Ａｃ）スペーサー部分、パルミトイル（Ｐａｌｍ：例えば、ペプチド

を形成するため）スペーサー部分、アミド（Ａｍ）（すなわち、尿素型の部分を形成するため）スペーサー部分、メチル（Ｍｅ）スペーサー部分、１−ナフチルメチル（Ｎ１）スペーサー部分、２−ナフチルメチル（Ｎ２）スペーサー部分、ベンジル（Ｂｚ）スペーサー部分およびアシルスペーサー部分から選択することができる、１個または２個の基で、Ｎ^δにおいて、オルニチン残基を置換することができる。好ましくは、アシルスペーサー部分は、１〜１６個の炭素、より好ましくは１〜１４個の炭素の鎖を含有し、所望によりヘテロ原子によって中断され、および好ましくはオルニチンのＮ^δより遠位の末端に求核性の官能基を有するアシル基である。求核性の官能基は、例えば、アミノ基またはヒドロキシル基であることができる。この基によって、さらなる部分を、スペーサーの末端に付加することが可能になり、スペーサーの目的は、何らかの追加の基が環状オリゴペプチドのＣＸＣＲ４結合能に及ぼす効果を最小化することである。アシルスペーサー部分は、アミノヘキサノイル（Ａｈｘ）、トリエチレングリコールアミノアシル（ＴＧＡＳ、すなわち、−ＣＯＣＨ_２（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２ＮＨ_２）、（Ａｈｘ）_２、（Ａｈｘ）_３、（ＴＧＡＳ）_２、および（ＴＧＡＳ）_３から選択することができる。これらのスペーサーの多量体が存在する場合には、繰り帰し単位は、アミド結合によって結合している。現在のところ、好ましいスペーサー基は、Ａｈｘ、ＴＧＡＳ、（Ａｈｘ）_３、（ＴＧＡＳ）_２、および（ＴＧＡＳ）_３である。また、Ｂが、Ｌｙｓ、ＤａｐまたはＤａｂである場合には、アシルスペーサー部分をはじめとする、オルニチンに関して記載した置換基も利用することができる。そのような場合には、スペーサー部分は、好ましくは、オリゴペプチドにスペーサー部分が結合している点より遠位の末端に求核性の官能基を有する（すなわち、ＢがＬｙｓの場合のＮ^ε）。

本発明の第５の態様によって、１種または複数の薬学的に許容される賦形剤と一緒になって、上記の第１、第２、第３または第４の態様において記載した本発明の化合物を含む薬学的組成物が提供される。好ましくは、当該組成物は、注射に適している。

本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物のうちのいずれか、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルを、いずれかの薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルと共に含む。本発明の薬学的組成物中に使用することができる薬学的に許容される担体、アジュバントおよびビヒクルとして、意図する剤型および投与経路によって異なるが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、リン酸等の緩衝物質、グリセリン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム等の塩または電解質、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック重合体、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の薬学的組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、直腸から、経鼻的に、頬側から、膣内から、または埋込み型リザーバーを介して投与することができる。上記で言及したように、非経口投与が好ましい。本発明の薬学的組成物は、いずれかの従来の無毒性で薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含有することができる。本明細書で使用する場合、非経口的なという用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内および頭蓋内への注射または注入の技法を含む。大部分の適用例として、静脈内注射または病巣内（例えば、腫瘍内）注射が予想される。

薬学的組成物は、無菌の注射用製剤の形態、例えば、無菌の注射用の水性または油性の懸濁液であることができる。この懸濁液は、当技術分野で既知の技法に従って、適切な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０等）および懸濁化剤を使用して製剤化することができる。また、無菌の注射用製剤は、無毒性の非経口投与に許容される希釈剤または溶媒中の無菌の注射用の溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液であることができる。利用することができる許容されるビヒクルおよび溶媒として、マンニトール溶液、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の固定油が、溶媒または懸濁媒体として、従来から利用されている。この目的には、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドをはじめとする、いずれかの無刺激性の固定油を利用することができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体等の脂肪酸は、注射剤の調製に有用であり、自然の薬学的に許容される油、例えば、オリーブ油またはヒマシ油等、特に、それらのポリオキシエチル化されたものも、注射剤の調製に有用である。

また、これらの油性の溶液または懸濁液は、Ｐｈ．Ｈｅｌｖまたは類似のアルコール等、長鎖アルコールの希釈剤または分散剤を含有することもできる。

本発明の薬学的組成物は、これらに限定されないが、カプセル剤、錠剤、ならびに水性の懸濁剤および液剤をはじめとする、いずれかの経口的に許容される投与剤型で経口投与することができる。経口投与錠剤の場合、通例使用する担体として、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。また、通常、ステアリン酸等の滑沢剤も添加する。カプセル剤の形態での経口投与のためには、有用な希釈剤として、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性の懸濁剤を経口投与する場合には、活性成分を、乳化剤および懸濁剤と組み合わせる。所望であれば、特定の甘味剤および／または矯味剤および／または着色剤を添加することができる。

また、本発明の薬学的組成物は、直腸投与のために坐剤の形態で投与することもできる。これらの組成物は、室温では固体であるが直腸温度では液体となり、したがって、直腸内で融けて活性成分を放出する、適切な非刺激性の賦形剤と、本発明の化合物を混合することによって調製することができる。そのような材料として、これらに限定されないが、カカオバター、蜜ろう、およびポリエチレングリコールが挙げられる。

本発明の薬学的組成物は、鼻からのエアロゾルまたは吸入によって投与することができる。そのような組成物は、製剤の技術分野で周知の技法に従って調製し、ベンジルアルコールもしくはその他の適切な保存剤、生物学的利用率を増強するための吸収促進剤、フッ化炭素、および／または当技術分野で既知の可溶化剤もしくは分散剤を利用して、食塩水中の溶液として調製することができる。

さらなる態様では、本発明は、上記の本発明の第１の態様による化合物の合成方法を提供し、当該方法は、検出可能な標識または有機錯体形成剤と標識との間の錯体がリガンドに結合するような条件下で、リガンドを検出可能な標識の供給源で処理する工程を含む。

さらに別の態様では、本発明は、上記の第２の態様による化合物の合成方法を提供し、当該方法は、細胞障害性部分がリガンドに直接的または間接的に結合するような条件下で、リガンドを細胞障害性部分の供給源で処理する工程を含む。

また、本発明は、治療法または診断において使用するために、上記の発明による化合物も提供する。

また、関連する態様では、本発明は、新生物性状態の治療のための医薬品の調製における、上記の発明による化合物の使用も提供する。

ＣＸＣＲ４受容体を有する組織を、適切な放射性核種または細胞障害性成分の標的にすることによって、転移の可能性を有する新生物の比較的選択性の化学療法を提供することが可能になるはずである。また、そのような腫瘍から生じた何らかの転移または循環する腫瘍細胞も、対象の放射性核種または細胞障害性成分の標的になるはずである。

さらなる態様では、本発明は、新生物性状態の診断用画像化のための医薬品の調製における、本発明の第１の態様に関して上記した化合物の使用を提供する。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、新生物は、転移の可能性を有するかまたは有することが疑われる。特定の実施形態では、新生物性状態は、乳癌または前立腺癌であることができる。

上記で言及したように、本発明の第１の態様の化合物は、ＣＸＣＲ４受容体を有する、したがって、転移の可能性を有する細胞の選択的な検出および画像化のための、極めて有用な道具を提供する。化合物は、日常的な方法（例えば、ｉ．ｖ．注射）によって投与することができ、患者の画像を、しばらくしてから撮影することができ、この時期までには、ＣＸＣＲ４の比較的高い発現を有するいずれかの組織が、本発明の検出可能な化合物の相対的な濃度を示すであろう。

また、関連する態様では、本発明は、新生物組織の画像化の方法も提供し、当該方法は、新生物を有する（または有することが疑われる）対象に、本発明の第１の態様による化合物を投与する工程と、化合物がｉｎ ｖｉｖｏにおいて分布した後に当該化合物を検出する工程とを含む。

当該の画像化の方法は、好ましくは、検出工程に続く、分布した化合物を検出した画像を生成するさらなる工程を含む。検出工程は、特に、標識が放射性核種である場合には、ＰＥＴまたは単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を使用して行うことができる。磁性または常磁性の標識を利用する場合には、磁気共鳴画像法が好ましい。

さらに別の態様によって、本発明は、新生物細胞の転移の可能性を決定する方法を提供し、当該方法は、本発明の第１の態様による化合物または上記の組成物に、当該細胞を暴露させて、当該化合物を当該細胞の表面上のＣＸＣＲ４受容体に結合させる工程と、未結合の化合物を当該細胞の近傍から除去する工程と、当該細胞に結合した化合物の存在および／または量を決定する工程とを含む。

当該の細胞の転移の可能性を決定する方法は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ（すなわち、患者から取り出した細胞または組織の検体を使用する）において実施することができる。

当該の細胞の転移の可能性を決定する方法を、本発明の第１の態様による化合物を使用して実施する場合、画像化あるいは結合した化合物の存在および／または量の決定は、特に、標識が放射性核種である場合には、ＰＥＴまたは単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を使用して行うことができる。磁性または常磁性の標識を利用する場合には、磁気共鳴画像法が好ましい。

本発明の化合物において使用するためのその他の検出可能な標識として、蛍光化合物（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ローダミン）が挙げられる。

本発明は、その上、さらに別の態様では、対象における新生物性状態の治療方法を提供し、当該新生物は、転移の可能性を有するかまたは有することが疑われ、当該方法は、本発明による化合物または上記の組成物を対象に投与する工程を含む。特定の実施形態では、新生物性状態は、乳癌または前立腺癌であることができる。

これ以降、本発明を、実施例のみを介してかつ添付の図面を参照してより詳細に記載する。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４に対するリガンドと検出可能な標識とを含む化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、該リガンドは、 ^１２５ Ｉ−ＣＰＣＲ４の存在下でＩＣ５０として測定した場合、該ＣＸＣＲ４受容体に対して２５０ｎＭ以下の結合親和性を有し、該リガンドは、その環状部分内にモチーフＢ−ＡｒｇまたはモチーフＢ−（Ｍｅ）Ａｒｇを有する環状オリゴペプチド部分を含み、かつＢは、塩基性アミノ酸、その誘導体、またはフェニルアラニンであり、ただし、Ｂが塩基性アミノ酸のＮ ^α −メチル誘導体である場合には、該モチーフはＢ−Ａｒｇである、化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステル。
（項目２）
前記環状オリゴペプチド部分が、配列：

を有し、
式中、
Ｂは、項目１において規定され；
Ｚは、側鎖中に芳香族基を含有するアミノ酸であり；
ｎは、１または０であり、ただし、該環状部分配列中の先行する４個のアミノ酸が、Ｄ−Ｔｙｒ／（Ｍｅ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌであり、Ｎａｌは、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニンである場合にのみ、ｎは１であり；かつ
Ｘは、Ｇｌｙ、（Ｍｅ）Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄａｐ（ジアミノプロピオン酸）、Ｄａｐ（ＦＰ）（（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノプロピオン酸）、Ｄａｂ（ジアミノ酪酸）、Ｄａｂ（ＦＰ）（（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノ酪酸）、Ｄａｂ（ＦＢ）（（Ｎ−フルオロベンゾイル）−ジアミノ酪酸）、およびＤａｐ（ＦＢ）（（Ｎ−フルオロベンゾイル）−ジアミノプロピオン酸）から選択される、項目１に記載の化合物。
（項目３）
Ｚが、Ｎａｌ、Ｄａｐ（ＦＢ）、またはＡＭＳ（ＦＢ）（アミノオキシセリンと４−フルオロベンズアルデヒドとのオキシム）から選択される、項目２に記載の化合物。
（項目４）
Ｂが、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、ＣｉｔおよびＨｉｓ、またはそれらのＮ−置換誘導体から選択される、項目１から３のいずれかに記載の化合物。
（項目５）
Ｂが、Ｍｅ基でＮ ^α −置換されている、項目１から４のいずれかに記載の化合物。
（項目６）
Ｂが、ＯｒｎまたはＤ−Ｏｒｎであり、前記オルニチン残基は、Ｎ ^δ において、フルオロベンゾイル（ＦＢ）スペーサー部分、フルオロプロピオニル（ＦＰ）スペーサー部分、アセチル（Ａｃ）スペーサー部分、アミド（Ａｍ）スペーサー部分、Ｍｅスペーサー部分、１−ナフチルメチル（Ｎ１）スペーサー部分、２−ナフチルメチル（Ｎ２）スペーサー部分、ベンジル（Ｂｚ）スペーサー部分、およびアシルスペーサー部分から選択された、１個または２個の基で置換されており、該アシルスペーサー部分は、１〜１４個の炭素の鎖を含有し、所望によりヘテロ原子によって中断され、該オルニチンのＮ ^δ より遠位の末端に求核性の官能基を有するアシル基である、項目２から５のいずれかに記載の化合物。
（項目７）
前記アシルスペーサー部分が、アミノヘキサノイル（Ａｈｘ）、トリエチレングリコールアミノアシル（ＴＧＡＳ）、（Ａｈｘ） _２ 、（Ａｈｘ） _３ 、（ＴＧＡＳ） _２ 、および（ＴＧＡＳ） _３ から選択される、項目６に記載の化合物。
（項目８）
Ｂが、Ｎ ^α においてＭｅ基で置換されたＤ−Ｏｒｎである、項目６に記載の化合物。
（項目９）
Ｂが、Ｎ ^δ において、ＦＢ、ＦＰ、Ａｃ、Ａｍ、Ｎ１、Ｎ２、ＭｅおよびＮ１、ＭｅおよびＮ２、Ｂｚ、ＢｚおよびＦＢ、ＢｚおよびＦＰ、ＭｅおよびＦＢ、ＭｅおよびＦＰ、またはＭｅで置換されたＯｒｎである、項目６に記載の化合物。
（項目１０）
Ｂが、Ｎ ^δ において、ＦＢ、ＦＰ、ＭｅおよびＦＢ、またはＭｅおよびＦＰで置換され、かつ所望によりＮ ^α においてＭｅ基で置換されたＤ−Ｏｒｎである、項目６に記載の化合物。
（項目１１）
前記環状オリゴペプチド部分が、配列：

を有し、
式中、Ｂ、ＺおよびＸは、項目２で規定され、ただし、該配列中の１個の残基のみが、Ｎ ^α −メチル化され得る、項目１から５のいずれかに記載の化合物。
（項目１２）
ＢがＡｒｇである、項目１１に記載の化合物。
（項目１３）
前記環状オリゴペプチド部分が、配列：

を有し、
式中、ＺおよびＸは、項目２で規定され、Ｂは、Ａｒｇ、（Ｍｅ）Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｃｉｔ、Ｏｒｎ（ＦＢ）、Ｏｒｎ（ＦＰ）、Ｏｒｎ（Ａｃ）、Ｏｒｎ（Ａｍ）、Ｏｒｎ（Ｎ１）、Ｏｒｎ（Ｎ２）、Ｏｒｎ（Ｍｅ，Ｎ１）、Ｏｒｎ（Ｍｅ、Ｎ２）、Ｏｒｎ（Ｍｅ）、Ｏｒｎ（Ｂｚ）、Ｏｒｎ（Ｂｚ，ＦＢ）、Ｏｒｎ（Ａｈｘ）、Ｏｒｎ（Ａｈｘ _２ ）、Ｏｒｎ（Ａｈｘ _３ ）、Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ）、Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ _２ ）、Ｏｒｎ（ＴＧＡＳ _３ ）、Ｏｒｎ（Ｍｅ，ＦＢ）、Ｄ−Ｏｒｎ（ＦＢ）、（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ（ＦＢ）、（Ｍｅ）Ｄ−Ｏｒｎ（Ｍｅ，ＦＢ）、Ｈｉｓ、およびＰｈｅから選択され、ただし、該配列中の１個の残基のみが、Ｎ ^α −メチル化され得る、項目１から４のいずれかに記載の化合物。
（項目１４）
前記第１残基がＤ−Ｔｙｒである、項目１３に記載の化合物。
（項目１５）
前記第３残基がＡｒｇである、項目１３または１４に記載の化合物。
（項目１６）
ＺがＮａｌである、項目１１から１４のいずれかに記載の化合物。
（項目１７）
ＸがＧｌｙである、項目１１から１５のいずれかに記載の化合物。
（項目１８）
前記環状オリゴペプチド部分が、

から選択された配列を有する、項目１から４のいずれかに記載の化合物。
（項目１９）
前記環状オリゴペプチド部分が、

から選択された配列を有する、項目１８に記載の化合物。
（項目２０）
前記環状オリゴペプチド部分が、

から選択された配列を有する、項目１９に記載の化合物。
（項目２１）
前記リガンドが、前記環状オリゴペプチド部分からなる、項目１〜２０のいずれかに記載の化合物。
（項目２２）
前記標識が、放射性標識である、項目１〜２１のいずれかに記載の化合物。
（項目２３）
前記化合物が、１個以上のＤａｐ（ＦＢ）基、Ｄａｐ（ＦＰ）基、ＦＢ基またはＦＰ基を含有し、かつ該フッ素置換基のうちの１個が ^１８ Ｆである、項目２２に記載の化合物。
（項目２４）
前記 ^１８ Ｆが、ＯｒｎまたはＤ−ＯｒｎのＮ ^δ におけるＦＢ置換基またはＦＰ置換基上に存在する、項目２３に記載の化合物。
（項目２５）
^１８Ｆ 、 ^４７ Ｓｃ、 ^５１ Ｃｒ、 ^５２ Ｆｅ、 ^５２ｍ Ｍｎ、 ^５６ Ｎｉ、 ^５７ Ｎｉ、 ^６２ Ｃｕ、 ^６４ Ｃｕ、 ^６７ Ｇａ、 ^６８ Ｇａ、 ^７２ Ａｓ、 ^７５ Ｂｒ、 ^７６ Ｂｒ、 ^７７ Ｂｒ、 ^８２ Ｂｒ、 ^８９ Ｚｒ、 ^９４ｍ Ｔｃ、 ^９７ Ｒｕ、 ^９９ｍ Ｔｃ、 ^１１１ Ｉｎ、 ^１２３ Ｉ、 ^１２４ Ｉ、 ^１２５ Ｉ、 ^１３１ Ｉ、 ^１９１ Ｐｔ、 ^１９７ Ｈｇ、 ^２０１ Ｔｌ、 ^２０３ Ｐｂ、 ^１１０ｍ Ｉｎ、 ^１２０ Ｉから選択された放射性標識を有する、項目２２に記載の化合物。
（項目２６）
有機錯体形成剤と放射性核種との間の錯体によって、前記リガンドに結合している放射性標識を有し、該錯体は、該リガンドの前記ＣＸＣＲ４受容体に対する結合特性を損なうことがない様式で、該リガンドに結合している、項目２２に記載の化合物。
（項目２７）
前記錯体形成剤が、前記リガンドに、スペーサー基によって結合している、項目２６に記載の化合物。
（項目２８）
前記放射性標識が、 ^３２ Ｐ、 ^６７ Ｃｕ、 ^７７ Ａｓ、 ^９０ Ｙ、 ^９９ Ｍｏ、 ^１０３ Ｒｕ、 ^１０５ Ｒｈ、 ^１０９ Ｐｄ、 ^１１１ Ａｇ、 ^１１４ｍ Ｉｎ、 ^１１７ｍ Ｓｎ、 ^１２１ Ｓｎ、 ^１２７ Ｔｅ、 ^１３１ Ｉ、 ^１４０ Ｌａ、 ^１４０ Ｎｄ、 ^１４２ Ｐｒ、 ^１４３ Ｐｒ、 ^１４９ Ｔｂ、 ^１４９ Ｐｍ、 ^１５１ Ｐｍ、 ^１５３ Ｓｍ、 ^１５９ Ｇｄ、 ^１６１ Ｔｂ、 ^１６６ Ｈｏ、 ^１６６ Ｄｙ、 ^１６９ Ｅｒ、 ^１６９ Ｙｂ、 ^１７２ Ｔｍ、 ^１７５ Ｙｂ、 ^１７７ Ｌｕ、 ^１８６ Ｒｅ、 ^１８８ Ｒｅ、 ^１９８ Ａｕ、 ^１９９ Ａｕ、 ^２１１ Ａｔ、 ^２１１ Ｂｉ、 ^２１２ Ｂｉ、 ^２１３ Ｂｉ、 ^２２５ Ａｃから選択される、項目２２に記載の化合物。
（項目２９）
前記放射性標識が、 ^９０ Ｙ、 ^１８８ Ｒｅおよび ^１３１ Ｉから選択される、項目２２に記載の化合物。
（項目３０）
細胞障害性部分とケモカイン受容体ＣＸＣＲ４に対するリガンドとを含む化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、該リガンドは、 ^１２５ Ｉ−ＣＰＣＲ４の存在下でＩＣ５０として測定した場合、該ＣＸＣＲ４受容体に対して２５０ｎＭ以下の結合親和性を有し、該リガンドは、その環状部分内にモチーフＢ−ＡｒｇまたはモチーフＢ−（Ｍｅ）Ａｒｇを有する環状オリゴペプチド部分を含み、かつＢは、塩基性アミノ酸、その誘導体、またはフェニルアラニンであり、ただし、Ｂが塩基性アミノ酸のＮ ^α −メチル誘導体である場合には、該モチーフはＢ−Ａｒｇである、化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステル。
（項目３１）
前記環状オリゴペプチド部分が、配列：

を有し、
式中、
Ｂは、塩基性アミノ酸、その誘導体、またはフェニルアラニンであり、ただし、Ｂが塩基性アミノ酸のＮ ^α −メチル誘導体、またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルである場合には、前記モチーフはＢ−Ａｒｇであり；
Ｚは、側鎖中に芳香族基を含有するアミノ酸であり；
ｎは、１または０であり、ただし、該環状部分配列中の先行する４個のアミノ酸が、Ｄ−Ｔｙｒ／（Ｍｅ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌである場合にのみ、ｎは１であり；かつ
Ｘは、Ｇｌｙ、（Ｍｅ）Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄａｐ（ジアミノプロピオン酸）、Ｄａｐ（ＦＰ）（（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノプロピオン酸）、Ｄａｂ（ジアミノ酪酸）、Ｄａｂ（ＦＰ）（（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノ酪酸）、Ｄａｂ（ＦＢ）（（Ｎ−フルオロベンゾイル）−ジアミノ酪酸）、およびＤａｐ（ＦＢ）（（Ｎ−フルオロベンゾイル）−ジアミノプロピオン酸）から選択される、項目３０に記載の化合物。
（項目３２）
Ｚが、Ｎａｌ（Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン）、Ｄａｐ（ＦＢ）、またはＡＭＳ（ＦＢ）から選択される、項目３１に記載の化合物。
（項目３３）
ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４に対するリガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、該リガンドは、 ^１２５ Ｉ−ＣＰＣＲ４の存在下でＩＣ５０として測定した場合、該ＣＸＣＲ４受容体に対して２５０ｎＭ以下の結合親和性を有し、該リガンドは、その環状部分内にモチーフＢ−ＡｒｇまたはモチーフＢ−（Ｍｅ）Ａｒｇを有する環状オリゴペプチド部分を含み、かつＢは、塩基性アミノ酸、その誘導体、またはフェニルアラニンであり、ただし、Ｂが塩基性アミノ酸のＮ ^α −メチル誘導体である場合には、該モチーフはＢ−Ａｒｇであり、ただし、該オリゴペプチド部分は、配列

も、配列

も有さない、化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステル。
（項目３４）
前記リガンドが、配列：

を有する環状オリゴペプチド部分を含み、
式中、
Ｂは、項目３３で規定され；
Ｚは、側鎖中に芳香族基を含有するアミノ酸であり；
ｎは、１または０であり、ただし、該環状部分配列中の先行する４個のアミノ酸が、Ｄ−Ｔｙｒ／（Ｍｅ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌである場合にのみ、ｎは１であり；かつ
Ｘは、Ｇｌｙ、（Ｍｅ）Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄａｐ（ジアミノプロピオン酸）、Ｄａｐ（ＦＰ）（（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノプロピオン酸）、Ｄａｂ（ジアミノ酪酸）、Ｄａｂ（ＦＰ）（（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノ酪酸）、Ｄａｂ（ＦＢ）（（Ｎ−フルオロベンゾイル）−ジアミノ酪酸）、およびＤａｐ（ＦＢ）（（Ｎ−フルオロベンゾイル）−ジアミノプロピオン酸）から選択される、項目３３に記載の化合物。
（項目３５）
Ｚが、Ｎａｌ（Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン）、Ｄａｐ（ＦＢ）、またはＡＭＳ（ＦＢ）から選択される、項目３４に記載の化合物。
（項目３６）
１個以上の親水性部分を結合させることによって改変されている、項目１から３５のいずれかに記載の化合物。
（項目３７）
１種または複数の薬学的に許容される賦形剤と一緒に、項目１から３６のいずれかに記載の化合物を含む薬学的組成物。
（項目３８）
注射に適した、項目３７に記載の組成物。
（項目３９）
項目１に記載の化合物を合成する方法であって、放射性核種または有機錯体形成剤と該放射性核種との間の錯体がリガンドに結合するような条件下で、該リガンドを、該放射性核種の供給源で処理する工程を含む、方法。
（項目４０）
治療または診断における使用のための、項目１から３６のいずれかに記載の化合物。
（項目４１）
新生物性状態の治療のための医薬品の調製における、項目１から３６のいずれかに記載の化合物の使用。
（項目４２）
新生物性状態の診断用画像化のための医薬品の調製における、項目１から２９のいずれかに記載の化合物の使用。
（項目４３）
前記新生物が、転移の可能性を有するかまたは有することが疑われる、項目４１または４２に記載の使用。
（項目４４）
前記新生物性状態が、乳癌または前立腺癌である、項目４１から４３のいずれかに記載の使用。
（項目４５）
新生物の組織を画像化する方法であって、新生物を有するかまたは有することが疑われる対象に、項目１から２９のいずれかに記載の化合物を投与する工程と、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて該化合物が分布した後に該化合物を検出する工程とを含む、方法。
（項目４６）
前記検出工程に続いて、前記検出した化合物の画像を生成するさらなる工程を含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
新生物の細胞の転移の可能性を決定する方法であって、項目１から２９のいずれかに記載の化合物に、該細胞を暴露させて、該化合物を該細胞の表面上のＣＸＣＲ４受容体に結合させる工程と、未結合の化合物を該細胞の近傍から除去する工程と、該細胞に結合した化合物の存在および／または量を決定する工程とを含む、方法。
（項目４８）
前記細胞は、前記新生物から取り出され、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて前記化合物に暴露される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記標識が放射性核種を含む場合、結合した化合物の存在および／または量を画像化するまたは決定する工程が、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴを使用して行われる、項目４５から４７のいずれかに記載の方法。
（項目５０）
対象における新生物性状態を治療する方法であって、該新生物が、転移の可能性を有するかまたは有することが疑われ、該対象に項目１から３６のいずれかに記載の化合物を投与する工程を含む、方法。
（項目５１）
前記新生物性状態が、乳癌または前立腺癌である、項目４５から５０のいずれかに記載の方法。
（項目５２）
項目１から２９のいずれかに記載の化合物を合成する方法であって、前記検出可能な標識または有機錯体形成剤と該標識との間の錯体が前記リガンドに結合するような条件下で、該リガンドを該検出可能な標識の供給源で処理する工程を含む、方法。
（項目５３）
項目３０から３２のいずれかに記載の化合物を合成する方法であって、前記細胞障害性部分が前記リガンドに直接的または間接的に結合するような条件下で、該リガンドを該細胞障害性部分の供給源で処理する工程を含む、方法。
（項目５４）
ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４に対するリガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステルであって、該リガンドが、配列：

を有する環状オリゴペプチド部分を含み、
式中、
Ｂは、項目１で規定され；
Ｚは、側鎖中に芳香族基を含有するアミノ酸であり；
ｎは、１または０であり；かつ
Ｘは、Ｇｌｙ、（Ｍｅ）Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｄａｐ（ジアミノプロピオン酸）、Ｄａｐ（ＦＰ）（（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノプロピオン酸）、Ｄａｂ（ジアミノ酪酸）、Ｄａｂ（ＦＰ）（（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノ酪酸）、Ｄａｂ（ＦＢ）（（Ｎ−フルオロベンゾイル）−ジアミノ酪酸）、およびＤａｐ（ＦＢ）（（Ｎ−フルオロベンゾイル）−ジアミノプロピオン酸）から選択され、該化合物は、所望により、検出可能な標識を含み、ただし、該化合物が検出可能な標識を含まない場合には、該環状オリゴペプチド部分は、配列

も、配列

も有さない、化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはエステル。

図１は、ＣＸＣＲ４およびＧＦＰレポーターをコードするベクターの細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質移入からの蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）の結果を示す。 図２ａおよび２ｂ（および表）は、ジャーカット細胞上でのＣＸＣＲ４における^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４結合パラメーターの決定、ならびにその^１２５Ｉ−ＳＤＦ−１αとの比較（図２ｂ）を示す。 図２ａおよび２ｂ（および表）は、ジャーカット細胞上でのＣＸＣＲ４における^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４結合パラメーターの決定、ならびにその^１２５Ｉ−ＳＤＦ−１αとの比較（図２ｂ）を示す。 図３は（および表）は、^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４をヌードマウスに注射した後の^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の体内分布を示す。 図４は、ＣＸＣＲ４陽性腫瘍およびＣＸＣＲ４陰性腫瘍を有するマウスにおける放射性標識ＣＰＣＲ４の分布のＰＥＴ／ＳＰＥＣＴによる画像を示す。

（実施例１）
放射性標識ＣＰＣＲ４のＳＰＥＣＴ／ＰＥＴによる画像化
１．１ 概要
１．１．１ 材料および方法：
腫瘍の転移の可能性を早期に評価するための方法は、治療法を予想および制御するために役立つ道具となるであろう。最近、ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ４が、転移における１つの重要な役割を担っているとされた。乳癌および前立腺癌等の多様な腫瘍において、ＣＸＣＲ４が、腫瘍細胞のホーミングの間に優勢な役割を担うことが見出されており、原発性腫瘍および転移の両方において発現することが示された。本研究の目的は、ＳＰＥＣＴおよびＰＥＴによる画像化によって、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍上および転移上のＣＸＣＲ４を画像化するための新規放射性標識プローブを開発することにあった。

ＣＸＣＲ４、すなわち、環状ペプチド

を、放射性標識して、ＣＸＣＲ４を発現するジャーカット細胞上での結合アッセイにおいて評価した。腫瘍原性線維肉腫細胞系ＣＭＳ５を、安定なＣＸＣＲ４／ＧＦＰ発現を目指して、レトロウイルスを用いて形質導入し、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）アッセイおよび放射性リガンド結合アッセイで特徴付けた。体内分布研究およびＳＰＥＣＴ／ＰＥＴによる画像化を、ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４^＋マウスにおいて実施した。腫瘍を、オートラジオグラフィー、ＩＨＣおよびＧＦＰの蛍光によってさらに分析した。

１．１．２ 結果および結論：
放射性標識ＣＰＣＲ４は、高い親和性（Ｋ_Ｄ：０．４±０．１ｍＭ）および特異性（＞９０％）で、アンタゴニスト的に、ＣＸＣＲ４を内因性に発現するジャーカット細胞およびＣＸＣＲ４／ＧＦＰを発現するように形質導入したＣＭＳ５細胞に結合する。オートラジオグラフィー、免疫組織化学（ＩＨＣ）、およびＧＦＰの蛍光によって確認されたように、ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４^＋線維肉腫は、マウスにおける信頼できるＣＸＣＲ４腫瘍モデルであることが見出された。ｉ．ｖ．注射した放射性標識ＣＰＣＲ４の体内分布研究は、注射１ｈ後に、ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４^＋腫瘍中では５．５±１．５％ＩＤ／ｇ（注射用量／ｇ）、およびＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４⁻対照中では０．６±０．２％ＩＤ／ｇを示した。急速な血中クリアランスおよび低いバックグランドの蓄積（＜１．０％ＩＤ／ｇ）の他に、より高いトレーサーの取込みが認められ、これらは、肝臓１９．５±２．８％ＩＤ／ｇ、腸１７．２±２．９％ＩＤ／ｇ、および腎臓１２．２±２．３％ＩＤ／ｇであった。マウスのＣＰＣＲ４−ＳＰＥＣＴおよび動物ＰＥＴ画像化を使用すると、ＣＸＣＲ４^＋腫瘍の明確な描写が可能であったが、同一動物のＣＸＣＲ４⁻対照の場合、活性の蓄積は認められなかった。

この研究では、我々は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＣＸＣＲ４ケモカイン受容体を標的にする最初の放射性標識プローブを開発するのに成功した。当該トレーサーは、高い親和性および特異性で、アンタゴニスト的に、その結合部位に結合し、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＸＣＲ４^＋腫瘍の明確な描写を可能にした。我々は、この新しいクラスのトレーサーが、腫瘍の転移の可能性の調査、ならびに転移過程の早期の画像化および放射性核種による治療法のための非常に有望なプローブとなるであろうと仮定する。

１．２ 実施例１の詳細な説明
１．２．１ 材料および方法
１．２．１．１ ペプチドの合成および放射性標識
ペプチドを、Ｆｍｏｃ戦略に従って、標準的な固相ペプチド合成のプロトコールを使用することによって合成した。Ｆｍｏｃアミノ酸であるＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、およびＦｍｏｃ−Ｇｌｙは、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｂａｄ Ｓｏｄｅｎ、ドイツ）から購入し、Ｆｍｏｃ−２−ナフチルアラニンは、Ｂａｃｈｅｍ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、スイス）から得た。ペプチド合成は、ＴＣＰ（塩化トリチルポリスチレン）樹脂上で、手作業で行った。Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸（ＴＢＴＵ）、およびジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）はそれぞれ、ＡｌｅｘｉｓおよびＡｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）から購入した。ＩｏｄｏＧｅｎ（１，３，４，６−テトラクロロ−３Ｒ，６Ｒ−ジフェニルグリコールウリル）は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州、米国）から得、ヨウ化ナトリウム−１２５は、Ｈａｒｔｍａｎｎ−Ａｎａｌｙｔｉｃ ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）から購入し、ヨウ化ナトリウム−１２３は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｅａｌｔｈ（Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、オランダ）から得た。ヨウ化ナトリウム−１２４は、Ｗ．Ｂｒａｎｄａｕ教授（Ｅｓｓｅｎ、ドイツ）から、御厚意による提供を受けた。すべてのその他の試薬は、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）から購入した。別段の指定がない限り、溶媒は、さらなる精製なしに使用した。

環状ペンタペプチドＣＰＣＲ４およびその誘導体の合成を、最近の記載に従い、若干の改変を加えて行った［１、２］。手短にいうと、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨをＴＣＰ樹脂に結合させた後、残りのアミノ酸を、ＴＢＴＵを用いて活性化してから、結合させ、その後のＦｍｏｃ基の脱保護をそれぞれ、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを使用することによって行った。ペプチド鎖の組立ての後、樹脂結合ペプチドを、酢酸、２，２，２−トリフルオロエタノールおよびジクロロメタンの混合物（２：２：６）で、室温で２時間処理した。その後、樹脂を、ろ過し、切断混合物で２回洗浄した。ろ液を合わせて、真空中で石油エーテルの存在下で蒸発させた。

環化のために、側鎖が保護されているペプチドを、ＤＭＦ中に、２．５ｍＭの濃度で溶解させた。−４０℃で、５当量のＮａＨＣＯ_３および３当量のＤＰＰＡを添加し、溶液を一晩攪拌して室温まで温めた。固体のＮａＨＣＯ_３をろ過した後、ＤＭＦを真空中で蒸発させた。残渣を、水と共に粉砕し、ろ過した後、水およびジエチルエーテルで洗浄した。完全に保護されている環化ペプチドを、９５％ＴＦＡおよび５％水の溶液で、室温で２時間処理した。脱保護されたペプチドを、氷冷ジエチルエーテルから沈殿させ、５℃で遠心分離した。非放射性のヨウ素化参照ペプチドの合成のために、アミノ酸構成単位であるＦｍｏｃ−Ｄ−３−ヨード−Ｔｙｒ−ＯＨを、以前の記載に従って合成した［２］。このアミノ酸の取込みおよびその後のペプチドの環化のために、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸）／コリジン活性化を使用した。その後、粗環化ペプチドを凍結乾燥し、分取用ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。最後に、ペプチドを、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄシリーズ１１００ ＨＰＬＣシステムを使用するＦｉｎｎｉｇａｎ（Ｂｒｅｍｅｎ、ドイツ）製のＬＣＱ ＬＣ−ＭＳ系上の分析用のＨＰＬＣおよびＨＰＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳによって、特徴付けた。

ペプチド合成の追加の詳細を以下に示す。

材料および方法
一般論
すべての市販の化学試薬は、さらなる精製なしに使用した。工業用の溶媒は、蒸留してから使用した。

トリチル樹脂は、ＰｅｐＣｈｅｍから、アミノ酸誘導体は、Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ、Ｂａｃｈｅｍ、Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ、Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、すべてのその他の化学薬品は、別段の記載がない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ、ＦｌｕｋａまたはＭｅｒｃｋから購入した。

ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）は、ＢＡＳＦから入手し、さらなる蒸留なしに使用した。乾燥溶媒は、Ａｌｄｒｉｃｈ、ＦｌｕｋａまたはＭｅｒｃｋから購入した。乾燥ジクロロメタンを、アルゴン下で水素化カルシウムから蒸留し、４Å分子ふるい上に保った。ＲＰ−ＨＰＬＣのための水は、０．２２μｍのフィルターを通してろ過した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製、Ｍｉｌｌｉｐａｋ４０）。

ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を、Ｏｍｎｉｃｏｒｍ ＹＭＣカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ Ｃ_１８、１ｍＬ／分）を使用して行った。溶出液は、水（０．１％ＴＦＡ）からアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）へ、３０分かけて直線的な勾配で変化させ（１０％から１００％、１０％から６０％、および２０％から５０％）、２２０ｎｍおよび２５４ｎｍで検出した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣの保持時間（Ｒ_ｔ）は分で、アセトニトリルの勾配パーセントと共に示した。半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣを、上記と同一の溶媒と組み合わせたＯｍｎｉｃｒｏｍ ＯＤＳ−Ａ Ｃ１８（１２０Å、５μｍ、２５０ｍｍ×２０ｍｍ）カラムを使用して、高圧モジュール１２５およびＵＶ検出器１６６を備えたＢｅｃｈｍａｎ
Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ上で行った。

ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ２５０またはＢｒｕｋｅｒ ＤＭＸ ５００上、２９８Ｋで記録した。化学シフトを、使用した溶媒のシグナルと比較して、δスケール上で、ｐｐｍで報告した。^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、^１Ｈ広域帯のデカップリングを使用して記録した。パルスプログラムを、Ｂｒｕｋｅｒの図書館から入手、または発明者が開発した。試料を、５ｍｍの直径を有するチューブ中に、０．５ｍｌの重水素化溶媒を使用して調製した。得られたスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＴＯＰＳＰＩＮ
１．３ソフトウエアを使用するＰＣワークステーション上で処理した。

ＥＳＩ質量スペクトルを、Ｏｍｎｉｃｒｏｍ ＹＭＣ ＯＤＳ−Ａ Ｃ１８カラム（１２０Å、３μｍ、１２５ｍｍ×２ｍｍ）を使用して、０．２ｍＬ／分の流速で、Ａｇｉｌｅｎｔ／ＨＰ １１００ ＲＰ−ＨＰＬＣシステムと組み合わせたＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ上で記録した。溶出液は、水から０．１％ギ酸を有するアセトニトリルへ、２０分かけて直線的な勾配で変化させ（１０％から１００％のアセトニトリル）、２２０ｎｍで検出した。

ＴＣＰ樹脂への負荷（一般的な手順）
ペプチド合成は、標準的なＦｍｏｃ戦略後に、ＴＣＰ樹脂（１ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して実施した［１３］。Ｆｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨ（１．２当量）を、ＴＣＰ樹脂に、無水ＤＣＭ（２ｍＬ）中のＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）（２．５当量）を用いて、室温で１時間結合させた。残存している塩化トリチル基は、ＭｅＯＨ、ＤＩＥＡの溶液（５：１、ｖ：ｖ）を１５分間添加することによってキャップした。樹脂を、ろ過し、ＤＣＭ（５×）およびＭｅＯＨ（３×）で十分に洗浄した。負荷容量を、樹脂を真空下で乾燥させた後の重量によって決定したところ、０．４〜０．９ｍｍｏｌ／ｇの範囲であった。

Ｆｍｏｃの脱保護（一般的な手順）
樹脂結合Ｆｍｏｃペプチドを、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン（ｖ／ｖ）で、１０分間、および２回目は５分間処理した。樹脂を、ＮＭＰ（５×）で洗浄した。

ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔのカップリング（一般的な手順）
ＮＭＰ中のＦｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨ（２当量）、ＴＢＴＵ（２当量）、ＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）（２当量）、ＤＩＥＡ（５．２当量）の溶液を、樹脂結合遊離アミンペプチドに添加し、室温で６０分間振とうした後、ＮＭＰ（５×）で洗浄した。

ｏ−ニトロベンゼンスルホニル（ｏ−Ｎｓ）による保護
Ｎ−アルキル化を、最適化プロトコールを使用して実施した［１４］。ＮＭＰ中の塩化ｏ−ニトロベンゼンスルホニル（ｏ−Ｎｓ−Ｃｌ）（５当量）およびコリジン（１０当量）の溶液を、樹脂結合遊離アミンペプチドに添加し、室温で１５分間振とうした。樹脂を、ＮＭＰ（３×）および乾燥ＴＨＦ（３×）で洗浄した。

Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ条件下でのＮ−アルキル化
乾燥ＴＨＦ中のトリフェニルホスフィン（５当量）、ＤＩＡＤ（アゾジカルボン酸ジイソプロピル）（５当量）およびアルコール（１０当量）の溶液を、樹脂結合ｏ−Ｎｓ保護ペプチドに添加し、室温で１０分間振とうした。樹脂をろ取し、乾燥ＴＨＦ（３×）およびＮＭＰ（３×）で洗浄した。

ｏ−Ｎｓの脱保護
ｏ−Ｎｓ脱保護のために、樹脂結合Ｎ−アルキル−Ｎ−ｏ−Ｎｓ−ペプチドを、ＮＭＰ中のメルカプトエタノール（１０当量）およびＤＢＵ（５当量）の溶液で、５分間処理した。脱保護の手順を、さらに１回繰り返した後、樹脂を、ＮＭＰ（５×）で洗浄した。

ＨＡＴＵ／ＨＯＡｔのカップリング（一般的な手順）
ＮＭＰ中のＦｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨ（２当量）、ＨＡＴＵ（２当量）、ＨＯＡｔ（ヒドロキシアゾベンゾトリアゾール）（２当量）、ＤＩＥＡ（４当量）の溶液を、樹脂結合Ｎ^α−メチルアミン遊離ペプチドに添加し、室温で３時間振とうした後、ＮＭＰ（５×）で洗浄した。

Ａｌｌｏｃの脱保護
乾燥ＤＣＭ中のＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（０．１２５当量）（０．５ｍｌ／ｇ樹脂）を、樹脂結合Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）ペプチドに添加し、その後、乾燥ＤＣＭ中のフェニルシラン（０．５ｍｌ／ｇ樹脂）を添加し、１時間振とうした。樹脂を、ＤＣＭで５回洗浄した。

ペプチドの切断
樹脂から完全に切断するために、ペプチドを、ＤＣＭおよびＨＦＩＰの溶液（４：１；ｖ：ｖ）で、室温で３０分間３回処理した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。

環化
ペプチドの１ｍＭ溶液およびＮａＨＣＯ_３（５当量）に、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）（３当量）を、室温で添加し、一晩または線状ペプチドがＥＳＩ−ＭＳによって観察されなくなるまで攪拌した。溶媒を、減圧下で蒸発させ、体積を減少させた後、ペプチドを、飽和ＮａＣｌ溶液中に沈殿させ、ＨＰＬＣグレードの水で２回洗浄した。

酸に不安定な側鎖の保護基の除去
環化ペプチドを、ＴＦＡ、水およびＴＩＰＳ（トリイソプロピルシラン）（９５：２．５：２．５）の溶液中、室温で、１時間または保護されているペプチドがＥＳＩ−ＭＳによって観察されなくなるまで攪拌し、ジエチルエーテル中に沈殿させ、２回洗浄した。

溶液中でのアシル化
オルニチン側鎖のアシル化のために、環化されかつ完全に保護されているペプチドを、ＤＭＦ中のＴＢＴＵ（１当量）および対応する酸（１当量）と共に、１５分間攪拌した。溶液は、精製のために、ＨＰＬＣ内に直接注入した。

アミノ酸合成
Ｎ^α−Ａｌｌｏｃ−Ｎ^ε−Ｂｏｃ−Ｌ−オルニチン
Ｎ^ε−Ｂｏｃ−Ｌ−オルニチン（１．００ｇ、４．３ｍｍｏｌ）を、水およびＴＨＦ（５０ｍｌ、１：１、ｖ／ｖ）中のＮａ_２ＣＯ_３（１．１４ｇ、１０．７５ｍｍｏｌ）の溶液に溶解させた。クロロギ酸アリル（０．４６ｍｌ、４．３ｍｍｏｌ）の添加後、溶液を１．５ｈ攪拌した。ＴＨＦを、減圧下で蒸発させた後、水相をジエチルエーテルで洗浄し（１×５０ｍＬ）、ｃｏｎｃ．ＨＣｌでｐＨ１まで酸性化し、生成物をＥｔＯＡｃで抽出した（３×５０ｍＬ）。有機層を合わせて乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、ろ過、濃縮した後、真空中で乾燥させて、無色、粘着性の油を、十分に純粋な生成物として得た（１．２０ｇ、９０％）。

Ｎ^α−Ａｌｌｏｃ−Ｎ^ε−Ｆｍｏｃ−Ｌ−オルニチン
Ｎ^α−Ａｌｌｏｃ−Ｎ^ε−Ｂｏｃ−Ｌ−オルニチン（１．２０ｇ、３．８７ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解させ、ＴＦＡ（５ｍＬ）をゆっくり添加した。４５分間攪拌した後、液体を蒸発させた。

粗生成物を、水およびＴＨＦ（４０ｍｌ、１：１、ｖ／ｖ）中のＮａ_２ＣＯ_３（１．０２ｇ、９．６８ｍｍｏｌ）の溶液に溶解させた。Ｆｍｏｃ−Ｎ−オキシスクシンイミド（１．３１ｇ、３．８７ｍｍｏｌ）の添加後、溶液を１．５ｈ攪拌した。ＴＨＦを、減圧下で蒸発させた後、水相をジエチルエーテルで洗浄し（１×５０ｍＬ）、ｃｏｎｃ．ＨＣｌでｐＨ１まで酸性化し、生成物をＥｔＯＡｃで抽出した（３×５０ｍＬ）。有機層を合わせて乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、ろ過、濃縮した後、真空中で乾燥させて、無色の固体を、十分に純粋な生成物として得た（１．６５ｇ、９７％）。

反応スキームを以下に示す。

１．２．１．２ ペプチドの放射ヨウ素化標識
ＣＰＣＲ４を、Ｉｏｄｏｇｅｎの方法を使用して、^１２３Ｉ−ヨウ化物、^１２４Ｉ−ヨウ化物、または^１２５Ｉ−ヨウ化物で標識した［２］。０．２ｍｇのペプチドを、２５０μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中に溶解させた。この溶液を、１５０μｇのＩｏｄｏｇｅｎでコートしたＥｐｐｅｎｄｏｒｆ製のカップに添加し、放射性ヨウ化物の溶液と組み合わせた。室温での１５分後、溶液を、固体の酸化試薬から取り出した。精製を、勾配ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して行った。放射化学純度は、通常、＞９５％であった。動物実験のために、放射性標識ペプチドを含有する画分を、水で希釈し、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カラムに結合させた。その後、カラムを、水で洗浄し、放射性標識ペプチドを、メタノールで溶出させた。メタノールを真空中で除去した後、残渣を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に溶解させて、希釈した。４℃で保存するために、溶液を、２０％エタノールを含有するＨ_２Ｏ中の０．１％トリフルオロ酢酸で酸性化した。

１．２．１．３ 親油性
親油性を決定するために、５００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．４〜２．７μＣｉの^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４を、５００μｌのオクタノールと混合し、激しくボルテックスした。定量的な相分離のために遠心分離した後、各相から１００μｌを取り出し、放射活性をガンマカウンター中で決定した。実験は、三つ組みで行い、独立に２回繰り返した。

１．２．１．４ 細胞系および組織培養
マウス線維肉腫細胞系ＣＭＳ５［３］およびヒト２９３Ｔ細胞系［４］（Ｒ．Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｕｍｏｕｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｉｅｌ ｄｅｎ Ｈｏｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ、オランダから、御厚意による提供を受けた）の両方を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＰＡＡ，Ｌｉｎｚ、オーストリア）および１％（ｖ／ｖ）Ｌ−グルタミンを補ったダルベッコ変法イーグル培地中で培養した。Ｔリンパ球ジャーカット細胞系（ＡＴＣＣ）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および１％（ｖ／ｖ）Ｌ−グルタミンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した。別段の言及がない限り、培地および補助剤は、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ（Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）から得た。

１．２．１．５ レトロウイルスベクターの構築および標的細胞の形質導入
高感度蛍光タンパク質をコードするｃＤＮＡを、ｐＥＧＦＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ドイツ）から、ＮｃｏＩ ＳｔｕＩ消化によって切り取り、クレノウ酵素を使用して平滑末端化した後、ｐＩＲＥＳｎｅｏ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ドイツ）の特有のＳｍａＩ部位に挿入して、ｐＩＲＥＳｅＧＦＰｎｅｏ３を得た。次の工程で、ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰを運ぶＮｏｔＩ断片を、ｐＢｕｌｌｅｔのＮｏｔＩ部位内にクローン化して（Ｓｈａｆｔら、２００３年）、ｐＢｕｌｌｅｔＩＲＥＳｅＧＦＰを得た。（Ｂ．Ｍｏｓｅｒ、Ｂｅｒｎから、御厚意により提供を受けた）ヒトケモカイン受容体４型（ＣＸＣＲ４）のｃＤＮＡを運ぶｐｃＤＮＡ３ＣＸＣＲ４［５］の１２９２ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ ＸｂａＩ断片を単離し、すべての部位をクレノウ酵素を用いて平滑末端化した後、レトロウイルスベクターｐＢｕｌｌｅｔＩＲＥＳｅＧＦＰのＢａｍＨＩ部位内にクローン化した。得られたベクターは、ｐＢｕｌｌｅｔＣＸＣＲ４−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰと名付けた。２９３Ｔ細胞の一過性の形質移入およびＣＭＳ５細胞の形質導入によるレトロウイルスの産生は、他所に記載されている［６］。

１．２．１．６ ＦＡＣＳによる分取および分析
トリプシン処理した細胞のＥＧＦＰおよびＣＸＣＲ４の発現を、４８８ｎｍでの４０ｍＷの励起エネルギーのＡｒｇｏｎ Ｌａｓｅｒビーム（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）を使用する蛍光活性化セルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。ＥＧＦＰの発現は、ＦＬ１（５３０／３０ｎｍ）フィルターを使用して、直接測定した。死滅細胞は、ヨウ化プロピジウムを細胞に添加することによって決定し、蛍光は、ＦＬ２ ５８５／４２ｎｍフィルターを使用して決定した。死滅細胞の割合は、常時、≦０．２％であった。ＣＸＣＲ４を発現するＣＭＳ５細胞の集団を、ＣＸＣＲ４−ＥＧＦＰ同時発現細胞を、ＦＬ１を用いて、２０の最小蛍光でえり分けることによって濃縮した。

トリプシン処理細胞の細胞表面上のＣＸＣＲ４の発現を、ヒトＣＸＣＲ４に対する特異性を有するフィコエリトリン（ＰＥ）標識モノクローナルラット抗体（１Ｄ９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を使用して決定した。トリプシン処理細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＦＣＳ）で洗浄し、１×１０^６個の細胞を、０．５μｇの抗体で暗所にて４℃で３０分間染色した。細胞を、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で広範囲に洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。非特異的染色を、ＰＥ標識ラットＩｇＧ２_ｂ，κ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）によって評価した。細胞表面上ＣＸＣＲ４の検出は、ＥＧＦＰと同一の試料において行い、ＣＸＣＲ４を、５７６／２６ｎｍのフィルター（ＦＬ２）を使用して検出した。ＣＸＣＲ４染色を、ＥＧＦＰの蛍光（ＦＬ１）に対してプロットした。

示された細胞の場所は、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）を補った培地中に再懸濁し、組換えヒト１００ｎＭ ＳＤＦ−１α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ドイツ）と共に、３７℃で１時間インキュベートした（以前に公開されたプロトコールを改変した）［７、８］。対照は、希釈液（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ）と共にインキュベートした。試料は、直ちに氷に移して、さらなる内在化を回避し、遠心分離した後、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで洗浄し、ＣＸＣＲ４に対するＦＡＣＳ染色を、上記に従って行った。

１．２．１．７ 受容体結合アッセイ
受容体結合アッセイのために、細胞を、ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ中に再懸濁した。４００，０００個の細胞（ジャーカット、ＣＭＳ５）または２００，０００個の細胞（ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４）を含有する全量２００μｌの懸濁液を、２５μｌのトレーサー溶液（３．１ｋＢｑ、約０．１ｎＭを含有する）、および２５μｌの希釈液または異なる濃度の競合相手と共にインキュベートした。ＩＣ_５０値を決定するために、^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４を、トレーサーとして使用した。ＳＤＦ−１αは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ドイツ）から得、^１２５Ｉ−ＳＤＦ−１αは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ、マサチューセッツ州、米国）から購入した。飽和曲線のために、トレーサー濃度を、５から５００ｐＭまで変化させ、一方非特異的結合は、１μＭの冷ＣＰＣＲ４の存在下で決定した。室温で２時間振とうした後、インキュベーションを、７００×ｇおよび４℃で４分間遠心分離することによって終了させた。細胞ペレットを、冷ＰＢＳで１回洗浄した後、第２の遠心分離の工程、または内在化研究のためには酸性の洗浄緩衝液（２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０）での２回の洗浄を行った。細胞結合放射活性を、ガンマカウンターを使用することによって決定した。実験は、二つ組みまたは三つ組みで２〜３回繰り返した。結合曲線のＩＣ_５０値は、Ｐｒｉｓｍ３．０（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を使用して、一部位または二部位の競合に基づくモデル上での非線形回帰によって計算した。Ｋ_ＤおよびＢｍａｘの値は、Ｐｒｉｓｍ３．０を用いてメーカーのプロトコールに従って、非線形回帰によって決定した。

１．２．１．８ ｉｎ ｖｉｖｏ研究
動物実験のために、ＣＭＳ５親細胞およびＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４形質導入細胞を、雌のＳｗｉｓｓ ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、フランス）中に皮下注射した。したがって、各マウスのために、１．５×１０^６個のＣＭＳ５細胞および２×１０^６個のＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞のそれぞれを、７５μｌのＰＢＳ中に再懸濁させて、同一容量のＭａｔｒｉｇｅｌ−Ｍａｔｒｉｘ ＨＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）と、メーカーのプロトコールに従って混合した。その後、細胞懸濁液をそれぞれ、各肩部に接種した。腫瘍増殖１４〜１６日後、マウスを、画像化および体内分布のために使用した。すべての動物実験は、地方自治体により承認されており、機関のガイドラインに従っている。

１．２．１．９ 体内分布研究
３７０ｋＢｑ（１０μＣｉ）の^１２５Ｉ標識ＣＰＣＲ４を、腫瘍を有するマウスの尾部の静脈内に静脈注射した。トレーサー注射の３０、６０および１２０分後に、マウスを堵殺して、解剖した。対象の臓器を取り出し、重量測定した組織試料中の放射活性を、Ｗａｌｌａｃ製（Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）製の１４８０ Ｗｉｚａｒｄ３ガンマカウンターを使用して測定した。結果は、組織重量１グラムあたりの注射用量のパーセント（％ＩＤ／ｇ）として表す。各値は、４匹から６匹の動物の平均値を示す。

１．２．２ 結果
１．２．２．１ ＣＰＣＲ４の合成および放射性標識
ＣＸＣＲ４受容体に対して高い親和性および選択性を示すＣＰＣＲ４、すなわち、環状ペンタペプチド

の合成を、以前の記載に従って、酸に不安定な塩化トリチル樹脂上で、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成のプロトコールを使用することによって実施した［１、２］。Ｎ−アルキル化による追加の改変を、Ｆｕｋｕｙａｍａ−Ｍｉｔｕｎｏｂｕ反応を介するＮ−メチル化のために設計した改変プロトコールを使用して行った［１４］。ペプチド鎖の組立ての後、側鎖が保護されているペプチドを、樹脂から切断し、ＤＰＰＡ法を使用して環化した［２］。すべての保護基を除去した後、粗環状ペンタペプチドを、分取用ＨＰＬＣによってさらに精製した。分析用のＨＰＬＣおよびＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳによる分析によって、当該ペプチドの均一性および同一性が証明された。

ＣＰＣＲ４のＴｒｙ側鎖における放射性標識を、^１２３Ｉ−ヨウ化物または^１２５Ｉ−ヨウ化物のいずれかを用いて、Ｉｏｄｏｇｅｎの方法を使用して行い、その後、未標識の前駆体を、ＨＰＬＣによって分離した。適用したＨＰＬＣの条件では、放射ヨウ素標識ペプチドを、未標識の前駆体および副産物から、非常に効率的に分離することができ、したがって、高い放射化学純度（＞９９％）および特異的な活性を得た。標識ペプチドの特異的な活性は、標識するのに使用した放射性ヨウ化物の活性であると思われた（^１２５Ｉの場合、＞２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、^１２３Ｉの場合、＞５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。放射性ヨウ化物の取込みは、通常、＞９５％であったが、ＨＰＬＣによる精製および生体適合性の製剤化の後の^１２３Ｉ−標識ペプチドおよび^１２５Ｉ−標識ペプチドの放射化学的な全収率は、５０％程度であった。ＰＢＳ中での生体適合性の製剤化後、^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の親油性を、オクタノール／水（ＰＢＳ）分配係数として決定した。−０．０４（±０．０１）のｌｏｇＰ値を得た。

１．２．２．２ ＣＸＣＲ４ベクターの構築およびウイルス感染
マウス線維肉腫細胞系ＣＭＳ５に、ＣＸＣＲ４−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰを、レトロウイルスによって形質導入した。細胞プールにおいて、ＦＡＣＳ分析によって１３０の平均蛍光強度で決定した場合、ＣＸＣＲ４をレトロウイルスによって形質導入したＣＭＳ５細胞のうちの７０〜８０％が、ｅＧＦＰ発現陽性であった。増殖曲線および生存アッセイ（ＸＴＴ）から、両方の細胞系が、ｉｎ ｖｉｒｔｏにおいては、類似の増殖の動態を有することが実証された（データを表示せず）。ＣＭＳ５細胞およびＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞を、ヒトＣＸＣＲ４について染色すると、ＣＭＳは、２．２％のバックグランド染色を示したが、ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞の６１．６％が、ヒトＣＸＣＲ４に対して陽性に染色され、６６の平均蛍光強度を示し、それらの細胞の５７．９％が、ＣＸＣＲ４およびｅＧＦＰの両方に対して陽性であった。（図１）反復ＦＡＣＳ分析によって示されたように、細胞系は、時間が経過しても安定であった（データを表示せず）。

１．２．２．３ 受容体結合研究
^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の新規ＣＸＣＲ４放射性リガンドとしての適切性を、最初に、ＣＸＣＲ４受容体を内因性に発現するジャーカット細胞［９、１０］において、次に、ＣＸＣＲ４を発現するようにレトロウイルスによって形質導入したＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞において試験した。両方の細胞系で、再現性のある特異性の高い結合が、^１２５Ｉ−ＳＤＦ−１α（５０〜７０％）および^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４（＞９０％）を使用することによって見出された。ＣＭＳ５親細胞においては、両方のトレーサーは、ジャーカット細胞および形質導入ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞の非特異的結合の範囲のごくわずかな結合しか示さなかった。飽和曲線からは、サブナノモルの範囲のほぼ同一のＫ_Ｄ値（０．３から０．４ｎＭ）が、両方の細胞系から得られ、これは、^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４のＣＸＣＲ４受容体に対する高い親和性を示している。（図２および関連する表Ａ）さらに、高い数の^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４結合部位（Ｂｍａｘ）が決定された。ジャーカット細胞の場合、Ｂｍａｘ値は、起源により依存性であり、培養条件によって強く変動したが、ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞上の結合部位の数（Ｂｍａｘ）は一定であり、再現性がより良好であった（２３±６ｆｍｏｌ受容体タンパク質）。

新規放射性リガンドとしての^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４を用いて、明確なＣＸＣＲ４選択性リガンドの親和プロフィールが、競合的放射性リガンド結合アッセイにおいて確認された。（図２、表Ｂ）ＳＤＦ−１α、ＣＰＣＲ４、およびその非放射性のヨウ素化参照化合物であるＩｏｄｏ−ＣＰＣＲ４について、ナノモルのＩＣ_５０値を有する高い親和性が、ＣＸＣＲ４受容体において、^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４または^１２５Ｉ−ＳＤＦ−１αのいずれかに関して見出された。ＳＤＦ−１αおよび環状ペンタペプチドと比較して、ＣＸＣＲ４選択性バイサイクラムＡＭＤ３１００は、両方のトレーサーとの低下した親和性を示した。トレーサーおよび競合相手によって、２種のＣＸＣＲ４結合部位を、以前の報告に従ってモニターした［９］。結合曲線の分析のために、一部位競合曲線フィットおよび二部位競合曲線フィットを、必要に応じて使用した。得られた高親和性結合部位および低親和性結合部位を、（１）および（２）として示した（図２、表Ｂ）。

^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４がＣＸＣＲ４受容体において結合した後の受容体の内在化を、酸性緩衝液（ｐＨ５．０）を用いた２回の短い洗浄工程後に分析した。その後も、トレーサーは、大部分は受容体から放出可能であった（＞８０％）。これは、受容体アゴニストから予想されるように、受容体の内在化が生じないことを示している（データを表示せず）。

１．２．２．４ 受容体の機能性
ヒトＣＸＣＲ４が、マウス細胞において機能性であるか否かを決定するために、細胞を、ヒトＳＤＦ−１αと共にプレインキュベートし、表面ＣＸＣＲ４について染色した後、ＦＡＣＳ分析を行った。対照処置細胞の７９．２％に対して、ヒトＳＤＦ−１αと共にプレインキュベートした後、ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞の５４．７％がＣＸＣＲ４に対して陽性に染色され、これは、ヒト受容体がマウスＣＭＳ５細胞において機能性であることを示している。ＣＭＳ５細胞におけるＣＸＣＲ４バックグランド染色は、ＳＤＦ−１αの存在下で、７．９から２．７％に減少した。ジャーカット細胞は、陽性の対照としての役目を果たし、陽性細胞パーセントの減少は示さなかったが、平均蛍光強度が３８５．４から１５５．４に低下した。ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞においては、平均蛍光強度は、偽処置した細胞の２０９．０からＳＤＦ−１αで処置した細胞の８０．５へ低下した。これは、ジャーカット細胞は、ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４細胞よりも、より多くのＣＸＣＲ４受容体を含有することを示している。

１．２．２．５ ｉｎ ｖｉｖｏにおける研究
^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の体内分布および腫瘍における蓄積を、ＣＭＳ５腫瘍およびＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４腫瘍を有するヌードマウス中に注射３０、６０および１２０分後に決定した。ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４腫瘍においては、^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の腫瘍における最も高い腫瘍蓄積を、６０分後に達成し、１グラムあたりの注射用量の５．５（±１．５）パーセント（％ＩＤ／ｇ）であったが、ＣＭＳ５親腫瘍においては、この時点で、わずかに０．６（±０．２）％ＩＤ／ｇを観察したにすぎない。^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４は、ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４腫瘍においては、３０分後では、４．７（±１．３）％ＩＤ／ｇ、および１２０分後では、３．８（±１．４）％ＩＤ／ｇの蓄積を示す。すべての時点において、より高いトレーサーの蓄積を、肝臓、腸および腎臓に関してのみ観察した。その他の臓器は、非常に低いバックグランドの蓄積を示したにすぎない。肝臓では、^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４の蓄積は、時間の経過と共に、３０分後の２７．７（±４．９）％ＩＤ／ｇから１２０分後の１５．０（±１．８）％ＩＤ／ｇに減少したが、腸では、トレーサーの蓄積は、３０分後の１６．０（±４．７）％ＩＤ／ｇから１２０分後の１９．２（±４．５）％ＩＤ／ｇにわずかに増加し、これは、これらの臓器における代謝過程を示している。腎臓では、トレーサーの蓄積は、６０分後に１２．２（±２．３）％ＩＤ／ｇのピークを示し、１２０分後には８．２（±１．１）％ＩＤ／ｇまで減少した（図３および表）。

図４は、ＣＸＣＲ４に対して陽性（ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４）および陰性（ＣＭＳ５対照）の両方の腫瘍を有するマウスにおける放射ヨウ素化標識ＣＰＣＲ４の分布についてのＰＥＴ／ＳＰＥＣＴの結果を示す。２種類の腫瘍のＣＰＣＲ４の取込みの差による明確な描写を観察することができる。ＭＲＩの結果を、比較のために示す。ＣＸＣＲ４陽性腫瘍は、注射２５時間後でさえも、ＰＥＴによって認識可能であった。同様の結果を、^１８Ｆ標識放射性リガンドを用いたＰＥＴを使用した場合および^１２３Ｉ標識を用いたガンマカメラを使用した場合にも得た。同様に、腫瘍の凍結切片のマイクロイメージャーを使用したｅｘ ｖｉｖｏにおける分析では、放射線の顕著な差を、陽性腫瘍と陰性腫瘍との間で認めることができた。

（実施例２）
ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体の発現を標的にする環状ペプチドの開発
ＨＩＶ−１感染、癌の転移、関節リューマチおよび慢性リンパ球性Ｂ細胞白血病のような、いくつかの疾患が、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体の天然リガンドとの相互作用に結び付けられている。この天然リガンドは、６８個のアミノ酸を含有するタンパク質である、ストロマ細胞由来因子１α（ＳＤＦ−１α）である［１１］。これらの疾患を治療するための１つの戦略として、小型のＣＸＣＲ４アンタゴニストを用いて、ＣＸＣＲ４とＳＤＦ−１αとの間の相互作用を遮断することができるであろう。さらに、適切な化合物を適切な放射性アイソトープで放射性標識することによって、ＰＥＴによってｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＸＣＲ４の発現を画像化するための薬剤を提供することができるであろう。

ＣＸＣＲ４アンタゴニストに関するＦｕｊｉｉらによる以前の研究は、配列

を有する、高い親和性の環状ペンタペプチドＣＰＣＲ４に至った［１］。この構造を、さらに改善するために、代謝安定性、生物学的利用率、立体硬直性、放射性標識のための化学的な多様性に関して、異なるアプローチが選ばれている。

最初に、立体的な動きやすさに影響を及ぼすため、および代謝安定性および生物学的利用率を高めるために、骨格アミドのＮ−メチルスキャンを行った。アルギニン残基をＮ^α−メチル化して、有用な親和性を有するペプチドを得た（ＩＣ_５０値がそれぞれ、（Ｎ−Ｍｅ）Ａｒｇ^３の２３ｎＭ、および（Ｎ−Ｍｅ）のＡｒｇ^４の３１ｎＭであった。ただし、Ａｒｇ残基に、先行する段落に記載した配列中の残基の位置に従って番号を付けた）。一方、その他のアミノ酸のＮ−メチル化は、親和性を顕著に低下させた（ＩＣ_５０＞１００ｎＭ）。Ａｒｇ^３をオルニチンで置換することによって、親和性は、ほとんど保持された［１２］。Ｏｒｎのデルタ−アミノ基を、存続期間の短いアイソトープを含有する、放射性標識した基によってアルキル化またはアシル化することができる。さらに、２個のグアニジノ基の高い塩基性を減少させることができると思われるので、生物学的利用率は改善されるはずである。オルニチンがアシル化された最初の誘導体は、１１ｎＭと３５ｎＭとの間のＩＣ_５０値を示し、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰＥＴ画像化のための小型のＣＸＣＲ４アンタゴニストの^１８Ｆによる放射性標識を初めて可能にした。下記のパネルは、Ｏｒｎが、ＦＢ、ＦＰ、ＡｃおよびＡｍのそれぞれでデルタ−Ｎ置換されている環状Ｏｒｎ含有ペンタペプチドを用いて得られた結果を示す。

種々のＣＸＣＲ４アンタゴニストの親和性

Ｎ^α−モノメチル化環状ペンタペプチドを用いた結合アッセイ（Ｎ^α−メチルスキャン）の結果を、下記の表１に示す（以下の表中、＞２５０ｎＭのＩＣ_５０値を有する、したがって、本発明の第１から第３の態様の範囲内に属さないペプチドが、比較のために含まれており、ＩＣ_５０値の後に＊が付いていることに留意されたい）。

ＯＤ１

の構造を、以下に示す。

これらの結果から、Ａｒｇ残基をメチル化した場合、親和性の損失は、わずか１／５〜１／１０にすぎないことを観察することができる。その他の残基をメチル化した場合には、損失はより大きくなる。

Ｎ^α−ジメチル化ペンタペプチドを用いた対応する結果を、下記に示し（表２）、これは、そのような改変からのさらなる親和性の損失を示している。

Ａｒｇを、オルニチンまたはシトルリンで置換したペンタペプチドを用いた結合アッセイの結果を、下記の表３に示す。

表３の結果は、環状ペンタペプチド中の第１のＡｒｇ残基が、親和性の劇的な損失を伴うことなく、オルニチン等のカチオン性の残基で置換することができることを示している。

^１８Ｆを含有する補欠分子基の取込みに関する、側鎖をアシル化したオルニチン誘導体の評価においては、フルオロベンゾイル化誘導体が最も高い親和性を示すことが見出された（１１ｎＭ、上のパネルを参照）。この化合物は、比較的高い親油性を示した（ＬｏｇＰ １．０６）。

また、Ｎ^δスペーサー部分を有する一連の誘導体をはじめ、いくつかのその他のＯｒｎ−Ｎ^δ改変ペンタペプチドおよび／またはＯｒｎ−Ｎ^α改変ペンタペプチドも調製した。ＣＸＣＲ４結合の結果を、表４に示す。

その上、Ｄ−Ｏｒｎの誘導体を含有する一連のペンタペプチド、さらにＢがＨｉｓまたはＰｈｅであるペンタペプチドも調製した。ＣＸＣＲ４結合の結果を、表５に示す。

Ａｌａまたは類似の残基を鎖中に挿入した、いくつかの環状ヘキサペプチドを、ＣＸＣＲ４に対する結合親和性について試験した。結果を、表６に示す（注：Ｄａｐ（ＦＰ）は、（Ｎ−フルオロプロピオニル）−ジアミノプロピオン酸）。

表６の結果は、親和性を中等度に損失するだけで、Ａｌａを、ＮａｌとＧｌｙとの間に挿入することができ、かつ／またはＧｌｙを、Ａｌａで置換することができることを示唆している。この位置にその他の残基を挿入しても、その他の位置に表６中の研究した残基のいずれかを挿入しても、良好な耐用性を示さなかった。

さらなるＮ^α−メチルスキャンを、一連の環状ヘキサペプチドを用いて行い（Ｎ−モノ−、ジ−およびトリメチル化）、表７に報告する。

これらの結果は、環状ヘキサペプチドのＮ^α−メチル化後の結合親和性の相当な損失を示している。ただし、Ｎ−メチル−Ｄ−Ｔｙｒヘキサペプチドは、その他の誘導体の大部分のようには、そのような親和性の顕著な損失を被ることはなかった。

標識のための補欠分子基の結合に関してより多くの柔軟性を与えるために、アミノ基の導入を、ＣＰＣＲ４中のＧｌｙ残基をＤａｐで置換することによって調査した。結果（表８）は、このように置換しても、親和性を中等度に損失するにすぎないことを示している（注：ＦＰ：２−フルオロプロピオニル；ＦＢ：４−フルオロベンゾイル）。

ＣＰＣＲ４または本明細書に記載するその他のペプチドのその他の可能な改変として、対応する^１８Ｆ標識化合物に対する類似体としての、Ｎａｌをその他のフッ素含有芳香族部分で置換したものが含まれる。例：

ＡＭＳ（ＦＢ）は、アミノオキシ−セリン部分と４−フルオロベンズアルデヒドとのオキシムである。

蛍光ＣＸＣＲ４リガンドの開発のためには、Ｎａｌを、Ｄａｐ（ＮＢＤ）（ＮＢＤは、７−ニトロ−１，２，３−ベンゾオキサジアゾールである）等の蛍光Ｄａｐ誘導体で置換することが可能である。この誘導体は、ＣＰＣＲ４と比較すると低下した親和性を示すが、ＦＡＣＳ分析からの結果は、そのようなリガンドは、それでも、そのような技法によるＣＸＣＲ４の発現の調査に適切であることができることを示唆している。

（実施例３）
ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体発現の、ペプチドに基づいたＰＥＴプローブおよびバイオルミネセンスを用いた多様式分子画像化
腫瘍細胞の転移および臓器特異的なホーミングにおける１つの重要な役割を、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４およびその内因性リガンドＳＤＦ−１αが担っている。ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＣＸＣＲ４の発現を標的とするために、我々は、放射性標識環状ペプチドであるＣＰＣＲ４を開発した。^１２５Ｉ−ＣＰＣＲ４は、最初のＰＥＴ画像化のプローブであり、これは、ＣＸＣＲ４に高い親和性で結合し（Ｋ_Ｄ＝０．４ｎＭ）、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＣＸＣＲ４を発現する腫瘍中での高い蓄積を示し（５．５％ＩＤ／ｇ、注射１ｈ後）、ＣＸＣＲ４陽性腫瘍の明確な描写を可能にする。

腫瘍の発展を受容体発現と相関させるため、および非放射性標識プローブを使用する潜在的な治療介入を多様式（バイオルミネセンスおよび核）画像化によってモニターするために、腫瘍細胞には、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）が形質導入されている。ＣＸＣＲ４およびｌｕｃ、またはそうでなければ、対照として、ｌｕｃもしくはｅＧＦＰのみの遺伝子を含有するレンチウイルスベクターを、構築した。これらのベクターは、マウスＣＭＳ５線維肉腫細胞の安定な形質導入に良好に使用された。ＣＭＳ５／ＣＸＣＲ４／ｌｕｃ細胞上でのＣＸＣＲ４の表面発現を、放射性リガンド結合アッセイおよびＦＡＣＳ研究において調査した。ＣＰＣＲ４結合の高い親和性および特異性、ならびにｌｕｃの機能性の発現が、細胞アッセイにおいて確認された。形質導入した細胞を、ヌードマウス内に皮下注射した。マウスを、放射性標識ＣＰＣＲ４およびバイオルミネセンス（ｌｕｃ）／蛍光（ｅＧＦＰ）による画像化を使用するμ−ＰＥＴを使用して分析した。ｅｘ ｖｉｖｏにおける分析を、オートラジオグラフィー、バイオルミネセンス測定、および免疫組織化学によって行った。ＣＰＣＲ４結合をよりよく理解するため、および改善された薬物動態を有するリガンドを設計するために、新たに提案されたＣＸＣＲ４受容体モデルが開発されており、現在は、それを、ＣＸＣＲ４受容体の変異体を調査することによって検証する。このコンピュータモデルに基づいて、トレーサーの最適化およびその他の標識の選択肢の調査のために、ＣＰＣＲ４誘導体の構造活性相関についての研究を行う。

結論として、このアプローチによって、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＸＣＲ４の発現の画像化が可能になり、かつ腫瘍の転移の可能性を非侵襲的に調査するのに用いる、および個人に合わせた治療法のためにＣＸＣＲ４の発現を決定するのに用いる高感度の画像化のプローブの開発が可能になる。

（実施例４）
ＣＸＣＲ４結合環状オリゴペプチドとキレート化剤との間の複合体の調製
当業者であれば、本発明の環状オリゴペプチド、適切なスペーサー部分（好ましくは、本明細書に記載するリンカー部分のうちの１つ）、およびキレート化剤または放射性金属の錯体形成に適したその他の部分からなる構築物または複合体を容易に調製することができるであろう。典型的には、近年、多数の刊行物に記載されているように、ＤＯＴＡを、例えば、リンカーを有する、完全に保護されているオリゴペプチドに、標準的な活性化の手順を使用するトリ−保護（例えば、トリ−ｔｅｒｔ−ブチル保護）ＤＯＴＡを使用して、あるいはＤＯＴＡのあらかじめ活性化されている種、例えば、ＤＯＴＡのモノ−、ジ−、トリ−もしくはテトラＮ−スクシンイミジルエステルまたは４−ニトロフェニルエステルを使用してのいずれかで結合させる。別法として、標準的なペプチド結合条件を使用して、この目標を達成することもできる。

同様に、ＴＥＴＡまたはＤＴＰＡ等のその他のキレート化剤／錯体形成部分を結合させることができる。また、ＤＴＰＡを、環状ｂｉｓ−無水物を使用して結合させることもできる。明らかに、キレート化剤をスペーサーにあらかじめ結合させ、したがって、最終工程でペプチド−スペーサー結合を形成させることもまた可能である。

また、当業者であれば、十分に記載されている、放射性医薬品の分野で確立されている結合の手順を使用して、この結合を達成することもできる。オキシムまたはヒドラゾンの形成等、その他の結合の経路、ならびにチオールとマレイミドとの反応等、その他の選択的な方法を使用しても、同様な結果に至ることができる。

上記の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明することを意図しており、本発明の範囲を限定する意図はなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されている。本明細書に引用したすべての文書は、参照によって、それらの全内容が本明細書に組み入れられている。

参照文献

Claims (1)

1. 本願明細書に記載された発明。

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