JP2013116122A - 濃縮された液体酵素添加剤の安定化 - Google Patents

Abstract

【課題】安定化された新規な酵素組成物の提供。
【解決手段】本発明は、1.5g/L以上の量で存在する酵素、ホウ素酸又はその誘導体、及び界面活性剤を含んで成る濃縮された液体酵素添加剤に関する。添加剤は、液体洗剤組成物において使用される。
【選択図】なし

Description

発明の分野：
本発明は、濃縮された液体酵素添加剤の沈殿を防ぐための安定化に関する。本発明はさらに、前記液体酵素添加剤の製造方法に関する。

発明の背景：
貯蔵安定性の問題は、酵素含有液体において良く知られている。特に酵素含有液体洗剤においては、特に洗剤がプロテアーゼを含む場合、時間にわたって安定した酵素活性を確保することが主要問題である。
従来技術は、例えばプロテアーゼを添加することにより、貯蔵安定性の改良を広範囲に対処して来た。

ホウ酸及びホウ素酸は、タンパク質分解酵素を可逆的に阻害することが知られている。１つのセリンプロテアーゼ、スブチリシンのホウ素酸による阻害の論議が、Molecular & Cellular Biochemistry 51 , 1983, pp. 5-32に提供されている。

ホウ素酸は、スブチリシンインヒビターとしての非常に異なった能力を有する。アルキル基、例えばメチル、ブチル又は２−シクロヘキシルエチルのみを含むホウ素酸は、最も不良なインヒビターとしてメチルホウ素酸を有する不良インヒビターであるが、ところが芳香族基、例えばフェニル、４−メトキシフェニル又は３，５−ジクロロフェニルを担持するホウ素酸は、特に効果的インヒビターとして３，５−ジクロロフェニルホウ素酸を有する良好なインヒビターである（Keller など, Biochem. Biophys. Res. Com. 176, 1991 , pp. 401-405を参照のこと）。

ホウ素に対して３−位置で置換を有するアリールホウ素酸が思いがけなく良好な可逆的プロテアーゼインヒビターであることもまた主張されている。特に、アセトアミドフェニルホウ素酸が、タンパク質分解酵素の卓越したインヒビターであることが主張されている（WO92/19707号を参照のこと）。EP0832174号においては、フェニルホウ素酸に隣接する>0=0によりパラ位置で置換されたフェニルホウ素酸誘導体が、液体において酵素安定剤として特別に良好な能力を有することが見出された。

しかしながら、酵素の安定化問題を解決することにより、もう１つの問題が出現している。ホウ素酸又はホウ素酸誘導体、例えば４−ホルミルフェニルホウ素酸（４−FPBA）を、酵素を安定化するために液体酵素添加剤に使用する場合、天然において所望しない副作用である沈殿物が、調製の間、及び貯蔵に基づいて形成されることが発生する。

発明の要約：
従って、本発明の目的は、酵素、及び調製の間、及び貯蔵に基づいて、沈殿物を形成しない、ホウ素酸又はその誘導体を含んで成る液体酵素添加剤を供給することである。本発明のさらなる目的は、沈殿物の最少形成を伴って、前記液体酵素添加剤を製造するための方法を提供することである。液体酵素添加剤への界面活性剤の添加が、貯蔵の間に形成される沈殿物の量を有意に低めることが驚くべきことに見出された。

従って、本発明は、本発明の第１の観点においては、1.5g/L以上の量で存在する酵素、フェニルホウ素酸又はその誘導体、及び界面活性剤を含んで成る濃縮された液体酵素添加剤を提供する。
本発明は、第２の観点においては、
i）液体酵素調製物を供給し；
ii）i）の液体を、ホウ素酸又はその誘導体と共に混合し；
iii）前記液体酵素添加に、界面活性剤を、段階ii）の前又は後、添加するか、又はホウ素酸又はその誘導体と一緒に添加する段階を含んで成る、濃縮された液体酵素添加剤の製造方法を提供する。
本発明はさらに、前記濃縮された液体酵素添加剤の使用に関する。

発明の特定の記載：
定義：
HLB値：
HLB（親水性−親油性バランス）値は、１〜20の指数である。

HLBシステムは、分子構造が提供するであろう界面活性剤性質のタイプを予測するための半−実験的方法である。HLBシステムは、いくつかの分子が親水性基を有し、他の分子が親油性基を有し、そしていくつかが両者を有する概念に基づかれる。分子上の又は混合物における個々のタイプの基の重量百分率は、分子構造が示す挙動性を予測する。油中水乳化剤は、典型的には約４の低いHLB数を有する。溶解剤は、高いHLB数を有する。水中油乳化剤は、中間〜高いHLB数を有する。

HLBは、W.C. Griffin, "Calculation of HLB Values of Non-Ionic Surfactants," Journal of the Society of Cosmetic Chemists 5（1954）: p249により記載されるような親水基−親油基バランスである。

界面活性剤：
界面活性剤として作用する化学物質。この用語は、乳化剤、分散剤、油−湿潤剤、水−湿潤剤、発泡剤及び脱泡剤として機能する多数の材料を包含する。乳化剤又は分散剤又は他のものとして作用する界面活性剤挙動性の型は、分子（又は分子の混合物）上の構造基に依存する。

pH：
本発明においては、pHは、RadlometerからのpH計測器PHM93、及びRoss（商標）セミ−ミクロ組合わせpH電極（Orion 8103SC）を用いて測定された。使用される前、pH電極は、Radlometer Analyticalからの標準緩衝液（pH4.005オーダー番号：S11M002；pH7.000オーダー番号：S11M004及びpH10.012オーダー番号：S11M007）を用いて検量された。pH、室温（23℃）で測定された。

酵素濃縮物：
酵素濃縮物は、液体の除去及び/又は所望しない材料の除去のために暴露された酵素発酵ブイヨンである。
濃縮された液体酵素添加剤：
濃縮された液体酵素添加剤は、最終製品、例えば洗剤の製造において原料又はプレミックスとして使用されるべき製品である。濃縮された液体酵素添加剤は、次において、液体酵素塩化剤又は濃縮された液体酵素添加剤として言及される。

序論：
液体洗剤におけるプロテアーゼ安定剤としてのホウ素酸及びその誘導体の使用は、問題を引起すことが示されている。前記プロテアーゼ安定剤を含んで成る液体酵素添加剤を調製する場合、及び前記液体酵素添加剤の貯蔵に基づいて、沈殿物が形成され得ることが見出された。洗剤製造は、それらの製品に添加されるべき液体が透明な液体であることを必要とする。不透明な液体の使用は、最終使用者に、汚染された洗剤の認識を心理学的に与える。従って、所望には、液体洗剤は透明であり、そして従って原料がそこに含まれる。さらに、沈殿物のない液体をポンプで送ることは容易である。前記液体酵素添加剤の製造における問題は、沈殿物が貯蔵に基づいて形成されることである。本発明者は、液体酵素添加物への界面活性剤の添加が沈殿物形成を妨げることを、驚くべきことは見出した。

さらに、沈殿物の形成が、液体酵素添加剤の製造の間、見出される。沈殿物の形成を回避する手段を見出すことにおいて、液体酵素添加剤のpHの調節が、安定剤の添加の前、pHが調節される場合、形成される沈殿物の主要部分を妨げ、そして安定剤の添加の後、調節される場合、沈殿物のほとんどを溶解することが、驚くべきことには言い出された。

液体酵素添加剤：
本発明の液体酵素添加剤は、酵素、ホウ素酸又は誘導体、及び界面活性剤を含んで成る。
本発明の特定の態様においては、液体酵素添加剤は、5.5〜10のpHを有する。本発明のより特定の態様においては、pHは7.5〜10である。
本発明のより特定の態様においては、液体酵素添加剤はさらに、液体酵素添加剤のpHを7.5〜10に調節するためのアルカリ性物質を含んで成る。

液体酵素添加剤は追加の材料も含むことができる。
本発明の特定の態様においては、液体酵素添加剤は、キレート化剤を含まない。本発明のより好ましい態様においては、液体酵素添加剤は、エタノールアミンを含まない。本発明のさらにより好ましい態様においては、液体酵素添加剤は、ホスホネートを含まない。本発明の最も好ましい態様においては、液体酵素添加剤は、香料を含まない。

酵素：
液体酵素添加剤は、液体洗剤に添加されるべき濃縮された製品である。従って、液体酵素添加剤に使用される酵素の量は非常に高い。本発明の特定の態様においては、液体酵素添加剤に存在する酵素の量は、少なくとも1.5g/Lである。本発明のより態様においては、酵素の量は少なくとも5g/Lである。本発明のさらなる特定の態様においては、存在する酵素の量は少なくとも10g/Lである。本発明の最も特定の態様においては、存在する酵素の量は、少なくとも20g/L、例えば25g/L以上である。特定の態様においては、酵素の量は、200g/Lを越えない。本発明のより特定の態様においては、酵素の量は、150g/Lを越えない。本発明の最も特定の態様においては、液体酵素添加剤に存在する酵素の量は100g/L以下である。

本発明の特定の態様においては、液体酵素添加剤は、４重量％以上酵素タンパク質を含んで成る。本発明のより特定の態様においては、液体酵素添加剤は、少なくとも5重量％の酵素タンパク質を含んで成る。本発明の最も特定の態様においては、液体酵素添加剤は、少なくとも7.5重量％の酵素タンパク質を含んで成る。

酵素は典型的には、細菌又は菌類により生成され、そして続いて、当業界において知られている方法により回収される。典型的には回収方法は、次の段階から成る：遠心分離又は濾過による細胞及び他の固形物の除去、及び減圧下での限外濾過及び/又は蒸発による濃縮。ポリオール、例えば１，２−プロパンジオール、ソルビトール、単純炭水化物又はグリセロールが、酵素を安定化するために、濃縮段階の直前、その間又は直後、添加され得る。

ポリオールの組合わせがまた使用され得る。追加の段階が、最終製品の規格に依存して、回収工程に包含され得る。前記工程の間、安定性を高めるために、例えば自己タンパク質分解を包含するタンパク質分解を低めるために、前記工程は典型的には、酵素が安定し、そしてそれらの活性がpH4.0〜6.5で低いようなpHで実施される。安定性を高めるためのもう１つの手段、例えばタンパク質分解の低減は、低い温度、例えば10℃以下で前記工程を実施することである。しかしながら、時々、膜を通しての流れを高めるために、より高い温度で濾過を実施することが好都合である。

本発明によれば、液体組成物は少なくとも１つの酵素を含む。前記酵素は、いずれかの市販の酵素、特にプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、リアーゼ、オキドレダクターゼ及びいずれかのそれらの混合物から成る群から選択された酵素であり得る。同じ種類からの酵素（例えば、プロテアーゼ）の混合物もまた包含される。

本発明によれば、プロテアーゼを含んで成る液体組成物が好ましい。特定の態様においては、第１酵素がプロテアーゼであり、そして第２酵素がアミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、リアーゼ及びオキシドレダクターゼから成る群から選択される、複数の酵素を含んで成る液体組成物が好ましい。より特定の態様においては、第２酵素はリパーゼである。

酵素変異体（例えば、組換え技法により生成される）は、用語“酵素”の意味内に包含されることが理解されるべきである。そのような酵素変異体の例は、例えばEP 251 ,446 号（Genencor）, WO 91/00345 号（Novo Nordisk）, EP 525,610 号（Solvay）及びWO 94/02618号（Gist-Brocades NV）に開示される。

酵素は、ハンドブック（Enzyme Nomenclature from NCIUBMB, 1992）に基づいて分類され得；また、インターネット上のENZYMEサイトhttp://www.expasv.ch/enzyme/も参照のこと。ENAYEは、酵素の命名法に関する情報貯蔵所である。それは主に、Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology（IUB-MB）, Academic Press, Inc., 1992の推薦に基づかれ、そしてそれはEC（Enzyme Commission）番号が供給されている個々のタイプの特徴づけられた酵素を記載する（Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305）。このIUB−MB Enzyme命名法は、それらの基質特異性及び時折り、それらの命名機構に基づかれ；そのような分類は、それらの酵素の構造特徴を表してはいない。

アミノ酸配列類似性に基づかれるファミリーにおける一定のグリコシドヒドロラーゼ酵素、例えばエンドグルカナーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、デキストラナーゼ及びα−ガラクトシダーゼのもう１つの分類が、数年前、提案されている。それらは現在、90種の異なったファミリーに分類されている；CAZY（ModO）インターネットサイト（URLでのCoutinho, P.M. & Henrissat, B.（1999）Carbohydrate-Active Enzymesサーバー：http://afmb.cnrs-mrs,fr/~cazy/CAZY/index.html）を参照のこと（対応する文献：Coutinho, P.M. & Henrissat, B.（1999）Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. In "Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering", H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat and B. Svensson eds., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12; Coutinho, P.M. & Henrissat, B.（1999）The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. In "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation"., K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita and T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tokyo, pp. 15-23）。

液体酵素添加剤は好ましくは、プロテアーゼ、例えばセリンプロテアーゼを含んで成る。

プロテアーゼ：適切なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物起源のものを包含する。微生物起源が好ましい。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン−様プロテアーゼであり得る。アルカリプロテアーゼの例は、スブチリシン、特にバチルスに由来するそれらのもの、例えばスブチリシンNovo、スブチリシンCarlsberg、スブチリシン309、スブチリシン147及びスブチリシン168（WO89/06279号に記載される）である。トリプシン−様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源のもの）、及びWO89/06270号に記載されるフサリウムプロテアーゼである。本発明の特定の態様においては、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである。セリンプロテアーゼ又はセリンエンドペプチダーゼ（新規名称）は、酵素の活性中心におけるセリン残基の存在により特徴づけられる種類のペプチダーゼである。

セリンプロテアーゼ：セリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、そして活性部位で必須セリン残基が存在する酵素である（White, Handler and Smith, 1973 "Principles of Biochemistry," Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271-272）。

細菌セリンプロテアーゼは、20,000〜45,000ドルトン範囲での分子量を有する。それらはジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害される。それらは単純な末端エステルを加水分解し、そして真核キモトリプシン、またセリンプロテアーゼに、活性において類似する。より狭い用語、すなわちアルカリプロテアーゼ（サブグループを包含する）は、pH9.0〜11.0のいくつかのセリンプロテアーゼの高いpH最適度に影響を及ぼす（再考においては、Priest（1977）Bacteriological Rev. 41 711-753を参照のこと）。

サブチラーゼ：セリンプロテアーゼのサブグループ、すなわち試験的に企画されたサブチラーゼは、Siezen など.（1991）, Protein Eng., 4 719-737により提案されている。それらは、スブチリシン様プロテアーゼとして、これまで言及されているセリンプロテアーゼの40個以上のアミノ酸配列の相同性分析により定義される。スブチリシンは、グラム陽性細菌又は菌類により生成されるセリンプロテアーゼとして、これまで定義され、そしてSiezenなど．によれば、現在、サブチラーゼのサブグループである。

広範囲の種類のスブチリシンが同定されており、そして多くのスブチリシンのアミノ酸配列が決定されている。それらは、バチルス株からの６種以上のスブチリシン、すなわちスブチリシン168、スブチリシンBPN’、スブチリシンCarlsberg, スブチリシンY、スブチリシン アミロサッカリチカス及びメセンテリコペプチダーゼ（Kurihara など.（1972）J. Biol. Chem. 247 5629-5631 ; Wells など.（1983）Nucleic Acids Res. 11 7911-7925; Stahl and Ferrari（1984）J. Bacteriol. 159 811-819, Jacobs など.（1985）Nucl. Acids Res. 13 8913-8926; Nedkov など.（1985）Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366 421-430, Svendsen など.（1986）FEBS Lett. 196 228- 232）、アクチノミセスからの１つのスブチリシン、サーモアクチノミセス・バルガリス（Thermoactinomyces vulgaris）からのサーミターゼ（Meloun など.（1985）FEBS Lett. 198 195-200）、及び１つの菌類スブチリシン、トリチラキウム・アルブム（Tritirachium album）からのプロテアーゼK（Jany and Mayer（1985）Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366 584-492）を包含する。さらなる参照については、Siezen など. からの表１が下記に再現されている。

スブチリシンは、物理的に及び化学的に十分に特徴づけられている。それらの酵素の一次構造（アミノ酸配列）の知識の他に、基質の結合、遷移状態、生成物、少なくとも３種の異なったプロテアーゼインヒビターを詳細に表し、そして天然の変動についての構造結果を定義する、スブチリシンの50以上の高解像度X−線構造が決定されている（Kraut（1977）Ann. Rev. Biochem. 46 331-358）。

サブチラーゼの１つのサブグループ、I−S1は、“従来の”スブチリシン、例えばスブチリシン168、スブチリシンBPN’、スブチリシンCarisberg（ALCALASE（商標）, Novozymes A/S）及びスブチリシンDYを包含する。サブチラーゼI−S2の追加のサブグループは、Siezenなど.（前記）により認識されている。サブグループI-S2プロテアーゼは、高いアルカリスブチリシンとして記載され、そして酵素、例えばスブチリシンPB92（MAXACAL（商標）, Gist-Brocades NV）, スブチリシン309（SAVINASE（商標）, Novozymes A/S）, スブチリシン147（ESPERASE（商標）, Novozymes A/S）, 及び アルカリ エラスターゼYaBを包含する。

サブチラーゼ遺伝子のランダム及び特定部位の突然変異誘発が、酵素の物理的及び化学的性質の知識から生じ、そしてサブチラーゼの触媒活性、基質特異性、三次構造、等に関する情報に寄与する（Wellsnado.（1987）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84; 1219-1223; Wellsnado.（1986）Phil. Trans. R. Soc. Lond.A. 317 415-423; Hwang and Warshel（1987）Biochem. 26 2669-2673; Rao nado.,（1987）Nature 328 551-554）。

この分野を包含するより最近の出版物は、基質における特定の標的配列（位置24及び64）を切断する変異体の企画に関するCorterなど.（1989）Proteins6 240-248；多くのこれまで公開された結果を論じるGraycar など.（1992）Annals of the New York Academy of Sciences 672 71-79；及びこれまでの結果をまた再考するTakagi（1993）Int. J. Biochem. 25 307-312である。

市販のプロテアーゼ（ペプチダーゼ）の例は、Kannase^TM, Everlase^TM, Esperase^TM, Alcalase^TM, Neutrase^TM, Durazym^TM, Savinase^TM, Ovozyme^TM, Pyrase^TM, Pancreatic Trypsin NOVO（PTN）, Bio-Feed^TM Pro 及び Clear-Lens^TM Pro（すべてはNovozymes A/S, Bagsvaerd, Denmarkからである）を包含する。他の好ましいプロテアーゼは、WO01/58275号及びWO01/58276号に記載されるそれらを包含する。

他の市販のプロテアーゼは、Ronozyme^TM Pro, Maxatase^TM, Maxacal^TM, Maxapem^TM, Opticlean^TM, Propeaseｖ, Purafect^TM 及び Purafect Ox^TM（Genencor International Inc., Gist-Brocades, BASF, 又は DSM Nutritional Productsから入手できる）を包含する。
リパーゼ：適切なリパーゼは、細菌又は菌類起源のそれらを包含する。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。

有用なリパーゼの例は、例えばEP258068号及びEP305216号に記載されるようなヒューミコラ・ラヌキノサ（Humicola lanuginose）リパーゼ、EP238023号に記載されるようなリゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、EP214761号に記載されるようなカンジダ（Candida）リパーゼ、例えばC.アンタルシチカ（C.antarctica）リパーゼ、例えばC. アンタルシチカA又はB、EP218272号に記載されるようなP.アルカリゲネス（P. alcaligenes）及びP. シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcal: genes）リパーゼ、EP331376号に記載されるようなP. セパシア（P. Cepacia）リパーゼ、GB1, 372,034号に開示されるようなP. スツゼリ（P. stutzeri）リパーゼ、P. フルオレセンス（P. fluorescens）リパーゼ、バチルス（Bacillus）リパーゼ、例えばB. サブチリスリパーゼ（Dartoisなど.,（1993）, Biochemica et Biophysica acta 1131, 253-260）、B. ステアロサーモフィラス（B.stearothermophilus）リパーゼ（JP64/744992号）及びB. プミラス（B. pumilus）リパーゼ（WO91/16422号）を包含する。

さらに、多くのクローン化されたリパーゼ、例えばペニシリウム・カメムベルチ（Penicillium camembertii）リパーゼ（Yamaguchiなど.,（1991）、Gene 103, 61-67）, ゲオトリカム・カンジダム（Geotricum candium）リパーゼ（Schimada, Y. など.,（1989）, J. Biochem. 106,383-388）及び種々のリゾバス（Rhizopus）リパーゼ、例えばR. デレマル（R. delemar）リパーゼ（Hass, M. J.など.,（1991）, Gene 109, 117-113）, R. ニベウス（R. niveus）リパーゼ（Kugimiya）など.,（1992）, Biosci. Biotech. Biochem. 56, 718-719）及びR. オリザエ（R. oryzae）リパーゼが有用である。

他のタイプの脂質分解酵素、例えばクチナーゼ、例えばWO88/09367号に記載されるようなシュドモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）に由来のクチナーゼ、又はWO90/09446号に記載されるようなフサリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi）に由来のクチナーゼがまた有用である。
市販のリパーゼの例は、Lipex^TM, Lipoprime^TM, Lipopan^TM, Lipolase^TM, Lipolase^TM Ultra, Lipozyme^TM, Palatase^TM, Resinase^TM, Novozym^TM 435 及び Lecitase^TM（すべた Novozymes A/Sから入手できる）を包含する。

他の市販のリパーゼは、Lumafast^TM（Genencor International Inc. からのシュードモナス・メンドシナリパーゼ）；Lipomax^TM（Gist- Brocades/Genencor Int. Inc.からのPs. シュードアルカリゲネスリパーゼ）；及びSolvay酵素からのバチルスsp. リパーゼを包含する。追加のリパーゼは、他の供給者、例えばLipase P "Amano"（Amano Pharmaceutical Co. Ltd.）から入手できる。

アミラーゼ：
適切なアミラーゼ（α及び/又はβ）は、細菌又は菌類起源のそれらを包含する。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。アミラーゼは、例えばGB1,296,839号に詳細に記載される、B. リケニホルミス（B. licheniformis）の特定株から得られたα−アミラーゼを包含する。市販のアミラーゼは、Duramyl^TM, Termamyl^TM, Fungamyl^TM 及び BAN^TM（Novo Nordisk A/Sから入手できる）及び Rapidase^TM及びMaxamyl P^TM（Genencorから入手できる）である。

セルラーゼ：
適切なセルラーゼは、細菌又は菌類起源のそれらを包含する。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。適切なセルラーゼは、アメリカ特許第4,435,307号に開示されており、これは、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）から生成された菌類セルラーゼを開示する。特に適切なセルラーゼは、色彩保護利点を有するセルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、ヨーロッパ特許出願第0495257号に記載されるセルラーゼである。

オキシドレダクターゼ：
液体組成物への使用のための適切ないずれかのオキシドレダクターゼ、例えばペルオキシダーゼ又はオキシダーゼが本明細書において使用され得る。本明細書における適切なペルオキシダーゼは、植物、細菌又は菌類起源のそれらを包含する。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。適切なペルオキシダーゼの例は、コプリナス（Coprinus）の株、例えばC. シネリウス（C. cinerius）又はC. マクロリザス（C. macrorhizus）、バチルスの株、例えばB. プミラス（B. pumilus）由来のそれら、例えば特にWO91/05858号に従ってのペルオキシダーゼである。

本明細書における適切なラッカーゼは、細菌又は菌類起源のそれらを包含する。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。適切なラッカーゼの例は、トラメテス（Trametes）の株、例えばT. ビロサ（T. villosa）又はT. ベルシカラー（T. versicolor）、又はコプリナス（Coprinus）の株、例えばC. シネレウス（C. cinereus）、又はミセロプソラ（Mycellophthora）の株、例えばM. サーモフィラ（M. thermophila）から得られるそれらである。

本発明の液体に存在し得る型の酵素は、オキシドレダクターゼ（EC1.-.-.-）、トランスファラーゼ（EC2.-.-.-）、 ヒドロラーゼ（EC3.-.-.-）、 リアーゼ（EC4.-.-.-）、 イソメラーゼ（EC5.-.-.-）及びリガーゼ（EC6.-.-.-）を包含する。

本発明における好ましいオキシドレダクターゼは、ペルオキシダーゼ（EC 1. 11. 1）、ラッカーゼ（EC 1. 10. 3. 2）及びグルコースオキシダーゼ（EC 1. 1. 3. 4）である。市販のオキシドレダクターゼ（EC1.-.-.-）の例は、Gluzyme^TM（Novozymes A/Sから入手できる酵素）である。さらなるオキシドレダクターゼは、他の供給者から入手できる。好ましいトランスフェラーゼは、次ぎのサブクラスのいずれかにおけるトランスフェラーゼである：

ａ）1−炭素基を転移するトランスフェラーゼ（EC 2. 1）；
ｂ）アルデヒド又はケトン残基を転移するトランスフェラーゼ（EC 2. 2）；アシルトランスフェラーゼ（EC 2. 3）；
ｃ）グリコシルトランスフェラーゼ（EC 2. 4）；
ｄ）アルキル又はメチル基以外のアリールを転移するトランスフェラーゼ（EC 2. 5）；及び
ｅ）窒素基を転移するトランスフェラーゼ（EC 2. 6）。

本発明における最も好ましい型のトランスフェラーゼは、トランスグルタミナーゼ（タンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼ；EC 2. 3. 2. 13）である。
適切なトランスグルタミナーゼのさらなる例は、WO96/06931号（Novo Nordisk A/S）に記載される。

本発明における好ましいヒドロラーゼは、次ぎのものである：カルボン酸エステルヒドロラーゼ（EC 3. 1. 1. −）、例えばリパーゼ（EC 3. 1. 1. 3）；フィターゼ（EC 3. 1. 3. −）、例えば３−フィターゼ（EC 3. 1. 3. 8）及び６−フィターゼ（EC 3. 1. 3. 26）；グリコシダーゼ（EC 3. 2, “カルボヒドラーゼ”として本明細書において示される群内にある）、例えばα−アミラーゼ（EC 3. 2. 1. 1）；ペプチダーゼ（EC 3. 4, プロテアーゼとしても知られている）；及び他のカルボニルヒドロラーゼ。市販のフィターゼの例は、Bio-Feed^TM Phytase（Novozymes）, Ronozyme^TM P（DSM Nutritional Products）, Natuphos^TM（BASF）, Finase^TM（AB Enzymes）, 及び Phyzyme^TM 製品シリーズ（Danisco）を包含する。他の好ましいフィターゼは、WO 98/28408号、WO 00/43503号 及び WO 03/066847号に記載されるそれらを包含する。

本明細書においては、用語“カルボヒドラーゼ”とは、特に５−及び６−員の環構造体の炭水化物鎖（例えば、澱粉）を分解することができる酵素（すなわち、グリコシダーゼ、EC 3. 2）のみならず、また炭水化物、例えば、６−員の構造体、例えばD−グルコースを、５−員の環構造体、例えばD−フルクトースに異性体化できる酵素を示すために使用される。

適切なカルボヒドラーゼは次ぎのものを包含する（括弧でEC番号）：α−アミラーゼ（３. ２. １. １）、β−アミラーゼ（３.２. １. ２）、グルカン１，４−α−グルコシダーゼ（３. ２. １. ３）、セルラーゼ（３. ２. １. ４）、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ（３．２．１．６）、エンド−１，４−β−キシラナーゼ（３．２．１．８）、デキストラナーゼ（３．２．１．１１）、キチナーゼ（３．２．１．１４）、ポリガラクツロナーゼ（３．２．１．１５）、リゾチーム（３．２．１．１７）、β−グルコシダーゼ（３．２．１．２１）、α−ガラクトシダーゼ（３．２．１．２２）、β−ガラクトシダーゼ（３．２．１．２３）、アミロ−１，６−グルコシダーゼ（３．２．１．３３）、キシラン１，４−β−キシロシダーゼ（３．２．１．３７）、グルカンエンド−１，３−β−D−グルコシダーゼ（３．２．１．３９）、α−デキストリンエンド−１，６−グルコシダーゼ（３．２．１．４１）、スクロースα−グルコシダーゼ（３．２．１．４８）、グルカンエンド−１，３−α−グルコシダーゼ（３．２．１．５９）、グルカン１，４−β−グルコシダーゼ（３．２．１．７４）、グルカンエンド−１，６−β−グルコシダーゼ（３．２．１．７５）、アラビナンエンド−１，５−α−アラビノシダーゼ（３．２．１．９９）、ラクターゼ（３．２．１．１０８）、キトナナーゼ（３．２．１．１３２）及びキシロースイソメラーゼ（５．３．１．５）。

市販のカルボヒドロラーゼの例は、Alpha-Gal^TM、 Bio-Feed^TM Alpha、 Bio-Feed^TM Beta、 Bio-Feed^TM Plus、 Bio-Feed^TM Wheat、 Bio-Feed^TM Z、 Novozyme^TM 188、 Carezyme^TM、 Celluclast^TM、 Cellusoft^TM、 Celluzyme^TM、 Ceremyl^TM、 Citrozym^TM、 Denimax^TM、 Dezyme^TM、 Dextrozyme^TM、 Duramyl^TM、 Energex^TM、 Finizym^TM、 Fungamyl^TM、 Gamanase^TM、 Glucanex^TM、 Lactozym^TM、 Liquezyme^TM、 Maltogenase^TM、 Natalase^TM、 Pentopan^TM、 Pectinex^TM、 Promozyme^TM、 Pulpzyme^TM、 Novamyl^TM、 Termamyl^TM、 AMG^TM（Amyloglucosidase Novo）、 Maltogenase^TM、 Sweetzyme^TM 及びAquazym^TM（すべてNovozymes NSから入手できる）を包含する。

さらなるカルボヒドロラーゼ、例えばRoxazyme^TM 及び Ronozyme^TM 製品シリーズ（DSM Nutritional Products）、the Avizyme^TM、Porzyme^TM 及び Grindazyme^TM製品シリーズ（Danisco, Finnfeeds）、 and Natugrain^TM（BASF）、Purastar^TM 及び Purastar^TM OxAm（Genencor）は、他の供給者から入手できる。
他の市販の酵素は、Mannaway^TM、Pectaway^TM、Stainzyme^TM 及び Renozyme^TMを包含する。

界面活性剤：
液体酵素添加剤における沈殿を回避するための適切な界面活性剤は、いずれの界面活性剤でもあり得る。本発明の界面活性剤は、アニオン性、非イオン性、カチオン性又は両性（両性イオン）であり得る。

特に、８以上のHLB値を有する界面活性剤が適切であることが見出された。本発明の特定の態様においては、界面活性剤のHLB値は、少なくとも９、例えば少なくとも10である。より特定の態様においては、HLB値は10〜20である。より特定の態様においては、界面活性剤のHLB値は11〜15である。

本発明の特定の態様においては、界面活性剤は、0〜40℃の温度範囲で酵素液体添加剤に溶解でき、そして相分離しない。より特定の態様においては、界面活性剤は、複数の界面活性剤の混合物として添加され得る。
添加される界面活性剤の量は、合計液体添加剤の0.1〜10％w/w, より特定には0.25〜8％w/w, 例えばさらにより特定には、0.5〜5％w/wである。
本発明の特定の態様においては、界面活性剤の量は、合計の液体酵素添加剤の１％w/w以下である。本発明の特定の態様においては、界面活性剤の量は、合計の液体酵素添加剤の0.7％w/w以下である。

本発明の特定の態様においては、液体酵素添加剤に添加される界面活性剤の量は少なくとも0.1％w/wである。本発明のより特定の態様においては、界面活性剤は、少なくとも0.25％w/wの量で液体酵素添加剤に添加される。さらにより特定の態様においては、界面活性剤は、少なくとも0.5％w/wの量で液体酵素添加剤に添加される。本発明の最も特定の態様においては、界面活性剤は、少なくとも１％w/wの量で液体酵素添加剤に添加される。

本発明の特定の対応においては、液体酵素添加剤に添加される界面活性剤の量は、20％w/w以下である。本発明のより特定の対応においては、液体酵素添加剤に添加される界面活性剤の量は、15％w/w以下である。本発明のさらにより特定の対応においては、液体酵素添加剤に添加される界面活性剤の量は、10％w/w以下である。本発明の最も特定の対応においては、液体酵素添加剤に添加される界面活性剤の量は、５％w/w以下である。

本発明の特定の態様においては、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。非イオン性界面活性剤は、アルコールエトキシレート（AEO又はAE）、アルコールプロポキシレート、カルボキシレート化されたアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化された脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えば、WO92/06154号に記載されるような）である。

アルキルフェノールのポリエチレン、ポリプロピレン及びポリブチレンオキシド縮合物が、本発明の界面活性剤系の非イオン界面活性剤としての使用のために適切であり、そしてポリエチレンオキシド縮合物が好ましい。それらの化合物は、直鎖又は枝分かれ鎖形状において、約６〜約14個の炭素原子、好ましくは約８〜約14個の炭素原子を含むアルキル基を有するアルキルフェノールと酸化アルキレンとの縮合生成物を包含する。好ましい態様においては、酸化エチレンは、アルキルフェノール１モル当たり、約２〜約25モル、より好ましくは約３〜約15モルに等しい量で存在する。このタイプの市販の非イオン性界面活性剤は、GAF Corporationにより市販されているIgepal^TM CO-630 ; 及びRohm & Haas Companyにより市販されているTriton^TM X-45, X-114, X-100, 及びX-102を包含する。それらの界面活性剤は、通常、アルキルフェノールアルコキシレート（例えば、アルキルフェノールエトキシレート）として言及される。

約１〜約25モルの酸化エチレンと第一及び第二脂肪族アルコールとの縮合生成物は、非イオン性界面活性剤として適切である。脂肪族アルコールのアルキル鎖は、直鎖又は枝分かれ鎖の第一又は第二アルコールであり、そして一般的には、約８〜約22個の炭素原子を含む。アルコール１モル当たり約３モルの酸化エチレンと、約８〜約20個の炭素原子、より好ましくは約10〜約18個の炭素原子を含むアルキル基を有するアルコールとの縮合生成物が好ましい。

このタイプの市販の非イオン性界面活性剤の例は、次のものを包含する：Tergitol^TM 15-S-9（９モルの酸化エチレンとC₁₁-C₁₅線状アルコールとの縮合生成物）、Tergitol^TM 24-L-6NMW（狭い分子量分布を有する、６モルの酸化エチレンとC₁₂-C₁₄第一アルコールとの縮合生成物）（両者ともUnion Carbide Corporationにより市販されている）；Neodol^TM 45-9（９モルの酸化エチレンとC₁₄-C₁₅線状アルコールとの縮合生成物）、Neodol^TM 23-3（3.0モルの酸化エチレンとC₁₂-C₁₃線状アルコールとの縮合生成物）、Neodol^TM 45-7（７モルの酸化エチレンとC₁₄-C₁₅線状アルコールとの縮合生成物）、Neodol^TM 45-5（５モルの酸化エチレンとC₁₄-C₁₅線状アルコールとの縮合生成物）（Shell Chemical Company により市販されている）；Kyro^TM EOB（９モルの酸化エチレンとC₁₃-C₁₅アルコールとの縮合生成物）（The Procter & Gamble Company により市販されている）；及びGenapol LA050（５モルの酸化エチレンとC₁₂-C₁₄アルコールとの縮合生成物）（Hoechstにより市販されている）；及びBASFにより市販されているLutensol（商標）AN, AT, AO 及び TO 型。それらの生成物におけるHLBの好ましい範囲は８〜20、及び最も好ましくは８〜18である。

次の式：

［ｎ＋ｍ＝９〜11、Xは酸化エチレン基の平均数を示し、そしてｙは酸化プロピレン基の平均数を示す］で表される界面活性剤が特に好ましい。このタイプの市販されている非イオン性界面活性剤の例は、Ineos Wxide, BelgiumからのSoftanol（商標）を包含する。

また、約６〜約30個の炭素原子、好ましくは約10〜約16個の炭素原子を含む疎水性基を有する、アメリカ特許第4,565,647号に開示されるアルキル多糖類、及び約1.3〜約10、好ましくは約1.3〜約３、最も好ましくは約1.3〜約2.7のサッカリド単位を含む親水性基を有する多糖、例えばポリグリコシドが、本発明の界面活性剤系の非イオン性界面活性剤として有用である。５〜６個の炭素原子を含むいずれかの還元サッカリドが使用され得、例えばグルコース、ガラクトース、及びガラクトシル成分がグルコシル成分により置換され得る（任意には、疎水性基が２−,３−,４−,等の位置で結合され、従って、グルコシド又はガラクトシドとは対照的に、グルコース又はガラクトースが得られる）。サッカリド間結合は、例えば、追加のサッカリド単位の１つの位置と先に存在するサッカリド単位上の２−,３−,４−及び/又は６−位置との間で存在することができる。

好ましいアルキルポリグリコシドは、下記式：
R²O（C_nH_2nO）_t（グリコシル）x
［式中、R²は、アルキル、アルキルフェニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルフェニル、及びそれらの混合物（ここで、アルキル基は約10〜約18、好ましくは約12〜約14個の炭素原子を含む）から成る群から選択され；ｎは、２又は３、好ましくは２であり；ｔは０〜約10、好ましくは０であり；そしてxは約1.3〜約10、好ましくは約1.3〜約３、最も好ましくは約1.3〜約2.7である］を有する。

グリコシルは好ましくは、グルコースに由来する。それらの化合物を調製するためには、アルコール又はアルキルポリエトキシアルコールが最初に形成され、そして次に、グルコース、又はグルコース源と反応せしめられ、グルコースが形成される（1−位置での結合）。次に、追加のグリコシル単位が、それらの１−位置と、先に存在するグルコシル単位２−,３−,４−,及び/又は６−位置、好ましくは、優力的には２−位置との間に結合され得る。

酸化プロピレンとプロピレングリコールとの縮合により形成される疎水性基と酸化エチレンとの縮合生成物がまた、界面活性剤として適切である。それらの化合物の疎水性部分は、好ましくは、約1500〜約1800の分子量を有し、そして水不溶性を示すであろう。この疎水性部分へのポリオキシエチレン成分の付加は、全体として分子の水溶性を高める傾向があり、そして生成物の液体特性は、ポリオキシエチレン含有率が縮合生成物の合計重量の約50％であり、約40モルまでの酸化エチレンとの縮合に対応する点まで維持される。このタイプの化合物の例は、BASFにより市販されている一定のPluronic^TM 界面活性剤を包含する。

酸化プロピレン及びエチレンジアミンの反応に起因する生成物と酸化エチレンとの縮合生成物はまた、本発明の非イオン性界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用のためにも適切である。それらの生成物の疎水性成分は、エチレンジアミン及び過剰の酸化プロピレンの反応生成物から成り、そして一般的には、約2500〜約3000の分子量を有する。この疎水性成分は、縮合生成物が約40〜約80重量％のポリオキシエチレンを含み、そして約5,000〜約11,000の分子量を有する程度まで、酸化エチレンにより縮合される。このタイプの非イオン性界面活性剤の例は、BASFから市販されているTetronic^TM 化合物を包含する。

他の適切な界面活性剤は、アルキルフェノールのポリ酸化エチレン縮合物、すなわち約１〜約25モルの酸化エチレン、アルキル多糖類及びそれらの混合物と第一及び第二脂肪族アルコールとの縮合生成物であり得る。３〜15個のエトキシ基を有するG₉-C₁₄アルキルフェノールエトキシレートが最も好ましい。他の適切な非イオン性界面活性剤は、下記式：

［式中、R¹はHであり、又はR¹はC_1-4ヒドロカルビル、２−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシプロピル又はそれらの混合物であり、R²はC_5-31ヒドロカルビルであり、そしてZは線状ヒドロカルビル鎖に直接的に結合される少なくとも３個のヒドロキシルを有するそのヒドロカルビル鎖を有するポリヒドロキシヒドロカルビルである］で表されるポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤である。好ましくは、R¹はメチルであり、R²は直鎖のC_11-15又はC_16-18アルキル、又はアルケニル鎖、例えばヤシアルキル又はそれらの混合物であり、そしてZは還元糖、例えばグルコース、フルクトース、マルトース又はラクトースから還元アミノ化反応において誘導される。

本発明の特定の態様においては、界面活性剤は、下記群から選択される：
R-O-（CH₂CH₂O）_nH
［式中、Rは、８〜22個の炭素原子を有する、枝分かれ鎖又は直鎖のアルカンであり、そしてｎは３に等しいか、又は３以上であり、より好ましい態様においては、ｎは５に等しいか又は５以上である。ｎは9, 7, 8, 15及び80に制限されない。特定の態様においては、平均鎖長は、C12〜C18、より好ましい態様においては、平均鎖長はC13〜C16であり、より特定の態様においては、平均鎖長はC13〜C15である］、

［式中、X＝５、ｍ＋n＝９〜11］、

［式中、X＝９、ｎ＋ｍ＝９〜11］、

［式中、ｍ＋ｎ＝12〜14、X＝７、ｙ＝2.5］。

本発明のもう１つの特定の態様においては、界面活性剤は、次の別称C11〜15-sec-アルキル−オメガ−ヒドロキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）を有する化合物群を包含するCAS. No. 68131−40−８；エトキシル化されたC11-15-第二アルコール、エトキシル化された第二アルコール；SM−９；Tergitol 15-S-9；及びエトキシル化されたアルコール（C16-C22）を包含するCAS. No. 69227-20-9から成る選択される。

界面活性剤はまた、アミン、アミド及び酸のエトキシレートでもあり得る。さらに、界面活性剤は、エトキシレート及びプロポキシレートのコポリマー、例えばアルコール、アミン、アミド及び酸のエトキシ−プロポキシブロックコポリマー（但し、それだけには限定されない）であり得る。

適切なアニオン性界面活性剤は、アルキルアルコキシル化されたスルフェート界面活性剤を包含する。その例は、式RO（A）mSO₃M ［式、Rは置換されていないC₁₀-C₂₀アルキル又はC₁₀-C₂₄アルキル成分を有するヒドロキシアルキル基、好ましくはC₁₂-C₂₀アルキル又はハロ−キシアルキル、より好ましくはC₁₂-C₁₈アルキル又はヒドロキシアルキルであり、Aはエトキシ又はプロポキシ単位であり、ｍはゼロよりも大きく、典型的に約0.5〜約６、より好ましくは約0.5〜約３であり、そしてMはH, 又は例えば、金属カチオンであり得るカチオン（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、等）、アンモニウム、又は置換されたアンモニウムカチオンである。

アルキルエトキシル化されたスルフェート及びアルキルプロポキシル化されたスルフェートが本明細書において企画される。置換されたアンモニウムカチオンの特定の例は、メチル−、ジメチル−、トリメチル−アンモニウムカチオン、及び第四アンモニウムカチオン、例えばテトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペルジニウムカチオン、及びアルキルアミン、例えばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、それらの混合物から誘導されたそれらのもの、及び同様のものを包含する。

典型的な界面活性剤は、C₁₂-C₁₈アルキルポリエトキシレート（1.0）スルフェート（C₁₂-C₁₈E（1.0）, C₁₂-C₁₈アルキルポリエトキシレート（2.25）スルフェート（C₁₂-C₁₈（2.25）M）及びC₁₂-C₁₈アルキルポリエトキシレート（3.0）スルフェート（C₁₂-C₁₈E（3.0）M）、C₁₂-C₁₈アルキルポリエトキシレート（4.0）スルフェート（C₁₂-C₁₈E（4.0）M）（ここで、Mは便利には、ナトリウム及びカリウムから選択される）である。

使用されるべき他の適切なアニオン性界面活性剤は、アルキルベンゼンスルホネート（LAS）、α−オレフィンスルホネート（AOS）、アルキルスルフェート（脂肪アルコールスルフェート）（AS）、アルコールエトキシスルホネート（AEOS又はAES）、第二アルカンスルホネート（SAS）、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニル−琥珀酸、キシレンスルホネート又はソープ、"The Journal of the American Oil Chemists Society", 52（1975）, pp. 323-329に従って、気体SO₃によりスルホネート化されるC₈-C₂₀カルボン酸（すなわち、脂肪酸）の線状エステルを包含するアルキルエステルスルホネート界面活性剤であり得る。適切な出発材料は、牛脂、ヤシ油、等由来の天然の脂肪物質を包含する。好ましいアニオン界面活性剤は、キシレンスルホン酸のナトリウム、カリウム又はアンモニウム塩、例えば（CH₃）₂C₆H₃SO₃Naである。

適切なアルキルエステルスルホネート界面活性剤は、下記式：

［式中、R³はC₈-C₂₀ヒドロカルビル、好ましくはアルキル又はそれらの組み合わせであり、R⁴はC₁-C₆ヒドロカルビル、好ましくはアルキル、又はそれらの組み合わせであり、そしてMはアルキルエステルスルホネートと共に水溶性塩を形成するカチオンである］で表される構造を有するアルキルエステルスルホネート界面活性剤を含んで成る。適切な塩形成カチオンは、金属、例えばナトリウム、カリウム及びリチウム、及び置換された又は置換されていないアンモニウムカチオン、例えばモノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンを包含する。好ましくは、R³はC₁₀-C₁₆アルキルであり、そしてR⁴はメチル、エチル又はイソプロピルである。R³がC₁₀-C₁₆アルキルであるメチルエステルスルホネートが特に好ましい。

他の適切なアニオン性界面活性剤は、式ROSO₃M［式中、Rは好ましくは、C₂₀-C₂₄ヒドロカルビル、好ましくはC₁₀-C₂₀アルキル成分を有するアルキル又はヒドロキシアルキル、より好ましくはC₁₂-C₁₈アルキル又はヒドロキシアルキルであり、そしてMは、H、又はカチオン、例えばアルカリ金属カチオン（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム）、又はアンモニウム、又は置換されたアンモニウム（例えば、メチル−、ジメチル−及びトリメチルアンモニウムカチオン、及び第四アンモニウムカチオン、例えばテトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペリジニウム、及びアルキルアミン、例えばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン及びそれらの混合物から誘導された第四アンモニウムカチオン、及び同様のもの）である］で表される水溶性塩又は酸であるアルキルスルフェート界面活性剤を包含する。典型的には、C₁₂-C₁₆のアルキル鎖は、低い洗浄温度（例えば、約50度以上）のために好ましい。

他のアニオン性界面活性剤はまた、本発明の洗濯洗剤組成物にも含まれ得る。それらは、次のものを包含する：石鹸の塩（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、及び置換されたアンモニウム塩、例えばモノ−、ジ−及びトリエタノール塩）、C₈-C₂₂第一又は第二アルカンスルホネート、C₈-C₂₄オレフィンスルホネート、イギリス特許第1,082,179号明細書に記載されるような、アルカリ土類金属クエン酸塩の熱分解された生成物のスルホン化により調製されたスルホン化さえたポリカルボン酸、C₈-C₂₄アルキルポリグリコールエーテルスルホネート（10モルまでの酸化エチレンを含む）、アルキルグリセロールスルホネート、脂肪アシルグリセロールスルホネート、脂肪オレイルグリセロールスルホネート、アルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルホネート、パラフィンスルホネート、アルキルホスホネート、イセチオネート、例えばアシルイセチオネート、N−アシルタウレート、アルキルスクシナメート及びスルホスクシネート、スルホスクシネートのモノエステル（特に、飽和及び不飽和C₁₂-C₁₈モノエステル）及びスルホスクシネートのジエステル（特に、飽和及び不飽和C₆-C₁₂ジエステル）、アシルサルコシネート、アルキル多糖類のスルフェート、例えばアルキルポリグルコシドのスルフェート（非イオン性の硫酸化されていない化合物は下記に記載される）、枝分かれ鎖の第一アルキルスルフェート、及びアルキルポリエトキシカルボキシレート、例えば式RO（CH₂CH₂O）_k-CH₂COO-M⁺［式中、RはC₈-C₂₂アルキルであり、ｋは１〜10の整数であり、そしてMは可溶性塩形成カチオンである］で表されるそれらのもの。樹脂酸及び水素化された樹脂酸、例えばロジン、水素化されたロジン、及びタル油に存在するか又はその油から誘導された樹脂酸及び水素化された樹脂酸がまた適切である。

アルキルベンゼンスルホネートが適切である。線状（直鎖）アルキルベンゼンスルホネート（LAS）（ここで、アルキル基は好ましくは、10〜18個の炭素原子を含む）が特に好ましい。
さらなる例は、“Surface Active Agents and Detergents”（Vol. I and II by Schwartz, Perry and Berch）に記載される。種々のそのような界面活性剤はまた、一般的に、アメリカ特許第3,929,678号（第23頁左欄、第58行〜第29頁左欄、第23行；引用により本明細書に組み込まれる）にも開示される。

適切なカチオン性洗剤海面活性剤は、１つの長鎖ヒドロカルビル基を有すそれらのものである。そのようなカチオン性界面活性剤の例は、次のものを包含する：アンモニウム海面活性剤、例えばアルキルトリメチルアンモニウムハロゲン化物、及び下記式：

［R²（OR³）y］［R⁴（OR³）y］₂R⁵N⁺X^-
［式中、R²は、アルキル又はアルキル鎖に約８〜約18個の炭素原子を有するアルキルベンジル基であり；個々のR³は、-CH₂CH₂-, -CH₂CH（CH₃）-, -CH₂CH₂（CH₂OH）-, -CH₂CH₂CH₂-及びそれらの混合物から成る群から選択され；個々のR⁴は、C₁-C₄アルキル、C₁-C₄ヒドロキシアルキル、２つのR⁴基を連結することによって形成されるベンジル環構造体、及び-CH₂CHOHCHOHCOR⁶CHOHCH₂OH（ここで、R⁶は、約1000以下の分子量を有するいずれかのヘキソース又はヘキソースポリマー、及びｙが０でない場合、水素である）から成る群から選択され；R⁵は、R⁴と同じであるか、又はアルキル鎖であり、ここで炭素原子の合計数、又はR²＋R^5がが約18よりも大きくなく；個々のｙは０〜約10であり、そしてｙ値の合計０〜約15であり；そしてXがいずれかの適合できるアニオンである］を有するそれらの海面活性剤。

適切なカチオン性界面活性剤は、下記式：
R₁R₂R₃R₄N⁺X^-（ｉ）
［式、C₆-C₁₆アルキルであり、個々のR₂, R₃, 及びR₄は独立して、C₁-C₄アルキル、C₁-C₄ヒドロキシアルキル、ベンジル及び-（C₂H₄0）XH（ここで、Xは２〜５の値である）であり、Xはアニオンである］で表される本発明の組成物において有用な水溶性第四アンモニウム化合物である。多くとも１つのR₂, R₃又はR₄がベンジルであるべきである。

R₁のための好ましいアルキル鎖長は、特に、アルキル基がヤシ脂肪に由来する鎖長の混合物、又はオレフィン増成又はOXOアルコール合成により合成的に誘導される場合、C₁₂-C₁₅である。
R₂R₃及びR₄のための好ましい基は、メチル及びヒドロキシエチル基であり、そしてアニオンXは、ハロゲン化合物、メトスルフェ−ト、アセテート及びホスフェートイオンから選択され得る。

本明細書において使用するための式（ｉ）の適切な第四アンモニウム化合物の例は、次のものである：ヤシトリメチルアンモニウム塩化合物又は臭化物；ヤシメチルジヒドロキシエチルアンモニウム塩化物又は臭化物；デシルトリエチルアンモニウム塩化物；デシルジメチルヒドロキシエチルアンモニウム塩化物又は臭化物；C₁₂-C₁₅ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム塩化物又は臭化物；ヤシジメチルヒドロキシエチルアンモニウム塩化物又は臭化物；ミリスチルトリメチルスルフェート；ラウリルジメチルベンジルアンモニウム塩化物又は臭化物；ラウリルジメチル（エテノキシ）₄アンモニウム塩化物又は臭化物；コリンエステル［式（ｉ）（式中、R₁は、下記式：

であり、そしてR₂R₃R₄はメチルである）で表される化合物］；ジアルキルイミダゾリン［式（ｉ）の化合物］。
本明細書において有用な他のカチオン性界面活性剤は、アメリカ特許第4,228,044号及びヨーロッパ特許第000224号に記載される。

両性界面活性剤もまた適切である。それらの界面活性剤は、第二又は第三アミンの脂肪族誘導体、又は複素環式第二及び第三アミンの脂肪族誘導体として広く記載され得、ここで前記脂肪族基は直鎖又は枝分かれ鎖であり得る。脂肪族置換基の１つは少なくとも約８個の炭素原子、典型的には、約８〜約18個の炭素原子を含み、そして少なくとも1つは、アニオン性水溶性基、例えばカルボキシ、スルホネート又はスルフェートを含む。例えば、両性界面活性剤については、アメリカ特許第3,929,678号（第19頁左欄、第18〜35行）を参照のこと。

両性イオン性界面活性剤もまた、適切である。それらの界面活性剤は、第二及び第三アミンの誘導体、複素環式第二及び第三アミンの誘導体、又は第四アンモニウム、第四ホスホニウム又は第三スルホニウム化合物の誘導体として広く記載され得る。例えば、両性イオン性界面活性剤については、アメリカ特許第3,929,678号（第19頁左欄、第38行〜第22頁右欄、第48行）を参照のこと。

半−極性非イオン性界面活性剤は、約10〜約18個の炭素原子の1つのアルキル成分及び約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された2つの成分を含む水溶性アミン酸化物；約10〜約18個の炭素原子の１つのアルキル成分及び約１〜約３個の炭酸原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された２つの成分を含む水溶性ホスフィン酸化物；及び約10〜約18個の炭素原子の１つのアルキル成分及び約１〜約３個の炭酸原子のアルキル及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された１つの成分を含む水溶性スルホキシドを含む、特定カテゴリーの非イオン性界面活性剤である。

半−極性非イオン性洗剤界面活性剤は、下記式：

［式中、R³は、約８〜約22個の炭素原子を含む、アルキル、ヒドロキシアルキル又はアルキルフェニル基、又はそれらの混合物であり；R⁴は、約２〜約３個の炭素原子を含むアルキレン又はヒドロキシアルキレン基、又はそれらの混合物であり；Xは０〜約３であり；そして個々のR⁵は、約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル又はヒドロキシアルキル基、又は約１〜約３個の酸化エチレン基を含むポリ酸化エチレンである］で表される酸化アミン界面活性剤を含む。R⁵基は、環構造を形成するために、例えば酸素又は窒素原子を通して、お互い結合され得る。

それらのアミンの界面活性剤は特に、C₁₀-C₁₈アルキルジメチルアミン酸化物及びC₈-C₁₂アルコキシエチルジヒドロキシエチルアミン酸化合物を含む。

酵素安定剤：
本発明の酵素安定剤は、ホウ素酸及び/又はその誘導体のいずれかである。
本発明の特定の態様においては、前記安定剤は、フェニルホウ素酸及び/又はその誘導体である。
本発明は、ホウ素酸又はその誘導体を含んで成る液体酵素添加剤を包含する。特定の態様においては、本発明は、フェニルホウ素酸又はその誘導体を含んで成る液体酵素添加剤を包含する。

本発明の特定の態様においては、安定剤は、ナフタレンホウ素誘導体である。
液体酵素添加剤に存在する安定剤の量は、液体酵素添加剤に存在する酵素の量に依存する。添加される安定剤の量は特に、合計液体添加剤の0.1〜20％（w/w）、より特定には0.5〜8％（w/w）、例えばさらにより特定には、１〜５％（w/w）である。

本発明の特定の態様においては、安定剤の量は、合計液体添加剤の1％（w/w）以上である。本発明のより特定の態様においては、安定剤の量は、合計液体添加剤の1.5％（w/w）以上である。本発明の最も特定の態様においては、安定剤の量は、合計液体添加剤の２％（w/w）以上である。

本発明の特定の態様においては、酵素液体添加剤に添加される安定剤の量は、少なくとも0.1％（w/w）である。本発明のより特定の態様においては、酵素液体添加剤に添加される安定剤の量は、少なくとも0.5％（w/w）である。本発明のさらにより特定の態様においては、酵素液体添加剤に添加される安定剤の量は、少なくとも１％（w/w）である。本発明の最も特定の態様においては、酵素液体添加剤に添加される安定剤の量は、少なくとも1.5％（w/w）である。

本発明の特定の態様においては、酵素液体添加剤に添加される安定剤の量は、20％（w/w）以下である。本発明のより特定の態様においては、酵素液体添加剤に添加される安定剤の量は、15％（w/w）以下である。本発明のさらにより特定の態様においては、酵素液体添加剤に添加される安定剤の量は、10％（w/w）以下である。本発明の最も特定の態様においては、酵素液体添加剤に添加される安定剤の量は、５％（w/w）以下である。

本発明の特定の態様においては、フェニルホウ素酸誘導体は、次の式：

［式中、Rは、水素、ヒドロキシ、C₁-C₆アルキル、置換されたC₁-C₆アルキル、C₁-C₆アルケニル及び置換されたC₁-C₆アルケニルから成る群から選択される］のものである。
本発明の好ましい態様は、酵素、及び上記に開示される式のフェニルホウ素酸誘導体酵素安定剤を含んで成る液体組成物を提供し、前記式中、RはC₁-C₆アルキル、特にCH₃, CH₃CH₂又はCH₃CH₂CH₂であり、又はRは水素である。本発明の特定の態様においては、酵素の安定剤は、４−ホルミル−フェニル−ホウ素酸（４−FPBA）である。

本発明のもう１つの特定の態様においては、安定剤は、下記から成る群から選択される：
チオフェン-2 ホウ素酸、 チオフェン-3 ホウ素酸、 アセトアミドフェニル ホウ素酸、 ベンゾフラン-2 ホウ素酸、 ナフタレン-1 ホウ素酸、 ナフタレン-2 ホウ素酸、 2-FPBA、 3-FBPA、 4- FPBA、 1-チアントレン ホウ素酸、 4-ジベンゾフラン ホウ素酸、 5-メチルチオフェン-2 ホウ素酸、 チオナフタレン ホウ素酸、 フラン-2 ホウ素酸、 フラン-3 ホウ素酸、 4、4 ジフェニル- 二ホウ素酸、 6-ヒドロキシ-2-ナフタレン、 4-（メチルチオ）フェニル ホウ素酸、 4（トリメチル シリル）フェニル ホウ素酸、 3-ブロモチオフェン ホウ素酸、 4-メチルチオフェン ホウ素酸、 2- ナフチル ホウ素酸、 5-ブロモチオフェン ホウ素酸、 5-クロロチオフェン ホウ素酸、 ジメチル- チオフェン ホウ素酸、 2-ブロモフェニル ホウ素酸、

3-クロロフェニル ホウ素酸、 3-メトキシ- 2-チオフェン、 p-メチル-フェニルエチル ホウ素酸、 2-チアントレン ホウ素酸、 ジ-ベンゾチオフェン ホウ素酸、 4-カルボキシフェニル ホウ素酸、 9-アントリル ホウ素酸、 3、5 ジクロロフェニル ホウ素酸、 ジフェニル ホウ素酸無水物、 o-クロロフェニル ホウ素酸、 p-クロロフェニル ホウ素酸 m-ブロモフェニル ホウ素酸、 p-ブロモフェニル ホウ素酸、 p-フルオロフェニル ホウ素酸、 p-トリル ホウ素酸、 o-トリル ホウ素酸、 オクチル ホウ素酸、 1 、3、5 トリメチルフェニル ホウ素酸、 3- クロロ-4-フルオロフェニル ホウ素酸、 3-アミノフェニル ホウ素酸、 3、5-ビス-（トリフルオロメチル）フェニル ホウ素酸、 2、4 ジクロロフェニル ホウ素酸、 4-メトキシフェニル ホウ素酸。

安定剤として適切な追加のホウ素酸誘導体は、アメリカ特許第4,963,655号, アメリカ特許第5,159,060号, WO 95/12655号, WO 95/29223号, WO 92/19707号, WO 94/04653号, WO 94/04654号, アメリカ特許第5442100号, アメリカ特許第5488157号 及びアメリカ特許第5472628号に記載される。

アルカリ化合物：
液体酵素添加剤に添加される場合、７以上にpHを提供するいずれかの化合物が、酵素含有混合物のpHを調節するために使用され得る。適切な化合物は、塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアルカリ緩衝塩であり得る。
適切な緩衝塩は、炭酸水素カリウム、炭酸カリウム、ピロリン酸四カリウム、トリポリリン酸カリウム、炭酸水素ナトリウム及び炭酸ナトリウムであり得る。他の適切な塩又はアルカリ性pHを提供できる化合物が使用され得る。

液体酵素添加剤の製造方法：
本発明はさらに、液体酵素添加剤の調製に関する。液体酵素添加剤は、酵素、ホウ素酸又はその誘導体、及び界面活性剤を含んで成る。それらの化合物は、ランダムな順序で又はすべて同時に混合され得る。

本発明の特定の態様においては、本発明の方法は、
i）液体酵素調製物を供給し；
ii）i）の液体酵素調製物を、界面活性剤及びホウ素酸又はその誘導体と共に混合する段階を含んで成る。

本発明のより特定の態様においては、本発明の方法は、
i）液体酵素調製物を供給し；
ii）i）の液体酵素調製物を、ホウ素酸又はその誘導体と共に混合し；そして
iii）界面活性剤を、ホウ素酸又はその誘導体の添加の前又は後、液体酵素添加剤に一緒に添加する段階を含んで成る。
本発明のより特定の態様においては、界面活性剤は、ホウ素酸又はその誘導体が添加される前、液体酵素調製物と共に混合される。

本発明の特定の態様においては、1.5g/Lの酵素を含んで成る濃縮された液体酵素添加剤の製造方法は、
i）液体酵素調製物を供給し；
ii）i）の液体酵素調製物を、ホウ素酸又はその誘導体と共に混合し；そして
iii）界面活性剤を、ホウ素酸又はその誘導体の添加の前又は後、液体酵素添加剤に添加する段階を含んで成る。

前記界面活性剤は、ホウ素酸又はその誘導体が添加される前、発酵ブイヨン、細胞を有さない発酵ブイヨン、又は１又は複数の酵素を含む濃縮物に添加され得る。
本発明の特定の態様においては、界面活性剤は、発酵ブイヨンに添加される。本発明のより特定の態様においては、界面活性剤は、細胞を有さない発酵ブイヨンに添加される。本発明の最も好ましい態様においては、界面活性剤濃縮物に添加される。

本発明者は、液体酵素添加剤の調製方法が、添加剤の安定性及び従って、そこにおける沈殿物の形成に対して効果を有することをさらに見出した。
本発明の特定の態様においては、酵素添加剤のpHは、4.5〜11である。本発明のより特定の態様においては、酵素添加剤のpHは、5.5〜10である。
本発明者は、pHの調節、及び調節が起こる時間が、液体酵素添加剤における沈殿物の形成に対して効果を有することを見出した。

本発明者は、酵素含有液体のpHが、沈殿を回避するために、pH7.5〜10、より特定には８〜９に調節され得ることを見出した。
pHは好ましくは、酵素含有液体及びホウ素酸又はその誘導体の混合の前、調節され、それにより、沈殿物の形成が回避される。調節はまた、酵素及びホウ素酸又はその誘導体の混合の後、行われ、それにより形成される沈殿物が溶解される。

本発明の特定の態様においては、本発明の方法は、
i）液体酵素調製物を供給し；
ii）i）の液体酵素調製物を、ホウ素酸又はその誘導体と共に混合し；ホウ素酸又は誘導体の添加の前又は後、液体のpHを7.5〜10に調節する段階を含んで成る。

従って、本発明の特定の態様においては、本発明の方法は、
i）液体酵素調製物を供給し；
ii）i）の液体酵素調製物を、ホウ素酸又はその誘導体と共に混合し；ホウ素酸又は誘導体の添加の前又は後、液体のpHを7.5〜10に調節し；そしてホウ素酸又はその誘導体の添加の前又は後、液体に界面活性剤を添加する段階を含んで成る。
pHは、いずれかの適切なアルカリ性物質により調節され得る。特定の態様においては、pHはNaOHにより調節される。

特定の態様においては、液体酵素添加剤の製造方法は、
i）１又は複数の酵素を含んで成る液体酵素調製物を供給し；
ii）i）の液体酵素調製物を、界面活性剤と共に混合し；
iii）ii）の液体酵素調製物のpHを、7.5〜10に調節し；
iv）ii）の液体組成物を、ホウ素酸又はその誘導体と共に混合するか；
又は
i）１又は複数の酵素を含んで成る液体酵素調製物を供給し；
ii）i）の液体酵素調製物のpHを、7.5〜10に調節し；
iii）ii）の液体酵素調製物を、界面活性剤と共に混合し；
iv）ii）の液体組成物を、ホウ素酸又はその誘導体と共に混合する段階を含んで成る。

より特定の態様においては、液体酵素添加剤の製造方法は、
i）１又は複数の酵素を含んで成る液体酵素調製物を供給し；
ii）i）の液体酵素調製物を、界面活性剤と共に混合し；
iii）ii）の液体酵素調製物のpHを、7.5〜10に調節し；
iv）ii）の液体組成物を、フェニルホウ素酸又はその誘導体と共に混合するか；
又は
i）１又は複数の酵素を含んで成る液体酵素調製物を供給し；
ii）i）の液体酵素調製物のpHを、7.5〜10に調節し；
iii）ii）の液体酵素調製物を、界面活性剤と共に混合し；
iv）ii）の液体組成物を、フェニルホウ素酸又はその誘導体と共に混合する段階を含んで成る。

ホウ素酸又はその誘導体は、一部又は十分に溶解された形で、ホウ素酸又はその誘導体を含む固形物又は液体として、液体酵素調製物に添加され得る。本発明の特定の態様においては、ホウ素酸又はその誘導体は、添加の前、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムによりpH8.5〜10に調節されたグリセロール又は１，２−プロパンジオールに溶解される。
本発明の液体酵素添加剤を含んで成る組成物：

本発明はまた、本発明の液体酵素添加剤を含んで成る組成物にも関する。組成物はいずれの組成物でもあり得るが、しかし特に適切な組成物は、清浄組成物、個人介護用組成物、繊維加工用組成物、例えば漂白用組成物、医薬組成物、革加工組成物、パルプ又は紙加工用組成物、食品及び飲料用組成物及び動物使用用組成物である。
本発明の特定の態様においては、液体酵素添加剤は、液体洗剤、例えば洗濯洗剤における原料として使用される。
本発明はさらに、液体洗剤組成物への液体酵素添加剤の使用にも向けられる。

液体酵素添加剤を含んで成る本発明の液体組成物（例えば、液体洗剤）によれば、液体酵素添加剤は、0.01〜20％w/wの濃度で存在することができ、好ましくは組成物は、0.05〜10％w/wの液体酵素添加剤を含むことができ、より好ましくは、液体組成物は、0.1〜５％w/wの液体酵素添加剤を含むことができ、最も好ましくは、液体組成物は、0.1〜３％w/wの液体酵素添加剤を含むことができる。

本発明の液体酵素添加剤が液体組成物、例えば洗剤に使用される場合、個々の酵素の量は、純粋な酵素タンパク質として計算される場合、典型的には１〜1000mg/L、特に５〜750mg/L、特別には10〜500mg/Lであろう。

液体酵素添加剤を含んで成る本発明の液体組成物（例えば、液体洗剤）によれば、液体組成物は、0.001〜7.5％w/wのホウ素酸又はその誘導体を含むことができ、好ましくは液体組成物は、0.005〜４％w/wのホウ素酸又はその誘導体を含むことができ、より好ましくは液体組成物は、0.005〜1.2％w/wのホウ素酸又はその誘導体を含むことができ、最も好ましくは液体組成物は、0.01〜0.15％w/wのホウ素酸又はその誘導体を含むことができる。ホウ素酸又はその誘導体は、酸又は前記酸のアルカリ金属塩であり得る。
本発明はさらに次の例により記載されるが、但しそれらは本発明の範囲を制限するものではない。

例１：
プロテアーゼを、４−FPBA及び界面活性剤と共に配合した。プロテアーゼは、約40g/Lの酵素タンパク質及び55％の1.2−プロパンジオールを含む濃縮Savinase溶液（pH5.5）であった。この例においては試験される界面活性剤は、表に見られる。

界面活性剤をプロテアーゼに添加した（最終組成物においては、２％w/w）。混合の後、pHを10MのNaOHにより8.7に調節した。pHは、RadlometerからのpH計測器PHM93、及びRoss（商標）セミ−ミクロ組合わせpH電極（Orion 8103SC）を用いて測定された。使用される前、pH電極は、Radlometer Analyticalからの標準緩衝液（pH4.005オーダー番号：S11M002；pH7.000オーダー番号：S11M004及びpH10.012オーダー番号：S11M007）を用いて検量された。pH、室温で測定された。

10MのNaOHによりpH9.6に調節された１，２−プロパンジオール中、30％4−FPBA溶液を、酵素/界面活性剤混合物に添加し、1.6％w/wの４−FPBAの最終濃度を得た。最終酵素濃度は、36mg/mlであった。

次に、サンプルを２種のバイアルに移し、これを密封の後、それぞれ5℃及び40℃で４週間インキュベートした。貯蔵の後、サンプルの物理的安定性を、肉眼での観察により決定した。参照として、サンプルを同じ方法（但し、界面活性剤の添加を伴わない）により調製した。
肉眼での観察の結果は、表３に見られる：

例２：
プロテアーゼを、４−FPBA及び界面活性剤と共に配合した。例１に使用される同じ３種の界面活性剤を研究した。プロテアーゼは、44g/Lの酵素及び30％の１，２−プロパンジオールを含む濃縮されたAlcalase（商標）の溶液（pH5.2）であった。

界面活性剤をプロテアーゼに添加した（最終組成物において２％w/w）。混合の後、pHを10MのNaOHにより8.7に調節した。10MのNaOHによりpH9.6に調節された１，２−プロパンジオール中、30％4−FPBA溶液を、酵素/界面活性剤混合物に添加し、1.6％w/wの４−FPBAの最終濃度を得た。最終酵素濃度は、40mg/mlであった。

次に、サンプルを２種のバイアルに移し、これを密封の後、それぞれ5℃及び40℃で４週間インキュベートした。貯蔵の後、サンプルの物理的安定性を、肉眼での観察により決定した。参照として、サンプルを同じ方法（但し、界面活性剤の添加を伴わない）により調製した。
肉眼での観察の結果は、表４に見られる：

例３：
この実験は、例１及び２に概略されるようにして行われた。但し、界面活性剤の濃度が変更された。結果は表５に示される。

異なったプロテアーゼが、沈殿を完全に妨げるために添加される異なった量の界面活性剤を必要とすることが結論づけられる。

例４：
プロテアーゼ（例１におけるのと同じ）を、次の方法を用いて、４−FPBAと共に配合した：
１）界面活性剤を、液体プロテアーゼサンプルに添加し、2％w/wの最終濃度にした（表１を参照のこと）。
２）混合の後、pHを10MのNaOHにより8.7に調節した。

３）次に、４−FPBAを添加し、1.6％w/wの最終濃度にした。
４）次に、サンプルを２種のバイアルに移し、密封の後、それらを、それぞれ5℃及び40℃で４週間インキュベートした。
５）貯蔵の後、サンプルの物理的安定性を、肉眼での観察により決定した。
参照として、サンプルを段階１−５に従って調製し、但し界面活性剤の添加は伴わなかった。

成分：
４−FPBA溶液：
10MのNaOHによりpH9.6に調節された、１，２−プロパンジオール中、30％４−FPBA。
10g/Lの酵素タンパク質及び55％の１，２−プロパンジオールを含む濃縮されたサビナーゼ溶液（pH5.5）。

10MのNaOHによりpH9.6に調節された、１，２−プロパンジオール中、30％４−FPBA。
界面活性剤C（例１からの）。
界面活性剤D：R-O-（CH₂OH₂O）_nH, すなわちRが13〜15個の炭素原子の平均鎖長を有するアルカンであり、そしてn=3である２種の界面活性剤の混合物。
界面活性剤E：界面活性剤Dと同じ、但しn=7。

界面活性剤F：界面活性剤Dと同じ、但しRが13個の炭素原子の平均鎖長を有し、そしてn=8であるアルカンである。
界面活性剤G：界面活性剤Fと同じ、但しn=15。
界面活性剤H：R-O-（CH₂OH₂O）_nH, すなわちRが13個の炭素原子の平均鎖長を有するアルカンであり、そしてn=3及び8である２種の界面活性剤の混合物。
試験結果が表６に示される。

この試験は、９以下のHLB値を有する界面活性剤が作用しなかったことを示す。
酸素タンパク質の決定：
酵素溶液の酸素タンパク質の濃度を、多くの方法により決定することができる。酸素の比活性が知られている場合、酵素タンパク質濃度は、選択された条件組で酵素活性（単位/g材料）をまず決定し、そして比活性（単位/mg酵素タンパク質）により割り算することにより決定され得る。酵素の比活性は、当業界において知られている手段により酵素を均質性にまず精製することにより決定される。次に、酵素活性が、酵素タンパク質濃縮物における酵素活性を測定するために使用されるのと同じ条件組で精製されたサンプルにおいて決定される。

合計タンパク質濃度がまた、精製されたサンプルにおいて決定され、そして次に、比活性が、精製されたサンプルのタンパク質濃度により酵素活性を割り算することにより行われる。合計タンパク質濃度は、当業界において良く知られている多くの合計タンパク質アッセイの１つにより決定され得る（異なった比色タンパク質アッセイの再考が、Christine V. Sa- pan, Roger L. Lundblad and Nicholas C. Price in Biotechnol. Appl. Biochem.（1999）29, p99- 108により与えられる）。酵素含有溶液が活性形上での興味あるタンパク質を単に含む場合、酵素タンパク質濃度は、合計タンパク質濃度を測定することにより直接的に決定され得る。

本発明における使用される方法は、N, N−ジメチルカゼイン（DMC）の加水分解に基づかれるアッセイである。手短には、プロテアーゼ活性が、８分間のプレインキュベーション期間の後、10分間、420nmで分光学的に追跡される。アッセイを、pH8.3及び37℃で実施する。次の液体をアッセイのために使用する：
DMC−基質：90mMの四硼酸ナトリウム中、0.4％のN, N−ジメチルカゼイン、120mMのリン酸ナトリウム、0.2％Brij35、pH8.0に調節される。

TNBS溶液：水中、1.73mMの１，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸。
希釈緩衝液：0.15MのKCl、0.05Mの硼酸、0.16Mの亜硫酸ナトリウム、0.2％Brij35、pH9.0に調節される。

アッセイのために、80μlのTNBS溶液を、45μlのサンプル又は標準（希釈緩衝液により希釈された）と共に混合し、そして反応を、160μlのDMC−基質の添加により開始する。
合計タンパク質決定：
参照文献：M. Matsushita, T. Irino, T. Komoda and Y. Sakagishi "Determination of proteins by a reverse biuret method combined with the copper-bathocuproine chelate reaction", Clinica Chimica Acta, 216（1993）, p 103-111。

Claims (27)

1.5g/L以上の量で存在する酵素、ホウ素酸又はその誘導体、及び界面活性剤を含んで成る濃縮された液体酵素添加剤。

前記酵素が、5g/L以上の量で存在する請求項１記載の液体酵素添加剤。

前記pHが5〜10である請求項１記載の液体酵素添加剤。

前記液体酵素添加剤のpHを7.5〜10に調節するためにアルカリ性物質を、さらに含んで成る請求項１記載の液体酵素添加剤。

前記界面活性剤のHLB値が少なくとも９である請求項１記載の液体酵素添加剤。

前記界面活性剤のHLB値が10〜20である請求項１記載の液体酵素添加剤。

前記酵素がプロテアーゼである請求項１記載の液体酵素添加剤。

第２酵素、特にアミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又はオキシドレダクターゼ、又はいずれかのそれらの混合物をさらに含んで成る請求項７記載の液体酵素添加剤。

前記第２酵素がアミラーゼである請求項８記載の液体酵素添加剤。

前記フェニルホウ素酸又はその誘導体が、合計液体添加剤の20％w/wまでの量で存在する請求項１〜９のいずれか１項記載の液体酵素添加剤。

前記フェニルホウ素酸又はフェニルホウ素酸誘導体が、合計液体添加剤の0.1〜10％w/wの量で添加される請求項１〜10のいずれか１項記載の液体酵素添加剤。

前記ホウ素酸又はその誘導体が、フェニルホウ素又はその誘導体である請求項１記載の液体酵素添加剤。

前記フェニルホウ素酸の誘導体が、次の式：

［式中、Rは、水素、ヒドロキシ、C₁-C₆アルキル、置換されたC₁-C₆アルキル、C₁-C₆アルケニル及び置換されたC₁-C₆アルケニルから成る群から選択される］
で表されるフェニルホウ素酸誘導体酵素安定剤である請求項12記載の液体酵素添加剤。

RがC₁-C₆アルキルである請求項13記載の液体酵素添加剤。

Rが水素である請求項13記載の液体酵素添加剤。

前記界面活性剤が、
R-O-（CH₂CH₂O）nH
［式中、Rは８〜22個の炭素原子を有する、枝分かれ鎖又は直鎖のアルカンであり、そしてnは３に等しいか又は３以上である］、

［式中、X＝５、ｍ＋n＝９〜11］、

［式中、X＝９、ｎ＋ｍ＝９〜11］、

［式中、ｍ＋ｎ＝12〜14、X＝７、ｙ＝2.5］、及び
（CH₃）₂C₆H₃SO₃Na
から成る群から選択される請求項１記載の液体酵素添加剤。

前記界面活性剤が、合計液体添加剤の0.1〜10％の量で添加される請求項１〜16のいずれか１項記載の液体酵素添加剤。

前記界面活性剤が、合計液体添加剤の0.25〜８％の量で添加される請求項１〜16のいずれか１項記載の液体酵素添加剤。

i）液体酵素調製物を供給し；
ii）i）の液体酵素調製物を、界面活性剤及びホウ素酸又はその誘導体と共に混合する段階を含んで成る請求項１記載の液体酵素添加剤の製造方法。

前記液体酵素添加剤のpHが、５〜10である請求項19記載の方法。

前記液体酵素添加剤のpHを7.5〜10に調節するためにアルカリ性物質を添加する段階をさらに含んで成る請求項19記載の方法。

前記アルカリ性物質が、請求項19記載の段階ii）の前、添加される請求項21記載の方法。

前記アルカリ性物質がNaOHである請求項21記載の方法。

液体洗剤組成物への請求項１〜18のいずれか１項記載の液体酵素添加剤の使用。

請求項１〜18のいずれか１項記載の液体酵素添加剤を含んで成る液体組成物。

前記液体組成物が洗剤である請求項25記載の液体組成物。

前記液体酵素添加剤が、液体酵素添加剤の合計量の0.01〜20％w/wの量で洗剤に存在する請求項26記載の液体組成物。