JP2013090600A - 乳酸生産菌 - Google Patents
乳酸生産菌 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013090600A JP2013090600A JP2011235485A JP2011235485A JP2013090600A JP 2013090600 A JP2013090600 A JP 2013090600A JP 2011235485 A JP2011235485 A JP 2011235485A JP 2011235485 A JP2011235485 A JP 2011235485A JP 2013090600 A JP2013090600 A JP 2013090600A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pyrf
- morella
- promoter
- bacterium
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【解決手段】異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子をモーレラ属細菌のゲノムに組み込む工程を備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。異種細菌がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクスであり、同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを組み込む方法。更に、上記方法によって作製された遺伝子組換えモーレラ属細菌を有機栄養的に培養する工程を備える乳酸の製造方法。
【選択図】なし
Description
すなわち、本発明は以下に掲げる(1)〜(37)を提供する。
(2)上記LDH遺伝子が相同組換えによってゲノムに組み込まれた、上記(1)に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(3)上記LDH遺伝子が同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)によって発現している、上記(1)または(2)に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(4)上記異種細菌がサーモアナエロバクテアリア(Thermoanaerobacteriales)目に帰属する細菌である、上記(1)〜(3)のいずれかに記載のモーレラ属細菌。
(5)上記異種細菌がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)である、上記(1)〜(3)のいずれかに記載のモーレラ属細菌。
(7)上記LDH遺伝子がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)に由来する、上記(6)に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(8)上記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、上記(6)に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(9)上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、上記(6)〜(8)のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(10)上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、上記(6)〜(9)のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(11)上記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする、上記(6)〜(10)のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(12)上記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、上記(6)〜(10)のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(13)NITE特許微生物寄託センター(NPMD)に受託番号NITE AP−1154で寄託されている、上記(6)〜(12)のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(15)上記工程が相同組換えにより行われる、上記(14)に記載の方法。
(16)上記LDH遺伝子とともに、同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を組み込む、上記(14)または(15)に記載の方法。
(17)上記異種細菌がサーモアナエロバクテアリア(Thermoanaerobacteriales)目に帰属する細菌である、上記(14)〜(16)のいずれかに記載の方法。
(18)上記異種細菌がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)である、上記(14)〜(16)のいずれかに記載の方法。
上記DNAコンストラクトをモーレラ属細菌のpyrF破壊株に形質転換する工程と
を備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
(20)上記LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードする、上記(19)に記載の方法。
(21)上記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、上記(19)に記載の方法。
(22)上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、上記(19)〜(21)のいずれかに記載の方法。
(23)上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、上記(19)〜(21)のいずれかに記載の方法。
(24)上記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする、上記(19)〜(23)のいずれかに記載の方法。
(25)上記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、上記(19)〜(23)のいずれかに記載の方法。
(26)モーレラ属細菌の野生株またはpyrF未破壊株のpyrFを相同組換えによって破壊する工程
をさらに備える、上記(19)〜(25)のいずれかに記載の方法。
(27)上記pyrF破壊株がモーレラ・サーモアセティカ(Moorella thermoacetica) ATCC 39079株のpyrFを相同組換えによって破壊して得られる、上記(19)〜(25)のいずれかに記載の方法。
(28)上記pyrF破壊株がNITE特許微生物寄託センター(NPMD)に受託番号NITE P−1057で寄託されている株である、上記(27)に記載の方法。
(29)上記(19)〜(28)のいずれかに記載の方法によって作製された、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(31)上記LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードする、上記(30)に記載のDNAコンストラクト。
(32)上記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、上記(30)に記載のDNAコンストラクト。
(33)上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、上記(30)〜(32)のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
(34)上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、上記(30)〜(32)のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
(35)上記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする、上記(30)〜(34)のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
(36)上記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、上記(30)〜(34)のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
また、本発明によれば、乳酸生産性を付与した遺伝子組換えモーレラ属細菌を有機栄養的に培養して乳酸を製造する方法が提供される。
本発明の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌は、「異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子が発現している、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌」である。
上記LDH遺伝子をモーレラ属細菌のホストに組み込む方法は、特に限定されないが、相同組換えを用いることが好ましい。
上記ホストに組み込まれた上記LDH遺伝子を発現するプロモーターは、特に限定されないが、同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)が好ましい。
上記異種細菌は、特に限定されないが、サーモアナエロバクテアリア(Thermoanaerobacteriales)目に帰属する細菌が好ましく、サーモアナエロバクター(Thermoanaerobacter)属に帰属する細菌がより好ましく、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)がさらに好ましい。
以下、本発明の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌について詳細に説明する。
遺伝子組換えを行うモーレラ属細菌(「ホストのモーレラ属細菌」ともいう。)は、モーレラ・サーモアセティカ(Moorella thermoacetica)、モーレラ・サーモオートトロフィカ(M. thermoautotrophica)、モーレラ・グリセリニ(M. glycerini)もしくはモーレラ・ムルデリ(M. mulderi)に分類される細菌または細菌分類学的にモーレラ属に分類される細菌であれば特に限定されないが、モーレラ・サーモアセティカが好ましく、なかでも、ATCC 39073株またはその変異株がより好ましく、ATCC 39073株のオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)を破壊して作出したウラシル要求性変異株である、NITE P−1057株がさらに好ましい。
モーレラ属細菌のゲノムに組み込まれる乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子は、配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードするものであれば特に限定されないが、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)に由来するもの、または配列番号2のDNA塩基配列からなるものが好ましい。
グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(リン酸化)(GAPDH,EC 1.1.1.12)は、解糖系/糖新生に関与する酵素であり、D−グリセルアルデヒド−3−リン酸と1,3−ビスホスホグリセリン酸との相互変換を触媒し(下記反応式)、常時発現している。
オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子はオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ(OMPデカルボキシラーゼ,EC 4.1.1.23)をコードする遺伝子である。
本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌において、乳酸生産性は、有機栄養的に培養した場合に乳酸を生産する能力があることをいう。有機栄養的に培養する場合の炭素源としては、本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌が資化できるものであれば特に限定はされないが、例えば、グルコース、フルクトース等のヘキソース類が挙げられる。
本発明において、異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子が発現している、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を製造する方法は、特に限定されないが、異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子をモーレラ属細菌のゲノムに組み込む工程を備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法によることが好ましい。
本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌を製造するためのDNAコンストラクト(ターゲティングベクター)は、骨格となるプラスミドベクターおよび相同組換え領域を含むものが好ましく、さらに薬剤耐性(感受性)遺伝子を含んでもよい。
上記相同組換え領域は、オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を含み、上記G3PDプロモーターを含む領域が上記LDH遺伝子の上流に上記LDH遺伝子を発現するように連結され、上記G3PDプロモーターおよび上記LDH遺伝子が上記pyrFの上流域または下流域に挿入されたものが好ましい。
前記LDH遺伝子としては、配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードするものであれば特に限定されないが、サーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)に由来するもの、または配列番号2のDNA塩基配列からなるものが好ましい。
前記G3PDプロモーターとしては、ホストのモーレラ属細菌種に由来するもの、すなわち、ホストのモーレラ属細菌と同種のモーレラ属細菌に由来するもの、であれば特に限定されないが、ホストのモーレラ属細菌株もしくはその野生株に由来するもの、またはホストのモーレラ属細菌株もしくはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一であるもの、が好ましい。
上記pyrFは、モーレラ属細菌のpyrF破壊株に導入したとき正常に機能するタンパク質を発現するものであれば、特に限定されず、ホストのモーレラ属細菌に由来するものであってもよいし、外来性のpyrFであってもよい。
pyrF、G3PDおよびLDH遺伝子の配置は、G3PDおよびLDHがpyrFの上流域または下流域に挿入された配置であって、pyrFおよびLDHが正常に発現する配置であれば特に限定されない。
DNAコンストラクト(ターゲティングベクター)の構築方法としては、特に限定されず、適当なプラスミドベクターに上記相同組換え領域を組み込む方法が挙げられる。
pyrF破壊株の作出方法は特に限定されないが、モーレラ属細菌の野生株またはpyrF未破壊株のpyrFを相同組換えによって破壊したものが好ましい。
上記DNAコンストラクト(ターゲティングベクター)を上記pyrF破壊株に形質転換をする方法は特に限定されず、DNAコンストラクトの骨格となるプラスミドベクターに合わせて適宜選択することが好ましい。大腸菌およびモーレラ属細菌の両方で複製するシャトルベクターでない場合には、pyrF破壊株への導入方法としては、エレクトロポレーションが好ましい方法の一つである。
モーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株のpyrFを破壊し、ウラシル要求性変異株を作製した。
以下の手順でモーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株のオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrFを破壊するためのベクターを構築した。
モーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株を完全合成培地(改変ATCC 1754 PETC Medium、表22Aを参照)に植菌し、55℃で嫌気的に培養した。
培養後、NucleoSpin Tissue(MACHEREY−NAGEL社製)を用いてトータルDNAを抽出した。
上記「遺伝子破壊ベクターpk18−dpyrFの構築」で生育が見られたコロニーを、カナマイシンを添加したLB培地に移植した後、コロニーダイレクトPCRを行い、インサートの確認を行った。プライマーは表1に示すpyrF−up−Fl(配列番号6)、pyrF−dn−R1(配列番号9)を用いた。コロニーダイレクトPCRの反応液組成を表6に、反応条件を表7に示す。コロニーを反応液に入れてPCRを行った。なお、SapphireAmp Fast PCR Master Mix (2×Premix)および滅菌蒸留水は、SapphireAmp(R) PCR Master Mix(タカラバイオ社製)に含まれるものを用いた。
バンドが確認できた株を、カナマイシンを添加したLB液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。
上記(1)で構築した遺伝子破壊ベクターpK18−dpyrFを、以下の手順で、モーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株に導入し、ダブルクロスオーバーの相同性組換えによってpyrFが破壊された株(dpyrF株)を選抜した。
272mMスクロース、16mM HEPESの組成で、水酸化カリウムを用いてpH7に合わせたHS緩衝液を調製し、20分間N2ガスで溶存酸素を置換した。
上記寒天培地に形成された20個のコロニーを、5mLのウラシル10μg/mL、5−FOA 0.2%の終濃度で添加した液体培地に植菌し、培養3日目に培地が濁っていることが確認できた6株を選択し、培養液1mLを集菌した。
(1)pyrF相補ベクターpK18−epyrFの構築
[pyrF相補ベクターpK18−epyrFの構築]
以下に示すプライマーpyrF−up−F1(配列番号6)とpyrF−dn−R1(配列番号9)との組み合わせを用いて、以下の条件でPCRを行い、pyrF遺伝子翻訳領域とその5’側の約1000bp、3’側の約1000bpを含む約2.7kbの遺伝子断片を増幅した。なお、KOD FX(PCR酵素)、2× PCR Buffer for KOD FXおよび2mM dNTPsは、KOD FX(東洋紡社製)に含まれるものを用いた。
2μLのSmaI処理をしたプラスミドpK18mobを、8μLのゲル抽出したPCR産物、10μLのLigation high Ver.2(東洋紡製)と混合し、16°Cで1時間インキュベートした。
Escherichia coli HST08 Premiumコンピテントセル(タカラバイオ製)にライゲーション溶液10μLを添加して軽く攪拌した。
氷中に10分静置した。
42℃で1分間ヒートショックを与えた後、すぐに氷中に静置した。
SOC培地を1ml加え、37℃で1時間インキュベート後、LB寒天培地(カナマイシン、X−gal、IPTG含有)に塗沫した。
37℃で一晩培養後、生えてきたコロニーを取得した。
上記(1)で生育が見られたコロニーをカナマイシン添加LB寒天培地に移植した後、コロニーダイレクトPCRを行い、インサートの確認を行った。プライマーはpyrF−up−F1(配列番号6)、pyrF−dn−R1(配列番号9)を用いた。コロニーダイレクトPCRの条件を以下に示す。なお、KOD FX(PCR酵素)、2× PCR Buffer for KOD FXおよび2mM dNTPsは、KOD FX(東洋紡社製)に含まれるものを用いた。
バンドが確認できた株について、カナマイシンを添加したLB液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。
吸光度による濃度測定、およびEcoRIまたはPstI処理サンプルの電気泳動を行った。
さらに、シーケンスによる塩基配列の解読を行って目的のpyrF遺伝子相補ベクターpK18−epyrFが構築できていることを確認した。
T. pseudethanolicus 39E株の乳酸脱水素酵素遺伝子(T−ldh)を取得し、上記(2)で構築したpyrF遺伝子相補ベクターpK18−epyrFのpyrF遺伝子領域へ挿入し、T−ldh遺伝子導入用相補ベクターpK18−ldhを構築することを目的とした。
形質転換のためのホストは、モーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株のpyrF遺伝子破壊株として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した NITE P−1057 株を用いた。
T. pseudethanolicus 39E株のTotal DNA、およびプライマーpyrF−1765−F(配列番号16:5'-tcggcctgctttcatgcttg-3')とpyrF−1764−R(配列番号17:5'-agttattatttcaccatctctatttc-3')とを用いて、pyrF相補ベクターpK18−epyrFを鋳型として、pyrF領域を含むベクター領域をPCR増幅した。PCRの条件は以下の通りである。なお、KOD FX(PCR酵素)、2× PCR Buffer for KOD FXおよび2mM dNTPsは、KOD FX(東洋紡社製)に含まれるものを用いた。
希釈したサンプル10μlを形質転換に用いた。
ダイレクトPCRによりコロニーを選択した。
ldh−F−1およびldh−R−1をプライマーとしたコロニーダイレクトPCRの結果、全ての株において目的のバンドが確認できた。それらの株の中から3株ずつを培養し、プラスミドを抽出した。制限酵素(EcoRI、EcoRV、またはPstI)処理、および電気泳動による確認の結果、全ての株においてT−Idhの挿入が確認できた。
宿主としては、M. thermoacetica ATCC 39073のpyrF破壊株として、先に独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託したdpyrF株(登録名MTA−D−pF株 受託番号NITE P−1057)を用いた。ここでは、上記(2)で構築したT−ldh導入用相補ベクターpK18−ldhをdpyrF株の細胞内にエレクトロポレーション法によって導入し、ダブルクロスオーバーの相同組換えによって、dpyrF株の染色体にT−ldhを組み込むことを目的とした。
dpyrF株は完全合成培地+終濃度0.01g/Lのウラシルに植菌し、H2+CO2を炭素源として55℃で培養した。OD600=0.1前後まで培養し、エレクトロポレーション用のサンプルとした。
培養液を272mMスクロースbufferで2回洗浄した。
洗浄後のペレットにスクロースbufferを4ml加えて懸濁した。
エレクトロポレーション用のキュベット(2mmギャップ)に懸濁液を380μl、形質転換用プラスミドを20μl加えた。この際、プラスミド量が1μg〜2μgとなるように調整した。
1.5kV、500Ω、50μFでパルスを与えた。
パルスを与えた懸濁液を、5mlの完全合成培地+終濃度0.01g/Lのウラシル+終濃度5g/Lのフルクトースの入ったバイアルに植菌した。
55℃で48時間培養した。
ロールチューブ法により、コロニー形成を試みた。
培養5〜7日で得られたコロニーを、5mlの完全合成培地+終濃度5g/Lのフルクトースの入ったバイアルに植菌した。
増殖が確認できた3株を50mlの完全合成培地+H2+CO2の入ったバイアルへ移し、T−ldh遺伝子導入株候補とした。
3株のT−ldh導入株候補からTotal DNAを抽出した。抽出キットにはNucleoSpin Tissue(MACHEREY−NAGEL)を使用し、抽出方法は添付のマニュアルに従った。
上記(2)で構築したC31株(MTA−T−ldh株)に導入されたT−ldhが転写されているか、定量RT−PCRを用いて調べた。
C31株(MTA−T−ldh株)およびATCC39073株を完全合成培地+終濃度5g/Lのフルクトースで、dpyrF株を完全合成培地+終濃度5g/Lのフルクトース+終濃度0.01g/Lのウラシルで、それぞれ培養した。
上記(3)でT−ldhの転写が確認できた。そこで、T−ldhの転写産物から乳酸デヒドロゲナーゼが合成され、機能しているかを確認するために乳酸デヒドロゲナーゼの比活性を測定した。
完全合成培地にリン酸buffer(pH6.5)を50mMとなるように添加した。炭素源としてフルクトースを60mMとなるように加えた。
C31株(MTA−T−ldh株)、ATCC39073株を上述の培地に10%植菌した。
OD600、pH、フルクトース濃度(HPLC分析)、乳酸濃度(HPLC分析)、酢酸濃度(HPLC分析)を経時的に測定した。HPLCの条件を以下に示す。
・装置名: 日本分光製 LC−2000Plus シリーズ(ポンプ:PU−2080Plus、オートサンプラー:AS−2057Plus、カラムオーブン:CO−2065Plus、検出器:RI−2031Plus)
・カラム: BIO−RAD製 発酵モニタリングカラム(カタログNo.125−0115)
・カラム温度: 65℃
・使用バッファー: 1mM H2SO4
・流速: 1ml/min
・検出器: RI
図4(A)には野生株とC31株(MTA−T−ldh株)をフルクトースとリン酸bufferを含んだ完全合成培地で培養した際のOD600とpH、図4(B)にはフルクトース消費量、乳酸および酢酸の生成量の経時変化を示した。
C31株(MTA−T−ldh株)と野生株は増殖に伴い、フルクトースが消費され、酢酸が生成され、pHが低下した。pHはリン酸bufferの影響で、pH5程度までしか下がらなかった。野生株は乳酸を蓄積しなかったが、C31株(MTA−T−ldh株)は酢酸の生成と同様に、増殖と連動して乳酸を蓄積し、定常期に入ると生成は止まった。C31株(MTA−T−ldh株)は最終的には0.7g/L(6.8mM)の乳酸を蓄積した。
受託番号:NITE P-1057
寄託日:2011年2月15日
受託機関:独立行政法人製品技術評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)
識別の表示:MTA-T-ldh
受領番号:NITE AP-1154
受領日:2011年10月24日
受託機関:独立行政法人製品技術評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)
Claims (37)
- 異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子が発現している、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- 前記LDH遺伝子が相同組換えによってゲノムに組み込まれた、請求項1に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- 前記LDH遺伝子が同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)によって発現している、請求項1または2に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- 前記異種細菌がサーモアナエロバクテアリア(Thermoanaerobacteriales)目に帰属する細菌である、請求項1〜3のいずれかに記載のモーレラ属細菌。
- 前記異種細菌がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)である、請求項1〜3のいずれかに記載のモーレラ属細菌。
- 乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子およびグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)がオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)の上流域または下流域に組み込まれ、該LDH遺伝子が該G3PDプロモーターによって発現している乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌であって、該LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードし、かつ、該G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来する、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- 前記LDH遺伝子がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)に由来する、請求項6に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- 前記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、請求項6に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- 前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、請求項6〜8のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- 前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、請求項6〜9のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- 前記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする、請求項6〜10のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- 前記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、請求項6〜10のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- NITE特許微生物寄託センター(NPMD)に受託番号NITE AP−1154で寄託されている、請求項6〜12のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- 異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子をモーレラ属細菌のゲノムに組み込む工程を備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。
- 前記工程が相同組換えにより行われる、請求項14に記載の方法。
- 前記LDH遺伝子とともに、同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を組み込む、請求項14または15に記載の方法。
- 前記異種細菌がサーモアナエロバクテアリア(Thermoanaerobacteriales)目に帰属する細菌である、請求項14〜16のいずれかに記載の方法。
- 前記異種細菌がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)である、請求項14〜16のいずれかに記載の方法。
- オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を含み、該G3PDプロモーターを含む領域が該LDH遺伝子の上流に該LDH遺伝子を発現するように連結され、該G3PDプロモーターおよび該LDH遺伝子が該pyrFの上流域または下流域に挿入されたDNAコンストラクトであって、該pyrFおよび該G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来し、かつ、該LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードするDNAコンストラクトを構築する工程と、
前記DNAコンストラクトをモーレラ属細菌のpyrF破壊株に形質転換する工程と
を備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。 - 前記LDH遺伝子がサーモアナエロバクター・シュードエタノリクス(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)に由来する、請求項19に記載の方法。
- 前記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、請求項19に記載の方法。
- 前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、請求項19〜21のいずれかに記載の方法。
- 前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、請求項19〜21のいずれかに記載の方法。
- 前記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする、請求項19〜23のいずれかに記載の方法。
- 前記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、請求項19〜23のいずれかに記載の方法。
- モーレラ属細菌の野生株またはpyrF未破壊株のpyrFを相同組換えによって破壊する工程
をさらに備える、請求項19〜25のいずれかに記載の方法。 - 前記pyrF破壊株がモーレラ・サーモアセティカ(Moorella thermoacetica) ATCC 39079株のpyrFを相同組換えによって破壊して得られる、請求項19〜25のいずれかに記載の方法。
- 前記pyrF破壊株がNITE特許微生物寄託センター(NPMD)に受託番号NITE P−1057で寄託されている株である、請求項27に記載の方法。
- 請求項19〜28のいずれかに記載の方法によって作製された、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を含み、該G3PDプロモーターを含む領域が該LDH遺伝子の上流に該LDH遺伝子を発現するように連結され、該G3PDプロモーターおよび該LDH遺伝子が該pyrFの上流域または下流域に挿入されたDNAコンストラクトであって、該pyrFおよび該G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来し、かつ、該LDH遺伝子がフィルミクテス(Firmicutes)門クロストリジウム(Clostridia)綱に属する乳酸生産性を持つ細菌に由来するDNAコンストラクト。
- 前記LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードする、請求項30に記載のDNAコンストラクト。
- 前記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、請求項30に記載のDNAコンストラクト。
- 前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、請求項30〜32のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
- 前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、請求項30〜32のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
- 前記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする、請求項30〜34のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
- 前記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、請求項30〜34のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌または請求項14〜28のいずれかに記載の方法によって作製された遺伝子組換えモーレラ属細菌を有機栄養的に培養する工程を備える乳酸の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011235485A JP5858463B2 (ja) | 2011-10-26 | 2011-10-26 | 乳酸生産菌 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011235485A JP5858463B2 (ja) | 2011-10-26 | 2011-10-26 | 乳酸生産菌 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013090600A true JP2013090600A (ja) | 2013-05-16 |
JP5858463B2 JP5858463B2 (ja) | 2016-02-10 |
Family
ID=48614273
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011235485A Expired - Fee Related JP5858463B2 (ja) | 2011-10-26 | 2011-10-26 | 乳酸生産菌 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5858463B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015023854A (ja) * | 2013-07-29 | 2015-02-05 | 三井造船株式会社 | モーレラ属細菌の酢酸非生産・乳酸生産株 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005518197A (ja) * | 2001-11-23 | 2005-06-23 | カーギル ダウ エルエルシー | カンジダ菌種の細胞における有機生成物の産生のための方法及び材料 |
JP2006238830A (ja) * | 2005-03-04 | 2006-09-14 | Ajinomoto Co Inc | 新規乳酸脱水素酵素遺伝子及び乳酸の製造法 |
JP2010017131A (ja) * | 2008-07-10 | 2010-01-28 | Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd | モーレラ属細菌及びプライマー |
WO2010032698A1 (ja) * | 2008-09-16 | 2010-03-25 | 三井化学株式会社 | 植物由来原料から乳酸を生産する方法及び乳酸生産細菌 |
WO2011019717A1 (en) * | 2009-08-10 | 2011-02-17 | Mascoma Corporation | Positive and negative selectable markers for use in thermophilic organisms |
-
2011
- 2011-10-26 JP JP2011235485A patent/JP5858463B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005518197A (ja) * | 2001-11-23 | 2005-06-23 | カーギル ダウ エルエルシー | カンジダ菌種の細胞における有機生成物の産生のための方法及び材料 |
JP2006238830A (ja) * | 2005-03-04 | 2006-09-14 | Ajinomoto Co Inc | 新規乳酸脱水素酵素遺伝子及び乳酸の製造法 |
JP2010017131A (ja) * | 2008-07-10 | 2010-01-28 | Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd | モーレラ属細菌及びプライマー |
WO2010032698A1 (ja) * | 2008-09-16 | 2010-03-25 | 三井化学株式会社 | 植物由来原料から乳酸を生産する方法及び乳酸生産細菌 |
WO2011019717A1 (en) * | 2009-08-10 | 2011-02-17 | Mascoma Corporation | Positive and negative selectable markers for use in thermophilic organisms |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015023854A (ja) * | 2013-07-29 | 2015-02-05 | 三井造船株式会社 | モーレラ属細菌の酢酸非生産・乳酸生産株 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5858463B2 (ja) | 2016-02-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2825267C (en) | Recombinant clostridium bacterium and uses thereof in isopropanol production | |
US9994878B2 (en) | Recombinant microorganisms and uses therefor | |
US9315832B2 (en) | Cyanobacterium sp. host cell and vector for production of chemical compounds in Cyanobacterial cultures | |
US9365868B2 (en) | Fermentation process for producing isopropanol using a recombinant microorganism | |
US9834795B2 (en) | Recombinant microorganisms and uses therefor | |
EP3221459B1 (fr) | Procédé de production d'au moins un métabolite d'intérêt par transformation d'un pentose dans un microorganisme | |
KR20150020619A (ko) | 재조합 미생물 및 그에 대한 용도 | |
EA019482B1 (ru) | Клетка, ферментирующая сахар-пентозу | |
KR101674361B1 (ko) | 유기산 제조에서의 모나스쿠스의 용도 | |
US20150376654A1 (en) | Recombinant microorganisms with increased tolerance to ethanol | |
BR112021011629A2 (pt) | Via de coprodução de derivados de 3-hp e acetil-coa a partir de malonato semialdeído | |
JP2013537429A (ja) | 改変微生物による改良されたグリコール酸発酵生産 | |
JP2017534268A (ja) | 有用産物の生産のための改変微生物および方法 | |
JP2014207885A (ja) | 遺伝子改変クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム | |
US9587256B2 (en) | Sequestration of carbon dioxide with hydrogen to useful products | |
JP5858463B2 (ja) | 乳酸生産菌 | |
Kita et al. | Isolation of thermophilic acetogens and transformation of them with the pyrF and kanr genes | |
KR20160111947A (ko) | 재조합 미생물의 생산 방법 | |
US20230242947A1 (en) | Genetically engineered rhodopseudomonas palustris | |
JP5963538B2 (ja) | モーレラ属細菌の遺伝子組換え法 | |
US20210261911A1 (en) | Microorganisms engineered for muconate production | |
US20150275238A1 (en) | Genetically engineered microbes and methods for converting organic acids to alcohols | |
Reddy et al. | Metabolic Engineering an ATP-neutral EMP pathway in Corynebacterium glutamicum: adaptive point mutation in NADH dehydrogenase restores growth | |
ES2607894T3 (es) | Enzimas productoras de acetil-CoA en levadura | |
BR112015007234B1 (pt) | Levedura transformada e método para a produção de etanol |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130711 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20130711 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130909 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141118 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150116 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150616 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150707 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20151117 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20151210 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5858463 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |