JP2013049928A

JP2013049928A - 生体適合性を有するナノ繊維及びその製造方法並びに細胞足場材料

Info

Publication number: JP2013049928A
Application number: JP2011187462A
Authority: JP
Inventors: Ick-Soo Kim; 翼水金; Byoung Suhk Kim; ビョンソク金; Kyu-O Kim; ギュオ金; Kei Watanabe; 圭渡邊; Yaeko Akada; 弥恵子赤田; Jae Hwan Lee; 在煥李
Original assignee: Shinshu University NUC; Toptec Co Ltd
Current assignee: Shinshu University NUC; Toptec Co Ltd
Priority date: 2011-08-30
Filing date: 2011-08-30
Publication date: 2013-03-14
Also published as: KR20130024726A

Abstract

【課題】機械的強度及び形状安定性に優れるとともに生分解性及び生体適合性に優れ、生体内での劣化が遅く、細胞への接着性に優れる細胞足場材料を提供する。
【解決手段】ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）と、多面体オリゴシルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との共重合体とを有するナノ繊維を含む細胞足場材料。ＰＯＳＳとＰＥＧとの共重合体は、プロピルジメチルシリルシクロヘキシルイソシアネート−ＰＯＳＳとＰＥＧとをウレタン結合させて得る。
【選択図】図５

Description

本発明は、生体適合性を有するナノ繊維、より詳しくは細胞足場材料（Scaffold）として有用なナノ繊維及びその製造方法並びに細胞足場材料に関する。

ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）は、機械的強度及び形状安定性に優れるとともに他のポリマーと比較して生分解性及び生体適合性に優れるという特徴をもった半結晶性ポリマーとして知られており、生体内での劣化が遅いため、生体内で使用する細胞足場材料として有望である（例えば、特許文献１及び２参照。）。

国際公開第２００６／１３５１０３号国際公開第２００７／１０２６０６号

しかしながら、ＰＣＬは強い疎水性を示すため、ＰＣＬを細胞足場材料として用いた場合、ＰＣＬに細胞が接着し難い（細胞への接着性に劣る）という性質がある。従って、ＰＣＬのように機械的強度及び形状安定性に優れるとともに生分解性及び生体適合性に優れ、生体内での劣化が遅く、しかもＰＣＬよりも細胞への接着性に優れる新材料の出現が望まれている。

そこで、本発明は、このような状況に鑑みてなされたもので、機械的強度及び形状安定性に優れるとともに生分解性及び生体適合性に優れ、生体内での劣化が遅く、細胞への接着性に優れるナノ繊維及びその製造方法並びに細胞足場材料を提供することを目的とする。

［１］本発明のナノ繊維は、ポリカプロラクトンと、ポリエチレングリコールと多面体オリゴシルセスキオキサン（ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌｏｌｉｇｏｓｉｌｓｅｓｑｕｉｏｘａｎｅ）との共重合体とを有する。

［２］本発明のナノ繊維においては、前記多面体オリゴシルセスキオキサンが以下の式（１）で表される多面体オリゴシルセスキオキサンであることが好ましい。
（但し、式（１）中、Ｒはアルキル基を示し、Ｒ’は末端に反応性の基を有する官能基を示す。）

［３］本発明のナノ繊維においては、前記ポリエチレングリコールの数平均分子量が３４００〜８０００であることが好ましい。

［４］本発明のナノ繊維においては、エレクトロスピニング法によって製造されたものであることが好ましい。

［５］本発明のナノ繊維の製造方法は、ポリカプロラクトンを含む溶液と、ポリエチレングリコールと多面体オリゴシルセスキオキサン（ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌｏｌｉｇｏｓｉｌｓｅｓｑｕｉｏｘａｎｅ）との共重合体を含む溶液とを混合する混合工程と、エレクトロスピニング法によって、前記混合工程で得られた混合溶液からナノ繊維を得る繊維化工程とを有する。

［６］本発明のナノ繊維の製造方法においては、前記混合工程の前に、ポリエチレングリコールと、プロピルジメチルシリルシクロヘキシルイソシアネート−多面体オリゴシルセスキオキサン（Ｉｓｏｃｙａｎａｔｏｐｒｏｐｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌｏｌｉｇｏｓｉｌｓｅｓｑｕｉｏｘａｎｅ）とをウレタン結合させて共重合体を得る共重合体合成工程をさらに有することが好ましい。

［７］本発明のナノ繊維の製造方法においては、前記多面体オリゴシルセスキオキサンが以下の式（１）で表される多面体オリゴシルセスキオキサンであることが好ましい。
（但し、式（１）中、Ｒはアルキル基を示し、Ｒ’は末端に反応性の基を有する官能基を示す。）

［８］本発明のナノ繊維の製造方法においては、前記ポリエチレングリコールの数平均分子量は３４００〜８０００であることが好ましい。

［９］本発明の細胞足場材料は、本発明のナノ繊維を含むものである。

本発明によれば、機械的強度及び形状安定性に優れるとともに生分解性及び生体適合性に優れ、生体内での劣化が遅く、細胞への接着性に優れるナノ繊維及びその製造方法並びに細胞足場材料が提供される。

実施形態に係るエレクトロスピン繊維を含むナノ繊維のＦＴ−ＩＲスペクトルである。実施形態に係るエレクトロスピン繊維を含むナノ繊維のＷＡＸＤパターンである。実施形態に係るエレクトロスピン繊維を含むナノ繊維のＴＧＡ曲線である。実施形態に係るエレクトロスピン繊維を含むナノ繊維の直径分布を示すグラフである。実施形態に係るエレクトロスピン繊維を含むナノ繊維のＳＥＭ写真と水接触画像である。実施形態に係るエレクトロスピン繊維を含むナノ繊維の骨格上にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を接種して培養した後の細胞接着率を示すグラフである。実施形態に係るエレクトロスピン繊維を含むナノ繊維の骨格上にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を接種して培養した後のＳＥＭ写真である。

以下、本発明のナノ繊維及びその製造方法並びに細胞足場材料について、実施形態に基づいて説明する。

実施形態に係るナノ繊維は、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と多面体オリゴシルセスキオキサン（ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌｏｌｉｇｏｓｉｌｓｅｓｑｕｉｏｘａｎｅ；ＰＯＳＳ）との共重合体とを有する。ここで、ナノ繊維とは、大部分が直径１μｍ未満である繊維をいう。実施形態に係るナノ繊維は、機械的強度及び形状安定性に優れるとともに生分解性及び生体適合性に優れる。なお、ナノ繊維は、目的に反しない限り他の成分が含まれていても良い。

本実施形態において、ＰＯＳＳは、以下の式（３）で表される多面体オリゴシルセスキオキサンである。
（但し、式（３）中、Ｒはシクロヘキシル基を示す。）

本実施形態において、ＰＥＧの数平均分子量は、３４００〜８０００である。ＰＥＧは、直鎖状の構造をしており、以下の式（２）のように示すことができる。

本実施形態において、ＰＥＧとＰＯＳＳとの共重合体は、以下の式（４）のように示すことができる。
（但し、式（４）中、Ｒはシクロヘキシル基を示す。）

実施形態に係るナノ繊維は、エレクトロスピニング法によって製造されたものである。より具体的な製造方法は、ＰＣＬを含む溶液と、ＰＥＧとＰＯＳＳとの共重合体を含む溶液とを混合する混合工程と、エレクトロスピニング法によって、混合工程で得られた混合溶液からナノ繊維を得る繊維化工程とを有する。なお、実施形態に係るナノ繊維と同じ成分を有するナノ繊維が得られれば、エレクトロスピニング法以外の方法によってナノ繊維を製造してもよい。

本実施形態において、ＰＥＧとＰＯＳＳとの共重合体は、ＰＥＧと、ＰＯＳＳのマクロモノマーであるプロピルジメチルシリルシクロヘキシルイソシアネート−多面体オリゴシルセスキオキサン（Ｉｓｏｃｙａｎａｔｏｐｒｏｐｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌｏｌｉｇｏｓｉｌｓｅｓｑｕｉｏｘａｎｅ）とをウレタン結合させて得る。このウレタン結合は、ジラウリン酸ジブチルすず（ＤＢＴＤＬ）を触媒とし、ＰＥＧの末端ジオール基とＰＯＳＳのマクロモノマーのモノイソシアネート基との間で生じる。

〔原料〕
ＰＣＬは、数平均分子量８０ｋＤａ（以下、単に「８０ｋ」という。他のポリマーについても同様である）のものをシグマアルドリッチジャパン社から入手した。

ＰＥＧは、数平均分子量が３．４ｋと８．０ｋで、アルドリッチ社製のものを精製して使用した。この精製は、ＰＥＧのクロロホルム溶液をｎ−ヘキサンに投入しＰＥＧを沈殿させる工程を、２回繰り返すことによって行った。

ＰＯＳＳのマクロモノマーであるプロピルジメチルシリルシクロヘキシルイソシアネート−多面体オリゴシルセスキオキサン（Ｉｓｏｃｙａｎａｔｏｐｒｏｐｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌｏｌｉｇｏｓｉｌｓｅｓｑｕｉｏｘａｎｅ）は、トーメンプラスチック社から入手した。直接ウレタン結合の触媒であるＤＢＴＤＬは、アルドリッチ社製の純度９５％のものをそのまま使用した。

両親媒性でテレキリックタイプのＰＥＧ３．４ｋとＰＯＳＳの共重合体（以下、「ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ」という。他の共重合体についても同様である。また、ＰＥＧの数平均分子量を記載しないときがある）及びＰＥＧ８．４ｋ−ＰＯＳＳは、ＤＢＴＤＬを触媒として、ＰＥＧの末端ジオール基とＰＯＳＳのマクロモノマーのモノイソシアネート基との間で直接ウレタン結合させて合成した。

両親媒性でテレキリックタイプのＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ及び両親媒性でテレキリックタイプのＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳがウレタン反応によって合成されたことは、^１Ｈ−ＮＭＲ測定で確認した。すなわち、３．１５ｐｐｍの−ＣＨ_２−ＮＣＯ基のＨシグナルが消えたのに伴い、ウレタン結合が形成されたことを示す４．２６ｐｐｍの化学シフトが現れた。

なお、両親媒性でテレキリックタイプのＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ中のＰＯＳＳ含有量及び両親媒性でテレキリックタイプのＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ中のＰＯＳＳ含有量は、ＰＯＳＳマクロモノマーのシクロヘキシル共鳴を、^１Ｈ−ＮＭＲ測定で観測することによって定量的に算出できる。

ＰＥＧ−ＰＯＳＳの末端の官能基数を算出すると、両親媒性でテレキリックタイプのＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳの末端は２．１で、両親媒性でテレキリックタイプのＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳの末端は１．９であった。また、ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ中のＰＯＳＳマクロモノマーの算出含有量、及びＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ中のＰＯＳＳマクロモノマーの算出含有量は、ＰＯＳＳのマクロモノマーの供給量とほぼ一致した。

〔エレクトロスピニング〕
まず、ＰＣＬとＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳとの混合液、ＰＣＬとＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳとの混合液、及びＰＣＬとＰＥＧ８．０ｋとの混合液を作製した。これらの混合液は、クロロホルム：ＤＭＦ＝９：１（重量比）の混合溶媒にＰＣＬを溶解させて１２ｗｔ％としたものと、テレキリックタイプのＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ、テレキリックタイプのＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ、及びＰＥＧ８．０ｋを室温でＤＭＦに一晩溶解させたものとをそれぞれ混合して得た。

なお、これら混合液中のテレキリックタイプのＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ、テレキリックタイプのＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ、及びＰＥＧ８．０ｋの各重量は、ＰＣＬの重量を基準として、いずれも約３０ｗｔ％であった。

次に、プラスチック注射器を用いてこれらの混合液を毛細管先端に供給した。そして、エレクトロスピニング装置の正極（アノード）に接続された銅線を混合液に挿入するとともに、負極（カソード）を金属製コレクターに取り付けた。毛細管先端とコレクターとの距離を１５ｃｍに固定し、正負極間電圧を１２ｋＶに固定した。

そして、ＰＣＬとＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳとの混合液、ＰＣＬとＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳとの混合液、及びＰＣＬとＰＥＧ８．０ｋとの混合液に直流電圧を印加し、エレクトロスピニングしてナノ繊維を製造した。これらの各混合液は、室温下で回転する金属製コレクターにエレクトロスピンされた。こうして、各ナノ繊維を得た。以下、エレクトロスピニング法によって得られたナノ繊維を単に「エレクトロスピン繊維」と表記する。

また、ＰＣＬとＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳとの混合液から得られるエレクトロスピン繊維を「ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ」と表記し、ＰＣＬとＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳとの混合液から得られるエレクトロスピン繊維を「ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ」と表記し、ＰＣＬとＰＥＧ８．０ｋとの混合液から得られるエレクトロスピン繊維を「ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ」と表記する。

〔解析〕
（１）ＦＴ−ＩＲ
エレクトロスピン繊維のＦＴ−ＩＲ解析は、ＩＲＰｒｅｓｔｉｇｅ−２１（島津製作所社製）を使用して６００〜４０００ｃｍ^−１の範囲で行った。

図１は、ＰＣＬ（ｎｅａｔＰＣＬ）、ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ、ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋの各エレクトロスピン繊維並びにＰＯＳＳのＦＴ−ＩＲスペクトルである。

ＰＣＬのエレクトロスピン繊維のスペクトルは、Ｃ＝Ｏ伸縮とＣ−Ｃ、Ｃ−Ｏ伸縮による１７２０ｃｍ^−１と１１６２ｃｍ^−１に特徴的なピークがあり、これらのピークは半結晶性のＰＣＬを示している。これらのピークは、結晶性ＰＣＬの１７２２ｃｍ^−１の比較的鋭いカルボニルバンドと、非晶質ＰＣＬの１７３４ｃｍ^−１の小さな肩バンドに起因する。

一方、ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ中の及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ中のＰＣＬの結晶性Ｃ＝Ｏ伸縮は相対的に減った。これは、ＰＣＬとＰＥＧ−ＰＯＳＳとの間に相互作用があることを示している。ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ中の及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ中のＰＯＳＳの存在を示す８９０ｃｍ^−１のはっきりとしたバンドも確認された。このバンドは、Ｓｉ−Ｏ−Ｈ基の曲げモードに起因する。

（２）広角Ｘ線回折（ＷＡＸＤ）
エレクトロスピン繊維の広角Ｘ線回折（ＷｉｄｅａｎｇｌｅＸ−ｒａｙｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ；ＷＡＸＤ）は、Ｘ線回折装置（リガク社製ＲｏｔａｆｌｅｘＲＴＰ３００）を用い、室温下で４０ｋＶ，１５０ｍＡの条件で、スキャン速度毎分２°にて５〜４０°の範囲で行った。なお、ＣｕＫα線の照射源は、波長１．５４０２Åとした。得られたＰＣＬ／ＰＥＧ−ＰＯＳＳの結晶化度は、生分解性の細胞足場材料としてＰＣＬ／ＰＥＧ−ＰＯＳＳを用いる場合にとても重要である。結晶化度は、構造、物理的特性（例えば、機械的特性等）、及び生分解性に決定的な影響を与えるからである。

図２は、ＰＣＬ（ｎｅａｔＰＣＬ）、ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ、ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ、及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋの各エレクトロスピン繊維のＷＡＸＤパターンである。ＷＡＸＤパターンは、ＰＣＬの微細構造にＰＥＧ−ＰＯＳＳを加えた影響を調べるために測定した。

図２に示すように、ＰＣＬ／ＰＥＧ−ＰＯＳＳの各エレクトロスピン繊維は、２θ＝２１．４°（強）、２１．９°（肩）、及び２３．６°（中）の３つの特徴的なピークを示した。これらは、〔１１０〕、〔１１１〕、及び〔２００〕の反射に相当し、ＰＣＬのエレクトロスピン繊維の微細結晶構造と同じである。

ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ、ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ、及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋのピーク強度は、ＰＣＬのエレクトロスピン繊維と比べてわずかに減少している。これは、かさ高いＰＯＳＳがＰＣＬの結晶化を阻害することに起因する。さらに、結晶ＰＯＳＳによる２θ＝７．５°の強い反射が明確に観測された。また、ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ中のＰＥＧの回折現象によって、〔１２０〕の反射に相当する２θ＝１８．８°のピークを生じた。

以上より、ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳの各エレクトロスピン繊維は、ＰＣＬ（ｎｅａｔＰＣＬ）のエレクトロスピン繊維と同程度の機械的強度、形状安定性及び生分解性を有することが分かった。すなわち、ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳの各エレクトロスピン繊維は、ＰＣＬのエレクトロスピン繊維と同様に、機械的強度及び形状安定性に優れるとともに、生分解性に優れることが分かった。

（３）ＴＧ／ＤＴＡ
ＰＣＬ、ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ、ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ、及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋの各エレクトロスピン繊維の熱安定性と混和性を調べるため、熱重量分析（Ｔｈｅｒｍｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃａｎａｌｙｓｉｓ；ＴＧＡ）を行った。熱重量分析は、窒素雰囲気下、昇温速度毎分２０℃の条件で、ＴＧ／ＤＴＡ６２００（セイコーインスツルメンツ社製）を用いた。

図３は、ＰＣＬ（ｎｅａｔＰＣＬ）、ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ、ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ、及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋの各エレクトロスピン繊維のＴＧＡ曲線である。図３に示すように、ＰＣＬのエレクトロスピン繊維（Ｔｄ：３２０℃）と比べて、ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ（Ｔｄ：２４０℃）の熱安定性は、２４０℃を超えると著しく減少する。一方、テレキリックタイプのＰＥＧ−ＰＯＳＳを取り込んだＰＣＬのエレクトロスピン繊維は、ＰＯＳＳのマクロモノマーを取り込んだため良好な熱安定性を示した。

しかしながら、ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳのエレクトロスピン繊維は、２００℃付近で２０％の重量減少を伴う最初の分解を示した。これは、ＰＣＬ／ＰＥＧのエレクトロスピン繊維の分解挙動と類似する。また、ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳのエレクトロスピン繊維の熱安定性は、３５０℃を超えるとＰＣＬのエレクトロスピン繊維の熱安定性を上回った。ＰＣＬ／ＰＥＧ−ＰＯＳＳのエレクトロスピン繊維はＰＯＳＳを取り込んだため、ＰＣＬのエレクトロスピン繊維と比べてＰＣＬ残渣（炭化物やセラミックスの生成量）が増加した。

（４）電子顕微鏡観察・水接触角
エレクトロスピン繊維の構造と直径を、走査電子顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＳＥＭ）法によって決定した。走査電子顕微鏡装置は日立制作所社のＳ−３０００Ｎを用い、Ｐｄ−Ｐｔをスパッタした各エレクトロスピン繊維試料に２０ｋＶの電位を印加して測定した。なお、エレクトロスピン繊維の直径は、画像処理ソフトＩｍａｇｅＪを用いて計測した。エレクトロスピン繊維の直径の平均値は、１５０回計測した平均の値とした。

図４は、（ａ）ＰＣＬ、（ｂ）ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ、（ｃ）ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ、及び（ｄ）ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋの各エレクトロスピン繊維の直径分布を示すグラフである。図４に示すように、各エレクトロスピン繊維の平均直径は、ＰＣＬが７１３±４０８ｎｍ、ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳが５２８±２５３ｎｍ、ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳが４７９±３２６ｎｍ、及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋが６０７±３４３ｎｍであった。テレキリックタイプのＰＥＧ−ＰＯＳＳ（ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ）のエレクトロスピン繊維は、ＰＣＬのエレクトロスピン繊維及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋのエレクトロスピン繊維と比べて、繊維径が小さく、繊維径分布が狭かった。

接触角分析器（協和界面科学社ＤＭ−ＣＥ１）を用いて、各エレクトロスピン繊維の水接触角を測定した。具体的には、マイクロシリンジから約１．３μＬの水滴を各エレクトロスピン繊維の表面に滴下し、滴下された水滴の外形を高解像度カメラで捕らえ、接触形状分析装置ＤＳＡ１００（ドイツＫｒｕｓｓ社製）と多機能統合解析ソフトＦＡＭＡＳを用いて角度を算出した。１５回の測定の平均値を水接触角データとした。なお、各エレクトロスピン繊維は、５０℃で４日間減圧乾燥したものを用いた。

図５は、（ａ）ＰＣＬ、（ｂ）ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ、（ｃ）ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ、及び（ｄ）ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋの各エレクトロスピン繊維のＳＥＭ写真と各エレクトロスピン繊維の水接触画像である。エレクトロスピン繊維は、繊維方向がランダムな状態で堆積している。

ＰＣＬのエレクトロスピン繊維の水接触角は約１２９．８±１．４°であり、ＰＣＬのエレクトロスピン繊維が疎水性であることを示している。しかしながら、ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳの水接触角は９６．７±５．４°であり、ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋの水接触角は７４．９±７．５°であり、ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳの水接触角は３６．５±１．５°であった。これは、ＰＣＬのエレクトロスピン繊維に、親水性のＰＥＧ及び／又は疎水性のＰＯＳＳを取り込むことによって、親水性−疎水性を調整できることを示している。

〔細胞培養〕
まず、ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ、ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ、及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋの各エレクトロスピン繊維を９９％エタノールに３０分間浸して殺菌した。この殺菌工程は２回行った。次に、各エレクトロスピン繊維を蒸留水で３回洗浄して残留エタノールを除去した。そして、各エレクトロスピン繊維上で、理研細胞バンクから入手した骨芽細胞様細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を１３世代に渡り継代培養した。

具体的には、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を各エレクトロスピン繊維の細胞足場材料に接種し、３時間、６時間、及び２４時間細胞培養したものを、温度４℃の条件下で、１０％ホルムアルデヒド溶液中にそれぞれ一晩浸した。次に、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％（２回）と濃度を徐々に増やしたエタノールで、細胞培養した各エレクトロスピン繊維を順次処理する工程（１工程５分間）を５回繰り返して脱水した。最後に、ｔ−ブチルアルコール（ワコーケミカル社製）を用いて、細胞培養した各エレクトロスピン繊維を一晩凍結乾燥させて分析用試料を得た。

培養は、培養器内をＣＯ_２５％雰囲気下、温度３７℃とし、細胞濃度を５×１０^４細胞／ウェルとして、αＭＥＭ（商品名ＧＩＢＣＯ）の培地を用いて行った。培地は、１０％の加熱不活性化したウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）と、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシンと、０．１％のβ−グリセロリン酸エステルとを含む。骨芽細胞分化を誘発するためにこの培地を用いた。

また、培養は、組織培養皿（ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｓｈｅｓ；ＴＣＤｓ）内で行った。組織培養皿は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（デンマーク）のポリスチレン皿（ブランド名Ｎｕｎｃ）を用いた。培養皿への栄養分の十分な供給を確保するため、培地は２日に１回交換した。

〔細胞接着〕
図６は、ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ、ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ、及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋの各エレクトロスピン繊維の骨格上にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を接種し、３時間、６時間、及び２４時間細胞培養した後の細胞接着率を示すグラフである。細胞接着率は、細胞培養後に培地に存在する細胞数を数え、下記の式により算出した。なお、細胞数は３回の平均値を採用した。

細胞接着率（％）＝｛１−浮遊細胞数／（５．０×１０^４）｝×１００

図６に示すように、ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳは、ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋと比べて、細胞培養当初の接着率が高かった。これは、ＰＯＳＳ中のシロキサン部位の表面エネルギーが高いためだと考えられる。実施形態に係るＰＣＬ／ＰＥＧ−ＰＯＳＳの細胞足場材料は、２４時間の細胞培養後、毒性がなく細胞足場材料表面と細胞との間で良好な細胞接着率（〜約９３％）を維持することが分かった。従って、ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ各エレクトロスピン繊維は、生体適合性及び細胞への接着性に優れることが分かった。

図７は、ＰＣＬ、ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ、ＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳ、及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋの各エレクトロスピン繊維の骨格上にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を接種し、３時間及び６時間細胞培養した後のＳＥＭ写真である。これら各エレクトロスピン繊維の細胞の接着、増殖、及び相互作用の各程度をＳＥＭ写真によって調べた。

本実施例において、各エレクトロスピン繊維の細胞足場材料は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞への細胞毒性がほとんどなかった。図７に示すように、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、実施例における各エレクトロスピン繊維の細胞足場材料にしっかりと付着して、細胞培養時間に応じて順調に集合体を形成した。なお、ＰＣＬのエレクトロスピン繊維で培養したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、６時間の細胞培養後に、細胞の接着が比較的少なかった。

一方、ＰＣＬ／ＰＥＧ３．４ｋ−ＰＯＳＳ及びＰＣＬ／ＰＥＧ８．０ｋ−ＰＯＳＳの各エレクトロスピン繊維は、３時間の細胞培養後、ＰＣＬのエレクトロスピン繊維と比べて、細胞の付着力がとても高かった。さらに、６時間の細胞培養後、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の大部分が細胞質を拡張し始めたことが確認された。すなわち、実施形態に係るナノ繊維は、細胞の付着力が高いこと、すわなち、細胞への接着性に優れることが分かった。

以上より、両親媒性でテレキリック型のＰＥＧ−ＰＯＳＳを取り込んだＰＣＬのエレクトロスピン繊維は、今後の生物医学材料、特に細胞足場材料として大きな期待が持てる。

なお、ＰＯＳＳを用いた細胞足場材料として、ポリ（エステル−ウレタン）（ＰＥＵ）とＰＯＳＳの多孔性複合フィルム（ＰＯＳＳ−ＰＥＵ）や、ポリ（カーボネート−シルセスキオキサン−ウレア）（ＰＯＳＳ−ＰＣＳＢＵ）が知られている（例えば、Ｙ．Ｌ．Ｇｕｏ、外２名、”Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ．Ｅｎｇ．Ｒｅｇ．Ｍｅｄ．”、２０１０年、第４巻、第７号、ｐ．５５３−５６４参照。）。

本発明のナノ繊維又は細胞足場材料（ＰＯＳＳ−ＰＥＧ／ＰＣＬ）は、上記した既存のＰＯＳＳ含有材料（ＰＯＳＳ−ＰＥＵやＰＯＳＳ−ＰＣＳＢＵ）の場合と比較して、原料となるＰＯＳＳ化合物（ＰＯＳＳ−ＰＥＧ）の合成が容易である。
また、本発明のナノ繊維又は細胞足場材料（ＰＯＳＳ−ＰＥＧ／ＰＣＬ）は、原料に細胞との親和性の高いＰＥＧを用いているため、上記した既存のＰＯＳＳ含有材料（ＰＯＳＳ−ＰＥＵやＰＯＳＳ−ＰＣＳＢＵ）の場合と比較して、細胞への接着性に優れる。
また、本発明のナノ繊維又は細胞足場材料（ＰＯＳＳ−ＰＥＧ／ＰＣＬ）は、原料に生分解性に優れたＰＣＬを用いているため、上記した既存のＰＯＳＳ含有材料（ＰＯＳＳ−ＰＥＵやＰＯＳＳ−ＰＣＳＢＵ）の場合と比較して生分解性に優れる。
さらにまた、本発明のナノ繊維の製造方法は、ＰＣＬを混合するという簡単な工程で、上記した既存のＰＯＳＳ含有材料（ＰＯＳＳ−ＰＥＵやＰＯＳＳ−ＰＣＳＢＵ）よりも優れた細胞足場材料を製造することができる。

Claims

ポリカプロラクトンと、
ポリエチレングリコールと多面体オリゴシルセスキオキサン（ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌｏｌｉｇｏｓｉｌｓｅｓｑｕｉｏｘａｎｅ）との共重合体とを有するナノ繊維。
前記多面体オリゴシルセスキオキサンが以下の式（１）で表される多面体オリゴシルセスキオキサンである請求項１に記載のナノ繊維。
（但し、式（１）中、Ｒはアルキル基を示し、Ｒ’は末端に反応性の基を有する官能基を示す。）
前記ポリエチレングリコールの数平均分子量が３４００〜８０００である請求項１または２に記載のナノ繊維。
エレクトロスピニング法によって製造された請求項１〜３のいずれかに記載のナノ繊維。
ポリカプロラクトンを含む溶液と、ポリエチレングリコールと多面体オリゴシルセスキオキサン（ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌｏｌｉｇｏｓｉｌｓｅｓｑｕｉｏｘａｎｅ）との共重合体を含む溶液とを混合する混合工程と、
エレクトロスピニング法によって、前記混合工程で得られた混合溶液からナノ繊維を得る繊維化工程とを有するナノ繊維の製造方法。
前記多面体オリゴシルセスキオキサンが以下の式（１）で表される多面体オリゴシルセスキオキサンである請求項５に記載のナノ繊維の製造方法。
（但し、式（１）中、Ｒはアルキル基を示し、Ｒ’は末端に反応性の基を有する官能基を示す。）
前記混合工程の前に、ポリエチレングリコールと、プロピルジメチルシリルシクロヘキシルイソシアネート−多面体オリゴシルセスキオキサン（Ｉｓｏｃｙａｎａｔｏｐｒｏｐｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌｏｌｉｇｏｓｉｌｓｅｓｑｕｉｏｘａｎｅ）とをウレタン結合させて共重合体を得る共重合体合成工程をさらに有する請求項５または６に記載のナノ繊維の製造方法。
前記ポリエチレングリコールの数平均分子量が３４００〜８０００である請求項５〜７のいずれかに記載のナノ繊維の製造方法。
請求項１〜４のいずれかに記載のナノ繊維を含む細胞足場材料。