JP2012533739A - ５−ｆｕをアッセイする方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、５−ＦＵをアッセイするための、方法、組成物、装置およびキットを提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、一般的には診断テストに関し、特に患者試料中の５−フルオロウラシルをアッセイするための組成物および診断方法に関するものである。

５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、がん治療の中で最も重要な化学療法剤の一つである。それは、一般的に、大腸、胃、乳がん、膵臓がんの様々な化学療法レジメンで使用されている。例えば、単独の５−ＦＵ、または、ＦＯＬＦＯＸおよびＦＯＦＩＲＩなどの併用レジメンにおける５−ＦＵは、転移性結腸直腸がんにおける標準的な一次治療法である。しかし、５−ＦＵは、頻繁に骨髄抑制、粘膜炎、皮膚炎、下痢、心毒性や死を含めた重篤な副作用に関連付けられている。これらの副作用は、個々の患者のための線量測定への現在のアプローチによって少なくとも部分的に引き起こされる。投与ボディ表面積（ＢＳＡ）のための現在の標準治療は患者の身長と体重のみを考慮している。ＢＳＡは、遺伝子型、年齢、性別、疾患の状態、薬物相互作用、臓器機能、合併症などの５−ＦＵの代謝と薬効に影響を与える要因の多くは考慮されていない。そのため、異なった患者の５−ＦＵの血中濃度が、ＢＳＡベースで等しい用量投与にもかかわらず、１０倍以上異なることは、そう驚くことではない。

最近の学術研究は、血漿５−ＦＵ濃度の薬物動態学的モニタリングに基づく個々の５−ＦＵの用量調整は、大幅に改善された５−ＦＵの客観的奏効率の結果となることを示している。例えば、Ｇｅｍｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２６（１３）：２０９９−２１０５（２００８）；Ｃｌｉｍｅｎｔｅ−Ｍａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．，９２（６）：１１５５−１１６５（２００３）；Ｍｉｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４１：５３７−５４１（１９８８）を参照のこと。これらの研究は、５−ＦＵ療法を受けた個々の患者における５−ＦＵの血中濃度の臨床試験が、５−ＦＵの投与量の調節の目的、治療効果の最適化、および重篤な副作用の軽減のために明らかに望ましいことを示唆している。

本発明は、一般的に、患者のサンプルで５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を測定する方法を提供する。

第一の態様において、５−ＦＵおよび任意に他の治療薬を投与した患者からのサンプルにおいて５−ＦＵをアッセイする方法が提供される。この方法では、サンプルは５−ＦＵ投与患者から取得される。次いで、サンプルはジヒドロピリミジン−デヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）の不活性化剤と混合され、５−ＦＵの量は、サンプル好ましくはＤＰＤ不活性化剤との混合物で測定される。

他の態様において、本発明は以下の工程を備える５−ＦＵで患者を治療する方法を提供する：５−フルオロウラシルの第１の量を投与する工程；５−ＦＵを投与した患者から得られたサンプル中の５−ＦＵの量を決定する工程であって、前記サンプルがＤＰＤの不活性化剤と体外で混合され、前記サンプル中の５−ＦＵの量が好ましくは不活性化剤の存在で測定される工程；および、５−ＦＵの第２の量を患者に投与する工程。第２の量で投与された５−ＦＵの量は、所定の最適なターゲットとなる５−ＦＵ ＡＵＣを参照して、患者のサンプルで測定された５−ＦＵのレベルに基づいて決定することができる。

また、本発明は、５−ＦＵのアッセイのために、５−ＦＵおよび任意の他の薬剤で治療を受けている患者からの血液サンプルを処理する方法を提供する。一実施形態において、この方法は以下の工程を含む：５−ＦＵを投与した患者から５−ＦＵを含む血液サンプルを得る工程；血液サンプルから血漿を分離する工程；ＤＰＤの不活化剤と分離した血漿を混合して混合物を形成する工程；および、混合物中の５−ＦＵのレベルの診断テストのための研究室へ混合物を送る工程。

別の実施形態において、この方法は以下の工程を含む：５−ＦＵを投与した患者から５−フルオロウラシルを含む血液サンプルを得る工程；ＤＰＤ不活性化剤と血液サンプルを混合して混合物を形成する工程；および、混合物から５−フルオロウラシルおよび不活性化剤を含む血漿を分離する工程。こうして得られた血漿は５−ＦＵをアッセイするための研究室に送ることができる。

さらに別の実施形態において、５−ＦＵを投与した患者から血液サンプルを処理する方法は以下の工程を必要とする：患者から５−ＦＵを含む血液サンプルを得る工程；ＤＰＤ不活性化剤と血液サンプルを混合して混合物を形成する工程；および、５−ＦＵをアッセイするための研究室に混合物を送る工程。

本発明のさらに別の態様において、ジヒドロピリミジン−デヒドロゲナーゼの不活性化剤と混合して、５−ＦＵを投与した患者から分離されたサンプルを含む組成物が提供され、前記試料が血液、血漿、または血清であり、不活性化剤は組成物中において少なくとも８５０ｎｇ／ｍｌの濃度である。

別の態様において、本発明は、容器中に以下のものを有するキットを提供する：（ａ）少なくとも８５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＤＰＤの不活性化剤との混合物中で、５−ＦＵ投与患者から分離されたサンプル（血液、血漿または血清）；および（ｂ）前記サンプルを１０℃以下の温度に冷却するための手段。

本発明の種々の態様において、好ましくは、試料は、前記患者から分離した後５乃至１０時間以内に凍結されていない。不活性化剤の例としては、例えば、ピリミジンまたはピリジン誘導体、特に、エニルウラシル、ギメラシルなどのウラシル類縁体を含む。５−ＦＵは、５−ＦＵに対する抗体を用いて、例えば、ＨＰＬＣ、質量仕様、またはイムノアッセイなどの任意の公知技術によって、サンプルでアッセイすることができる。

特に定義しない限り、ここで使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって理解されるものと同じ意味を持っている。ここに記載されている方法および材料と類似または等価の方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料は以下のとおりである。不一致の場合には、定義を含む本明細書が制御する。さらに、材料、方法、および実施例は一例であり、限定されることは意図されていない。

本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。

図１は、クリニックの設定で実装されたサンプル処理方法の一例を示す図である。 図２は、エニルウラシルが血液サンプル中の５−ＦＵの分解を防ぐのに有効であることを示すグラフである。 図３は、５−ビニルウラシル、５−ヨードウラシルおよびギメラシルが、すべての血液サンプルで５−ＦＵの安定化に有効であったことを示すグラフである。 図４は、血液中のギメラシルの低濃度が、５−ＦＵのＤＰＤ介在分解の阻害に有効であることを示すグラフである。 図５は、長時間の間血漿分離することなく血液中にギメラシルを維持する効果を示すグラフである。 図６は、シリンジアセンブリを転送する実施形態を示す図である。 図７Ａ及び図７Ｂは、シリンジアセンブリを転送する実施形態を示す図である。 図８は、シリンジアセンブリを転送する実施形態を示す図である。

Ｉ．サンプルの調製、５−ＦＵのアッセイ、組成物およびキット
本発明の第一の態様において、５−ＦＵアッセイで使用するために（例えば、５−ＦＵまたは５−ＦＵのプロドラッグで治療した患者から）５−ＦＵを含む患者サンプルを処理する方法が提供されている。方法は、サンプル中の５−フルオロウラシルの安定性の向上、および、５−ＦＵの測定精度の大幅な改善をもたらす。従って、別の態様において、本発明は、また、処理方法に従って処理した患者サンプルを用いて５−ＦＵをアッセイする方法を提供する。一般に、処理方法は、（例えば、５−ＦＵまたは５−ＦＵのプロドラッグを投与した患者から）５−ＦＵを含むサンプルを得る工程；サンプルをジヒドロピリミジン−デヒドロゲナーゼの不活性化剤と混合して混合物を形成する工程；および、混合物中の５−ＦＵをアッセイするために研究室に混合物を送る工程；を含む。

なお、本発明の実施形態は５−ＦＵで処理された患者から得られた患者サンプルに関連して詳細に説明しているが、本発明は、また、５−ＦＵのプロドラッグで処理された患者から得られた患者サンプルを包含することに留意されたい。このようなプロドラッグ（例えば、テガフール、ドキシフルリジン、およびカペシタビン）は、代謝的に患者の体内で活性化し、５−ＦＵに変換される。

本発明で用いられる５−ＦＵを含む患者のサンプルは、５−ＦＵのレベルが測定される５−ＦＵを投与されたすべての患者から得ることができる。それは、また、テガフール、ドキシフルリジンおよびカペシタビンなどの一またはそれ以上の５−ＦＵのプロドラッグを投与した患者から得ることができる。例えば、５−ＦＵは、一般的に、乳がん、肺がん、大腸がん、膵臓がんや頭頸部がんの患者を含むがん患者の化学療法で使用されている。５−ＦＵはまた、線維柱帯切除術のサイトで抗がん痕化剤として緑内障患者の眼科手術に使用されている。さらに、５−ＦＵは、ボーエン病、日光角化症、皮膚の基底細胞がんを治療するためのクリームとして局所的に使用されている。本発明の方法は、特に、がん患者のサンプルにおける５−ＦＵのアッセイのために有利である。これに関連して、患者は５−ＦＵを含む治療レジメンを受けているがん患者にすることができる。たとえば、５−ＦＵは、通常、葉酸またはロイコボリンと一緒に投与される。転移性大腸がんにおいて、５−ＦＵは、しばしば、ＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵ＋オキサリプラチンとロイコボリン）とＦＯＬＦＩＲＩ（５−ＦＵ＋イリノテカンおよびロイコボリン）などの併用療法で使用されている。ベバシズマブ、セツキシマブおよびパニツムマブのような新しい薬は、また、レジメンに追加することができる。本発明は、このようなレジメンで治療を受けている患者から得られたサンプルで５−ＦＵをアッセイすることにおいて、また特定の患者への投与量を最適化するために適用可能である。

本発明での使用に適した患者サンプルは、患者の身体のどの部分からも得ることができる。例えば、適当なサンプルは、腫瘍組織、血液、血漿、血清、尿などの組織または体液サンプルとすることができる。

がん治療において、５−フルオロウラシルは、通常、静脈内ボーラス注射または静脈内注入により投与される。投与は、治療法の選択に応じて、毎日、毎週、４週間毎に繰り返すことができる。ボーラス注射は、１から１０分以上または２０から６０分以上与えることができ、例えば、５日間連続して６サイクルごとに４週間繰り返すことができる。連続点滴静脈注入において、５−ＦＵは、数時間を超えて、例えば、毎週８時間かけて投与することができる。血液サンプルは、５−ＦＵの投与前、投与後または投与中にいつでも、患者から取得することができる。多くの場合、定常状態で血液の５−ＦＵ濃度を測定することが望ましく、その場合、定常状態に達した後の血液サンプルを取得する。８時間持続注入の例では、定常状態は注入の開始後２時間で到達することができる。

一般に、血液サンプルは、末梢静脈血を取得する任意の従来の方法で収集することができる。例えば、血液サンプルは、通常、クリニックで使用されているチューブまたはバイアルに収集することができる。採取した血液の量は、特定の５−ＦＵのアッセイに必要な量に依存する。例えば、１ミリリットル、２ミリリットル、５ミリリットル、１０ミリリットルは、５−ＦＵアッセイのほとんどの種類に十分な量である。必要に応じて、ＥＤＴＡまたはヘパリンは、血液凝固を防ぐために血液サンプルと混合することができる。混合は、例えばヘパリン化チューブまたはＥＤＴＡチューブを用いることによって、達成することができる。

本発明によれば、５−ＦＵを含む得られた患者のサンプルが、次にジヒドロピリミジン−デヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）の不活性化剤と体外で混合され、ＤＰＤの活性化を阻害するとともに５−ＦＵの劣化を防ぐ。ＤＰＤ不活性化剤が患者サンプルに添加され共に混合される前に、患者のサンプルは約０℃の温度で例えば約５分間以上冷却される。しかし、好ましくは、患者のサンプルは、患者の身体から分離した後迅速に、ＤＰＤ不活性化剤と混合される。得られた混合物（ＤＰＤ不活性化剤と混合した患者サンプル）はその後、サンプル中の５−ＦＵの量またはレベルまたは濃度を測定するための研究室に送られる。

一実施形態において、５−ＦＵのアッセイのために患者のサンプルを処理する方法は、５−ＦＵまたは５−ＦＵのプロドラッグを投与した患者から５−フルオロウラシルを含む血液サンプルを得る工程と、血液サンプルをＤＰＤ不活性化剤と混合して混合物を形成する工程と、必要に応じて患者サンプル中の５−ＦＵの量を測定するため研究室に混合物を送る工程と、を備える。

別の実施形態において、５−ＦＵのアッセイのために患者のサンプルを処理する方法は、５−ＦＵまたは５−ＦＵのプロドラッグで処理された患者から５−ＦＵを含む血液サンプルを得る工程と、血液サンプルをジヒドロピリミジン−デヒドロゲナーゼの不活性剤と混合して混合物を形成する工程と、混合物から５−ＦＵおよび不活性剤を含む血漿を分離する工程と、必要に応じて５−ＦＵレベルをアッセイするために血漿を研究室に送る工程と、を備える。好ましい実施形態において、混合ステップは、血液サンプルは患者から引き出された後迅速に実行される。すなわち、血液サンプルが患者の身体から分離された後、ＤＰＤ不活性化剤が添加され、できるだけ早く採取した血液サンプルと混合すべきである。また、好ましくは、ＤＰＤ不活性化剤と混合された血液サンプルから血漿を分離するステップは、血液が取り出された時点から、４乃至５時間以内、好ましくは１時間以内に実行される。

別の実施形態において、５−ＦＵのアッセイのために患者のサンプルを処理する方法は、５−ＦＵまたは５−ＦＵのプロドラッグで処理された患者からの５−ＦＵを含む血液サンプルを得る工程と、血液サンプルから血漿を分離する工程と、分離した血漿をＤＰＤ不活性剤と混合して混合物を形成する工程と、５−ＦＵのレベルを測定するために研究室に混合物を送る工程と、を備える。

図１は、サンプルの処理方法が診療所でどのように実施することができるかを示している。図１に示すように、ＤＰＤ不活化剤注射器（ＤＰＤ不活性化溶液を含む）と転送デバイスを準備する。具体的には、ＤＰＤ不活化剤注射器（図６も参照）のキャップがはずされ、注射器はＢＤ転送デバイス（図７も参照）に接続され、血液サンプルが収集されるまで組み合わせたユニットを保持する。図１に示すように、患者の血液を取り出すことができる。具体的には、患者が所定の注入速度で５−ＦＵを連続的に注入されている間に、血液を６−ｍＬのＫ２−ＥＤＴＡ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）チューブに取り出すことができる。血液は、５−ＦＵの連続注入を開始した後少なくとも２時間で、注入ポートからではなく、末梢静脈から引き出される。血液は、例えば少なくともチューブが全量の３／４、好ましくはｍｇ／ｍ^２換算で投与された５−ＦＵの正確な量となるまで、引き出され、総注入時間が記録される。図１に示すように、ＤＰＤ不活性化溶液は、次いで、直ちに血液サンプルチューブに分注される。具体的には、結合された注射器転送装置ユニットは、Ｋ２−ＥＤＴＡチューブを介して接続され、しっかりとチューブストッパーを介して挿入されており、その後注射器プランジャが完全に押される。次いで、サンプルは、少なくとも３回反転させることで静かに混合される。血漿は、１０分間で１５００ｇ乃至２０００ｇに遠心分離により分離される。最後に、図１に示すように、半分以下の血漿が、使い捨てピペットで除去され、３−ｍＬのＣｒｙｏｖｉａｌ（登録商標）チューブに移される。具体的には、血漿中に先端を挿入する前に、使い捨てピペットのバルブが絞られる。その後、ピペットの先端が透明な血漿層の上部の下に挿入され、バルブはゆっくりと解放される。血漿が引かれるので、ピペットはチューブを追跡する。透明な血漿層の半分以下がピペットに引き取られ、繰り返し吸引は、血漿と赤血球との間の軟膜／細胞層を乱さないように、回避される。血漿は、ピペットからストレージおよび５−ＦＵの分析用の３−ｍＬのクライオバイアルチューブに転送される。

ＤＰＤの不活性化剤は一般に当該分野で知られている。ＤＰＤ（ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ、ＥＣ １．３．１．２）は、５，６−ジヒドロピリミジンにピリミジンの可逆的な還元の触媒作用を及ぼす酵素である。ここで使用されるように、用語「ＤＰＤの不活性化剤」やその言い換えは、ＤＰＤの酵素活性化すなわちピリミジンまたは５−ＦＵの還元の触媒作用を及ぼす能力を阻害する、任意の有機または無機分子を意味する。用語「ＤＰＤの不活性化剤」は、５−ＦＵを包含していない。不活性化の例としては、例えば、ピリミジン誘導体、ピリジン誘導体およびバルビツリック酸誘導体がある。いくつかの実施形態において、ＤＰＤ不活性化剤は、ＤＰＤ阻害剤、好ましくは不可逆的なＤＰＤ阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＤＰＤ不活性化剤は、ウラシル誘導体、すなわち、ハロゲン原子、Ｃ_２−４アルケニル基、Ｃ_２−４ハロアルケニル、Ｃ_２−６アルキニル基、Ｃ_２−６ハロアルケニル基、シアノ基、Ｃ_１−４アルキル基、および、Ｃ_１−４ハロアルキル基から選択された構成成分により５位で置換されたウラシル化合物である。特定の実施形態において、ＤＰＤ不活性化剤は、エニウラシル、５−プロピニルウラシル、５−シアノウラシル、５−ブロモエチニルウラシル、５−（１−クロロビニル）ウラシル、５−ヨードウラシル、５−ブロモビニルウラシル、（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）ウラシル、５−ヘキサ−１−イニルウラシル、５−ビニルウラシル、５−トリフルオロウラシル、５−ブロモウラシル、および５−（２−ブロモ−１−クロロビニル）ウラシルからなる群から選択されたウラシル誘導体である。いくつかの実施形態において、使用されるＤＰＤ不活性剤は、バルビツール酸の誘導体、２，４−ジヒドロキシピリジンの誘導体、および２，６−ジヒドロキシピリジンの誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、ＤＰＤ不活性化剤はピリジン誘導体である。特定の実施形態において、使用されるＤＰＤ不活性化剤は、ギメラシル（５−クロロ−２，４−ジヒドロキシピリジン）または３−シアノ−２，６−ジヒドロキシピリジンである。

語句「ＤＰＤ不活性化剤」が本明細書中で使用されているが、この開示を知らされた当業者には明らかなように、実際には「一またはそれ以上のＤＰＤ不活性化剤」を意味している。具体的には、単一のＤＰＤ不活性化剤または二またはそれ以上のＤＰＤ不活性化剤の組み合わせが、単一の患者サンプルと混合することができる。一般に、一またはそれ以上のＤＰＤ不活化剤は、患者サンプル（例えば、尿、全血、血清または血漿）中のＤＰＤ活性を実質的に抑制するのに十分で、サンプルの取り扱いと保管の通常の条件下で、５−ＦＵのアッセイが完了できる十分な時間の間、重要で有意義なサンプル中の５−ＦＵの劣化の防止のために十分な混合物の最終濃度に到達するように、全量で使用される。例えば、患者サンプル内の任意のＤＰＤ不活性化剤の合計最終濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ乃至約６０μｇ／ｍｌまたはそれ以上までの範囲に及ぶ。別の例においては、一またはそれ以上のＤＰＤ不活性剤が、患者サンプル中のＤＰＤ活性を阻害するのに十分な量で、患者サンプル中に添加され混合され、その結果、サンプルが患者から取得され室温（約２５℃）以下の温度に置かれた後、約０．５時間以内に患者サンプル中の５−ＦＵの劣化は１０％以下であり、好ましくは、サンプルが患者から取得され室温以下の温度に置かれた後、約１０時間以内に患者サンプル中の５−ＦＵの劣化は１０％以下である。当業者には明らかなように、使用されるＤＰＤ不活性化剤の量は、特定のＤＰＤ不活性化剤の阻害活性、および、特定のサンプル中のＤＰＤの量に応じて異なる。以下の例に示すように、当業者であれば、日常的な実験により、容易に、いかなるＤＰＤ不活性化剤の最適量をも決定することができる。

本発明の方法によって処理されたサンプルは、それらが引き取られた後であってアッセイ前におけるサンプル中の５−ＦＵの劣化が最小となるため、５−ＦＵレベルのアッセイで使用するのに特に適している。従って、本発明は、さらに５−ＦＵまたはそのプロドラッグを投与した患者から患者サンプル中の５−ＦＵを測定する方法を提供する。方法は、一般的に少なくとも以下の工程を含む：上述したように５−ＦＵまたはそのプロドラッグを投与した患者から得られた処理された患者サンプルを提供する工程であって、サンプルが体外でジヒドロピリミジン−デヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）酵素の不活性化剤と混合される工程；および、サンプル中の５−ＦＵの量を測定する工程。いくつかの実施形態において、試料中の５−ＦＵの量は、ＤＰＤ不活性化剤の存在下で測定される。

一実施形態において、５−ＦＵをアッセイする方法は、５−ＦＵを投与した患者から５−フルオロウラシルを含む血液サンプルを得る工程と；血液サンプルをＤＰＤ不活性化剤と混合して混合物を得る工程と；混合物中の５−ＦＵの量を測定する工程と；を備える。

別の実施形態において、５−ＦＵをアッセイする方法は、５−ＦＵで治療された患者から５−ＦＵを含む血液サンプルを得る工程と；血液サンプルをＤＰＤ不活性化剤と混合して混合物を得る工程と；混合物から血液サンプルと不活性剤とを含む血漿を分離する工程と；血漿中の５−ＦＵの量を測定する工程と；を備える。好ましい実施形態において、ＤＰＤ不活性化剤と混合した血液サンプルから血漿を分離するステップは、血液が取り出された時点から４乃至５時間以内、好ましくは１時間以内に実施される。

別の実施形態において、５−ＦＵをアッセイする方法は、５−ＦＵで治療された患者から５−ＦＵを含む血液サンプルを得る工程と；血液サンプルから血漿を分離する工程と；分離した血漿をＤＰＤ不活性剤と混合して混合物を形成する工程と；混合物中の５−ＦＵの量を測定する工程と；を含む。

当技術分野で公知の任意の５−ＦＵアッセイ技術は、本発明の方法によって得られたサンプル中の５−ＦＵ濃度を測定するために使用される。例えば、ＨＰＬＣにより定量的に５−ＦＵをアッセイするための方法は、一般に当該分野で知られている。ガス液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）およびＧＣ−ＭＳは、一般的に５−ＦＵ濃度を測定するために使用されている。液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳＭＳ）は、５−ＦＵの定量化のためにますます人気がある。また、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２０５，１１６号は、５−ＦＵと特異的に免疫反応性を示す抗体を使用して血漿サンプル中の５−ＦＵの定量化のための５−ＦＵイムノアッセイを開示している。

従って、一実施形態において、本発明の５−ＦＵをアッセイする方法は、イムノアッセイを用いて５−ＦＵまたはそのプロドラッグを投与した患者から得られた５−ＦＵを含む患者サンプル中の５−ＦＵを測定する工程を含み、患者サンプルは患者から取得された後ＤＰＤ不活性化剤と体外で混合される。すなわち、測定ステップは、５−ＦＵを含む患者のサンプルを５−ＦＵと免疫学的に活性な抗体に接触させる工程と、抗体に対する５−ＦＵの結合を決定する工程と、を含む。５−ＦＵ抗体は当技術分野で知られており、例えば、米国特許第７，２０５，１１６号に開示されている。患者サンプルは、血液、血清、血漿、尿等が挙げられ、好ましくは上記のサンプル処理方法によって調製された血漿サンプルとすることができる。好ましくは、５−ＦＵ抗体に対し５−ＦＵの結合を決定するステップは、上述したように、例えば５−ヨードウラシル、５−ビニルウラシル、エニルウラシルまたはギメラシルなどのＤＰＤ不活性化剤の存在下で行われる。

以下に例示の例において、５−ＦＵは、米国特許第７，２０５，１１６号に開示された抗体を用いて、オリンパスＡＵ６８０アナライザにより抗体ベースの凝集アッセイを用いて測定された。具体的には、２つの独立した試薬が提供されており：第１試薬は、ポリマーまたは基板に結合した５−ＦＵの複数の分子を含み、第２試薬は、固体支持体（例えば、ナノ粒子またはビーズ）に接続された複数の５−ＦＵ抗体を含む。２種類の試薬が遊離５−ＦＵの不存在下で混合されると、それらはナノ粒子の大きな凝集体を形成して光を散乱させ、結果として高い吸収値を示す。遊離５−ＦＵの存在下、例えば、５−ＦＵを含む患者サンプルと混合させたとき、凝集反応がやや抑制され、光の散乱もほとんどなく、低吸収値を示す。従って、サンプル中の５−ＦＵの濃度は、第１及び第２の試薬による凝集の量によって決定されているサンプルの吸光度に基づいて測定される。機器は５−ＦＵの異なる既知濃度の複数の標準サンプルで較正され、標準曲線が生成される（５−ＦＵ濃度対吸光度）。個々のサンプルからの吸光度の値は、濃度を決定するために、この曲線と比較される。

従って、特定の態様において、本発明のアッセイ法における５−ＦＵを測定する工程は、ポリマーまたは基板と接合した複数の５−ＦＵ分子を有する第１試薬と、固体支持体に取り付けられた複数の５−ＦＵ抗体を有する第２試薬とを、５−ＦＵを含む患者サンプルの存在下で接触させる工程と、第１および第２試薬の凝集を決定する工程と、を備える。患者サンプルは、血液、血清、血漿、尿等が挙げられ、好ましくは上記のサンプル処理方法によって調製された血漿サンプルにすることができる。好ましくは、５−ＦＵ抗体に対する５−ＦＵの結合を決定する工程は、上述したように例えば５−ヨードウラシル、５−ビニルウラシル、エニルウラシルまたはギメラシルなどのＤＰＤ不活性化剤の存在下で実行される。

従って、別の態様において、本発明はまた、（１）５−ＦＵと選択的に免疫学的に活性な抗体および（２）ＤＰＤ不活性化剤を備える組成物を提供する。一実施形態において、組成物は、（１）５−ＦＵと選択的に免疫学的に活性な抗体および（２）ＤＰＤ不活性化剤の混合物中に、５−ＦＵを含み５−ＧＵまたはそのプロドラッグから取得された患者サンプル（血液、血清、血漿、尿など）を備える。好ましくは、抗体は、実質的にＤＰＤ不活性化剤と免疫学的に活性でなく、組成物中の実質的にすべての５−ＦＵ分子に結合するのに十分な組成物の量である。好ましくは、組成物中の抗体が、２５％未満好ましくは１５％未満であり、ＤＰＤ不活性化剤との交差反応性を持っている。抗体の例としては、米国特許第７，２０５，１１６号に開示されているものを含む。好適なＤＰＤ不活性化剤は、上述したように、例えばギメラシル、５−ヨードウラシル、５−ビニルウラシル、エニルウラシルを含むが、上記に限定されない。組成物に含まれるＤＰＤ不活性化剤の量もまた上述されている。好ましくは、ＤＰＤ不活性化剤が、少なくとも６００ｎｇ／ｍｌまたは少なくとも８５０ｎｇ／ｍｌの量で組成物中に含まれている。

一実施形態において、組成物は、（１）固体支持体に取り付けられ、５−ＦＵと選択的な免疫反応の活性を有する複数の抗体；（２）ポリマーまたは基板と結合した複数の５−ＦＵ分子；および（３）ＤＰＤ不活性化剤；を備える。好ましくは、組成物中の抗体が、２５％未満、好ましくは１５％未満の、ＤＰＤ不活性化剤との交差反応性を有している。必要に応じて、組成物は、さらに５−ＦＵを含み５−ＦＵまたはそのプロドラッグで治療された患者から得られた、患者サンプル（血液、血清、血漿、尿等）を含む。

また、本発明は、ＤＰＤ不活性化剤との混合物中に、５−ＦＵあるいはそのプロドラッグを投与した患者から分離されたサンプルを含む組成物を提供する。好ましくは、ＤＰＤ不活性化剤はギメラシルである。また好ましくは、試料は、血液、血漿、または血清であり、不活化剤は、組成物中少なくとも６００、８５０、１０００、１２００、２０００または４０００ｎｇ／ｍｌの濃度である。

別の態様において、本発明は、容器中に：少なくとも６００ｎｇ／ｍｌ、８５０ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ、１２００ｎｇ／ｍｌ、２０００ｎｇ／ｍｌまたは４０００ｎｇ／ｍｌの濃度のＤＰＤ不活性化剤との混合物中に、５−ＦＵまたはそのプロドラッグを投与した患者から分離されたサンプル（血液、血漿または血清）を有するキットを提供する。必要に応じて、キットはさらに１０℃以下の温度に試料を冷却するための手段を含む。発泡スチロールの箱または宅配便の封筒などの容器に試料を冷却するために、ＰｏｌａｒＰａｃｋ（登録商標）（テグラント）やＴｈｅｒｍｏＳａｆｅ（登録商標）などの冷却パックを使用することができる。定期的に氷またはドライアイスを使用することもできる。

区分容器中に、（１）固体支持体に取り付けられ、５−ＦＵと選択的な免疫反応の活性を有する複数の抗体；（２）ポリマーまたは基板と結合した複数の５−ＦＵ分子；および（３）ＤＰＤ不活性化剤；を備えるアッセイキットも提供される。好ましくは、組成物中の抗体が、２５％未満、好ましくは１５％未満の、ＤＰＤ不活性化剤との交差反応性を有する。キットはまた、必要に応じて、標準材料として使用するための５−ＦＵを独立したコンパートメントに含む。キットは、与えられた任意の患者サンプル中の５−ＦＵレベルを決定するための便利で使いやすい方法の使用を可能とする。

本発明の各種の態様において、ＤＰＤ不活性化剤との混合物中の患者サンプルは、好ましくは、患者から分離した後１時間、２時間、３時間、４時間以内または５乃至４８時間以内に凍結されない。

５−ＦＵをアッセイする方法は、５−ＦＵまたは５−ＦＵのプロドラッグによる治療を最適化するために特に有用であり、血液の５−ＦＵレベルは、薬剤のある投与後に決定され、薬剤の次の投与を調整／決定するための参照として使用される。このように、本発明のさらに別の態様において、５−ＦＵまたは５−ＦＵのプロドラッグで患者を治療する方法も提供される。一般的に、この方法は、（１）治療を必要とする患者に５−ＦＵまたは５−ＦＵのプロドラッグの第１の用量を投与する工程と；（２）患者から得られたサンプル中の５−ＦＵの量を決定する工程であって、サンプルはジヒドロピリミジン−デヒドロゲナーゼの不活性剤と体外で混合される工程と；（３）患者に５−ＦＵまたはそのプロドラッグの第２の用量を投与する工程と；を含む。第２の用量で投与した５−ＦＵまたはそのプロドラッグの量は、所定の最適なターゲットである５−ＦＵのＡＵＣを参考にして、患者サンプルで測定された５−ＦＵのレベルに基づいて決定される。第２の用量は、ターゲット濃度内で血液の５−ＦＵ濃度を提供するための量で投与することができる。この治療方法において、患者から得られたサンプル中の５−ＦＵ量を決定する工程は、上述したように本発明のサンプルの処理が組み込んだ、上述した本発明のアッセイ方法に従って、患者サンプルの５−ＦＵをアッセイする。しかし、医師は、診断ラボからのこのようなアッセイをオーダーし、ラボから送られたアッセイレポートから５−ＦＵのレベルを決定する。

たとえば、５−ＦＵを含む治療において、曲線下面積（ＡＵＣ）で表される５−ＦＵの定量的な目標血中濃度は、２０乃至２４ｍｇ・ｈ／Ｌまでのものであることが提案されている。一実施形態において、本発明の治療方法は、５−ＦＵの用量を最適化するために使用されるとともに、以下の工程：（１）例えばＢＳＡ（体表面積）で決定された量である、５−ＦＵの第１の用量を患者に投与する工程と；（２）患者から得られたサンプル中の５−ＦＵの量を決定する工程であって、サンプルはＤＰＤの不活性化剤と体外で混合される工程と；（３）工程（２）で求めた５−ＦＵの量に基づいて、２０乃至２５ｍｇ・ｈ／Ｌの範囲内で血液／血漿５−ＦＵのＡＵＣを提供できると計算され予測される量で、５−ＦＵの第２の用量を患者に投与する工程；を含む。すなわち、患者サンプル中の測定された５−ＦＵレベルが２０ｍｇ・ｈ／Ｌ以下の血液／血漿５−ＦＵのＡＵＣを示す場合、医師が第１の投与量を超える第２の投与量で投与すべき５−ＦＵの量を増加することを勧める。患者サンプル中の測定された５−ＦＵレベルが２５ｍｇ・ｈ／Ｌ以上の血液／血漿５−ＦＵのＡＵＣを示す場合、医師が第１の投与量と比較して第２の投与量で投与すべき５−ＦＵの量を減少することを勧める。５−ＦＵをアッセイするための、アッセイ方法とその様々な実施形態は、上述されており、繰り返すことなく、本明細書に援用する。好ましい実施形態において、治療法の決定ステップは、５−ＦＵで治療された患者から５−ＦＵを含む血液サンプルを得る工程と、血液サンプルをＤＰＤ不活性化剤と体外で混合して混合物を形成する工程と、混合物から５−ＦＵを含む血漿および不活性化剤を分離する工程と、血漿中の５−ＦＵの量を測定する工程と、を備えている。

別に述べたように、本発明は、５−ＦＵまたはそのプロドラッグで患者の治療を導くための患者サンプルにおける５−ＦＵを測定するためのアッセイキットを製造するためのＤＰＤ不活性化剤の使用を提供し、治療は、（１）治療の必要な患者に、５−ＦＵまたは５−ＦＵのプロドラッグの第１の用量を投与する工程と；（２）患者から得られたサンプル中の５−ＦＵの量を決定する工程であって、サンプルがＤＰＤ不活性化剤と体外で混合される工程と；（３）工程（２）で決定された５−ＦＵの量に基づいて決定された量であって、所定の基準範囲内、例えば、２０乃至２５ｍｇ・ｈ／Ｌの範囲内の血液／血漿５−ＦＵのＡＵＣの結果となるよう計算され予想された量で、患者に５−ＦＵまたはそのプロドラッグの第２の用量を投与する工程と；を備える。アッセイキットの構成要素は、上述したものまたは以下に記載するものである。

ＩＩ．デバイスおよびキット
本発明は、また、患者血液サンプルにＤＰＤ不活性化剤を転送し、患者血液サンプルとＤＰＤ不活性化剤を混合させるための転送装置を提供する。本発明は、その中のＤＰＤ不活性化剤の有無にかかわらず、後述の転送シリンジアセンブリを包含する。図６を参照すると、転送シリンジアセンブリ６００および６００’は、ＤＰＤ不活性化剤の溶液をクリニックまたは試験ラボに保管および出荷するために、および、保管されたＤＰＤ不活性化剤の溶液を患者サンプルに転送するために、特に有益である。転送シリンジアセンブリ６００（６００および６００’）は、ＤＰＤ不活性剤の溶液６２０（例えば、ＤＭＳＯまたはメタノール溶媒中のギメラシルまたはエニウラシルの溶液）が事前に充填される、転送シリンジのチャンバーを画定するバレル６１０を含んでいる。バレル６１０は、遠位端から延びる先端部６３０を有している。先端部６３０は、使用時に注射針と作動可能に接続される。さらに、転送シリンジアセンブリは、先端に取り付けられたあるいはバレル６１０の遠位端から延びる先端シールド６４０を含む。先端シールド６４０は、先端部６３０を超えて縦方向に延びている。さらに、転送シリンジアセンブリ６００は、操作可能に先端６３０または先端シールド６４０に接続する、先端キャップ６５０を含んでいる。好ましい実施形態において、先端シールド６４０および先端キャップ６５０は、嵌合溝を持ち、一緒に連結している。例えば、先端シールド６４０は内側に向く溝を有し、先端キャップ６５０は外側に向く溝を有し、あるいはその逆の溝を有し、先端キャップ６５０は、先端シールド６４０としっかりとねじ込まれて固定され、バレルチャンバーの先端部６３０を封止する。プランジャ６６０は、バレル６１０のチャンバー内に摺動自在に挿入される。

転送シリンジアセンブリ６００’は、注射針６７０がシリンジ先端部６３０に接続されている以外、転送シリンジアセンブリ６００と同じである。注射針は、好ましくは、注射針キャップでシールドされる。注射針は、患者サンプルを含む別の容器（バイアルまたはチューブ）を穿刺するために使用され、プランジャ６６０をスライドさせるか押すことにより患者のサンプル容器にＤＰＤ不活性化溶液を供給する。

図７は別の転送シリンジアセンブリ７００を示しており、転送シリンジアセンブリ６００の先端キャップ６５０が注射針カバー７１０に置き換えられている点、注射針カバー７１０’が転送シリンジアセンブリ６００’の上に搭載されている点、以外は転送シリンジアセンブリ６００および６００’と同じである。注射針カバー７１０を参照すると、それは、注射針７４０の周りに同軸状に配置され、注射針７４０に沿って注射針の尖った先端を超えて延びる、管状体７３０を通常含む。注射針カバー７１０’は注射針７４０が欠けている以外注射針カバー７１０と同じである。注射針カバーは、転送シリンジアセンブリ７００を形成する転送シリンジアセンブリ６００または６００’上に作動可能に接続され搭載される。例えば、一実施形態において、転送シリンジアセンブリ６００の先端シールド６４０は、注射針７４０のルアーアダプタ７２０を結合するための内側に向く溝を有する。別の実施形態において、転送シリンジアセンブリ６００’の先端シールド６４０はルアーアダプタ７２０’を結合するための内側に向く溝を有し、注射針カバー７１０’が注射針６７０をシールドする転送シリンジアセンブリ６００’上に載置される。また、７２０または７２０’は注射針７４０の周りに同軸状に載置されたコネクタとすることができる。

転送シリンジアセンブリ７００は、図８に示すように、便利かつ安全に患者のサンプルチューブにＤＰＤ不活性化剤の溶液を転送するために使用することができる。図８における転送シリンジアセンブリ８００は、転送シリンジアセンブリ７００および患者サンプル（例えば、血液）を含むチューブ８１０を含み、チューブ８１０は注射針カバー７１０または７１０’に挿入され、注射針７４０または６７０はチューブの穴をあけることが可能なキャップ８１２を介してサンプルチューブ８１０内に挿入される。このようにして、ＤＰＤ不活性化溶液が転送シリンジアセンブリ７００に含まれている場合、プランジャ６６０は押されて、サンプルチューブにＤＰＤ不活性化溶液を供給する。

さらに別の態様において、本発明は、上述した一またはそれ以上の転送シリンジアセンブリを含むキットを提供する。キットは、どのような形態（例えば、溶液中）においても、ＤＰＤ不活性化剤を含むことができあるいは含まないこともできる。含まれている場合は、ＤＰＤ不活性化剤は、転送シリンジアセンブリ中または別のコンパートメント中に保存することができ、患者血液サンプル中におけるＤＰＤ酵素活性を阻害するために十分で、サンプル中での５−ＦＵ劣化を避けるのに十分な量である。キットは、さらに、以下のアイテムを一またはそれ以上含む：使い捨てピペット、採血管、血漿サンプルを受け取り保管するためのクライオバイアルチューブ、輸送チューブ、患者サンプルを輸送するための吸収性材料からなるバッグなど。キットはさらに、医療専門家に、サンプル中の５−ＦＵアッセイの目的で患者サンプルをどのようにして取得して処理するのかを説明するインストラクションシートを含むことができ、それらはすべて上記に詳細に記載されている。さらに、キットは５−ＦＵと選択的に免疫学的活性を有する抗体を含むことができる。このキットは、また、必要に応じて標準材料として使用するため、独立したコンパートメントに５−ＦＵを含んでいる。

一実施態様において、キットは、コンテナ内に、（１）図６または図７に示すような転送シリンジアセンブリ、（２）ＤＰＤ不活性化剤、および（３）５−ＦＵと選択的に免疫反応性を有する抗体、を備える。別の実施形態において、キットは、コンテナ内に、（１）図６または図７に示した転送シリンジアセンブリ、（２）ＤＰＤ不活性化剤、（３）固体支持体に結合されて５−ＦＵと選択的に免疫反応性を有する複数の抗体、（４）ポリマーまたは基板に結合された複数の５−ＦＵ分子、を備える。好ましくは、キット内の抗体が、２５％未満、好ましくは１５％未満の、ＤＰＤ不活性化剤との交差反応性を有する。キットはまた、独立したコンパートメント内に、標準材料として使用するための５−ＦＵを含む。また、好ましくは、ＤＰＤ不活性化剤は、転送シリンジアセンブリのバレルに含まれている溶液中に存在する。

以下の例示の例において、５−ＦＵは、米国特許第７，２０５，１１６号に開示された抗体を用いて、オリンパスＡＵ６８０アナライザで抗体ベースの凝集アッセイを用いて測定された。具体的には、サンプル中の５−ＦＵの濃度は、ナノ粒子が凝集の量によって決定されるサンプルの吸光度に基づいて決定される。システムは、遊離５−ＦＵのない状態で混合したとき、ナノ粒子の大きな凝集体を形成し光を散乱して高い吸収値となる２種類の試薬を必要とする。遊離５−ＦＵの存在下では、凝集反応がやや抑制されて光の散乱も少なくなり低い吸収値となる。機器は毎月２回キャリブレーションされ、曲線（５−ＦＵ濃度対吸光度）が生成される。個々のサンプルからの吸光度の値は、濃度を決定するために、この曲線と比較される。

一般に、凝集アッセイにおいて、５−ＦＵ標識アミノデキストランを含有する緩衝液の９５μｌがキュベットにピペットで採取され、次いで濾過した血漿試料の７μＬもピペットで採取される。サンプルと試薬を混合し、その後約３．５分間インキュベートする。５−ＦＵ抗体結合ナノ粒子の９５μｌがキュベットにピペットで採取し混合される。完全な反応は約６．２分間インキュベートする。６００ｎｍでの一連の２７回の測定は、このプロセスを通してＡＵ６８０アナライザにより定期的な間隔で行われ、５−ＦＵ濃度は、２つの特定の時点からの測定値を使用して計算される。

ＩＩＩ．実施例
１．安定剤としてのエニルウラシルの使用
血液の６つのチューブ（スプレーオンＫ_２ＥＤＴＡチューブ、６ｍＬ）が６人のドナーのそれぞれから引き出され、血液チューブが穏やかに抗凝固剤を混合するために数回反転された。血液はプールされ、ドナーから分離された。各血液サンプルの等分量は新しいコニカルチューブに転送され、在庫の５−ＦＵの計算量（２００ｎｇ／μＬの）が、５００ｎｇ／ｍＬの５−ＦＵの最終濃度のために各血液サンプルに添加された。各血液サンプルは、以下の条件でエニルウラシルを含む６本のチューブ（チューブ当たりの血液５ｍＬ）のセットに小分けされた：
高濃度（最終的に４０００ｎｇ／ｍＬの血液）、ＤＭＳＯ溶媒；
低濃度（最終的に１０００ｎｇ／ｍＬの血液）、ＤＭＳＯ溶媒。

また、血液は、陰性コントロールとして機能するように、ＤＭＳＯのみ（無エニルウラシル）を含むチューブに添加された。すべての血液チューブは反転することにより混合された。血液チューブは４５分または２４時間室温でインキュベートされ、適切な時期に、チューブは、血漿を分離するために室温で１０分間２０００ｘｇで遠心分離された。血漿は、遠心分離の直後に吸引され、クリーンなクリオバイアルに分注した。サンプルは、オリンパスアナライザＡＵ６８０（２００μＬ、１２，５００ｒｐｍで１５分間スピン）のための標準的な条件の下で実行された。測定は、血漿の収集直後および最初の読み込みの２４時間後に行われた。血漿は室温で保存された。図２は、エニルウラシルが血液サンプル中の５−ＦＵの分解を防ぐのに有効であったことを示している。

２．安定剤としての５−ビニルウラシル、５−ヨードウラシルおよびギメラシルの使用
血液の３つのチューブ（スプレーオンＫ_２ＥＤＴＡチューブ、１０ｍＬ）が６人のドナーのそれぞれから引き出され、血液チューブが穏やかに抗凝固剤を混合するために数回反転された。血液はプールされ、ドナーから分離された。各血液サンプルの等分量は新しいコニカルチューブに転送され、在庫の５−ＦＵの計算量（２００ｎｇ／μＬの）が、５００ｎｇ／ｍＬの５−ＦＵの最終濃度のために各血液サンプルに添加された。各血液サンプルは、４本のチューブ（チューブ当たり５ｍＬの血液）のセットに小分けされた。チューブの各セットは異なっていたが、下記の条件の組み合わせを含んでいた：
５−ヨードウラシルの低濃度（血液中で最終的に１０μｇ／ｍＬ）；
５−ヨードウラシルの高濃度（血液中で最終的に４０μｇ／ｍＬ）；
５−ビニルウラシルの低濃度（血液中で最終的に５μｇ／ｍＬ）；
５−ビニルウラシルの高濃度（血液中で最終的に２０μｇ／ｍＬ）；
ギメラシルの低濃度（血液中で最終的に３００ｎｇ／ｍＬ）；
ギメラシルの高濃度（血液中で最終的に１，２００ｎｇ／ｍＬ）。

チューブは反転により混合された。血液チューブは４５分間室温でインキュベートされた。適切なタイミングで、血液チューブは、血漿を分離するために、室温で１０分間２０００ｘｇで遠心分離された。血漿は遠心分離の直後に吸引され、新しいコニカルチューブに分注された。血漿サンプルは、オリンパスアナライザＡＵ６８０（２００μＬ、１２，５００ｒｐｍで１５分間スピン）のための標準的な条件の下で実行された。血漿は室温で保存された。図３は、５−ビニルウラシル、５−ヨードウラシルおよびギメラシルが、すべての血液サンプルで５−ＦＵの安定化に有効であったことを示している。

３．必要なＤＰＤ不活性化剤の量
血液の４つのチューブ（スプレーオンＫ_２ＥＤＴＡチューブ、１０ｍＬ）が６人のドナーのそれぞれから引き出され、穏やかに抗凝固剤を混合するために数回反転された。すべてのドナーの血液は、１つの大きなチューブにプールされ、そのプールされた血液の２つの等分量が２つの新しいチューブに転送された。残りの血液は、白血球（ＷＢＣ）／バフィーコートを分離するために使用された。ＷＢＣ／バフィーコートは、残りの血液チューブを遠心分離し、各チューブからＷＢＣ層を抽出してプールし、ＷＢＣ／バフィーコートを濃縮するために再び遠心分離し、クリーンなチューブに濃縮したＷＢＣ／バフィーコート層を分離する、ことにより単離した。血液の１つのボリュームは、５００ｎｇ／ｍＬの最終濃度の在庫５−ＦＵの計算量（２００ｎｇ／μＬの）に添加され、血液の他のボリュームは、１５００ｎｇ／ｍＬの最終濃度の在庫５−ＦＵの計算量（２００ｎｇ／μＬの）に添加された。８つのチューブごとに３セットが、分注した血液を等分にするために準備された。さらに、ギメラシルの代わりに３００μＬの３０％メタノール／水を接種されたネガティブコントロールが用いられた。セットごとの８つのチューブの４つに、低濃度の５−ＦＵの血液が、各チューブに６ｍＬ分注された。高濃度の５−ＦＵの血液が、６ｍＬごとのネガティブコントロールチューブに対してと同様に、セットごと残りの４つのチューブに分注された。８つのチューブは、その後、３０％のＭｅＯＨ／水中０．１２ｍｇ／ｍＬギメラシルの溶液３００μＬまたは０．０４ｍｇ／Ｌのギメラシルの３００μＬいずれかを接種された。血液チューブはギメラシルを混合させるために反転され、４５分間室温で置かれた。血液チューブは１０分間室温で２０００ｘｇで遠心分離された。血漿は、遠心分離した直後に吸引され、クリーンなクリオバイアルに分注された。ＷＢＣ／バフィーコートは、プラズマの指定されたチューブに添加され、均一に混合するためにボルテックスされた。血漿サンプルは、ＡＵ６８０アナライザ（２００μＬ、１２，５００ｒｐｍで１５分間スピン）の標準的な条件の下で実行された。測定は、ＷＢＣ／バフィーコートを添加した後２４時間（「２４時間」）とともにＷＢＣ／バフィーコートを添加した直後（「初期」）に行われた。２４時間の測定では、血漿は、一晩環境での出荷をシミュレートするため、実験の最初の２４時間室温で保存された。下記の表１はその結果をまとめたものである。

血液の４つのチューブ（スプレーオンＫ_２ＥＤＴＡチューブ、１０ｍＬ）が５人のドナーのそれぞれから引き出され、穏やかに抗凝固剤を混合するために数回反転された。血液はコニカルチューブにドナーによってプールされた。各ドナーの血液の等分量はクリーンなチューブに転送された。在庫の５−ＦＵの計算量（２００ｎｇ／μＬの）が、５００ｎｇ／ｍＬの５−ＦＵの最終濃度を達成するために各血液サンプルに添加され、チューブは混合のために反転された。混合された血液は、ドナーあたり９チューブであってチューブあたり血液３．５ｍＬとなるように、クリーンなチューブ中に等分に分注された。ギメラシルは、各チューブに対し、２００、４００または６００ｎｇ／ｍＬの最終濃度でチューブに添加された。さらに、対照サンプルでは、ネガティブコントロールとして使用するために、ギメラシルの代わりにメタノールが血液に添加された。血液チューブは、ギメラシルまたはメタノールの添加後４５分間室温に置かれた。適切なタイミングで、血液チューブは、血漿を分離するために、室温で１０分間２０００ｘｇで遠心分離された。血漿は遠心分離した直後に吸引され、血漿はクリーンなチューブに分注された。血漿サンプルは、オリンパスＡＵ６８０アナライザ（２００μＬ、１２，５００ｒｐｍで１５分間スピン）のための標準条件を用いて実行した。５−ＦＵ濃度の測定は、血漿の収集後（「初期」）、その後２４時間（「２４時間」）に実施された。２４時間測定では、血漿は、２４時間室温で保存された。結果を表２にまとめる。表２と図４に示すように、血液中の低濃度のギメラシルは、５−ＦＵのＤＰＤ介在劣化を阻害するために有効である。２００ｎｇ／ｍＬおよび６００ｎｇ／ｍＬのギメラシルを含有するサンプル間の５−ＦＵ濃度の全体的なパーセントの差は１％未満である。

４．血漿分離の前における血液中のギメラシルの拡張インキュベーションの効果
血液の６つのチューブ（スプレーオンＫ_２ＥＤＴＡチューブ、６ｍＬ）が６人のドナーのそれぞれから引き出され、血液チューブは抗凝固剤を血液中に混合するために数回反転された。血液チューブはプールされドナーによって分離された。各ドナーの血液の等分量は新しいチューブに転送され、在庫の５−ＦＵの計算量（２００ｎｇ／μＬの）が、５００ｎｇ／ｍＬの５−ＦＵの最終濃度を達成するために各血液サンプルに添加された。混合された血液サンプルは、ドナーあたり８チューブであってチューブあたり血液４ｍＬとなるように、クリーンなチューブ中に等分に分注された。メタノール溶液中のギメラシルが、１２００ｎｇ／ｍＬの最終濃度に達するように血液チューブに添加された。ネガティブコントロールのために、メタノールのみがコントロールされる血液チューブに添加された。血液チューブは、血漿分離後４５分間、２４時間または４８時間室温に置かれた。適切なタイミングで、血液チューブは、血漿を分離するために、室温で１０分間２０００ｘｇで遠心分離された。血漿は遠心分離した直後に吸引され、クリーンなクリオバイアルに分注された。５−ＦＵのアッセイのために、血漿サンプルは、上述したオリンパスＡＵ６８０アナライザのための標準条件（２００μＬ、１２，５００ｒｐｍで１５分間スピン）を用いて実行した。５−ＦＵ濃度の測定は、血漿の収集後および最初の測定から２日の間実施された。血漿は、測定間隔の間室温で保存された。この実施例の結果は以下の表３と図５にまとめられる。

図５からわかるように、長い時間血漿分離することなく血液中にギメラシルを維持することは、５−ＦＵ濃度を人為的に高める可能性がある。血液サンプルは、好ましくは、ギメラシル阻害剤が追加されているのと同じ日以内に遠心分離される。

５．患者サンプルでの５−ＦＵのアッセイ
サンプルの収集は、定常状態のレベルを（５−ＦＵの平均ｔ_１／_２は〜１３分）を確認するため、５−ＦＵ治療の開始後および薬剤注入の終了前の少なくとも２時間の間に臨床医学者の現場で取り出された静脈血で構成される。オンドーズサンプルスタビライザーが、採血に続きすぐに血液サンプルに注入され混合されて、血液サンプルは最大４時間まで室温で残ることができる。サンプルは、その後遠心分離される（１５００−２０００ｇ、１０分間）。血漿の約半分は、バーコードで標識された血漿輸送チューブに転送され、分析のために、Ｍｙｒｉａｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．に周囲温度で一晩で出荷される。

受け取り時に、サンプルのバーコードがスキャンされ追跡される。サンプルは、分析のために使用される得られた濾液のフィルター膜を介して遠心分離される。オンドーズアッセイは、競争力のある均質な２試薬ナノ粒子凝集免疫測定法である。第１試薬は、５−ＦＵ主導の抗体結合ナノ粒子からなる第２試薬と結合した５−ＦＵを含んでいる。血漿中の遊離５−ＦＵの量は２つのアッセイ試薬の凝集を阻害する。ナノ粒子の凝集から特定の波長における吸光度の量は、血漿中の薬物の量に依存する。この吸光度は、定量するために標準化された検量線と比較される。Ｇａｍｅｌｉｎ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２６（１３）：２０９９−１０５（２００８）に基づいて、曲線（ＡＵＣ）下の面積で表される、定量的なターゲット範囲は、５−ＦＵの測定された濃度およびテスト要求フォームで臨床医によって提供された注入時間のから計算される。

明細書で記載したすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する当業者のレベルを示すものである。個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参考として援用されることが示されたかのように、全ての刊行物および特許出願は、本明細書中と同程度に参考として援用される。刊行物および特許出願の単なる言及は、必ずしも本出願に先行技術であることを承認するものではない。

前述の発明は、理解の明確さの目的で図面および実施例により詳細に記載されているが、特定の変更および修正が添付の特許請求の範囲内で実施できることは明らかである。

Claims (34)

1. ５−ＦＵおよびそのプロドラッグを投与された患者からのサンプルにおいて５−フルオロウラシルをアッセイする方法であって、前記方法が：
   前記患者からサンプルを取得する工程であって、前記サンプルはジヒドロピリミジン−デヒドロゲナーゼの一またはそれ以上の不活性化剤と体外で混合される工程；および、
   前記サンプル中の５−フルオロウラシルの量を決定する工程；
   を備えることを特徴とする方法。
2. ５−ＦＵおよびそのプロドラッグを投与された患者からのサンプルにおいて５−フルオロウラシルをアッセイする方法であって、前記方法が：
   ５−フルオロウラシルまたはそのプロドラッグを投与された前記患者から得られたサンプル中の５−フルオロウラシルを測定する工程であって、前記サンプルが前記患者から得られた後ジヒドロピリミジン−デヒドロゲナーゼの一またはそれ以上の不活性化剤と体外で混合される工程；
   を備えることを特徴とする方法。
3. ５−フルオロウラシルまたはそのプロドラッグで患者を治療する方法であって：
   ５−フルオロウラシルまたはそのプロドラッグの第１の量を前記患者に投与する工程；
   ５−フルオロウラシルまたはそのプロドラッグを投与した前記患者から得られたサンプル中の５−フルオロウラシルの量を決定する工程であって、前記サンプルがジヒドロピリミジン−デヒドロゲナーゼの不活性化剤と体外で混合される工程；および、
   前記決定工程の後、５−フルオロウラシルまたはそのプロドラッグの第２の量を患者に投与する工程；
   を備えることを特徴とする方法。
4. 前記決定または測定工程が、前記サンプルを５−フルオロウラシルと免疫反応性の抗体と接触させる工程を備える、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記サンプルが前記患者からの分離後１０時間以内に凍結されない、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記サンプルが血液、血漿、血清または尿である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記サンプルが血液である、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記不活性化剤がピリミジンまたはピリジンの誘導体である、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記不活性化剤がエニルウラシルまたはギメラシルである、請求項８に記載の方法。
10. ５−フルオロウラシルが前記不活性化剤の存在下で測定される、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
11. ５−フルオロウラシルのアッセイのために、５−フルオロウラシルまたはそのプロドラッグを含むレジメンで治療を受けている患者からの血液サンプルを処理する方法であって、前記方法が：
    前記患者から５−フルオロウラシルを含む血液サンプルを得る工程；
    前記血液サンプルから血漿を分離する工程；
    ジヒドロピリミジン−デヒドロゲナーゼの不活化剤と分離した血漿を混合して混合物を形成する工程；および、
    ５−フルオロウラシルの前記アッセイのため研究室へ前記混合物を送る工程；
    を備えることを特徴とする方法。
12. ５−フルオロウラシルまたはそのプロドラッグを含むレジメンで治療を受けている患者からの血液サンプルを処理する方法であって、前記方法が：
    前記患者から５−フルオロウラシルを含む血液サンプルを得る工程；
    ジヒドロピリミジン−デヒドロゲナーゼの不活性化剤と血液サンプルを混合して混合物を形成する工程；
    前記混合物から５−フルオロウラシルおよび前記不活性化剤を含む血漿を分離する工程；および、
    前記５−フルオロウラシルのアッセイのために前記血漿を研究室に送る工程；
    を含むことを特徴とする方法。
13. ５−フルオロウラシルまたはそのプロドラッグを含むレジメンで治療を受けている患者からの血液サンプルを処理する方法であって、前記方法が：
    前記患者から５−フルオロウラシルを含む血液サンプルを得る工程；
    ジヒドロピリミジン−デヒドロゲナーゼの不活性化剤と血液サンプルを混合して混合物を形成する工程；および、
    前記５−フルオロウラシルのアッセイのために前記混合物を研究室に送る工程；
    を含むことを特徴とする方法。
14. 前記サンプルが前記患者から分離後１０時間以内に凍結されない、請求項１１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記不活性化剤がピリミジンまたはピリジンの誘導体である、請求項１１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記不活性化剤がエニルウラシルまたはギメラシルである、請求項１５に記載の方法。
17. ジヒドロピリミジン−デヒドロゲナーゼの不活性化剤と混合して、５−フルオロウラシルを投与した患者から分離されたサンプルを含む組成物であって、前記不活性化剤が前記サンプルと体外で混合されることを特徴とする組成物。
18. 前記不活性化剤がピリミジンまたはピリジンの誘導体である、請求項１７に記載の組成物。
19. ＤＰＤ不活性化剤と混合した５−ＦＵと選択的な免疫反応性を有する抗体を備えることを特徴とする組成物。
20. ５−ＦＵを含み、５−ＦＵまたはそのプロドラッグで治療された患者から得られた、患者サンプルをさらに備える、請求項１９に記載の組成物。
21. ポリマーまたは基板と結合された複数の５−ＦＵ分子をさらに備え、前記抗体が固体支持体に取り付けられた、請求項１９または２０に記載の組成物。
22. 容器中に：
    ジヒドロピリミジン−デヒドロゲナーゼの不活性化剤と混合して、５−フルオロウラシルまたはそのプロドラッグを投与した患者から分離された５−フルオロウラシルを含む患者サンプルあって、前記不活性化剤が前記患者サンプルと体外で混合される患者サンプル；および、
    前記サンプルを１０℃以下の温度に冷却するための手段；
    を備えることを特徴とするキット。
23. 前記不活性化剤がピリミジンまたはピリジンの誘導体である、請求項２２に記載のキット。
24. 前記不活性化剤が少なくとも８５０ｎｇ／ｍｌの濃度であり、前記サンプルが血液または血漿または血清である、請求項２２または２３に記載のキット。
25. コンパートメントに分けられたコンテナ内に、（１）５−ＦＵと選択的に免疫反応性を有する抗体、および（２）ＤＰＤ不活性化剤、を備えることを特徴とするアッセイキット。
26. ポリマーまたは基板と結合された複数の５−ＦＵ分子をさらに備え、前記抗体が固体支持体に取り付けられた、請求項２５に記載のキット。
27. 別のコンパートメントに、５−フルオロウラシルをさらに備える、請求項２５または２６に記載のキット。
28. ５−ＦＵ抗体およびＤＰＤ不活性化剤がキット中の別のコンパートメントに存在する、請求項２５、２６または２７に記載のキット。
29. クレーム３０乃至３４のいずれか１項に記載の転送シリンジアセンブリをさらに備える、クレーム２２乃至２８のいずれか１項に記載のキット。
30. 転送シリンジアセンブリであって：
    転送シリンジのチャンバーを規定するバレルであって、前記バレルの終端から延びる端部を有するバレル；
    前記バレルのチャンバー内に摺動自在に挿入されたプランジャ；
    端部に装着され、前記端部に沿って縦方向に前記バレルの終端から延びる端部シールド；および、
    前記端部または端部シールドと駆動可能に接続され、前記端部シールドと結合することで前記端部をシールする端部キャップ；
    を備えることを特徴とする転送シリンジアセンブリ。
31. 前記チャンバー中に、ジヒドロピリミジン−デヒドロゲナーゼの不活性化剤の溶液をさらに備える、請求項３０に記載の転送シリンジアセンブリ。
32. 転送シリンジアセンブリであって：
    転送シリンジのチャンバーを規定するバレルであって、前記バレルの終端から延びる端部を有するバレル；
    前記バレルのチャンバー内に摺動自在に挿入されたプランジャ；
    前記端部と駆動可能に接続した針状部を有する針状部カバーであって、前記針状部カバーが、針状部の周りに同軸状に配置された通常チューブ状の部材と、針状部に沿って針状部の尖った先端部を超えて延びる針状部の壁部と、を有する針状部カバー；
    を備えることを特徴とする転送シリンジアセンブリ。
33. 患者サンプルを含む、穴明け可能なキャップを有するサンプル収集チューブであって、前記サンプル収集チューブが針状部カバー内に挿入され、針状部が穴明け可能なキャップを介してサンプル収集チューブに挿入されるサンプル収集チューブをさらに備える、請求項３２に記載の転送シリンジアセンブリ。
34. 前記チャンバー中に、ジヒドロピリミジン−デヒドロゲナーゼの不活性化剤の溶液をさらに備える、請求項３２または３３に記載の転送シリンジアセンブリ。
    

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