BR112012000873A2

BR112012000873A2 - método de dosar 5-fluorouracil em uma amostra de um paciente tratado com f-fu ou um pró-fármaco deste, método de tratar um paciente com 5-fluorouracil ou um pró-fármaco deste, método de processamento de uma amostra de sangue de um paciente tratado com um regime compreendendo 5-fluorouracil ou um pró-fármaco deste para um teste de 5-fluorouracil, método de processamento de uma amostra de sangue de um paciente tratado com um regime compreendendo 5-fluorouracil ou um pró-fármaco deste, composição, kit, kit de teste, conjunto de seringa de transferência

Info

Publication number: BR112012000873A2
Application number: BR112012000873-0A
Authority: BR
Inventors: Roa Benjamin; Colvin Carrie; Mcleod Howard; Overfield Michael; J Salamone Salvatore
Original assignee: Myriad Genetics Inc
Priority date: 2009-07-17
Filing date: 2010-07-19
Publication date: 2019-11-05
Also published as: EP3792634A3; EP3792634A2; US8440442B2; EP2454589A4; EP2454589A1; CN102648412A; CA2768488A1; US20110034488A1; AU2010273964A1; IN2012DN01379A; WO2011009140A1; JP2012533739A; JP5863047B2

Abstract

método de dosar 5-fluorouracil em uma amostra de um paciente tratado com 5-fu ou um pró-fármaco deste, método de tratar um paciente com 5-fluorouracil ou um pró-fármaco deste, método de processamento de uma amostra de sangue de um paciente tratado com um regime compreendendo 5 - fluorouracil ou um pró-fármaco deste para um teste de 5-fluorouracil, método de processamento de uma amostra de sangue de um paciente tratado com um regime compreendendo 5 - fluorouracil ou um pró-fármaco deste, composição, kit, kit de teste, conjunto de seringa de transferência a presente invenção fornece método, composições, dispositivo e kits para dosar 5-fu.

Description

MÉTODO DE DOSAR 5-FLUOROURACIL EM UMA AMOSTRA DE UM PACIENTE TRATADO COM 5-FU OU UM PRÓ-FÁRMACO DESTE, MÉTODO DE TRATAR UM PACIENTE COM 5-FLUOROURACIL OU UM PRÓ-FÁRMACO DESTE, MÉTODO DE PROCESSAMENTO DE UMA AMOSTRA DE SANGUE DE UM 5 PACIENTE TRATADO COM UM REGIME COMPREENDENDO 5-FLUOROURACIL OU UM PRÓ-FÁRMACO DESTE PARA UM TESTE DE 5-FLUOROURACIL, MÉTODO DE PROCESSAMENTO DE UMA AMOSTRA DE SANGUE DE UM PACIENTE TRATADO COM UM REGIME COMPREENDENDO 5 -FLUOROURACIL OU UM PRÓ-FÁRMACO DESTE, COMPOSIÇÃO, KIT, KIT DE TESTE, ‘ 10 CONJUNTO DE SERINGA DE TRANSFERÊNCIA

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção se refere geralmente a um teste de diagnóstico, e particularmente a um método de diagnóstico e composição para dosar 5-fluorouracil em amostras de paciente.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

O 5-fluorouracil (5-FU) é um dos quimioterápicos no tratamento do câncer. É comumente usado em vários regimes quimioterápicos para cânceres colorretal, estômago, de mama e pancreático. Por exemplo, 5-FU isoladamente ou em regime de 20 combinação, tal como FOLFOX e FOFIRI é a terapia de primeira linha padrão do câncer colorretal metastático. No entanto, o 5-FU é frequentemente associado com efeitos graves adversos incluindo mielossupressão, mucosite, dermatite, diarréia, toxicidade cardíaca e até mesmo a morte. Estes efeitos 25 adversos são causados pelo menos em parte pela atual abordagem para determinar a dose para pacientes individuais. O padrão de tratamento atual para dosagem - Área de Superfície Corporal (ASC) - somente considera a altura e o peso do paciente. A ASC não leva em conta vários dos fatores 3 0 que impactam no metabolismo e eficácia do 5-FU tal como genótipo, idade, sexo, estado da doença, interações medicamentosas, função do órgão e co-morbidades. Desta forma, não é tão surpreendente que as concentrações de 5-FU no

2/32 sangue em diferentes pacientes possam variar em mais de dez ondulações apesar da administração de dose igual com base em ASC.

Estudos acadêmicos recentes têm mostrado que o ajuste individual da dose de 5-FU com base no monitoramento farmacocinético das concentrações de 5-FU no plasma pode resultar em uma faixa de resposta ao objetivo significativamente melhorada de 5-FU. Vide, por exemplo, Gemelin et al. J. Clin. Oncol., 26(13):2099-2105 (2008); Climente-Marti et al. , J. Pharmaceut. Sci., 92(6):1155-1165 (2003); Milano et al., Int. J. Câncer, 41:537-541 (1988). Estes estudos sugerem que o teste clínico de concentrações de 5-FU no sangue em pacientes individuais submetidos à terapia de 5-FU é claramente desejado para o propósito de ajustamento da dose de 5-FU, otimização do efeito terapêutico e redução das reações graves adversas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece, em geral, um método de teste do 5-fluorouracil (5-FU) em uma amostra do paciente.

Em um primeiro aspecto, um método é fornecido para dosar o 5-FU em uma amostra de um paciente tratado com 5-FU e opcionalmente outros terapêuticos. No método, uma amostra é obtida de um paciente tratado com 5-FU. A amostra é então misturada com um inativador da dehidropiramidina desidrogenase (DPD) , e a quantidade de 5-FU é medida na amostra preferencialmente misturando com o inativador DPD.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento de um paciente com 5-FU, compreendendo as etapas de: administrar para o paciente uma primeira dose de 5-fluorouracil; determinar a quantidade de 5-FU em uma amostra obtida a partir de um paciente tratado com 5-FU, em que a dita amostra é misturada in vitro com um inativador de DPD, e em que a quantidade de 5-FU na dita amostra é medida

3/32 preferencialmente na presença de um inativador; e administrar para o paciente uma segunda dose de 5-FU. A quantidade de 5FU administrada na segunda dose pode ser determinada com base no nível de 5-FU medido em uma amostra do paciente em referência a uma ASC de 5-FU ideal predeterminada ou alvo.

A presente invenção também fornece métodos de processamento de uma amostra de sangue de um paciente submetido a uma terapia com 5-FU e opcionalmente outras drogas, para um teste de 5-FU. Em uma realização, o método • 10 inclui as seguintes etapas: obter uma amostra de sangue contendo 5-FU de um paciente tratado com 5-FU; isolar o plasma da amostra de sangue; misturar o plasma separado com um inativador de DPD para formar uma mistura; e enviar a mistura para um laboratório para teste de diagnóstico do 15 nível de 5-FU na mistura.

Em outra realização, o método compreende as etapas de: obter uma amostra de sangue contendo 5-fluorouracil de um paciente tratado com 5-FU; misturar a amostra de sangue com um inativador de DPD para formar uma mistura; e isolar o 20 plasma contendo 5-fluorouracil e o inativador da mistura. O plasma desta forma obtido pode ser enviado para um laboratório para teste de 5-FU.

Adicionalmente em outra realização, o método de processamento da amostra de sangue de um paciente tratado com 25 5-FU implica as seguintes etapas: obter uma amostra de sangue contendo 5-FU do paciente; misturar a amostra de sangue com

I um inativador de DPD para formar uma mistura; e enviar a mistura para um laboratório para dosar o 5-FU.

Adicionalmente em outro aspecto da presente 30 invenção, é fornecida uma composição compreendendo uma amostra isolada de um paciente tratado com 5-FU, em mistura com um inativador de dehidropiramidina desidrogenase, em que a dita amostra é sangue ou plasma ou soro, e o inativador

4/32 está em uma concentração de pelo menos 850 ng/ml na composição.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit contendo em um recipiente: (a) uma amostra (sangue, plasma ou soro) isolada de um paciente tratado com 5-FU, em mistura com um inativador de DPD em uma concentração de pelo menos 850 ng/ml; e (b) meios para resfriar a dita amostra em uma temperatura abaixo de 10°C.

Nos vários aspectos da presente invenção, a amostra preferencialmente não é congelada dentro de 5 a 10 horas após a separação do dito paciente. Exemplos de inativadores incluem, por exemplo, pirimidina ou derivados de pirimidina, particularmente análogos de uracila tal como eniluracil e gimeracil. O 5-FU pode ser testado em uma amostra através de quaisquer técnicas conhecidas, por exemplo, HPLC, Mass-Spec ou testes imunológicos usando anticorpos contra o 5-FU.

A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um técnico no assunto ao qual esta invenção pertence. Apesar de métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui poderem ser usados na prática ou no teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, controlarão. Adicionalmente, os materiais, métodos, e exemplos são somente ilustrativos e não pretendidos como sendo limitantes.

Outras características e vantagens da invenção estarão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada e a partir das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um diagrama demonstrando uma realização do método de processamento da amostra implementada

5/32 • 10 em uma configuração clínica;

A Figura 2 é um gráfico mostrando que o eniluracil foi efetivo em uma degradação preventiva do 5-FU nas amostras de sangue;

Ά Figura 3 é um gráfico mostrando que o 5viniluracil, 5-iodouracil e gimeracil foram todos eficazes na estabilização do 5-FU nas amostras de sangue.

A Figura 4 é um gráfico mostrando que as baixas concentrações de gimeracil no sangue são eficazes em inibir a degradação mediada por DPD do 5-FU.

A Figura 5 é um gráfico mostrando o efeito de manter o gimeracil no sangue sem a separação de plasma por um tempo mais longo;

A Figura 6 é um desenho mostrando uma realização de um conjunto de seringa de transferência;

As Figuras 7A e 7B são desenhos mostrando uma realização de um conjunto de seringa de transferência;

A Figura 8 é um desenho mostrando uma realização de um conjunto de seringa de transferência.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

1. Preparação da Amostra, Teste de 5-FU, Composições e Kits

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, um método é fornecido para processar amostras do paciente contendo 5-FU (por exemplo, de pacientes tratados com 5-FU ou um pró-fármaco de 5-FU) para uso em um teste de 5-FU. O método resulta em um aumento da estabilidade do 5fluorouracil nas amostras e apuração significativamente melhorada das medições do 5-FU. Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também fornece um método de dosar o 5-FU usando uma amostra do paciente processada de acordo com um método de processamento. Geralmente, o método de processamento compreende as etapas de obter uma amostra

6/32 contendo 5-FU (por exemplo, de um paciente tratado com 5-FU ou um pró-fármaco de 5-FU); misturar a amostra com um inativador de dehidropiramidina desidrogenase para formar uma mistura; e enviar a mistura para um laboratório para dosar o 5-FU na mistura.

É percebido que enquanto as realizações da presente invenção são descritas em detalhes no contexto das amostras do paciente obtidas a partir de um paciente tratado com 5-FU, a presente invenção englobaria também amostras de pacientes obtidas a partir de um paciente tratado com um pró-fármaco de 5-FU. Tal pró-fármaco (por exemplo, tegafur, doxifluridina e capecitabina) é metabolicamente ativado dentro do corpo do paciente e convertido em 5-FU.

A amostra do paciente contendo 5-FU usada na presente invenção pode ser de qualquer paciente tratado com 5-FU no qual o nível de 5-FU deve ser medido. Pode ser também de pacientes administrados com um ou mais pró-fármacos de 5FU tal como tegafur, doxifluridina e capecitabina. Por exemplo, o 5-FU é comumente usado na quimioterapia para pacientes com câncer incluindo pacientes com câncer de mama, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer pancreático ou câncer na cabeça e pescoço. O 5-FU também é usado na cirurgia oftálmica em pacientes de glaucoma como um agente anticicratizante no local da trabeculectomia. Adicionalmente, o 5-FU é usado topicamente como um creme para tratar a doença de Bowen, ceratoses solares e carcinomas basocelulares da pele. Os métodos da presente invenção são particularmente vantajosos para dosar o 5-FU em amostras de pacientes com câncer. Neste contexto, o paciente pode ser um paciente com câncer submetido a regimes de tratamento compreendendo 5-FU. Por exemplo, o 5-FU é tipicamente administrado com ácido fólico ou leucovorina. No câncer de cólon metastático, o 5-FU é frequentemente usado em combinação de regimes tais como

7/32

FOLFOX (5-FU mais oxaliplatina e leucovorina) e FOLFIRI (5-FU mais irinotecano e leucovorina). Drogas mais novas tais como bevacizumabe, panitumumabe e cetuximab também podem ser adicionadas aos regimes. A presente invenção é aplicável em todas as terapias e regimes de tratamento para dosar 5-FU em amostras obtidas para pacientes sendo tratados com tais regimes, e para otimizar a quantidade de 5-FU administrada para um paciente em particular.

Amostras adequadas do paciente para uso na presente invenção podem ser de qualquer parte do corpo de um paciente. Por exemplo, amostras adequadas podem ser amostras de tecido ou corporal, tal como tecidos tumorais, sangue, plasma, soro, urina, etc.

Em terapias de câncer, o 5-fluorouracil é tipicamente administrado através de injeção intravenosa em bolus ou infusão intravenosa. A administração pode ser repetida diariamente, semanalmente, a cada quatro semanas, dependendo da escolha do regime de tratamento. A injeção em bolus pode ser administrada durante 1 a 10 minutos ou durante 20 a 60 minutos, e, por exemplo, pode ser repetida por 5 dias consecutivos, cada quatro semanas ou 6 ciclos. Em infusão contínua IV, o 5-FU pode ser administrado durante várias horas, por exemplo, em 8 horas semanalmente. Amostras de sangue podem ser retiradas de um paciente em qualquer tempo antes, após ou durante a administração de 5-FU. Frequentemente, a medição do nível de 5-FU no sangue em um estado estável é desejável, em que o caso das amostras de sangue são retiradas após um estado estável ser alcançado. Por exemplo, em uma infusão contínua de oito horas, um estado estável pode ser alcançado duas horas após a iniciação da infusão.

Tipicamente, as amostras de sangue podem ser coletadas em quaisquer métodos convencionais de retirada de

8/32 sangue venoso periférico. Por exemplo, uma amostra de sangue pode ser coletada dentro de um tubo ou via tipicamente usada em clínicas. Ά quantidade de sangue coletada depende da quantidade necessária para um teste de 5-FU em particular. Por exemplo, 1 mililitro a 2 mililitros a 5 mililitros a 10 mililitros podem ser suficientes para a maioria dos tipos de teste de 5-FU. Opcionalmente, EDTA ou heparina podem ser misturados com a amostra de sangue para prevenir a coagulação. A mistura pode ser alcançada, por exemplo, usando um tubo heparinizado ou um tubo EDTA.

De acordo com a presente invenção, a amostra obtida do paciente contendo 5-FU é então misturada com um inativador de dehidropiramidina desidrogenase (DPD) in vitro para inibir a atividade do DPD e prevenir a degradação do 5-FU. A amostra do paciente pode ser resfriada em uma temperatura de cerca de 0°C, por exemplo, por cerca de 5 minutos ou mais antes do inativador de DPD ser adicionado à amostra do paciente e misturado. Mas preferencialmente, a amostra do paciente é misturada com o inativador de DPD imediatamente após sua separação do corpo do paciente. A mistura resultante (amostra do paciente em mistura com inativador DPD) pode então ser enviada para um laboratório para dosar a quantidade ou nível ou concentração de 5-FU na amostra.

Em uma realização, o método de processamento de uma amostra do paciente para um teste 5-FU compreende obter uma amostra de sangue contendo 5-fluorouracil de um paciente tratado com 5-FU ou um pró-fármaco de 5-FU, misturando a amostra de sangue com um inativador de DPD para formar uma mistura, e opcionalmente enviar a mistura para um laboratório para dosar a quantidade de 5-FU na amostra do paciente.

Em outra realização, o método de processamento de uma amostra do paciente para teste do 5-FU compreende obter uma amostra de sangue contendo 5-FU de um paciente tratado

9/32 com 5-FU ou um pró-fármaco de 5-FU, misturando a amostra de sangue com urn inativador de dehidropiramidina desidrogenase para formar uma mistura, isolando o plasma contendo 5-FU e o inativador da mistura; e opcionalmente enviar o plasma para um laboratório para dosar o nível de 5-FU. Em realizações preferidas, a etapa de mistura toma lugar imediatamente após a amostra de sangue ser retirada de um paciente. Isto é, após a amostra de sangue ser separada do corpo do paciente, o inativador de DPD deve ser adicionado e misturado com a • 10 amostra de sangue coletada o mais rápido possível.

Preferencialmente também, a etapa de isolar o plasma da amostra de sangue misturada com um inativador de DPD é desempenhada dentro de 4 ou 5 horas, mais preferencialmente dentro de 1 hora a partir do momento em que o sangue é 15 retirado.

Em outra realização, o método de processamento de uma amostra de sangue para o teste de 5-FU compreende obter uma amostra de sangue contendo 5-FU de um paciente tratado com 5-FU ou um pró-fármaco de 5-FU, isolar o plasma da 20 amostra de sangue, misturar o plasma separado com o inativador de DPD para formar uma mistura e enviar a mistura para um laboratório para teste do nível de 5-FU.

A Figura 1 demonstra como o método de processamento da amostra pode ser implementado em uma clínica. Uma seringa 25 de inativador de DPD (contendo uma solução inativadora de DPD) e um dispositivo de transferência podem ser preparados conforme ilustrado na Figura 1. Especificamente, a cápsula de uma seringa de inativador de DPD (vide também a Figura 6) é desparafusada, a seringa é conectada a um Dispositivo de 3 0 Transferência de BD (vide também a Figura 7) , e a unidade combinada é colocada de lado até que a amostra de sangue tenha sido coletada. O sangue do paciente pode ser retirado conforme mostrado na Figura 1. Especificamente, o sangue pode

10/32 ser retirado em um tubo Vacutainer® K₂-EDTA de 6 mL enquanto o paciente adicionalmente está sendo infundido com o 5-FU na faixa de infusão prescrita. O sangue é retirado de uma veia periférica, não de uma porta de infusão, pelo menos 2 horas após o início da infusão contínua de 5-FU. O sangue é retirado até que o tubo esteja, por exemplo, pelo menos preenchido em 3/4, e preferencialmente a dose exata de 5-FU administrada em mg/m² e a duração total da infusão são registradas. Uma solução inativadora de DPD é então imediatamente dispensada no tubo da amostra de sangue conforme mostrado na Figura 1. Especificamente, a unidade de dispositivo de seringa de transferência combinada é conectada sobre o tubo K₂-EDTA e firmemente inserida através do aparador do tubo, após o qual o êmbolo da seringa é completamente deprimido. A amostra é então suavemente misturada invertendo o tubo pelo menos 3 vezes. 0 plasma é separado através de centrifugação em 1500 g - 2000 g por 10 minutos. Finalmente, não mais que metade do plasma é removida com uma pipeta descartável e transferida para um tubo Criotubo® de 3 mL conforme ilustrado na Figura 1. Especificamente, o bulbo da pipeta descartável é espremido antes da inserção da ponta no plasma. Então, a ponta da pipeta é inserida logo abaixo do topo da camada clara de plasma e o bulbo é liberado aos poucos. A pipeta é seguida abaixo do tubo conforme o plasma é retirado. Não mais que metade da camada clara do plasma é retirada na pipeta e a aspiração repetida é retirada de forma a prevenir o movimento da camada celular/coágulo entre o plasma e as células vermelhas do sangue. 0 plasma é transferido da pipeta para um tubo Criotubo de 3 mL para armazenamento e análise do nível de 5-FU.

Inativadores de DPD são geralmente conhecidos na técnica. O DPD (dehidropiramidina desidrogenase, EC 1.3.1.2)

11/32 é uma enzima que catalisa a redução reversível das pirimidinas para 5,6-dehidropirimidinas. Conforme usado aqui, o termo inativador de DPD ou paráfrases deste devem significar qualquer molécula orgânica ou inorgânica que inibe a atividade enzimática do DPD, isto é, sua habilidade de catalisar a redução da pirimidina ou 5-FU. O termo inativador de DPD não engloba o 5-FU. Exemplos de inativadores incluem, por exemplo, derivados de pirimidina, derivados de piridina, e derivados de ácido barbitúrico. Em algumas realizações, o inativador de DPD é um inibidor de

DPD, preferencialmente um inibidor de DPD irreversível. Em algumas realizações, o inativador de DPD é um derivado de uracila, isto é, um composto de uracila substituído na posição 5 por uma parte escolhida de um átomo alógeno, um grupo alquenila C₂-₄, um grupo de haloalquenila C₂.₄, um grupo de alquinila C₂_₆, um grupo de haloalquinila C₂.₆, um grupo ciano, um grupo alquila Ci-₄ e um grupo haloalquila Ci_₄. Em realizações específicas, o inativador DPD é um derivado de uracila selecionado de um grupo consistindo eniluracil, 5propiniluracil, 5-cianouracil, 5-bromoetiniluracil, 5-(lclorovinil) uracila, 5-iodouracil, 5-bromoviniluracil, (E)-5(2-bromovinil) uracila, 5-hex-l-iniluracil, 5-viniluracil, 5trifluorouracil, 5-bromouracil e 5-(2-bromo-l-clorovinil) uracila. Em algumas realizações, o inativador de DPD usado é escolhido a partir de derivados de ácido barbitúrico, derivados de 2,4-dehidroxipitridina e derivados do 2,6dehidroxpiridina. Em algumas realizações, o inativador de DPD é um derivado de piridina. Em realizações específicas, o inativador de DPD usado é o gimeracil (5-cloro-2,4dehidroxipiridina) ou 3-ciano-2,6-dehidroxiporidina.

Enquanto a frase um inativador de DPD é usada aqui, significa realmente um ou mais inativadores de DPD como ficará claro para um técnico no assunto informado na

12/32 matéria revelada. Especificamente, um único inativador de DPD ou uma combinação de dois ou mais inativadores de DPD podem ser misturados com uma única amostra do paciente. Geralmente, o um ou mais inativadores de DPD podem ser usados em uma quantidade total para alcançar uma concentração final na mistura suficiente para inibir substancialmente a atividade do DPD na amostra do paciente (por exemplo, urina, sangue total, soro ou plasma) e para prevenir qualquer degradação do 5-FU significativa ou expressiva na amostra, sob condições normais de manuseio da amostra e armazenamento e por um tempo suficiente para permitir que os testes de 5-FU sejam finalizados. Por exemplo, a concentração final total de qualquer inativador(es) de DPD na amostra do paciente pode variar de cerca de 1 ng/ml para cerca de 60 ug/ml ou mais. Por outro exemplo, um ou mais inativadores de DPD são adicionados e depois misturados em uma amostra do paciente em uma quantidade suficiente para inibir a atividade do DPD em uma amostra do paciente de forma que não haja mais de 10% de degradação do 5-FU na amostra do paciente dentro de cerca de 0,5 hora após a amostra ser obtida do paciente e colocada em temperatura ambiente (cerca de 25°C), preferencialmente não mais que 10% de degradação do 5-FU na amostra do paciente dentro de cerca de 10 horas após a amostra ser obtida e colocada sob temperatura ambiente. Como ficará aparente para um técnico no assunto, a quantidade de inativador de DPD usada pode variar dependendo da atividade de inibição de um inativador de DPD particular e a quantidade de DPD em uma amostra particular. Técnicos no assunto podem prontamente determinar uma quantidade ideal de qualquer inativador particular através de uma rotina de experimentação, conforme mostrado nos exemplos abaixo.

As amostras processadas pelo método da presente invenção são particularmente adequadas para uso em testes

13/32 para o nível de 5-FU, como degradação de 5-FU nas amostras após elas serem retiradas, mas antes do teste ser minimizado. Desta forma, a presente invenção fornece adicionalmente um método para dosar o 5-FU em uma amostra do paciente de um paciente tratado com 5-FU ou um pró-fármaco deste. O método geralmente inclui pelo menos as etapas de fornecer uma amostra de paciente processada obtida de um paciente tratado com 5-FU ou um pró-fármaco deste, conforme descrito acima, em que a amostra é misturada in vitro com um inativador da enzima de dehidropiramidina desidrogenase (DPD), e medindo a quantidade de 5-FU na amostra. Em algumas realizações, a quantidade de 5-FU na amostra é medida na presença do inativador de DPD.

Em uma realização, o método de teste de 5-FU compreende obter uma amostra de sangue contendo 5fluorouracil de um paciente tratado com 5-FU, misturando a amostra de sangue com um inativador de DPD para formar uma mistura, e medir a amostra de 5-FU na mistura.

Em outra realização, o método de dosar o 5-FU compreende a obtenção de uma amostra de sangue contendo 5-FU de um paciente tratado com 5-FU, misturando a amostra de sangue com um inativador de DPD para formar uma mistura, isolando o plasma contendo 5-FU e o inativador de uma mistura, e medir a quantidade de 5-FU no plasma. Em realizações preferidas, a etapa de isolar o plasma da amostra de sangue misturada com inativador de DPD é desempenhada dentro de 4 ou 5 horas, mais preferencialmente dentro de 1 hora, a partir do momento que o sangue é retirado.

Em outra realização, o método de dosar o 5-FU compreende obter uma amostra de sangue contendo 5-FU de um paciente tratado com 5-FU, isolando o plasma da amostra de sangue, misturando o plasma separado com o inativador de DPD para formar uma mistura e medindo a quantidade de 5-FU na

14/32 mistura.

Quaisquer técnicas de teste de 5-FU conhecidas na técnica podem ser usadas na medição dos níveis de 5-FU nas amostras obtidas pelo método da presente invenção. Por exemplo, métodos para quantitativamente dosar o 5-FU através de HPLC são geralmente conhecidos na técnica. Cromatografia líquida de gás (GLC) e GC-MS são comumente usadas para medir a concentração de 5-FU. Cromatografia líquida de espectroscopia de massa em tandem (LC-MSMS) é crescentemente popular para a quantificação de 5-FU. Alternativamente, o N²de patente U.S 7.205.116 que é incorporado aqui como referência, revela testes imunológicos de 5-FU para a quantificação de 5-FU nas amostras de plasma usando anticorpos especificamente imunorreativos com 5-FU.

Desta forma, em uma realização, o método de dosar o 5-FU da presente invenção inclui medir o 5-FU em uma amostra de paciente contendo 5-FU obtida de um paciente tratado com 5-FU ou um pró-fármaco deste usando um teste imunológico, em que a amostra do paciente é misturada in vitro com um inativador de DPD após ser obtida de um paciente. Isto é, a etapa de medição compreende contatar a amostra do paciente contendo 5-FU com um anticorpo imunorreativo com o 5-FU e determinar a ligação do 5-FU ao anticorpo. O anticorpo de 5FU é conhecido na técnica e é revelado, por exemplo, no N² de patente U.S 7,205,116. A amostra do paciente pode ser sangue, soro, plasma, urina, etc., e preferencialmente uma amostra de plasma preparada pelos métodos de processamento da amostra descritos acima. Preferencialmente, a etapa de determinar a ligação do 5-FU ao anticorpo de 5-FU é desempenhada na presença de um inativador de DPD conforme descrito acima, por exemplo, 5-iodouracil, 5-viniluracil, eniluracil ou gimeracil.

Nos seguintes exemplos ilustrativos, o 5-FU foi

15/32 medido usando um teste de aglutinação com base no anticorpo no Analisador Olympus AU680 usando um anticorpo revelado no N² de patente U.S 7.205.116. Especificamente, dois reagentes separados são fornecidos: um primeiro reagente compreende uma pluralidade de moléculas 5-FU conjugadas a um polímero ou substrato, e um segundo reagente compreende uma pluralidade de anticorpos 5-FU para um suporte sólido (por exemplo, uma nano partícula ou esfera). Ao misturar dois reagentes na ausência de 5-FU livre, eles formarão grandes agregações de nano partículas e dispersores de luz para resultar em um valor de absorção mais alto. Na presença de 5-FU livre, por exemplo, quando misturado com uma amostra de paciente contendo 5-FU, a reação de aglutinação se torna de alguma forma inibida e a dispersão de luz é para uma extensão menor, causando um valor de absorção mais baixo. Desta forma, a concentração de 5-FU em uma amostra é medida com base na absorção de uma amostra, que é determinada por uma quantidade de agregação através do primeiro e segundo reagentes. 0 instrumento é calibrado com uma pluralidade de amostras de referência com diferentes concentrações conhecidas de 5-FU, e uma curva padrão é gerada (Absorção vs. concentração de 5FU) . Os valores de absorção de amostras individuais são comparados com esta curva para determinar a concentração.

Desta forma, em uma realização específica, a etapa de medir o 5-FU no método de teste da presente invenção compreende contatar um primeiro reagente tendo uma pluralidade de moléculas de 5-FU conjugadas a um polímero ou substrato, e um segundo reagente tendo uma pluralidade de anticorpos de 5-FU anexados a um suporte sólido, na presença de uma amostra de paciente contendo 5-FU, e determinar a agregação do primeiro e segundo reagentes. A amostra do paciente pode ser sangue, soro, plasma, urina, etc., e preferencialmente uma amostra de plasma preparada através dos

16/32 métodos de processamento da amostra descritos acima. Preferencialmente, a etapa de determinar a ligação de 5-FU a um anticorpo 5-viniluracil é desempenhada na presença de um inativador DPD conforme descrito acima, por exemplo, 5iodouracil, 5-viniluracil, eniluracil ou gimeracil.

Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também fornece uma composição compreendendo (1) um anticorpo seletivamente imunorreativo com 5-FU e (2) um inativador de DPD. Em uma realização, a composição compreende uma amostra do paciente (sangue, soro, plasma, urina, etc.) contendo 5-FU e obtida de um paciente tratado com 5-FU ou um pró-fármaco deste, em mistura com (1) um anticorpo seletivamente imunorreativo com 5-FU e (2) um inativador de DPD. Preferencialmente o anticorpo não é substancialmente reativo com o inativador de DPD, e em uma quantidade na composição suficiente para ligar substancialmente todas as moléculas de 5-FU na composição. Preferencialmente, o anticorpo na composição tem menos de 25%, preferencialmente menos de 15%, de reatividade cruzada com o inativador DPD. Exemplos de anticorpo incluindo aqueles revelados no N² de patente U.S 7.205.116. Inativadores de DPD adequados são como descritos acima, incluindo, entre outros, por exemplo, gimeracil, 5iodouracil, 5-viniluracil e eniluracil. A quantidade de tais inativadores de DPD a serem incluídas na composição é também descrita acima. Preferencialmente, um inativador de DPD é incluído na composição em uma quantidade de pelo menos 600 ng/ml ou pelo menos 850 ng/ml.

Em uma realização, a composição compreende (1) uma pluralidade de anticorpos ligados a um suporte sólido e seletivamente imunorreativo com o 5-FU; (2) uma pluralidade de moléculas de 5-FU conjugadas a um polímero ou substrato; e (3) um inativador de DPD. Preferencialmente, os anticorpos na composição têm menos de 25%, preferencialmente menos de 15%,

17/32 de reatividade cruzada com o inativador de DPD. Opcionalmente, a composição inclui adicionalmente uma amostra de paciente (sangue, soro, plasma, urina, etc.) contendo 5-FU e obtida de um paciente tratado com 5-FU ou um pró-fármaco 5 deste.

A presente invenção também fornece uma composição compreendendo uma amostra isolada de um paciente tratado com 5-FU ou um pró-fármaco deste, em mistura com um inativador de DPD. Preferencialmente o inativador de DPD é gimeracil.

Também preferencialmente a amostra é sangue ou plasma ou soro, e o inativador está em uma concentração de pelo menos 600, 850, 1000, 1200, 2000 ou 4000 ng/ml na composição.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit tendo em um recipiente: uma amostra (sangue, plasma ou 15 soro) isolada de um paciente tratado com 5-FU ou um prófármaco deste, em mistura com um inativador de DPD em uma concentração de pelo menos 600 ng/ml, 850 ng/ml, 1000 ng/ml, 1200 ng/ml, 2000 ng/ml ou 4000 ng/ml. Opcionalmente, o kit inclui adicionalmente meios para resfriar a amostra em uma 20 temperatura abaixo de 10°C. Para resfriar a amostra em um recipiente tal como uma caixa Styrofoam ou um envelope de Fedex, embalagens de resfriamento tal como PolarPack® (Tegrant) e ThermoSafe® podem ser usadas. Gelo comum, ou gelo seco também podem ser usados.

Um kit de teste também é fornecido, compreendendo em um recipiente compartimentado, (1) uma pluralidade de anticorpos ligados a um suporte sólido e seletivamente imunorreativos com 5-FU; (2) uma pluralidade de moléculas de 5-FU conjugadas a um polímero ou substrato; e (3) um 30 inativador de DPD. Preferencialmente, os anticorpos na composição têm menos de 25%, preferencialmente menos de 15%, de reatividade cruzada com o inativador de DPD. O kit opcionalmente contém também em um compartimento separado 5-FU

18/32 para uso como material de referência. O kit tornaria possível um uso conveniente do método de determinação do nível de 5-FU em qualquer dada amostra do paciente.

Nos diversos aspectos da presente invenção, preferencialmente a amostra do paciente na mistura com um inativador de DPD não é congelada dentro de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, ou dentro de 5 a 48 horas após a separação do paciente.

O método de teste do 5-FU é particularmente útil na otimização do tratamento com 5-FU ou um pró-fármaco de 5-FU em que o nível de 5-FU no sangue é determinado após uma dose da droga e usado como uma referência para ajustar/determinar a dose seguinte da droga. Desta forma, em adicionalmente outro aspecto da presente invenção, um método de tratar um paciente com 5-FU ou com um pró-fármaco 5-FU também é fornecido. Geralmente, o método compreende as etapas de (1) administrar para um paciente em necessidade do tratamento uma primeira dose de 5-FU ou um pró-fármaco 5-FU; (2) determinar a quantidade de 5-FU em uma amostra obtida de um paciente, em que a amostra é misturada in vitro com um inativador de dehidropiramidina desidrogenase; e (3) administrar para o paciente uma segunda dose de 5-FU ou um pró-fármaco deste. A quantidade de 5-FU ou pró-fármaco administrada na segunda dose pode ser determinada com base no nível de 5-FU medido na amostra do paciente em referência a uma ASC de 5-FU predeterminada ideal ou alvo. A segunda dose pode então ser administrada em uma quantidade para fornecer uma concentração de 5-FU no sangue dentro da concentração alvo. Neste método de tratamento, a etapa de determinar a quantidade de 5-FU em uma amostra obtida de um paciente pode compreender dosar o 5FU em uma amostra de paciente de acordo com o método de teste da presente invenção conforme descrito acima, que incorpora o método de processamento da amostra da presente invenção

19/32 também descrito acima. No entanto, um médico pode também pedir um teste a partir de um laboratório de diagnóstico e determinar um nível de 5-FU a partir do relatório do teste enviado do laboratório.

Por exemplo, em terapias envolvendo 5-FU, a concentração de sangue alvo quantitativa de 5-FU, como expressa pela Área Sob a Curva (ASC) proposta para ser de 20 a 24 mg-h/L. Em uma realização, o método de tratamento da presente invenção é usado para otimizar a dosagem de 5-FU, e compreende as etapas de: (1) administrar para um paciente uma primeira dose de 5-FU, que pode ser em uma quantidade determinada, por exemplo, pela ASC (área de superfície do corpo) , (2) determinar a quantidade de 5-FU em uma amostra obtida de um paciente, em que a amostra é misturada in vitro com um inativador de DPD, e (3) com base na quantidade de 5FU medida na etapa (2) , administrar para o paciente uma segunda dose de 5-FU em uma quantidade calculada ou esperada para fornecer uma ASC de 5-FU de sangue/plasma dentro de uma faixa de 20 a 25 mg-h/L. Isto é, se o nível de 5-FU medido na amostra do paciente indicar uma ASC de 5-FU abaixo de 20 mgh/L, então é recomendado que o médico aumente a quantidade de 5-FU administrada na segunda dose sobre a quantidade na primeira dose. Se o nível de 5-FU medido na amostra do paciente indicar um ASC de 5-FU de sangue/plasma acima de 25 mg-h/L, então é recomendado que o médico reduza a quantidade de 5-FU administrada na segunda dose em comparação com a quantidade na primeira dose. Para dosar o 5-FU, o método de teste e diversas realizações deste foram descritos acima e estão incorporados aqui sem repetição. Em uma realização preferida, a etapa de determinação do método de tratamento compreende obter uma amostra de sangue contendo 5-FU de um paciente tratado com 5-FU, misturar a amostra de sangue in vitro com o inativador de DPD para formar uma mistura, isolar

20/32 o plasma contendo 5-FU e o inativador da mistura, e medir a quantidade de 5-FU no plasma.

Estabelecida alternativamente, a presente invenção fornece o uso de um inativador de DPD para fabricar um kit de teste para medir 5-FU em uma amostra do paciente para guiar o tratamento do paciente com 5-FU ou um pró-fármaco deste, em que o tratamento compreende as etapas de (1) administração para um paciente em necessidade de tratamento uma primeira dose de 5-FU ou um pró-fármaco de 5-FU; (2) determinar a quantidade de 5-FU em uma amostra obtida do paciente, em que a amostra é misturada in vitro com um inativador de DPD; e (3) administrar para o paciente uma segunda dose de 5-FU ou um pró-fármaco deste, em uma quantidade determinada com base na quantidade de 5-FU determinada na etapa (2) , e calcular ou esperar resultar em uma ASC de 5-FU de sangue/plasma dentro de uma faixa de referência predeterminada, por exemplo, na faixa de 20 a 25 mgh/L. Os componentes do kit de teste são descritos acima ou abaixo.

II. Dispositivos e Kits

A presente invenção também fornece dispositivos de transferência para transferir um inativador DPD para, e misturar um inativador DPD com, uma amostra de sangue do paciente. Observa-se que a presente invenção engloba os conjuntos de seringa de transferência descritos abaixo com ou sem um inativador de DPD nele. Em referência a Figura 6, os conjuntos de seringa de transferência 600 e 600' são particularmente úteis em armazenar e transportar uma solução inativadora de DPD para uma clínica ou laboratório de teste, e transferir a solução inativadora de DPD armazenada para um paciente. 0 conjunto de seringa de transferência 600 (600 e 600') inclui um cilindro definindo uma câmara da seringa de transferência, que pode ser pré-preenchida com uma solução inativadora de DPD 620 (por exemplo, uma solução de gimeracil

21/32 ou eniuracil em um DMSO ou solvente metanol). O cilindro 610 tem uma ponta 630 se estendendo a partir de uma extremidade distal. A ponta 630 pode ser operacionalmente conectada a uma agulha no momento do uso. Adicionalmente, o conjunto de seringa de transferência inclui adicionalmente um protetor de ponta 64 0 em anexo a ponta ou se estendendo da extremidade distal do cilindro 610. O protetor de ponta 640 se estende longitudinalmente sobre a ponta 630. Adicionalmente, o conjunto de seringa de transferência 600 inclui uma cápsula de ponta 650 que pode ser operacionalmente conectada a ponta 630 ou ao protetor de ponta 640. Em realizações preferidas, o protetor de ponta 640 e a cápsula de ponta 650 possuem encaixes e são travados juntos. Por exemplo, o protetor de ponta 640 pode ter um encaixe voltado para dentro e a cápsula de ponta ter um encaixe voltado para fora, ou vice-versa, de forma que a cápsula de ponta 650 seja firmemente encaixada e travada com o protetor de ponta 640 de forma a selar a ponta 630 da câmara do cilindro. Um êmbolo 660 é inserido deslizavelmente dentro da câmara do cilindro 610.

O conjunto de seringa de transferência 600' é o mesmo que o conjunto de seringa de transferência 600 exceto a agulha 670 é ligada a uma ponta de seringa 630. A agulha é preferencialmente protegida com uma cápsula de agulha. A agulha pode ser usada para perfurar outro recipiente (frasco ou tubo) contendo a amostra do paciente para inserir a solução inativadora de DPD no recipiente de amostra do paciente deslizando ou empurrando o êmbolo 660.

A Figura 7 ilustra outro conjunto de seringa de transferência 700, que é o mesmo que o conjunto de seringa de transferência 600 e 600 exceto pela cápsula de ponta 650 do conjunto de seringa de transferência 600 é substituída por uma cobertura de agulha 710, ou que uma cobertura de agulha 710' é montada no conjunto de seringa de transferência 600.

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Em referência a cobertura de agulha 710, esta inclui um corpo 730 geralmente tubular coaxialmente disposto em torno da agulha 740, e tendo uma parede tubular se estendo ao longo da agulha 740 e além da ponta afiada da agulha. A cobertura da agulha 710 é a mesma que a cobertura de agulha 710 exceto pela ausência da agulha 740. As coberturas da agulha podem ser conectadas e montadas operacionalmente no conjunto de seringa de transferência 600 ou 600 formando o conjunto de seringa de transferência 700. Por exemplo, em uma realização, o protetor de ponta 640 do conjunto de seringa de transferência 600 pode ter um encaixe para dentro para travar o adaptador luer 720 da agulha 740. Em outra realização, o protetor de ponta 640 do conjunto de seringa de transferência 600' pode ter um encaixe interno para travar o adaptador luer 720 de forma que a cobertura de agulha 710' seja montada no conjunto de seringa de transferência 600 protegendo a agulha 670. Alternativamente, 720 ou 720 pode ser um conector coaxialmente montado em volta da agulha 740.

O conjunto de seringa de transferência 700 pode ser usado para transferir convenientemente e seguramente a solução inativadora de DPD em um tubo de amostra de paciente conforme mostrado na Figura 8. 0 conjunto de seringa de transferência 800 na figura 8 inclui o conjunto de seringa de transferência 700 e o tubo 810 contendo a amostra do paciente (por exemplo, sangue) em que o tubo 810 é inserido na cobertura da agulha 710 ou 71Õ e a agulha 740 ou 670 foi inserida no tubo 810 de amostra através de uma cápsula perfurável 812 do tubo. Desta maneira, o êmbolo 660 pode ser empurrado desta forma levando a solução inativadora de DPD ao tubo de amostra, se a solução inativadora de DPD estiver contida no conjunto de seringa de transferência 700.

Em adicionalmente outro aspecto, a presente invenção fornece um kit incluindo, um ou mais conjuntos de

23/32 seringa de transferência descritos acima. O kit pode ou não incluir um inativador de DPD em qualquer forma (por exemplo, em solução). Se incluso, o inativador de DPD pode ser armazenado em um conjunto de seringa de transferência, ou em um compartimento separado, e pode estar em uma quantidade suficiente para inibir a atividade enzimática do DPD em uma amostra de sangue do paciente e para prevenir a degradação do 5-FU na amostra. O kit pode incluir adicionalmente um ou mais dos seguintes itens: pipetas descartáveis, tubos de retirada de sangue, criotubos para receber e armazenar amostras de plasma, tubos de transporte com materiais absorventes para transportar uma amostra do paciente, etc. 0 kit pode incluir adicionalmente folhas de instruções explicando aos profissionais de cuidados da saúde como obter e processar as amostras do paciente para o propósito de dosar o 5-FU nas amostras, que são todas descritas em detalhes acima. Adicionalmente, o kit pode incluir um anticorpo seletivamente imunorreativo com 5-FU. Este kit contém opcionalmente também em um compartimento separado 5-FU para uso como um material de referência.

Em uma realização, o kit compreende em um recipiente, (1) um conjunto de seringa de transferência conforme ilustrado na Figura 6 ou na Figura 7, (2) um inativador de DPD, e (3) um anticorpo seletivamente imunorreativo com 5-FU. Em outra realização, o kit compreende em um recipiente, (1) um conjunto de seringa de transferência ilustrado na Figura 6 ou na Figura 7, (2) um inativador de DPD, (3) uma pluralidade de anticorpos ligados a um suporte sólido e seletivamente imunorreativo com 5-FU; (4) uma pluralidade de moléculas 5-FU conjugadas a um polímero ou substrato. Preferencialmente, os anticorpos no kit têm menos de 25%, preferencialmente menos de 15%, de reatividade cruzada com o inativador de DPD. O kit contém opcionalmente

24/32 também em um compartimento separado 5-FU para uso como um material de referência. Preferencialmente também, o inativador de DPD está em uma solução contida em um cilindro do conjunto de seringa de transferência.

Nos seguintes exemplos ilustrativos, o 5-FU foi medido usando um teste de aglutinação com base no anticorpo no Analisador Olympus AU680 usando um anticorpo revelado no documento de patente U.S 7,205,116. Especificamente, a concentração de 5-FU em uma amostra é determinada com base na absorção de uma amostra, que é determinada pela quantidade de agregação através das nano partículas. O sistema necessita de dois reagentes, que quando misturados na ausência de 5-FU livre formarão grandes agregações de nano partículas e dispersores de luz para resultar em um valor de absorção mais alto. Na presença de 5-FU livre, a reação de aglutinação se torna de alguma forma inibida e a dispersão de luz é menor, causando um valor de absorção menor. O instrumento é calibrado duas vezes ao mês, e uma curva é gerada (Absorção vs. concentração de 5-FU). Os valores de absorção de amostras individuais são comparados a esta curva para determinar a concentração.

Geralmente no teste de aglutinação, 95 μΐ de um comprimido contendo 5-FU de amino-dextrana marcada é pipetado a uma cuveta, seguido por 7 pl de uma amostra de plasma filtrado. A amostra e o reagente são misturados e então incubados por cerca de 3,5 minutos. 95 μΐ de nano partículas de anticorpos de 5-FU conjugados são pipetados na cuveta e misturados. A reação completa incubada por cerca de 6,2 minutos. Uma série de 27 medições em 600 nm é tomada em intervalos regulares pelo analisador AU680 em todo este processo, e a concentração de 5-FU é calculada usando medidas a partir de dois pontos de tempo específicos.

III. Exemplos

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1. Uso de Eniluracil como Estabilizador

Seis tubos de sangue (dispersados em tubos K₂EDTA, 6 mL) foram retirados de cada um dos seis doadores, e os tubos de sangue foram suavemente invertidos diversas vezes para misturar o anticoagulante. 0 sangue foi concentrado e mantido em separado por doador. Uma alíquota de cada amostra de sangue foi transferida para um novo tubo cônico, e um volume calculado de 5-FU estocado (em 200 ng/pL) foi fornecido em cada amostra de sangue para uma concentração final de 500 ng/mL de 5-FU. Cada amostra de sangue foi colocado em alíquotas para um conjunto de seis tubos (5 ml de sangue por tubo) contendo eniluracil sob as seguintes condições:

	Alta concentração	(4000	ng/mL	final	do	sangue),
solvente	DMSO ;
	Baixa concentração	(1000	ng/mL	final	no	sangue),
solvente	DMSO.
	Adicionalmente, o	sangue	foi adicionado	a tubos
contendo	somente DMSO (nenhum eniluracil)	para	servir como

controles negativos. Todos os tubos de sangue foram misturados através de inversão. Os tubos de sangue foram incubados em temperatura ambiente por 45 minutos ou 24 horas, e no tempo apropriado, os tubos foram centrifugados em 2000 xg por 10 minutos em temperatura ambiente para separar o plasma. 0 plasma foi aspirado imediatamente seguido de centrifugação e dispensa nos criotubos limpos. As amostras foram operadas sob condições padrão para o analisador Olympus AU680 (200 pL, girados por 15 minutos em 12.500 rpm). Medições foram tiradas imediatamente após a coleta do plasma e 24 horas após a leitura inicial. O plasma foi armazenado em temperatura ambiente. A Figura 2 mostra que o eniluracil foi efetivo em prevenir a degradação do 5-FU nas amostras de sangue.

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2. Uso de 5-Viniluracil, 5-Iodouracil, e Gimeracil como Estabilizadores

Três tubos de sangue (dispersos em tubos K₂EDTA, 10 ml) foram retirados de cada um dos seis doadores, e tubos de sangue foram cuidadosamente invertidos diversas vezes para misturar anticoagulante. O sangue foi concentrado e mantido separado por doador. Uma alíquota de cada amostra de sangue foi transferida para um novo tubo cônico, e um volume calculado de 5-FU estocado (em 200 ng/pL) foi fornecido em cada amostra de sangue para uma concentração final de 500 ng/mL de 5-FU. Cada amostra de sangue foi colocada em alíquotas para um grupo de quatro tubos (5 mL de sangue por tubo) . Cada grupo de tubos era diferente, mas incluía uma combinação das condições abaixo:

	Baixa	concentração	de	5-iodouracil	(10	ug/mL	final
no	sangue)	/
		Alta	concentração	de	5-iodouracil	(40	ug/mL	final
no	sangue)	7
		Baixa	concentração	de	5-viniluracil	(5	ug/mL	final
no	sangue)	7
		Alta	concentração	de	5-viniluracil	(20	ug/mL	final
no	sangue)	1 ·

Baixa concentração de gimeracil (300 ng/mL final no sangue);

Alta concentração de gimeracil (1200 ng/mL final no sangue).

Os tubos foram misturados por inversão. Os tubos de sangue incubados em temperatura ambiente por 45 minutos. Nos momentos apropriados, os tubos de sangue foram centrifugados em 2000 xg por 10 minutos em temperatura ambiente para separar o plasma. 0 plasma foi aspirado imediatamente seguido de centrifugação, e dispensa em novos tubos cônicos. Amostras de plasmas foram operadas sob condições padrão pelo

27/32 analisador Olympus AU680 (200 pL, girados por 15 minutos em 12500 rpm). O plasma foi armazenado em temperatura ambiente. A Figura 3 mostra que o 5-viniluracil, 5-iodouracil, e gimeracil foram todos efetivos em estabilizar 5-FU nas amostras de sangue.

3. A Quantidade de Inativador de DPD Necessária

Quatro tubos de sangue (dispersados em tubos K₂EDTA, 10 ml) foram retirados de cada um dos seis doadores, e cuidadosamente invertidos diversas vezes para misturar o anticoagulante. Todo o sangue do doador foi retirado em um grande tubo, e duas alíquotas iguais do sangue retirado foram transferidas para dois novos tubos. O sangue restante foi utilizado para isolar célula branca do sangue CBS/camada leuco-plaquetária. A CBS/camada leuco-plaquetária foi isolada através da centrifugação dos tubos de sangue restantes e retirando a camada de CBS de cada tubo, centrifugando novamente para enriquecer a CBS/camada leuco-plaquetária, e separar a camada de CBS/camada leuco-plaquetária enriquecida em dois tubos limpos. Um volume de sangue foi fornecido com um volume calculado de 5-FU estocado (em 200 ng/pL) para uma concentração final de 500 ng/mL, e o outro volume de sangue foi fornecido com um volume calculado de 5-FU estocado (em 200 ng/pL) para uma concentração final de 1500 ng/mL. Três conjuntos de oito tipos cada foram preparados para aliquotar o sangue fornecido neles. Adicionalmente, um controle negativo usado que foi inoculado com 300 pL de 30% de metanol/água ao invés de gimeracil. Para quatro dos oito tubos por conjunto, a baixa concentração de sangue com 5-FU foi colocado em alíquotas, 6 ml cada tubo. A alta concentração de 5-FU no sangue foi colocado em alíquotas para os quatro tubos restantes por conjunto, bem como para o tubo de controle negativo, 6 ml cada. Os oito tubos foram inoculados com 300 pL de 0,12 mg/mL de gimeracil em 30% de

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MeOH/água ou 300 pL de 0,04 mg/mL de gimeracil. Os tubos de sangue foram invertidos para misturar o gimeracil, e então colocados em temperatura ambiente por 45 minutos. Os tubos de sangue foram centrifugados em 2000xg por 10 minutos e 5 temperatura ambiente. O plasma foi aspirado imediatamente após a centrifugação e dispensa em criotubos limpos. A CBS/camada leuco-plaquetária foi adicionada em tubos designados de plasma, e centrifugada para misturar-se uniformemente. As amostras de plasma foram operadas sob 10 condições padrão para o analisador AU680 (200 pL, girar por 15 minutos em 12.500 rpm). As medidas foram feitas imediatamente após a adição da CBS/camada leuco-plaquetária (inicial), bem como 24 horas (24-hora), após a adição da CBS/camada leuco-plaquetária. Para a medição de 24 horas, o 15 plasma foi armazenado em temperatura ambiente pelas primeiras 24 horas do experimento para simular o ambiente noturno de transporte. A tabela 1 abaixo sumariza os resultados.

Tabela 1

Concentração alvo de 5-FU	Concentração de Gimeracil (ng/mL)	CBS	Medida média de 5-FU	Mudança de % (Inicial vs. 24 horas)
Inicial	24 horas
500 ng/mL	2000	C/CBS	465,8	478,6	2,7%
2000	Nenhu ma CBS	488,3	474,3	-2.9%
6000	C/CBS	4 73,7	478,6	1,0%
6000	Nenhu ma CBS	479,1	487,3	1,7%
1500 ng/mL	2000	C/CBS	1377,7	1418, 1	2,9%
2000	Nenhu ma CBS	1434,9	1427, 3	- 0,5%
6000	C/CBS	1402,9	1390, 1	- 0,9%
6000	Nenhu	1430,3	1458,	2,0%

29/32

	ma CBS		3
0	C/CBS	1267,4	856	-32,5%

Quatro tubos de sangue (dispersados em tubos

K₂EDTA, 10 mL) foram retirados de cada 5 doadores, e cuidadosamente invertidos diversas vezes para misturar o anticoagulante. O sangue foi retirado por doador em tubos cônicos. Uma alíquota de cada sangue do doador foi transferida para um tubo limpo. Um volume calculado de 5-FU estocado (em 200 ng/pL) foi adicionado a cada amostra de sangue para alcançar uma concentração final de 500 ng/mL de 5-FU, e os tubos foram invertidos para misturar. 0 sangue fornecido foi colocado em alíquotas em tubos limpos, nove tubos por doador e 3,5 ml de sangue por tubo. O Gimeracil foi adicionado aos tubos em uma concentração final de 200, 400 ou 600 ng/mL para cada tubo. Adicionalmente, nas amostras de controle, metanol foi adicionado ao sangue ao invés de gimeracil, a fim de servir como uma amostra negativa. Os tubos de sangue colocados em temperatura ambiente por 45 minutos após a adição de gimeracil ou metanol. Nos momentos apropriados, os tubos de sangue foram centrifugados em 2000 xg por 10 minutos em temperatura ambiente para separar o plasma. 0 plasma foi aspirado imediatamente após a centrifugação, e o plasma foi dispensado em tubos limpos. As amostras de plasma foram operadas usando condições padrão pelo analisador AU680 (200 pL, girar por 15 minutos em 12.500 rpm) . As medições da concentração de 5-FU foram tomadas após a coleta de plasma (inicial) e 24 horas (24h) após isso. Para a medição 24h, o plasma foi armazenado em temperatura ambiente durante as 24 horas. A Tabela 2 resume os resultados. Conforme mostrado na Tabela 2 e na Figura 4, baixas concentrações de gimeracil no sangue também são efetivas em inibir a degradação mediada por DPD do 5-FU. A diferença na porcentagem geral de concentração de 5-FU entre

30/32 as amostras contendo 200 ng/mL e 600 ng/mL de gimeracil é menos de 1%.

Tabela 2

Concentração de Gimeracil	Inicial	24h
200 ng/mL	518,7	523,4
400 ng/mL	523,0	521,6
600 ng/mL	519,5	523,3

4. Efeito da Incubação Estendida de Gimeracil no Sangue antes da Separação de Plasma

Seis tubos (dispersados em tubos K₂EDTA, 6 mL) foram retirados de cada seis doadores, e os tubos de sangue foram invertidos diversas vezes para misturar o anticoagulante no sangue. Os tubos de sangue foram retirados e mantidos separados por doador. Uma alíquota de cada amostra de sangue do doador foi transferida para um novo tubo, e um volume calculado de 5-FU estocado (em 200 ng/pL) foi adicionado para cada amostra de sangue para alcançar uma concentração final de 500 ng/mL de 5-FU. As amostras de sangue fornecidas foram colocado em alíquotas em tubos limpos, 4 ml de sangue para cada 8 tubos por doador. 0 Gimeracil no solvente de metanol foi adicionado aos tubos de sangue para alcançar uma concentração final de 1200 ng/mL. Para o controle negativo, o metanol somente é adicionado no tubo de sangue de controle. Os tubos de sangue colocados em temperatura ambiente por 45 minutos, 24 horas ou 48 horas antes da separação do plasma. Nos momentos apropriados, - os tubos de sangue foram centrifugados em 2000 xg por 10 minutos em temperatura ambiente para separação do plasma. O plasma foi aspirado imediatamente após a centrifugação e dispensado em criotubos limpos. Para os testes de 5-FU, as amostras de plasma foram operadas em condições padrão pelo analisador AU680, conforme descrito acima (200 pL, girar por 15 minutos em 12.500 rpm). As medidas de concentração de 5-FU foram tomadas após a coleta do plasma e por 2 dias seguintes a

31/32 leitura inicial. 0 plasma foi armazenado em temperatura ambiente durante o intervalo. Os resultados do experimento estão resumidos na Tabela 3 abaixo, e na Figura 5.

Tabela 3

Tempo de incubação no sangue	Concentração de 5-FU (ng/ml)
Após a separação do plasma	24h após a separação do plasma
45 minutos	533,3	538,1
24 horas	551,8	551,9
48 horas	581,3	578,4

Como pode ser visto na Figura 5, manter o gimeracil no sangue sem a separação do plasma por um tempo mais longo pode fazer com que a concentração de 5-FU aumente artificialmente. A amostra de sangue preferencialmente é centrifugada no mesmo dia que o inibidor de gimeracil é 10 adicionado.

5. Testando o 5-FU nas Amostras do Paciente

A coleta de amostra consiste na retirada de sangue venoso na clínica entre pelo menos 2 horas após a iniciação do tratamento com 5-FU e antes do fim da infusão da droga 15 para assegurar níveis de estado estável (a média ti/₂ para 5FU é de aproximadamente 13 minutos) . O Estabilizador da Amostra na Dose é injetado e misturado na amostra de sangue imediatamente seguindo a retirada de sangue, e a amostra de sangue pode então ficar em temperatura ambiente por até 4 20 horas. A amostra é então centrifugada. (1500-2000 g, por 10 minutos). Aproximadamente metade do plasma é transferida para um tubo de transporte de plasma, marcado com um código de barras, e transportado à noite em temperatura ambiente para Laboratórios Myriad Genetic, Inc. para análise.

Após o recebimento, o código de barras da amostra é escaneado e rastreado. As amostras são centrifugadas através de uma membrana de filtro com o resultado filtrado usado para análise. O teste onDose é um teste imunológico de aglutinação

32/32 da nano partícula de dois reagentes homogêneos competitivos. O primeiro reagente contém 5-FU conjugado com o segundo reagente consistindo de 5-FU direcionado, nano partículas conjugadas de anticorpo. A quantidade de 5-FU livre no plasma inibe a agregação dos dois reagentes do teste. A quantidade de absorção de luz em certos comprimentos de onda da aglutinação das nano partículas depende da quantidade da droga no plasma. Esta absorção é comparada a uma curva de calibração padronizada para quantificação. A faixa alvo quantitativa, como expressa pela Área Sob a Curva (ASC), com base em Gamelin E, et al, J Clin Oncol 26(13) :2099-105 (2008), é calculada a partir da concentração medida de 5-FU e da duração da infusão fornecida pelo clínico no formulário de solicitação do teste.

Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível dos técnicos no assunto ao qual esta invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados como referência para a mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especifica e individualmente indicado a ser incorporado como referência. A mera menção das publicações e pedidos de patente não necessariamente constituem uma admissão de que elas são técnica anterior a este pedido.

Apesar da invenção acima mencionada ter sido descrita em alguns detalhes através da ilustração e exemplos para propósitos de clareza do entendimento, é óbvio que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações pendentes.

Claims

1. MÉTODO DE DOSAR 5-FLUOROURACIL EM UMA AMOSTRA DE UM PACIENTE TRATADO COM 5-FU OU UM PRÓ-FÁRMACO DESTE, O dito método sendo caracterizado por compreender:

obter uma amostra do dito paciente, em que a dita amostra é misturada in vitro com um ou mais inativadores de dehidropiramidina desidrogenase; e determinar a quantidade de 5-fluorouracil na dita amostra.

2. METÓDO DE DOSAR 5 -FLUOROURACIL EM UMA AMOSTRA DE UM PACIENTE TRATADO COM 5-FLUOROURACIL OU UM PRÓ-FÁRMACO DESTE, o dito método é caracterizado por compreender:

medir o 5-fluorouracil em uma amostra obtida do dito paciente tratado com 5-fluorouracil ou um pró-fármaco deste, em que a dita amostra é misturada in vitro com um inativador de dehidropiramidina desidrogenase após ser obtida do dito paciente.

3 . MÉTODO DE TRATAR UM PACIENTE COM 5 FLUOROURACIL OU UM PRÓ-FÁRMACO DESTE, caracterizado por compreender:

administrar ao dito paciente uma primeira dose de

5-fluorouracil de um pró-fármaco deste;

determinar a quantidade de 5-fluorouracil em uma amostra obtida a partir do dito paciente tratado com 5fluorouracil ou o _dito pró-fármaco, em que a dita amostra é misturada in vitro com um inativador de dehidropiramidina desidrogenase; e administrar para o dito paciente uma segunda dose de 5-f luorouracil ou o dito pró-fármaco após a etapa de determinação.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado em que a dita etapa de determinação ou medição compreende contatar a dita amostra

2/6 com um imunorreativo de anticorpo com 5-fluorouracil.

5 . MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado em que a dita amostra não é congelada dentro de 10 horas após a separação do dito paciente. 6 . MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado em que a dita amostra é sangue, plasma, soro ou urina. 7 . MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado em que a dita amostra é sangue. 8 . MÉTODO, de acordo com qualquer uma das

reivindicações 1-7, caracterizado em que o dito inativador é um derivado de pirimidina ou piridina.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado em que o dito inativador é eniluracil ou gimeracil.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado em que o 5-fluorouracil é medido na presença do dito inativador.

11. MÉTODO DE PROCESSAMENTO DE UMA AMOSTRA DE SANGUE DE UM PACIENTE TRATADO COM UM REGIME COMPREENDENDO 5- FLUOROURACIL OU UM PRÓ-FÁRMACO DESTE, PARA UM TESTE DE 5-

FLUOROURACIL, o dito método é caracterizado por compreender: obter uma amostra de sangue contendo 5-fluorouracil do dito paciente;

isolar o plasma da dita amostra de sangue;

misturar o plasma separado com um inativador de dehidropiramidina desidrogenase para formar uma mistura; e enviar a dita mistura para um laboratório para o dito teste de 5-fluorouracil.

12. MÉTODO DE PROCESSAMENTO DE UMA AMOSTRA DE

SANGUE DE UM PACIENTE TRATADO COM UM REGIME COMPREENDENDO 53/6

FLUOROURACIL OU UM PRÓ-FÁRMACO DESTE, o dito método é caracterizado por:

obter uma amostra de sangue contendo 5-fluorouracil do dito paciente;

misturar a amostra de sangue com um inativador de dehidropiramidina desidrogenase para formar uma mistura; e isolar o plasma contendo 5-fluorouracil e o dito inativador da dita mistura enviando o dito plasma para um laboratório para dosar o 5-fluorouracil.

13. MÉTODO DE PROCESSAMENTO DE UMA AMOSTRA DE SANGUE DE UM PACIENTE TRATADO COM UM REGIME COMPREENDENDO 5 FLUOROURACIL OU UM PRÓ-FÁRMACO DESTE, o dito método caracterizado por compreender:

obter uma amostra de sangue contendo 5-fluorouracil do dito paciente;

misturar a amostra de sangue com o inativador de dehidropiramidina desidrogenase para formar uma mistura; e enviar a dita mistura para um laboratório para dosar o 5-fluorouracil.

14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-13, caracterizado em que a dita amostra não é congelada dentro de 10 horas após a separação do dito paciente.

15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-14, caracterizado em que o dito inativador é um derivado de pirimidina ou piridina.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado em que o dito inativador é eniluracil ou gimeracil.

17. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender:

uma amostra isolada de um paciente tratado com 5fluorouracil, misturado com um inativador de dehidropiramidina desidrogenase, em que o dito inativador é

4/6 misturado in vitro com a dita amostra.

18. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada em que o dito inativador é um derivado de pirimidina ou piridina.

19. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender um anticorpo seletivamente imunorreativo com 5-FU em mistura com um inativador de DPD.

20. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada por compreender adicionalmente uma amostra de paciente contendo 5-FU e obtida de um paciente tratado com 5FU ou um pró-fármaco deste.

21. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizada por compreender adicionalmente uma pluralidade de moléculas de 5-FU conjugadas a um polímero ou substrato, em que o dito anticorpo é ligado a um suporte sólido.

22. KIT, caracterizado por compreender em um recipiente:

uma amostra de paciente contendo 5-fluorouracil isolado de um paciente tratado com 5-fluorouracil ou um prófármaco deste, misturado com um inativador de dehidropiramidina desidrogenase, em que o dito inativador é misturado com a dita amostra do paciente in vitro; e meios para resfriar a dita amostra em uma temperatura abaixo de 10°C.

23. KIT, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado em que o dito inativador é um derivado de pirimidina ou piridina.

24. KIT, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado em que o dito inativador está em uma concentração de pelo menos 850 ng/ml, em que a dita amostra é sangue ou plasma ou soro.

25. KIT DE TESTE, caracterizado por compreender em

5/6 um recipiente compartimentado (1) um anticorpo seletivamente imunorreativo com 5-FU, e (2) um inativador DPD.

26. KIT, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por compreender adicionalmente uma pluralidade de moléculas de 5-FU conjugadas a um polímero ou substrato, em que o dito anticorpo é ligado a um suporte sólido.

27. KIT, de acordo com a reivindicação 2 5 ou 26, caracterizado por compreender em um compartimento separado, 5-fluorourac i1.

28. KIT, de acordo com a reivindicação 25, 26, ou

27, caracterizado em que o anticorpo de 5-FU e o inativador de DPD estão em compartimentos separados no kit.

29. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22-28, caracterizado por compreender adicionalmente o conjunto de seringa de transferência tal como definido em qualquer uma das reivindicações 30-34.

30. CONJUNTO DE SERINGA DE TRANSFERÊNCIA, caracterizado por compreender:

um cilindro definindo uma câmara de seringa de transferência e tendo uma ponta se estendendo de uma extremidade distal do dito cilindro;

um êmbolo deslizavelmente inserido dentro da câmara do dito cilindro;

um protetor de ponta ligado à ponta ou se estendendo da dita extremidade distal do dito cilindro longitudinalmente ao longo da dita ponta; e uma cápsula de ponta conectada a dita ponta ou protetor de ponta, travado com o dito protetor de ponta desta forma selando a dita ponta.

31. CONJUNTO DE SERINGA DE TRANSFERÊNCIA, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por compreender adicionalmente na dita câmara uma solução de um inativador de dehidropiramidina desidrogenase.

6/6

32. CONJUNTO DE SERINGA DE TRANSFERÊNCIA, caracterizado por compreender:

um cilindro definindo uma câmara da seringa de transferência e tendo uma ponta se estendo de uma extremidade distal do dito cilindro;

um êmbolo deslizavelmente inserido dentro da câmara do dito cilindro; e uma cobertura de agulha tendo uma agulha operacionalmente conectada à dita ponta, em que a dita cobertura de agulha tem um corpo geralmente tubular coaxialmente disposto em torno da agulha, e uma parede tubular se estendendo ao longo da agulha e além da ponta afiada da agulha.

33. CONJUNTO DE SERINGA DE TRANSFERÊNCIA, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por compreender adicionalmente um tubo de coleta de amostra de paciente e

tendo uma cápsula perfurável, em que o tubo de coleta de amostra é inserido em uma cobertura de agulha, em que a agulha é inserida no tubo de coleta de amostra através da

cápsula perfurável.

34. CONJUNTO DE SERINGA DE TRANSFERÊNCIA, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizado por compreender adicionalmente a dita câmara de uma solução de um inativador de dehidropiramidina desidrogenase.