JP2012500829A - Cbd1エピトープにおけるオーバーラップする中和決定基に対応する合成ペプチドによって広域中和抗体が誘導される - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、破傷風毒素、HIV−1 Gag p24、及びHIV−1 Env−gp120からなる群より選択されるペプチドのTヘルパーエピトープに融合されたHIV−1 gp41ペプチドのカベオリン1結合ドメインを有するキメラペプチドに関する。これらのキメラペプチド又はタンパク質を含む組成物、並びにこれらのキメラペプチド又はタンパク質を含む薬学的な免疫原性組成物及びワクチンも本発明の部分である。HIV−1活性を中和する方法及びHIV−1活性に対する中和抗体を誘導するためのキメラペプチドの使用並びにHIV−1感染を処置する方法も開示される。
Pasteur Instituteでの1983年のBarre-Sinousi、Chermann、及びMontagnierによるLAVの発見及び単離以降、AIDSの大きな副作用のない有効な処置及び予防についての研究は困難なものであった。
本発明は、このように、Tヘルパーエピトープペプチドに融合されたHIV−1 gp41ペプチドのカベオリン1結合ドメイン(CBD1)又はCBD1の変異体を含むキメラペプチドに関する。別の態様において、本発明は、破傷風毒素、HIV−1 Gag−p24、及びHIV−1 Env−gp 120からなる群より選択されるTヘルパーエピトープペプチドに融合された、HIV−1 gp41ペプチドのカベオリン1結合ドメイン又はCBD1の変異体を含むキメラペプチドに関する。
及びその混合物、並びに
及びその混合物、並びに前述のペプチドのいずれかの混合物の群より選択されるキメラペプチドを提供する。本発明は、また、以下:C−S−L−E−Q−I−W−N−N−M−T−W−M−Q−W−D−K(配列番号31)、C−S−L−E−Q−I−W−N−N−M(配列番号32)及びC−S−L−E−Q−I−A−N−N−M−T−A−M−Q−A−D−K(配列番号39)のペプチドに関する。
本明細書において使用する「キメラペプチド」又は「融合タンパク質」は互換的に使用され、このペプチド又はタンパク質は、自然では一緒に連結されない2つ又はそれ以上のペプチド配列を連結することにより作製されることを意味する。キメラペプチドは、わずか50のアミノ酸、又はわずか40のアミノ酸、又はわずか30のアミノ酸、又はわずか25のアミノ酸、又はわずか20のアミノ酸のサイズを有する。一般的に、キメラペプチドは、50〜50のアミノ酸残基又は5〜40のアミノ酸残基又は5〜30のアミノ酸残基又は5〜20のアミノ酸残基又は10〜50のアミノ酸残基又は10〜40のアミノ酸残基又は10〜30のアミノ酸残基又は10〜20のアミノ酸残基を有する。
− OVAp323−336(ISQAVHAAHAEINE)、オボアルブミン由来の強力なTヘルパーエピトープ、
− PADREペプチドaKXVAAWTLKAAaZC(X=L−シクロヘキシルアラニン、Z=アミノカプロン酸)、非天然の汎(pan)HLA DR結合エピトープ;又は
− Gag、gp120、gp41、及びポリメラーゼタンパク質を含むHIV−1タンパク質由来のエピトープ
である。
− 配列番号5〜25の、配列番号31〜38及び52〜59の、又は配列番号39のキメラペプチドのCBD1部位中に位置付けられる決定基;
− 配列番号1又は26〜30のペプチドの決定基;
− 配列番号1又は26〜30において定義されるペプチド中に位置付けられる決定基で、前記ペプチドがTヘルパーエピトープに融合されている;
− 配列番号1又は26〜30において定義されるペプチド中に位置付けられる決定基で、前記ペプチドが、破傷風毒素、HIV−1 Gag−p24、及びHIV−1 Env−gp 120からなる群より選択されるTヘルパーエピトープに融合されている;
− 配列番号1又は26〜30において定義されるペプチド中に位置付けられる決定基で、前記ペプチドが配列番号2〜4の少なくとも1つのペプチドに融合されている
に対し、それらを認識する。
− HIV−1不含ウイルスを中和し、新たな正常細胞の感染を予防すること;及び
− ADCC(抗体依存的な細胞媒介性の細胞毒性)及びCDC(補体依存的な細胞毒性)機構に関与するエフェクター細胞又は分子を動員し、細胞毒性及び感染細胞の破壊に導くこと
により得ることができる。
に含まれる又はそれから本質的になるもしくはなる。
− Tヘルパー破傷風毒素エピトープWNNMTWMQW(配列番号26);
− HIV−1 Gag p24ペプチドのTヘルパーエピトープWNNMTWMQW(配列番号26);又は
− TヘルパーHIV−1エピトープHIV−1 Env−gp120ペプチドWNNMTWMQW(配列番号26);
のキメラペプチド又はいくつかのキメラペプチド
及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなる。
− Tヘルパー破傷風毒素エピトープXnWNNM(配列番号27)、
式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数である;
− HIV−1 Gag p24ペプチドのTヘルパーエピトープXnWNNM(配列番号27)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数である;
− TヘルパーHIV−1エピトープHIV−1 Env−gp120ペプチドXnWNNM(配列番号27)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数である;又は− その混合物、又は、上に開示する、配列番号26のキメラペプチドとの混合物、
の変異体キメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなる組成物又は医薬組成物に関する。
− Tヘルパー破傷風毒素エピトープXnWNNMTW(配列番号28)、
式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜3の数である;
− HIV−1 Gag p24ペプチドのTヘルパーエピトープXnWNNMTW(配列番号28)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜3の数である;
− TヘルパーHIV−1エピトープHIV−1 Env−gp120ペプチドXnWNNMTW(配列番号28)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜3の数である;又は
− その混合物、又は、上に開示する、配列番号26及び/又は配列番号27のキメラペプチドとの混合物、
の変異体キメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなる医薬的組成物又は組成物に関する。
− Tヘルパー破傷風毒素エピトープXnWNNMTWMQWZp(配列番号29)、
式中、X及びZは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、pは0〜3、好ましくは1〜3の数である;
− HIV−1 Gag p24ペプチドのTヘルパーエピトープXnWNNMTWMQWZp(配列番号29)、式中、X及びZは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、pは0〜3、好ましくは1〜3の数である;
− TヘルパーHIV−1エピトープHIV−1 Env−gp120ペプチドXnWNNMTWMQWZp(配列番号29)、式中、X及びZは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、pは0〜3、好ましくは1〜3の数である;
− その混合物、又は、上に開示する、配列番号26〜28の少なくとも1つのキメラペプチドとの混合物、
及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を有する。
− Tヘルパー破傷風毒素エピトープXnWNNMTWMQWZ(配列番号30)、
式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、ZはD−Kである;
− HIV−1 Gag p24ペプチドのTヘルパーエピトープXnWNNMTWMQWZ(配列番号30)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、ZはD−Kである;
− TヘルパーHIV−1エピトープHIV−1 Env−gp120ペプチドXnWNNMTWMQWZ(配列番号30)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、ZはD−Kである;又は
− その混合物、又は、上に開示する、配列番号26〜29の少なくとも1つのキメラペプチドとの混合物、
及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を有する。
及びその混合物、並びに
及びその混合物、及び上記のペプチドのいずれかの混合物の群より選択されるキメラペプチド;及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤を含む又はそれから本質的になるもしくはなる組成物又は医薬組成物は、本発明の別の態様である。
− Tヘルパー破傷風毒素エピトープWNNMTWMQW(配列番号26);
− HIV−1 Gag p24ペプチドのTヘルパーエピトープWNNMTWMQW(配列番号26);又は
− TヘルパーHIV−1エピトープHIV−1 Env−gp120ペプチドWNNMTWMQW(配列番号26);
のキメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなる。
− Tヘルパー破傷風毒素エピトープXnWNNM(配列番号27)、
式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数である;
− HIV−1 Gag p24ペプチドのTヘルパーエピトープXnWNNM(配列番号27)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数である;
− TヘルパーHIV−1エピトープHIV−1 Env−gp120ペプチドXnWNNM(配列番号27)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数である;又は− その混合物、又は、上に開示する、配列番号26のキメラペプチドとの混合物、
の変異体キメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなる免疫原性組成物に関する。
− Tヘルパー破傷風毒素エピトープXnWNNMTW(配列番号28)、
式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜3の数である;
− HIV−1 Gag p24ペプチドのTヘルパーエピトープXnWNNMTW(配列番号28)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜3の数である;
− TヘルパーHIV−1エピトープHIV−1 Env−gp120ペプチドXnWNNMTW(配列番号28)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜3の数である;又は
− その混合物、又は、上に開示する、配列番号26及び/又は配列番号27のキメラペプチドとの混合物、
の変異体キメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなる免疫原性組成物に関する。
− Tヘルパー破傷風毒素エピトープXnWNNMTWMQWZp(配列番号29)、
式中、X及びZは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、pは1〜3の数である;
− HIV−1 Gag p24ペプチドのTヘルパーエピトープXnWNNMTWMQWZp(配列番号29)、式中、X及びZは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、pは1〜3の数である;
− TヘルパーHIV−1エピトープHIV−1 Env−gp120ペプチドXnWNNMTWMQWZp(配列番号29)、式中、X及びZは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、pは1〜3の数である;
− その混合物、又は、上に開示する、配列番号26〜28の少なくとも1つのキメラペプチドとの混合物、
及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を有する。
− Tヘルパー破傷風毒素エピトープXnWNNMTWMQWZ(配列番号30)、
式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、ZはD−Kである;
− HIV−1 Gag p24ペプチドのTヘルパーエピトープXnWNNMTWMQWZ(配列番号30)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、ZはD−Kである;
− TヘルパーHIV−1エピトープHIV−1 Env−gp120ペプチドXnWNNMTWMQWZ(配列番号30)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、ZはD−Kである;又は
− その混合物、又は、上に開示する、配列番号26〜29の少なくとも1つのキメラペプチドとの混合物、
及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を有する。
及びその混合物、並びに
及びその混合物、及び上記のペプチドのいずれかの混合物の群より選択されるキメラペプチド;及び生理学的に許容可能な希釈剤又は医薬的に許容可能な賦形剤を含む又はそれから本質的になるもしくはなる免疫原性組成物は、本発明の別の態様である。
− Tヘルパー破傷風毒素エピトープWNNMTWMQW(配列番号26);
− HIV−1 Gag p24ペプチドのTヘルパーエピトープWNNMTWMQW(配列番号26);又は
− TヘルパーHIV−1エピトープHIV−1 Env−gp120ペプチドWNNMTWMQW(配列番号26);
のキメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなる。
− Tヘルパー破傷風毒素エピトープXnWNNM(配列番号27)、
式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数である;
− HIV−1 Gag p24ペプチドのTヘルパーエピトープXnWNNM(配列番号27)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数である;
− TヘルパーHIV−1エピトープHIV−1 Env−gp120ペプチドXnWNNM(配列番号27)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数である;又は− その混合物、又は、上に開示する、配列番号26のキメラペプチドとの混合物、
の変異体キメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなるワクチンに関する。
− Tヘルパー破傷風毒素エピトープXnWNNMTW(配列番号28)、
式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜3の数である;
− HIV−1 Gag p24ペプチドのTヘルパーエピトープXnWNNMTW(配列番号28)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜3の数である;
− TヘルパーHIV−1エピトープHIV−1 Env−gp120ペプチドXnWNNMTW(配列番号28)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜3の数である;又は
− その混合物、又は、上に開示する、配列番号26及び/又は配列番号27のキメラペプチドとの混合物、
の変異体キメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなるワクチンに関する。
− Tヘルパー破傷風毒素エピトープXnWNNMTWMQWZp(配列番号29)、
式中、X及びZは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、pは1〜3の数である;
− HIV−1 Gag p24ペプチドのTヘルパーエピトープXnWNNMTWMQWZp(配列番号29)、式中、X及びZは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、pは1〜3の数である;
− TヘルパーHIV−1エピトープHIV−1 Env−gp120ペプチドXnWNNMTWMQWZp(配列番号29)、式中、X及びZは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、pは1〜3の数である;又は
− その混合物、又は、上に開示する、配列番号26〜28の少なくとも1つのキメラペプチドとの混合物、
を有する本発明の変異体キメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなるワクチン。
− Tヘルパー破傷風毒素エピトープXnWNNMTWMQWZ(配列番号30)、
式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、ZはD−Kである;
− HIV−1 Gag p24ペプチドのTヘルパーエピトープXnWNNMTWMQWZ(配列番号30)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、ZはD−Kである;
− TヘルパーHIV−1エピトープHIV−1 Env−gp120ペプチドXnWNNMTWMQWZ(配列番号30)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、ZはD−Kである;又は
− その混合物、又は、上に開示する、配列番号26〜29の少なくとも1つのキメラペプチドとの混合物、
を有する本発明の変異体キメラペプチド、及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤
を含む又はそれから本質的になるもしくはなるワクチン。
及びその混合物、並びに
及びその混合物、及び上記のペプチドのいずれかの混合物の群より選択されるキメラペプチド;及び生理学的に許容可能な希釈剤又は薬学的に許容可能な賦形剤を含む又はそれから本質的になるもしくはなるワクチン(カクテル又はカクテルワクチンとも呼ばれる)は、本発明の別の態様である。
材料及び方法
以下の材料及び方法を、実施例を通じて使用した。
キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、スクアレン、Tween 80、及びSpan 85(w/v)をSigmaから購入した。Imject(登録商標)マレイミド活性化KLH(mcKLH;Pierce Biotechnology)をCBD1ペプチドのための担体タンパク質として試験した。CBD1エピトープの領域でのHIV−1 MN gp41の配列からのオーバーラップペプチドをAIDS Research and Reference Program/NIAID、NIH(AIDS/NIH)から得た。ピキア・パストリス(Pichia pastoris)において産生されたHIV−1 gp41組み換えフラグメント586−682をViral Therapeutics, Inc.から購入した。
免疫グレードの純度(80〜90%純粋)の全てのペプチドが、NeoMPS(Strasbourg, France)により合成された。CBD1ペプチドはgp41のアミノ酸位置618〜633である:SLEQIWNNMTWMQWDK(配列番号1)(Hovanessian et al., 2004)。CBD1ペプチド(C17K)のN末端のシステイン残基を、Pierce Biotechnologyから購入されたImject(登録商標)活性化キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)にそれを結合するために加えた。Tヘルパーエピトープペプチドのアミノ酸配列は以下である:(1)破傷風毒素Tet830ペプチド、AQYIKANSKFIGITEL(配列番号2)、(2)HIV−1 gp120421−436ペプチド、KQIINMWQVVGKAMYA(配列番号3)及び(3)HIV−1 Gag298−312ペプチド、KRWIILGLNKIVRMY(配列番号4)。
カベオリン1結合モチーフベースのペプチドの配列は以下:
である。
完全及び不完全フロイントアジュバント(CFA及びIFA)、ムラミルジペプチド(MDPという)(N−アセチル−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン水和物)、MDP誘導体(MDP−Lys(L18)という)(Nα−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−Ne−ステアロイル−L−リシン)及び水酸化アルミニウム(ミョウバン)をSigmaから購入した。CpGオリゴデオキシヌクレオチド(マウス用のCpG ODN 1826;ウサギ及びモルモット用のCpG ODN 2007;マカク用のCpG ODN 10103)をColey Pharmaceutical Group(USA)から購入した。界面活性剤で安定化した水中油型乳剤MF59を実験室で調製した。それは、水中の5%スクアレン(w/v)、0.5% Tween 80(w/v)、0.5% Span 85(w/v)(O'Hagan and Rappuoli, 2004)からなる。Montanide ISA 51は、好意により、SEPPIC(フランス)により提供された。
2.1 動物の免疫化及びELISA
ウサギ(Fauves de Bourgogne、6週齢)及びモルモット(350〜400g)をAnimal Production Center(Olivet, France)から購入した。BALB/cマウス(6〜8週齢)をCharles River Laboratories(France)から購入した。動物を約2〜3週間の間隔で5回、CBD1又はCBD1由来ペプチドを用いて、CFA及びIFA(本明細書で提示する実験データのために)又は他のアジュバント(データ提示せず)を使用して免疫化した。そのような懸濁液を、150μl、300μl、及び500μlの全容積中で、等しい抗原/アジュバントの割合(1V/1V)で、それぞれマウス、モルモット、及びウサギにおいて投与した。
体重4〜6kgの成体雄カニクイザル(Macaca fascicularis)を、Mauritius繁殖コロニーから輸入し、非ヒト霊長類ケア(EEC指令N86−609、1986年11月24日)のための欧州ガイドラインに従って維持し、扱った。動物を、免疫化及び血液サンプル採取のためにケタミン・クロルハイドレート(ketamine chlorhydrate)(10〜15mg/kg)を用いて鎮静させた。第1組の免疫化において、動物を、皮内(i.d.)又は筋肉内(i.m.)経路を介して、アジュバント[MF59+MDP−Lys(L18)]を使用し、システイニルCBD1ペプチド(200μg)を用いて免疫化した。対照マカクを、アジュバント単独を用いて注射した。第2組の免疫化において、動物を、アジュバントとして[CpG+Montanide ISA51]で構成される混合物を使用し、Tet−KK−CBD1(400μg)を用いて又はCBD1+TetA830ペプチド(200μg+150μg)を用いて皮下に免疫化した。各々の免疫化のために、1容積のアジュバント混合物と1容積の免疫原からなる500μlを投与した。一般的に、動物を、免疫応答をモニターするために、各々の免疫化後15日目に放血した。
CD4+Tリンパ球を、10%熱不活化ウシ胎児血清及び50IU/mlのペニシリン−ストレプトマイシンを含むRPMI−1640中で増殖させた。CD4+リンパ球を、Dynabeads M-450 CD8(Dynal(登録商標)Invitrogen)を使用してCD8+細胞の除去後、PBMCから調製した。PHAを用いた3日間の刺激後、細胞を、IL−2を含む新鮮培養液中に懸濁させ、72時間後に初代HIV−1単離株BZ167を用いて感染させた(Hovanessian et al., 2004; Rey-Cuille et al., 2006)。HIV感染に対する抗CBD1免疫血清の阻害活性を、許容細胞とのインキュベーション(37℃、90分間)前に免疫血清の種々の希釈物を用いた所与のHIV単離株のプレインキュベーション(37℃、20分間)によりアッセイした。そのような初代CD4+細胞におけるウイルス産生の最大ピークは、感染後4〜5日目に起こる。細胞を3日目に継代し、ウイルス産生をELISAにより培養上清においてモニターし、HIV主要コアタンパク質p24の濃度を測定する(HIV-1 p24 ELISAキット、Perkin-Elmer)。異なる実験において得られた値は、3連のサンプルのng/mlで平均値±SDある。
HIV感染性のアッセイのために、階段希釈の培養上清を使用し、HIV−1末端反復配列(LTR)の制御下にあるLacZ遺伝子を含むHeLa P4細胞に感染させた。HIV−1の侵入及び複製は、HIV−1 LTRの活性化をもたらし、β−ガラクトシダーゼの発現に導く。感染から48時間後、細胞を洗浄し、β−ガラクトシダーゼ活性を記載のように570nm波長のフィルターを使用して測定する(Nisole et al., 2000)。
皮内(i.d.)又は筋肉内(i.m.)に免疫化されたマカクにおけるCBD1ペプチドに対する細胞性免疫応答。応答は、IFN−γ ELISPOTアッセイにおいて、CBD1ペプチドを用いて、示された日にサンプリングされたPBMCを刺激することにより得られた。MultiScreen 96ウェルろ過プレート(Millipore, Guyancourt, France)を35%エタノール水を用いて30秒間湿らせ、次に滅菌パイロジェフリー水を用いて3回洗浄し、続いてPBSを用いて追加洗浄した。プレートを、次に、PBS中の濃度10μg/mlのサルIFN−γ(クローンGZ4、Mabtech AB, Sophia Antipolis, France)に対するモノクローナル抗体を用いて4℃で一晩インキュベーションしてコーティングした。
プレートを、PBSを用いて6回洗浄し、次に、10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS、Laboratoires Eurobio;培養液)が添加されたglutamax-1(Invitrogen)を含むRoswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培地で37℃で2時間インキュベーションしてブロッキングした。末梢血単核球細胞(PBMC)を密度匂配遠心により回収し、2×105個の細胞を各ウェルに加えた。ペプチドを、次に、3連で、培養液中に最終濃度1μMで加えた。ホルボール12ミリスチン酸13アセテート(PMA)(Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France)+イオノマイシン(ionomycine)(Sigma-Aldrich)(それぞれ最終濃度0.1μM及び1μM)を陽性対照として使用した。培養液単独を陰性対照として使用した。プレートを、5% CO2を含む雰囲気において37℃で18時間インキュベートした。それらを次にPBSを用いて5回洗浄し、0.5% FCSを含むPBSにおいて濃度1μg/mLのビオチン化抗IFN−γ抗体(クローン7−B6−1、Mabtech AB)を用いて4℃で一晩インキュベートした。プレートを、PBSを用いて5回洗浄し、0.25μg/mLのアルカリホスファターゼ−ストレプトアビジンコンジュゲート(Sigma-Aldrich)を用いて37℃で1時間インキュベートし、PBSを用いて5回洗浄した。スポットを、NBT/BCIP基質(Sigma-Aldrich)を80μl/ウェルで加えることにより発色した。スポットを、KSソフトウェアを使用しAutomated Elispot Reader System(Carl Zeiss, Le Pecq, France)を用いてカウントした。結果を、3連のウェルでの106個のPBMC当たりのIFN−γスポット形成細胞(IFN−γSFC/PBMC100万個)の平均値として表わす。バックグラウンドを、非刺激サンプルにおけるIFN−γ SFC/PBMC100万個の平均数の2倍として計算した。バックグラウンドの除去後に50超のIFN−γ SFC/PBMC100万個を産生するサンプルを陽性としてスコアした。
以下の実施例における全てのペプチドを、当技術分野において公知の方法を使用し、NeoMPS(Strasbourg, France)により合成した。全てのペプチドが、80%〜90%の免疫グレードの純度であった。
一連の実験をウサギにおいて実施し、遊離ペプチドとして又は担体タンパク質(例えばストレプトアビジン及びオボアルブミンなど)に結合した、完全フロイントアジュバント(CFA)を用いてアジュバント化されたCBD1ペプチドの免疫原性を比較した。
これらの実験の目的は、ヒトにおいて適合性があるアジュバント、MF−59、CpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)、及びMDP−Lysを使用し、マウスにおけるCBD1ペプチドに対する体液性及び細胞性免疫応答をモニターすることである。1群当たり6匹の動物を、MF−59、[MF−59+CpG ODN]、又は[MF−59+MDP−Lys]中で製剤化された50μgのCBD1ペプチドを用いて、両側の前脛骨筋中に筋肉内注射により2又は3週間の間隔で4回免疫化した。6匹のマウスの群に、[MF59+MDP−Lys]又は[MF59+CpG]のいずれかにおいて製剤化されたCBD1ペプチド(C17K)を用いて筋肉内注射した。各群の対照動物に、陰性対照としてアジュバント調製物のみを用いて注射した。マウスの異なる群を、最終注射から10日後に心穿刺によって放血させ、脾臓を除去し、ELISPOTアッセイ及びサイトカイン分泌評価を実施した。5回目の免疫化から10日後、免疫血清を、CBD1ペプチド(C17K)に対するELISAにより試験した。平均OD値±s.d.は、各群の1/8000希釈での免疫血清の平均値に対応する。結果を表2に示す。
CFAを用いてアジュバント化されたCBD1ペプチドの免疫原性を、モルモットにおいて、CBD2ペプチド、CBD1/Aペプチド(それにおいて3つの保存された芳香族トリプトファン残基がアラニンに変化している)、及びCBD1ペプチドの最後の12のアミノ酸残基を含むC13Kペプチドと並行して研究した(表3)。
2匹の動物(ウサギ、モルモット、及びマウス)の群を、CFAを使用し、2〜3週間の間隔で、CBD1ペプチド(C17K;ウサギ、モルモット、及びマウスにおいてそれぞれ150、75、50μg/注射)を用いて免疫化した。5回目の免疫化から10日後、免疫血清を、CBD1ペプチドに対するELISAにより試験した。モルモット及びマウスの免疫血清におけるIgG1及びIgG2サブクラス抗体の割合を、特異的抗体によりモニターした。力価は、0.1に等しいOD450nm値を与える免疫血清の逆希釈に対応する。HIV−1中和活性(表1においてモニター)をID50(阻害希釈50)として表わし、それはHIV−1感染の50%阻害をもたらす免疫血清の希釈を指す。
モルモットの免疫血清(放血S5)を、次に、ヒトCD4+Tリンパ球のHIV−1 BZ162感染を阻害するための能力について試験した。100倍希釈では、CBD1ペプチドを用いて免疫化されたモルモットA2及びF16からの免疫血清によってHIV感染がそれぞれ66%および57%阻害された。CBD1/AペプチドはCBD1ペプチドと同程度に免疫原性を示したが、CBD1/Aペプチドを用いて免疫化されたモルモットD7及びD8からの免疫血清は、100倍希釈ではHIV−1感染と阻害しなかった(表3を参照こと)。この後者は、中和抗体の開発用のカベオリン1結合モチーフ中の保存されたW残基の重要性を指摘する。
CBD1ペプチド、C17K及びC18Kが、それ自体で種々の動物(マウス、モルモット、ウサギ)において強い抗体応答を誘発することが可能であるという事実は、それがT細胞エピトープと共にB細胞エピトープを含むことを示す。他方で、最後の12のアミノ酸に対応するC13Kペプチドは、マウス、モルモット、及びウサギにおいて全く免疫原性を示さない。N末端の5〜6アミノ酸残基の非存在における免疫原性のこの喪失は、CBD1ペプチドのこの部分がTヘルパーエピトープの役割を果たし、保存されたCBMを含む部分が、図3に示す通り、B細胞エピトープの役割を果たす。
1)Tet830:AQYIKANSKFIGITEL(配列番号2)。これは、多数のMHCクラスII分子に結合する破傷風毒素からの「乱雑な(promiscuous)」T細胞エピトープである(Slingluff et al., 2001)。
2)gp120421−436:KQIINMWQWGKAMYA(配列番号3)。これは、ヒト、マウス、及びマカクにおいてヘルパーT細胞エピトープ機能を現すHIV−1 gp120中の4番目の定常ドメインである(Egan et al., 2004)。
3)Gag298−312:KRWIILGLNKIVRMY(配列番号4)。これは、13のヒトHLA−DR対立遺伝子に結合するHIV−GagヒトDRスーパーモチーフ(CN末端コアタンパク質p24に位置する)である(Wilson et al., 2001)。
である。
である。
マウスにおけるTヘルパーエピトープと融合されたCBD1、CBD1及びCBM由来ペプチドの免疫原性、及びHIV−1感染を阻害する誘発抗体の能力を、2組の実験において研究した。
CBD1ペプチドに融合されたTetA830、gp120421−436、及びGag298−312 Tヘルパーペプチドを使用した第1組の実験(表5並びに図4及び5にまとめる)。
6匹のマウスの群を、種々のペプチド(C17K、C18K及びC13Kのキメラペプチドについては75μg:A36K、A35K、K36K、K35K、A30K、K29K、K30K、及びR33Kペプチドについては150μg)と完全フロイントアジュバントを使用して皮下に免疫化した。5回目の免疫化から10日後、16,000倍希釈の免疫血清を、CBD1ペプチド(C17K)に対するELISAにより試験した。OD450nm値±s.d.は、各群における6つの血清サンプルの平均値に対応する。IgG1及びIgG2サブクラス抗体の割合を、特異的抗体によりモニターした。各群からのプール血清を、初代CD4+Tリンパ球のHIV−1 BZ167感染を阻害する能力について、CBD1ペプチドに対するELISAによりアッセイした。HIV−1産生を、以前に記載された通りに(Hovanessian et al., 2004b)、感染後5日目の培養上清においてp24の濃度を測定することによりモニターした。中和活性をID50(阻害希釈50)として表わし、それはHIV1感染の50%阻害をもたらす免疫血清の希釈を指す。それぞれのプール血清の200倍希釈での培養液におけるHIV−1産生の%阻害も提示する。結果を以下の表5に示す。
5匹のマウスの群を、K27W、K24W、K23M、K30W(G)、及びK27W(G)構築物についてのCBM IWNNMTWMQWの異なるサイズフラグメントに融合されたGag298−312Tヘルパーペプチドで構成される種々のキメラペプチドを使用して皮下に免疫化したのに対し、K27W−2については、モチーフは二次コンセンサス配列に対応するIWDNMTWMEWであった。唯一の除外は、C10Mペプチド(C−S−L−E−Q−I−W−N−N−M)に結合されたGag298−312ペプチドで構成されるK27Mキメラペプチドであった。それはCBD1ペプチド(C17K)の最初の9つのアミノ酸残基に対応する。この実施例についてのペプチドを、以下の表6に示す。
抗CBM抗体が、HIV−1産生細胞培養物に加えられた場合、欠損ウイルス粒子の産生を起こすことができたとの観察(図17)は、別々の中和決定基に対するそのような抗体が、HIV−1産生細胞の表面上に発現されるgp41と反応することもできることを指摘する。結果的に、そのような抗体は、Fc媒介性のエフェクター系、例えば抗体依存的な細胞性の及び補体媒介性の細胞毒性などによりインビボでHIV感染細胞の除去を引き起こしうる(Parren and Burton, 2001)。他方で、HIV偽ウイルス粒子に対する応答において最近報告されているように、欠陥HIV粒子は、ウイルスタンパク質に対する体液性及び細胞性免疫応答の生成のための宿主免疫系に関与しうる。(Chen et al., 2005)。
体重4〜6kgの成体雄カニクイザル(Macaca fascicularis)を、Mauritius繁殖コロニーから輸入し、非ヒト霊長類ケア(EEC指令N86−609、1986年11月24日)のための欧州ガイドラインに従って維持し、扱った。動物を、免疫化及び血液サンプルの採取のためにケタミン・クロルハイドレート(10〜15mg/kg)を用いて鎮静させた。第1組の免疫化において、動物を、皮内(I.D.)又は筋肉内(I.M.)経路を介して、アジュバント[MF59+MDP−Lys(L18)]を使用し、システイニルCBD1ペプチド(200μg)を用いて免疫化した。対照マカクを、アジュバント単独を用いて注射した。この実施例において、CBD1は、配列番号42において定義される、C18KペプチドCKSLEQIWNNMTWMQWDKを指す。
合計8匹の動物をこの試験において使用した。3匹の動物の2群に、0、4、8、12、及び16週目に、[MDP−Lys+MF−59]アジュバント中で製剤化されたCBD1ペプチド(200μg)を用いて筋肉内又は皮内経路を介して注射した。対照として、2匹のマカクを、アジュバント製剤単独を用いて筋肉内又は皮内のいずれかに注射した。血清及びPBMCを0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、及び22週目に回収し、ELISAにより抗体の力価を試験し、また、CBD1ペプチドに特異的なIFN−γ ELISpotを実施することにより細胞性免疫応答をモニターした。
マカクにおけるCBD1ペプチドに対する潜在的なMHC拘束を克服するために、破傷風毒素からの「乱雑な」T細胞エピトープ(TetA830:AQYIKANSKFIGITEL)(多数のMHCクラスII分子と結合する)を使用した(Jackson et al., 2002)。ジリシンリンカー(KK)(MHC−II抗原提示に関連する抗原プロセシングに関与するリソソームプロテアーゼカテプシンBの標的配列である)を介してCBD1ペプチドと融合された、TetA830、ヘルパーエピトープで構成されるTet−KK−CBD1共線形キメラを構築した(Lennon-Dumenill et al., 2002; Yano et al., 2005)。ジリシンモチーフは、また、小胞体における保持及び免疫原の半減期の延長に関与しうる(Steinhilb et al., 2002)。
初代HIV−1単離株による初代CD4+Tリンパ球の感染を阻害するマカク免疫血清の能力を試験した。一貫して、本発明者らは、そのような培養物におけるHIV−1感染が、対照マカク血清の<200倍希釈存在において30〜50%、免疫前又はアジュバント単独を用いて注射されたマカクからで増強されることを観察した。ウイルス産生に対するこの増強効果は、培養における初代ヒトTリンパ球細胞の増殖に及ぼすマカク血清の刺激効果に起因しうる。この理由のため、HIV感染に対するマカク免疫血清の阻害効果を、200及び400倍希釈でアッセイした。
HIV−1阻害効果は、200倍希釈と比較し、400倍でより顕著であり、それはマカク血清のより高い希釈での固有の増強効果の完全な喪失に起因しうる。HIV−1感染の阻害の程度は、中和活性を現したマカクの免疫血清の400倍希釈で60〜75%であった(図13)。
キメラTet−KK−CBD1ペプチドと比較し、遊離のCBD1及びTetペプチドを用いて免疫化されたマカクにおいて誘導された免疫体液性応答を特徴付けるために、免疫血清の反応性を、種々のCBD1関連ペプチドに対して試験した:CBD1ペプチドのC末端部分に対応するC13Kペプチド、HIV−2におけるCBD1ペプチドホモログであるCBD2ペプチド、N及びC末端が改変されたアミノ酸残基内のカベオリン1結合モチーフとオーバーラップするアミノ酸配列を有する一連のペプチド、及びgp41の組換え調製物(図14)。これらの試験によって、中和及び非中和マカク免疫血清の交差反応性プロファイルにおける主要な違いが明らかになった。実際に、非中和免疫血清(マカクM13246及びM13510)を、種々のオーバーラップペプチドp6362、p6363、p6364、p6365、及びp9127並びに組換えgp41との強い交差反応性により、中和免疫血清(マカクM11635、M13421、M13450、及びM13284)から区別した。この広いスペクトルの交差反応性は特異的である。なぜなら、免疫血清のいずれもCBD2ペプチドと反応しなかったからである。これらの結果は、融合されたTet−KK−CBD1ペプチドよりむしろ、遊離のCBD1及びTetペプチドの同時免疫化が、中和抗体の生成に有利に働くことを説明する。
中和抗体を誘導することができるペプチドワクチンは、部分的に、天然タンパク質における対応する領域の三次元構造を模倣する抗原エピトープの設計に依存しなくてはならない。
非常に低い割合のHIV−1感染者だけが、低いELISA力価を伴うCBD1ペプチドに対する抗体を有することが過去に示された(Hovanessian et al., 2004b)。この目的のために、ジスルフィドループを含むgp41における免疫原性エピトープ(ペプチド600〜612)及びgp41におけるカベオリン1結合ドメイン、即ち、CBD1エピトープ(ペプチド618〜633)に対するIgG抗体の存在をELISAにより試験した。ヒトHIV−1陽性及び陰性の血清を、1000倍希釈で試験した。450nm±S.D.(括弧中)で測定されたOD値の平均値を、各群(n=試験された血清の数)について与える。各アッセイでのカットオフ点を、各国からの30人の非HIV感染者からの血清を用いて決定した(Hovanessian et al., 2004b)。
実施例8(上)において、CBMベースのペプチドIWNNMTWMQW及びIWNNMTWは、Tヘルパーエピトープに融合された場合、初代Tリンパ球培養物においてHIV−1感染を中和することが可能である高力価なCBM特異的抗体を誘導することにより免疫原性であることが示された。所与のペプチドに対して惹起された中和免疫血清は、関連するCBM由来ペプチドと交差反応せず、このように、CBD1における別々の中和立体構造エピトープの存在を示唆する(表7)。CBD1におけるいくつかの別々のオーバーラップエピトープの存在は、CBM由来キメラペプチドに対して生成されたマウスモノクローナル抗体により確認された。
8匹のBALB/Cマウス(6〜8週齢)の2群を、完全フロイントアジュバント(CFA)を使用し、カクテルA及びカクテルBペプチド(以下で記載する)を用いて免疫化した。4回の皮下注射が1ヶ月間隔で投与された。
4回目の免疫化から2週間後、免疫血清を、カクテルA及びカクテルBペプチドに対するELISAにより試験した。抗カクテルA及び抗カクテルB抗体の力価は、0.1に等しいOD450nm値を与える免疫血清の逆希釈に対応する。ELISAのための実験条件を、上の方法のポイント2.1に記載した。結果を表14に提示する。マウスにおける個々のペプチドの免疫原性を、実施例8B及び表8に記載している。
4回目の免疫化から2週間後、各群の免疫血清を集め、CD4+Tリンパ球の初代HIV−1 BZ167(クレードB)感染を阻害する能力についてアッセイした。HIV−1の産生を、感染後5日目の培養上清においてHIV−1主要コアタンパク質p24の濃度を測定することによりモニターした(図18)。カクテルA及びカクテルBペプチドとのそれらの強い反応性と一致し(表14)、いずれかのカクテルペプチドに対して惹起された免疫血清が中和抗体を誘発し、それらは用量依存的な様式でHIV−1感染を阻害した(図18)。HIV−1 BZ167感染の50%阻害(ID50)を与えるカクテルA及びカクテルBプール血清希釈を、それぞれ300及び400倍希釈と推定した。
CBD1ベースのペプチドカクテルワクチン製剤の免疫原性及び有効性を、カニクイザルにおいて2相で評価した:
1.免疫化動物におけるカクテルワクチン製剤に対する体液性及び細胞性免疫応答をモニターすることによる;及び
2.HIV−1エンベロープ糖タンパク質を発現する複製能力のあるキメラサル/ヒト免疫不全ウイルス(SHIV)免疫化動物を投与することによる。
− 免疫原及びアジュバントを用いて免疫化された6匹のマカク;
− 対照PBS及びアジュバントを用いて注射された6匹の対照マカク;
第I相において、マカクは、0、4、10、16、及び22〜26週目に5回の皮下注射を受け、血漿又は血清、及びPBMCを免疫化から2及び4週間(及び適用可能な場合は6週間)後に回収し、ELISAにより抗体の力価を試験し、また、CBD1エピトープ特異的IFN−γ産生を、ELIspotアッセイを使用してモニターした。
免疫化マカクにおけるCBD1ベースのペプチドに対する細胞性免疫応答を、示した日にサンプリングされたPBMCをCBD1ベースのペプチド(カクテル免疫原中)を用いて刺激することにより、先に記載した(上の方法のポイント2.5)IFN−γ ELISpotアッセイにおいてモニターする。IFN−γ ELISpotアッセイのために試験されるペプチドは以下である:C17K、K27W、K24W、Gag298−312:K−R−W−I−I−L−G−L−N−K−I−V−R−M−Y(配列番号4)、TetA830:A−Q−Y−I−K−A−N−S−K−F−I−G−I−T−E−L(配列番号2)及びgp120421−436:K−Q−I−I−N−M−W−Q−V−V−G−K−A−M−Y−A(配列番号3)(対照ペプチドとして)。
C13Kペプチド(CIWNNMTWMQWDK)(配列番号33)は、C17Kペプチドのより短いバージョンであり、それ自体は種々の動物において免疫原性を示さない。しかし、ジリシンリンカーを使用してTヘルパーエピトープペプチドと融合された場合、このC13Kペプチドは免疫原性を示す。従って、IWNNMTWMQWDK配列(配列番号23)に融合された、TヘルパーエピトープペプチドTetA830、gp120421−436、及びGag298−312でそれぞれ構成されるA30K、K29K、及びK30Kキメラペプチドは、高力価のHIV−1中和抗体を誘導する(実施例8A及び表5)。
1)破傷風毒素TetA830ペプチド、AQYIKANSKFIGITEL(配列番号2);
2)HIV−1 gp120421−436ペプチド、KQIINMWQVVGKAMYA(配列番号3);及び
3)HIV−1 Gag298−312ペプチド、KRWIILGLNKIVRMY(配列番号4)
である。
Claims (23)
- Tヘルパーエピトープに融合されたHIV−1 gp41ペプチドのカベオリン1結合ドメイン(CBD1)又は前記CBD1の変異体を含む、から本質的になる又はなるキメラペプチド。
- Tヘルパーエピトープが、破傷風毒素、HIV−1 Gag p24、及びHIV−1 Env−gp120からなる群より選択されるペプチド由来である、請求項1記載のキメラペプチド。
- HIV−1 gp41ペプチドのカベオリン1結合ドメインがSLEQIWNNMTWMQWDK(配列番号1)から本質的になる、請求項1又は2記載のキメラペプチド。
- CBD1の変異体が以下:
a)XnWNNM(配列番号27)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数である;
b)XnWNNMTW(配列番号28)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜3の数である;
c)XnWNNMTWMQWZp(配列番号29)、式中、X及びZは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、pは0〜3、好ましくは1〜3の数である;及び
d)XnWNNMTWMQWZ(配列番号30)、式中、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜6の数であり、ZはD−Kである
の間から選ばれる、請求項1又は2記載のキメラペプチド。 - CBD1の変異体がIWNNMTW(配列番号50)、IWNNMTWMQWDK(配列番号23)、及びXnWNNMTWMQW(配列番号51)の中から選ばれる、請求項4記載のキメラペプチド。
- Tヘルパーエピトープペプチドが、配列AQYIKANSKFIGITEL(配列番号2)から本質的になる破傷風毒素Tet830ペプチド、配列KQIINMWQVVGKAMYA(配列番号3)から本質的になるHIV−1 gp120421−436ペプチド、又は配列KRWIILGLNKIVRMY(配列番号4)から本質的になるHIV−1 Gag298−312ペプチドである、請求項1〜5のいずれか一項記載のキメラペプチド。
- カベオリン1結合ドメインgp41ペプチド及びTヘルパーエピトープが、ジリシンリンカー(KK)又はグリシンプロリンリンカー(GPGPG)から選択されるペプチドリンカーにより連結される、請求項1〜6のいずれか一項記載のキメラペプチド。
-
及びそれらの混合物から本質的になる群より選択される、請求項1〜7のいずれか一項記載のキメラペプチド。 - 請求項1〜8のいずれか一項記載のキメラペプチド及びその混合物のCBD1ベースのペプチドSLEQIWNNMTWMQWDK(配列番号1)、IWNNMTWMQWDK(配列番号23)、(p62)ASWSNKSLDDIWNNM(配列番号24)の決定基に対するモノクローナル抗体。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載のキメラペプチド又はいくつかのキメラペプチド、又は請求項9記載のモノクローナル抗体、及び生理学的に許容可能な希釈剤を含む組成物。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載のキメラペプチド又はいくつかのキメラペプチド、又は請求項9記載のモノクローナル抗体、及び薬学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載のキメラペプチド又はいくつかのキメラペプチド、又は請求項9記載のモノクローナル抗体、及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載のキメラペプチド又はいくつかのキメラペプチド及び薬学的に許容可能な担体を含むワクチン。
- 配列番号12(K27W)、配列番号35(K24W)、配列番号16(K30W(G))、及び配列番号38(K27W(G))からなる、請求項10〜13のいずれか一項記載の組成物又はワクチン。
- 配列番号31(C17K)に定義するペプチド、配列番号32(C10M)に定義するペプチド、及び/又は配列番号39(CBD1/A)に定義するペプチドをさらに含む、請求項10〜13のいずれか一項記載の組成物又はワクチン。
- 配列番号12(K27W)、配列番号35(K24W)、配列番号16(K30W(G))、及び配列番号38(K27W(G))並びに配列番号31(C17K)からなる、請求項15記載の組成物又はワクチン。
- 医薬としての使用のための、請求項1〜8のいずれか一項記載のキメラペプチド又はいくつかのキメラペプチド又は請求項9記載のモノクローナル抗体。
- HIV−1に対する中和抗体の誘導に使用するための、請求項1〜8のいずれか一項記載のキメラペプチド又は少なくとも1つのキメラペプチド。
- HIV−1の中和に使用するための、請求項9記載のモノクローナル抗体。
- HIV−1又はAIDS又はHIV−1感染の処置に使用するための、請求項1〜8のいずれか一項記載のキメラペプチドもしくはいくつかのキメラペプチド、又は請求項9記載のモノクローナル抗体。
- HIV−1に対する中和抗体を誘導するため又はHIV−1を処置するため又はHIV−1感染を処置するための医薬の製造のための、請求項1〜8のいずれか一項記載の少なくとも1つのキメラペプチド、好ましくは1つのキメラペプチドもしくは複数のキメラペプチドの使用。
- HIV−1を中和するため、HIV−1を処置するため、又はHIV−1感染を処置するために使用するための、請求項9記載のモノクローナル抗体。
- HIV−1感染の予防法に使用するための、請求項1〜8のいずれか一項記載の少なくとも1つのキメラペプチド、好ましくは1つのキメラペプチド若しくは複数のキメラペプチド、又は請求項9記載のモノクローナル抗体。
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