JP2012210159A - Method for specifying coryne pusilla planula larva - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
Description
本発明は、タマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法に関する。 The present invention relates to a method for identifying Tamaumi hydraplanula larvae.
一般に、火力発電所や原子力発電所には、タービンを駆動するのに使用した蒸気を冷やすため、蒸気と海水との間で熱交換を行わせる復水器が備えられている。この熱交換に使用する海水の取水の際に、海水に生息するヒドロ虫やミズクラゲ等の付着生物が流入し、取水路や配管に付着し、発電所プラントの正常稼働を妨げるという問題が知られる。 In general, thermal power plants and nuclear power plants are provided with condensers that exchange heat between the steam and seawater in order to cool the steam used to drive the turbine. There is a known problem that when the seawater used for this heat exchange is taken in, adhering organisms such as hydroworms and moon jellyfish that inhabit the seawater flow in and adhere to the intake channel and piping, preventing normal operation of the power plant. .
取水のための海域における付着生物の来襲、発生状況、プラントへの流入状況、発電所プラント内での付着状況を確認したり、これらの付着生物の種類を特定したりできれば、効率的な防除のタイミングや、付着生物種にあった防除方法を設定することができる。 If it is possible to confirm the invasion of adhering organisms in the sea area for water intake, the occurrence status, the inflow status to the plant, the adhering status in the power plant, and the type of these adhering organisms, efficient control will be possible. The timing and the control method suitable for the attached species can be set.
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生は、ヒドロ虫綱生物の中でも特に頻繁に発電所に流入して被害をもたらしている。しかしながら、ヒドロ虫綱生物における抗原に特異的に結合する抗体として、ヒドロ虫綱生物の蛍光タンパク質に特異的に結合する抗体が知られているのみであり（特許文献１参照）、ヒドロ虫綱生物であるタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出できる方法は開発されていなかった。 Benicumida hydraactinula larvae and Tamaumihydraplanula larvae are particularly frequent among hydrozoans, causing damage to power plants. However, only an antibody that specifically binds to a fluorescent protein of a hydrozoa organism is known as an antibody that specifically binds to an antigen in a hydrozoa organism (see Patent Document 1). No method has been developed that can specifically detect the larvae of Tamaumi hydraplanula.
本発明は、タマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法を提供することを目的とする。 It is an object of the present invention to provide a method for identifying Tamami hydraplanula larvae.
本発明者らは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生で免疫したマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合することにより得られたハイブリドーマをスクリーニングしたところ、多くの場合、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生で免疫していることから予想されるように、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生のみに反応するモノクローナル抗体か、または、幼生の構造が似ているように、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生、ムラサキイガイペディベリジャー幼生にも反応するモノクローナル抗体しか得られなかった。しかしながら、本発明者らは、頻度は少ないながらも、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生には反応するが、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors screened a hybridoma obtained by fusing a spleen cell of a mouse immunized with Benicida hydra actinula larvae and a mouse myeloma cell. In many cases, the hydrangea hydra actinula larvae were screened. As expected from the immunization, either a monoclonal antibody that reacts only with the larvae of Benicaria hydraactinula, or the larvae of the Only monoclonal antibodies that react with hydraplanula larvae, jellyfish prawn larvae, and mussel pediberger larvae were obtained. However, the inventors of the present invention, although less frequently, are monoclonal antibodies that react with fenicidal hydra-actinula larvae and T. hydraplanula larvae and The inventors have found that monoclonal antibodies that do not react with hydraplanula larvae can be obtained, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法は、試料に、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントと、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントとを反応させることを特徴とする。ここで、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。また、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。 That is, the method for identifying a Tamami hydraplanula larvae according to the present invention comprises, as a sample, a monoclonal antibody or fragment thereof that reacts with Benicida hydra actinula larvae and Tamami hydraplanula larvae; And reacting with a monoclonal antibody or a fragment thereof which does not react with larvae of T. hydraplanula. Here, it is preferable that the monoclonal antibody reacting with Benicida hydraactinula larvae and Tamaumihydraplanula larvae is a monoclonal antibody produced by the hybridoma deposited under accession number FERM P-21904. In addition, a monoclonal antibody that reacts with Benicida hydraactinula larvae but does not react with Tamaumihydraplanula larvae has been deposited under the accession number FERM P-21906, the hybridoma deposited under the accession number FERM P-21903. It is preferably a monoclonal antibody produced by either a hybridoma, a hybridoma deposited with accession number FERM P-21905, or a hybridoma deposited with accession number FERM P-21907.
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出用試薬は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含有することを特徴とする。ここで、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。 The detection reagent for specifically detecting T. hydraplanula larvae according to the present invention includes a monoclonal antibody or fragment thereof that reacts with Benicida hydra actinula larvae and T. hydraplanula larvae, and Benicida hydra actinula It contains a monoclonal antibody or a fragment thereof that reacts with larvae but does not react with T. hydraplanula larvae. Here, the monoclonal antibody that reacts with Benicida hydra actinula larvae and Tamami hydraplanula larvae is a monoclonal antibody produced by the hybridoma deposited under accession number FERM P-21904, A monoclonal antibody that reacts with larvae but does not react with larvae of T. hydraplanula, hybridoma deposited with accession number FERM P-21903, hybridoma deposited with accession number FERM P-21906, accession number FERM P-21905 It is preferably a monoclonal antibody produced by either the hybridoma deposited under (1) or the hybridoma deposited under the deposit number FERM P-21907.
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出器は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化されていることを特徴とする。ここで、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。 The detector for specifically detecting T. hydraplanula larvae according to the present invention includes a monoclonal antibody or fragment thereof that reacts with fenicida hydra actinula larvae and T. hydraplanula larvae, and It is characterized in that a monoclonal antibody or a fragment thereof that reacts with the above and does not react with larvae of Tamami Hydraplanura is immobilized. Here, the monoclonal antibody that reacts with Benicida hydra actinula larvae and Tamami hydraplanula larvae is a monoclonal antibody produced by the hybridoma deposited under accession number FERM P-21904, A monoclonal antibody that reacts with larvae but does not react with larvae of T. hydraplanula, hybridoma deposited with accession number FERM P-21903, hybridoma deposited with accession number FERM P-21906, accession number FERM P-21905 It is preferably a monoclonal antibody produced by either the hybridoma deposited under (1) or the hybridoma deposited under the deposit number FERM P-21907.
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出する検出キットは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含有することを特徴とする。ここで、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。 The detection kit for specifically detecting the larva of T. hydraplanula according to the present invention comprises a monoclonal antibody or fragment thereof that reacts with the larvae of Benicum hydra actinula and the stag beetle hydraplanula larva, and And a monoclonal antibody or a fragment thereof which does not react with larvae of T. hydraplanula. Here, the monoclonal antibody that reacts with Benicida hydra actinula larvae and Tamaumi hydraplanula larvae is a monoclonal antibody produced by the hybridoma deposited under the accession number FERM P-21904. A monoclonal antibody that reacts with larvae but does not react with larvae of T. hydraplanula, hybridoma deposited with accession number FERM P-21903, hybridoma deposited with accession number FERM P-21906, accession number FERM P-21905 It is preferably a monoclonal antibody produced by either the hybridoma deposited under (1) or the hybridoma deposited under the deposit number FERM P-21907.
本発明によれば、タマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the method of specifying a Tamami hydraplanula larva can be provided.
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention completed based on the above knowledge will be described in detail with reference to examples.
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。 Unless otherwise stated in the embodiments and examples, J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. The method described in the protocol collection, or a modified or modified method thereof is used. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them are used.
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。 The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. it can. The embodiments and specific examples of the invention described below show preferred embodiments of the present invention, and are shown for illustration or explanation. It is not limited. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.
＝＝タマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法＝＝
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを試料（例えば、海水若しくは川水またはそれを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物等）に加え、試料中のタマウミヒドラプラヌラ幼生由来の抗原と反応させ、その抗原を同定することにより行うことができる。
== How to identify Tamaumi hydraplanula larvae ==
According to the present invention, there is provided a method for identifying a larva of tumulus hydraplanula, a monoclonal antibody or a fragment thereof specifically reacting with larvae of Benicida hydraactinula, Add a monoclonal antibody or fragment thereof that reacts specifically and does not react with larvae of thaliana hydra to the sample (for example, seawater or river water or a lysate treated with an ultrasonic device, a homogenizer, etc.) It can be performed by reacting with an antigen derived from the larvae of Tamamihydra planula and identifying the antigen.
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法により、様々な種類の生物が含まれる試料中で、タマウミヒドラプラヌラ幼生の有無の確認、タマウミヒドラプラヌラ幼生の同定、タマウミヒドラプラヌラ幼生の分離、タマウミヒドラプラヌラ幼生の個体数や量の測定を行うことができるようになる。また、火力発電所や原子力発電所等の臨海プラント及び沿岸水産設備の周辺海域や取水口付近におけるタマウミヒドラプラヌラ幼生の襲来、発生、残存状況を容易に把握・推定することが可能となるため、タマウミヒドラ幼生及びタマウミヒドラ成体による被害の抑制化が可能となる。 According to the method for identifying Tamaumi hydraplanula larvae according to the present invention, confirmation of the presence or absence of Tamaumi hydraplanula larvae, identification of Tamaumi hydraplanula larvae, It becomes possible to measure the number and amount of larvae of Tamaumi hydraplanula larvae. In addition, it is possible to easily grasp and estimate the invasion, occurrence, and residual status of Tamaumi hydraplanula larvae in the vicinity of waterfront plants and coastal fisheries facilities such as thermal power plants and nuclear power plants and in the vicinity of intakes. In addition, it is possible to suppress damage caused by larvae of tamaumihydra and adult tamaumihydra.
具体的には、例えば、前述の２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントをそれぞれ異なる蛍光波長を有する蛍光色素で標識し、タマウミヒドラプラヌラ幼生を含む試料に作用させる。この際、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントには反応し、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応するがタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントには反応しない生物を、タマウミヒドラプラヌラ幼生と特定することができる。 Specifically, for example, the above-described two types of monoclonal antibodies or fragments thereof are labeled with fluorescent dyes having different fluorescence wavelengths, and allowed to act on a sample containing Tamaumihydraplanula larvae. At this time, it reacts with a monoclonal antibody or a fragment thereof specifically reacting with the larvae of Benicumida hydraactinula and the larvae of Tamamihydraplanula, and specifically reacts with the larvae of Benicumida hydraactinula, but reacts specifically with the larvae of Organisms that do not react with monoclonal antibodies or fragments thereof that do not react with larvae can be identified as Tamamihydraplanula larvae.
あるいは、前述の２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを磁性体などの担体に結合させる。まず、タマウミヒドラプラヌラ幼生を含む試料に磁性体が結合したベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを作用させ、その後、磁石などを用いて担体を回収する。ここで回収された試料には、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生が含まれている。この回収試料に対し、続いて磁性体などの担体に結合したベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応するがタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを作用させる。そして、磁石などを用いてそのモノクローナル抗体またはそのフラグメントを除去する。この際、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応するがタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントに結合したベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生のみが取り除かれ、タマウミヒドラプラヌラ幼生が残留する。従って、この方法によりタマウミヒドラプラヌラ幼生のみを回収することができる。なお、磁性体としては、例えば、鉄、酸化鉄等を用いることができる。また、磁性体の代わりにＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorting）、ｐａｎｎｉｎｇ等の方法を用いても同様にタマウミヒドラプラヌラ幼生を回収できる。 Alternatively, the above-described two types of monoclonal antibodies or fragments thereof are bound to a carrier such as a magnetic substance. First, a monoclonal antibody or fragment thereof that reacts specifically with fenicum hydra actinula larvae and Tama hydra planula larvae that are bound to a magnetic substance is allowed to act on a sample containing tamaumi hydraplanula larvae, and then a magnet or the like is used. And recover the carrier. The sample collected here includes fenicum hydra actinula larvae or Tamami hydraplanula larvae. Subsequently, a monoclonal antibody or a fragment thereof that reacts specifically with fenicidal hydra actinula larvae bound to a carrier such as a magnetic substance but does not react with antrum hydraplanula larvae is allowed to act on the collected sample. Then, the monoclonal antibody or fragment thereof is removed using a magnet or the like. At this time, only the venicida hydraactinula larvae bound to the monoclonal antibody or fragment thereof that reacts specifically with the venicida hydraactinula larvae but does not react with the tumulus hydraplanula larvae are removed. Larvae remain. Therefore, only Tamaumihydraplanula larvae can be recovered by this method. In addition, as a magnetic body, iron, iron oxide, etc. can be used, for example. In addition, the larva of Tamami hydra planula can be similarly recovered by using a method such as FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) or panning instead of the magnetic substance.
なお、モノクローナル抗体またはそのフラグメントが幼生に反応するというとき、その幼生の形状は、ｗｈｏｌｅ-ｍｏｕｎｔであっても、組織切片であっても、粗抽出液（超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物）であっても、当業者が抗体反応に用いる形状であれば、特に限定されない。また、その幼生に対して行う処理（固定、溶解、抽出等）も、当業者が抗体反応に用いるために通常行う処理であれば、特に限定されない。 When the monoclonal antibody or a fragment thereof reacts with the larvae, the shape of the larvae may be a whole-mount or a tissue section, a crude extract (dissolved with an ultrasonic device, a homogenizer, etc.). Even if it is the shape which those skilled in the art use for an antibody reaction, it will not specifically limit. Also, treatments (fixation, dissolution, extraction, etc.) performed on the larvae are not particularly limited as long as they are treatments that are usually performed by those skilled in the art for use in antibody reactions.
＝＝モノクローナル抗体またはそのフラグメント＝＝
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定する方法に使用する２種類のモノクローナル抗体のそれぞれは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体であれば特に制限されるものではない。このような２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを使用することによって、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントには反応するが、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントには反応しない生物がタマウミヒドラプラヌラ幼生であると特定することができる。
== Monoclonal antibody or fragment thereof ==
Each of the two types of monoclonal antibodies used in the method for identifying Tamaumi hydraplanula larvae according to the present invention includes a monoclonal antibody that specifically reacts with Benicida hydraactinula larvae and Tamaumi hydraplanula larvae, There is no particular limitation as long as it is a monoclonal antibody that specifically reacts with Kudaumihydra actinula larvae but does not react with Tamaumihydraplanula larvae. By using these two types of monoclonal antibodies or fragments thereof, the antibody reacts with monoclonal antibodies or fragments thereof that specifically react with the larvae of Benicaria hydraactinula and Tamaumihydraplanula larvae. An organism that specifically reacts with hydraactinula larvae but does not react with tamadra hydraplanula larvae and does not react with a monoclonal antibody or a fragment thereof can be identified as tamadra hydraplanula larvae.
ここで、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、それぞれベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生以外の生物種に対して反応性を有していても、有していなくても制限されない。ただし、タマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出するためには、タマウミヒドラプラヌラ幼生以外の個々の生物種に対する反応性が、前述の２種類の抗体またはそのフラグメントにおいて同じであることが好ましい。特に、タマウミヒドラプラヌラ幼生と生息域が重複するためにタマウミヒドラプラヌラ幼生と一緒に試料中に含まれる可能性の高い生物、例えば、ミズクラゲプラヌラ幼生、フジツボ類幼生、イガイ類幼生、及び、コペポーダ等に対する反応性が前述の２種類の抗体において同じであれば、より正確にタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定することが可能である。 Here, a monoclonal antibody or fragment thereof specifically reacting with Benicida hydraactinula larvae and Tamamihydraplanula larvae, and specifically reacting with Benicida hydraactinula larvae, The non-reacting monoclonal antibody or a fragment thereof is not limited even if it has reactivity or non-reactivity with species other than Benicida hydra actinula larvae and Tamami hydraplanula larvae, respectively. However, in order to specifically detect Tamaumihydraplanula larvae, it is preferable that the reactivity with respect to individual species other than Tamaumihydraplanula larvae is the same in the aforementioned two types of antibodies or fragments thereof. In particular, organisms that are likely to be included in the sample along with the Tamami Hydra Planula larvae due to overlapping habitats with the Tamami Hydra Planula larvae, such as the jellyfish Planula larvae, barnacle larvae, mussel larvae, and If the reactivity with a copepod or the like is the same in the above-described two types of antibodies, it is possible to more accurately identify the larva of Tamamihydraplanula.
なお、モノクローナル抗体のフラグメントとしては、前述のモノクローナル抗体の一部からなり、可変領域を含む抗原結合部位であれば特に制限されるものではないが、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等を用いることができる。これらのフラグメントは、例えば、前述のモノクローナル抗体をタンパク質分解酵素によって部分消化することにより得ることができる。なお、タンパク質分解酵素としては、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントを得ることができるものであればどのようなものであってもよいが、例えば、ペプシン、フィシン等の分解酵素を用いることができる。 The fragment of the monoclonal antibody is not particularly limited as long as it is a part of the above-mentioned monoclonal antibody and includes an antigen binding site containing a variable region. For example, Fab fragment, F (ab ′) 2 fragment Etc. can be used. These fragments can be obtained, for example, by partially digesting the aforementioned monoclonal antibody with a proteolytic enzyme. Any proteolytic enzyme may be used as long as it can obtain a Fab fragment or F (ab ′) 2 fragment. For example, a protease such as pepsin or ficin may be used. Can do.
＝＝モノクローナル抗体製造方法＝＝
前述の２種類のモノクローナル抗体は、それぞれ、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから得ることができる。
== Method for producing monoclonal antibody ==
The two types of monoclonal antibodies described above are specifically hybridomas that produce monoclonal antibodies that react specifically with the larvae of Benicum hydra actinula and the larvae of T. hydraplanula, and specifically for the venicida hydra actinula larvae, respectively. It can be obtained from a hybridoma that produces a monoclonal antibody that reacts and does not react with larvae of T. hydraplanula.
ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の製造は、常法に従って行うことができる。例えば、該ハイブリドーマを適当な培養培地で培養し、培養上清を回収することにより行ってもよいが、前述のハイブリドーマを哺乳類動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サル等）の腹腔内に投与し、腹水を回収することにより行ってもよい。なお、モノクローナル抗体の精製は、前述のハイブリドーマの培養上清または培養したハイブリドーマを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物、または前述のハイブリドーマを腹腔内に投与した哺乳類動物から採取した腹水を、常法、例えば、硫安塩析、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィー等）、ゲル濾過等の方法、またはこれらの方法を適宜組み合わせた方法により行うことができる。 Production of a monoclonal antibody using a hybridoma can be performed according to a conventional method. For example, the hybridoma may be cultured in an appropriate culture medium, and the culture supernatant may be collected. The hybridoma described above may be used in mammals (eg, mouse, rat, hamster, rabbit, pig, cow, horse, It may be carried out by intraperitoneal administration of dogs, monkeys, etc.) and collecting ascites. In addition, the purification of the monoclonal antibody is performed by using the culture supernatant of the hybridoma or the lysate obtained by treating the cultured hybridoma with an ultrasonic device, a homogenizer, or the ascites collected from a mammal administered intraperitoneally with the hybridoma. It can be performed by a conventional method, for example, ammonium sulfate salting out, chromatography (for example, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc.), gel filtration, or a combination of these methods.
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおいて受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されている細胞株ＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）を用いることができる。また、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおいて受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されている細胞株Ｔ−Ｈ３Ｈ７（１）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されている細胞株Ｔ−Ｈ３Ａ１（６）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されている細胞株Ｔ−Ｈ３Ｇ１０（４）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されている細胞株Ｔ−Ｐ２Ｆ１２（７）のいずれかを用いることができる。 As a hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically reacts with Benicida hydra actinula larvae and Tamaumi hydraplanula larvae, for example, deposited under the accession number FERM P-21904 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) The cell line TC-H2D7 (3) that has been used can be used. In addition, as a hybridoma that produces a monoclonal antibody that reacts specifically with Benicida hydraactinula larvae but does not react with Tamaumihydraplanula larvae, for example, the accession number at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Cell line T-H3H7 (1) deposited under FERM P-21903, cell line T-H3A1 (6) deposited under accession number FERM P-21906, cells deposited under accession number FERM P-21905 Any of strain T-H3G10 (4) and cell strain T-P2F12 (7) deposited under accession number FERM P-21907 can be used.
＝＝ハイブリドーマの作製＝＝
本発明に係る方法に用いられる抗体を産生するハイブリドーマは、常法により作製することができる。以下に一例を示す。
== Production of hybridoma ==
The hybridoma producing the antibody used in the method according to the present invention can be prepared by a conventional method. An example is shown below.
まず、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生、あるいはその粗抽出液を抗原として用い、適当な量の抗原をマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サル等の哺乳動物の静脈内、皮下、腹腔内等に１〜複数回投与して免疫する。この際、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生のいずれかのみを抗原として用いても、両方を抗原として用いてもよい。また、免疫にアジュバントを使用してもよい。 First, Benicida hydraactinula larvae or Tamami hydraplanula larvae, or crude extracts thereof, are used as antigens, and an appropriate amount of antigen is used in mice, rats, hamsters, rabbits, pigs, cows, horses, dogs, monkeys, etc. The mammal is immunized by administration once or multiple times in the mammals intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or the like. At this time, either Benikudaumihydra actinula larvae or Tamamihydraplanula larvae may be used as antigens, or both may be used as antigens. An adjuvant may be used for immunization.
その後、免疫した動物から抗体産生細胞を採取し、採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合させてハイブリドーマを作製する。得られたハイブリドーマの中で、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応性するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選定することにより、本発明に係る方法に用いられる２種類のモノクローナル抗体をそれぞれ産生するハイブリドーマを得ることができる。 Thereafter, antibody-producing cells are collected from the immunized animal, and the collected antibody-producing cells and myeloma cells (myeloma cells) are fused to produce a hybridoma. Among the obtained hybridomas, hybridomas that produce monoclonal antibodies that specifically react with the larvae of Benicumida hydraactinula and those that react specifically with the larvae of Tamunihydraplanula, and specifically react with the larvae of Benicida hydraactinula. By selecting a hybridoma that produces a monoclonal antibody that does not react with tamaumihydraplanula larvae, a hybridoma that produces each of the two types of monoclonal antibodies used in the method of the present invention can be obtained.
前記抗体産生細胞とミエローマ細胞は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等の細胞融合促進剤を用いて細胞融合することができるが、エレクトロポレーション等の電気刺激を利用して細胞融合することもできる。なお、細胞融合の効率を高めるために、ジメチルスルホキシドやレシチン等の補助剤を培養培地に含ませてもよい。 The antibody-producing cells and myeloma cells can be fused with a cell fusion promoter such as polyethylene glycol (PEG) or Sendai virus (HVJ), for example, using electrical stimulation such as electroporation. Cell fusion is also possible. In order to increase the efficiency of cell fusion, adjuvants such as dimethyl sulfoxide and lecithin may be included in the culture medium.
前記抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等を用いることができる。これらの細胞は、動物から脾臓、リンパ節、胸腺、または末梢血を摘出し、摘出した組織を破砕、濾過、遠心分離等することにより得ることができる。また、前記ミエローマ細胞としては、各種動物由来の細胞株を用いてもよいが、それ自身薬剤に対して抵抗性を示さないが、融合すると薬剤に対して抵抗性を示す細胞株を用いることが好ましい。これにより、細胞融合した後、薬剤を添加した培養培地（例えば、ＨＡＴ培地等）で培養することにより、細胞融合によって得られたハイブリドーマの選択が容易となる。なお、融合させる抗体産生細胞とミエローマ細胞は、同種の動物由来の細胞を用いることが望ましいが、異なる種の動物由来の細胞を用いてもよい。 Examples of the antibody-producing cells that can be used include spleen cells, lymph node cells, thymocytes, and peripheral blood cells. These cells can be obtained by removing spleen, lymph nodes, thymus, or peripheral blood from an animal, and crushing, filtering, centrifuging, etc. the removed tissue. In addition, as the myeloma cells, cell lines derived from various animals may be used. However, cell lines that do not themselves show resistance to drugs but that are resistant to drugs when fused may be used. preferable. Thereby, after cell fusion, selection of a hybridoma obtained by cell fusion is facilitated by culturing in a culture medium (for example, HAT medium) to which a drug is added. The antibody-producing cells and myeloma cells to be fused are preferably cells derived from the same species, but cells derived from animals of different species may be used.
前述のハイブリドーマの選定は、常法のスクリーニングやクローニングにより行うことができる。ハイブリドーマのスクリーニングには、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Enzyme Immuno Assay、ＥＬＩＳＡ：Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ：Radio Immuno Assay）、ウエスタンブロッティング等を用いることができ、ハイブリドーマのクローニングには、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等を用いることができる。本発明に係るハイブリドーマの選定において、上記スクリーニング及びクローニングを繰り返し行うことにより、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはその粗抽出液、及び、タマウミヒドラプラヌラ幼生またはその粗抽出液に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはその粗抽出液に対して特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生またはその粗抽出液に対して反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することが可能となる。 The aforementioned hybridoma can be selected by routine screening or cloning. For screening of hybridomas, for example, enzyme immunoassay (EIA: Enzyme Immuno Assay, ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), radioimmunoassay (RIA: Radio Immuno Assay), Western blotting, etc. can be used. For cloning, for example, limiting dilution method, soft agar method, fibrin gel method, fluorescence excitation cell sorter method and the like can be used. In the selection of the hybridoma according to the present invention, the above-mentioned screening and cloning are repeated to react specifically with Benicida hydraactinula larvae or a crude extract thereof, and Tamamihydraplanula larvae or a crude extract thereof. A hybridoma that produces a monoclonal antibody, and a monoclonal antibody that reacts specifically with the larva of Benicida hydra actinula or its crude extract and does not react with the larva of Tama hydra planula or its crude extract A hybridoma can be selected.
なお、ハイブリドーマのスクリーニングでは、最低限ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはその粗抽出液、及び、タマウミヒドラプラヌラ幼生またはその粗抽出液に対する反応性を調べればよいが、さらに、ミズクラゲプラヌラ幼生のような、ヒドロ虫綱以外の刺胞動物門に属する生物、アカフジツボをはじめとするフジツボ類のキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイをはじめとするイガイ類のペディベリジャー幼生等の他の幼生やプランクトンまたはその粗抽出液との反応性を調べ、タマウミヒドラプラヌラ幼生以外の個々の生物種に対する反応性が、前述の２種類のモノクローナル抗体またはフラグメントにおいて同じであることを確認することが好ましい。 In the screening of hybridomas, it is sufficient to examine the reactivity of at least vicinal hydra actinula larvae or a crude extract thereof, and Tamaumi hydraplanula larvae or a crude extract thereof. Other larvae and plankton, such as cyprid larvae of barnacles such as red horned moths, peas larvae of mussels such as copepoda and mussel It is preferable to check the reactivity with the liquid to confirm that the reactivity with respect to individual species other than the larvae of Tamamihydraplanula is the same in the above-described two types of monoclonal antibodies or fragments.
＝＝タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出用試薬＝＝
上記「モノクローナル抗体またはそのフラグメント」に記載される２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメント、すなわち、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを使用することによってタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定することができるので、それらの２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、それらの２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含むことを特徴とするタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出用試薬、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器、及び、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出キットとして利用可能である。
== Reagent for detection of Tamami Hydra Planula larva ==
Two types of monoclonal antibodies or fragments thereof described in the above “monoclonal antibodies or fragments thereof”, that is, monoclonal antibodies or fragments thereof that specifically react with Benicida hydraactinula larvae and Tamamihydraplanula larvae, and By using a monoclonal antibody or a fragment thereof that reacts specifically with Benicum hydra actinula larvae but does not react with Tama hydraplanula larvae, it is possible to identify Tamaumi hydraplanula larvae. A monoclonal antibody or a fragment thereof comprises a detection reagent for Tamaumi hydraplanula larvae, which comprises these two types of monoclonal antibodies or fragments thereof, And is available as a kit for detecting ball sea Hydra plug Marne-la-larvae.
なお、本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出用試薬は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含むものであればどのようなものでもよく、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質等）、安定剤（例えば、ＢＳＡ、ヤギ血清等）等の、抗体またはそのフラグメント以外に抗原の検出用試薬に含ませる一般的な物質が１または２以上、さらに含まれていてもよい。 Note that the reagent for detection of T. hydraplanula larvae according to the present invention includes a monoclonal antibody or fragment thereof that specifically reacts with Benicida hydra actinula larvae and T. hydraplanula larvae, and Any monoclonal antibody or fragment thereof that reacts specifically with larvae but does not react with T. hydraplanula larvae may be used, such as a buffer (eg, phosphate, carbonate, hydrochloric acid). Salt solution such as salt), preservatives (eg, sodium azide, etc.), substances for inhibiting non-specific reactions (eg, block ace, gelatin, skim milk, etc.) Substances necessary to detect hydraactinula larvae or T. hydraplanula larvae (for example, In addition to antibodies or fragments thereof, one or more general substances to be included in the reagent for detecting antigen may be further included, such as a lysozyme and the like, and a stabilizer (eg, BSA, goat serum) .
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが媒体（例えば、濾紙等の紙、ガラス、繊維、ニトロセルロース等の変性セルロース、ナイロン、プラスチック等から成るフィルター、メンブレン、プレート、ディッシュ等）に固定化されているものを含めばどのようなものでもよく、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質、発色基質、二次抗体、発色増強剤等）、安定剤（例えば、ＢＳＡ、ヤギ血清等）等の、抗体またはそのフラグメント以外に抗原の検出器に含ませる一般的な物質が１または２以上、さらに含まれていてもよい。 The detector for the larva of T. hydraplanula according to the present invention is a monoclonal antibody or a fragment thereof that specifically reacts with larvae of Benicum hydra actinula and larva of T. hydraplanula, and a peculiar to a venicida hydra actinula larva. Monoclonal antibodies or fragments thereof that react in a reactive manner and do not react with larvae of T. hydraplanula, such as filters such as filter paper, glass, fibers, modified cellulose such as nitrocellulose, nylon, plastics, membranes, Plate, dish, etc. may be used as long as it is fixed, for example, a buffer solution (for example, a solution of a salt such as phosphate, carbonate, hydrochloride), a preservative (for example, Sodium azide, etc.), substances for suppressing non-specific reactions (for example, Substances (eg, labeling substance, chromogenic substrate, secondary antibody, chromogenic enhancement) required to detect the larva of Benicida hydraactinula or Tamamihydraplanula larvae by means of immunological techniques such as rock ace, gelatin, skim milk, etc. In addition to the antibody or fragment thereof, one or more general substances to be included in the antigen detector may be further included, such as an agent, etc.) and a stabilizer (for example, BSA, goat serum, etc.).
本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器の一例としては、試料を滴下する部分または試料を浸す第一の部分と、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、あるいは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化された第二の部分と、第二の部分に固定化されたモノクローナル抗体が産生されたホストの動物種の免疫グロブリンに特異的に反応する抗免疫グロブリン抗体等が固定化された第三の部分を有し、第二の部分が第一の部分と第三の部分との間に備えられ、第一の部分には、金属コロイド粒子（例えば、金コロイド粒子等）、重金属（例えば、金、白金等）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ローダミン、ファロイジン等）、着色ラテックス粒子等の標識物質で標識されたクロマトグラフ媒体を挙げることができる。前記クロマトグラフ媒体としては、例えば、ガラスやシリカ等の無機繊維からなる濾紙、ニトロセルロース等の変性セルロース等を用いることができる。 As an example of the detector of Tamaumi hydraplanula larvae according to the present invention, the sample dripping part or the first part soaking the specimen, and specifically reacting with the stag beetle hydraactinula larvae and the Tamaumi hydraplanula larvae A monoclonal antibody or a fragment thereof, or a second portion on which a monoclonal antibody or fragment thereof that specifically reacts with the larvae of Benicaria hydraactinula but does not react with the larvae of T. hydraplanula, An anti-immunoglobulin antibody that specifically reacts with the immunoglobulin of the host animal species in which the monoclonal antibody immobilized on the portion is produced has a third portion, and the second portion comprises the first portion. It is provided between one part and a third part, and the first part has metal colloid particles (for example, gold colloid particles etc. , Heavy metals (e.g., gold, platinum, etc.), fluorescent substance (e.g., FITC (fluorescein isothiocyanate), rhodamine phalloidin, etc.), can be exemplified labeled chromatographic media with a labeling substance such as colored latex particles. Examples of the chromatographic medium include filter paper made of inorganic fibers such as glass and silica, and modified cellulose such as nitrocellulose.
例えば、本検出器の第二の部分にベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化されたクロマトグラフ媒体（以下、クロマトグラフ媒体Ａと称する）と、本検出器の第二の部分にベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化されたクロマトグラフ媒体（以下、クロマトグラフ媒体Ｂと称する）とが含まれる検出器を用いて同一の試料を解析し、クロマトグラフ媒体Ａでは陽性を示し、クロマトグラフ媒体Ｂでは陰性を示す場合には、試料にタマウミヒドラプラヌラ幼生が特異的に含まれていると判断できる。逆に、クロマトグラフ媒体Ａ、Ｂで共に陰性の場合には、試料にタマウミヒドラプラヌラ幼生が含まれていないと判断でき、クロマトグラフ媒体Ａ、Ｂで共に陽性の場合には、試料に少なくともベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生が含まれていると判断できるが、タマウミヒドラプラヌラ幼生が含まれるか否かは不明である。 For example, a chromatographic medium (hereinafter referred to as chromatographic medium A) in which a monoclonal antibody or a fragment thereof specifically reacting with the larvae of Benicum hydra actinula and Tama hydra planula larvae is immobilized on the second part of the present detector. And the second part of the detector is a chromatographic medium in which a monoclonal antibody or fragment thereof that specifically reacts with the larvae of Benicum hydra actinula and does not react with the larvae of T. hydraplanula. (Hereinafter referred to as chromatographic medium B) and the same sample is analyzed, and if chromatographic medium A shows positive and chromatographic medium B shows negative, It can be judged that Umihydra planula larvae are specifically included. Conversely, if both chromatographic media A and B are negative, it can be determined that the sample does not contain T. hydraplanula larvae. If both chromatographic media A and B are positive, the sample contains at least Although it can be determined that Benicumida hydraactinula larvae are included, it is unclear whether or not Tamamihydraplanula larvae are included.
このような検出器の原理として、クロマトグラフ媒体Ａに関し、例えばタマウミヒドラプラヌラ幼生またはその溶解物を含む試料を、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントが第二の部分に固定化されたクロマトグラフ媒体Ａの第一の部分に滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、試料中のタマウミヒドラプラヌラ幼生またはその溶解物は、クロマトグラフ媒体Ａの第一の部分から第二の部分を経て第三の部分を超えて移動する。この時、前述の液体試料中に含まれるタマウミヒドラプラヌラ幼生由来の抗原は第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントと反応して複合体を形成し、液が媒体中を広がるのを利用して、その複合体は第二の部分へと移動し、第二の部分において固定化された前述のモノクローナル抗体またはそのフラグメントに捕捉されてその位置で標識物質によりタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出が可能となる。なお、このクロマトグラフ媒体Ａ第一の部分からくるフリーの抗体は、第三の部分へと移動し、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分で発色が生じる。この第三の部分での発色は、検出の陽性対照となる。これに対して、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生由来の抗原とタマウミヒドラプラヌラ幼生由来の抗原のいずれも含まない試料を第一の部分に滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントが、第二の部分を素通りして第三の部分へと移動し、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分でのみ発色が生じる。このように、クロマトグラフ媒体Ａの第二の部分にシグナルが現れたか否かによって、試料中にベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生が存在するかどうかを判定することが可能となる。 As a principle of such a detector, with respect to the chromatographic medium A, for example, a sample containing Tamaumi hydraplanula larvae or a lysate thereof is specifically reacted with Benicida hydraactinula larvae and Tamaumi hydraplanula larvae. When the antibody or a fragment thereof is dropped on the first part of the chromatographic medium A immobilized on the second part, or the first part is immersed in the sample, the Tamamihydraplanula larvae in the sample or their dissolution Things move from the first part of the chromatographic medium A through the second part and beyond the third part. At this time, the antigen derived from the larva of T. hydraplanula contained in the liquid sample reacts with the labeled monoclonal antibody or fragment thereof contained in the first part to form a complex, and the liquid passes through the medium. Utilizing the spread, the complex moves to the second part, and is captured by the monoclonal antibody or fragment thereof immobilized on the second part and is labeled with the labeling substance at the position. Larvae can be detected. The free antibody coming from the first part of the chromatographic medium A moves to the third part, is captured by the anti-immunoglobulin antibody immobilized in the third part, and develops color in the third part. Occurs. This color development in the third part serves as a positive control for detection. On the other hand, when a sample that does not contain antigens derived from Benicum hydra actinula larvae and antigens derived from Tamami hydraplanula larvae is dropped on the first part or the first part is immersed in the sample The labeled monoclonal antibody or fragment thereof contained in the first part moves through the second part to the third part and is captured by the anti-immunoglobulin antibody immobilized in the third part. Color development occurs only in the third part. In this way, it is possible to determine whether or not Benicida hydra actinula larvae or Tamami hydraplanula larvae are present in the sample depending on whether or not a signal appears in the second portion of the chromatographic medium A. Become.
また、クロマトグラフ媒体Ｂに関し、例えばタマウミヒドラプラヌラ幼生またはその溶解物を含む試料を、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応するがタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが第二の部分に固定化されたクロマトグラフ媒体Ｂの第一の部分に、滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、試料中のタマウミヒドラプラヌラ幼生またはその溶解物は、クロマトグラフ媒体Ｂの第一の部分から第二の部分を経て第三の部分を超えて移動する。この時、前述の液体試料中に含まれるタマウミヒドラプラヌラ幼生由来の抗原は第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、第二の部分に固定されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントとは反応性を有さないため、第一の部分から第二の部分を素通りして、第三の部分へ移動する。従って、第二の部分の位置において標識物質によってタマウミヒドラプラヌラ幼生は検出されない。同時に、第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、液が媒体中を広がるのを利用して、フリーのまま第一の部分から第二の部分を経て、第三の部分へと移動する。第一の部分からくるこのフリーの抗体は、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分で発色が生じる。この第三の部分での発色は、検出の陽性対照となる。 Further, for chromatographic medium B, for example, a sample containing T. hydraplanula larvae or a lysate thereof reacts specifically with Benicida hydra actinula larvae, but does not react with T. hydraplanula larvae, or the like. When the fragment is dropped on the first part of the chromatographic medium B in which the fragment is immobilized on the second part or the first part is immersed in the sample, the Tamami hydraplanula larvae in the sample or its lysate are , Moving from the first part of the chromatographic medium B through the second part and beyond the third part. At this time, the antigen derived from the larva of T. hydraplanula contained in the liquid sample is labeled monoclonal antibody or a fragment thereof contained in the first part, and a monoclonal antibody or a fragment thereof immobilized in the second part. Since it has no reactivity with the fragment, it moves from the first part through the second part to the third part. Therefore, no Tamami hydraplanula larvae are detected by the labeling substance at the position of the second portion. At the same time, the labeled monoclonal antibody or fragment thereof contained in the first part is freed from the first part through the second part by utilizing the fact that the liquid spreads in the medium. Move to. This free antibody from the first part is captured by the anti-immunoglobulin antibody immobilized in the third part and color develops in the third part. This color development in the third part serves as a positive control for detection.
この様に、クロマトグラフ媒体Ａでは陽性を示し、クロマトグラフ媒体Ｂでは陰性を示す場合には、その試料にタマウミヒドラプラヌラ幼生が特異的に含まれていると判断できる。 As described above, when the chromatographic medium A is positive and the chromatographic medium B is negative, it can be determined that the sample contains specifically the T. hydraplanula larvae.
また、本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出キットは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含むものであればどのようなものでもよく、これらの２種類のモノクローナル抗体またはそのフラグメント以外に、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質、発色基質、二次抗体、発色増強剤等）、安定剤（例えば、ＢＳＡ、ヤギ血清等）等の抗原の検出キットに含ませる一般的な物質、若しくは前述のタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器、またはこれらのうち２以上を組み合わせたものが含まれていてもよい。 In addition, the detection kit for Tamaumi hydraplanula larvae according to the present invention includes a monoclonal antibody or fragment thereof that specifically reacts with Benicida hydraactura larvae and Tamaumi hydraplanula larvae, and Any monoclonal antibody or fragment thereof may be used as long as it contains a monoclonal antibody or a fragment thereof that specifically reacts with larvae and does not react with T. hydraplanula larvae. Liquids (for example, solutions of salts such as phosphates, carbonates, hydrochlorides, etc.), preservatives (for example, sodium azide, etc.), substances for suppressing non-specific reactions (for example, block ace, gelatin, Skimmed milk, etc.), Benicida hydra actinula larvae by immunological techniques For detecting kits for detecting antigens such as substances (eg, labeling substances, chromogenic substrates, secondary antibodies, chromogenic enhancers, etc.) and stabilizers (eg, BSA, goat serum, etc.) necessary to detect larvae A general substance to be included, a detector for the above-mentioned Tamami Hydraplanula larvae, or a combination of two or more of these may be included.
なお、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出用試薬、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器、及び、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出キットにおける標識物質としては、例えば、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ファロイジン等）、金等のコロイド粒子、重金属（例えば、金、白金等）、色素タンパク質（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）等）、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジン等の物質を用いることができるがこれらに制限されるものではなく、公知の標識物質を用いてもよい。また、発色基質としては、前述の酵素に対する発色基質であれば特に制限されるものではなく、例えば、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ｏ-フェニレンジアミン(o-Phenylenediamine)、過酸化水素水、ＢＣＩＰ/Ｎｉｔｒｏ-ＴＢ（5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/Nitrotetrazolium blue）、ｐＮＰＰ（para-nitorophenylphosphate）等を用いることができる。発色増強剤としては、前述の基質の発色を増強させることができるものであればどのようなものでもよく、例えば、硫酸等を用いることができ、二次抗体としては、例えば、本発明に係るモノクローナル抗体が産生されたホストの動物種の免疫グロブリンに特異的に反応する抗免疫グロブリン抗体、抗ＩｇＧ（Ｈ+Ｌ）、抗ＩｇＧ（Ｆｃ）等を用いることができる。 Examples of the labeling substance in the detection reagent for tamaumihydraplanula larvae, the detector for tamaumihydraplanula larvae, and the detection kit for tamaumihydraplanula larvae include, for example, fluorescent substances (eg, FITC, rhodamine, phalloidin, etc. ), Colloidal particles such as gold, heavy metals (eg, gold, platinum, etc.), chromoproteins (eg, phycoerythrin (PE), phycocyanin (PC), etc.), radioisotopes (eg, 3 H, 32 P, 35 S, 125 I, 131 I, etc.), enzymes (eg, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.), biotin, streptavidin, and the like can be used, but are not limited thereto, and known labeling substances may be used. . The chromogenic substrate is not particularly limited as long as it is a chromogenic substrate for the above-mentioned enzyme. For example, diaminobenzidine (DAB), o-phenylenediamine (o-Phenylenediamine), hydrogen peroxide solution, BCIP / Nitro -TB (5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate / Nitrotetrazolium blue), pNPP (para-nitorophenylphosphate), etc. can be used. As the color development enhancer, any one can be used as long as it can enhance the color development of the aforementioned substrate. For example, sulfuric acid or the like can be used, and the secondary antibody is, for example, according to the present invention. Anti-immunoglobulin antibodies, anti-IgG (H + L), anti-IgG (Fc) and the like that specifically react with immunoglobulins of the host animal species from which the monoclonal antibody was produced can be used.
また、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出用試薬、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出器、及び、タマウミヒドラプラヌラ幼生の検出キットに関する前述の免疫学的手法としては、ＥＩＡ（Enzyme Immunoassay）、蛍光免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）、ＲＩＡ（Radio Immuno Assay）、ウエスタンブロッティング、ラテックス凝集法、イムノクロマト法、サンドイッチ法等の公知の方法を用いることができる。 Further, the above-described immunological techniques relating to detection reagents for tamaumihydraplanula larvae, detectors for tamaumihydraplanula larvae, and detection kits for tamaumihydraplanula larvae include EIA (Enzyme Immunoassay), fluorescence immunoassay Methods, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), RIA (Radio Immunoassay), Western blotting, latex agglutination method, immunochromatography method, sandwich method and the like can be used.
以上のように、本発明に係るタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出方法を用いることにより、様々な種類の生物が含まれる試料中で、タマウミヒドラプラヌラ幼生の有無の確認、タマウミヒドラプラヌラ幼生の同定、タマウミヒドラプラヌラ幼生の分離、タマウミヒドラプラヌラ幼生の個体数や量の測定を行うことができるようになるが、検出器や検出キットを用いることにより、より容易にこれらを行うことができるようになる。 As described above, by using the method for detecting Tamaumi hydraplanula larvae according to the present invention, in the sample containing various types of organisms, confirmation of the presence of Tamaumi hydraplanula larvae, Identification, separation of Tamami hydraplanula larvae, measurement of the number and amount of Tamami hydraplanula larvae will be possible, but these can be done more easily by using detectors and detection kits. become able to.
以下に、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. These examples are for explaining the present invention, and do not limit the scope of the present invention.
[実施例１]
本実施例では、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。
[Example 1]
In this example, a hybridoma that produces a monoclonal antibody reactive to Benicida hydra actinula larvae was established.
＝＝ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生の飼育方法＝＝
鹿児島県湾竜ヶ水沿岸に設置された養殖生簀、あるいは、播磨新島ヨットハーバーの浮き桟橋裏面からベニクダウミヒドラ群体を採取した。この群体を海水で洗浄した後、雌雄に選別し、オスとメスを約１：９の割合で水温６〜７℃の海水を有する循環式水槽に収容して孵化直後のアルテミアを与えながら飼育した。適宜、幼生遊出直前のメスポリプを選別し、遊出したアクチヌラ幼生を採取した。回収したアクチヌラ幼生をろ過海水で洗浄した後、１００個体ずつ冷凍保存した。この冷凍幼生を、以下に記載の免疫、ＥＬＩＳＡ用抗原試料として使用した。
== How to raise larvae of Benicida mihydra actinula ==
Benikudaumihydra colony was collected from aquaculture ginger installed on the coast of Ryugamizu Bay, Kagoshima Prefecture, or from the back of the floating pier of Harima Niijima Yacht Harbor. This colony was washed with seawater and then sorted into males and females, and males and females were housed in a circulating water tank having seawater at a water temperature of 6-7 ° C. at a ratio of about 1: 9 and fed with Artemia immediately after hatching. . The female polyps immediately before the larval migration were selected as appropriate, and the activated actinula larvae were collected. The collected actinula larvae were washed with filtered seawater and then stored frozen for 100 individuals. This frozen larva was used as an antigen sample for immunity and ELISA described below.
＝＝ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生によるマウスの免疫＝＝
１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（メス）の腹腔内に抗原（ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生１００〜２００個／３００〜４００μＬのＰＢＳ）を５回注射し、マウスを免疫した。具体的には、１回目の投与から１６８日目に２回目の投与を、２回目の投与から２４日目に３回目の投与を、３回目の投与から２１日目に４回目の投与を、４回目の投与から３９日目に５回目の投与を行った。
== Immunoimmunization of mice by Benicida hydra actinula larvae ==
Ten weeks old BALB / c mice (female) were intraperitoneally injected with antigen (100-200 Benicumumi hydra actinula larvae / 300-400 μL PBS) five times to immunize the mice. Specifically, the second administration on day 168 from the first administration, the third administration on day 24 from the second administration, the fourth administration on day 21 from the third administration, The fifth administration was performed on the 39th day from the fourth administration.
＝＝ハイブリドーマの作製＝＝
（脾臓組織の単離）
最終免疫から４日後に、マウスから脾臓を摘出し、１０％のＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：GIBCO社製）及び１％の抗生物質（Antibiotic-Antimycotic：GIBCO社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（GIBCO社製）培地中で滅菌ステンレスメッシュを用いて裏漉しし、細胞を分散・懸濁させて脾臓細胞を得た。この脾臓細胞を１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ＋培地）で洗浄・遠心した後、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ−培地）で３回遠心・洗浄し、脾臓細胞を回収した。
== Production of hybridoma ==
(Isolation of spleen tissue)
Four days after the final immunization, the spleen was removed from the mouse and RPMI 1640 (GIBCO) containing 10% FBS (Fetal Bovine Serum: GIBCO) and 1% antibiotic (Antibiotic-Antimycotic: GIBCO). Spleen cells were obtained by dispersing and suspending the cells using a sterile stainless mesh in the medium. The spleen cells were washed and centrifuged with RPMI1640 medium (FBS + medium) containing 10% FBS, and then centrifuged and washed three times with RPMI1640 medium (FBS - medium) to collect spleen cells.
（細胞融合とＨＡＴ選択：不活化ウィルス法）
まず、凍結ミエローマ細胞（マウス骨髄癌細胞、Ｐ３Ｕ１）を融解した後、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０で培養し、生存率、増殖性の高い株を選別し、１回移植して融合に備えた。GenomOne-CF（不活化センダイウィルス外膜：HVJ-E、石原産業(株)製）を用いて細胞融合を行った。前述のミエローマ細胞と脾臓細胞を１：２の割合で混合した後、遠心して上清を除去し、細胞ペレット（沈殿）を作製した。これに、氷冷した融合用緩衝液（１倍濃度液）を添加（脾臓細胞１０８細胞あたり１ｍＬ添加）し、細胞群を懸濁させた。氷冷したHVJ-E懸濁液を添加（細胞懸濁液１ｍＬあたり２５μＬを添加）し、氷上で５分間静置した。その後、遠心（４℃、１０００ｒｐｍ×５分間）を行い、３７℃で１５分間インキュベーションした。続いて、ＦＢＳ＋培地（３７℃）１０ｍＬを添加して細胞群を懸濁させた（脾臓細胞１０８細胞／５０ｍＬ）。これを、ＦＢＳ＋培地１０ｍＬが入った分室シャーレ３枚にそれぞれ２ｍＬずつ播種し、ＣＯ２インキュベータ内で静置培養を行った。培養開始から１日後、各シャーレから培地を４ｍＬずつ取り、２×ＨＡＴ培地６ｍＬとconditioned medium ０．３〜０．４ｍＬを各シャーレに添加し（終濃度０．８×ＨＡＴ培地）、ＣＯ２インキュベータ内で静置培養することにより、ＨＡＴ選択培養を行った。
(Cell fusion and HAT selection: inactivated virus method)
First, frozen myeloma cells (mouse bone marrow cancer cells, P3U1) were thawed, cultured in RPMI 1640 containing 10% FBS and 1% antibiotics, and a strain with high survival rate and proliferative properties was selected and transplanted once. Prepared for fusion. Cell fusion was performed using GenomOne-CF (inactivated Sendai virus outer membrane: HVJ-E, manufactured by Ishihara Sangyo Co., Ltd.). The above myeloma cells and spleen cells were mixed at a ratio of 1: 2, and then centrifuged to remove the supernatant to prepare a cell pellet (precipitate). To this was added ice-cold fusion buffer (1 × concentration solution) (added 1 mL per 10 8 spleen cells) to suspend the cell group. Ice-cooled HVJ-E suspension was added (25 μL was added per 1 mL of cell suspension) and allowed to stand on ice for 5 minutes. Thereafter, centrifugation (4 ° C., 1000 rpm × 5 minutes) was performed, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 15 minutes. Subsequently, 10 mL of FBS + medium (37 ° C.) was added to suspend the cell group (spleen cells 10 8 cells / 50 mL). 2 mL each of this was inoculated into 3 laboratory petri dishes containing 10 mL of FBS + medium and static culture was performed in a CO 2 incubator. One day after the start of the culture, 4 mL of the medium is taken from each petri dish, 6 mL of 2 × HAT medium and 0.3 to 0.4 mL of conditioned medium are added to each dish (final concentration 0.8 × HAT medium), and a CO 2 incubator. The HAT selective culture was performed by static culture in the cell.
（ハイブリドーマ細胞のスクリーニング）
ＨＡＴ選択培養開始から４日（融合処理から５日）〜１０日後、各シャーレの各セル内で明瞭な増殖が確認されたハイブリドーマ細胞のコロニーのうち、シングルコロニーを形成しているコロニーをピックアップし、選択増殖培地［１×ＨＴ培地と１０％の細胞増殖因子（conditioned medium from J774A.1 cells、Sigma-aldrich社）を含む］の入った９６穴ウェルプレートに移し、ハイブリドーマの培養を行った。その後、明瞭なハイブリドーマの増殖が確認されたウェルについて、その培養上清を採取し、以下のＥＬＩＳＡ法により抗体の産生を確認した。
(Screening of hybridoma cells)
Four to ten days after the start of HAT selective culture (5 days after the fusion treatment), among colonies of hybridoma cells in which distinct growth was confirmed in each cell of each petri dish, a colony forming a single colony was picked up. Then, the cells were transferred to a 96-well plate containing a selective growth medium [containing 1 × HT medium and 10% cell growth factor (conditioned medium from J774A.1 cells, Sigma-aldrich)], and hybridomas were cultured. Thereafter, the culture supernatant was collected from wells in which the growth of clear hybridomas was confirmed, and antibody production was confirmed by the following ELISA method.
（ＥＬＩＳＡ法）
以下の各工程において、特に記載がない場合は室温にて処理、反応を行った。
（１）ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）を加え、氷中でホモジナイズを行い、５０００ｒｐｍで２０分間遠心することにより得たベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生粗抽出液をタンパク質濃度２０μｇ／ｍＬになるように調製した。
（２）（１）で得られたベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生の粗抽出液５０μＬを、９６穴イワキＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加え、４℃で一晩インキュベートして抗原をウェル底面に吸着させた。
（３）（２）で吸着処理した各ウェルをＴＢＳ（０．５Ｍ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．５）２００μＬで洗浄した。
（４）各ウェルを１％ ＢＳＡを含むＴＢＳ １００μlで１時間ブロッキングした。
（５）各ウェルをＴＴＢＳ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）２００μｌで３回洗浄した。
（６）ハイブリドーマを培養することにより得られた培養上清（一次抗体）５０μＬを各ウェルに加え、２時間反応させた。
（７）各ウェルをＴＴＢＳ ２００μｌで４回洗浄した。
（８）各ウェルに２次抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）ヤギ抗体、BETHYL社）溶液（ＴＢＳで５００倍に希釈した溶液）５０μｌを加えて１時間反応させた。
（９）各ウェルをＴＴＢＳ ２００μｌで５回洗浄した。
（１０）各ウェルに基質（アルカリフォスファターゼ基質キット、BIO-RAD 社）溶液 １００μｌを加え、１時間振盪することにより発色させた。
（11）マイクロプレートリーダー（BIO-RAD Model550）を用いて、各ウェルの溶液の吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。
(ELISA method)
In the following steps, treatment and reaction were performed at room temperature unless otherwise specified.
(1) Benikudaumihydraactinula larvae crude extraction obtained by adding 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) to Benicidaumihydraactinula larvae, homogenizing in ice, and centrifuging at 5000 rpm for 20 minutes The solution was prepared to a protein concentration of 20 μg / mL.
(2) Add 50 µL of the crude extract of Benicida hydra actinula larvae obtained in (1) to each well of a 96-well Iwaki ELISA plate and incubate overnight at 4 ° C to adsorb the antigen to the bottom of the well. It was.
(3) Each well adsorbed in (2) was washed with 200 μL of TBS (0.5 M NaCl and 20 mM Tris-HCl; pH 7.5).
(4) Each well was blocked with 100 μl of TBS containing 1% BSA for 1 hour.
(5) Each well was washed 3 times with 200 μl of TTBS (TBS containing 0.05% Tween 20).
(6) 50 μL of culture supernatant (primary antibody) obtained by culturing the hybridoma was added to each well and allowed to react for 2 hours.
(7) Each well was washed 4 times with 200 μl of TTBS.
(8) A secondary antibody (alkaline phosphatase-labeled anti-mouse IgG (Fc) goat antibody, BETHYL) solution (50 μl) was added to each well and reacted for 1 hour.
(9) Each well was washed 5 times with 200 μl of TTBS.
(10) 100 μl of substrate (alkaline phosphatase substrate kit, BIO-RAD) solution was added to each well, and color was developed by shaking for 1 hour.
(11) The absorbance (405 nm) of the solution in each well was measured using a microplate reader (BIO-RAD Model 550).
上記ＥＬＩＳＡ法により高い抗体産生能が確認されたハイブリドーマについて、２４穴ウェルで２〜５日間培養し、ＥＬＩＳＡ法によりベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生粗抽出液に対して結合性の高い抗体を産生するハイブリドーマ（Ｔ−Ｈ３Ｈ７（１）、Ｔ−Ｈ３Ａ１（６）、Ｔ−Ｈ３Ｇ１０（４）、ＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）、Ｔ−Ｐ２Ｆ１２（７）、ＴＣＡ−Ｈ１Ａ１１（３）、ＴＣＡ−Ｈ２Ｅ１０（１）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｈ１０（１）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｂ５（５）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｂ１０（３））を得た。 The hybridoma whose high antibody-producing ability has been confirmed by the above-mentioned ELISA method is cultured in a 24-well well for 2 to 5 days, and an antibody having a high binding property to the crude extract of Benicida hydra actinula larvae is produced by the ELISA method. Hybridoma (T-H3H7 (1), T-H3A1 (6), T-H3G10 (4), TC-H2D7 (3), T-P2F12 (7), TCA-H1A11 (3), TCA-H2E10 (1) , TCA-H3H10 (1), TCA-H3B5 (5), TCA-H3B10 (3)) were obtained.
[実施例２]
本実施例では、実施例１で得られた１０種のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体について、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生に対する反応性を調べた。
[Example 2]
In this example, for the monoclonal antibodies produced by the 10 hybridomas obtained in Example 1, Benicumida hydraactinula larvae, Tamamihydraplanula larvae, moon jellyfish pranula larvae, red pheasant crisp larvae, copepoda, mussels The reactivity to larvae was examined.
＝＝アカフジツボキプリス幼生の飼育方法＝＝
循環式水槽を用い、アルテミアを給餌してアカフジツボ成体の維持・飼育を行い、定期的に幼生を孵出させた。幼生には培養した浮遊珪藻 Chaetoceros 等を給餌し、キプリス幼生を生産した。
== Raising method of red pheasant cricket larvae ==
Using a circulating water tank, Artemia was fed to maintain and breed adult red barnacles, and the larvae were spawned regularly. The larvae were fed with cultured floating diatom Chaetoceros and produced cypris larvae.
＝＝ムラサキイガイペディベリジャー幼生の飼育方法＝＝
兵庫県姫路市周辺沿岸からムラサキイガイ成体を採取し、やや低温に制御した水槽を用いて維持・飼育し、定期的に放卵・放精させた。媒精後、発生が進行した初期幼生に、培養したハプト藻 Isochrysis 等を給餌することによって人工飼育し、ペディベリジャー幼生を生産した。
== How to raise mussel pediberger larvae ==
Adult mussels were collected from the coastal area around Himeji City, Hyogo Prefecture, maintained and bred using a slightly cool water tank, and regularly ovulated and fertilized. By feeding the cultured haptophyte Isochrysis and the like to the early larvae that developed after the maturation, they were artificially raised to produce pediberger larvae.
＝＝コペポーダの採取方法＝
兵庫県姫路市周辺沿岸から、プランクトンネットを用いてプランクトンを採取した。採取したプランクトンをシャーレ内の海水中に移し、ピペットでコペポーダ類のみ選別採取した。
== How to collect a copyoda =
Plankton was collected from the coast around Himeji City, Hyogo Prefecture using a plankton net. The collected plankton was moved into the sea water in the petri dish, and only the copypods were selected and collected with a pipette.
＝＝タマウミヒドラプラヌラ幼生の飼育方法＝＝
兵庫県東播磨沿岸からタマウミヒドラポリプ群体を採取した後、低温水槽内で維持・飼育し、成熟させた。受精後、胚発生中の雌ポリプ群体を深型シャーレ内の海水中に移し、照明下で静置した。その後、生殖体外へ遊離してきたプラヌラ幼生を口太ピペットで採取し、凍結保存した。
== How to breed Tamami Hydra Planula larva ==
After collecting Tamami Hydra polyp colonies from the Higashi-Harima coast of Hyogo Prefecture, they were maintained and reared in a low-temperature water tank and matured. After fertilization, embryonic female polyps were transferred into seawater in a deep petri dish and allowed to stand under illumination. Thereafter, the planula larvae released to the outside of the reproductive body were collected with a mouth pipette and stored frozen.
＝＝ミズクラゲプラヌラ幼生の飼育方法＝＝
兵庫県姫路市近辺沿岸から成熟雌クラゲ体を採取した。海水を満たした小型プラスチック容器内でクラゲ体を裏返し、保育嚢の縁辺に存在しているプラヌラ幼生を口太ピペットで採取し、凍結保存した。
== How to breed larvae of the moon jellyfish
Mature female jellyfish bodies were collected from the coast near Himeji City, Hyogo Prefecture. The jellyfish body was turned inside out in a small plastic container filled with seawater, and the planula larvae present on the edge of the nursery sac were collected with a mouth pipette and stored frozen.
実施例１のＥＬＩＳＡ法の記載に従い、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液（タンパク質の濃度：２０μｇ/ｍＬ）を調製し、各ハイブリドーマが産生する抗体の、これらの粗抽出液に対する反応性を確認した。なお、小数第一位以上の数値が得られた場合に、反応性があるとした。 According to the description of the ELISA method of Example 1, a crude extract of Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, moon jellyfish planula larvae, red pheasant larvae larvae, copepoda, mussels pea divergence larvae (protein concentration: 20 μg / mL) And the reactivity of the antibody produced by each hybridoma to these crude extracts was confirmed. In addition, when the numerical value more than the decimal place was obtained, it was considered that there was reactivity.
また、各ハイブリドーマが産生する抗体のアイソタイプを、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Roche Applied Science 社）を用いて調べた。 In addition, the isotype of the antibody produced by each hybridoma was examined using a mouse monoclonal antibody isotyping kit (Roche Applied Science).
表１に示すように、Ｔ−Ｈ３Ｈ７（１）、Ｔ−Ｈ３Ａ１（６）、Ｔ−Ｈ３Ｇ１０（４）、及びＴ−Ｐ２Ｆ１２（７）のハイブリドーマの培養上清は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生の粗抽出液に対して反応性を示し、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液には反応性を示さなかった。また、ＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）のハイブリドーマの培養上清は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生の粗抽出液に対して反応性を示し、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液には反応性を示さなかった。ＴＣＡ−Ｈ１Ａ１１（３）のハイブリドーマの培養上清は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の粗抽出液に対して反応を示し、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、及びムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液に対して反応を示さなかった。ＴＣＡ−Ｈ２Ｅ１０（１）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｈ１０（１）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｂ５（５）、及びＴＣＡ−Ｈ３Ｂ１０（３）のハイブリドーマの培養上清は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の粗抽出液、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液に対して反応を示し、アカフジツボキプリス幼生、及びコペポーダの粗抽出液には反応性を示さなかった。 As shown in Table 1, the culture supernatants of hybridomas of T-H3H7 (1), T-H3A1 (6), T-H3G10 (4), and T-P2F12 (7) It was reactive to the crude extract of the larvae, but was not reactive to the crude extracts of Tamamihydraplanula larvae, Moon jellyfish planula larvae, Akafujitsubo Cyprus larvae, Copepoda, and Mussel mussel pediberger larvae. Moreover, the culture supernatant of the hybridoma of TC-H2D7 (3) showed reactivity to the crude extract of Benicida mihydra actinula larvae and Tamaumi hydraplanula larvae, and the jellyfish pranula larvae, red clover crisp larvae, The crude extract of mussel pediberger larvae showed no reactivity. The culture supernatant of the hybridoma of TCA-H1A11 (3) showed a response to the crude extract of Benicumida hydraactinula larvae, Tamaumihydraplanula larvae, and jellyfish prawn larvae. There was no response to the crude extract of mussel pediberger larvae. The culture supernatants of hybridomas of TCA-H2E10 (1), TCA-H3H10 (1), TCA-H3B5 (5), and TCA-H3B10 (3) were benikuda hydra actinula larvae, tamaumihydraplanula larvae, In addition, there was a reaction with the crude extract of the larvae of the jellyfish and the larvae of the jellyfish and the crude extract of the mussel pepedier larvae, but there was no reactivity with the crude extract of the red scallop larvae and the copepod.
つまり、実施例１で得られた、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体を産生する１０種のハイブリドーマのうち、ヒドロ虫綱に属するベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生の両方に反応し、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）のみであった。
以上のように、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応性のあるモノクローナル抗体は、通常ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生のみに反応する（１０種中４種）か、あるいは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生以外にも、タマウミヒドラプラヌラ幼生だけでなく、ミズクラゲプラヌラ幼生やムラサキイガイペディベリジャー幼生にも反応する（１０種中５種）かのいずれかである。つまり、刺胞動物門に属する動物の幼生の間で、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生というヒドロ虫綱の動物幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）のハイブリドーマが得られたことは、当業者であっても容易に予測できるものではない。また、このハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体によって、他種の動物を含む試料の中で、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生を特定することができるという有利な効果を奏する。 As described above, the monoclonal antibody reactive with venicida hydra actinula larvae usually reacts only with venicida hydra actinula larvae (4 species out of 10), or venicida hydra actinula larvae. In addition to larvae, it reacts not only with Tamami hydraplanula larvae, but also with jellyfish planula larvae and purple mussel pediberger larvae (5 of 10 species). In other words, among the larvae of the animals belonging to the cnidaria, TC-H2D7, which produces monoclonal antibodies that specifically react with hydrolarvae larvae such as Benicida hydraactinula larvae and Tamaumihydraplanula larvae ( Even if it is those skilled in the art, it cannot be easily predicted that the hybridoma of 3) was obtained. In addition, the monoclonal antibody produced by this hybridoma has the advantageous effect of being able to identify Benicida hydra actinula larvae and Tamaumi hydraplanula larvae in samples containing other species of animals.
加えて、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に特異的に反応するＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に対し反応性を示し、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に特異的に反応するがタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないＴ−Ｈ３Ｈ７（１）、Ｔ−Ｈ３Ａ１（６）、Ｔ−Ｈ３Ｇ１０（４）、Ｔ−Ｐ２Ｆ１２（７）のいずれかのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に対して反応性を示さない生物を特定することにより、タマウミヒドラプラヌラ幼生を特異的に検出することが可能である。 In addition, the TC-H2D7 (3) hybridoma, which specifically reacts with Benicida hydraactinula larvae and Tamaumihydraplanula larvae, is reactive to the monoclonal antibody produced by Any hybridoma of T-H3H7 (1), T-H3A1 (6), T-H3G10 (4), or T-P2F12 (7) that specifically reacts but does not react with the larvae of T. hydraplanula is produced. By identifying an organism that does not show reactivity with the monoclonal antibody, it is possible to specifically detect Tamaumihydraplanula larvae.
Claims (9)
試料に、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントと、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントとを反応させることを特徴とする方法。 A method for identifying Tamami Hydra Planula larvae, comprising:
In the sample, a monoclonal antibody or fragment thereof that reacts with Benicida hydraactinula larvae and Tamamihydraplanula larvae, and a monoclonal antibody that reacts with Benicida hydraactinula larvae but does not react with Tamamihydraplanula larvae Reacting the fragment.
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする方法。 A method for identifying a Tamami hydraplanula larva as claimed in claim 1,
The monoclonal antibody produced by the hybridoma deposited under the accession number FERM P-21904, wherein the monoclonal antibody that reacts with the larvae of Benicum hydra actinula and the larvae of Tamaumi hydraplanula.
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする方法。 A method for identifying a Tamami hydraplanula larva as claimed in claim 2,
A hybridoma deposited with the accession number FERM P-21906, a monoclonal antibody deposited with the accession number FERM P-21903, wherein the monoclonal antibody reacts with the larvae of Benicumumi hydraactinula and does not react with the larvae of T. hydraplanula. A monoclonal antibody produced by either the hybridoma deposited under accession number FERM P-21905 or the hybridoma deposited under accession number FERM P-21907.
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含有することを特徴とする検出用試薬。 A detection reagent that specifically detects Tamaumi hydraplanula larvae,
A monoclonal antibody or a fragment thereof that reacts with the larvae of Benicumida hydraactinula or a fragment thereof, and a monoclonal antibody or a fragment thereof that reacts with the larvae of the A reagent for detection characterized by containing.
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする検出用試薬。 A detection reagent for specifically detecting the Tamamihydraplanula larvae according to claim 4,
The monoclonal antibody that reacts with the venicida hydraactinula larvae and tamaumihydraplanula larvae is a monoclonal antibody produced by a hybridoma deposited under accession number FERM P-21904,
A hybridoma deposited with the accession number FERM P-21906, a monoclonal antibody deposited with the accession number FERM P-21903, wherein the monoclonal antibody reacts with the larvae of Benicumumi hydraactinula and does not react with the larvae of T. hydraplanula. A detection reagent, which is a monoclonal antibody produced by either the hybridoma deposited under accession number FERM P-21905 or the hybridoma deposited under accession number FERM P-21907.
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化されていることを特徴とする検出器。 A detector that specifically detects larvae of Tamamihydra,
A monoclonal antibody or a fragment thereof that reacts with the larvae of Benicumida hydraactinula or a fragment thereof, and a monoclonal antibody or a fragment thereof that reacts with the larvae of the A detector characterized by being fixed.
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする検出器。 A detector for specifically detecting a larva of Tamamihydraplanula according to claim 6,
The monoclonal antibody that reacts with the venicida hydraactinula larvae and tamaumihydraplanula larvae is a monoclonal antibody produced by a hybridoma deposited under accession number FERM P-21904,
A hybridoma deposited with the accession number FERM P-21906, a monoclonal antibody deposited with the accession number FERM P-21903, wherein the monoclonal antibody reacts with the larvae of Benicumumi hydraactinula and does not react with the larvae of T. hydraplanula. And a monoclonal antibody produced by either the hybridoma deposited under accession number FERM P-21905 or the hybridoma deposited under accession number FERM P-21907.
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含有することを特徴とする検出キット。 A detection kit for specifically detecting Tamami hydraplanula larvae,
A monoclonal antibody or a fragment thereof that reacts with the larvae of Benicumida hydraactinula or a fragment thereof, and a monoclonal antibody or a fragment thereof that reacts with the larvae of the A detection kit comprising:
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０４で寄託されているハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であり、
前記ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応し、タマウミヒドラプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０３で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０６で寄託されているハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０５で寄託されているハイブリドーマ、あるいは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９０７で寄託されているハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とする検出キット。 A detection kit for specifically detecting larva of Tamami Hydraplanula according to claim 8,
The monoclonal antibody that reacts with the venicida hydraactinula larvae and tamaumihydraplanula larvae is a monoclonal antibody produced by a hybridoma deposited under accession number FERM P-21904,
A hybridoma deposited with the accession number FERM P-21906, a monoclonal antibody deposited with the accession number FERM P-21903, wherein the monoclonal antibody reacts with the larvae of Benicumumi hydraactinula and does not react with the larvae of T. hydraplanula. A detection kit, which is a monoclonal antibody produced by either the hybridoma deposited under accession number FERM P-21905 or the hybridoma deposited under accession number FERM P-21907.
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