JP5474860B2 - Monoclonal antibodies specific to Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae - Google Patents
Monoclonal antibodies specific to Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae Download PDFInfo
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Description
本発明は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマまたはその作製方法、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に特異的なモノクローナル抗体またはそのフラグメント、並びに、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の検出方法、検出用試薬、検出キット、及び検出器に関する。 The present invention relates to a hybridoma that produces a monoclonal antibody specific to Benikudaumihydra actinula larvae, Tamamihydraplanula larvae, and moon jellyfish planan larvae, or a method for producing the same, Benicida hydraactinula larvae, , And a monoclonal antibody or fragment thereof specific to jellyfish planula larvae, as well as a detection method, a detection reagent, a detection kit, and a detector of Benicumumi hydraactinula larvae, Tamaumi hydraplanula larvae, .
一般に、火力発電所や原子力発電所には、タービンを駆動するのに使用した蒸気を冷やすため、蒸気と海水との間で熱交換を行わせる復水器が備えられている。この熱交換に使用する海水の取水の際に、海水に生息するヒドロ虫やミズクラゲ等の付着生物が流入し、取水路や配管に付着し、プラントの正常稼働を妨げるという問題が知られる。 In general, thermal power plants and nuclear power plants are provided with condensers that exchange heat between the steam and seawater in order to cool the steam used to drive the turbine. During the intake of seawater used for this heat exchange, there is a problem that adhering organisms such as hydroworms and moon jellyfish that inhabit the seawater flow in and adhere to intake channels and piping, preventing normal operation of the plant.
取水のための海域における付着生物の来襲、発生状況、プラントへの流入状況、発電所プラント内での付着状況を確認したり、これらの付着生物の種類を特定したりできれば、効率的な防除のタイミングや、付着生物種にあった防除方法を設定することができる。 If it is possible to confirm the invasion of adhering organisms in the sea area for water intake, the occurrence status, the inflow status to the plant, the adhering status in the power plant, and the type of these adhering organisms, efficient control The timing and the control method suitable for the attached species can be set.
ヒドロ虫綱生物の幼生やクラゲ類の幼生は、特に頻繁に発電所に流入して被害をもたらしている。しかしながら、これらの生物を特定できる抗体として、ヒドロ虫綱の蛍光タンパク質に特異的に結合する抗体が知られているのみであり（特許文献１参照）、ヒドロ中綱生物の幼生とクラゲ類の幼生に特異的に結合する抗体は開発されていなかった。 Hydrozoa larvae and jellyfish larvae flow into power plants, causing damage. However, as antibodies that can identify these organisms, only antibodies that specifically bind to the fluorescent protein of the hydrozoa are known (see Patent Document 1), and larvae of hydromedium and jellyfish larvae are known. Antibodies that specifically bind to have not been developed.
本発明は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマまたはその作製方法、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に特異的なモノクローナル抗体またはそのフラグメント、並びに、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の検出方法、検出用試薬、検出キット、及び検出器を提供することを目的とする。 The present invention relates to a hybridoma that produces a monoclonal antibody specific to Benikudaumihydra actinula larvae, Tamamihydraplanula larvae, and moon jellyfish planan larvae, or a method for producing the same, Benicida hydraactinula larvae, And a monoclonal antibody or fragment thereof specific for jellyfish planula larvae, as well as a detection method, a detection reagent, a detection kit, and a detector for Benikudaumihydraactinula larvae, Tamaumihydraplanula larvae, The purpose is to provide.
本発明者らは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生で免疫したマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合することにより得られたハイブリドーマをスクリーニングしたところ、多くの場合、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生で免疫していることから予想されるように、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生のみに反応するモノクローナル抗体か、または、幼生の構造が似ているように、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生、ムラサキイガイペディベリジャー幼生にも反応するモノクローナル抗体しか得られなかった。しかしながら、本発明者らは、頻度は少ないながらも、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応を示すが、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、及びムラサキイガイペディベリジャー幼生には反応を示さないモノクローナル抗体を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors screened a hybridoma obtained by fusing a spleen cell of a mouse immunized with Benicida hydra actinula larvae and a mouse myeloma cell. In many cases, the hydrangea hydra actinula larvae were screened. As expected from the immunization, either a monoclonal antibody that reacts only with the larvae of Benicaria hydraactinula, or the larvae of the Only monoclonal antibodies that react with hydraplanula larvae, jellyfish prawn larvae, and mussel pediberger larvae were obtained. However, the present inventors, although less frequently, respond to benikuda hydraactinula larvae, tamaumihydraplanula larvae, and moon jellyfish pranula larvae. Found that a monoclonal antibody showing no reaction can be obtained, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応し、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、及びムラサキイガイペディベリジャー幼生には反応しないことを特徴とする。 That is, the monoclonal antibody according to the present invention or a fragment thereof reacts with Benicida hydraactinula larvae, Tamaumi hydraplanula larvae, and moon jellyfish pranula larvae, but does not react with red pheasant cyprips larvae, copepoda larvae, It is characterized by that.
本発明に係るハイブリドーマは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応し、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、及びムラサキイガイペディベリジャー幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生することを特徴とする。ここで、本発明に係るハイブリドーマは、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９１９で寄託されているハイブリドーマであることが好ましい。 The hybridoma according to the present invention produces a monoclonal antibody that reacts with the larvae of Benicumida hydraactinula, Tamamihydraplanula larvae, and jellyfish planula larvae, but does not react with the red scallop larvae, the copepoda, and the blue mussel pediberger larvae. It is characterized by. Here, the hybridoma according to the present invention is preferably a hybridoma deposited under the accession number FERM P-21919.
本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９１９で寄託されているハイブリドーマから産生されることを特徴とするモノクローナル抗体またはそのフラグメントであることが好ましい。 The monoclonal antibody or a fragment thereof according to the present invention is preferably a monoclonal antibody or a fragment thereof characterized by being produced from a hybridoma deposited under accession number FERM P-21919.
本発明に係る検出用試薬は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生を特異的に検出するための検出用試薬であって、本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントのいずれかを含むことを特徴とする。 The detection reagent according to the present invention is a detection reagent for specifically detecting Benicida mihydra actinula larvae, Tamaumi hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae, the monoclonal antibody according to the present invention or It is characterized by containing any of the fragments.
本発明に係る検出キットは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生を特異的に検出するための検出キットであって、本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントのいずれかを含むことを特徴とする。 The detection kit according to the present invention is a detection kit for specifically detecting venicida hydraactinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae, the monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention. One of them is included.
本発明に係る検出器は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生を特異的に検出するための検出器であって、本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントのいずれかが固定化されていることを特徴とする。 The detector according to the present invention is a detector for specifically detecting venicida hydraactinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae, the monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention. One of them is fixed.
本発明によれば、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に特異的な反応性を示すモノクローナル抗体またはそのフラグメント、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、並びに、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の検出方法、検出用試薬、検出器、検出キットを提供することができる。 According to the present invention, a monoclonal antibody or a fragment thereof showing specific reactivity to Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae, a hybridoma producing the monoclonal antibody, and Benicuda It is possible to provide a detection method, a detection reagent, a detector, and a detection kit for Umihydra actinula larvae, Tamaumihydraplanula larvae, and Moon jellyfish planula larvae.
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention completed based on the above knowledge will be described in detail with reference to examples.
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。 Unless otherwise stated in the embodiments and examples, J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. The method described in the protocol collection, or a modified or modified method thereof is used. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them are used.
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。 The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. it can. The embodiments and specific examples of the invention described below show preferred embodiments of the present invention, and are shown for illustration or explanation. It is not limited. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.
＝＝モノクローナル抗体またはそのフラグメント＝＝
本発明に係るモノクローナル抗体は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応し、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生には反応しないものであれば特に制限されるものではない。
== Monoclonal antibody or fragment thereof ==
The monoclonal antibody according to the present invention is not particularly limited as long as it reacts with the larvae of Benicowida hydraactinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish pranulas larvae, but does not react with red pheasant cyprips larvae, coppoda, mussel peedier larvae. Is not to be done.
本発明に係るフラグメントとしては、前述のモノクローナル抗体の一部からなり、可変領域を含む抗原結合部位であれば特に制限されるものではないが、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等を用いることができる。これらのフラグメントは、例えば、前述のモノクローナル抗体をタンパク質分解酵素によって部分消化することにより得ることができる。なお、タンパク質分解酵素としては、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントを得ることができるものであればどのようなものであってもよいが、例えば、ペプシン、フィシン等の分解酵素を用いることができる。 The fragment according to the present invention is not particularly limited as long as it is an antigen-binding site comprising a part of the aforementioned monoclonal antibody and including a variable region. For example, Fab fragment, F (ab ′) 2 fragment, etc. Can be used. These fragments can be obtained, for example, by partially digesting the aforementioned monoclonal antibody with a proteolytic enzyme. Any proteolytic enzyme may be used as long as it can obtain a Fab fragment or F (ab ′) 2 fragment. For example, a protease such as pepsin or ficin may be used. Can do.
＝＝モノクローナル抗体製造方法＝＝
本発明に係るモノクローナル抗体は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生に反応し、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生には反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（以下、「本発明に係るハイブリドーマ」と称する）から得ることができる。
== Method for producing monoclonal antibody ==
The monoclonal antibody according to the present invention is a hybridoma that produces a monoclonal antibody that reacts with the larvae of Benicumida hydraactinula, Tamaumihydraplanula larvae, jellyfish pranular larvae, and does not react with red scallop larvae, coppoda, mussel pediberger larvae ( (Hereinafter referred to as “hybridoma according to the present invention”).
本発明に係るハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の製造は、常法に従って行うことができる。例えば、該ハイブリドーマを適当な培養培地で培養し、培養上清を回収することにより行ってもよいが、前述のハイブリドーマを哺乳類動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サル等）の腹腔内に投与し、腹水を回収することにより行ってもよい。なお、モノクローナル抗体の精製は、前述のハイブリドーマの培養上清または培養したハイブリドーマを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物、または前述のハイブリドーマを腹腔内に投与した哺乳類動物から採取した腹水を、常法、例えば、硫安塩析、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィー等）、ゲル濾過等の方法、またはこれらの方法を適宜組み合わせた方法により行うことができる。 Production of a monoclonal antibody using the hybridoma according to the present invention can be performed according to a conventional method. For example, the hybridoma may be cultured in an appropriate culture medium, and the culture supernatant may be collected. The hybridoma described above may be used in mammals (eg, mouse, rat, hamster, rabbit, pig, cow, horse, It may be carried out by intraperitoneal administration of dogs, monkeys, etc.) and collecting ascites. In addition, the purification of the monoclonal antibody is performed by using the culture supernatant of the hybridoma or the lysate obtained by treating the cultured hybridoma with an ultrasonic device, a homogenizer, or the ascites collected from a mammal administered intraperitoneally with the hybridoma. It can be performed by a conventional method, for example, ammonium sulfate salting out, chromatography (for example, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc.), gel filtration, or a combination of these methods.
前述のハイブリドーマとしては、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおいて受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９１９で寄託されている細胞株ＴＣＡ−Ｈ１Ａ１１（３）を用いることができる。 As the above hybridoma, for example, the cell line TCA-H1A11 (3) deposited under the accession number FERM P-21919 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology can be used.
＝＝ハイブリドーマの作製＝＝
本発明に係るハイブリドーマは、常法により作製することができる。以下に一例を示す。
== Production of hybridoma ==
The hybridoma according to the present invention can be prepared by a conventional method. An example is shown below.
まず、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはその粗抽出液、タマウミヒドラプラヌラ幼生またはその粗抽出液、あるいは、ミズクラゲプラヌラ幼生またはその粗抽出液を抗原として用い、適当な量の抗原をマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サル等の哺乳動物の静脈内、皮下、腹腔内等に１〜複数回投与して免疫する。その際、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、あるいは、ミズクラゲプラヌラ幼生のいずれかのみを抗原として用いても、これらのうち２種類以上を抗原として用いてもよい。また、免疫にアジュバントを使用してもよい。 First, Benicida hydraactinula larvae or crude extract thereof, Tamamihydraplanula larvae or crude extract thereof, or jellyfish planula larvae or crude extract thereof are used as antigens, and an appropriate amount of antigen is used in mice, rats. Immunization is carried out once or multiple times by intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, etc. of mammals such as hamsters, rabbits, pigs, cows, horses, dogs and monkeys. At that time, either Benikudaumihydraactinula larvae, Tamamihydraplanula larvae, or moon jellyfish planula larvae may be used as antigens, or two or more of them may be used as antigens. An adjuvant may be used for immunization.
その後、免疫した動物から抗体産生細胞を採取し、採取した抗体産生細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合させてハイブリドーマを作製する。得られたハイブリドーマの中で、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生に反応を示すが、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生には反応性を示さないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選定することにより、本発明に係るハイブリドーマを得ることができる。この方法によると、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生のいずれかを抗原として用いるだけで、これら３種類の生物種に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。 Thereafter, antibody-producing cells are collected from the immunized animal, and the collected antibody-producing cells and myeloma cells (myeloma cells) are fused to produce a hybridoma. Among the obtained hybridomas, a monoclonal antibody that reacts with the larvae of Benicumida hydraactinula, Tamaumihydraplanula larvae, and moon jellyfish larvae, but does not react with red pheasant larvae, coppoda, and mussel peedier larvae The hybridoma according to the present invention can be obtained by selecting a hybridoma that produces s. According to this method, a hybridoma that produces monoclonal antibodies specific for these three species can be obtained by using any one of Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae as antigens. Can be obtained.
前記抗体産生細胞とミエローマ細胞は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等の細胞融合促進剤を用いて細胞融合することができるが、エレクトロポレーション等の電気刺激を利用して細胞融合することもできる。なお、細胞融合の効率を高めるために、ジメチルスルホキシドやレシチン等の補助剤を培養培地に含ませてもよい。 The antibody-producing cells and myeloma cells can be fused with a cell fusion promoter such as polyethylene glycol (PEG) or Sendai virus (HVJ), for example, using electrical stimulation such as electroporation. Cell fusion is also possible. In order to increase the efficiency of cell fusion, adjuvants such as dimethyl sulfoxide and lecithin may be included in the culture medium.
前記抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等を用いることができる。これらの細胞は、動物から脾臓、リンパ節、胸腺、または末梢血を摘出し、摘出した組織を破砕、濾過、遠心分離等することにより得ることができる。また、前記ミエローマ細胞としては、各種動物由来の細胞株を用いてもよいが、それ自身薬剤に対して抵抗性を示さないが、融合すると薬剤に対して抵抗性を示す細胞株を用いることが好ましい。これにより、細胞融合した後、薬剤を添加した培養培地（例えば、ＨＡＴ培地等）で培養することにより、細胞融合によって得られたハイブリドーマの選択が容易となる。なお、融合させる抗体産生細胞とミエローマ細胞は、同種の動物由来の細胞を用いることが望ましいが、異なる種の動物由来の細胞を用いてもよい。 Examples of the antibody-producing cells that can be used include spleen cells, lymph node cells, thymocytes, and peripheral blood cells. These cells can be obtained by removing spleen, lymph nodes, thymus, or peripheral blood from an animal, and crushing, filtering, centrifuging, etc. the removed tissue. In addition, as the myeloma cells, cell lines derived from various animals may be used. However, cell lines that do not themselves show resistance to drugs but that are resistant to drugs when fused may be used. preferable. Thereby, after cell fusion, selection of a hybridoma obtained by cell fusion is facilitated by culturing in a culture medium (for example, HAT medium) to which a drug is added. The antibody-producing cells and myeloma cells to be fused are preferably cells derived from the same species, but cells derived from animals of different species may be used.
前述のハイブリドーマの選定は、常法のスクリーニングやクローニングにより行うことができる。ハイブリドーマのスクリーニングには、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Enzyme Immunoassay、ＥＬＩＳＡ：Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ：Radio Immuno Assay）、ウエスタンブロッティング等を用いることができ、ハイブリドーマのクローニングには、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等を用いることができる。本発明に係るハイブリドーマの選定において、上記スクリーニング及びクローニングを繰り返し行うことにより、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはその粗抽出液、タマウミヒドラプラヌラ幼生またはその粗抽出液、及びミズクラゲプラヌラ幼生またはその粗抽出液に対して特異性の高いモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することが可能となる。 The aforementioned hybridoma can be selected by routine screening or cloning. For screening of hybridomas, for example, enzyme immunoassay (EIA: Enzyme Immunoassay, ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), radioimmunoassay (RIA: Radio Immuno Assay), Western blotting, etc. can be used. For cloning, for example, a limiting dilution method, a soft agar method, a fibrin gel method, a fluorescence excitation cell sorter method, or the like can be used. In the selection of the hybridoma according to the present invention, by repeating the above screening and cloning, the oyster hydra actinula larvae or the crude extract thereof, the Tamaumi hydraplanula larvae or the crude extract thereof, and the moon jellyfish planula larvae or the crude extract thereof are obtained. It is possible to select a hybridoma that produces a monoclonal antibody having high specificity for the extract.
なお、ハイブリドーマのスクリーニングでは、最低限ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはその粗抽出液、タマウミヒドラプラヌラ幼生またはその粗抽出液、ミズクラゲプラヌラ幼生またはその粗抽出液、アカフジツボキプリス幼生またはその粗抽出液、コペポーダまたはその粗抽出液、及びムラサキイガイペディベリジャー幼生またはその粗抽出液との反応性を調べればよいが、これら以外のフジツボ類幼生やイガイ類幼生等の生物、またはその粗抽出液に対する反応性を調べてもよい。これにより、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはその粗抽出液、タマウミヒドラプラヌラ幼生またはその粗抽出液、及びミズクラゲプラヌラ幼生またはその粗抽出液に対してより特異性の高いモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。特に、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生と生息域が重複するために、これらの生物種と一緒に試料中に含まれる可能性の高い生物の幼生やプランクトンに対する反応性を調べることにより、様々な種の幼生またはプランクトンを含む試料（例えば、海水等）中からベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生をより特異的に検出できるようになる。すなわち、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の存在の有無の確認、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の同定、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の個体数や量の測定をより正確に行うことができるようになる。また、火力発電所や原子力発電所等の臨海プラント及び沿岸水産設備の周辺海域や取水口付近におけるベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の襲来、発生、残存状況を容易に把握・推定することが可能となるため、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生、及びこれらの生物の成体による被害の抑制化が可能となる。 In hybridoma screening, at least Benicida hydra actinula larvae or a crude extract thereof, Tamami hydraplanula larvae or a crude extract thereof, jellyfish planula larvae or a crude extract thereof, Akafutsubo Cyprus larvae or a crude extract thereof. , Coppoda or its crude extract, and mussel pediberger larva or its reactivity with crude extract, but other species such as barnacle larvae and mussel larvae, or their reactivity to crude extract May be examined. Thus, a hybridoma that produces a monoclonal antibody having a higher specificity to Benicida hydra actinula larvae or a crude extract thereof, Tamamihydra planula larvae or a crude extract thereof, and a moon jellyfish planula larvae or a crude extract thereof. Can be obtained. In particular, the larvae and plankton of organisms that are likely to be included in the sample together with these species due to the overlap of the habitat with Benicida hydraactinula larvae, Tamaumi hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae Species of larvae of various species or samples containing plankton (for example, seawater, etc.) for more specific detection of Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae become able to. That is, confirmation of the presence of Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planan larvae, identification of Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae, Benicuda It becomes possible to more accurately measure the number and amount of Umihydra actinula larvae, Tamaumihydraplanula larvae, and Moon jellyfish Planula larvae. Invasion, occurrence, and survival of Benikuda Hydra actinula larvae, Tamaumi hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae in the vicinity of waterfront plants and coastal fisheries facilities such as thermal power plants and nuclear power plants and in the vicinity of intakes Therefore, it is possible to suppress damage caused by adults of Benikudaumihydraactinula larvae, Tamaumihydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae, and adults of these organisms.
＝＝モノクローナル抗体またはそのフラグメントの使用＝＝
本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応し、アカフジツボキプリス幼生、ムラサキイガイペディベリジャー幼生、及びコペポーダには反応しない。従って、様々な種類の生物が含まれる試料において、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生を特異的に回収したり、検出したりするのに有用である。
== Use of monoclonal antibodies or fragments thereof ==
The monoclonal antibody according to the present invention or a fragment thereof reacts with Benicida hydraactinula larvae, Tamamihydraplanula larvae, and moon jellyfish planan larvae, but does not react with red scallop larvae, blue mussel pediberger larvae, and copepoda. Therefore, it is useful for specifically recovering and detecting Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae in samples containing various kinds of organisms.
ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の回収は、モノクローナル抗体またはそのフラグメントとの親和性を利用して行うことができる。例えば、磁性体などの担体を結合させた本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントをベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、またはミズクラゲプラヌラ幼生に作用させ、その後、磁石などを用いて担体を回収することにより行うことができる。なお、前記磁性体としては、例えば、鉄、酸化鉄等を用いることができる。その他、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の回収において、ＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorting）、ｐａｎｎｉｎｇ等の方法を用いてもよい。 The recovery of Benicumida hydraactinula larvae, Tamaumihydraplanula larvae, and moon jellyfish pranula larvae can be performed by utilizing the affinity with the monoclonal antibody or a fragment thereof. For example, the monoclonal antibody according to the present invention or a fragment thereof to which a carrier such as a magnetic substance is bound is allowed to act on venicida hydraactinula larvae, Tamaumi hydraplanula larvae, or moon jellyfish planula larvae, and thereafter using a magnet or the like. This can be done by recovering the carrier. In addition, as said magnetic body, iron, iron oxide, etc. can be used, for example. In addition, methods such as FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting), panning, etc. may be used in the collection of Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae.
本発明に係るベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の検出は、試料（例えば、海水若しくは川水またはそれを超音波装置、ホモジナイザー等で処理した溶解物等）に、本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントを加えて試料中のベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生由来の抗原と反応させることにより、その抗原を同定することにより行うことができる。 According to the present invention, the detection of Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae is carried out using a sample (for example, seawater or river water or a lysate obtained by treating it with an ultrasonic device, a homogenizer, or the like). In addition, a monoclonal antibody according to the present invention or a fragment thereof can be added to react with an antigen derived from Benicida hydra actinula larvae or Tamami hydraplanula larvae in the sample, thereby identifying the antigen. .
従って、本発明に係る抗体またはそのフラグメントを含む試薬、キット、及び器具は、それぞれベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の検出用試薬、検出キット、及び検出器として利用可能である。 Therefore, the reagent, kit, and instrument containing the antibody or fragment thereof according to the present invention are respectively a reagent, a detection kit, and a detector for detecting Benicumumi hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae. Is available as
なお、本発明に係るベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の検出用試薬は、本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含むものであればどのようなものでもよく、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質等）、安定剤（例えば、ＢＳＡ、ヤギ血清等）等の、抗体またはそのフラグメント以外に抗原の検出用試薬に含ませる一般的な物質が１または２以上、さらに含まれていてもよい。 It should be noted that the detection reagent for Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae according to the present invention may be any as long as it contains the monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention. Well, for example, a buffer solution (for example, a salt solution such as phosphate, carbonate, hydrochloride), a preservative (for example, sodium azide, etc.), a substance for suppressing a non-specific reaction (for example, Block ace, gelatin, skim milk, etc.), substances (for example, labeling substances), stabilizers necessary to detect fenic hydra actinula larvae, Tamaumi hydraplanula larvae, and jellyfish pranula larvae by immunological techniques (Eg BSA, goat serum, etc.) Substance one or more may be further included.
本発明に係るベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の検出器は、本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントが媒体（例えば、濾紙等の紙、ガラス、繊維、ニトロセルロース等の変性セルロース、ナイロン、プラスチック等から成るフィルター、メンブレン、プレート、ディッシュ等）に固定化されているものを含めばどのようなものでもよく、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質、発色基質、二次抗体、発色増強剤等）、安定剤（例えば、ＢＳＡ、ヤギ血清等）等の、抗体またはそのフラグメント以外に抗原の検出器に含ませる一般的な物質が１または２以上、さらに含まれていてもよい。 According to the present invention, the detector of the venicida hydraactinula larvae, the tumulus hydraplanula larvae, and the moon jellyfish planula larvae is a medium (for example, paper such as filter paper, glass, fiber, Any material may be used as long as it is fixed to a modified cellulose such as nitrocellulose, a filter made of nylon, plastic, membrane, plate, dish, etc. For example, a buffer solution (for example, phosphate, Solutions of carbonates, hydrochlorides and other salts), preservatives (eg sodium azide, etc.), substances for inhibiting non-specific reactions (eg block ace, gelatin, skim milk, etc.), immunological techniques Benicum hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish In addition to antibodies or fragments thereof such as substances necessary for detecting larvae (eg, labeling substances, chromogenic substrates, secondary antibodies, chromogenic enhancers, etc.), stabilizers (eg, BSA, goat serum, etc.) One or more general substances to be included in the detector may be further included.
本発明に係るベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の検出器の一例としては、試料を滴下する部分または試料を浸す第一の部分と、本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化された第二の部分と、本発明に係るモノクローナル抗体が産生されたホストの動物種の免疫グロブリンに特異的に反応する抗免疫グロブリン抗体等が固定化された第三の部分を有し、第二の部分が第一の部分と第三の部分との間に備えられ、第一の部分には、金属コロイド粒子（例えば、金コロイド粒子等）、重金属（例えば、金、白金等）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ローダミン、ファロイジン等）、着色ラテックス粒子等の標識物質で標識された、本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含むクロマトグラフ媒体を挙げることができる。前記クロマトグラフ媒体としては、例えば、ガラスやシリカ等の無機繊維からなる濾紙、ニトロセルロース等の変性セルロース等を用いることができる。このようなクロマトグラフ媒体を用いることにより、試料中にベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、またはミズクラゲプラヌラ幼生が存在するかどうかを検出することが可能になる。 Examples of the detectors of Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae according to the present invention include a part for dripping a sample or a first part for immersing a sample, and a monoclonal according to the present invention. A second portion on which the antibody or fragment thereof is immobilized, and a third portion on which an anti-immunoglobulin antibody or the like that specifically reacts with the immunoglobulin of the host animal species from which the monoclonal antibody according to the present invention is produced is immobilized. The second part is provided between the first part and the third part, and the first part includes metal colloid particles (for example, gold colloid particles), heavy metal (for example, Gold, platinum, etc.), fluorescent substances (eg, FITC (fluorescein isothiocyanate), rhodamine, phalloidin, etc.), labeling substances such as colored latex particles Are identified, it may be mentioned chromatographic medium containing a monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention. Examples of the chromatographic medium include filter paper made of inorganic fibers such as glass and silica, and modified cellulose such as nitrocellulose. By using such a chromatographic medium, it is possible to detect whether Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, or moon jellyfish planula larvae are present in the sample.
その原理としては、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、若しくはミズクラゲプラヌラ幼生またはその溶解物を含む試料をクロマトグラフ媒体の第一の部分に滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、試料中のベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、若しくはミズクラゲプラヌラ幼生またはその溶解物は、第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントと反応して複合体を形成し、液が媒体中を広がるのを利用して、その複合体は第二の部分へと移動し、第二の部分において固定化された前述のモノクローナル抗体またはそのフラグメントに捕捉されてその位置で標識物質によりベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の検出が可能となる。第一の部分からくるフリーの抗体は、第三の部分へと移動し、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分で発色が生じる。この第三の部分での発色は、検出の陽性対照となる。これに対して、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生由来の抗原、タマウミヒドラプラヌラ幼生由来の抗原、ミズクラゲプラヌラ幼生由来の抗原のいずれも含まない試料を第一の部分に滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントが、第二の部分を素通りして第三の部分へと移動し、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分でのみ発色が生じる。このように、第二の部分にシグナルが現れたか否かによって、試料中にベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、またはミズクラゲプラヌラ幼生が存在するかどうかを判定することが可能となる。 The principle is that a sample containing Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, or moon jellyfish planula larvae or lysates thereof is dropped into the first part of the chromatographic medium, or the first part is added to the sample. Or the lysate of jellyfish hydraplanula larvae, sun hydraplanula larvae, or jellyfish planula larvae or lysates thereof in the sample react with the labeled monoclonal antibody or fragment thereof contained in the first part. The complex is formed, and the complex spreads in the medium. The complex moves to the second part and is captured by the monoclonal antibody or the fragment immobilized on the second part. Benicum hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula by the labeling substance at that position Raw, and it is possible to detect Aurelia plastic Marne-la-larvae. The free antibody coming from the first part moves to the third part and is captured by the anti-immunoglobulin antibody immobilized in the third part, and color development occurs in the third part. This color development in the third part serves as a positive control for detection. On the other hand, a sample containing none of the antigen derived from Benicida hydra actinula larvae, the antigen derived from Tamami hydraplanula larvae, or the antigen derived from moon jellyfish planan larvae was dropped on the first part, When one part is soaked, the labeled monoclonal antibody or fragment thereof contained in the first part moves through the second part to the third part and is immobilized in the third part. Captured by the anti-immunoglobulin antibody, color development occurs only in the third part. In this way, it is possible to determine whether or not there is a Benicida hydra actinula larvae, Tamaumi hydraplanula larvae, or moon jellyfish planula larvae depending on whether or not a signal appears in the second part. Become.
一方、本発明に係るベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の検出キットは、本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含むものであればどのようなものでもよく、本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメント以外に、例えば、緩衝液（例えば、リン酸塩、炭酸塩、塩酸塩等の塩の溶液）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、非特異的な反応を抑制するための物質（例えば、ブロックエース、ゼラチン、スキムミルク等）、免疫学的手法によりベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生を検出するのに必要な物質（例えば、標識物質、発色基質、二次抗体、発色増強剤等）、安定剤（例えば、ＢＳＡ、ヤギ血清等）等の抗原の検出キットに含ませる一般的な物質、若しくは前述のような本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントが媒体に固定化されている検出器、またはこれらのうち２以上を組み合わせたものが含まれていてもよい。 On the other hand, the detection kit for Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae according to the present invention may be any one as long as it contains the monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention. In addition to the monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention, for example, a buffer (for example, a solution of a salt such as phosphate, carbonate, hydrochloride), a preservative (for example, sodium azide), non-specific Necessary to detect substances (eg, block ace, gelatin, skim milk, etc.), immunogenic techniques, and larvae of victorium hydraactinula larvae, tamamihydraplanula larvae, and jellyfish prura larvae Substance (for example, labeling substance, coloring substrate, secondary antibody, coloring enhancer, etc.), stabilizer (for example, BSA, goat serum, etc.) such as a general substance to be included in an antigen detection kit, or a detector in which the monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention as described above is immobilized on a medium, or two of these detectors What combined the above may be contained.
また、本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、異なる結合性を有する抗体と組み合わせて使用したり、検出用試薬、検出器、検出キットとしたりしてもよい。 Further, the monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention may be used in combination with antibodies having different binding properties, or may be used as a detection reagent, detector, or detection kit.
例えば、本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントと、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応を示すがミズクラゲプラヌラ幼生には反応を示さないモノクローナル抗体またはそのフラグメントとを、それぞれ異なる蛍光波長を有する蛍光色素で標識し、ミズクラゲプラヌラ幼生を含む試料に作用させる。この際、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応するがミズクラゲプラヌラ幼生には反応しないモノクローナル抗体またはそのフラグメントには反応を示さないが、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントには反応を示す生物を、ミズクラゲプラヌラ幼生と特定することができる。 For example, a monoclonal antibody according to the present invention or a fragment thereof, and a monoclonal antibody or a fragment thereof that reacts with Benicida hydraactinula larvae and Tamaumihydraplanula larvae but does not react with moon jellyfish planula larvae, respectively. Label with fluorescent dyes with different fluorescence wavelengths and act on samples containing moon jellyfish planula larvae. At this time, although it does not react with a monoclonal antibody or a fragment thereof that reacts with the larvae of Benicumida hydraactinula and the larvae of Tamamihydrauranu but does not react with the jellyfish larva larvae, The organism that reacts with the hydraplanula larvae and the monoclonal antibody or fragment thereof that reacts with the jellyfish larvae can be identified as the jellyfish larvae larvae.
さらに、本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントと、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応を示すがミズクラゲプラヌラ幼生には反応を示さないモノクローナル抗体またはそのフラグメントとを磁性体などの担体に結合させる。まず、ミズクラゲプラヌラ幼生を含む試料に磁性体などの担体が結合した本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントを作用させ、その後、磁石などを用いて担体を回収する。ここで回収された試料には、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生が含まれている。この回収試料に対し、続いて磁性体などの担体に結合したベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応を示すがミズクラゲプラヌラ幼生には反応を示さないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを作用させる。そして、磁石などを用いて担体に結合したモノクローナル抗体またはそのフラグメントを除去する。この際、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応を示すがミズクラゲプラヌラ幼生には反応を示さないモノクローナル抗体またはそのフラグメントに結合したベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生のみが取り除かれ、ミズクラゲプラヌラ幼生が残留する。従って、この方法によりミズクラゲプラヌラ幼生のみを回収することができる。なお、磁性体としては、例えば、鉄、酸化鉄等を用いることができる。また、磁性体の代わりにＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorting）、ｐａｎｎｉｎｇ等の方法を用いても同様にミズクラゲプラヌラ幼生を回収できる。 Further, a monoclonal antibody or a fragment thereof according to the present invention and a monoclonal antibody or a fragment thereof that reacts with Benicida hydraactinula larvae and Tamaumi hydraplanula larvae but does not react with jellyfish pranula larvae. And so on. First, a monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention, in which a carrier such as a magnetic substance is bound, is allowed to act on a sample containing the jellyfish planula larvae, and then the carrier is recovered using a magnet or the like. Samples collected here include Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae. Next, a monoclonal antibody or a fragment thereof that reacts with fenicum hydraactinula larvae and Tamaumi hydraplanula larvae but does not react with jellyfish pranula larvae bound to a carrier such as a magnetic substance. Make it work. Then, the monoclonal antibody or fragment thereof bound to the carrier is removed using a magnet or the like. In this case, the venicida hydra actinula larvae and tamaumi hydra conjugated to a monoclonal antibody or fragment thereof that reacts with the larvae of Benicida hydraactinula and larvae of the humus hydraplanula but does not react with the jellyfish pranula larvae. Only the planula larvae are removed, and the jellyfish planula larvae remain. Therefore, only the moon jellyfish planula larvae can be recovered by this method. In addition, as a magnetic body, iron, iron oxide, etc. can be used, for example. In addition, the jellyfish planula larvae can be similarly recovered by using a method such as FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) or panning instead of the magnetic substance.
また、前述の検出器の第二の部分にベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応を示すがミズクラゲプラヌラ幼生には反応を示さないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化されたクロマトグラフ媒体（以下、クロマトグラフ媒体Ａと称する）と、検出器の第二の部分に本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固定化されたクロマトグラフ媒体（以下、クロマトグラフ媒体Ｂと称する）とが含まれる検出器を用いることにより、ミズクラゲプラヌラ幼生を特定することができる。具体的には、クロマトグラフ媒体Ａとクロマトグラフ媒体Ｂを用いて同一の試料を解析し、クロマトグラフ媒体Ａでは陰性を示し、クロマトグラフ媒体Ｂでは陽性を示す場合には、試料にミズクラゲプラヌラ幼生が特異的に含まれていると判断できる。逆に、クロマトグラフ媒体Ａ、Ｂで共に陰性の場合には、試料にミズクラゲプラヌラ幼生が含まれていないと判断でき、クロマトグラフ媒体Ａ、Ｂで共に陽性の場合には、試料に少なくともベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生が含まれていると判断できるが、ミズクラゲプラヌラ幼生が含まれているか否かは不明である。 In addition, the second part of the above-described detector was immobilized with a monoclonal antibody or fragment thereof that reacted with Benicida hydraactinula larvae and Tamaumi hydraplanula larvae but not with jellyfish planula larvae. A chromatographic medium (hereinafter referred to as chromatographic medium A) and a chromatographic medium (hereinafter referred to as chromatographic medium B) in which the monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention is immobilized on the second part of the detector. It is possible to specify the jellyfish planula larvae. Specifically, the same sample is analyzed using the chromatographic medium A and the chromatographic medium B, and when the chromatographic medium A is negative and the chromatographic medium B is positive, the sample is a jellyfish planula larvae. Can be determined to be specifically included. Conversely, if both chromatographic media A and B are negative, it can be determined that the sample does not contain jellyfish planula larvae, and if both chromatographic media A and B are positive, the sample contains at least Benicuda. Although it can be judged that the sea urchin actinula larvae or the sea urchin hydraplanula larvae are included, it is unclear whether or not the moon jellyfish planula larvae are included.
このような検出器の原理として、クロマトグラフ媒体Ａに関し、例えばミズクラゲプラヌラ幼生またはその溶解物のみを含む試料を、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応を示すがミズクラゲプラヌラ幼生には反応を示さないモノクローナル抗体またはそのフラグメントが第二の部分に固定化されたクロマトグラフ媒体Ａの第一の部分に滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、試料中のミズクラゲプラヌラ幼生またはその溶解物は、クロマトグラフ媒体Ａの第一の部分から第二の部分を経て第三の部分を超えて移動する。この時、第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメント、及び第二の部分に固定化されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ミズクラゲプラヌラ幼生に反応性を持たないため、前述の試料中のミズクラゲプラヌラ幼生またはその溶解物はクロマトグラフ媒体Ａ上でいずれのモノクローナル抗体またはそのフラグメントとも結合せずに第一の部分と第二の部分を素通りする。同時に、第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントはフリーの状態で第二の部分を素通りして第三の部分へと移動し、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分でのみ発色が生じる。この第三の部分での発色は、検出の陽性対照となる。一方、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生、あるいはその溶解物を含む液体試料を、クロマトグラフ媒体Ａの第一の部分に滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、液体試料中のベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生由来の抗原は、第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントと反応して複合体を形成し、液が媒体中を広がるのを利用して、その複合体は第二の部分へと移動し、第二の部分において固定化された前述のモノクローナル抗体またはそのフラグメントに捕捉されてその位置で標識物質によりベニクダウミヒドアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生の検出が可能となる。このように、クロマトグラフ媒体Ａの第二の部分にシグナルが現れたか否かによって、試料中にベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生またはタマウミヒドラプラヌラ幼生が存在するかどうかを判定することが可能となる。 As a principle of such a detector, with respect to the chromatographic medium A, for example, a sample containing only the moon jellyfish planula larvae or a lysate thereof shows a reaction with the beech hydraactinula larvae and the Tamaumi hydraplanula larvae. When a monoclonal antibody that does not react to larvae or a fragment thereof is dropped on the first part of the chromatographic medium A immobilized on the second part or the first part is immersed in the sample, The moon jellyfish planula larvae or lysates thereof travel from the first part of chromatographic medium A through the second part and beyond the third part. At this time, the labeled monoclonal antibody or fragment thereof contained in the first part, and the monoclonal antibody or fragment thereof immobilized on the second part are not reactive with the moon jellyfish planula larvae. The jellyfish planula larvae or lysates therein pass through the first part and the second part on the chromatographic medium A without binding to any monoclonal antibody or fragment thereof. At the same time, the labeled monoclonal antibody or fragment thereof contained in the first part passes through the second part in a free state and moves to the third part, and the anti-immunity immobilized in the third part It is captured by the globulin antibody and color develops only in the third part. This color development in the third part serves as a positive control for detection. On the other hand, when a liquid sample containing Benicida hydraactinula larvae or Tamami hydraplanula larvae or a lysate thereof is dropped on the first part of the chromatographic medium A or the first part is immersed in the sample. In the liquid sample, the antigen derived from the larvae of Benicum hydra actinula larvae or Tamami hydraplanula larvae reacts with the labeled monoclonal antibody or fragment thereof contained in the first part to form a complex. Using the spread in the medium, the complex moves to the second part, and is captured by the aforementioned monoclonal antibody or fragment immobilized on the second part, and is then bent by the labeling substance at that position. Detection of larvae of Kudaumihidakuchinura or tamaumihydraplanula larvae becomes possible. In this way, it is possible to determine whether or not Benicida hydra actinula larvae or Tamami hydraplanula larvae are present in the sample depending on whether or not a signal appears in the second portion of the chromatographic medium A. Become.
また、クロマトグラフ媒体Ｂに関し、例えばミズクラゲプラヌラ幼生またはその溶解物を含む試料を、本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントが第二の部分に固定化されたクロマトグラフ媒体Ｂの第一の部分に、滴下したり、試料に第一の部分を浸したりすると、試料中のミズクラゲプラヌラ幼生またはその溶解物は、クロマトグラフ媒体Ｂの第一の部分から第二の部分を経て第三の部分を超えて移動する。この時、前述の試料中に含まれるミズクラゲプラヌラ幼生由来の抗原は第一の部分に含まれる標識されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントと反応して複合体を形成し、液が媒体中を広がるのを利用して、その複合体は第二の部分へと移動し、第二の部分において固定化された前述のモノクローナル抗体またはそのフラグメントに捕捉されてその位置で標識物質により、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、またはミズクラゲプラヌラ幼生の検出が可能となる。なお、このクロマトグラフ媒体Ａ第一の部分からくるフリーの抗体は、第三の部分へと移動し、第三の部分において固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉され、第三の部分で発色が生じる。この第三の部分での発色は、検出の陽性対照となる。この様に、クロマトグラフ媒体Ｂの第二の部分にシグナルが現れたか否かによって、試料中にベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、あるいはミズクラゲプラヌラ幼生が存在するかどうかを判定することが可能となる。 Further, with respect to the chromatographic medium B, for example, a sample containing the jellyfish jellyfish larvae or a lysate thereof is applied to the first part of the chromatographic medium B in which the monoclonal antibody or fragment thereof according to the present invention is immobilized on the second part. When dripping or immersing the first part in the sample, the jellyfish planula larvae or the lysate thereof in the sample exceeds the third part from the first part of the chromatographic medium B through the second part. Move. At this time, the antigen derived from the jellyfish larvae larvae contained in the sample reacts with the labeled monoclonal antibody or fragment thereof contained in the first part to form a complex, and the liquid spreads in the medium. Utilizing this, the complex migrates to the second part, and is captured by the aforementioned monoclonal antibody or fragment thereof immobilized in the second part and is labeled with the labeling substance at that position. Detection of larvae, Tamaumi hydraplanula larvae, or moon jellyfish planula larvae becomes possible. The free antibody coming from the first part of the chromatographic medium A moves to the third part, is captured by the anti-immunoglobulin antibody immobilized in the third part, and develops color in the third part. Occurs. This color development in the third part serves as a positive control for detection. Thus, it is determined whether or not there is a Benicida hydra actinula larvae, Tamaumi hydraplanula larvae, or moon jellyfish planula larvae depending on whether or not a signal appears in the second part of the chromatographic medium B. It becomes possible to do.
従って、クロマトグラフ媒体Ａでは陰性を示し、クロマトグラフ媒体Ｂでは陽性を示す場合には、その試料にミズクラゲプラヌラ幼生が特異的に含まれていると判断できる。 Therefore, if the chromatographic medium A is negative and the chromatographic medium B is positive, it can be determined that the jellyfish planula larvae are specifically contained in the sample.
また、例えば、本発明に係るモノクローナル抗体またはそのフラグメントと、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生には反応を示すがミズクラゲプラヌラ幼生には反応を示さないモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む検出キットを用いれば、ミズクラゲプラヌラ幼生を検出することができる。 Further, for example, a monoclonal antibody according to the present invention or a fragment thereof, and a monoclonal antibody or a fragment thereof that reacts with Benicida hydraactinula larvae and Tamaumi hydraplanula larvae but does not react with jellyfish pranula larvae. If the detection kit is used, it is possible to detect the jellyfish planula larvae.
なお、本発明に係る検出用試薬、検出器、検出キットにおける標識物質としては、例えば、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ファロイジン等）、金等のコロイド粒子、重金属（例えば、金、白金等）、色素タンパク質（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）等）、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジン等の物質を用いることができるがこれらに制限されるものではなく、公知の標識物質を用いてもよい。また、発色基質としては、前述の酵素に対する発色基質であれば特に制限されるものではなく、例えば、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ｏ-フェニレンジアミン(o-Phenylenediamine)、過酸化水素水、ＢＣＩＰ/Ｎｉｔｒｏ-ＴＢ（5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/Nitrotetrazolium blue）、ｐＮＰＰ（para-nitorophenylphosphate）等を用いることができる。発色増強剤としては、前述の基質の発色を増強させることができるものであればどのようなものでもよく、例えば、硫酸等を用いることができ、二次抗体としては、例えば、本発明に係るモノクローナル抗体が産生されたホストの動物種の免疫グロブリンに特異的に反応する抗免疫グロブリン抗体、抗ＩｇＧ（Ｈ+Ｌ）、抗ＩｇＧ（Ｆｃ）等を用いることができる。 Examples of the labeling substance in the detection reagent, detector, and detection kit according to the present invention include, for example, fluorescent substances (for example, FITC, rhodamine, phalloidin, etc.), colloidal particles such as gold, heavy metals (for example, gold, platinum, etc.) ), Chromoprotein (eg, phycoerythrin (PE), phycocyanin (PC), etc.), radioisotope (eg, 3 H, 32 P, 35 S, 125 I, 131 I, etc.), enzyme (eg, peroxidase, alkaline phosphatase) Etc.), biotin, streptavidin, and other substances can be used, but are not limited thereto, and known labeling substances may be used. The chromogenic substrate is not particularly limited as long as it is a chromogenic substrate for the above-mentioned enzyme. For example, diaminobenzidine (DAB), o-phenylenediamine (o-Phenylenediamine), hydrogen peroxide solution, BCIP / Nitro -TB (5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate / Nitrotetrazolium blue), pNPP (para-nitorophenylphosphate), etc. can be used. As the color development enhancer, any one can be used as long as it can enhance the color development of the aforementioned substrate. For example, sulfuric acid or the like can be used, and the secondary antibody is, for example, according to the present invention. Anti-immunoglobulin antibodies, anti-IgG (H + L), anti-IgG (Fc) and the like that specifically react with immunoglobulins of the host animal species from which the monoclonal antibody was produced can be used.
また、前述の免疫学的手法としては、ＥＩＡ（Enzyme Immunoassay）、蛍光免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）、ＲＩＡ（Radio Immuno Assay）、ウエスタンブロッティング、ラテックス凝集法、イムノクロマト法、サンドイッチ法等の公知の方法を用いることができる。 The immunological methods described above include EIA (Enzyme Immunoassay), immunofluorescence assay, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), RIA (Radio Immunoassay), Western blotting, latex agglutination method, immunochromatography method, sandwich method. A known method such as can be used.
以上のように、本発明に係るベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の検出方法を用いることにより、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の同定や分離及び量の測定が可能となるが、検出キットや検出器を用いることにより、より容易にベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生を同定することができるようになる。 As described above, by using the detection method of Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae according to the present invention, Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and It is possible to identify, isolate, and measure the amount of jellyfish larvae larvae, but by using detection kits and detectors, it is possible to more easily identify fenic hydraactinula larvae, Tamaumi hydraplanula larvae, and jellyfish larvae larvae Will be able to.
以下に、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples. These examples are for explaining the present invention, and do not limit the scope of the present invention.
[実施例１]
本実施例では、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。
[Example 1]
In this example, a hybridoma that produces a monoclonal antibody reactive to Benicida hydra actinula larvae was established.
＝＝ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生の飼育方法＝＝
鹿児島県湾竜ヶ水沿岸に設置された養殖生簀、あるいは、播磨新島ヨットハーバーの浮き桟橋裏面からベニクダウミヒドラ群体を採取した。この群体を海水で洗浄した後、雌雄に選別し、オスとメスを約１：９の割合で水温６〜７℃の海水を有する循環式水槽に収容して孵化直後のアルテミアを与えながら飼育した。適宜、幼生遊出直前のメスポリプを選別し、遊出したアクチヌラ幼生を採取した。回収したアクチヌラ幼生をろ過海水で洗浄した後、１００個体ずつ冷凍保存した。この冷凍幼生を、以下に記載の免疫、ＥＬＩＳＡ用抗原試料として使用した。
== How to raise larvae of Benicida mihydra actinula ==
Benikudaumihydra colony was collected from aquaculture ginger installed on the coast of Ryugamizu Bay, Kagoshima Prefecture, or from the back of the floating pier of Harima Niijima Yacht Harbor. This colony was washed with seawater and then sorted into males and females, and males and females were housed in a circulating water tank having seawater at a water temperature of 6-7 ° C. at a ratio of about 1: 9 and fed with Artemia immediately after hatching. . The female polyps immediately before the larval migration were selected as appropriate, and the activated actinula larvae were collected. The collected actinula larvae were washed with filtered seawater and then stored frozen for 100 individuals. This frozen larva was used as an antigen sample for immunity and ELISA described below.
＝＝ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生によるマウスの免疫＝＝
１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（メス）の腹腔内に抗原（ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生１００〜２００個／３００〜４００μＬのＰＢＳ）を５回注射し、マウスを免疫した。具体的には、１回目の投与から１６８日目に２回目の投与を、２回目の投与から２４日目に３回目の投与を、３回目の投与から２１日目に４回目の投与を、４回目の投与から３９日目に５回目の投与を行った。
== Immunoimmunization of mice by Benicida hydra actinula larvae ==
Ten weeks old BALB / c mice (female) were intraperitoneally injected with antigen (100-200 Benicumumi hydra actinula larvae / 300-400 μL PBS) five times to immunize the mice. Specifically, the second administration on day 168 from the first administration, the third administration on day 24 from the second administration, the fourth administration on day 21 from the third administration, The fifth administration was performed on the 39th day from the fourth administration.
＝＝ハイブリドーマの作製＝＝
（脾臓組織の単離）
最終免疫から４日後に、マウスから脾臓を摘出し、１０％のＦＢＳ（Fetal Bovine Serum；GIBCO社製）及び１％の抗生物質（Antibiotic-Antimycotic；GIBCO社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（GIBCO社製）培地中で滅菌ステンレスメッシュを用いて裏漉しし、細胞を分散・懸濁させて脾臓細胞を得た。この脾臓細胞を１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ＋培地）で洗浄・遠心した後、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ−培地）で３回遠心・洗浄し、脾臓細胞を回収した。
== Production of hybridoma ==
(Isolation of spleen tissue)
Four days after the final immunization, the spleen was removed from the mouse and RPMI 1640 (GIBCO) containing 10% FBS (Fetal Bovine Serum; GIBCO) and 1% antibiotic (Antibiotic-Antimycotic; GIBCO). Spleen cells were obtained by dispersing and suspending the cells using a sterile stainless mesh in the medium. The spleen cells were washed and centrifuged with RPMI1640 medium (FBS + medium) containing 10% FBS, and then centrifuged and washed three times with RPMI1640 medium (FBS - medium) to collect spleen cells.
（細胞融合とＨＡＴ選択：不活化ウイルス法）
まず、凍結ミエローマ細胞（マウス骨髄癌細胞、Ｐ３Ｕ１）を融解した後、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０で培養し、生存率、増殖性の高い株を選別し、１回移植して融合に備えた。GenomOne-CF（不活化センダイウィルス外膜：HVJ-E、石原産業(株)製）を用いて細胞融合を行った。前述のミエローマ細胞と脾臓細胞を１：２の割合で混合した後、遠心して上清を除去し、細胞ペレット（沈殿）を作製した。これに、氷冷した融合用緩衝液（１倍濃度液）を添加（脾臓細胞１０８細胞あたり１ｍＬ添加）し、細胞群を懸濁させた。氷冷したHVJ-E懸濁液を添加（細胞懸濁液１ｍＬあたり２５μＬを添加）し、氷上で５分間静置した。その後、遠心（４℃、１０００ｒｐｍ×５分間）を行い、３７℃で１５分間インキュベーションした。続いて、ＦＢＳ＋培地（３７℃）１０ｍＬを添加して細胞群を懸濁させた（脾臓細胞１０８細胞／５０ｍＬ）。これを、ＦＢＳ＋培地１０ｍＬが入った分室シャーレ３枚にそれぞれ２ｍＬずつ播種し、ＣＯ２インキュベータ内で静置培養を行った。培養開始から１日後、各シャーレから培地を４ｍＬずつ取り、２×ＨＡＴ培地６ｍＬとconditioned medium ０．３〜０．４ｍＬを各シャーレに添加し（終濃度０．８×ＨＡＴ培地）、ＣＯ２インキュベータ内で静置培養することにより、ＨＡＴ選択培養を行った。
(Cell fusion and HAT selection: inactivated virus method)
First, frozen myeloma cells (mouse bone marrow cancer cells, P3U1) were thawed and cultured in RPMI 1640 containing 10% FBS and 1% antibiotics. Prepared for fusion. Cell fusion was performed using GenomOne-CF (inactivated Sendai virus outer membrane: HVJ-E, manufactured by Ishihara Sangyo Co., Ltd.). The above myeloma cells and spleen cells were mixed at a ratio of 1: 2, and then centrifuged to remove the supernatant to prepare a cell pellet (precipitate). To this was added ice-cold fusion buffer (1 × concentration solution) (added 1 mL per 10 8 spleen cells) to suspend the cell group. Ice-cooled HVJ-E suspension was added (25 μL was added per 1 mL of cell suspension) and allowed to stand on ice for 5 minutes. Thereafter, centrifugation (4 ° C., 1000 rpm × 5 minutes) was performed, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 15 minutes. Subsequently, 10 mL of FBS + medium (37 ° C.) was added to suspend the cell group (spleen cells 10 8 cells / 50 mL). 2 mL each of this was inoculated into 3 laboratory petri dishes containing 10 mL of FBS + medium and static culture was performed in a CO 2 incubator. One day after the start of the culture, 4 mL of the medium is taken from each petri dish, 6 mL of 2 × HAT medium and 0.3 to 0.4 mL of conditioned medium are added to each dish (final concentration 0.8 × HAT medium), and a CO 2 incubator. The HAT selective culture was performed by static culture in the cell.
（ハイブリドーマ細胞のスクリーニング）
ＨＡＴ選択培養開始から４日（融合処理から５日）〜１０日後、各シャーレの各セル内で明瞭な増殖が確認されたハイブリドーマ細胞のコロニーのうち、シングルコロニーを形成しているコロニーをピックアップし、選択増殖培地［１×ＨＴ培地と１０％の細胞増殖因子（conditioned medium from J774A.1 cells、Sigma-aldrich社）を含む］の入った９６穴ウェルプレートに移し、ハイブリドーマの培養を行った。その後、明瞭なハイブリドーマの増殖が確認されたウェルについて、その培養上清を採取し、以下のＥＬＩＳＡ法により抗体の産生を確認した。
(Screening of hybridoma cells)
Four to ten days after the start of HAT selective culture (5 days after the fusion treatment), among colonies of hybridoma cells in which distinct growth was confirmed in each cell of each petri dish, a colony forming a single colony was picked up. Then, the cells were transferred to a 96-well plate containing a selective growth medium [containing 1 × HT medium and 10% cell growth factor (conditioned medium from J774A.1 cells, Sigma-aldrich)], and hybridomas were cultured. Thereafter, the culture supernatant was collected from wells in which the growth of clear hybridomas was confirmed, and antibody production was confirmed by the following ELISA method.
（ＥＬＩＳＡ法）
以下の各工程において、特に記載がない場合は室温にて処理、反応を行った。
（１）ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）を加え、氷中でホモジナイズを行い、５０００ｒｐｍで２０分間遠心することにより得たベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生粗抽出液をタンパク質濃度２０μｇ／ｍＬになるように調製した。
（２）（１）で得られたベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生の粗抽出液５０μＬを、９６穴イワキＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加え、４℃で一晩インキュベートして抗原をウェル底面に吸着させた。
（３）（２）で吸着処理した各ウェルをＴＢＳ（０．５Ｍ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．５）２００μＬで洗浄した。
（４）各ウェルを１％ ＢＳＡを含むＴＢＳ １００μlで１時間ブロッキングした。
（５）各ウェルをＴＴＢＳ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）２００μｌで３回洗浄した。
（６）ハイブリドーマを培養することにより得られた培養上清（一次抗体）５０μＬを各ウェルに加え、２時間反応させた。
（７）各ウェルをＴＴＢＳ ２００μｌで４回洗浄した。
（８）各ウェルに２次抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）ヤギ抗体、BETHYL社）溶液（ＴＢＳで５００倍に希釈した溶液）５０μｌを加えて１時間反応させた。
（９）各ウェルをＴＴＢＳ ２００μｌで５回洗浄した。
（１０）各ウェルに基質（アルカリフォスファターゼ基質キット、BIO-RAD 社）溶液 １００μｌを加え、１時間振盪することにより発色させた。
（11）マイクロプレートリーダー（BIO-RAD Model550）を用いて、各ウェルの溶液の吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。
(ELISA method)
In the following steps, treatment and reaction were performed at room temperature unless otherwise specified.
(1) Benikudaumihydraactinula larvae crude extraction obtained by adding 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) to Benicidaumihydraactinula larvae, homogenizing in ice, and centrifuging at 5000 rpm for 20 minutes The solution was prepared to a protein concentration of 20 μg / mL.
(2) Add 50 µL of the crude extract of Benicida hydra actinula larvae obtained in (1) to each well of a 96-well Iwaki ELISA plate and incubate overnight at 4 ° C to adsorb the antigen to the bottom of the well. It was.
(3) Each well adsorbed in (2) was washed with 200 μL of TBS (0.5 M NaCl and 20 mM Tris-HCl; pH 7.5).
(4) Each well was blocked with 100 μl of TBS containing 1% BSA for 1 hour.
(5) Each well was washed 3 times with 200 μl of TTBS (TBS containing 0.05% Tween 20).
(6) 50 μL of culture supernatant (primary antibody) obtained by culturing the hybridoma was added to each well and allowed to react for 2 hours.
(7) Each well was washed 4 times with 200 μl of TTBS.
(8) A secondary antibody (alkaline phosphatase-labeled anti-mouse IgG (Fc) goat antibody, BETHYL) solution (50 μl) was added to each well and reacted for 1 hour.
(9) Each well was washed 5 times with 200 μl of TTBS.
(10) 100 μl of substrate (alkaline phosphatase substrate kit, BIO-RAD) solution was added to each well, and color was developed by shaking for 1 hour.
(11) The absorbance (405 nm) of the solution in each well was measured using a microplate reader (BIO-RAD Model 550).
上記ＥＬＩＳＡ法により高い抗体産生能が確認されたハイブリドーマについて、２４穴ウェルで２〜５日間培養し、ＥＬＩＳＡ法によりベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生粗抽出液に対して結合性の高い抗体を産生するハイブリドーマ（Ｔ−Ｈ３Ｈ７（１）、Ｔ−Ｈ３Ａ１（６）、Ｔ−Ｈ３Ｇ１０（４）、ＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）、Ｔ−Ｐ２Ｆ１２（７）、ＴＣＡ−Ｈ１Ａ１１（３）、ＴＣＡ−Ｈ２Ｅ１０（１）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｈ１０（１）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｂ５（５）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｂ１０（３））を得た。 The hybridoma whose high antibody-producing ability has been confirmed by the above-mentioned ELISA method is cultured in a 24-well well for 2 to 5 days, and an antibody having a high binding property to the crude extract of Benicida hydra actinula larvae is produced by the ELISA method. Hybridoma (T-H3H7 (1), T-H3A1 (6), T-H3G10 (4), TC-H2D7 (3), T-P2F12 (7), TCA-H1A11 (3), TCA-H2E10 (1) , TCA-H3H10 (1), TCA-H3B5 (5), TCA-H3B10 (3)) were obtained.
[実施例２]
本実施例では、実施例１で得られた１０種のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、およびミズクラゲプラヌラ幼生に特異的に反応するか否かを調べた。
[Example 2]
In this example, whether the monoclonal antibodies produced by the 10 hybridomas obtained in Example 1 specifically react with Benicida hydraactinula larvae, Tamaumi hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae. I investigated.
＝＝アカフジツボキプリス幼生の飼育方法＝＝
循環式水槽を用い、アルテミアを給餌してアカフジツボ成体の維持・飼育を行い、定期的に幼生を孵出させた。幼生には培養した浮遊珪藻 Chaetoceros 等を給餌し、キプリス幼生を生産した。
== Raising method of red pheasant cricket larvae ==
Using a circulating water tank, Artemia was fed to maintain and breed adult red barnacles, and the larvae were spawned regularly. The larvae were fed with cultured floating diatom Chaetoceros and produced cypris larvae.
＝＝ムラサキイガイペディベリジャー幼生の飼育方法＝＝
兵庫県姫路市周辺沿岸からムラサキイガイ成体を採取し、やや低温に制御した水槽を用いて維持・飼育し、定期的に放卵・放精させた。媒精後、発生が進行した初期幼生に、培養したハプト藻 Isochrysis 等を給餌することによって人工飼育し、ペディベリジャー幼生を生産した。
== How to raise mussel pediberger larvae ==
Adult mussels were collected from the coastal area around Himeji City, Hyogo Prefecture, maintained and bred using a slightly cool water tank, and regularly ovulated and fertilized. By feeding the cultured haptophyte Isochrysis and the like to the early larvae that developed after the maturation, they were artificially raised to produce pediberger larvae.
＝＝コペポーダの採取方法＝
兵庫県姫路市周辺沿岸から、プランクトンネットを用いてプランクトンを採取した。採取したプランクトンをシャーレ内の海水中に移し、ピペットでコペポーダ類のみ選別採取した。
== How to collect a copyoda =
Plankton was collected from the coast around Himeji City, Hyogo Prefecture using a plankton net. The collected plankton was moved into the sea water in the petri dish, and only the copypods were selected and collected with a pipette.
＝＝タマウミヒドラプラヌラ幼生の飼育方法＝＝
兵庫県東播磨沿岸からタマウミヒドラポリプ群体を採取した後、低温水槽内で維持・飼育し、成熟させた。受精後、胚発生中の雌ポリプ群体を深型シャーレ内の海水中に移し、照明下で静置した。その後、生殖体外へ遊離してきたプラヌラ幼生を口太ピペットで採取し、凍結保存した。
== How to breed Tamami Hydra Planula larva ==
After collecting Tamami Hydra polyp colonies from the Higashi-Harima coast of Hyogo Prefecture, they were maintained and reared in a low-temperature water tank and matured. After fertilization, embryonic female polyps were transferred into seawater in a deep petri dish and allowed to stand under illumination. Thereafter, the planula larvae released to the outside of the reproductive body were collected with a mouth pipette and stored frozen.
＝＝ミズクラゲプラヌラ幼生の飼育方法＝＝
兵庫県姫路市近辺沿岸から成熟雌クラゲ体を採取した。海水を満たした小型プラスチック容器内でクラゲ体を裏返し、保育嚢の縁辺に存在しているプラヌラ幼生を口太ピペットで採取し、凍結保存した。
== How to breed larvae of the moon jellyfish
Mature female jellyfish bodies were collected from the coast near Himeji City, Hyogo Prefecture. The jellyfish body was turned inside out in a small plastic container filled with seawater, and the planula larvae present on the edge of the nursery sac were collected with a mouth pipette and stored frozen.
実施例１のＥＬＩＳＡ法の記載に従い、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液（タンパク質の濃度：２０μｇ/ｍＬ）を調製し、各ハイブリドーマが産生する抗体の、これらの粗抽出液に対する反応性を確認した。なお、小数第一位以上の数値が得られた場合に、反応性があるとした。 According to the description of the ELISA method of Example 1, a crude extract of Benicumida hydraactinula larvae, Tamamihydraplanula larvae, moon jellyfish planula larvae, Akafujitsubo Cyprus larvae, copepoda, mussels peedier larvae (protein concentration: 20 μg / mL) And the reactivity of the antibody produced by each hybridoma to these crude extracts was confirmed. In addition, when the numerical value more than the decimal place was obtained, it was considered that there was reactivity.
また、各ハイブリドーマが産生する抗体のアイソタイプを、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Roche Applied Science 社）を用いて調べた。 In addition, the isotype of the antibody produced by each hybridoma was examined using a mouse monoclonal antibody isotyping kit (Roche Applied Science).
表１に示すように、Ｔ−Ｈ３Ｈ７（１）、Ｔ−Ｈ３Ａ１（６）、Ｔ−Ｈ３Ｇ１０（４）、及びＴ−Ｐ２Ｆ１２（７）のハイブリドーマの培養上清は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生の粗抽出液に対して反応性を示し、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液には反応性を示さなかった。また、ＴＣ−Ｈ２Ｄ７（３）のハイブリドーマの培養上清は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生及びタマウミヒドラプラヌラ幼生の粗抽出液に対して反応性を示し、ミズクラゲプラヌラ幼生、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液には反応性を示さなかった。ＴＣＡ−Ｈ１Ａ１１（３）のハイブリドーマの培養上清は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の粗抽出液に対して反応を示し、アカフジツボキプリス幼生、コペポーダ、及びムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液に対して反応を示さなかった。ＴＣＡ−Ｈ２Ｅ１０（１）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｈ１０（１）、ＴＣＡ−Ｈ３Ｂ５（５）、及びＴＣＡ−Ｈ３Ｂ１０（３）のハイブリドーマの培養上清は、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生の粗抽出液、ムラサキイガイペディベリジャー幼生の粗抽出液に対して反応を示し、アカフジツボキプリス幼生、及びコペポーダの粗抽出液には反応性を示さなかった。 As shown in Table 1, the culture supernatants of hybridomas of T-H3H7 (1), T-H3A1 (6), T-H3G10 (4), and T-P2F12 (7) It was reactive to the crude extract of the larvae, but was not reactive to the crude extracts of Tamamihydraplanula larvae, Moon jellyfish planula larvae, Akafujitsubo Cyprus larvae, Copepoda, and Mussel mussel pediberger larvae. Moreover, the culture supernatant of the hybridoma of TC-H2D7 (3) showed reactivity to the crude extract of Benicida mihydra actinula larvae and Tamaumi hydraplanula larvae, and the jellyfish pranula larvae, red clover crisp larvae, The crude extract of mussel pediberger larvae showed no reactivity. The culture supernatant of the hybridoma of TCA-H1A11 (3) showed a response to the crude extract of Benicumida hydraactinula larvae, Tamaumihydraplanula larvae, and jellyfish prawn larvae. There was no response to the crude extract of mussel pediberger larvae. The culture supernatants of hybridomas of TCA-H2E10 (1), TCA-H3H10 (1), TCA-H3B5 (5), and TCA-H3B10 (3) were benikuda hydra actinula larvae, tamaumihydraplanula larvae, In addition, there was a reaction with the crude extract of the larvae of the jellyfish and the larvae of the jellyfish and the crude extract of the mussel pepedier larvae, but there was no reactivity with the crude extract of the red scallop larvae and the copepod.
つまり、実施例１で得られた１０種のハイブリドーマのうち、刺胞動物門に属する動物の幼生である、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマはＴＣＡ−Ｈ１Ａ１１（３）のみであった。
以上のように、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生に反応性のあるモノクローナル抗体は、通常ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生のみ、またはベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生とタマウミヒドラプラヌラ幼生のみに反応する（１０種中５種）か、あるいは、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生以外にも、タマウミヒドラプラヌラ幼生、ミズクラゲプラヌラ幼生、ムラサキイガイペディベリジャー幼生にも反応する（１０種中４種）かのいずれかである。つまり、刺胞動物門に属する動物の幼生である、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するＴＣＡ−Ｈ１Ａ１１（３）のハイブリドーマが得られたことは、当業者であっても容易に予測できるものではない。また、このハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体によって、他種の動物を含む試料の中で、ベニクダウミヒドラアクチヌラ幼生、タマウミヒドラプラヌラ幼生、及びミズクラゲプラヌラ幼生を特定することができるという有利な効果を奏する。 As described above, a monoclonal antibody reactive with Benicida hydraactinula larvae usually reacts only with venicida hydraactinula larvae, or only with Benicida hydraactinula larvae and only Tamaumihydraplanula larvae ( 5 species out of 10), or reacts to the larvae of T. hydraplanula, jellyfish prawn larvae, and mussel pediberger larvae (4 of 10 species) It is. That is, of TCA-H1A11 (3) that produces monoclonal antibodies specifically reacting with the larvae of the animals belonging to the cnidaria, venicida hydraactinula larvae, tamaumihydraplanula larvae, and moon jellyfish pranula larvae It is not easily predicted by those skilled in the art that the hybridoma was obtained. In addition, the monoclonal antibody produced by this hybridoma has the advantageous effect of being able to identify Benicumida hydraactinula larvae, Tamaumihydraplanula larvae, and jellyfish plasma larvae in samples containing other species of animals. Play.
Claims (5)
請求項２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部位を含むフラグメントを含むことを特徴とする検出用試薬。 A detection reagent for specifically detecting Benicida hydra actinula larvae, Tamami hydraplanula larvae, and moon jellyfish planula larvae,
A detection reagent comprising the monoclonal antibody according to claim 2 or a fragment containing the antigen-binding site thereof.
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