JP2012170377A - New lactic acid bacterium - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規乳酸菌に関し、より詳細には、グラム陽性菌のみならずグラム陰性菌に対しても有効な抗菌性物質を産生する新規乳酸菌に関する。 The present invention relates to a novel lactic acid bacterium, and more particularly to a novel lactic acid bacterium that produces an antibacterial substance that is effective not only against gram-positive bacteria but also against gram-negative bacteria.
乳酸菌は、ヨーグルトの製造に用いられる等、これまで多くのものが知られている（例えば、特許文献１参照。）。
特許文献１に記載のように、「乳酸菌は様々な機能を有していることが知られており、その中でも抗菌作用は近年注目されてきている。乳酸菌が生産する抗菌性物質として、乳酸や酢酸などの有機酸、過酸化水素、ジアセチル、ロイテリン、バクテリオシンなどがある。その中でバクテリオシンは、一般に近縁のグラム陽性菌に対して抗菌作用を示すタンパク質性もしくはペプチド性の物質である。乳酸菌のバクテリオシンは、人間の消化酵素で分解消化されること、乳酸菌が古くから広く食品に利用されていて安全性が高いことなどから、精力的にその探索が実施されてきている。」（特許文献１、発明の詳細な説明中の段落番号０００２〜０００３）。
また、乳酸菌が生産するバクテリオシンとしては、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）４８１株が産生するヘルベティシンＪ（Helveticin J）が知られている（非特許文献１参照）。このヘルベティシンＪはグラム陽性菌に対して抗菌作用を示すタンパク質性もしくはペプチド性の物質である。
Many lactic acid bacteria have been known so far, such as used for the production of yogurt (see, for example, Patent Document 1).
As described in Patent Document 1, “lactic acid bacteria are known to have various functions, and antibacterial action has attracted attention in recent years. Among the antibacterial substances produced by lactic acid bacteria, lactic acid and There are organic acids such as acetic acid, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin, bacteriocin, etc. Among them, bacteriocin is a proteinaceous or peptidic substance that generally shows antibacterial activity against closely related gram-positive bacteria. The search for lactic acid bacteria bacteriocin has been conducted vigorously because it is digested and digested by human digestive enzymes, and lactic acid bacteria have been widely used in foods for a long time and are highly safe. " (Patent Document 1, paragraph numbers 0002 to 0003 in the detailed description of the invention).
As bacteriocin produced by lactic acid bacteria, Helveticin J produced by Lactobacillus helveticus 481 strain is known (see Non-Patent Document 1). This Helveticin J is a proteinaceous or peptidic substance that exhibits antibacterial activity against Gram-positive bacteria.
また、本発明者は、以前から乳酸菌の研究に携わり、既に乳酸菌に関連する特許出願も行ってきた（例えば、特許文献２、特許文献３等）。 The inventor has been engaged in research on lactic acid bacteria for a long time, and has already filed patent applications related to lactic acid bacteria (for example, Patent Document 2, Patent Document 3 and the like).
上述の特許文献１及び非特許文献１の如く、乳酸菌が産生する物質は、その多くがグラム陽性菌に対して有効であるものの、大腸菌等のようなグラム陰性菌に対して有効なものはほとんど知られていなかった。
そこで、本発明では、グラム陰性菌に対しても有効な抗菌性物質を産生する新規な乳酸菌を提供することを目的とする。
As described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1, most of the substances produced by lactic acid bacteria are effective against Gram-positive bacteria, but most are effective against Gram-negative bacteria such as Escherichia coli. It was not known.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel lactic acid bacterium that produces an antibacterial substance that is also effective against gram-negative bacteria.
本発明の本発明者らは、グラム陰性菌に対しても有効な抗菌性物質を産生する新規な乳酸菌の探索を行なった結果、自然界や発酵食品に広く分布しているラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する新規な乳酸菌ＭＳＣ００３株が、大腸菌をはじめ多くのグラム陰性菌に対して抗菌性を示す物質を産生することを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of searching for a new lactic acid bacterium that produces an antibacterial substance that is also effective against gram-negative bacteria, the inventors of the present invention have found that Lactobacillus (Lactobacillus) widely distributed in nature and fermented foods. The present inventors have found that a novel lactic acid bacterium MSC003 strain belonging to helveticus produces substances exhibiting antibacterial activity against many gram-negative bacteria including E. coli.
即ち、本発明の乳酸菌株（以下、「本菌株」という。）は、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する新規な乳酸菌ＭＳＣ００３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０２６）である。
本菌株（乳酸菌ＭＳＣ００３株、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０２６）は、後述の如く、大腸菌をはじめ多くのグラム陰性菌に対する抗菌性物質を産生する。
That is, the lactic acid strain of the present invention (hereinafter referred to as “the present strain”) is a novel lactic acid bacterium strain MSC003 (accession number NITE P-1026) belonging to Lactobacillus helveticus.
This strain (lactic acid bacterium MSC003 strain, accession number NITE P-1026) produces antibacterial substances against many gram-negative bacteria including Escherichia coli, as described later.
本発明は、本菌株の培養物（以下、「本培養物」という。）も提供する。
本発明は、本培養物（本菌株の培養物）を炭素数１〜３のアルコールを用いて抽出する工程を経て得られる抽出組成物（以下、「本抽出組成物」という。）も提供する。
本発明は、本菌株を用いて発酵する工程を用いて製造された食品組成物（以下、「本食品組成物」という。）も提供する。
本発明は、本培養物及び／又は本抽出組成物を有効成分として含有することを特徴とする抗菌剤（以下、「本抗菌剤」という。）も提供する。本抗菌剤は、食品、動物飼料、化粧品、医薬品及び洗浄剤よりなる群より選ばれる少なくとも１つの製品の保存剤として好適に使用できる。また、本抗菌剤は、ｐＨ５以下に調整されてもよい。
The present invention also provides a culture of the present strain (hereinafter referred to as “main culture”).
The present invention also provides an extraction composition (hereinafter referred to as “the present extraction composition”) obtained through a step of extracting the main culture (culture of the present strain) using an alcohol having 1 to 3 carbon atoms. .
The present invention also provides a food composition (hereinafter referred to as “the present food composition”) produced using a process of fermenting with the present strain.
The present invention also provides an antibacterial agent (hereinafter referred to as “the present antibacterial agent”) comprising the present culture and / or the present extract composition as an active ingredient. The antibacterial agent can be suitably used as a preservative for at least one product selected from the group consisting of foods, animal feeds, cosmetics, pharmaceuticals, and detergents. Moreover, this antibacterial agent may be adjusted to pH 5 or less.
本発明の新規な乳酸菌株（本菌株）は、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する新規な乳酸菌ＭＳＣ００３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０２６）である。
本菌株であるラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する乳酸菌ＭＳＣ００３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０２６）は、自然界や発酵食品に広く分布しているラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する乳酸菌から分離されたものである。
本菌株は、以下に示す菌学的性質を有する。これらの菌学的性質は、乳酸菌の科学と技術（学会出版センター、１９９６年）及びBergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition（２００９年）に記載の方法に準拠し検査した。
Lactobacillus helveticus Lactobacillus helveticus Lactobacillus MSC003 strain (Accession number NITE P-1026) is isolated from Lactobacillus helveticus lactic acid bacteria widely distributed in nature and fermented foods It has been done.
This strain has the following mycological properties. These bacteriological properties were examined in accordance with the methods described in the science and technology of lactic acid bacteria (Academic Publishing Center, 1996) and Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition (2009).
以上の特徴をBergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition（２００９年）を参照して近縁菌種を検索した結果、本菌株はラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）の特徴を示した。しかし、アピ５０ＣＨ（シスメックス・ビオメリュー社製）を用いた糖類資化性試験においてＤ−セロビオース及びＤ−スクロースの結果が基準株とは異なる非典型的性質を示した。
また、表１には示していないが、通常のラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）とは異なり、１０％還元脱脂乳培地では乳酸の生成が遅く、酵母エキスを０．５％添加することで改善されるという特徴的な性質を示した。
遺伝学的性質は以下の如くである。本菌株について１６ＳｒＤＮＡの塩基配列１５００ベースペア（ｂｐ）を解読し、アポロンＤＢ-ＢＡ５．０データベースで近縁菌種の相同性検索を行った結果、登録されているラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）ＪＣＭ１１２０株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列と９９．３％の相同率を示した。また、国際塩基配列データベースではラクトバチルス・ヘルベティカスＬＨ株、ラクトバチルス・ヘルベティカスＬＨ５株およびラクトバチルス・ヘルベティカスＩＭＡＵ５０００１株と１００．０％の相同率を示した。
従って、本菌株をラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）と同定した。
As a result of searching for related bacterial species with reference to the above-mentioned characteristics in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition (2009), this strain showed the characteristics of Lactobacillus helveticus. However, in the saccharide utilization test using API 50CH (manufactured by Sysmex Biomelieu), the results of D-cellobiose and D-sucrose showed atypical properties different from the reference strain.
Although not shown in Table 1, unlike normal Lactobacillus helveticus, lactic acid production is slow in 10% reduced skim milk medium, which can be improved by adding 0.5% yeast extract. It showed the characteristic nature of being.
Genetic properties are as follows. The 16S rDNA base sequence 1500 base pair (bp) of this strain was decoded, and as a result of homology search of related bacterial species in the Apollon DB-BA5.0 database, the registered Lactobacillus helveticus (Lactobacillus helveticus) It showed a 99.3% homology with the 16S rDNA base sequence of JCM1120 strain. In addition, the international base sequence database showed a 100.0% homology with the Lactobacillus helveticus LH strain, Lactobacillus helveticus LH5 strain and Lactobacillus helveticus IMAU50001 strain.
Therefore, this strain was identified as Lactobacillus helveticus.
一方、上述した非特許文献１に記載されたラクトバチルス・ヘルベティカス４８１株が産生するバクテリオシンのヘルベティシンＪ（Helveticin J）の性質と、本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株が産生する抗菌物質の性質と、は大きく異なる。即ち、（ａ）ヘルベティシンＪは近縁種であるラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）及びラクトバチルス・ラクティス（Lactobacillus lactis）の限られた菌株に対してのみ抗菌活性を示し、抗菌スペクトルが狭いこと（本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株が産生する抗菌物質は抗菌スペクトルが広い）。（ｂ）トリプシンやペプシンなどのプロテアーゼ（タンパク分解酵素）により失活すること（本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株が産生する抗菌物質はプロテアーゼにより失活しない）。（ｃ）１００℃、３０分間の加熱処理により失活すること（本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株が産生する抗菌物質は該加熱処理により失活しない）。これら（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）等のヘルベティシンＪの性質が、本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株が産生する抗菌物質とは大きく異なる。
したがって、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）のこれまで知られている菌株とは明確に異なる菌株であると認められ、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）ＭＳＣ００３株と命名した。
このラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）ＭＳＣ００３株は、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に平成２３年１月６日（寄託日）付で上記名称（識別の表示：Lactobacillus helveticus ＭＳＣ００３）で寄託されており、受託番号はＮＩＴＥ Ｐ−１０２６である。
On the other hand, the properties of the bacteriocin Helveticin J (Helveticin J) produced by the aforementioned Lactobacillus helveticus 481 strain described in Non-Patent Document 1 and the properties of the antibacterial substance produced by the lactic acid bacterium MSC003 strain are largely different. Different. That is, (a) Helveticin J is antibacterial only against limited strains of closely related species Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus and Lactobacillus lactis. It exhibits activity and has a narrow antibacterial spectrum (the antibacterial substance produced by the lactic acid bacterium strain MSC003 of this strain has a wide antibacterial spectrum). (B) Inactivation by a protease (proteolytic enzyme) such as trypsin or pepsin (an antibacterial substance produced by the lactic acid bacterium strain MSC003 is not inactivated by the protease). (C) Inactivation by heat treatment at 100 ° C. for 30 minutes (an antibacterial substance produced by the lactic acid bacteria MSC003 strain of the present strain is not inactivated by the heat treatment). The properties of Helveticin J such as (a), (b) and (c) are greatly different from the antibacterial substance produced by the lactic acid bacterium strain MSC003.
Therefore, it was recognized that the strain was clearly different from the strain known so far of Lactobacillus helveticus, and was named Lactobacillus helveticus MSC003 strain.
The Lactobacillus helveticus MSC003 strain was established in January 2011 at the National Institute of Technology and Evaluation (NPMD), an independent administrative agency with an address of 2-5-8, Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture. It is deposited with the above name (indication of identification: Lactobacillus helveticus MSC003) with 6 days (deposit date), and the deposit number is NITE P-1026.
本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株は、上述したように、天然に存する乳酸菌から分離されたものであり、本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株それ自身及びその培養物についてもヒトを含む動物に対する毒性はなく、ヒトを含む動物に対して経口摂取や皮膚への塗布を安全に行うことができる。 As described above, this strain lactic acid bacterium MSC003 strain is isolated from a naturally occurring lactic acid bacterium, and this strain lactic acid bacterium MSC003 strain itself and its culture are not toxic to animals including humans. Can be safely taken orally and applied to the skin.
本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株は、大腸菌をはじめ多くのグラム陰性菌に対する抗菌性物質を産生する。該抗菌性物質は、後に詳述する表２（ＭＳＣ００３の抗菌スペクトル）に示す通り、サルモネラ血清型エンテリティディス、サルモネラ血清型ティフィムリウム、大腸菌、大腸菌Ｏ−１５７、コレラ菌及びシュードモナス・フラギ（なお、表２中では、記載を容易にするため、サルモネラ血清型エンテリティディス及びサルモネラ血清型ティフィムリウムの「血清型」を省略している。）等のようなグラム陰性菌に対して抗菌性を示すと共に、ボツリヌス菌Ａ型、ボツリヌス菌Ｂ型、ボツリヌス菌Ｆ型、スポロゲネス菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性ブドウ球菌、セレウス菌及びリステリア・モノサイトゲネス菌等のようなグラム陽性菌に対しても抗菌性を示す。
加えて、本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株は、ｐＨ４．５、１２１℃で１５分間の処理条件下で熱安定性を示す。
そして、本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株が産生する抗菌性物質は、上述したグラム陰性菌に対して有効であると共に次のような特徴を有する。
（イ）プロテアーゼで消化されない。
（ロ）ｐＨ５以下（例えば、ｐＨ２〜５）で安定性を示す。
This lactic acid bacterium strain MSC003 produces an antibacterial substance against many gram-negative bacteria including E. coli. The antibacterial substance includes Salmonella serotype Enteritidis, Salmonella serotype Typhimurium, E. coli, Escherichia coli O-157, Vibrio cholerae and Pseudomonas fragii (as shown in Table 2 (antibacterial spectrum of MSC003) described in detail later). In Table 2, “serotypes” of Salmonella serotype Enteritidis and Salmonella serotype Typhimurium are omitted for ease of description. Against gram-positive bacteria such as Clostridium botulinum type A, Clostridium botulinum type B, Clostridium botulinum type F, Sporogenes, Staphylococcus aureus, Methicillin-resistant Staphylococcus, Bacillus cereus, and Listeria monocytogenes Even antibacterial.
In addition, the lactic acid bacteria MSC003 strain of this strain exhibits thermal stability under the treatment conditions of pH 4.5 and 121 ° C. for 15 minutes.
And the antibacterial substance which this strain lactic acid bacteria MSC003 strain produces is effective with respect to the Gram negative bacterium mentioned above, and has the following characteristics.
(I) Not digested with protease.
(B) It exhibits stability at pH 5 or lower (for example, pH 2 to 5).
本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株の分離菌株の保存は、ＭＲＳブイヨンで培養した培養菌液を１０％還元脱脂乳培地に０．５％量程度添加し、そのまま−２０℃から−８０℃で冷凍することで保存できる。
そして、使用にあたっては、菌株を含む保存物をＭＲＳブイヨンに１％量程度添加し、３７℃で２４時間保つことで培養することができる。
本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株の培養に使用することのできる培地としては、本菌株が増殖し得るものであれば任意のものでよい。例えば、使用可能な培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン、アミノ酸等を含む通常用いられる培地（液体培地、固体培地など）であるが、乳酸菌の培養に適する培地を用いてもよい。乳酸菌の培養に適する培地としては、例えば、ＭＲＳブイヨン、ＭＲＳ寒天培地、ＢＣＰ加プレートカウント培地、酵母エキスを０．５％量加えた１０％還元脱脂乳培地等が挙げられる。
本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株の培養は、とくに嫌気的条件下で行う必要はなく、通常の好気的条件下で培養することができる。培養条件は特に限定はないが、温度は３０〜４０℃、ｐＨは６．０〜７．０、培養時間は２４〜７２時間の範囲とされてもよい。
Preservation of the isolated strain of the lactic acid bacterium MSC003 strain is achieved by adding about 0.5% of the culture solution cultured in MRS broth to 10% reduced skim milk medium and freezing at −20 ° C. to −80 ° C. as it is. Can be saved.
And in use, it can culture | cultivate by adding about 1% amount of the preservation | save containing a strain to MRS broth, and keeping at 37 degreeC for 24 hours.
As a medium that can be used for culturing the lactic acid bacteria MSC003 strain of the present strain, any medium can be used as long as the strain can grow. For example, the usable medium is a commonly used medium (liquid medium, solid medium, etc.) containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, vitamins, amino acids, etc., but a medium suitable for culturing lactic acid bacteria can also be used. Good. Examples of the medium suitable for culturing lactic acid bacteria include MRS broth, MRS agar medium, BCP-added plate count medium, and 10% reduced skim milk medium supplemented with 0.5% yeast extract.
The lactic acid bacteria MSC003 strain of this strain need not be cultured under anaerobic conditions, and can be cultured under normal aerobic conditions. The culture conditions are not particularly limited, but the temperature may be 30 to 40 ° C., the pH may be 6.0 to 7.0, and the culture time may be 24 to 72 hours.
本培養物は、本菌株ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する乳酸菌ＭＳＣ００３株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０２６）の培養物である。
本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株の培養は、上述したような条件下にて行うことができ、その培養物（本培養物）は本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株が産生する前記の抗菌性物質を含有する。従って、本培養物自身も、それが含有する該抗菌性物質に基づくグラム陽性菌及びグラム陰性菌に対する抗菌性を有する。
また、本培養物としては、本菌株を液状または固形培地で培養した培養物全体を用いることもできるが、必要に応じて培養物の一部を分取した分取物としてもよい。分取物としては、培養液（菌体含有）、コロニー、培養上清（菌体不含）等を例示できる。そして、本培養物として培養上清を用いる場合には、培養液から菌体を遠心分離等によって分離し、培養上清液のｐＨを炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等によりｐＨを５以下に調整（例えば、ｐＨ２〜５程度）して、本抗菌剤として利用することもできる。更に、培養上清液の粗精製物を本抗菌剤として用いることもでき、この粗精製物は、例えば、培養上清液をイオン交換、限外濾過、逆浸透、ゲル濾過等の方法で抗菌活性を有する画分を取得することで調製することもできる。
The main culture is a culture of the lactic acid bacterium MSC003 strain (accession number NITE P-1026) belonging to the present strain Lactobacillus helveticus.
Cultivation of the lactic acid bacterium strain MSC003 can be performed under the above-described conditions, and the culture (main culture) contains the antibacterial substance produced by the lactic acid bacterium MSC003 strain. Therefore, this culture itself has antibacterial properties against Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria based on the antibacterial substance contained therein.
In addition, as the main culture, the whole culture obtained by culturing the present strain in a liquid or solid medium can be used, but if necessary, a fraction obtained by separating a part of the culture may be used. Examples of the fraction include a culture solution (containing microbial cells), a colony, a culture supernatant (containing no microbial cells), and the like. When using the culture supernatant as the main culture, the cells are separated from the culture solution by centrifugation or the like, and the pH of the culture supernatant solution is adjusted to 5 with sodium carbonate, sodium hydroxide, potassium hydroxide, or the like. The following antibacterial agent can also be used after adjusting (for example, about pH 2 to 5). Furthermore, a crudely purified product of the culture supernatant can also be used as the antibacterial agent. This crudely purified product can be antibacterial by, for example, ion exchange, ultrafiltration, reverse osmosis, gel filtration and the like. It can also be prepared by obtaining a fraction having activity.
本抽出組成物は、本培養物（本菌株の培養物）を炭素数１〜３のアルコールを用いて抽出する工程を経て得られる抽出組成物である。
本培養物に含まれる前記抗菌性物質は、本培養物と炭素数１〜３のアルコールとを接触させると、アルコール層に抽出されるので、本培養物からアルコール層に抽出される抽出画分を含む本抽出組成物は前記抗菌性物質を含有する。
従って、本抽出組成物も、それが含有する前記抗菌性物質に基づくグラム陽性菌及びグラム陰性菌に対する抗菌性を有する。
ここに用いる炭素数１〜３のアルコールとしては、メチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコールを例示できるが、本抽出組成物に残留する場合の低毒性を考慮すれば、エチルアルコールが好ましい。
また、炭素数１〜３のアルコールを接触させ抽出する本培養物としては、本乳酸菌株を培養した培養物そのものでもよいが、本培養物に含まれる前記抗菌性物質は本培養物を遠心分離や静置分離した際に得られる上清に含まれるので、本培養物を遠心分離や静置分離して生じる上清を該アルコール層と接触させるようにしてもよい。
The present extract composition is an extract composition obtained through a step of extracting the main culture (culture of the present strain) using an alcohol having 1 to 3 carbon atoms.
The antibacterial substance contained in the main culture is extracted into the alcohol layer when the main culture and the alcohol having 1 to 3 carbon atoms are brought into contact with each other. Therefore, the extracted fraction extracted from the main culture into the alcohol layer. The extract composition containing the above-mentioned antibacterial substance.
Therefore, this extract composition also has antibacterial properties against gram-positive bacteria and gram-negative bacteria based on the antibacterial substance contained therein.
Examples of the alcohol having 1 to 3 carbon atoms used herein include methyl alcohol, ethyl alcohol, n-propyl alcohol, and isopropyl alcohol. However, considering the low toxicity when remaining in the extract composition, ethyl alcohol is preferable.
In addition, the main culture to be extracted by contact with alcohol having 1 to 3 carbon atoms may be a culture itself obtained by culturing the lactic acid bacterial strain, but the antibacterial substance contained in the main culture is obtained by centrifuging the main culture. Or the supernatant obtained by stationary separation, the supernatant produced by centrifugation or stationary separation of the main culture may be brought into contact with the alcohol layer.
本抽出組成物は、本培養物を炭素数１〜３のアルコールを用いて抽出する工程を経て得られるものであり、本培養物から抽出された前記抗菌性物質を含有するアルコール層は、本抽出組成物中にアルコールが含まれてもよい場合には、アルコールを留去せず、そのままアルコールを含んだ状態の本抽出組成物としてもよい。そして、本培養物から抽出された前記抗菌性物質を含有するアルコール層は、それが含有するアルコールの一部又は全部を留去したり、及び／又は、それが含有する水分の一部又は全部を留去して本抽出組成物としてもよい。さらに、本培養物から抽出された前記抗菌性物質を含有するアルコール層は、乾燥固化して本抽出組成物としてもよい。
また、本抽出組成物は、水に安定して溶解するので、水溶液としておくこともできる。本抽出組成物に含まれる前記抗菌性物質はｐＨ５以下で安定した抗菌性を発揮するのでｐＨ５以下（例えば、ｐＨ＝２〜５）の水溶液としてもよい。
The present extract composition is obtained through a step of extracting the main culture with an alcohol having 1 to 3 carbon atoms, and the alcohol layer containing the antibacterial substance extracted from the main culture includes In the case where alcohol may be contained in the extraction composition, the present extraction composition may be used as it is without alcohol being distilled off. And, the alcohol layer containing the antibacterial substance extracted from the main culture is obtained by distilling off part or all of the alcohol contained therein and / or part or all of the water contained therein. It is good also as this extraction composition by distilling off. Furthermore, the alcohol layer containing the antibacterial substance extracted from the main culture may be dried and solidified to form the main extract composition.
Moreover, since this extraction composition melt | dissolves stably in water, it can also be made into aqueous solution. The antibacterial substance contained in the extract composition exhibits a stable antibacterial property at a pH of 5 or less, and may be an aqueous solution having a pH of 5 or less (for example, pH = 2 to 5).
本抽出組成物は、上述の通り、本培養物を炭素数１〜３のアルコールを用いて抽出する工程を経て得られるものであればよく何ら限定されるものではないが、例えば、本培養物にエチルアルコールを接触させる接触ステップと、接触ステップにより培養物と接触したエチルアルコール層を回収する回収ステップと、回収ステップにより回収されたエチルアルコール層のエチルアルコールを留去し抽出組成物とする留去ステップと、を含んでなる製造方法により製造されうる。 The present extract composition is not limited as long as it is obtained through the process of extracting the main culture with an alcohol having 1 to 3 carbon atoms, as described above. A contact step in which ethyl alcohol is brought into contact with, a recovery step in which the ethyl alcohol layer in contact with the culture in the contact step is recovered, and the ethyl alcohol in the ethyl alcohol layer recovered in the recovery step is distilled off to obtain an extract composition. And a leaving step.
接触ステップでは、本培養物にエチルアルコールを接触させる。
接触ステップにおける本培養物（体積）に対するエチルアルコール（体積）の比率（エチルアルコール（体積）／本培養物（体積））は、あまり小さいと前記抗菌性物質がエチルアルコール層に十分抽出されず、逆にあまり多いとエチルアルコール層が多すぎて回収ステップや留去ステップを実施することが大変になるため、これらを両立する範囲とされてもよく、特に限定されるものではないが、通常、１〜１０とされてもよい。また、接触ステップにおける本培養物及びエチルアルコールの温度は、あまり低いと凍結により前記抗菌性物質がエチルアルコール層に十分抽出されない恐れがあり、逆にあまり高いと前記抗菌性物質が変性を起こす恐れが生じるので、これらを両立する範囲とされてもよく、特に限定されるものではないが、通常、１℃〜１５℃とされてもよい。そして、接触ステップにおける本培養物及びエチルアルコールの接触時間は、あまり短いと前記抗菌性物質がエチルアルコール層に十分抽出されず、逆にあまり長いと時間がかかりすぎるので、これらを両立する範囲とされてもよく、特に限定されるものではないが、通常、４時間〜２４時間とされてもよい。
また、接触ステップにおいてエチルアルコール層と接触させる本培養物としては、本乳酸菌株を培養した培養物そのものでもよいが、本培養物に含まれる前記抗菌性物質は本培養物を遠心分離や静置分離した際に得られる上清に含まれるので、本培養物を遠心分離や静置分離して生じる上清を接触ステップにおいてエチルアルコール層と接触させるようにしてもよい。
In the contacting step, the main culture is contacted with ethyl alcohol.
If the ratio of ethyl alcohol (volume) to main culture (volume) in the contacting step (ethyl alcohol (volume) / main culture (volume)) is too small, the antibacterial substance is not sufficiently extracted into the ethyl alcohol layer, On the other hand, if the amount is too large, there are too many ethyl alcohol layers and it will be difficult to carry out the recovery step and the distillation step, so these may be in a compatible range, and although not particularly limited, It may be 1-10. In addition, if the temperature of the main culture and ethyl alcohol in the contact step is too low, the antibacterial substance may not be sufficiently extracted into the ethyl alcohol layer due to freezing, and conversely if too high, the antibacterial substance may denature. Therefore, it may be set as a range in which these are compatible, and is not particularly limited, but may be usually 1 ° C to 15 ° C. And, if the contact time of the main culture and ethyl alcohol in the contact step is too short, the antibacterial substance is not sufficiently extracted into the ethyl alcohol layer, and conversely, if it is too long, it takes too much time. Although not particularly limited, it may normally be 4 hours to 24 hours.
In addition, the main culture which is brought into contact with the ethyl alcohol layer in the contact step may be a culture itself obtained by culturing the present lactic acid strain, but the antibacterial substance contained in the main culture may be obtained by centrifuging or standing the main culture. Since it is contained in the supernatant obtained upon separation, the supernatant produced by centrifuging or static separation of the main culture may be brought into contact with the ethyl alcohol layer in the contact step.
回収ステップでは、接触ステップにより培養物と接触したエチルアルコール層を回収する。
接触ステップにおいて培養物と接触したエチルアルコール層は、培養物層とは液−液分離するので比重差を利用して遠心分離や静置分離の後に、分液することでエチルアルコール層を回収できる（上層に透明なエチルアルコール層、下層に白色の培養物層が形成される）。かかるエチルアルコール層には、本菌株が産生する前記の抗菌性物質が含まれている。
In the recovery step, the ethyl alcohol layer that has contacted the culture is recovered in the contact step.
The ethyl alcohol layer that has come into contact with the culture in the contacting step is liquid-liquid separated from the culture layer, so that the ethyl alcohol layer can be recovered by separating the solution after centrifugation or standing separation using the specific gravity difference. (A transparent ethyl alcohol layer is formed in the upper layer, and a white culture layer is formed in the lower layer). Such an ethyl alcohol layer contains the antibacterial substance produced by the strain.
留去ステップでは、回収ステップにより回収されたエチルアルコール層のエチルアルコールを留去し本抽出組成物とする。
回収ステップで回収されたエチルアルコール層からエチルアルコールを留去するには、エチルアルコールを蒸発させ除去すればよく、常圧下又は減圧下でエチルアルコールを蒸発除去してもよい（前記抗菌性物質を含む本抽出組成物が高温により劣化することを防止又は減少させることからは減圧下で行うようにしてもよい。）。
また、本抽出組成物中にエチルアルコールが含まれてもよい場合には、エチルアルコールを完全に留去せず、エチルアルコールを含んだ状態の本抽出組成物としてもよい。
本抽出組成物は、水に安定して溶解するので、水溶液としておくこともできる。本抽出組成物に含まれる前記抗菌性物質はｐＨ５以下で安定した抗菌性を発揮するのでｐＨ５以下（例えば、ｐＨ＝２〜５）の水溶液としてもよい。
In the distillation step, the ethyl alcohol in the ethyl alcohol layer recovered in the recovery step is distilled off to obtain the present extraction composition.
In order to distill off the ethyl alcohol from the ethyl alcohol layer recovered in the recovery step, the ethyl alcohol may be removed by evaporation, or the ethyl alcohol may be removed by evaporation under normal pressure or reduced pressure (the antibacterial substance may be removed). In order to prevent or reduce deterioration of the present extract composition containing it due to high temperature, it may be performed under reduced pressure.
Moreover, when ethyl alcohol may be contained in this extract composition, it is good also as this extract composition of the state which ethyl alcohol was not distilled off completely.
Since this extraction composition dissolves stably in water, it can also be made into an aqueous solution. The antibacterial substance contained in the extract composition exhibits a stable antibacterial property at a pH of 5 or less, and may be an aqueous solution having a pH of 5 or less (for example, pH = 2 to 5).
本食品組成物は、本菌株を用いて発酵する工程を用いて製造された食品組成物である。
本菌株乳酸菌ＭＳＣ００３株は、本菌株が属する乳酸菌株及び前記抗菌性物質の特徴に基づき、特に食品分野へ好適に用いることが可能である。即ち、本菌株は、本菌株を用いて発酵原料を発酵する工程を用いて発酵食品を製造するために使用することができる。なお、本菌株は、他の食品用微生物と組み合わせて発酵させることができる。
発酵原料としては、例えば、野菜、果物、乳等の発酵原料があげられ、これらを本菌株を用いて発酵させることで、本食品組成物である漬物、味噌、醤油、乳製品、ヨーグルト等を得ることができる。例えば、野菜、果物、乳等の発酵原料に本菌株を添加する場合には、原料１グラムあたり１０４個〜１０７個（１万個〜１千万個）の割合で本菌株を添加し、３０〜４０℃で発酵させるようにしてもよい。
This food composition is a food composition manufactured using the process of fermenting using this strain.
The lactic acid bacterium strain MSC003 can be suitably used particularly in the food field based on the characteristics of the lactic acid bacterium to which the bacterium belongs and the antibacterial substance. That is, this strain can be used for producing a fermented food using a step of fermenting a fermentation raw material using this strain. In addition, this strain can be fermented in combination with other food-grade microorganisms.
Examples of the fermentation raw material include fermentation raw materials such as vegetables, fruits, and milk. By fermenting these with the present strain, pickles, miso, soy sauce, dairy products, yogurt, etc., which are the food composition, can be obtained. Obtainable. For example, when adding this strain to fermentation raw materials such as vegetables, fruits and milk, the strain is added at a rate of 10 4 to 10 7 (10,000 to 10 million) per gram of the raw material. You may make it ferment at 30-40 degreeC.
本抗菌剤は、本培養物及び／又は本抽出組成物を有効成分として含有することを特徴とする抗菌剤である。
本培養物及び本抽出組成物に含まれる前記抗菌性物質に基づく抗菌性が本抗菌剤において発揮され、本抗菌剤が含む前記抗菌性物質の動物（ヒトを含む）に対する安全性から本抗菌剤は食品、動物飼料、化粧品、医薬品及び洗浄剤よりなる群より選ばれる少なくとも１つの製品の保存剤として好適に用いられる。なお、ここにいう化粧品、医薬品及び洗浄剤としては口腔等のような体腔に適用されるものを含み、そして洗浄剤には、身体用洗浄剤、手洗い用洗浄剤、衣類用洗浄剤、住居用洗浄剤及び医療機器用洗浄剤等が含まれる。
本抗菌剤の該製品への配合量は該製品の種類などにより適宜設定すればよいが、例えば、本培養物及び／又は本抽出組成物の量に換算して、１〜１００重量％の割合とされてもよい。
そして、本抗菌剤に含まれる前記抗菌性物質はｐＨ５以下で安定した抗菌性を発揮するので本抗菌剤はｐＨ５以下（例えば、ｐＨ＝２〜５）に調整されてもよい。
The antibacterial agent is an antibacterial agent containing the culture and / or the extract composition as an active ingredient.
The antibacterial agent based on the antibacterial substance contained in the culture and the extract composition is exerted in the antibacterial agent, and the antibacterial agent includes the antibacterial substance contained in the antibacterial agent for safety to animals (including humans) Is suitably used as a preservative for at least one product selected from the group consisting of food, animal feed, cosmetics, pharmaceuticals and detergents. The cosmetics, pharmaceuticals and cleaning agents mentioned here include those applied to body cavities such as the oral cavity, and the cleaning agents include body cleaning agents, hand cleaning agents, clothing cleaners, and residential use agents. A cleaning agent and a cleaning agent for medical equipment are included.
The blending amount of the antibacterial agent in the product may be set as appropriate depending on the type of the product, for example, a ratio of 1 to 100% by weight in terms of the amount of the main culture and / or the main extract composition. It may be said.
And since the said antibacterial substance contained in this antibacterial agent exhibits the stable antibacterial property at pH 5 or less, this antibacterial agent may be adjusted to pH 5 or less (for example, pH = 2-5).
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。なお、実施例において使用する「ＭＳＣ００３株」は、上述の如く、自然界や発酵食品に広く分布しているラクトバチルス・ヘルベティカスから分離されたものであり、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）に属する乳酸菌ＭＳＣ００３株として２０１１年１月６日（寄託日）付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０２６として寄託されている。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The “MSC003 strain” used in the examples was isolated from Lactobacillus helveticus widely distributed in nature and fermented foods as described above, and is a lactic acid bacterium belonging to Lactobacillus helveticus. As of MSC003 strain, on January 6, 2011 (deposit date), the National Institute for Product Evaluation and Technology Patent Microorganisms Deposit Center (NPMD) (2-5-8 Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture) has accession number NITE P- Deposited as 1026.
実験例１：ＭＳＣ００３株の抗菌スペクトル
（試験対象菌の培養）
試験の対象菌を準備し、各々の対象菌を液体培地で培養する。対象菌としては、表２に示す通り、グラム陽性菌として、ボツリヌス菌Ａ型、ボツリヌス菌Ｂ型、ボツリヌス菌Ｆ型、スポロゲネス菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性ブドウ球菌、セレウス菌及びリステリア・モノサイトゲネス菌を用い、グラム陰性菌として、サルモネラ血清型エンテリティディス、サルモネラ血清型ティフィムリウム、大腸菌、大腸菌Ｏ−１５７、コレラ菌及びシュードモナス・フラギを用いた（なお、表２中では、記載を容易にするため、サルモネラ血清型エンテリティディス及びサルモネラ血清型ティフィムリウムの「血清型」を省略している。）。
これらの対象菌のうちボツリヌス菌Ａ型、ボツリヌス菌Ｂ型及びボツリヌス菌Ｆ型の培養には、ＴＰＧＹ（Trypticase-Peptone-Glucose-Yeast extract）ブイヨンを用い、その他のスポロゲネス菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性ブドウ球菌、セレウス菌及びリステリア・モノサイトゲネス菌、サルモネラ血清型エンテリティディス、サルモネラ血清型ティフィムリウム、大腸菌、大腸菌Ｏ−１５７、コレラ菌及びシュードモナス・フラギの培養には、普通ブイヨンを用い、いずれも３５℃で２４時間培養した。
Experimental Example 1: Antibacterial spectrum of MSC003 strain (culture of test subject bacteria)
Test target bacteria are prepared, and each target bacteria is cultured in a liquid medium. As shown in Table 2, as the target bacteria, as gram-positive bacteria, Clostridium botulinum type A, Clostridium botulinum type B, Clostridium botulinum type F, Sporogenes, Staphylococcus aureus, methicillin-resistant staphylococci, Bacillus cereus, and Listeria monosite Genes bacteria was used, and Salmonella serotype Enteritidis, Salmonella serotype Typhimurium, Escherichia coli, E. coli O-157, Vibrio cholerae and Pseudomonas fragii were used as gram-negative bacteria. For the sake of simplicity, the “serotype” of Salmonella serotype Enteritidis and Salmonella serotype Typhimurium is omitted.)
TPGY (Trypticase-Peptone-Glucose-Yeast extract) bouillon is used for culturing Clostridium botulinum type A, Clostridium botulinum type B, and Clostridium botulinum type F among these target bacteria, and other Sporogenes bacteria, Staphylococcus aureus, and methicillin. For culturing resistant Staphylococcus, Bacillus cereus and Listeria monocytogenes, Salmonella serotype Enteritidis, Salmonella serotype Typhimurium, Escherichia coli, Escherichia coli O-157, Vibrio cholerae and Pseudomonas fragii, normal broth is used. All were cultured at 35 ° C. for 24 hours.
（試験液の調製）
阻止円を評価するための試験液の調製方法を図１を参照して説明する。
予め、ＭＳＣ００３株をＭＲＳブイヨン（乳酸菌用の液体培地）を用いて３７℃で２４時間の３回培養し（前培養）、前培養液を得た。
そして、市販の還元脱脂粉乳と酵母エキスを蒸留水に溶解し、０．５％酵母エキスを含む１０％還元脱脂乳培地を調製した。
調製した０．５％酵母エキスを含む１０％還元脱脂乳培地１００ｍｌにＭＳＣ００３株の前培養液１ｍｌを接種した。ＭＳＣ００３株の前培養液を接種した０．５％酵母エキスを含む１０％還元脱脂乳培地を３７℃で７２時間培養した。
培養した培養液を２０分間遠心分離（３０００Ｇ）した。
遠心分離した上清を分取した。
分取した上清５０ｍｌ（約１０℃）に５００ｍｌのエチルアルコール（約１０℃）を徐々に加えながら混合し、その後、その混合物を１０℃のまま１晩静置した。
１晩静置した該混合物を２０分間遠心分離（３０００Ｇ）した。
遠心分離した該混合物からエチルアルコール層を分液し回収した。
分液したエチルアルコール層をロータリエバポレーターにかけ、減圧下（約４５℃）にてエチルアルコールを留去した。
エチルアルコールを留去し残留した画分約１ｍｌに蒸留水を加え溶解させ１０ｍｌとした。これに１０Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ４．５に調整し、試験液とした。
(Preparation of test solution)
A method for preparing a test solution for evaluating the inhibition circle will be described with reference to FIG.
In advance, the MSC003 strain was cultured in MRS broth (liquid medium for lactic acid bacteria) three times at 37 ° C. for 24 hours (preculture) to obtain a preculture solution.
Then, commercially available reduced skim milk powder and yeast extract were dissolved in distilled water to prepare a 10% reduced skim milk medium containing 0.5% yeast extract.
100 ml of 10% reduced skim milk medium containing 0.5% yeast extract prepared was inoculated with 1 ml of the preculture solution of MSC003 strain. A 10% reduced skim milk medium containing 0.5% yeast extract inoculated with the preculture solution of MSC003 strain was cultured at 37 ° C. for 72 hours.
The cultured medium was centrifuged (3000G) for 20 minutes.
The centrifuged supernatant was collected.
To 50 ml (about 10 ° C.) of the collected supernatant, 500 ml of ethyl alcohol (about 10 ° C.) was gradually added and mixed, and then the mixture was allowed to stand overnight at 10 ° C.
The mixture, which was allowed to stand overnight, was centrifuged (3000 G) for 20 minutes.
The ethyl alcohol layer was separated and collected from the centrifuged mixture.
The separated ethyl alcohol layer was put on a rotary evaporator, and the ethyl alcohol was distilled off under reduced pressure (about 45 ° C.).
Ethyl alcohol was distilled off, and distilled water was added to about 1 ml of the remaining fraction to dissolve to make 10 ml. 10N-sodium hydroxide aqueous solution was added to this, and it adjusted to pH4.5, and was set as the test liquid.
（抗菌活性測定用寒天培地の調製）
対象菌それぞれの培養液を、約５０℃に保たれた活性測定用寒天培地（予め加熱殺菌し溶解させ調製した）に１％接種し混合して抗菌活性測定用寒天培地を調製した。なお、活性測定用寒天培地として、対象菌のうちボツリヌス菌Ａ型、ボツリヌス菌Ｂ型及びボツリヌス菌Ｆ型には、ＴＰＧＹ（Trypticase-Peptone-Glucose-Yeast extract）培地を用い、その他のスポロゲネス菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性ブドウ球菌、セレウス菌及びリステリア・モノサイトゲネス菌、サルモネラ血清型エンテリティディス、サルモネラ血清型ティフィムリウム、大腸菌、大腸菌Ｏ−１５７、コレラ菌及びシュードモナス・フラギには、普通寒天（nutrient agar）を用いた。
対象菌の培養液を接種した抗菌活性測定用寒天培地それぞれ２０ｍｌを、直径９ｃｍのシャーレに注入し、抗菌活性測定用寒天培地を固化させた。
各シャーレ内で固化した抗菌活性測定用寒天培地に直径約６ｍｍの穴（ほぼ直円柱状）をあけた（ピペット等を用いて該穴を形成した）。
(Preparation of agar medium for antibacterial activity measurement)
Agar medium for measuring antibacterial activity was prepared by inoculating 1% of the culture solution of each target bacterium into an agar medium for measuring activity maintained at about 50 ° C. (prepared by heat sterilization and dissolution). As an agar medium for activity measurement, among the target bacteria, Clostridium botulinum type A, Clostridium botulinum type B, and Clostridium botulinum type F use a TPGY (Trypticase-Peptone-Glucose-Yeast extract) medium, and other Sporogenes bacteria, Common to Staphylococcus aureus, methicillin-resistant staphylococci, Bacillus cereus and Listeria monocytogenes, Salmonella serotype Enteritidis, Salmonella serotype Typhimurium, Escherichia coli, Escherichia coli O-157, Vibrio cholerae and Pseudomonas fragii Agar (nutrient agar) was used.
20 ml of each antibacterial activity measurement agar medium inoculated with the culture solution of the target bacteria was injected into a petri dish having a diameter of 9 cm to solidify the antibacterial activity measurement agar medium.
A hole (substantially right cylindrical shape) having a diameter of about 6 mm was formed in the agar medium for antibacterial activity measurement solidified in each petri dish (the hole was formed using a pipette or the like).
（抗菌活性の評価）
抗菌活性測定用寒天培地の穴（ウエル）に５０μｌの試験液を注入した。
その後、穴（ウエル）に５０μｌの試験液を注入したシャーレそれぞれを４℃で２時間静置した後、３５℃で２４時間又は４８時間培養した。なお、対象菌のうちボツリヌス菌Ａ型、ボツリヌス菌Ｂ型及びボツリヌス菌Ｆ型は、アネロパック（登録商標）を用い嫌気ジャーにて培養し、他の対象菌は、恒温器内にて通常通り培養した。
培養後、穴（ウエル）の周囲に形成された透明な阻止円の直径（ｍｍ）を測定した。阻止円の直径は、抗菌活性測定用寒天培地の穴（ウエル）が直径６ｍｍであるので、６ｍｍを超えれば抗菌性を示している。
(Evaluation of antibacterial activity)
50 μl of the test solution was injected into a well of an agar medium for antibacterial activity measurement.
Thereafter, each petri dish in which 50 μl of the test solution was injected into the well (well) was allowed to stand at 4 ° C. for 2 hours, and then cultured at 35 ° C. for 24 hours or 48 hours. Among the target bacteria, Clostridium botulinum type A, Clostridium botulinum type B, and Clostridium botulinum type F are cultured in an anaerobic jar using Aneropack (registered trademark), and other target strains are cultured as usual in a thermostat. did.
After incubation, the diameter (mm) of the transparent blocking circle formed around the hole (well) was measured. The diameter of the inhibition circle shows antibacterial properties when the diameter of the agar medium for measuring the antibacterial activity is 6 mm, so that it exceeds 6 mm.
測定した阻止円の直径（ｍｍ）を表２に表す。
表２に示すように、ボツリヌス菌Ａ型、ボツリヌス菌Ｂ型、ボツリヌス菌Ｆ型、スポロゲネス菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性ブドウ球菌、セレウス菌及びリステリア・モノサイトゲネス菌のいずれのグラム陽性菌に対しても、そしてサルモネラ血清型エンテリティディス、サルモネラ血清型ティフィムリウム、大腸菌、大腸菌Ｏ−１５７、コレラ菌及びシュードモナス・フラギのいずれのグラム陰性菌に対しても、ＭＳＣ００３株の培養物からエチルアルコールにて抽出した成分は十分な抗菌性を示した。
As shown in Table 2, any of Gram-positive bacteria such as Clostridium botulinum type A, Clostridium botulinum type B, Clostridium botulinum type F, Sporogenes, Staphylococcus aureus, Methicillin-resistant Staphylococcus, Bacillus cereus, and Listeria monocytogenes In contrast, and against any Gram-negative bacteria of Salmonella serotype Enteritidis, Salmonella serotype Typhimurium, Escherichia coli, E. coli O-157, Vibrio cholerae and Pseudomonas fragii, The components extracted with alcohol showed sufficient antibacterial properties.
（抗菌性のｐＨによる変化測定）
上述の試験液の調整において、エチルアルコールを留去し残留した画分約１ｍｌに蒸留水を加え溶解させ１０ｍｌとした。これに１０Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液の添加量を変えてｐＨを４．０〜７．０の間で段階的に変化（ｐＨを０．５刻みで変化）させたものを試験液として、対象菌を大腸菌（グラム陰性菌）及びリステリア・モノサイトゲネス菌（グラム陽性菌）として上と同様に試験した。結果を表３に示す。
表３から明らかなように、ＭＳＣ００３株の培養物からエチルアルコールにて抽出した成分は、ｐＨ４〜５の範囲にて大腸菌（グラム陰性菌）及びリステリア・モノサイトゲネス菌（グラム陽性菌）のいずれにも抗菌性を示すが、ｐＨ５．５以上においては、大腸菌（グラム陰性菌）及びリステリア・モノサイトゲネス菌（グラム陽性菌）のいずれにも抗菌性を示さなかった。
なお、ｐＨ４以下の試験液においては乳酸に由来する抗菌作用により阻止円が形成され、本試験法ではＭＳＣ００３株の産生する抗菌性物質による抗菌作用と区別できないため、表３にはｐＨ４以下の試験結果を示していない。
In the preparation of the above test solution, ethyl alcohol was distilled off and distilled water was added to about 1 ml of the remaining fraction to dissolve it to 10 ml. The test bacteria were prepared by changing the addition amount of 10N-sodium hydroxide aqueous solution to change the pH stepwise between 4.0 and 7.0 (change the pH in 0.5 increments). Were tested as above for E. coli (Gram-negative bacteria) and Listeria monocytogenes (Gram-positive bacteria). The results are shown in Table 3.
As is clear from Table 3, the components extracted from the culture of the MSC003 strain with ethyl alcohol were either Escherichia coli (Gram negative bacteria) or Listeria monocytogenes bacteria (Gram positive bacteria) in the pH range of 4-5. However, at pH 5.5 or higher, neither Escherichia coli (Gram-negative bacteria) nor Listeria monocytogenes (Gram-positive bacteria) showed antibacterial properties.
In addition, in the test solution of pH 4 or less, a blocking circle is formed by the antibacterial action derived from lactic acid, and this test method cannot be distinguished from the antibacterial action of the antibacterial substance produced by MSC003 strain. Results are not shown.
（抗菌性の酵素処理による影響測定）
上述の試験液の調整において、エチルアルコールを留去し残留した画分約１ｍｌに蒸留水を加え溶解させ１０ｍｌとした。これに２Ｎ−塩酸水溶液又は１０Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を添加して、表４に示す各種プロテアーゼの至適ｐＨに調整した。各種プロテアーゼを５ｍｇ／ｍｌの濃度で加え、表４に示す温度で１時間反応させた後、８５℃で３０分間加熱して酵素を失活させた。２Ｎ−塩酸水溶液又は１０Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液を用いて、再度、ｐＨ４．５に調整したものを試験液とした。大腸菌を対象として上と同様に試験した。
なお、プロテアーゼとしては、表４に示すとおり、ペプシン、プロナーゼＥ、トリプシン、プロティナーゼＫ、プロテアーゼ、α−キモトリプシンを用いた。また、プロテアーゼの代わりに蒸留水を添加したものをコントロール（対照）とし、抗菌性を示す物質が過酸化水素に基づくか否かを確認するためにカタラーゼを５ｍｇ／ｍｌ添加して実験を行った。
表４中の抗菌活性（％）は、（コントロールの阻止円の直径（ｍｍ）−６ｍｍ）に対する（各実験例（ペプシン、プロナーゼＥ、トリプシン、プロティナーゼＫ、プロテアーゼ、α−キモトリプシン、カタラーゼ）の阻止円の直径（ｍｍ）−６ｍｍ）の割合（％）として示した。（コントロールの阻止円の直径（ｍｍ）−６ｍｍ）及び（各実験例（ペプシン、プロナーゼＥ、トリプシン、プロティナーゼＫ、プロテアーゼ、α−キモトリプシン、カタラーゼ）の阻止円の直径（ｍｍ）−６ｍｍ）における２つの「６ｍｍ」は抗菌活性測定用寒天培地の穴（ウエル）の直径６ｍｍを意味しているので、阻止円の直径（ｍｍ）から６ｍｍを減じた数値は抗菌性の強さを示す。即ち、上記のような抗菌活性（％）によって、各実験例（ペプシン、プロナーゼＥ、トリプシン、プロティナーゼＫ、プロテアーゼ、α−キモトリプシン、カタラーゼ）における処理によって、これらの処理がされていないコントロール（対照）に対して抗菌作用がどの程度影響を受けているかを見ることができる。
表４に示す実験結果から明らかなように、ＭＳＣ００３株の培養物に含まれる抗菌性物質は、ペプシン、プロナーゼＥ、トリプシン、プロティナーゼＫ、プロテアーゼ、α−キモトリプシンのプロテアーゼにより消化されず（抗菌活性（％）は全て１００％であり、酵素の処理により抗菌作用は影響を受けていない。）、過酸化水素に基づくものでもないことが明らかになった（カタラーゼを添加しても抗菌活性（％）は１００％であり影響を受けていない。）。
In the preparation of the above test solution, ethyl alcohol was distilled off and distilled water was added to about 1 ml of the remaining fraction to dissolve it to 10 ml. To this, 2N-hydrochloric acid aqueous solution or 10N-sodium hydroxide aqueous solution was added to adjust to the optimum pH of various proteases shown in Table 4. Various proteases were added at a concentration of 5 mg / ml, reacted at the temperature shown in Table 4 for 1 hour, and then heated at 85 ° C. for 30 minutes to inactivate the enzyme. A test solution was prepared by adjusting the pH to 4.5 again using a 2N-hydrochloric acid aqueous solution or a 10N-sodium hydroxide aqueous solution. E. coli was tested as above.
As shown in Table 4, pepsin, pronase E, trypsin, proteinase K, protease, and α-chymotrypsin were used as proteases. In addition, an experiment was performed in which 5 mg / ml of catalase was added to confirm whether or not the antibacterial substance was based on hydrogen peroxide, with the addition of distilled water instead of protease as a control. .
The antibacterial activity (%) in Table 4 indicates the inhibition of each experimental example (pepsin, pronase E, trypsin, proteinase K, protease, α-chymotrypsin, catalase) relative to (control inhibition circle diameter (mm) −6 mm). It was shown as a ratio (%) of a circle diameter (mm) -6 mm). 2 in (diameter of control inhibition circle (mm) -6 mm) and (inhibition circle diameter (mm) -6 mm of each experimental example (pepsin, pronase E, trypsin, proteinase K, protease, α-chymotrypsin, catalase)) “6 mm” means 6 mm in the diameter of the hole (well) of the agar medium for measuring antibacterial activity, and the numerical value obtained by subtracting 6 mm from the diameter (mm) of the inhibition circle indicates the antibacterial strength. That is, by the antibacterial activity (%) as described above, the control (control) in which these treatments were not performed by treatment in each experimental example (pepsin, pronase E, trypsin, proteinase K, protease, α-chymotrypsin, catalase). You can see how much the antibacterial effect is affected.
As is apparent from the experimental results shown in Table 4, the antibacterial substance contained in the culture of the MSC003 strain is not digested by the proteases pepsin, pronase E, trypsin, proteinase K, protease, and α-chymotrypsin (antibacterial activity ( %) Was 100%, and the antibacterial effect was not affected by the treatment of the enzyme.) It was revealed that it was not based on hydrogen peroxide (antibacterial activity (%) even with addition of catalase) Is 100% and not affected.)
（本抗菌剤の保存剤としての使用例）
以下、本抗菌剤を食品、動物飼料、化粧品、医薬品及び洗浄剤の製品の保存剤として用いる場合の処方例を示す。
なお、これら処方例における本抗菌剤は、上述したｐＨ４．５に調整された試験液と同様に調製したものを用いた。
(Use example of this antibacterial agent as a preservative)
Hereinafter, formulation examples in the case where the antibacterial agent is used as a preservative for foods, animal feeds, cosmetics, pharmaceuticals, and cleaning products are shown.
In addition, what was prepared similarly to the test liquid adjusted to pH4.5 mentioned above was used for this antibacterial agent in these prescription examples.
（処方例１）本抗菌剤を白菜の漬物（食品）の保存剤として用いる処方例
白菜 １０ｋｇ
食塩 ０．３ｋｇ
赤唐辛子 １０本
昆布 ５０ｃｍ
柚子 ２個
本抗菌剤 ０．５ｋｇ
(Prescription example 1) Prescription example using this antibacterial agent as a preservative for pickled Chinese cabbage (food) 10 kg of Chinese cabbage
0.3kg of salt
10 red chili peppers 50cm
2 eggplants antibacterial agent 0.5kg
（処方例２）本抗菌剤を豚用飼料（動物飼料）の保存剤として用いる処方例
とうもろこし ６０ｋｇ
ライ麦 １０ｋｇ
大豆粕 ２２ｋｇ
米ぬか粕 １．５ｋｇ
炭酸カルシウム ０．５ｋｇ
リン酸カルシウム ０．５ｋｇ
食塩 ０．５ｋｇ
本抗菌剤 ５ｋｇ
(Formulation example 2) Prescription example using this antibacterial agent as a preservative for pig feed (animal feed) Corn 60 kg
10kg rye
22kg soybean meal
Rice bran rice cake 1.5kg
Calcium carbonate 0.5kg
Calcium phosphate 0.5kg
0.5kg salt
This antibacterial agent 5kg
（処方例３）本抗菌剤を皮膚用軟膏（医薬品）の保存剤として用いる処方例
ワセリン ２０ｋｇ
ステアリルアルコール １０ｋｇ
モノステアリン酸グリセリル １ｋｇ
硬化ヒマシ油 ２ｋｇ
グリセリン ５ｋｇ
１，３−ブチレングリコール ５ｋｇ
カルボキシビニルポリマー １ｋｇ
香料 １ｋｇ
本抗菌剤 １０ｋｇ
精製水 ４５ｋｇ
(Prescription example 3) Prescription example using this antibacterial agent as a preservative for ointment for skin (medicine) Vaseline 20kg
Stearyl alcohol 10kg
1kg glyceryl monostearate
Hardened castor oil 2kg
Glycerin 5kg
1,3-butylene glycol 5kg
Carboxy vinyl polymer 1kg
Fragrance 1kg
This antibacterial agent 10kg
45kg of purified water
（処方例４）本抗菌剤を洗口剤（洗浄剤）の保存剤として用いる処方例
エチルアルコール １０ｋｇ
グリセリン １０ｋｇ
サッカリンナトリウム ２０ｇ
クエン酸 ０．２ｋｇ
ハッカ ０．５ｋｇ
香料 ０．３ｋｇ
本抗菌剤 １０ｋｇ
精製水 ４９ｋｇ
(Formulation example 4) Formulation example using this antibacterial agent as a preservative for a mouthwash (cleaning agent) Ethyl alcohol 10 kg
Glycerin 10kg
Saccharin sodium 20g
Citric acid 0.2kg
Mint 0.5kg
Fragrance 0.3kg
This antibacterial agent 10kg
49kg of purified water
（処方例５）本抗菌剤を除菌剤（洗浄剤）の保存剤として用いる処方例
エチルアルコール ２０ｋｇ
本抗菌剤 ２０ｋｇ
クエン酸 ０．５ｋｇ
香料 ０．５ｋｇ
精製水 ５９ｋｇ
(Formulation example 5) Formulation example using this antibacterial agent as a preservative for a disinfectant (cleaning agent) Ethyl alcohol 20 kg
This antibacterial agent 20kg
Citric acid 0.5kg
Fragrance 0.5kg
Purified water 59kg
ＮＩＴＥ Ｐ−１０２６ NITE P-1026
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