JP2012162572A - M−csfに対する抗体の使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の1つの実施形態では、それぞれ配列番号2および4に示す重鎖および軽鎖アミノ酸配列を含むモノクローナル抗体RX1と、M−CSFへの結合に関して75%以上競合する非マウス抗体を、マクロファージ関連疾患を有する被験体に投与することを含む、マクロファージ関連疾患を治療する方法が提供される。もう1つの実施形態では、上記非マウス抗体は、モノクローナル抗体RX1と同じM−CSFのエピトープに特異的に結合する。
【選択図】なし
Description
マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)としても知られる、コロニー刺激因子(CSF−1)は、マクロファージの産生および増殖を刺激する。マクロファージはじゅく状硬化過程の周知のメディエイターであり、初期病変内に移動して脂質を取り込むことにより閉塞性プラークの形成に寄与する。それによって生じる、心臓、脳および四肢に供給する動脈を含む血管の狭窄は、狭心症および血管閉塞の他の症状を引き起こす。マクロファージはまた、安定なプラークを不安定にさせるプロテアーゼおよび他の生物活性分子を分泌することにより、不安定プラークの形成にも寄与し得る。不安定プラークは、心筋梗塞または発作を生じさせる、血管の完全な閉塞を引き起こし得る血液凝固の引き金を引く原因的役割を果たす。最後に、マクロファージはまた、血管形成術後の再狭窄を導く過増殖性修復過程においても役割を果たし得る。数多くの使用可能な治療法にもかかわらず、アテローム硬化性血管疾患およびその関連症状と損傷結果のためのより有効な予防および治療戦略に対する大きな医学的需要がなおも存在する。そこで、そのような疾患を予防または治療するための新しい薬剤および方法を同定することが当技術分野において求められている。
本発明の物質および方法は、当技術分野における上記および他の関連する需要を満たすものである。本発明の1つの実施形態では、それぞれ配列番号2および4に示す重鎖および軽鎖アミノ酸配列を含むモノクローナル抗体RX1と、M−CSFへの結合に関して75%以上競合する非マウス抗体を、マクロファージ関連疾患を有する被験体に投与することを含む、マクロファージ関連疾患を治療する方法が提供される。もう1つの実施形態では、上記非マウス抗体は、モノクローナル抗体RX1と同じM−CSFのエピトープに特異的に結合する。本発明に従って治療されるマクロファージ関連疾患は、たとえばアテローム硬化性疾患またはHIV感染に関連する状態であり得る。しかし、本発明に従って治療されるマクロファージ関連疾患は、マクロファージ活性が病理に寄与するいかなる疾患状態を治療するためにも有用であると考えられる。
Kabatデータベースhttp://www.bioinf.org.uk/abs/seqtest.html,
Kabat Release 5.0(1992)についてのFTPサイト ftp://ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat/Rel5.0/,
ImMunoGeneTicsデータベース(Montpellier France)http://imgt.cnusc.fr:8104/,
V−Base http://www.mrc− cpe.cam.ac.uk/LIST.php?menu=901,
Zurich University http://www.unizh.ch/〜antibody/Sequences/index.html,
The Therapeutic Antibody Human Homology Project(TAHHP) http://www.path.cam.ac.uk/〜mrc7/humanisation/TAHHP.html,
Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Domains http://how.to/AnalyseAntibodies/,
Humanization by design http://people.cryst.bbk.ac.uk/〜ubcg07s/,
Antibody Resources http://www.antibodyresource.com/educational.html,
Antibody Engineering(by TT Wu),Humana Pressに認められる。上述した抗体のいずれかは、場合により抗体依存性細胞毒性または補体依存性細胞毒性活性を低下させるIgG1定常領域内の突然変異を含む、IgG1定常領域のフラグメントを含み得る。あるいは、上述した抗体のいずれかは、場合により半抗体(half−antibody)の形成を低下させるIgG4定常領域内の突然変異を含む、IgG4定常領域のフラグメントを含み得る。
Kabatデータベースhttp://www.bioinf.org.uk/abs/seqtest.html,
Kabat Release 5.0(1992)についてのFTPサイト ftp://ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat/Rel5.0/,
ImMunoGeneTicsデータベース(Montpellier France)http://imgt.cnusc.fr:8104/,
V−Base http://www.mrc− cpe.cam.ac.uk/LIST.php?menu=901,
Zurich University http://www.unizh.ch/〜antibody/Sequences/index.html,
The Therapeutic Antibody Human Homology Project(TAHHP) http://www.path.cam.ac.uk/〜mrc7/humanisation/TAHHP.html,
Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Domains http://how.to/AnalyseAntibodies/,
Humanization by design http://people.cryst.bbk.ac.uk/〜ubcg07s/,
Antibody Resources http://www.antibodyresource.com/educational.html,
Antibody Engineering(by TT Wu),Humana Pressにおけるヒト抗体配列のいずれか1つの一部に由来する、基づくまたはそれを含む。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
マクロファージ関連疾患を治療する方法であって、モノクローナル抗体RX1と、M−CSFへの結合に関して75%を超えて競合する非マウス抗体を、マクロファージ関連疾患を有する被験体に投与する工程を含み、該モノクローナル抗体RX1は、それぞれ配列番号2および4に示す重鎖および軽鎖アミノ酸配列を含む、方法。
(項目2)
前記非マウス抗体が前記モノクローナル抗体RX1と同じM−CSFのエピトープに特異的に結合する、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記マクロファージ関連疾患がアテローム硬化性疾患である、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記マクロファージ関連疾患がHIV感染に関連する状態である、項目1または2に記載の方法。
(項目5)
前記非マウス抗体が、配列番号120または121の少なくとも4個連続する残基を含むM−CSFのエピトープに結合する、項目2に記載の方法。
(項目6)
前記非マウス抗体がモノクローナル抗体である、項目1−5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記非マウス抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト遺伝子操作抗体、ヒト抗体、または一本鎖抗体である、項目1−5のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記非マウス抗体がIgG抗体である、項目1−7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記非マウス抗体が、配列番号9のM−CSFに関して少なくとも10 −7 Mまたはそれ以上の親和性K d (解離平衡定数)を保持する、項目1−8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記非マウス抗体が、配列番号9のM−CSFに関して少なくとも10 −8 Mまたはそれ以上の親和性K d を保持する、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記非マウス抗体が、配列番号9のM−CSFに関して少なくとも10 −9 Mまたはそれ以上の親和性K d を保持する、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記非マウス抗体が、配列番号24に90%同一なアミノ酸配列を含む、項目1−11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記非マウス抗体が配列番号24を含む、項目11に記載の方法。
(項目14)
前記非マウス抗体が、
(a)配列番号18、21、24、29、32および36から成る群;または
(b)配列番号 、21、24、32、36およびQASQSIGTSIH(配列番号_)から成る群
より選択される少なくとも1個の配列を含む、項目1−13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記非マウス抗体が、
(a)配列番号18、21、24、29、32および36から成る群;または
(b)配列番号 、21、24、32、36およびQASQSIGTSIH(配列番号_)から成る群
より選択される少なくとも2個の配列を含む、項目1−13のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記非マウス抗体が、
(a)配列番号18、21、24、29、32および36から成る群;または
(b)配列番号 、21、24、32、36およびQASQSIGTSIH(配列番号_)から成る群
より選択される少なくとも3個の配列を含む、項目1−13のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記非マウス抗体が、
(a)配列番号18、21、24、29、32および36から成る群;または
(b)配列番号 、21、24、32、36およびQASQSIGTSIH(配列番号_)から成る群
より選択される少なくとも4個の配列を含む、項目1−13のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記非マウス抗体が、
(a)配列番号18、21、24、29、32および36から成る群;または
(b)配列番号 、21、24、32、36およびQASQSIGTSIH(配列番号_)から成る群
より選択される少なくとも5個の配列を含む、項目1−13のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記非マウス抗体が、
(a)配列番号18、21、24、29、32および36;または
(b)配列番号18、21、24、32、36およびQASQSIGTSIH(配列番号_)
の全部を含む、項目1−13のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記非マウス抗体が、配列番号16、19、22、27、30および34のうちの1個またはそれ以上をさらに含む、項目11−18のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記非マウス抗体が、配列番号17、20、23、28、31および35のうちの1個またはそれ以上をさらに含む、項目11−18のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記非マウス抗体が、配列番号18、21、25、29、32および37のうちの1個またはそれ以上をさらに含む、項目11−18のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記非マウス抗体が、配列番号18、21、26、29、33および38に示す1またはそれ以上のコンセンサスCDRをさらに含む、項目11−18のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
前記非マウス抗体が、CDR内の少なくとも1個のアミノ酸がもう1つ別の抗M−CSF抗体の対応するCDRの対応する残基によって置換されているCDRを含む、項目11−23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記非マウス抗体が、配列番号4に示すアミノ酸配列に少なくとも65%相同である可変軽鎖アミノ酸配列を含む、項目11−24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記非マウス抗体が、配列番号2に示すアミノ酸配列に少なくとも65%相同である可変重鎖アミノ酸配列を含む、項目11−25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記非マウス抗体が、ヒト抗体配列の1個の定常領域およびヒト抗体配列の1またはそれ以上の重および軽鎖可変フレームワーク領域を含む、項目1−26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記ヒト抗体配列が、個々のヒト配列、ヒトコンセンサス配列、個々のヒト生殖細胞系配列またはヒトコンセンサス生殖細胞系配列である、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記非マウス抗体がIgG1定常領域のフラグメントを含む、項目27に記載の方法。
(項目30)
前記非マウス抗体が、抗体依存性細胞毒性または補体依存性細胞毒性活性を低下させるIgG1定常領域内の突然変異を含む、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記非マウス抗体がIgG4定常領域のフラグメントを含む、項目27に記載の方法。
(項目32)
前記非マウス抗体が、半抗体の形成を低下させるIgG4定常領域内の突然変異を含む、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記非マウス抗体が、アミノ酸配列
[式中、Xは任意のアミノ酸である]
を含む重鎖可変領域を含む、項目1−32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記非マウス抗体が、アミノ酸配列
[式中、Xは任意のアミノ酸である]
を含む重鎖可変領域を含む、項目1−32のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記非マウス抗体が、アミノ酸配列
[式中、Xは任意のアミノ酸である]
を含む重鎖可変領域を含む、項目1−32のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
前記非マウス抗体が、アミノ酸配列
[式中、Xは任意のアミノ酸である]
を含む重鎖可変領域を含む、項目1−32のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記非マウス抗体が、アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、項目1−32のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記非マウス抗体が、アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域を含む、項目1−32のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記非マウス抗体が、アミノ酸配列
[式中、Xは任意のアミノ酸である]
を含む軽鎖可変領域を含む、項目1−32のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
前記非マウス抗体が、アミノ酸配列
[式中、Xは任意のアミノ酸である]
を含む軽鎖可変領域を含む、項目1−32のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記非マウス抗体が、アミノ酸配列
[式中、Xは任意のアミノ酸である]
を含む軽鎖可変領域を含む、項目1−32のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記非マウス抗体が、アミノ酸配列
[式中、Xは任意のアミノ酸である]
を含む軽鎖可変領域を含む、項目1−32のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記非マウス抗体が、アミノ酸配列
[式中、Xは任意のアミノ酸である]
を含む軽鎖可変領域を含む、項目1−32のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記非マウス抗体が、アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、項目1−32のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
前記非マウス抗体が、アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、項目1−32のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記非マウス抗体が、アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域を含む、項目1−32のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
少なくとも1個のXが、Kabat番号付け法を用いる配列番号2または4内の同じ対応位置のアミノ酸と同じである、項目33−46のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
少なくとも1個のXが、Kabat番号付け法を用いる配列番号2または4内の同じ対応位置のアミノ酸の保存的置換である、項目33−46のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
少なくとも1個のXが、Kabat番号付け法を用いる配列番号2または4内の同じ対応位置のアミノ酸の非保存的置換である、項目33−46のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
少なくとも1個のXが、Kabat番号付け法を用いて、ヒト抗体配列内の同じ対応位置のアミノ酸である、項目33−46のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
少なくとも1個のXが、Kabat番号付け法を用いて、ヒトコンセンサス抗体配列内の同じ対応位置のアミノ酸である、項目33−46のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記ヒト抗体配列が、ヒトコンセンサス配列、ヒト生殖細胞系配列、ヒトコンセンサス生殖細胞系配列、またはKabatにおけるヒト抗体配列のいずれか1つである、項目50に記載の方法。
(項目53)
前記非マウス抗体が、配列番号114、116または119に示す重鎖配列のいずれか1つを含む、項目1−32のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記非マウス抗体が、配列番号41または43に示す重鎖可変領域配列のいずれか1つを含む、項目1−32のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
前記非マウス抗体が、配列番号45、47、48、51、53または136に示す軽鎖配列のいずれか1つを含む、項目1−32のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記非マウス抗体が、配列番号114に示す重鎖配列および配列番号47に示す軽鎖配列を含む、項目1に記載の方法。
(項目57)
前記非マウス抗体が、配列番号116に示す重鎖配列および配列番号47に示す軽鎖配列を含む、項目1に記載の方法。
(項目58)
前記非マウス抗体が、配列番号119に示す重鎖配列および配列番号47に示す軽鎖配列を含む、項目1に記載の方法。
(項目59)
前記非マウス抗体が、配列番号41または43に示す可変重鎖アミノ酸配列に少なくとも65%同一である可変重鎖アミノ酸配列を含む、項目33−46のいずれか一項に記載の方法。
(項目60)
前記非マウス抗体が、配列番号41または43に示す可変重鎖アミノ酸配列に少なくとも80%同一である可変重鎖アミノ酸配列を含む、項目59に記載の方法。
(項目61)
前記非マウス抗体が、配列番号45、47、48、51または53に示す可変軽鎖アミノ酸配列に少なくとも65%同一である可変軽鎖アミノ酸配列を含む、項目33−46のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
前記非マウス抗体が、配列番号45、47、48、51または53に示す可変軽鎖アミノ酸配列に少なくとも80%同一である可変軽鎖アミノ酸配列を含む、項目61に記載の方法。
(項目63)
前記非マウス抗体が、項目33−38、53または59−60のいずれかに示す重鎖および項目39−46、54または61−62のいずれかに示す軽鎖を含む方法。
(項目64)
前記非マウス抗体が少なくとも10 −7 の親和性Kdを有する、項目12−63のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
前記非マウス抗体が少なくとも10 −9 の親和性Kdを有する、項目64に記載の方法。
(項目66)
第二治療薬を投与することをさらに含む、項目12−65のいずれか一項に記載の方法。
(項目67)
バイアルまたはビンまたは薬剤充填済み注射器などの容器中に包装された、治療有効量の項目1−65のいずれか一項に記載の抗体を含むキットであって、該容器に添付または共に包装されたラベルをさらに含み、該ラベルは、該容器の内容物を説明し、マクロファージ関連疾患を治療するための該容器の内容物の使用に関する指示および/または指図を提供する、キット。
マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)としても知られる、コロニー刺激因子(CSF−1)は、骨髄ストローマ細胞、破骨細胞および他の細胞によって発現される。M−CSFは、細胞の中でも特に、マクロファージおよび破骨細胞の産生と増殖を刺激することが示されている。マクロファージの作用は多くの状況において有益であるが、いくつかの状況ではマクロファージ活性は有害である。マクロファージは、じゅく状斑の形成、プラークの不安定化および血管形成術後の再狭窄において役割を果たすことが示された。マクロファージおよびM−CSFの産生はまた、HIV複製に関係することが示されており、感染マクロファージはウイルスの貯蔵所として機能し得る。
1)相同性決定のために類似アミノ酸を考慮に入れて、図3に示すアミノ酸配列と少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%相同である可変重鎖アミノ酸配列を含む、および/または図3に示すアミノ酸配列と少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%相同である可変軽鎖アミノ酸配列を含む変異体を包含する、図3に示すアミノ酸配列を有するマウス抗体RX1のアミノ酸変異体;
2)図3に示すアミノ酸配列を有するマウス抗体RX1の1またはそれ以上の相補性決定領域(CDR)を含み、好ましくは少なくともRX1重鎖のCDR3を含み、および好ましくは2またはそれ以上、あるいは3またはそれ以上、あるいは4またはそれ以上、あるいは5またはそれ以上、あるいは6個全部のCDRを含む、M−CSF結合ポリペプチド(マウス抗体RX1を除く);
3)図13B−16Bに示す重および軽鎖アミノ酸配列を有するHuman Engineered(商標)抗体または図13B−16BのもとのHuman Engineered(商標)重または軽鎖と少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有する、たとえば65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%および100%の同一性を含む、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有する、重または軽鎖を含むその変異体;
4)図13B−16BのHuman Engineered(商標)抗体の1またはそれ以上のCDRの高危険度残基を含み、および好ましくは2またはそれ以上、あるいは3またはそれ以上、あるいは4またはそれ以上、あるいは5またはそれ以上、あるいは6個全部のCDRを含む、M−CSF結合ポリペプチド(マウス抗体RX1を除く);
5)Human Engineered(商標)抗体または図3Bに示す高危険度アミノ酸残基を保持し、図3Bに示す低または中危険度残基に1またはそれ以上の変化を含む、
たとえば図3Bに示す低危険度残基の1またはそれ以上の変化および中危険度残基の保存的置換を含む、または
たとえば図3Bに示す中および高危険度アミノ酸残基を保持し、低危険度残基に1またはそれ以上の変化を含む、
[但し、変化は挿入、欠失または置換を含み、保存的置換であり得るかまたは遺伝子操作抗体(engineered antibody)の配列をヒト軽鎖または重鎖配列、ヒト生殖細胞軽鎖または重鎖配列、コンセンサスヒト軽鎖または重鎖配列、またはコンセンサスヒト生殖細胞軽鎖または重鎖配列により近いものにし得る]
M−CSFに結合する能力を保持する変異体。そのような抗体は、好ましくは少なくとも10−7、10−8または10−9またはそれ以上の親和性でM−CSFに結合し、好ましくはM−CSFの所望生物活性を中和する。
1)相同性決定のために類似アミノ酸を考慮に入れて、図10に示すアミノ酸配列と少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%相同である可変重鎖アミノ酸配列を含む、および/または図10に示すアミノ酸配列と少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%相同である可変軽鎖アミノ酸配列を含む変異体を包含する、図10に示すアミノ酸配列を有するマウス抗体MC3のアミノ酸変異体;
2)図10に示すアミノ酸配列を有するマウス抗体MC3の1またはそれ以上の相補性決定領域(CDR)を含み、好ましくは少なくともMC3重鎖のCDR3を含み、および好ましくは2またはそれ以上、あるいは3またはそれ以上、あるいは4またはそれ以上、あるいは5またはそれ以上、あるいは6個全部のCDRを含む、M−CSF結合ポリペプチド(場合によりマウス抗体MC3を含むまたは除く);
3)低、中および高危険度残基を同定するために図18C−18Eに示すKabat番号付け法を使用して、Studnickaら、米国特許第5,766,886号および本文中の実施例3に述べられている方法に従ってマウス配列を変化させることによって作製されるHuman Engineered(商標)抗体であって、以下の重鎖の少なくとも1つと以下の軽鎖の少なくとも1つ:(a)低危険度残基の全部が、必要に応じて、ヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基であるように修飾されている重鎖または(b)低および中危険度残基の全部が、必要に応じて、ヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基であるように修飾されている重鎖、(c)低危険度残基の全部が、必要に応じて、ヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基であるように修飾されている軽鎖または(b)低および中危険度残基の全部が、必要に応じて、ヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基であるように修飾されている軽鎖、を含む抗体;
4)もとのHuman Engineered(商標)重または軽鎖と少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有する、たとえば65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%および100%の同一性を含む、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましく少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する重または軽鎖を含む、上記段落(3)における上記抗体の変異体;
5)図10のマウスMC3抗体の1またはそれ以上のCDRの高危険度残基を含み、および好ましくは2またはそれ以上、あるいは3またはそれ以上、あるいは4またはそれ以上、あるいは5またはそれ以上、あるいは6個全部のCDRを含む、M−CSF結合ポリペプチド(場合によりマウス抗体MC3を含むまたは除く);
6)Human Engineered(商標)抗体またはマウスMC3抗体の高危険度アミノ酸残基を保持し、低または中危険度残基に1またはそれ以上の変化を含む、
たとえば低危険度残基の1またはそれ以上の変化および中危険度残基の保存的置換を含む、または
たとえば中および高危険度アミノ酸残基を保持し、低危険度残基に1またはそれ以上の変化を含む、
[但し、変化は挿入、欠失または置換を含み、保存的置換であり得るかまたは遺伝子操作抗体の配列をヒト軽鎖または重鎖配列、ヒト生殖細胞軽鎖または重鎖配列、コンセンサスヒト軽鎖または重鎖配列、またはコンセンサスヒト生殖細胞軽鎖または重鎖配列により近いものにし得る]
M−CSFに結合する能力を保持する変異体。そのような抗体は、好ましくは少なくとも10−7、10−8または10−9またはそれ以上の親和性でM−CSFに結合し、好ましくはM−CSFの所望生物活性を中和する。
1)図3に示す完全な軽および重鎖配列を有するマウスRX1と同じM−CSFのエピトープに結合する非マウスまたは非げっ歯動物モノクローナル抗体;
2)図7のM−CSFのアミノ酸98−105の少なくとも4個の隣接アミノ酸に結合する非マウスまたは非げっ歯動物モノクローナル抗体;および
3)M−CSFへの結合に関して、図3に示す完全配列を有するマウス抗体RX1と75%以上、80%以上、または81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%または95%以上競合する非マウスまたは非げっ歯動物モノクローナル抗体を含む。そのような抗体は、好ましくは少なくとも10−7、10−8または10−9またはそれ以上の親和性でM−CSFに結合し、好ましくはM−CSFの所望生物活性を中和する。
本発明は、マクロファージ関連疾患に罹患している被験体を治療するための薬剤の製造を含む、ここで述べるM−CSF特異的抗体を用いてマクロファージ関連疾患に罹患している被験体を治療する方法を提供する。「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、完全構築抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(たとえば二重特異性抗体)、抗原に結合することができる抗体フラグメント(たとえばFab’、F’(ab)2、Fv、一本鎖抗体、ダイアボディ)、およびそれらが所望生物活性を示す限り、前記を含む組換えポリペプチドを含む。無傷完全長分子に加えて、「抗体」という用語はまた、そのフラグメント(たとえばscFv、Fv、Fd、Fab、Fab'およ
びF(ab)’2フラグメントなど)、または無傷分子および/またはM−CSF(またはM−CSFR)に結合するフラグメントの多量体または凝集物を指す。これらの抗体フラグメントは抗原に結合し、たとえばガラクトース残基の組込みにより、清掃と取込みを促進する構造特徴を示すように誘導体化され得る。
Interest,第5版、Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)によって述べられている軽鎖可変ドメイン内の残基24−34(L1)、50−56(L2)および89−97(L3)および重鎖可変ドメイン内の31−35(H1)、50−65(H2)および95−102(H3)]および/または超可変ループからの残基[すなわちChothiaら、J.Mol.Biol.196:901−917(1987)によって述べられている軽鎖可変ドメイン内の残基26−32(L1)、50−52(L2)および91−96(L3)および重鎖可変ドメイン内の26−32(H1)、53−55(H2)および96−101(H3)]を含む。
ここで提供する、マクロファージ関連疾患を治療するための組成物および方法は、所望効果を達成するために単独でまたは他の治療薬と組み合わせて使用される1またはそれ以上の抗体を利用し得る。本発明に従った抗体は、環境抗原との直接接触または抗原による免疫のいずれかの結果として抗体を産生する動物から単離し得る。あるいは、抗体は、当技術分野で周知の抗体発現系の1つを用いて組換えDNA法によって生産し得る(たとえばHarlowとLane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)参照)。そのような抗体は、すべて本発明に従ってマクロファージ関連疾患の治療のために使用し得る、組換えIgG、免疫グロブリン由来配列を有するキメラ融合タンパク質または「Human Engineered(商標)」抗体を含み得る。
ポリクローナル抗体は、好ましくは関連抗原とアジュバントの多回皮下(sc)または腹腔内(ip)注射により動物において惹起される。関連抗原を、二官能性または誘導体化試薬、たとえばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を通して複合)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リシン残基を通して)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸または当技術分野で公知の他の試薬を用いて、免疫する種において免疫原性であるタンパク質、たとえばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビターに複合することにより、改善された抗体応答が得られ得る。
モノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature,256:495(1975)によって最初に述べられたハイブリドーマ法を用いて作製し得るかまたは組換えDNA法によって作製し得る。
モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手法を用いて(たとえばモノクローナル抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドを使用することによって)ハイブリドーマ細胞から単離し、配列決定し得る。配列決定は一般に、対象とする遺伝子またはcDNAの少なくとも一部の単離を必要とする。通常これは、モノクローナル抗体をコードするDNAまたは、好ましくはmRNA(すなわちcDNA)をクローニングすることを必要とする。クローニングは標準手法を用いて実施される(たとえば参照によりここに組み込まれる、Sambrookら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Guide,Vols 1−3,Cold Spring Harbor Press参照)。たとえばcDNAライブラリーをポリA+mRNA、好ましくは膜結合mRNAの逆転写によって構築し、ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを用いてライブラリーをスクリーニングし得る。好ましい実施形態では、しかし、対象免疫グロブリン遺伝子セグメント(たとえば軽鎖可変セグメント)をコードするcDNA(または完全長cDNAの部分)を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用する。増幅された配列は、何らかの適切なベクター、たとえば発現ベクター、ミニ遺伝子ベクターまたはファージディスプレイベクターに容易にクローニングすることができる。使用するクローニングの特定方法は、対象免疫グロブリンペプチドのある程度の部分の配列を決定することが可能である限り、決定的に重要でないことは認識される。ここで使用する、「単離」核酸分子または「単離」核酸配列は、(1)同定され、核酸の天然ソースにおいて通常結合している少なくとも1つの汚染核酸分子から分離されている、または(2)対象核酸の配列が決定できるようにクローニングされ、増幅され、標識化されている、またはさもなければバックグラウンド核酸から区別される、単離されているとみなされる核酸分子である。単離核酸分子は、それが天然で認められる形態または環境以外である。単離核酸分子は、それゆえ、天然細胞において存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離核酸分子は、たとえば核酸分子が天然細胞の位置とは異なる染色体位置にある抗体を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を包含する。
Information,National Library of Medicine,National Institutes of Health,Bethesda,Mdである。
本発明の抗体は、組換えによって直接生産され得るだけでなく、好ましくはシグナル配列または成熟タンパク質またはポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生産され得る。選択されるシグナル配列は、好ましくは宿主細胞によって認識され、プロセシングされる(すなわちシグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。原核生物宿主細胞が天然抗体シグナル配列を認識およびプロセシングしない場合、シグナル配列を、たとえばペクチン酸リアーゼ(たとえばpelB)アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lpp、または熱安定エンテロトキシンIIリーダーの群から選択されるシグナル配列によって置換し得る。酵母分泌のためには、天然シグナル配列を、たとえば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(SaccharomycesおよびKluyveromycesα因子リーダーを含む)、または酸性ホスファターゼリーダー、鵞口瘡カンジダグルコアミラーゼリーダー、または国際公開番号第WO90/13646号に述べられているシグナルによって置換し得る。哺乳動物細胞発現においては、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、たとえば単純疱疹gDシグナルが使用可能である。
発現およびクローニングベクターはどちらも、ベクターが1またはそれ以上の選択宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターではこの配列は、ベクターが宿主染色体DNAとは独立して複製することを可能にするものであり、複製起点または自律複製配列を含む。そのような配列は様々な細菌、酵母およびウイルスに関して周知である。プラスミドpBR322からの複製起点は大部分のグラム陰性細菌に適し、2μプラスミド起点は酵母に適し、様々なウイルス起点は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターのために有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターのためには必要ない(SV40起点は、単にそれが初期プロモーターを含むので、典型的に使用され得る)。
発現およびクローニングベクターは、選択マーカーとも称される、選択遺伝子を含み得る。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質または他の毒素、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、テトラサイクリン、G418、ゲネチシン、ヒスチジノールまたはミコフェノール酸に対する耐性を与える、(b)栄養要求性欠損を補う、または(c)複合培地からは得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし、たとえばバチルス属についてはD−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
あるいは、本発明の抗体をコードするDNA配列、野生型DHFRタンパク質、およびアミノグリコシド3’−ホスホトランスフェラーゼ(APH)などのもう1つ別の選択マーカーで形質転換または共形質転換した宿主細胞(特に内因性DHFRを含む野生型宿主)は、アミノグリコシド系抗生物質、たとえばカナマイシン、ネオマイシン、またはG418などの選択マーカーのための選択試薬を含む培地での細胞増殖によって選択できる。たとえば米国特許第4,965,199号参照。
20,622または38,626)は、Leu2遺伝子を担持する公知のプラスミドによって補足される。Ura3欠損酵母菌株は、ura3遺伝子を担持するプラスミドによって補足される。
発現およびクローニングベクターは通常、宿主生物によって認識され、抗体をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。原核生物宿主に関する使用に適するプロモーターは、アラビノース(たとえばaraB)プロモーター、phoAプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系、およびtacプロモーターなどのハイブリッドプロモーターを含む。しかし、他の公知の細菌プロモーターも適切である。細菌系における使用のためのプロモーターはまた、本発明の抗体をコードするDNAに作動可能に連結されたシャイン−ダルガーノ配列を含む。
高等真核生物による、本発明の抗体をコードするDNAの転写は、しばしばエンハンサー配列をベクターに挿入することによって上昇する。多くのエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子から現在公知である(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン)。典型的には、しかしながら、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。例は、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(bp100−270)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントに関して、Yaniv,Nature 297:17−18(1982)も参照のこと。エンハンサーは、抗体コード配列の5’または3’側の位置でベクターにスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5’側の部位に位置する。
真核宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核細胞)において使用される発現ベクターは、転写の終結のためおよびmRNAを安定化するために必要な配列も含む。そのような配列は、一般に真核生物またはウイルスDNAまたはcDNAの5’および場合により3’非翻訳領域から得られ得る。これらの領域は、抗体をコードするmRNAの非翻訳部分内にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。1つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開番号第WO94/11026号およびその中で開示される発現ベクター参照。もう1つは、マウス免疫グロブリン軽鎖転写ターミネーターである。
ここでベクターにおいてDNAをクローニングまたは発現するための適切な宿主細胞は、上述した原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。このための適切な原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌、たとえばEscherichiaなどのEnterobacteriaceae、たとえば大腸菌、Enterobacter、Erwinia、Klebsiella、Proteus、Salmonella、たとえばネズミチフス菌、Serratia、たとえば霊菌、およびShigella、ならびに枯草菌およびB.licheniformis(たとえば1989年4月12日公開のドイツ特許第DD266,710号に開示されているB.licheniformis 41P)などのBacilli、緑膿菌などのPseudomonas、およびStreptomycesを含む。1つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、大腸菌294(ATCC 31,446)であるが、大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC 31,537)および大腸菌W3110(ATCC 27,325)などの他の菌株も適切である。これらの例は限定ではなく例示である。
56,500)、K.drosophilarum(ATCC 36,906)、K.thermotoleransおよびK.marxianusなどのKluyveromyces宿主;yarrowia(欧州特許第EP402,226号);Pichia pastors(欧州特許第EP183,070号);Candida;Trichoderma reesia(欧州特許第EP244,234号);Neurospora crassa; Schwanniomyces occidentalisなどのSchwanniomyces;およびたとえばNeurospora、Penicillium、Tolypocladiumなどの糸状菌、およびA.nidulansおよび黒色アスペルギルスなどのAspergillus宿主などの、多くの他の属、種および菌株が一般的に入手可能であり、ここで有用である。
(毛虫)、Aedes aegypti(蚊)、Aedes albopictus(蚊)、キイロショウジョウバエ(ハエ)およびBombyx moriなどの宿主から数多くのバキュロウイルス菌株および変異体および対応する許容昆虫宿主細胞が同定された。トランスフェクションのための様々なウイルス菌株、たとえばAutographa californica NPVおよびBombyx mori NPVのBm−5菌株が公的に入手可能であり、そのようなウイルスは、特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、本発明に従ってここでウイルスとして使用し得る。
CCL61)、DXB−11、DG−44を含むチャイニーズハムスター卵巣細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞/−DHFR(CHO、Urlaubら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980));SV40によって形質転換されたサル腎CV1系統(COS−7、ATCC CRL 1651);ヒト胚腎細胞系統(293または懸濁液培養中での増殖のためにサブクローニングされた293細胞[Grahamら、J.Gen Virol.36:59(1977)];ベビーハムスター腎細胞(BHK、ATCC CCL 10);マウスセルトリ細胞(TM4、Mather,Biol.Reprod.23:243−251(1980));サル腎細胞(CV1 ATCC CCL 70);アフリカミドリザル腎細胞(VERO−76、ATCC CRL−1587);ヒト子宮頸癌細胞(HELA、ATCC CCL 2);イヌ腎細胞(MDCK、ATCC CCL 34);バッファローラット肝細胞(BRL 3A、ATCC CRL1442);ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL
75);ヒト肝細胞(Hep G2、HB 8065);マウス乳腺癌(MMT 060562、ATCC CCL51);TRI細胞(Matherら、Annals N.Y Acad.Sci.383:44−68(1982));MRC 5細胞;FS4細胞;およびヒト肝細胞癌系統(Hep G2)である。
本発明の抗体を生産するために使用する宿主細胞は様々な培地で培養し得る。Ham’s F10(Sigma)、最小必須培地((MEM)、(Sigma)、RPMI−1640(Sigma)およびダルベッコ改変イーグル培地((DMEM)、Sigma)などの市販の培地が宿主細胞を培養するのに適する。加えて、Hamら、Meth.Enz.58: 44(1979)、Barnesら、Anal.Biochem.102:255(1980)、米国特許第4,767,704号;同第4,657,866号;同第4,927,762号;同第4,560,655号;または5,122,469号;国際公開番号第WO90103430号;同第WO87/00195号;または米国特許第30,985号に述べられている培地のいずれかを宿主細胞のための培地として使用し得る。これらの培地のいずれかに、ホルモンおよび/または他の成長因子(インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子など)、塩(塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩など)、緩衝剤(HEPESなど)、ヌクレオチド(アデノシンおよびチミジンなど)、抗生物質(Gentamycin(商標)薬剤など)、微量元素(通常マイクロモル範囲内の最終濃度で存在する無機化合物と定義される)、およびグルコースまたは等価エネルギー源を必要に応じて添加し得る。他のいかなる必要な添加物も、当業者に公知の適切な濃度で含まれ得る。温度、pH等のような培養条件は、発現のために選択される宿主細胞に関してこれまでに使用されたものであり、当業者には明白である。
組換え手法を使用するとき、抗体は、細胞内で、細胞周辺腔で生産され得るか、または微生物培養からを含めて、培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で生産される場合は、最初の工程として、宿主細胞または溶解フラグメントである、微粒子デブリを、たとえば遠心分離または限外ろ過によって除去する。Betterら、Science 240:
1041−1043(1988);ICSU Short Reports 10:105(1990);およびProc.Natl.Acad.Sci.USA 90:457−461(1993)は、大腸菌の細胞周辺腔に分泌された抗体を単離するための手順を述べている[Carterら、Bio/Technology 10:163−167(1992)も参照]。
キメラおよびヒト化抗体は親マウスモノクローナル抗体よりもヒトにおいて免疫原性が低いので、はるかに低いアナフィラキシーの危険度でヒトの治療のために使用できる。それゆえ、これらの抗体は、ヒトへのインビボ投与を含む治療適用において好ましいと考えられる。
抗体の特定の残基または領域の同定のための有用な方法は、CunninghamとWells,Science,244:1081−1085(1989)によって述べられたように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここでは、1個の残基または標的残基の群を同定し(たとえばarg、asp、his、lysおよびgluなどの荷電残基)、抗原とアミノ酸の相互作用に影響を及ぼすために中性または負電荷を有するアミノ酸(最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン)によって置換する。置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸を、次に、置換部位にまたは置換部位の代わりにさらなるまたは他の変異体を導入することによって改良する。そこで、アミノ酸配列部位を導入するための部位はあらかじめ定められるが、突然変異の性質自体はあらかじめ定められる必要がない。たとえば所与の部位の突然変異の成績を分析するために、アラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘発を標的コドンまたは領域で実施し、発現された抗体変異体を所望活性に関してスクリーニングする。
(1)疎水性:ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン;
(2)中性親水性:システイン、セリン、トレオニン;
(3)酸性:アスパラギン酸、グルタミン酸;
(4)塩基性:アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、アルギニン;
(5)鎖の方向に影響を及ぼす残基:グリシン、プロリン;および
(6)芳香族:トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。
Protein Sequence and Structure,vol.5,supp. 3(1978)参照]などのスコアリングマトリックスがコンピュータプログラムと共に使用できる。たとえば同一性パーセントは、その後、同一適合の総数に100を乗じ、次にマッチする範囲内のより長い配列の長さと2つの配列を整列するためにより長い配列に導入したギャップの数の合計で除して、算定することができる。
ヒト遺伝子操作(Human Engineering(商標))
抗体可変ドメインのヒト遺伝子操作(Human Engineering(商標))は、抗体分子の結合活性を維持しつつ免疫原性を低下させるための方法として、Studnickaら、米国特許第5,766,886号;Studnickaら、Protein Engineering 7:805−814(1994)]によって記述された。その方法によれば、各々の可変領域アミノ酸には置換の危険度が割り当てられた。アミノ酸置換は3つの危険度カテゴリーの1つによって区別される:(1)低危険度変化は、抗原結合を破壊する最小限の可能性で、免疫原性を低下させる最大の潜在的可能性を有するものである;(2)中危険度変化は、免疫原性をさらに低下させるが、抗原結合またはタンパク質の折りたたみに影響を及ぼす可能性がより大きいものである;(3)高危険度残基は、抗体に結合するためまたは抗体構造を維持するために重要であり、抗原結合またはタンパク質の折りたたみが影響を受ける最も高い危険度を担うものである。プロリンの三次元構造における役割のゆえに、プロリンにおける修飾は一般に、その位置が典型的には低危険度位置である場合でも、少なくとも中危険度変化とみなされる。
Engineered(商標))される。「低危険度」位置であり、前記方法に従った修飾のための候補であるアミノ酸残基は、げっ歯動物可変領域のアミノ酸配列をヒト可変領域配列と整列することによって特定される。個々のVHまたはVL配列、またはヒトコンセンサスVHまたはVL配列、または個々のまたはコンセンサスヒト生殖細胞系配列を含む、いかなるヒト可変領域も使用できる。何らかの数の低危険度位置、またはすべての低危険度位置のアミノ酸残基を変更することができる。たとえば整列したマウスとヒトのアミノ酸残基が異なる各々の低危険度位置で、げっ歯動物残基をヒト残基で置換するアミノ酸修飾を導入する。あるいは、すべての低危険度位置のアミノ酸残基および何らかの数の中危険度残基を変更することができる。理想的には、最も低い免疫原性を達成するために低および中危険度位置の全部をげっ歯動物からヒト配列に変更する。
(IgA1またはIgA2などの何らかのサブクラスの)、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4などの何らかのサブクラスの)、またはIgMを含む、Human Engineered(商標)抗体可変領域と組み合わせて使用し得る。ヒト重および軽鎖遺伝子を、哺乳動物細胞などの宿主細胞に導入し、生じる組換え免疫グロブリン産物を得て、特性決定する。
M−CSFに対するヒト抗体はまた、内因性免疫グロブリン産生を有さず、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニック動物を用いて生産できる。たとえば国際公開番号第WO98/24893号は、動物が内因性重および軽鎖遺伝子座の不活性化のために機能的内因性免疫グロブリンを生産しない、ヒトIg遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示する。国際公開番号第WO91/741号も、抗体が霊長動物定常および/または可変領域を有し、内因性免疫グロブリンをコードする遺伝子座が置換または不活性化されている、免疫原に対する免疫応答を惹起することができるトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主を開示する。国際公開番号第WO96/30498号は、修飾抗体分子を形成するために定常または可変領域の全部または一部を置換するためなどの、哺乳動物において免疫グロブリン遺伝子座を修飾するためのCre/Lox系の使用を開示する。国際公開番号第WO94/02602号は、不活性化内因性Ig遺伝子座と機能的ヒトIg遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示する。米国特許第5,939,598号は、内因性重鎖を有さず、1またはそれ以上の異種定常領域を含む外因性免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを作製する方法を開示する。
組換えヒト抗体遺伝子のレパートリーを作製するための技術の開発、および糸状バクテリオファージの表面でのコードされる抗体フラグメントの提示は、ヒト抗体を直接作製するための手段を提供した。ファージ技術によって生産される抗体は、細菌において抗原結合フラグメント−通常はFvまたはFabフラグメント−として生産され、それゆえエフェクター機能を欠く。エフェクター機能は以下の2つの戦略の1つによって導入できる:フラグメントは、哺乳動物細胞における発現のために完全抗体に構築するか、またはエフェクター機能の引き金を引くことができる第二結合部位を有する二重特異性抗体フラグメントに構築することができる。
抗体の共有結合修飾も本発明の範囲内に包含される。それらは、化学合成によってあるいは、適宜に、抗体の酵素または化学的切断によって作製し得る。抗体の他の種類の共有結合修飾は、抗体の標的アミノ酸残基を、選択側鎖あるいはNまたはC末端残基と反応することができる有機誘導体化試薬と反応させることによって分子に導入される。
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。これらの残基は中性または塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は本発明の範囲内に包含される。
適切な細胞への治療用抗体の送達は、物理的DNA導入法(たとえばリポソームまたは化学的処理)の使用またはウイルスベクター(たとえばアデノウイルス、アデノ関連ウイルスまたはレトロウイルス)の使用を含む、当技術分野で公知の適切なアプローチの使用により、エクスビボ、インサイチューまたはインビボでの遺伝子治療を通して実施できる。たとえばインビボ治療のためには、単独またはベクター、リポソームまたは沈殿物と組み合わせた、所望抗体をコードする核酸を直接被験体に注入することができ、また一部の実施形態では、抗体化合物の発現を所望する部位に注入し得る。エクスビボ治療のためには、被験体の細胞を取り出し、核酸をこれらの細胞に導入して、改変した細胞を直接被験体に戻すかまたは、たとえば多孔膜の中に被包して、それを患者に移植する。たとえば米国特許第4,892,538号および同第5,283,187号参照。核酸を生細胞に導入するために使用可能な種々の手法がある。手法は、核酸をインビトロで培養細胞に導入するか、またはインビボで意図する宿主の細胞に導入するかに依存して異なる。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の導入に適する手法は、リポソームの使用、電気穿孔、微量注入、細胞融合、DEAE−デキストラン、およびリン酸カルシウム沈殿法を含む。核酸のエクスビボでの送達のために一般的に使用されるベクターはレトロウイルスである。
有効な治療は、重大な毒性を持たない有効な薬剤を同定することに依存する。抗体は、当技術分野で公知の方法によって結合親和性に関してスクリーニングし得る。たとえばゲルシフトアッセイ、ウエスタンブロット法、放射標識競合アッセイ、クロマトグラフィーによる共分画、共沈、架橋、ELISA等が使用でき、それらはたとえば、その全体が参照によりここに組み込まれる、Current Protocols in Molecular Biology(1999)John Wiley & Sons,NYに述べられている。
Spring Harbor Laboratory,Ed HarlowとDavid Lane(1988)に述べられているような常套的交差ブロックアッセイが実施できる。未知の抗体を、本発明のM−CSF特異的抗体へのM−CSFの結合を阻害するその能力によって特性決定する、常套的競合結合アッセイも使用し得る。無傷M−CSF、そのフラグメント、あるいは図7のM−CSFのアミノ酸98−105または図7のアミノ酸65−73または138−144(5H4またはMC3によって認識されるM−CSFエピトープに対応する)によって表されるような線状エピトープが使用できる。エピトープマッピングは、Champeら、J.Biol.Chem.270:1388−1394(1995)に述べられている。
Pathol.,74(3):291−7(2003),Lewinら、AIDS,12(7):719−27(1998),Dereuddre−Bosquet Nら、AIDS Res Hum Retroviruses,13(11):961−6(1997),Zuberら、AIDS Res Hum Retroviruses,17(7):631−5(2001)、およびNorthら、J Virol,79(12):7349−54(2005)に述べられている。
動物モデルにおいて有効な2以上のM−CSF抗体が同定されているので、マクロファージ関連疾患に対して一層改善された効果を与えるために2またはそれ以上のそのようなM−CSF抗体を一緒に混合することはさらに有益であると考えられる。1またはそれ以上のM−CSF抗体を含有する組成物を、マクロファージ関連疾患に罹患しているまたは罹患する素因がある人または哺乳動物に投与し得る。2つの治療薬の同時投与は、薬剤がそれらの治療作用を及ぼす期間に重複がある限り、薬剤が同時にまたは同じ経路によって投与される必要はない。異なる日または異なる週の投与のように、同時または連続投与が考慮される。
本発明の方法の実施において使用される抗M−CSF抗体は、所望送達方法に適した担体を含有する医薬組成物中に製剤され得る。適切な担体は、抗M−CSF抗体と組み合わせたとき、抗体の所望活性を保持し、被験体の免疫系と非反応性であるいかなる物質も包含する。例は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水、静菌水等のような多くの標準医薬担体のいずれかを含むが、これらに限定されない。様々な水性担体、たとえば水、緩衝水、0.4%食塩水、0.3%グリシン等が使用でき、穏やかな化学修飾等に供した、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等のような安定性を高めるための他のタンパク質を含み得る。
Sciences 16版、Osol,A.編集(1980)に開示されている。
ら、J Clin.Invest.1055:1279−87,2000に述べられているように、インビトロでM−CSFが誘導するマウス単球(CD11b+細胞、高レベルのM−CSFに対する受容体を発現する、CD11細胞のサブセット)の増殖および生存をブロックする血清の能力を測定するアッセイを用いて評価し得る。
抗M−CSF抗体は、「裸の」または非複合形態で投与され得るか、または他の治療薬または診断薬に直接複合され得るか、またはそのような他の治療薬または診断薬を含む担体ポリマーに間接的に複合され得る。
この実施例は、M−CSF抗体RX1および5A1が種特異的であること、および抗体RX1、MC1およびMC3がヒトM−CSF活性を中和することを示す。RX1は、本出願の提出日に先立って1年以上前に使用可能となった市販抗体である。例示的な市販供給源は、マウス抗ヒトM−CSFモノクローナル抗体クローン116、692および21(Anogen);抗ヒトM−CSF抗体クローン21113.131、26730および26786(R & D Systems,Inc.);および抗ヒトM−CSF抗体クローンM16(Antigenix America,Inc.)を含むが、これらに限定されない。
この実施例は、RX1抗体のヒト化のための手順を述べる。5H4、MC1およびMC3は同様の手順を用いてヒト化される。
マウスRX1についてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図3Bに示す。National Biomedical Foundation Protein Identification Resourceまたは同様のデータベースを用いて同定されるヒト抗体の配列を、ヒト化抗体のフレームワークを与えるために使用する。ヒト化重鎖の配列を選択するため、マウスRX1重鎖配列をヒト抗体重鎖の配列と整列する。各々の位置で、その位置が以下で定義される4つのカテゴリーのいずれかに属さなければ、ヒト抗体アミノ酸をヒト化配列のために選択し、いずれかに属する場合はマウスRX1アミノ酸を選択する:
(1)その位置が、Kabat,J.Immunol.,125,961−969(1980)によって定義される、相補性決定領域(CDR)内に属する;
(2)ヒト抗体アミノ酸がその位置のヒト重鎖に関してまれであり、一方マウスRX1アミノ酸がその位置のヒト重鎖に関して一般的である;
(3)その位置がマウスRX1重鎖のアミノ酸配列内のCDRの直近にある;または
(4)マウスRX1抗体の三次元モデリングが、そのアミノ酸が物理的に抗原結合領域に近いことを示唆する。
(1)CDR;
(2)ヒト抗体よりも典型的なマウスRX1アミノ酸;
(3)CDRに隣接;または
(4)結合領域への三次元近接の可能性。
(1)ヌクレオチド配列は、上述したように選択されるアミノ酸配列をコードする;
(2)これらのコード配列の5’側で、ヌクレオチド配列はリーダー(シグナル)配列をコードする。これらのリーダー配列は抗体に典型的であるとして選択された;
(3)コード配列の3’側で、ヌクレオチド配列は、マウスRX1配列の一部である、マウス軽鎖J5セグメントおよびマウス重鎖J2セグメントに続く配列である。これらの配列は、スプライス供与シグナルを含むため、包含される;および
(4)配列の各々の末端は、XbaI部位での切断とベクターのXbaI部位へのクローニングを可能にするXbaI部位である。
重鎖を合成するため、Applied Biosystems 380B DNA合成装置を用いて4個のオリゴヌクレオチドを合成する。オリゴヌクレオチドの2個は重鎖の各々の鎖の一部であり、各々のオリゴヌクレオチドは、アニーリングを可能にするため次のものと約20ヌクレオチド重複する。合わせて、オリゴヌクレオチドは、XbaI部位での切断を可能にするための各末端の数個の余分なヌクレオチドと共にヒト化重鎖可変領域全体をカバーする。オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲルから精製する。
10μl アニーリングしたオリゴヌクレオチド
0.16mM 各々のデオキシリボヌクレオチド
0.5mM ATP
0.5mM DTT
100μg/ml BSA
3.5μg/ml T4g43タンパク質(DNAポリメラーゼ)
25μg/ml T4g44/62タンパク質(ポリメラーゼ付属タンパク質)
25μg/ml 45タンパク質(ポリメラーゼ付属タンパク質)
混合物を37℃で30分間インキュベートする。次にT4DNAリガーゼ10uを添加し、再び37℃で30分間インキュベーションを実施する。ポリメラーゼおよびリガーゼを、70℃で15分間反応物をインキュベートすることによって不活性化する。遺伝子をXbaIで消化するため、5μl中に200μg/ml BSAおよび1mM DTT、水43μlおよびXbaI 50uを含む2XTA 50μlを反応物に添加する。反応物を37℃で3時間インキュベートし、その後ゲルで精製する。XbaIフラグメントをゲルから精製し、標準方法によってプラスミドpUC19のXbaI部位にクローニングする。標準手法を用いてプラスミドを精製し、ジデオキシ法を用いて配列決定する。
発現ベクターをマウスSp2/0細胞にトランスフェクトし、プラスミドを組み込む細胞を、標準方法によって発現ベクターに与えられる選択マーカーに基づいて選択する。これらの細胞がM−CSFに結合する抗体を分泌したことを確認するため、細胞からの上清を、M−CSFを発現することが既知である細胞と共にインキュベートする。洗浄後、細胞をフルオレセイン複合ヤギ抗ヒト抗体と共にインキュベートし、洗浄して、FACSCAN細胞蛍光光度計で蛍光を分析する。
この実験は、Human Engineered(商標)RX1抗体のクローニングと発現、ならびにそのような抗体の精製と結合活性に関する試験を述べる。Human Engineered(商標)5H4、MC1およびMC3抗体は同様の手順を用いて作製される。
抗体可変ドメインのヒト遺伝子操作(Human Engineering(商標))は、Studnickaによって[たとえばStudnickaら、米国特許第5,766,886号;Studnickaら、Protein Engineering 7:805−814(1994)]抗体分子の結合活性を維持しつつ免疫原性を低下させるための方法として記述された。その方法によれば、各々の可変領域アミノ酸に置換の危険度が割り当てられた。アミノ酸置換は3つの危険度カテゴリーの1つによって区別される:(1)低危険度変化は、抗原結合を破壊する最小限の可能性で、免疫原性を低下させる最大の潜在的可能性を有するものである;(2)中危険度変化は、免疫原性をさらに低下させるが、抗原結合またはタンパク質の折りたたみに影響を及ぼす可能性がより大きいものである;(3)高危険度残基は、抗体に結合するためまたは抗体構造を維持するために重要であり、抗原結合またはタンパク質の折りたたみが影響を受ける最も高い危険度を担うものである。プロリンの三次元構造における役割のゆえに、プロリンにおける修飾は一般に、その位置が典型的には低危険度位置である場合でも、少なくとも中危険度変化とみなされる。置換変化が好ましいが、挿入および欠失も可能である。図3Bおよび3Cは、それぞれ高、中または低危険度変化と分類される、マウスRX1軽および重鎖の各アミノ酸残基についての危険度割当てを示す。
抗体由来のシグナル配列と共に上述した重および軽鎖V領域配列の各々をコードするDNAフラグメントを、合成ヌクレオチド合成を用いて構築した。上述した軽鎖V領域アミノ酸配列の各々をコードするDNAを、ヒトκ軽鎖定常領域を含むベクターpMXP10に挿入した。上述した重鎖V領域アミノ酸配列の各々をコードするDNAを、ヒトγ2重鎖定常領域を含むベクターpMXP6に挿入した。図19A、19Bおよび20に示す配列を有するヒトγ1(cDNA)およびγ4(ゲノムおよびcDNA)定常領域に融合した重鎖V領域アミノ酸配列を含む付加的なベクターも構築した。これらのベクターはすべて、hCMVプロモーターおよびマウスκ軽鎖3’非翻訳領域、ならびにそれぞれG418またはヒスチジノール耐性トランスフェクタントの選択のためのneoまたはhisなどの選択マーカー遺伝子を含む。軽および重鎖ベクターをそれぞれ表2および3に示す。
上述した軽または重鎖遺伝子のいずれかを含むベクターも、一過性トランスフェクションのために構築した。これらのベクターは、neoまたはhis遺伝子ではなく、エプスタイン‐バーウイルス核抗原を発現するHEK293細胞における複製のためのエプスタイン‐バーウイルスoriPを含むことを除き、恒久的トランスフェクションのための上述したベクターと同様である。一過性トランスフェクションのためのベクターを表5および6に示す。
各々エプスタイン‐バーウイルスからのoriPおよび上述した軽鎖または重鎖遺伝子を含む別々のベクターをHEK293E細胞に一過性にトランスフェクトした。一過性にトランスフェクトした細胞を10日間までインキュベートし、その後上清を回収して、プロテインAクロマトグラフィーを用いて抗体を精製した。293E細胞の一過性トランスフェクションによって生産されたタンパク質を以下の表7に示す。
軽鎖および重鎖遺伝子の各々1コピーを一緒に含む上述したベクター(表4)をEx−Cell 302適合CHO−K1細胞にトランスフェクトする。Ex−Cell 302培地での懸濁液増殖に適応させたCHO−K1細胞を、典型的には線状ベクター40μgで電気穿孔する。あるいは、線状DNAを線状ポリエチレンイミン(PEI)と複合し、トランスフェクションのために使用することができる。1%FBSおよびG418を添加したEx−Cell 302培地を含む96穴プレートに細胞を接種する。クローンを96穴プレート中でスクリーニングし、各々のトランスフェクションから上部〜10%のクローンを、Ex−Cell 302培地を含む24穴プレートに移す。
本発明に従ったベクターおよびすべての細胞系からの免疫グロブリンポリペプチドの精製のための方法を設計し得る。当技術分野において周知の方法に従って、終了後のろ過によって細胞を除去する。ろ液をプロテインAカラムに負荷する(必要に応じて複数回の通過)。カラムを洗浄し、その後、発現され、分泌された免疫グロブリンポリペプチドをカラムから溶出する。抗体生成物の作製のために、ウイルス不活性化工程としてプロテインAプールを低pH(最小限30分間および最大限1時間pH3)に保持する。次に生成物をさらに精製するために吸着陽イオン交換工程を使用する。吸着分離カラムからの溶出液を、潜在的ウイルス粒子のさらなる清掃を与えるためにウイルス保持フィルターに通す。生成物が結合しない陰イオン交換カラムに通すことによってろ液をさらに精製する。最後に、ダイアフィルトレーション(膜分離精製法)を通して生成物を製剤緩衝液に移すことによって精製工程を終了する。保持液を少なくとも1mg/mLのタンパク質濃度に調整し、安定剤を添加する。
組換えHuman Engineered(商標)抗体のM−CSF結合活性を評価する。タンパク質を、プロテインAカラムに通すことによって振とうフラスコ培養上清から精製し、その後A280によって濃度を測定する。上記実施例1または以下の7で述べるように結合アッセイを実施する。PBS被覆溶液中で前希釈したsM−CSF抗原をマイクロプレートに固定化するためにImmulon IIプレートを前記sM−CSF抗原で前被覆する。0.25から20μg/mlまでにわたる様々な試験濃度のM−CSFを50μl/穴で添加し、4℃で一晩インキュベートする。次にプレートをPBS−0.05%Tweenで3回洗う。PBS−0.05%Tweenに1%BSAを添加し、その後37℃で30分間インキュベートすることによってブロッキングを実施する。免疫グロブリンポリペプチドの希釈溶液をPBS−0.05%Tween1%BSA溶液中で調製する。2または3倍連続希釈溶液を調製し、二重または三重試験様式で添加する(100μl/穴)。37℃で90分間のインキュベーション後、マイクロプレートをPBS−0.05%Tweenで3回洗う。シグナル発現のために、ペルオキシダーゼに複合したヤギ抗ヒトIgG(γまたはFc特異的)二次抗体を各々の穴に添加し、37℃で60分間インキュベートした後、クエン酸緩衝液プラス0.012%H2O2中0.4mg/mlでOPDを添加する。室温で5−10分後、1M H2SO4100μlを添加してアッセイを停止し、プレートを490nmで読み取る。ヤギ抗ヒトIgG(γ特異的)およびヤギ抗ヒトIgG(Fc特異的)抗体の両方を使用した。
以下の実施例は、修飾または非修飾IgG1またはIgG4定常領域を有するRX1 Human Engineered(商標)抗体を含む、RX1由来またはRX1競合抗体などのM−CSF特異的抗体を用いたヒトの治療のための手順を述べる。MC1またはMC3由来あるいはMC1またはMC3競合抗体についてもこの手順に従うことができる。
以下の実施例は、抗体MC1およびMC3を作製するための手順を示す。MC1およびMC3は、ヒトM−CSF抗体を中和し、ヒトM−CSFに結合する2つのモノクローナルマウス抗体である。これらの抗体のアミノ酸配列を図9および10にそれぞれ示す。それらは、a)組換えヒトM−CSFによるBalb Cマウスの免疫;b)ELISA形式でのヒトM−CSFに結合する抗体を産生する陽性クローンについてのスクリーニング;c)安定なハイブリドーマクローンを生成するための陽性クローンのサブクローニング;d)大量の抗体を生産するための細胞培養のスケールアップ;e)先の実施例で述べたような親和性分析、細胞結合および中和活性アッセイでの抗体の精製と特性決定を含む、一連の工程によって同定された。
この実施例は、マウス抗M−CSF抗体RX1および5H4、ならびにそれらのFabフラグメントが異なる中和活性を有することを示す。以下の実施例はまた、抗体RX1、5H4およびMC3がM−CSFに対して種々の親和性を有することを示す。この実施例はさらに、上記無傷抗体の親和性が上記抗体のFabフラグメントに比べてより高いことを明らかにする。
以下の実施例は、アテローム硬化性病変を低減する上での本発明の抗M−CSF中和抗体の治療効果に関するインビボ試験のための手順を述べる。
以下の実施例は、AIDSを治療する上での本発明の抗M−CSF中和抗体の治療効果に関するインビボ試験のための手順を述べる。
以下の実験は、HIV−1の拡大を阻止する本発明の抗M−CSF抗体の能力を測定するための手順を述べる。
HIV−1セロネガティブ供血者の白血球搬出およびその後の密度勾配遠心分離後の血液からPBMCを単離する;単球を向流遠心細胞水簸によって精製する(Gruber,M.F.ら、J.Immunol.154:5528(1995);Gerrard,T. L.ら、Cell.Immunol.82:394(1983))。水簸した単球の生存能力をトリパンブルー排除法によって測定し、CD14の存在を代表的試料のフローサイトメトリー(FACS)分析によって測定する。MDMを生成するため、単球を、10%プールヒト血清、2mM L−グルタミン酸(Life Technologies)、1mMピルビン酸ナトリウム(Life Technologies)およびペニシリン(50U/ml)/ストレプトマイシン(50μg/ml)(Life Technologies)を含むDMEM(Life Technologies,Gaithersburg,MD)完全培地を用いて6穴組織培養プレート(Costar,Cambridge,MA)において5%CO2中37℃にて、4×106/2mlの濃度で、8日間培養中で分化させる。MDMの単離および培養に使用するすべての試薬を内毒素に関して試験する。
MDMを削り取ることによって採集し、500,000細胞/ml、1.5ml/穴の濃度で24穴組織培養プレート(Nunc,Naperville,IL)に接種する。24−48時間後、MDMをHIV−1に感染させる(Gruber,M.F.ら、J.Immunol.154:5528(1995))。その後3日ごとに、培地の80%を収集し、−80°で保存して、その後置き換える。一部の実験では、ウイルス吸着後にAZT(Sigma,St.Louis,MO)を1μMの濃度で添加し、3日ごとに補充する。また別の実験では、ウイルス吸着後に抗M−CSF抗体を添加し、3日ごとに補充する。添加する抗M−CSFの濃度は、100ng/mlのM−CSFの生物活性を中和するのに十分であるべきである。HIV−1に感染したMDM培養を、上述したように、一般にDMEM完全培地に維持する。場合により実験は逆転写酵素阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤などの第二抗HIV治療薬の添加を含み得る。
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