JP2012118363A - Confocal microscope - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、共焦点顕微鏡に関する。 The present invention relates to a confocal microscope.
従来、試料面に照射した１本のライン状の光を走査して観察を行う共焦点顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１を参照。）。 2. Description of the Related Art Conventionally, a confocal microscope that performs observation by scanning a single line of light irradiated on a sample surface is known (see, for example, Patent Document 1).
しかしながら、上述のような従来の共焦点顕微鏡によって試料から発せられた複数の波長の観察光を同時に検出したい場合には、複数の検出器を用意し、これによって観察光を波長毎に検出しなければならなかった。このため、従来の共焦点顕微鏡は波長毎に光路を形成する必要があり、小型化が難しいという問題があった。
そこで本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、複数の波長の観察光を同時に検出可能で省スペース化を図った共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。
However, if you want to simultaneously detect the observation light of multiple wavelengths emitted from the sample by the conventional confocal microscope as described above, you must prepare multiple detectors and thereby detect the observation light for each wavelength. I had to. For this reason, the conventional confocal microscope has a problem that it is necessary to form an optical path for each wavelength, and it is difficult to reduce the size.
Therefore, the present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to provide a confocal microscope capable of simultaneously detecting observation lights having a plurality of wavelengths and saving space.
上記課題を解決するために本発明は、
光源からの照明光の一部を制限して複数のスリット光を形成するための複数のスリットが並んで形成された第１遮光部材と、
前記第１遮光部材で形成された複数のスリット光を走査する走査手段と、
前記走査手段で走査された複数のスリット光を試料に集光し、前記試料上に前記複数のスリット光によるスリットパターンを投影する対物レンズと、
前記第１遮光部材と共役な位置に配置され、前記対物レンズで集光された前記試料からの観察光束の一部を制限する複数のスリットが並んで形成された第２遮光部材と、
前記第２遮光部材の複数のスリットを通過した光を検出する検出器とを有し、
前記第２遮光部材の複数のスリットのうちの１つのスリットは、他のスリットと波長透過特性が異なることを特徴とする共焦点顕微鏡を提供する。
In order to solve the above problems, the present invention
A first light-shielding member formed by arranging a plurality of slits for limiting a part of the illumination light from the light source and forming a plurality of slit lights;
Scanning means for scanning a plurality of slit lights formed by the first light shielding member;
An objective lens that focuses a plurality of slit lights scanned by the scanning unit on a sample, and projects a slit pattern by the plurality of slit lights on the sample;
A second light-shielding member that is arranged in a position conjugate with the first light-shielding member and is formed side by side with a plurality of slits that limit a part of the observation light beam collected from the sample collected by the objective lens;
A detector for detecting light that has passed through the plurality of slits of the second light shielding member,
One of the plurality of slits of the second light shielding member has a wavelength transmission characteristic different from that of the other slits, and provides a confocal microscope.
本発明によれば、複数の波長の観察光を同時に検出可能で省スペース化を図った共焦点顕微鏡を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a confocal microscope capable of simultaneously detecting observation lights having a plurality of wavelengths and saving space.
以下、本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡を添付図面に基づいて説明する。
はじめに、本実施形態に係る共焦点顕微鏡の全体的な構成を説明する。
図１に示すように共焦点顕微鏡１は、試料２を載置するステージ３、対物レンズ４、及び顕微鏡本体５を有している。顕微鏡本体５の側面には、照明光を供給する光源６が備えられており、共焦点顕微鏡１の各部を制御するコンピュータ（ＰＣ）７が接続されている。
Hereinafter, a confocal microscope according to an embodiment of the present invention will be described with reference to the accompanying drawings.
First, the overall configuration of the confocal microscope according to the present embodiment will be described.
As shown in FIG. 1, the confocal microscope 1 includes a stage 3 on which a sample 2 is placed, an objective lens 4, and a microscope body 5. A light source 6 that supplies illumination light is provided on a side surface of the microscope main body 5, and a computer (PC) 7 that controls each part of the confocal microscope 1 is connected thereto.
図２（ａ）に示すように顕微鏡本体５内の光路１００上には、光源６側から順に照明側スリット部９と第１ダイクロイックミラー１１が備えられている。
第１ダイクロイックミラー１１の反射光路１０１上には走査ミラー１２が備えられており、さらに走査ミラー１２の表側反射面の反射光路１０２上にはレンズ１３、反射ミラー１４、及び対物レンズ４が順に備えられている。また、走査ミラー１２から見て第１ダイクロイックミラー１１の透過光路１０３上には、レンズ１６、反射ミラー１７、観察側スリット部１９、反射ミラー２１、レンズ２２、及び反射ミラー２３が順に備えられている。
反射ミラー２３から見て走査ミラー１２の裏側反射面の反射光路１０４上には、ズームレンズ２５、集光レンズ２７ａ、及び検出器２８ａが順に備えられている。ズームレンズ２５により観察側スリット部１９の像を結像するか、又は、観察側スリット部１９の各スリットを透過した光束が検出器２８ａの同一画素に重畳して集光されないようにしている。
As shown in FIG. 2A, an illumination side slit portion 9 and a first dichroic mirror 11 are provided on the optical path 100 in the microscope body 5 in order from the light source 6 side.
A scanning mirror 12 is provided on the reflection light path 101 of the first dichroic mirror 11, and a lens 13, a reflection mirror 14, and the objective lens 4 are provided on the reflection light path 102 of the front-side reflection surface of the scanning mirror 12 in this order. It has been. A lens 16, a reflection mirror 17, an observation-side slit portion 19, a reflection mirror 21, a lens 22, and a reflection mirror 23 are sequentially provided on the transmission optical path 103 of the first dichroic mirror 11 when viewed from the scanning mirror 12. Yes.
A zoom lens 25, a condensing lens 27 a, and a detector 28 a are sequentially provided on the reflection light path 104 on the back side reflection surface of the scanning mirror 12 when viewed from the reflection mirror 23. An image of the observation side slit portion 19 is formed by the zoom lens 25, or a light beam transmitted through each slit of the observation side slit portion 19 is superimposed on the same pixel of the detector 28a so as not to be condensed.
光源６は、複数の波長の光を含んだ照明光を出力する光源であって、本実施形態では白色光源が用いられている。
検出器２８ａには、ＣＭＯＳカメラが用いられている。また、検出器２８ａには、図４に示すようにＰＣ７に備えられているＣＰＵ３０からの指示に基づいて検出器２８ａを制御するための検出器制御部２９ａが備えられている。なお、検出器制御部２９ａには、走査ミラー１２の動作と同期して検出器２８ａを制御するためのタイミング信号を検出器制御部２９ａへ出力する信号発生回路３０ａが備えられている。
The light source 6 is a light source that outputs illumination light including light of a plurality of wavelengths. In the present embodiment, a white light source is used.
A CMOS camera is used for the detector 28a. Further, as shown in FIG. 4, the detector 28a includes a detector control unit 29a for controlling the detector 28a based on an instruction from the CPU 30 provided in the PC 7. The detector control unit 29a includes a signal generation circuit 30a that outputs a timing signal for controlling the detector 28a to the detector control unit 29a in synchronization with the operation of the scanning mirror 12.
照明側スリット部９と観察側スリット部１９は、いずれも対物レンズ４の物体側の所定の位置に対して光学的に共役な位置に配置されている。
照明側スリット部９は、複数種類のマルチスリット１０を切替可能に保持する回転切替部材である。各マルチスリット１０は、図３（ａ）にその一例を示すように複数の細長い長方形状のスリットが並んで形成された遮光部材であって、各スリットには波長透過特性の異なる励起フィルタが貼り付けられている。本実施形態では、マルチスリット幅Ｌが異なり、かつ励起フィルタの波長透過特性の組み合わせが異なる３つのマルチスリット１０が照明側スリット部９に保持されている。ここで、マルチスリット幅Ｌとは、全てのスリット幅と全てのスリット間隔を合計した長さであって、スリット数、スリット幅、及びスリット間隔によって定められるものである。なお、本実施形態における３つのマルチスリット１０は、いずれもスリット間隔がスリット幅の２．５倍以上に設計されている。これにより、各スリットを通過したスリット光どうしの干渉を防止することができる。具体的には、図３（ａ）に示したマルチスリットの一例は、黒塗り部分が各スリットを示しており、スリット数が１０、スリット長が５ｍｍ、スリット幅が１０μｍ、スリット間隔が９０μｍ、マルチスリット幅Ｌが８９０μｍである。
斯かる構成の照明側スリット部９には、図４に示すようにＰＣ７のＣＰＵ３０からの指示に基づいて照明側スリット部９を回転させるための駆動部３１が備えられており、これによって３つのマルチスリット１０を切り替えて光路中に選択的に配置することができる。
Both the illumination side slit portion 9 and the observation side slit portion 19 are arranged at optically conjugate positions with respect to a predetermined position on the object side of the objective lens 4.
The illumination-side slit portion 9 is a rotation switching member that holds a plurality of types of multi-slits 10 in a switchable manner. Each multi-slit 10 is a light-shielding member in which a plurality of elongated rectangular slits are formed side by side as shown in FIG. 3A, and excitation filters having different wavelength transmission characteristics are attached to each slit. It is attached. In the present embodiment, three illumination slits 9 are held in the illumination-side slit section 9 with different multi-slit widths L and different combinations of wavelength transmission characteristics of excitation filters. Here, the multi-slit width L is a total length of all slit widths and all slit intervals, and is determined by the number of slits, the slit width, and the slit interval. In addition, all the three multi slits 10 in this embodiment are designed so that the slit interval is 2.5 times or more the slit width. Thereby, interference of the slit light beams that have passed through each slit can be prevented. Specifically, in the example of the multi-slit shown in FIG. 3A, the black portion indicates each slit, the number of slits is 10, the slit length is 5 mm, the slit width is 10 μm, the slit interval is 90 μm, The multi slit width L is 890 μm.
As shown in FIG. 4, the illumination side slit portion 9 having such a configuration is provided with a drive unit 31 for rotating the illumination side slit portion 9 based on an instruction from the CPU 30 of the PC 7. The multi slit 10 can be switched and selectively arranged in the optical path.
観察側スリット部１９は、上記照明側スリット部９が保持する３つのマルチスリット１０と同じマルチスリット幅Ｌの３つのマルチスリット２０を切替可能に保持する回転切替部材である。なお、マルチスリット２０の各スリットには、図３（ｂ）にその一例を示すように、マルチスリット幅Ｌの同じマルチスリット１０の各スリットに貼り付けられている励起フィルタに対応しており、波長透過特性の異なる蛍光フィルタが貼り付けられている。
斯かる観察側スリット部１９には、図４に示すようにＰＣ７のＣＰＵ３０からの指示に基づいて観察側スリット部１９を回転させるための駆動部３２が備えられており、これによって３つのマルチスリット２０を切り替えて光路中に選択的に配置することができる。
なお、上記構成の照明側スリット部９が保持する３つのマルチスリット１０と、観察側スリット部１９が保持する３つのマルチスリット２０は、観察に際して、同じマルチスリット幅Ｌのものどうしが光路中に配置して使用される。また、照明側スリット部９及び観察側スリット部１９のいずれにもスリットが設けられていない開口部を有していてもよい。
走査ミラー１２には、ガルバノミラーが用いられており、図４に示すようにＰＣ７のＣＰＵ３０からの指示に基づいて走査ミラー１２の動作を制御するためのミラー制御部３３が備えられている。
The observation-side slit part 19 is a rotation switching member that holds three multi-slits 20 having the same multi-slit width L as the three multi-slits 10 held by the illumination-side slit part 9 in a switchable manner. Each slit of the multi-slit 20 corresponds to an excitation filter attached to each slit of the multi-slit 10 having the same multi-slit width L, as shown in FIG. Fluorescent filters with different wavelength transmission characteristics are attached.
As shown in FIG. 4, the observation side slit portion 19 is provided with a drive portion 32 for rotating the observation side slit portion 19 based on an instruction from the CPU 30 of the PC 7, thereby three multi-slits. 20 can be switched and selectively placed in the optical path.
The three multi-slits 10 held by the illumination-side slit part 9 and the three multi-slits 20 held by the observation-side slit part 19 have the same multi-slit width L in the optical path during observation. Used for placement. Moreover, you may have an opening part in which neither the illumination side slit part 9 nor the observation side slit part 19 is provided with the slit.
As the scanning mirror 12, a galvano mirror is used, and as shown in FIG. 4, a mirror control unit 33 for controlling the operation of the scanning mirror 12 based on an instruction from the CPU 30 of the PC 7 is provided.
以上の構成の下、光源６から射出された照明光は、照明側スリット部９のマルチスリット１０を透過することで波長の異なる複数のスリット光となる。この複数のスリット光は、第１ダイクロイックミラー１１で反射され、さらに走査ミラー１２の表側反射面で反射された後、レンズ１３、反射ミラー１４、及び対物レンズ４を順に介してステージ３上の試料２に照射される。これにより励起された試料２から発せられた観察光（蛍光）は、再び対物レンズ４、反射ミラー１４、及びレンズ１３を順に介し、走査ミラー１２の表側反射面で反射された後、第１ダイクロイックミラー１１を透過する。そしてこの観察光は、レンズ１６と反射ミラー１７を介し、観察側スリット部１９の位置に試料２に投影されたマルチスリット１０の像が形成される。その像を形成する光線がマルチスリット２０を透過することで、試料２における観察側スリット部１９と共役な位置からの光線のみが取り出される。また、各々のスリットを通ったスリット光は、波長が異なる。この複数の波長の異なるスリット光は、反射ミラー２１、レンズ２２、及び反射ミラー２３を順に経て走査ミラー１２の裏側反射面で反射され、ズームレンズ２５と集光レンズ２７ａを介して検出器２８ａで検出される。
なお、試料２に照射される波長の異なる複数のスリット光は、走査ミラー１２によって試料面上を一次元的に走査されるため、検出器２８ａでは試料２の観察領域全体にわたって複数の波長による観察光が時系列に検出されることとなる。これによりＰＣ７は、検出器２８ａから観察光の検出信号を時系列に取得することで、各々の波長における観察光を試料２の各々の観察領域で検出し、これに基づいて試料２の二次元画像を波長毎に生成してＰＣ７のモニタ７ａに表示させる。このようにして使用者は、観察波長が異なる複数の共焦点画像を１回の走査ミラー１２の走査により観察することが可能となる。
Under the above configuration, the illumination light emitted from the light source 6 passes through the multi slit 10 of the illumination side slit portion 9 to become a plurality of slit lights having different wavelengths. The plurality of slit lights are reflected by the first dichroic mirror 11 and further reflected by the front-side reflecting surface of the scanning mirror 12, and then the sample on the stage 3 through the lens 13, the reflecting mirror 14, and the objective lens 4 in this order. 2 is irradiated. The observation light (fluorescence) emitted from the sample 2 thus excited is again reflected by the front reflecting surface of the scanning mirror 12 through the objective lens 4, the reflection mirror 14, and the lens 13 in order, and then the first dichroic. It passes through the mirror 11. The observation light forms an image of the multi-slit 10 projected on the sample 2 at the position of the observation-side slit portion 19 through the lens 16 and the reflection mirror 17. The light rays forming the image are transmitted through the multi-slit 20, whereby only the light rays from the position conjugate with the observation side slit portion 19 in the sample 2 are extracted. Moreover, the wavelength of the slit light passing through each slit is different. The slit light having a plurality of different wavelengths passes through the reflection mirror 21, the lens 22, and the reflection mirror 23 in order, and is reflected by the back side reflection surface of the scanning mirror 12, and is detected by the detector 28a via the zoom lens 25 and the condenser lens 27a. Detected.
The plurality of slit lights with different wavelengths irradiated on the sample 2 are scanned one-dimensionally on the sample surface by the scanning mirror 12, so that the detector 28a observes the entire observation region of the sample 2 with a plurality of wavelengths. Light is detected in time series. Accordingly, the PC 7 acquires the observation light detection signal from the detector 28a in time series, thereby detecting the observation light at each wavelength in each observation region of the sample 2, and based on this, the two-dimensional of the sample 2 is detected. An image is generated for each wavelength and displayed on the monitor 7a of the PC 7. In this way, the user can observe a plurality of confocal images having different observation wavelengths by scanning the scanning mirror 12 once.
ここで、検出器２８ａによって複数の波長の観察光を同時に検出する方法について説明する。
上述のように試料２から発せられた観察光は、波長の異なる複数のスリット光として検出器２８ａの検出面に照射され、走査ミラー１２によって検出面上を一次元的に走査されるため、図５（ａ）に示すように検出面上の各ラインには複数のスリット光が順次入射することになる。このため、各ラインは、各々のスリット光が入射するタイミングに同期して受光開始と受光終了を繰り返し、それぞれの受光開始から受光終了までの間で検出された検出信号の出力を行う（図６を参照。）。なお、検出器２８ａの各ラインから出力された検出信号は、ＰＣ７の一時記憶部３６内に確保された複数のフレームバッファに波長毎に別々に記憶される（図５（ｂ）を参照。）。したがって、波長の異なる複数のスリット光が検出面上を一回走査することで、一時記憶部３６に一画面分の検出信号が波長毎に記憶されることになり、これに基づいてＰＣ７のＣＰＵ３０は観察波長の異なる複数の二次元画像を生成することが可能となる。なお、検出器２８ａのラインとは、図５（ａ）に示すように検出器２８ａの検出面を構成する複数の画素のうち、スリット光の走査方向と直交する方向に並んだ画素の集合（画素群）をいう。また、本実施形態において、図４に示すＰＣ７には、検出器２８ａの各ラインで検出された検出信号を波長毎に一時的に記憶するための一時記憶部３６が備えられている。
Here, a method of simultaneously detecting observation light having a plurality of wavelengths by the detector 28a will be described.
As described above, the observation light emitted from the sample 2 is irradiated onto the detection surface of the detector 28a as a plurality of slit lights having different wavelengths and is scanned one-dimensionally on the detection surface by the scanning mirror 12. As shown in FIG. 5A, a plurality of slit lights are sequentially incident on each line on the detection surface. Therefore, each line repeats the light reception start and the light reception end in synchronization with the timing at which each slit light enters, and outputs a detection signal detected between the light reception start and the light reception end (FIG. 6). See). The detection signals output from each line of the detector 28a are stored separately for each wavelength in a plurality of frame buffers secured in the temporary storage unit 36 of the PC 7 (see FIG. 5B). . Accordingly, when a plurality of slit lights having different wavelengths scan the detection surface once, a detection signal for one screen is stored in the temporary storage unit 36 for each wavelength, and based on this, the CPU 30 of the PC 7 is stored. Can generate a plurality of two-dimensional images having different observation wavelengths. As shown in FIG. 5A, the line of the detector 28a is a set of pixels arranged in a direction perpendicular to the scanning direction of the slit light among a plurality of pixels constituting the detection surface of the detector 28a ( Pixel group). In the present embodiment, the PC 7 shown in FIG. 4 is provided with a temporary storage unit 36 for temporarily storing the detection signals detected by the respective lines of the detector 28a for each wavelength.
上記構成の下、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、検出器２８ａの各ラインの受光動作を設定するための図７に示す受光動作設定ルーチンを実行可能に構成されている。
受光動作設定ルーチンは、使用者が本ルーチンの開始の指示をＰＣ７へ入力することで開始される。
ステップＳ１：ＰＣ７のＣＰＵ３０が、使用者によって走査ミラー１２の所望の駆動周波数と振幅、及び所望の受光時間がＰＣ７へ入力されているか否かを判定する。これらがＰＣ７へ入力されている場合はステップＳ２へ進み、そうでない場合は本ステップＳ１を再度実行する。なお、前記所望の受光時間は、各ラインの受光時間を設定する上で基準となるものである。
ステップＳ２：ＣＰＵ３０が、使用者によって観察側スリット部１９の３つのマルチスリット２０から所望のマルチスリット２０が選択され、その情報がＰＣ７へ入力されているか否かを判定する。所望のマルチスリット２０の情報がＰＣ７へ入力されている場合はステップＳ３へ進み、そうでない場合は本ステップＳ２を再度実行する。
Under the above configuration, the confocal microscope 1 according to the present embodiment is configured to be able to execute the light receiving operation setting routine shown in FIG. 7 for setting the light receiving operation of each line of the detector 28a.
The light receiving operation setting routine is started when the user inputs an instruction to start this routine to the PC 7.
Step S1: The CPU 30 of the PC 7 determines whether or not a desired driving frequency and amplitude of the scanning mirror 12 and a desired light receiving time are input to the PC 7 by the user. If these are input to the PC 7, the process proceeds to step S2, and if not, this step S1 is executed again. The desired light receiving time is a reference for setting the light receiving time of each line.
Step S2: The CPU 30 determines whether or not a desired multi-slit 20 is selected from the three multi-slits 20 of the observation-side slit 19 by the user and the information is input to the PC 7. If the information on the desired multi-slit 20 has been input to the PC 7, the process proceeds to step S3, and if not, this step S2 is executed again.
ステップＳ３：ＣＰＵ３０が、ステップＳ１で得られた走査ミラー１２の所望の駆動周波数と振幅に基づいて、検出器２８ａの検出面上を走査する複数のスリット光の各ラインへの到達時間（各スリット光が走査し始めてから各ラインへ到達するまでの時間）を算出する。またＣＰＵ３０が、ＰＣ７の一時記憶部３６内に、前記複数のスリット光と同じ数のフレームバッファ、即ちステップＳ２で選択された所望のマルチスリット２０のスリット数と同じ数のフレームバッファを確保する。
ステップＳ４：ＣＰＵ３０が、ステップＳ３で得られた各スリット光の各ラインへの到達時間を、各スリット光が各ラインに入射する度に各ラインで実行される受光の受光開始時間として、各ラインの各スリット光に対する受光開始時間と受光時間からなる制御テーブルを作成する。なお、本実施形態において、当該受光時間は全て共通であり、ステップＳ１で得られた所望の受光時間がそのまま用いられる。
ステップＳ５：ＣＰＵ３０が、ステップＳ４で作成した制御テーブルの情報を検出器制御部２９ａへ出力し、本ルーチンが終了する。
Step S3: Based on the desired drive frequency and amplitude of the scanning mirror 12 obtained in Step S1, the CPU 30 arrives at each line of a plurality of slit lights that scan the detection surface of the detector 28a (each slit The time from when the light starts to scan until it reaches each line is calculated. Further, the CPU 30 secures the same number of frame buffers as the plurality of slit lights in the temporary storage unit 36 of the PC 7, that is, the same number of frame buffers as the number of slits of the desired multi-slit 20 selected in step S2.
Step S4: The CPU 30 sets the arrival time of each slit light obtained in Step S3 as the light reception start time of light reception executed in each line every time the slit light enters each line. A control table including the light reception start time and the light reception time for each of the slit lights is created. In the present embodiment, all the light reception times are common, and the desired light reception time obtained in step S1 is used as it is.
Step S5: The CPU 30 outputs the information of the control table created in step S4 to the detector control unit 29a, and this routine ends.
本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、上記受光動作設定ルーチンを実行することで、走査ミラー１２の所望の駆動周波数と振幅、所望の受光時間、及び観察側スリット部１９のマルチスリット２０に合わせて、各ラインの受光動作を制御するための制御テーブルを作成し、これを検出器制御部２９ａへ出力することができる。
これにより、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１において、検出器２８ａが試料２からの観察光を検出する、即ち受光を行う際には、上記制御テーブルに基づいて信号発生回路３０ａがタイミング信号を出力する。そして、このタイミング信号にしたがって検出器制御部２９ａが検出器２８ａの各ラインの受光動作を制御することで、各ラインの受光開始時間と受光時間を適切に制御することができる（図６を参照。）。したがって、検出器２８ａの検出面上を走査する複数のスリット光が各ラインに順次入射する度に、各ラインで受光を適切に行うことができる。なお、検出器制御部２９ａは、各ラインが受光を行う度に、受光によって得られた検出信号をＰＣ７の一時記憶部３６内の所定のフレームバッファへ出力する（図６を参照。）。以上のようにして検出器２８ａの各ラインは各スリット光が入射するのと同期して受光の開始を行い、受光終了までの間に受光された検出信号の出力を適切に行うことができ、一時記憶部３６の複数のフレームバッファに検出信号が波長毎に記憶されることとなる。そしてこれに基づいてＣＰＵ３０は、観察波長の異なる複数の二次元画像を生成することが可能となる。
The confocal microscope 1 according to the present embodiment executes the light receiving operation setting routine to match the desired drive frequency and amplitude of the scanning mirror 12, the desired light receiving time, and the multi-slit 20 of the observation side slit unit 19. Thus, a control table for controlling the light receiving operation of each line can be created and output to the detector control unit 29a.
Thereby, in the confocal microscope 1 according to the present embodiment, when the detector 28a detects the observation light from the sample 2, that is, when receiving light, the signal generation circuit 30a outputs the timing signal based on the control table. Output. The detector control unit 29a controls the light receiving operation of each line of the detector 28a according to this timing signal, so that the light receiving start time and the light receiving time of each line can be appropriately controlled (see FIG. 6). .) Therefore, each time a plurality of slit lights that scan the detection surface of the detector 28a sequentially enter each line, it is possible to appropriately receive light on each line. The detector control unit 29a outputs a detection signal obtained by light reception to a predetermined frame buffer in the temporary storage unit 36 of the PC 7 every time each line receives light (see FIG. 6). As described above, each line of the detector 28a can start light reception in synchronization with the incidence of each slit light, and can appropriately output the detection signal received until the end of light reception, Detection signals are stored for each wavelength in the plurality of frame buffers of the temporary storage unit 36. Based on this, the CPU 30 can generate a plurality of two-dimensional images having different observation wavelengths.
以上、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１によれば、試料２から発せられた複数の波長の観察光を１つの検出器２８ａで同時に検出することができ、上述した従来の共焦点顕微鏡のように複数の検出器を必要としないため、小型化が実現でき、部品点数も少なくなるので低価格化を実現することもできる。また、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、上述のように照明側スリット部９が保持するマルチスリット１０の各スリットに励起フィルタを貼り付け、観察側スリット部１９が保持するマルチスリット２０の各スリットに蛍光フィルタを貼り付けた構成であるため、これらのフィルタは従来の共焦点顕微鏡に備えられた励起フィルタや蛍光フィルタに比して十分に小型であり、これによってさらなる低価格化を実現することができる。 As described above, according to the confocal microscope 1 according to the present embodiment, the observation light having a plurality of wavelengths emitted from the sample 2 can be simultaneously detected by the single detector 28a, as in the conventional confocal microscope described above. In addition, since a plurality of detectors are not required, the size can be reduced and the number of parts can be reduced, so that the price can be reduced. In addition, the confocal microscope 1 according to the present embodiment has an excitation filter attached to each slit of the multi slit 10 held by the illumination side slit portion 9 as described above, and the multi slit 20 held by the observation side slit portion 19. Since the fluorescent filter is attached to each slit, these filters are sufficiently small compared to the excitation filters and fluorescent filters provided in conventional confocal microscopes. can do.
なお、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１において、照明側スリット部９が保持するマルチスリット１０の各スリットには、上述のように波長透過特性の異なる励起フィルタが貼り付けられており、観察側スリット部１９が保持するマルチスリット２０の各スリットには、前記励起フィルタに対応した蛍光フィルタが貼り付けられている。しかしこれに限られず、マルチスリット１０の各スリットのうち、複数のスリットに波長透過特性の同じ励起フィルタを貼り付け、これに対応してマルチスリット２０の各スリットのうち、複数のスリットに波長透過特性の同じ蛍光フィルタを貼り付けた構成としてもよい。この構成により、観察波長の同じ複数の共焦点画像を取得することができるため、これらの画像をＰＣ７のＣＰＵ３０が合成することで、１枚の明るい共焦点画像を取得することが可能となる。したがって、低い強度の照明光によって試料２の明るい共焦点画像を取得することが可能となり、高い強度の照明光が試料２に悪影響を及ぼしてしまうという光毒性の問題を解消することができる。 In the confocal microscope 1 according to the present embodiment, the excitation filters having different wavelength transmission characteristics as described above are attached to the slits of the multi-slit 10 held by the illumination-side slit unit 9, and the observation side A fluorescent filter corresponding to the excitation filter is attached to each slit of the multi-slit 20 held by the slit portion 19. However, the present invention is not limited to this, and excitation filters having the same wavelength transmission characteristics are attached to a plurality of slits among the slits of the multi-slit 10, and the wavelength transmission is transmitted to the plurality of slits among the slits of the multi-slit 20 correspondingly. It is good also as a structure which affixed the fluorescence filter with the same characteristic. With this configuration, a plurality of confocal images having the same observation wavelength can be acquired. Therefore, the CPU 30 of the PC 7 can combine these images to acquire a single bright confocal image. Therefore, it is possible to acquire a bright confocal image of the sample 2 with the low intensity illumination light, and the phototoxicity problem that the high intensity illumination light adversely affects the sample 2 can be solved.
また、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１において、上記受光動作設定ルーチンで作成される制御テーブル中の受光時間は、上述のように全て共通である。しかしこれに限られず、受光時間を必要に応じて適宜変更した制御テーブルを作成する構成としてもよい。例えば、走査ミラー１２の動作速度、即ち複数のスリット光が検出器２８ａの検出面上を走査する速度の変化に応じて、ライン毎に受光時間を変更して制御テーブルを作成する構成としてもよい。これにより、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１で取得される観察波長の異なる複数の共焦点画像の明るさムラを解消することができる。 In the confocal microscope 1 according to the present embodiment, the light reception times in the control table created by the light reception operation setting routine are all common as described above. However, the present invention is not limited to this, and a configuration may be adopted in which a control table in which the light reception time is appropriately changed as necessary is created. For example, the control table may be created by changing the light reception time for each line in accordance with the change in the operation speed of the scanning mirror 12, that is, the speed at which the plurality of slit lights scan the detection surface of the detector 28a. . Thereby, the brightness nonuniformity of the several confocal image from which the observation wavelength which is acquired with the confocal microscope 1 which concerns on this embodiment differs can be eliminated.
また、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、上述のように照明側スリット部９のマルチスリット１０に励起フィルタを備え、観察側スリット部１９のマルチスリット２０に蛍光フィルタを備えており、これによって試料２が発した蛍光を観察する共焦点蛍光顕微鏡である。しかしこれに限られず、少なくとも観察側スリット部１９が保持するマルチスリット２０の各スリットに波長透過特性の異なる波長選択フィルタを貼り付けた構成とすることで、通常の共焦点顕微鏡を実現することもできる。 Moreover, the confocal microscope 1 according to the present embodiment includes the excitation filter in the multi slit 10 of the illumination side slit portion 9 and the fluorescent filter in the multi slit 20 of the observation side slit portion 19 as described above. This is a confocal fluorescence microscope for observing the fluorescence emitted from the sample 2. However, the present invention is not limited to this, and an ordinary confocal microscope can be realized by using a configuration in which wavelength selective filters having different wavelength transmission characteristics are attached to each slit of the multi-slit 20 held by the observation-side slit unit 19 at least. it can.
１ 共焦点顕微鏡
２ 試料
４ 対物レンズ
７ ＰＣ
９ 照明側スリット部
１０ マルチスリット
１２ 走査ミラー
１９ 観察側スリット部
２０ マルチスリット
２８ａ，２８ｂ 検出器
２９ａ，２９ｂ 検出器制御部
３０ａ，３０ｂ 信号発生回路
３０ ＣＰＵ
３６ 一時記憶部
1 Confocal microscope 2 Sample 4 Objective lens 7 PC
DESCRIPTION OF SYMBOLS 9 Illumination side slit part 10 Multi slit 12 Scanning mirror 19 Observation side slit part 20 Multi slit 28a, 28b Detector 29a, 29b Detector control part 30a, 30b Signal generation circuit 30 CPU
36 Temporary storage
Claims (6)
前記第１遮光部材で形成された複数のスリット光を走査する走査手段と、
前記走査手段で走査された複数のスリット光を試料に集光し、前記試料上に前記複数のスリット光によるスリットパターンを投影する対物レンズと、
前記第１遮光部材と共役な位置に配置され、前記対物レンズで集光された前記試料からの観察光束の一部を制限する複数のスリットが並んで形成された第２遮光部材と、
前記第２遮光部材の複数のスリットを通過した光を検出する検出器とを有し、
前記第２遮光部材の複数のスリットのうちの１つのスリットは、他のスリットと波長透過特性が異なることを特徴とする共焦点顕微鏡。 A first light-shielding member formed by arranging a plurality of slits for limiting a part of the illumination light from the light source and forming a plurality of slit lights;
Scanning means for scanning a plurality of slit lights formed by the first light shielding member;
An objective lens that focuses a plurality of slit lights scanned by the scanning unit on a sample, and projects a slit pattern by the plurality of slit lights on the sample;
A second light-shielding member that is arranged in a position conjugate with the first light-shielding member and is formed side by side with a plurality of slits that limit a part of the observation light beam collected from the sample collected by the objective lens;
A detector for detecting light that has passed through the plurality of slits of the second light shielding member,
One of the plurality of slits of the second light shielding member has a wavelength transmission characteristic different from that of the other slits.
前記第２遮光部材の複数のスリットには、前記波長透過特性の異なる励起フィルタに対応する蛍光フィルタが備えられていることを特徴とする請求項２に記載の共焦点顕微鏡。 The plurality of slits of the first light shielding member are provided with excitation filters having different wavelength transmission characteristics,
The confocal microscope according to claim 2, wherein the plurality of slits of the second light shielding member are provided with fluorescent filters corresponding to the excitation filters having different wavelength transmission characteristics.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018050318A (en) * | 2017-11-02 | 2018-03-29 | 浜松ホトニクス株式会社 | Image acquisition device, imaging device, and calculation device |
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-
2010
- 2010-12-02 JP JP2010268972A patent/JP2012118363A/en not_active Withdrawn
Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| US10142566B2 (en) | 2013-02-01 | 2018-11-27 | Hamamatsu Photonics K.K. | Rolling readout type camera and imaging method for using the same |
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