JP2012105659A - グラム陽性菌の血清耐性因子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】細菌感染症の処置又は予防に使用することができる、新たに特定されたグラム陽性菌の血清耐性因子、BibAポリペプチド。該タンパク質は、コイルドコイルドメイン、BibAタンパク質のリーダー配列及び該コイルドコイルドメイン、BibAタンパク質のプロリンリッチドメイン、BibAタンパク質のコイルドコイルドメイン及びプロリンリッチドメイン、並びに、BibAタンパク質のリーダー配列、コイルドコイルドメイン及びプロリンリッチドメインからなる群から選択されるBibAタンパク質の一部を含む。
【選択図】なし
Description
80,479号および2005年11月29日に出願された同第60/740,291号
の利益を主張し、そしてこれらの出願を参考として援用する。
本発明は免疫学及びワクチン学の分野に関する。特に、新たに同定されたグラム陽性菌
の血清耐性因子、及びその細菌感染症の処置及び予防のための組成物の使用に関する。
グラム陽性菌のB群ストレプトコッカス(GBS)は、新生児、妊婦、高齢者及び慢性
疾患患者における致命的な細菌感染症の最も重要な原因の一つである。ストレプトコッカ
ス・ピオゲネス(GBS)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Strep pneu
mo)及びスタフィロコッカス・アウレウス(Staph)等のその他のグラム陽性菌も
、世界の重大な罹患率及び死亡率に関与している。
タンパク質に発現し、宿主粘膜表面の良好なコロニー形成に寄与する(非特許文献1;
Talay, 2005)特に、ストレプトコッカス・アガラクティエ(GBS)及びス
トレプトコッカス・ピオゲネス(GAS)は、ヒト免疫グロブリン(Boyle, 19
98)及び液相補体制御因子の両方を結合する能力を特徴とする機能的に関連する多くの
タンパク質を発現する(Jarvaら、2004; Lindahlら、2005)。G
BSにおいては、IgA及び/又はIgG受容体はMタンパク質族に属し(Stenbe
rgら、1992)、Mタンパク質は、免疫グロブリンの抗原結合部外のII型Fc領域
と相互作用する(Cunningham, 2000)。
部(Bevanger, 1983; Johnson and Ferrieri,
1984; Lindahlら、1990; Russell−Jonesら、1984
)及び補体制御H因子(FH)に結合し、GBS表面上のC3b沈着を回避する(Are
schougら、2002)。IgAの結合部位は上記タンパク質のN末端側にあるが、
FH結合領域はBacのC末端側にある(Areschougら、2002; Jarv
aら、2002)。Bacは、構造上肺炎球菌のHicタンパク質と関係があり、同じ様
にFHと結合する(Janulczykら、2000; Jarvaら、2004)。
作用を回避する能力に関与している(Horstmannら、1988; Pandir
ipallyら、2002; Pandiripallyら、2003)。Mタンパク質
は、補体の古典的経路成分C3転化酵素(C4b2a)の重要な制御因子であるC4結合
タンパク質(C4bp)の収集も媒介する(Berggardら、2001; Blom
ら、2004)。C4bに結合したMタンパク質は、別経路におけるFHと同様の方法で
C4bの開裂における分解促進活性及び補助因子活性を示す(Carlssonら、20
05; Perez−Caballeroら、2004; Thernら、1995)。
GAS及びGBSは、ヒトC5aを不活性化し(非特許文献1;非特許文献2)フィブ
ロネクチンに結合する多機能酵素C5aペプチダーゼも分泌し、上皮細胞の細菌侵入を促
進する(非特許文献3;非特許文献4)。
血清耐性因子は、これらのグラム陽性菌が宿主の免疫反応を回避するために使用する機
序において役割を果たしていると考えられる。
組成物を開発するために使用できる新しい血清耐性因子を特定する継続的な必要性がある
。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
(項目1)
(1)BibAタンパク質のコイルドコイルドメイン;
(2)該BibAタンパク質のリーダー配列及び該コイルドコイルドメイン;
(3)該BibAタンパク質のプロリンリッチドメイン;
(4)該BibAタンパク質の該コイルドコイルドメイン及び該プロリンリッチドメイ
ン;並びに
(5)該BibAタンパク質の該リーダー配列、該コイルドコイルドメイン及び該プロ
リンリッチドメイン
からなる群から選択されるBibAタンパク質の一部を含むBibAポリペプチドであっ
て、
該BibAタンパク質の一部が該BibAタンパク質のその他の隣接したアミノ酸配列
を含まない、ポリペプチド。
。
(項目2)
前記BibAタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号1と少なくとも95%同一である、
項目1に記載のBibAポリペプチド。
(項目3)
前記BibAタンパク質のアミノ酸配列が配列番号1である、項目1に記載のBibA
ポリペプチド。
(項目4)
前記プロリンリッチドメインのアミノ酸配列が、配列番号5と少なくとも95%同一であ
る、項目1に記載のBibAポリペプチド。
(項目5)
前記プロリンリッチドメインのアミノ酸配列が配列番号5である、項目1に記載のBi
bAポリペプチド。
(項目6)
前記コイルドコイルドメインのアミノ酸配列が、配列番号7と少なくとも95%同一であ
る、項目1に記載のBibAポリペプチド。
(項目7)
前記コイルドコイルドメインのアミノ酸配列が配列番号7である、項目1に記載のBi
bAポリペプチド。
(項目8)
前記リーダー配列のアミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸1〜36と少なくとも95%
同一である、項目1に記載のBibAポリペプチド。
(項目9)
前記リーダー配列のアミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸1〜36である、項目1に
記載のBibAポリペプチド。
(項目10)
前記一部が前記コイルドコイルドメインからなる、項目1に記載のBibAポリペプチ
ド。
(項目11)
前記一部が前記リーダー配列及び前記コイルドコイルドメインからなる、項目1に記載
のBibAポリペプチド。
(項目12)
前記一部のアミノ酸配列が、配列番号6と少なくとも95%同一である、項目11に記
載のBibAポリペプチド。
(項目13)
前記一部のアミノ酸配列が配列番号6である、項目11に記載のBibAポリペプチド
。
(項目14)
前記一部が前記プロリンリッチドメインからなる、項目1に記載のBibAポリペプチ
ド。
(項目15)
前記一部が前記コイルドコイルドメイン及び前記プロリンリッチドメインからなる、請求
項1に記載のBibAポリペプチド。
(項目16)
前記一部のアミノ酸配列が、配列番号4と少なくとも95%同一である、項目15に記
載のBibAポリペプチド。
(項目17)
前記一部のアミノ酸配列が配列番号4である、項目15に記載のBibAポリペプチド
。
(項目18)
前記一部が前記リーダー配列、前記コイルドコイルドメイン、及び前記プロリンリッチド
メインからなる、項目1に記載のBibAポリペプチド。
(項目19)
前記一部のアミノ酸配列が、配列番号8と少なくとも95%同一である、項目18に記
載のBibAポリペプチド。
(項目20)
前記一部のアミノ酸配列が配列番号8である、項目18に記載のBibAポリペプチド
。
(項目21)
項目1〜20の何れかに記載のBibAポリペプチド;及び
薬学的に許容される担体
を含む組成物。
(項目22)
第2のポリペプチドを更に含む、項目21に記載の組成物。
(項目23)
前記ポリペプチドが、GBS1〜GBS689からなる群から選択される、項目22に
記載の組成物。
(項目24)
項目1〜20の何れかに記載のBibAポリペプチドをコードする単離核酸分子。
(項目25)
配列番号16から得られるヌクレオチド配列を含む、項目24に記載の単離核酸分子。
(項目26)
項目24又は25に記載の核酸分子;及び
薬学的に許容される担体
を含む組成物。
(項目27)
第2のポリペプチドをコードする第2の核酸分子を更に含む、項目26に記載の組成物
。
(項目28)
前記第2のポリペプチドが、GBS1〜GBS689からなる群から選択される、項目
27に記載の組成物。
(項目29)
前記ポリペプチドの少なくとも1つが担体タンパク質と結合している、項目21〜23
の何れかに記載の組成物。
(項目30)
前記担体タンパク質が、細菌毒素、細菌トキソイド、N.メニンジティディス外膜タンパ
ク質、熱ショックタンパク質、百日咳タンパク質、H.influenzaeタンパク質D、サイト
カイン、リンホカイン、ホルモン、成長因子、C.ディフィシレトキシンA、C.ディフ
ィシレトキシンB、及び鉄取込みタンパク質からなる群から選択される、項目29に記
載の組成物。
(項目31)
小児ワクチンに有用な活性因子を更に含む、項目21〜30の何れかに記載の組成物。
(項目32)
前記活性因子が:
(a)N.メニンジティディス、S.ニューモニエ、ボルデテラ−ペルツッシス、モラ
クセラ・カタラーリス、クロストリジウム・テタニ、コリネバクテリウム・ジフテリエ、
RSウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、及び
ロタウイルスポリペプチド抗原からなる群から選択されるポリペプチド抗原;ならびに
(b)該ポリペプチド抗原をコードする核酸分子
からなる群から選択される、項目31に記載の組成物。
(項目33)
高齢の個体又は免疫不全の個体用のワクチンに有用な第2の活性因子を更に含む、項目
21〜30の何れかに記載の組成物。
(項目34)
前記第2の活性因子が:
(a)エンテロコッカス・フェカーリス、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィ
ロコッカス・エピデルミス、シュードモナス・エルジノーサ、レジオネラ・ニューモフィ
ラ、リステリア・モノサイトゲネス、インフルエンザウイルス、及びパラインフルエンザ
ウイルスポリペプチド抗原からなる群から選択されるポリペプチド抗原;ならびに
(b)該ポリペプチド抗原をコードする核酸分子
からなる群から選択される、項目33に記載の組成物。
(項目35)
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症を処置又は予防する方法であって、請
求項21〜34の何れかに記載の組成物の有効量を、処置又は予防を必要とする個体に投
与することを包含する、方法。
(項目36)
項目21〜34の何れかに記載の組成物を含む容器;及び
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症の処置又は予防に該組成物を使用す
るための説明書
を含むキット。
(項目37)
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症を予防又は処置するワクチンを製造す
るための方法であって、
(a)項目1〜20の何れかに記載のBibAポリペプチド;及び
(b)薬学的に許容される担体
を組み合わせることを包含する、方法。
(項目38)
(a)前記BibAポリペプチドをコードする発現コンストラクトを含む宿主細胞を培
養すること;及び
(b)該BibAポリペプチドを回収すること
からなる方法により、該ポリペプチドが製造される、項目33に記載の方法。
(項目39)
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症を処置又は予防するワクチンを製造す
るための方法であって、
(a)項目24又は25に記載の核酸分子;及び
(b)薬学的に許容される担体
を組み合わせることを包含する、方法。
(項目40)
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症を処置又は予防する医薬品の製造にお
ける、項目1〜20の何れかに記載のBibAポリペプチドの使用。
(項目41)
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症を処置又は予防する医薬品の製造にお
ける、項目24又は25に記載の核酸分子の使用。
(項目42)
項目1〜20の何れかに記載のBibAポリペプチドに特異的に結合する抗体の調製物
。
(項目43)
前記抗体がポリクローナルである、項目42に記載の調製物。
(項目44)
前記抗体がモノクローナルである、項目42に記載の調製物。
(項目45)
前記抗体が、F(ab’) 2 断片、F(ab)断片、F v 分子、非共有結合のヘテロダイ
マー、一本鎖F v 分子、二量体抗体断片コンストラクト、三量体抗体断片コンストラクト
、ミニボディー、ダイアボディー、及びキメラ抗体からなる群から選択される、項目4
2に記載の調製物。
(項目46)
前記抗体がヒト化される、項目42〜45の何れかに記載の調製物。
(項目47)
前記抗体がヒト抗体である、項目42〜45の何れかに記載の調製物。
(項目48)
前記抗体が、BibAのコイルドコイルドメインのエピトープに特異的に結合する、請求
項42〜47の何れかに記載の調製物。
(項目49)
前記抗体が、BibAのN末端部分においてエピトープに特異的に結合する、項目42
〜47の何れかに記載の調製物。
(項目50)
前記抗体が、BibAのプロリンリッチドメインにおいてエピトープに特異的に結合する
、項目42〜47の何れかに記載の調製物。
(項目51)
項目42〜50の何れかに記載の調製物;及び
薬学的に許容される担体
を含む組成物。
(項目52)
小児ワクチンに有用な活性因子に特異的に結合する抗体を更に含む、項目51に記載の
組成物。
(項目53)
前記活性因子が、N.メニンジティディス、S.ニューモニエ、ボルデテラ・ペルツッシ
ス、モラクセラ・カタラーリス、クロストリジウム・テタニ、コリネバクテリウム・ジフ
テリエ、RSウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイル
ス、及びロタウイルスポリペプチド抗原からなる群から選択されるポリペプチド抗原であ
る、項目52に記載の組成物。
(項目54)
高齢の個体又は免疫不全の個体用のワクチンに有用な活性因子に特異的に結合する抗体を
更に含む、項目51に記載の組成物。
(項目55)
前記活性因子が、エンテロコッカス・フェカーリス、スタフィロコッカス・アウレウス、
スタフィロコッカス・エピデルミス、シュードモナス・エルジノーサ、レジオネラ・ニュ
ーモフィラ、リステリア・モノサイトゲネス、インフルエンザウイルス、及びパラインフ
ルエンザウイルスポリペプチド抗原からなる群から選択されるポリペプチド抗原である、
項目54に記載の組成物。
(項目56)
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症を処置又は予防する方法であって、請
求項51〜55の何れかに記載の組成物を、処置又は予防を必要とする患者に投与するこ
とを包含する、方法。
(項目57)
項目51に記載の組成物を含む容器;及び
S.アガラクティエによる感染症の処置又は予防に該組成物を使用するための説明書
を含むキット。
(項目58)
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症を処置又は予防する組成物を製造する
ための方法であって、
項目42〜50の何れかに記載の調製物;及び
薬学的に許容される担体
を組み合わせることを包含する、方法。
(項目59)
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症を処置又は予防する医薬品の製造にお
ける、項目42〜50の何れかに記載の調製物の使用。
出願者は、グラム陽性菌(GBS)において宿主細胞の補体活性化経路と相互作用し、
侵入する細菌の補体抵抗性又は回避機序に関与すると考えられる血清耐性因子を特定した
。この新たに特定された血清耐性因子は、本明細書においてB群ストレプトコッカス免疫
グロブリン結合固着(BibA)と呼ばれる(又GBS 3とも呼ばれる)。BibAは
広く発現されるタンパク質であり、分析した31種のGBS株の81%で存在する(表3
)。
末端領域は、S.ピオゲネスのMタンパク質族(22%の同一性)、S.アガラクティエ
のBac(20%の同一性)、S.ニューモニエのPspC(20%の同一性)及びS.
ディスアガラクティエのMig(27%の同一性)のように一連のグラム陽性免疫グロブ
リン結合タンパク質と低い類似性が示された。vBibAは、S.ニューモニエのHic
様タンパク質等の他のグラム陽性菌の耐性因子と幾つかの類似点を共有する。
usGは、大腸菌において共転写され(Downingら、1990)、グラム陽性菌及
びグラム陰性菌の大きなパネルにおいて隣接している(Barreiroら、2001;
Fullerら、1999; Jeongら、1993; Katayama, et
al, 1996; Miyakeら、1994; Poplawskiら、2000
; Puttikhuntら、1995; Sharp, 1994; Syvanen
ら、1996)。この証拠は、BibAの現在のゲノムのローカリゼーションが挿入事象
に由来することを示唆する。興味深いことに、A909株に存在する2種類のトランスポ
サーゼは、GBS亜型分類のツールとして提案され(Tamuraら、2000)、その
存在が多座シークエンスタイピング(MLST)によって分析されたS.アガラクティエ
種の発生と関係付けられている(Hery−Arnaudら、2005)IS1381族
に属す。
ることが明らかとなった。その配列変動は主としてN末端又はC末端領域におけるアミノ
酸の短い繰り返し数の違いによる。全長のBibAは、N末端のヘリックスリッチ領域、
C末端のプロリンリッチドメイン、細胞壁ペプチドグリカンにタンパク質を固着するLP
XTG(配列番号3)モチーフ及び膜貫通領域からなる。図IA、2B BibAのコイ
ルドコイルドメインは、S.アガラクティエの複数の血清型において十分保たれている。
がある。Mタンパク質の2次構造は主として安定したダイマーを形成するα−ヘリカルコ
イルドコイル構造である(Phillipsら、1981)。コンピュータによるBib
Aの2次構造の予測(Bergerら、1995)により、N末端領域においてコイルド
コイル配列を形成する傾向のあるヘリックスリッチ領域(283−294領域及び366
−400領域)が示された。BibAの組み換え形態に関する研究により、Mタンパク質
に関しては、BibAは非還元条件で開くダイマーを形成できることが示唆された。一方
、2次構造のカノニカルエレメントはプロリンリッチドメイン内にあると予測され、分子
のこの部分はポリプロリンヘリックス様構造を呈することができることを示唆する。
回収される。BibAは、細胞壁上に発現されても上清部分に分泌されたとしても、同一
の明らかな分子量を有する。これは、BibAの分泌は細胞壁固定領域のタンパク質分解
開裂による可能性があるこ又はタンパク質のソーティング障害は分泌が原因である可能性
があることを示唆する。実際、BibAはシグナルペプチドにおいてYSSIRKg/s
様モチーフ(配列番号64)を有するが、これは以前スタフィロコッカス・アウレウス及
び他のグラム陽性菌にあると言われていた(Bae and Schneewind,
2003)。このようなモチーフは、殆どBibA中にあり、分析した8種類のGBS株
全てにおいて保たれている。YSSIRK−G/S様モチーフ(配列番号64)は、タン
パク質成熟の促進に関与しているとされている(Bae and Schneewind
, 2003)。この証拠に基づき、本発明者等は、ソルターゼ成分はBibAの完全で
効率的な固着を制限し、成熟したBibAの不十分なプロセス及び上清におけるタンパク
質の放出が生じると仮定する。
ロニー形成を媒介し、宿主免疫反応を調節する多機能性タンパク質群の一種として特定さ
れる(Jarvaら、2003; Lindahlら、2005)。しかしながら、Bi
bAはヒト免疫グロブリン及び補体制御因子C4bpの両方に結合するというようなユニ
ークな特徴を有する。IgA及びC4bpのBibA結合部位は、タンパク質のN末端領
域にある。しかしながら、IgAに特異的なBac N末端領域に相同性はない(Lin
dahlら、1990)。マウス及びウシのIgGに結合しないことは、Bib Aが他
のIg結合タンパク質について報告されているようにヒトに特異的な機能的役割を有する
ことを示唆する。
IgG及びIgAに結合する。分泌されたBibAのプロリンリッチドメインは、ヒト上
皮細胞との結合相互作用の原因である。実施例8及び9。プロリンリッチドメインには、
8つのアミノ酸の周期性がある。プロリンは、モチーフのb位及びf位を占めそれが19
回繰り返される。
部分からなる2つのコンストラクトを生成した。ヒトIgGに結合するBibAは、主に
タンパク質のN末端領域に結合し、C末端領域にはあまり結合しない。一方、ヒトIgA
への結合は殆どBibAのN末端部分に関係する。この領域もBibAのC4bpへの結
合の原因であった。又、組み換えBibAは約10−8Mの結合定数で起源の異なるヒト
上皮細胞に結合する。
インは、BibAのC4結合タンパク質のような補体との結合相互作用の原因である。実
施例7。又、コイルドコイルドメインは、IgG及びIgAのようなヒト免疫グロブリン
との結合相互作用の原因である。実施例10、11及び12。IgA結合部位は、Bib
AのN末端部分(約200のアミノ酸)にあると思われる。BibAは、他のコイルドコ
イルタンパク質と同様にダイマーを形成する。実施例1。
胞に結合し、N末端のコイルドコイルドメインは血清因子に曝露されると考えられている
。N末端のコイルドコイルドメインはC4結合タンパク質のような補体を引き寄せて侵入
する細菌から排除すると考えられている。コイルドコイルドメインに結合した宿主細胞と
の補体結合相互作用は、補体活性を宿主細胞に引き寄せ、細菌の侵入を更に促進する。
ンリッチドメインがないか或いは別々に発現される場合、BibAは主として分泌され表
面に露出されないと考えられている。しかしながら、開裂又は分岐したBibAでも標的
宿主細胞に接近した時に免疫システムの注目を細菌から逸らすと考えられている。
障害によって、GBSの細胞への付着におけるBibAの役割を確認した。突然変異の相
補性はGBS付着型表現型を修復したが、BibAの過剰発現は上皮細胞結合を有意に増
大した。これらの特性は、BibAは新しい多機能性タンパク質であり、恐らくGBSの
病原性に関係することを示す。
Sポリアクリルアミドゲル上での見かけの分子量は約80kDaである。タンパク質のプ
ロリンリッチドメインは、BibAが束状に折畳まれることにより、この相違の原因であ
る可能性がある。膜を伴う形態は容易に分解され、タンパク質のごく一部が8OkDとし
てゲル上を進み、大部分が約60kDaの分子量で進む。これは、細胞膜結合型において
はプロリンリッチモチーフがまだ細胞壁成分に結合していて、直線状構造を保っているこ
とを示す。実施例2〜4、6を参照されたい。
ための必要条件である。組み換えBibAの上皮細胞への結合の分析により、細胞への結
合は推定約4×10−8Mの結合定数で飽和することが明らかとなった。特に、BibA
の肺、腸、気管支及び頚部由来の上皮細胞系への結合は、遍在性の受容体の存在を示唆す
る。BibAは、Mタンパク質(Courtneyら、1994; Courtneyら
、1997; Wang and Stinson, 1994)のように細菌の上皮細
胞への付着を媒介する。同質遺伝子型のBibA陽性株及びBibA陰性株に関する研究
により、BibA陽性株は上皮細胞に付着するが、BibA陰性株の付着は非常に少ない
ことが示された。又、表面にBibAを露出しない株におけるBibAの細胞壁固着型の
発現は、その結合表現型を増大した。興味深いことに、このような結果はGBSコロニー
形成の標的であるヒト頚部上皮細胞系(ME 180)及び肺上皮細胞系(A549)の
両方において確認された。
てS.アガラクティエ感染症の予防及びを処置するための組成物において活性因子として
有用であることを示唆する。
本発明の「BibAポリペプチド」は、(1)BibAタンパク質のコイルドコイルド
メイン、(2)BibAタンパク質のリーダー配列及びコイルドコイルドメイン、(3)
BibAタンパク質のプロリンリッチドメイン、(4)BibAタンパク質のコイルドコ
イル及びプロリンリッチドメイン、又は(5)BibAタンパク質のリーダー配列、コイ
ルドコイルドメイン及びプロリンリッチドメインからなるBibAタンパク質の部分を含
むがBibAタンパク質の他の連続するアミノ酸配列はない。本発明のBibAポリペプ
チドは、全長のBibAポリペプチドのアミノ酸配列を含まない。
含む。
ミノ酸配列を有している。
BibAは、N末端リーダー又は上記配列番号1の初めの下線を引いた配列によって示
される信号配列領域及び上記配列番号1の末端の下線を引いた配列によって示されるC末
端膜貫通領域を有する。BibAのリーダー又は信号配列領域から1つの以上アミノ酸が
除去されることもある。このようなBibA断片の例を以下の配列番号2に示す。
胞壁アンカーモチーフはBibA配列から除去され、以下の配列番号4に示すコイルドコ
イル及びプロリンリッチセグメントを残す。
BibAの高度に保存されたコイルドコイルドメインは、タンパク質のN末端の方に位
置し、以下のBibA配列番号1の配列における下線部分にある。下線を引いたBibA
のコイルドコイルドメインに対応する断片を以下の配列番号7に示す。
配列番号1
II. BibAポリペプチドをコードする核酸分子
本発明には、BibAポリペプチドをコードする核酸分子が含まれる。本発明には、こ
のような分子に対して少なくとも50%の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる
核酸分子も含まれる。特定の配列によって、配列同一性の程度は好ましくは50%以上(
例えば60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、9
4%、95%、96%、97%、98%、99%以上)である。ヌクレオチド配列間の同
一性は、好ましくはギャップ開始ペナルティ=12及びギャップ伸長ペナルティ=1のパ
ラメータを使用したアフィンギャップ検索を使用したMPSRCHプログラム(Oxfo
rd Molecular)に実装されたSmith−Waterman相同性検索アル
ゴリズムによって決定する。
ンジェントな」条件下でハイブリダイゼーションを行うことができる。ハイブリダイゼー
ションのストリンジェンシーを増大する条件は、当該技術分野で広く知られており公表さ
れている。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 1989, p.7.52を参照されたい。(
ストリンジェンシーを増大するための)適切な条件の例は以下のものを含む:25℃、3
7℃、50℃、55℃及び68℃の培養温度、10X SSC、6X SSC、IX S
SC及び0.1X SSC(但し、SSCは0.15MのNaCl及び15のmMクエン
酸緩衝液である)及び他の緩衝系を使用したそれらの同等物の緩衝液濃度、0%、25%
、50%及び75%のホルムアミド濃度、5分〜24時間の培養時間、1回、2回又はそ
れ以上の洗浄処理、1分、2分又は15分の洗浄培養時間、及び6X SSC、IX S
SC、0.1X SSC又は脱イオン水の洗浄液。ハイブリダイゼーション法及びそれら
の最適化は当該技術分野で既知の。例えば、Sambrook, 1989; Ausu
belら、eds., Short Protocols in Molecular
Biology, 4th ed., 1999; U.S. Patent 5,70
7,829; Ausubelら、eds., Current Protocols
in Molecular Biology. Supplement 30, 198
7を参照されたい。
ハイブリダイズし、他の実施形態において、本発明の核酸分子は中ストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は高ストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズする。低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件の例は、50℃及び1OX SSCである。中ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件の例は、55℃及びIX SSCである。高ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件の例は、68℃及び0.1X SSCである。
少なくともn個の連続するヌクレオチドを含み、特定の配列によってnは10以上(例え
ば12、14、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、
90、100、150、200以上)である。
(a)配列リストに開示する配列と同じ(即ち100%同じ)配列;
(b)配列リストに開示する配列との配列同一性を共有する配列;
(c)(a)若しくは(b)の配列と比較して別々の部位にあるか連続する1個、2個
、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個若しくは10個の単一ヌクレオチド又はア
ミノ酸変異(欠失、挿入、置換)を有する配列;及び
(d)ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列リストの特定の配列とア
ライメントした場合、初め(N末端又は5’)から終わり(C−末端又は3’)へ、p個
のモノマー(但しp>×)まで及ぶアライメントについてこのようなウィンドウがp−×
+1あり、各ウィンドウはアライメントされた同一のモノマーを少なくとも×−y個有す
るように移動する×モノマー(アミノ酸又はヌクレオチド)のムービングウィンドウ。但
し、xは20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100
、150、200から選択し、yは0.50、0.60、0.70、0.75、0.80
、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96
、0.97、0.98、0.99から選択し、x−yが整数でない場合は四捨五入して整
数にする。好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムはNeedleman−Wu
nschのグローバルアラインメントアルゴリズム[Needleman & Wuns
ch (1970) J. MoI. Biol. 48, 443−453]であり、
デフォルトのパラメータを使用する(例えばギャップ開始ペナルティ=10.0、ギャッ
プ伸長ペナルティ=0.5及びEBLOSUM62スコアリングマトリックスを使用)。
このアルゴリズムは、便利なことにEMBOSSパッケージのニードルツールに実装され
ている[Riceら、(2000) Trends Genet. 16:276−27
7]。
び/又はC末端/3’に対して更に配列を有してもよい。
o(即ち組換えタンパク質)又はin vivo(即ちDNAワクチン)でのBibAポ
リペプチドの生成に使用することができる。本発明は、本発明の他の核酸分子に好ましく
は「高ストリンジェントな」条件(例えば0.1xSSC、0.5%のSDS溶液内で6
5℃)下でハイブリダイズすることができる一本鎖核酸分子も提供する。
ペプチド核酸(PNA)等を含めDNA又はRNAを含んでもよい。本発明の核酸分子は
、ゲノムDNA、cDNA又はmRNAの一部を含んでもよい。本発明の核酸分子は全長
のBibAタンパク質をコードしない。
をコードする核酸分子の例を以下の配列番号16に示す。
本発明の核酸分子は、例えば、化学合成によってゲノム又はcDNAライブラリーから
(例えば、PCRのようなプライマー増幅法を使用)、微生物自体から等、種々の方法で
調製することができる、種々の形態(例えば一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブ等)を
とることができる。これらは、好ましくは極めて純粋な(即ち、他のGBS又は宿主細胞
の核酸が殆どない)形態で調製される。
することができる。Caruthersら、Nucl. Acids Res. Sym
p. Ser. 215−223, 1980; Hornら、Nucl Acids
Res. Symp. Ser. 225−232, 1980; Hunkapill
erら、(1984), Nature 310: 105−111; Grantha
mら、(1981), Nucleic Acids Res. 9: r43−r74
を参照されたい。
的手法で生成することができる。その後cDNA分子は当該技術分野で周知の分子生物学
的手法を使用して複製することができる。テンプレートとしてゲノムDNA又はcDNA
を使用してPCR等の増幅法を使用して、本発明のポリヌクレオチドの追加の複製を得る
ことができる。
シング及び/又は発現を修飾する改変を含むがこれに限定されるものではない)でコード
配列を改変するために当該技術分野で一般的に知られている方法を使用してヌクレオチド
配列を遺伝子操作してもよい。無作為な断片化によるDNAシャフリング及び遺伝子断片
及び合成オリゴヌクレオチドのPCR再結合を使用してヌクレオチド配列を遺伝子操作し
てもよい例えば、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの改変、コンドン選択性
の変更、スプライスバリアントの生成、突然変異の導入等を行うために部位特異的変異誘
発を使用することができる。
ることができる。例えば、N末端リーダー配列は、ポリヒスチジン(HIS)又はグルタ
チオンSトランスフェラーゼ(GST)等のタグタンパク質のの配列コードと置換される
場合がある。発現されたタンパク質の精製、検出及び安定を促進するために、このような
タグタンパク質を使用してもよい。特定の原核又は真核宿主に選択されるコドンは、タン
パク質の発現率を増大するため、或いは天然の配列から発生した転写よりも長い半減期の
ような所望の性質を有するRNA転写の生成するために選択することができる。これらの
方法は当該技術分野で周知であり、WO05/032582に詳述されている。
BibAポリペプチドは、例えば、ポリペプチド発現を許容する条件下で本発明の核酸
分子で形質転換した宿主細胞を培養することによって組み換えで生成することができる。
BibAポリペプチドは、化学的手段によって合成するか、或いはS.アガラクティエか
ら単離した全長BibAタンパク質から調製することができる。
1. 核酸分子
上記ポリペプチドを組み換えで生成するために特定のBibAポリペプチドをコードす
る任意の核酸分子を使用することができる。ポリペプチドをタグタンパク質及びGBSポ
リペプチドからなる融合タンパク質として発現するようにインフレームのタグタンパク質
をBibAポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にコードするヌクレオチド配列を
加えることによってBibAポリペプチドの組み換え生成を促進することができる。この
ようなタグタンパク質は、発現されたタンパク質の精製、検出及び安定度を促進すること
ができる。本発明において使用するのに好適なタグタンパク質には、ポリアルギニンタグ
(アルギニンタグ)、ポリヒスチジンタグ(ヒスチジンタグ)、FLAGタグ、Stre
タグ、c−mycタグ(Sタグ)、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合領域、
SBPタグ、キチン結合領域、グルタチオンSトランスフェラーゼタグ(GST)、マル
トース結合タンパク質、抗転写終結因子(NusA)、大腸菌チオレドキシン(TrxA
)、及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼI(DsbA)等がある。好ましいタグタ
ンパク質は、Hisタグ及びGST等である。Terpeら、Appl Microbi
ol Biotechnol (2003) 60:523−33を参照されたい。
理によって、発現された融合タンパク質から除去される場合がある。一般的に使用される
プロテアーゼは、エンテロキナーゼ、タバコエッチウイルス(TEV)、トロンビン及び
Xa因子等である。
ポリペプチドをコードする核酸分子を、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要な
要素を含む発現コンストラクトに挿入することができる。コード配列及び適切な転写及び
翻訳調節要素を含む発現コンストラクトの構築を行うために、当業者に周知の方法を使用
することができる。これらの方法には、in vitroの組み換えDNA技術、合成技
術、及びin vivoの遺伝子組み換え技術が含まれる。
異種宿主は原核生物であっても真核生物であってもよい。大腸菌は好ましい宿主細胞で
あるが、他に適切な宿主としてはバシラスサチリス、ビブリオコレラ、サルモネラチフィ
、サルモネラチフィムリウム、ナイセリアラクタミカ、ナイセリアシネレア、マイコバク
テリア(例えばM.チューバキュロウセス)、イースト等がある。
望の方法で処理する能力によって選択することができる。このようなポリペプチドの修飾
には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシレーション、リン酸化、脂質化及びアシル
化が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチドのプレプロ体を開裂する翻訳後プ
ロセシングも、正しい挿入、折り畳み及び機能を促進するために使用することができる。
翻訳後の活性のための特殊な細胞機構及び特有の機序を有する種々の宿主細胞が米国菌株
保存機関(ATCC; 10801 University Boulevard, M
anassas, VA 20110−2209)から入手可能であり、異種タンパク質
の正しい修飾及び処理を確実にするために選択することができる。WO 01/9834
0を参照されたい。
ル封入された核酸の転移、リポソーム媒介性細胞融合、DNAコーティングラテックスビ
ーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、「遺
伝子銃」法、及びDEAE又はリン酸カルシウム媒介性トランスフェクション等が含まれ
るがこれらに限定されない)を使用して、発現コンストラクトを宿主細胞に導入すること
ができる。
回収に好適な条件下で培養できる。形質転換細胞生成タンパク質は、ヌクレオチド配列及
び/又は使用された発現コンストラクトによって分泌又は細胞内に貯蔵される。当業者は
、発現コンストラクトが原核又は真核細胞膜を通して可溶性ポリペプチドの分泌を誘導す
る信号配列を含むよう設計することができることを理解できる。
本発明のBibAポリペプチドは、適切なストレプトコッカス・アガラクティエ菌或い
は遺伝子操作した宿主細胞から単離することができる。精製したBibAポリペプチドは
、当該技術分野で周知の方法を使用して、タンパク質、炭水化物又は脂質等細胞の他の成
分から分離される。このような方法には、粒径排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウ
ム分画法、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、及びプレパラテ
ィブゲル電気泳動が含まれるが、これらに限定されない。精製したBibAポリペプチド
の製剤は少なくとも純度80%であり、好ましくは、製剤は純度90%、95%又は99
%である。製剤の純度は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動等当該技術分野で既知
の任意の手段によって評価することができる。適切な場合は、ポリペプチドは例えば尿素
を使用して可溶化することができる。
本発明のBibAポリペプチドは、例えば固相法を使用して合成することができる。例
えば、Merrifield, J Am. Chem. Soc. 85, 2149
−54, 1963; Robergeら、Science 269, 202−04,
1995を参照されたい。合成は手動又は自動で行うことができる。自動合成は、例え
ば、Applied Biosystems 43 IA ペプチド合成装置(Perk
in Elmer)を使用して達成することができる。場合により、ポリペプチドの断片
は、別々に合成され、化学的方法を使用して組み合わされ、最終的な分子を生成してもよ
い。
抗体はBibAポリペプチド又は他の抗原に特異的に結合するよう生成することができ
、又、治療又は診断に使用することができる。「抗体」という用語は、完全な免疫グロブ
リン分子並びに抗原を結合することができるその断片を指す。これらには、ハイブリッド
(キメラ)抗体分子(例えばWinterら、Nature 349, 293−99,
1991; U.S. Patent 4,816,567)、F(ab’)2及びF
(ab)断片及びFv分子、非共有結合ヘテロダイマー(例えば、Inbarら、Pro
c. Natl. Acad. ScL U.S.A. 69, 2659−62, 1
972; Ehrlichら、Biochem 19, 4091−96, 1980)
、一本鎖Fv分子(sFv)(例えば、Hustonら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U.S.A. 85, 5897−83, 1988)、二量体抗体
又は三量体抗体断片コンストラクト、ミニボディー(例えば、Packら、Bioche
m 31, 1579−84, 1992; Cumberら、J. Immunolo
gy 149B, 120−26, 1992)、ヒト化抗体分子(例えば、Riech
mannら、Nature 332, 323−27, 1988; Verhoeya
nら、Science 239, 1534−36, 1988; and U.K.
Patent Publication No. GB 2,276,169, pub
lished 21 September 1994)、及びこのような分子から得られ
た任意の機能的断片並びにファージディスプレイのような非従来的なプロセスにより得ら
れた抗体が含まれる。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗
体を得る方法は、当該技術分野で周知である。
リッチドメインのエピトープに特異的に結合する。一般的に、エピトープを形成するため
には少なくとも6個、7個、8個、10個又は12個の連続するアミノ酸が必要である。
しかし、非連続性のアミノ酸を有するエピトープは、更に多くのアミノ酸、例えば少なく
とも15個、25個又は50個のアミノ酸が必要な場合もある。所望の特異性を有する抗
体を特定するために、種々の免疫測定法(例えばウェスタンブロット法、酵素免疫測定、
放射性免疫分析、免疫組織化学分析、免疫沈降又は当該技術分野で既知の他の免疫化学的
分析)を使用することができる。当該技術分野において、競合的結合又は免疫放射定量測
定法については、多数のプロトコルが周知である。このような免疫測定は、一般的に免疫
原及び免疫原に特異的に結合する抗体の間の錯体形成の測定を行う。特定の抗原に特異的
に結合する抗体の製剤により得られる検出信号は、一般的に、免疫化学的分析法において
他のタンパク質を使用した場合に得られる検出信号の少なくとも5倍、10倍又は20倍
強い。好ましくは、抗体は免疫化学的分析において他のタンパク質を検出せず、溶液から
特定の抗原を免疫沈殿させることができる。
ーナル抗体の生成するためにポリペプチドを使用することができる。必要に応じて、抗原
をウシ血清アルブミン、チログロブリン及びキーホールリンペットヘモシニアン等の担体
タンパク質に結合させることもできる。宿主種によって、免疫反応を増大するために種々
のアジュバントを使用することができる。このようなアジュバントには、フロイントアジ
ュバント及びミネラルゲル(例えば水酸化アルミニウム)、及び表面作用物質(例えばリ
ソレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリン
ペットヘモシニアン及びジニトロフェノール)が含まれるが、これらに限定されない。ヒ
トに使用されるアジュバントの中で、BCG(バチルス・ルメット・ゲラン)及びコリネ
バクテリウム・パルブムは特に有用である。
分子を生成する方法を使用して調製することができる。これらの方法には、ハイブリドー
マ法、ヒトB細胞ハイブリドーマ法及びEBVハイブリドーマ法(Kohlerら、Na
ture 256, 495−497, 1985; Kozborら、J. Immu
nol. Methods 81, 31−42, 1985; Coteら、Proc
. Natl. Acad. Sci. 80, 2026−2030, 1983;
Coleら、Mol. Cell Biol. 62, 109−120, 1984)
が含まれるが、これらに限定されない。
を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングを使用
することができる(Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci
. 81, 6851−6855, 1984; Neubergerら、Nature
312, 604−608, 1984; Takedaら、Nature 314,
452−454, 1985)。モノクローナル及び他の抗体も、治療に使用した場合
に患者が抗体に対して免疫反応を起こすことを予防するために「ヒト化」することができ
る。このような抗体は、配列が治療に直接使用されるヒト抗体に十分類似しているか或い
は少数のキー残基の改変を必要とする場合がある。げっ歯類の抗体及びヒト配列の間の配
列の相違は、ヒト配列のものと異なる残基を個々の残基の部位特異的突然変異誘発或いは
相補性決定領域のグレーティングによって置き換えることにより最小化することができる
。
特定の抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体は、米国特許第5,565,332号
に開示されている通り、部分的に又は完全にヒト化される抗原結合部位を含んでもよい。
体を生成する方法を使用して一本鎖モノクローナル抗体の生成で説明した方法を応用する
ことができる。関連する特異性を有するが異なるイディオタイプの組成物のモノクローナ
ル抗体は、無作為な組換え免疫グロブリンライブラリー(Burton, Proc.
Natl. Acad. Sci. 88, 11120−23, 1991)からのチ
ェインシャフリングによって生成することができる。
PCRのようなDNA増幅法を使用しても構築することができる(Thirionら、1
996, Eur. J. Cancer Prev. 5, 507−11)。一本鎖
モノクローナル抗体は、単一特異性又は二重特異性であってもよく、又2価又は4価であ
ってもよい。4価の二重特異性一本鎖モノクローナル抗体の構築は、例えばColoma
& Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15,
159−63で説明されている。2価の二重特異性一本鎖モノクローナル抗体の構築は、
Mallender & Voss, 1994, J. Biol. Chem. 2
69, 199−206で説明されている。
オチド合成を使用して構築し、標準組換えDNA方法を使用して発現コンストラクトにク
ローニングし、コード配列を発現するよう細胞に導入することができる。或いは、例えば
線維状ファージ法(Verhaarら、1995, Int. J. Cancer 6
1, 497− 501; Nichollsら、1993, J. Immunol.
Meth. 165, 81−91)を使用して一本鎖モノクローナル抗体を直接生成
することができる。
oc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833−3837, 1989
; Winterら、Nature 349, 293−299, 1991)に開示さ
れている通り、リンパ球群内のin vivo生成の誘導により或いは高度に特異的な結
合試薬の免疫グロブリンライブラリー又はパネルをスクリーニングすることによって生成
することができる。
O 94/13804に記載の「2重特異性抗体(ディアボディ)」のような、免疫グロ
ブリンに由来し、多価性及び多選択性の結合タンパク質も調製することができる。
合するカラムに通すことによって抗体を親和性精製することができる。次に、高塩濃度の
緩衝液を使用して、結合した抗体をカラムから溶出することができる。
本発明は、S.アガラクティエ感染症を予防及び処置するための組成物を提供する。本
発明の組成物は、少なくとも1つの活性物質を含有する。活性物質は、BibAポリペプ
チド、BibAポリペプチドをコードする核酸分子、又はBibAポリペプチドに特異的
に結合する抗体である。好適なBibAポリペプチドには、例えば、図24の第「I」群
、第「II」群及び第「III」群において特定されたものが含まれる。本発明の組成物
には、これらの群の2つ以上からの1つ以上のBibAポリペプチドが含まれてもよい。
には、1つ以上の(a)GBS抗原、(b)非GBS抗原、(c)(a)又は(b)をコ
ードする核酸分子、及び(a)又は(b)に特異的に結合する抗体が含まれるが、これら
に限定されない。
本発明の組成物に含まれてもよいGBS抗原には、全体が参考として本明細書に組み入
れられているWO 02/34771に開示されたGBSタンパク質(例えばGBS1−
GBS689)の抗原部分が含まれる。好ましい抗原には、GBS 80、GBS 10
4、GBS 322、GBS 67、GBS 276及びGBS 59が含まれる。
本発明の組成物は、本発明の治療、予防又は診断法に使用するために一つ以上の抗原と
共に投与される場合がある。本発明の組成物は、場合によりS.アガラクティエタンパク
質に由来しない補助的なポリペプチド抗原を1つ以上含んでもよい。好ましい抗原には、
以下に記載するものが含まれる。更に、本発明の組成物は以下に記載する病原による感染
症を処置又は予防するために使用してもよい。以下に記載の抗原との組み合わせの他に、
本発明の組成物は又、本明細書に記載の通りアジュバントと組み合わされる場合もある。
1つ以上の病原に由来する抗原が含まれるが、これらに限定されない。
本発明において使用するのに好適な細菌抗原には、細菌から単離、精製或いは得られた
タンパク質、多糖類、リポ多糖類及び外膜小胞が含まれる。又、細菌抗原には細菌溶解物
及び不活性化された細菌製剤が含まれる場合がある。細菌抗原は、組み換え発現によって
生成してもよい。細菌抗原には、好ましくは少なくともライフサイクルの1時期に細菌の
表面上の露出されるエピトープが含まれる。細菌抗原は、好ましくは複数の血清型で保存
される。細菌抗原には、以下に特定する特異性抗原例だけでなく以下に記載する1つ以上
の細菌に由来する抗原が含まれる。
えば参考文献1〜7において特定されたタンパク質)、糖類(多糖類、少糖類又はリポ多
糖類を含む)、又はA、C、W135、Y、及び/又はB等のN.メニンギイテイデイス
血清型群から精製又は得られた外膜小胞(参考文献8、9、10、11)が含まれる場合
がある。メニンギイテイデイスタンパク質抗原は、アドヒージョン、オートトランスポー
ター、トキシン、鉄取込みタンパク質、及び膜結合タンパク質(好ましくは完全な外膜タ
ンパク質)から選択される場合がある。
類(多糖類又は少糖類を含む)及び/又はストレプトコッカス・ニューモニエ由来のタン
パク質が含まれる場合がある。糖類抗原は、血清型1型、2型、3型、4型、5型、6B
型、7F型、8型、9N型、9V型、10A型、11A型、12F型、14型、15B型
、17F型、18C型、19A型、19F型、20型、22F型、23F型及び33F型
から選択してもよい。タンパク質抗原は、WO 98/18931、WO 98/189
30米国特許第6,699,703号、米国特許第6,800,744号、WO 97/
43303及びWO 97/37026において特定されているタンパク質から選択され
る場合がある。ストレプトコッカス・ニューモニエタンパク質は、ポリヒスチジントライ
アッド族(PhtX)、コリン結合タンパク質族(CbpX)、CbpXトランケート、
LytX族、LytXトランケート、CbpXトランケート−LytXトランケートキメ
ラタンパク質、ニューモリシン(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、Sp10
1、Spl30、Spl25又はSpl33から選択される場合がある。
ス抗原には、WO 02/34771又はWO 2005/032582で特定されてい
るタンパク質(GBS 40を含む)、GBS Mタンパク質の断片の融合物(WO 0
2/094851、及びDale, Vaccine (1999) 17:193−2
00、及びDale, Vaccine 14(10): 944−948に記載のもの
を含む)、フィブロネクチン結合タンパク質(Sfbl)、ストレプトコッカスヘム結合
タンパク質(Shp)、及びストレプトリジンS(SagA)が含まれる場合がある。
99/58562で特定されている抗原、外膜タンパク質抗原(HMW−OMP)、C抗
原及び/又はLPSが含まれる。
シス・ホロトキシン(PT)及び線維状ヘマグルチニン(FHA)、並びに場合によりパ
ータクチン及び/又は凝集原2・3抗原との組み合わせも含まれる。
より無毒な組み換えシュードモナス・エルジノーサ・エキソトキシンAに結合したS.ア
ウレウス型5・8莢膜多糖類、例えばStaph VAXTM、又は表面タンパク質由来
の抗原、インベーシン(ロイコシジン、キナーゼ、ヒアルロニダーゼ)、食細胞の貪食を
阻害する表面因子(莢膜、Aタンパク質)、カロチノイド、カタラーゼ生成、Aタンパク
質、コアグラーゼ、凝固因子、及び/又は真核細胞膜を溶解する膜傷害毒素(ヘモリジン
、ロイコトキシン、ロイコシジン)(場合により解毒される)が含まれる。
(SAA)が含まれる。
質として本発明の組成物と共に又は結合して使用されるテタヌス・トキソイド(TT)が
含まれる。
RM197のように解毒されるジフテリア毒素が含まれる。更にADPリボシル化を調節
・阻害できるか或いは関与する抗原は、本発明の組成物と組み合わせ/同時投与/配合が
考えられる。ジフテリアトキソイドは、担体タンパク質として使用してもよい。
まれる。
タンパク質、P.エルジノーサLPS、特にPAO1(O5血清型)から単離されたLP
S、及び/又は外膜タンパク質F(OprF)を含む外膜タンパク質(Infect I
mmun. 2001 May; 69(5): 3510−3515)が含まれる。
合がある。
ッカス抗原には、WO 02/34771、WO 03/093306、WO 04/0
41157又はWO 2005/002619で特定されているタンパク質又は糖類抗原
が含まれる(タンパク質GBS 80、GBS 104、GBS 276及びGBS 3
22を含み、血清型Ia、Ib、Ia/c、II、III、IV、V、VI、VII及び
VIII由来の糖類抗原を含む)。
PorB(Zhuら、Vaccine (2004) 22:660−669を参照)、
輸送結合タンパク質、例えばTbpA及びTbpB(Priceら、Infection
and Immunity (2004) 71(1):277−283を参照)、不
透明タンパク質(例えばOpa)、還元修飾タンパク質(Rmp)、及び外膜小胞(OM
V)製剤(Planteら、J Infectious Disease (2000)
182:848−855を参照;又、例えばWO99/24578、WO99/365
44、WO99/57280、WO02/079243も参照)が含まれる。
、B、Ba及びC(失明の原因となるトラホームの病因)、血清型L1、L2及びL3(
性病性リンパ肉芽腫症に関与する)及び血清型D〜K由来の抗原が含まれる。クラミジア
・トラコーマ抗原には、WO 00/37494、WO 03/049762、WO 0
3/068811又はWO 05/002619で特定されている抗原が含まれる場合も
あり、PepA(CT045)、LcrE(CT089)、ArtJ(CT381)、D
naK(CT396)、CT398、OmpH様(CT242)、L7/L12(CT3
16)、OmcA(CT444)、AtosS(CT467)、CT547、Eno(C
T587)、HrtA(CT823)及びMurG(CT761)が含まれる。
る。
パク質(DsrA)が含まれる。
反復、又は米国特許第6,756,361号に示されるその他のエンテロコッカス由来の
抗原が含まれる。
HopY及び/又はウレアーゼ抗原が含まれる。
0 IdDaヘマグルチニンが含まれる。
02 August; 70(8): 4414)が含まれる。
gEC)、分散接着性大腸菌(DAEC)、病原大腸菌(EPEC)、及び/又は腸管出
血性大腸菌(EHEC)に由来する場合がある。
毒され、感染防御抗原(PA)と呼ばれる一般的なB成分を共有することができるA成分
(致死因子(LF)及び浮腫因子(EF))から選択される場合がある。
Immun. 2003 Jan; 71(1): 374−383)、LPS (In
fect Immun. 1999 Oct; 67(10): 5395)、エルシニ
ア・ペスティスV抗原(Infect Immun. 1997 Nov; 65(11
): 4476−4482)が含まれる。
、LPS、BCG抗原、場合によりカチオン性脂質小胞に形成した抗原85B(Ag85
B)及び/又はESAT−6の融合タンパク質(Infect Immun. 2004
October; 72(10): 6148)、マイコバクテリウム・ツベルクロー
シス(Mtb)イソシトレート・デヒドロゲナーゼ関連抗原(Proc Natl Ac
ad Sci U S A. 2004 Aug 24; 101(34): 1265
2)、及び/又はMPT51抗原(Infect Immun. 2004 July;
72(7): 3829)が含まれる。
m Biophys Acta. 2004 Nov 1; 1702(2): 145
)、LPS、及び表面タンパク質抗原(SPA)(J Autoimmun. 1989
Jun;2 Suppl:81)を含む外膜タンパク質が含まれる。
場合がある。
が含まれる。
リポ多糖類、O1イナバ型O特異的多糖類、V.コレラ0139、IEM108ワクチン
抗原(Infect Immun. 2003 Oct; 71(10):5498−5
04)、及び/又は閉鎖帯毒素(Zot)が含まれる。
ax−TyVi)が含まれる。
A、OspB、Osp C及びOsp D)、他の表面タンパク質、例えばOspE結合
タンパク質(Erps)、デコリン結合タンパク質(例えばDbpA)、及び抗原性変異
VIタンパク質、例えばP39及びP13関連抗原(完全な膜タンパク質、Infect
Immun. 2001 May; 69(5): 3323−3334)、VIsE
抗原変異タンパク質(J Clin Microbiol. 1999 Dec; 37
(12): 3997)が含まれる。
P)が含まれる。
糖類を含むOMPが含まれる。
あってもよい。更に、細菌抗原には、外膜小胞(OMV)製剤が含まれる場合もある。更
に、抗原には前記細菌の生の、弱毒化及び/又は精製した抗原が含まれる。本発明の抗原
は、グラム陰性菌又はグラム陽性菌に由来する場合がある。本発明の抗原は好気性細菌又
は嫌気性細菌に由来する場合がある。
は抗原、例えば担体タンパク質(例えばCRM197)に結合することができる。このよ
うな結合は、米国特許第5,360,897号及びCan J Biochem Cel
l Biol. 1984 May;62(5):270−5に示されているように糖類
のカルボニル部分の還元的アミノ化によって影響されるタンパク質のアミノ基への直接結
合であってもよい。或いは、糖類はリンカーによって、例えばBioconjugate
Techniques, 1996及びCRC, Chemistry of Pro
tein Conjugation and Cross−Linking, 1993
に示された琥珀酸アミド又は他の結合で結合してもよい。
本発明において使用するのに好適なウイルス抗原には、不活性化(或いは殺滅)ウイル
ス、弱毒化ウイルス、スプリットウイルス製剤、精製したサブユニット製剤、ウイルスか
ら単離、精製、抽出されるウイルスタンパク質、及びウイルス様粒子(VLP)が含まれ
る。ウイルス抗原は、細胞培養又は他の基質上で増殖したウイルスに由来する場合がある
。或いは、ウイルス抗原を組み換えで発現してもよい。ウイルス抗原には、好ましくはウ
イルスの表面上にその生周期の少なくとも1時期に露出されるエピトープが含まれる。ウ
イルス抗原は、好ましくは複数の血清型又は分離株で保たれる。ウイルス抗原には、以下
に特定する特異性抗原例だけでなく以下に記載する1つ以上のウイルスに由来する抗原も
含まれる。
ザA、B及びC型に由来する場合がある。オルソミクソウイルス抗原は、ヘマグルチニン
(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)、核タンパク質(NP)、マトリックスタンパク質
(M1)、膜タンパク質(M2)、1つ以上の転写酵素成分(PB1、PB2及びPA)
を含むウイルスタンパク質から1つ以上を選択してもよい。好ましい抗原には、HA及び
NAが含まれる。
いは、インフルエンザ抗原は、広範囲に流行する可能性のある菌株(即ち現在流行してい
る菌株と比較して新しいヘマグルチニンを有するインフルエンザ株、或いは鳥類に対して
病原性でヒト集団に水平に伝搬される可能性を有するインフルエンザ株、又はヒトに対し
て病原性のインフルエンザ株)に由来する場合がある。
ニューモウイルス(RSV)、パラミクソウイルス(PIV)及びモルビリウイルス(麻
疹)に由来する場合がある。
)、ウシRSウイルス、マウス肺炎ウイルス及びシチメンチョウ鼻気管炎ウイルスに由来
する場合がある。好ましくは、ニューモウイルスはRSVである。ニューモウイルス抗原
は、表面融合(F)タンパク質、糖タンパク質(G)及び小疎水性タンパク質(SH)、
マトリックスタンパク質M及びM2、ヌクレオカプシドタンパク質N、P及びL、及び非
構造タンパク質NS1及びNS2を含む以下のタンパク質から1つ以上を選択してもよい
。好ましいニューモウイルス抗原には、F、G及びMが含まれる。例えば、J Gen
Virol. 2004 Nov; 85(Pt 11):3229を参照されたい。ニ
ューモウイルス抗原は、キメラウイルス内で形成するか又はキメラウイルスに由来する場
合がある。例えば、キメラRSV/PIVウイルスは、RSV及びPIVの両成分を含む
場合がある。
ザウイルス1〜4型(PIV)、ムンプスウイルス、センダイウイルス、シミアンウイル
ス5型、ウシパラインフルエンザウイルス及びニューカッスル病ウイルスから得てもよい
。好ましくは、パラミクソウイルスはPIV又はムンプスウイルスである。パラミクソウ
イルス抗原は、以下のタンパク質から1つ以上選択してもよい:ヘマグルチニン−ノイラ
ミニダーゼ(HN)、融合タンパク質F1及びF2、核タンパク質(NP)、リンタンパ
ク質(P)、巨大タンパク質(L)及びマトリックスタンパク質(M)。好ましいパラミ
クソウイルスタンパク質には、HN、F1及びF2が含まれる。パラミクソウイルス抗原
は、キメラウイルス内で形成するか又はキメラウイルスに由来する場合がある。例えば、
キメラRSV/PIVウイルスは、RSV及びPIVの両成分を含む場合がある。市販の
ムンプスワクチンには、単価或いは麻疹及び風疹ワクチンと組み合わせた弱毒生ムンプス
ウイルスが含まれる(MMR)。
る場合がある。モルビリウイルス抗原は、以下のタンパク質から1つ以上を選択してもよ
い:ヘマグルチニン(H)、糖タンパク質(G)、融合因子(F)、巨大タンパク質(L
)、核タンパク質(NP)、ポリメラーゼリンタンパク質(P)及びマトリックス(M)
。市販の麻疹ワクチンには、一般的にムンプスワクチン及び風疹ワクチンと組み合わせた
弱毒生麻疹ウイルスが含まれる(MMR)。
イノウイルス、Heparnavirus、カルジオウイルス及びアフタウイルスに由来
する場合がある。エンテロウイルス、例えばポリオウイルスから得た抗原は好ましい。
2型又は3型、コクサッキーA群ウイルス1〜22型及び24型、コクサッキーB群ウイ
ルス1〜6型、エコーウイルス(ECHO)ウイルス1〜9型、11〜27型及び29〜
34型及びエンテロウイルス68〜71型に由来する場合がある。好ましくは、エンテロ
ウイルスはポリオウイルスである。エンテロウイルス抗原は、好ましくは以下のカプシド
タンパク質VP1、VP2、VP3及びVP4から1つ以上選択される。市販のポリオワ
クチンには、不活性ポリオワクチン(IPV)及び経口ポリオウイルスワクチン(OPV
)が含まれる。
肝炎ウイルス(HAV)に由来する場合がある。市販のHAVワクチンには、不活性化し
たHAVワクチンが含まれる。
ス又はアルテリウイルスに由来する場合がある。ルビウイルス、例えば風疹ウイルスに由
来する抗原が好ましい。トガウイルス抗原は、E1、E2、E3、C、NSP−I、NS
PO−2、NSP−3又はNSP−4から選択される場合がある。トガウイルス抗原は、
好ましくはE1、E2又はE3から選択される。市販の風疹ワクチンには、一般的にムン
プスワクチン及び麻疹ワクチンと組み合わせた低温適応生ウイルスが含まれる(MMR)
。
イルス、デング熱ウイルス(1型、2型、3型又は4型)、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウ
イルス、西ナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、
ポワッサン脳炎ウイルスに由来する場合がある。フラビウイルス抗原は、PrM、M、C
、E、NS−1、NS−2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b及びNS5から選
択される場合がある。フラビウイルス抗原は、好ましくはPrM、M及びEから選択され
る。市販のTBEワクチンには、不活化ウイルスワクチンが含まれる。
ス(BVDV)、ブタコレラウイルス(CSFV)又はボーダー病ウイルス(BDV)に
由来する場合がある。
来する場合がある。ヘパドナウイルス抗原は、表面抗原(L、M及びS)、コア抗原(H
Bc、HBe)から選択される場合がある。市販のHBVワクチンには、表面抗原Sタン
パク質を含むサブユニットワクチンが含まれる。
る。HCV抗原は、E1、E2、E1/E2、NS345ポリプロテイン、NS 345
コアポリプロテイン、コア、及び/又は非構造的領域のペプチド(Houghtonら、
Hepatology (1991) 14:381)から1つ以上選択してもよい。
イルス)及びベシクロウイルス(VSV)に由来する場合がある。ラブドウイルス抗原は
、糖タンパク質(G)、核タンパク質(N)、巨大タンパク質(L)、非構造タンパク質
(NS)から選択される場合がある。市販の狂犬病ウイルスワクチンは、ヒト2倍体細胞
又はアカゲザル胎児肺細胞で増殖させた死滅ウイルスを含む。
びノーウォーク様ウイルス、例えばハワイウイルス及びスノーマウンテンウイルスに由来
する場合がある。
ルス、鳥伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、マウス肝炎ウイルス(MHV)及びブタ伝
染性胃腸炎ウイルス(TGEV)に由来する場合がある。コロナウイルス抗原は、スパイ
ク(S)、エンベロープ(E)、マトリックス(M)、ヌクレオカプシド(N)及びヘマ
グルチニン・エステラーゼ糖タンパク質(HE)から選択される場合がある。好ましくは
、コロナウイルス抗原はSARSウイルスに由来する。SARSウイルス抗原は、WO
04/92360に記載されている。
ルス又はスプーマウイルスに由来する場合がある。腫瘍ウイルス抗原は、HTLV−1、
HTL V−2又はHTL V−5に由来する場合がある。レンチウイルス抗原は、HI
V−1又はHIV−2に由来する場合がある。レトロウイルス抗原は、gag、pol、
env、tax、tat、rex、rev、nef、vif、vpu及びvprから選択
される場合がある。HIV抗原は、gag (p24gag及びp55gag)、env
(gρl60及びgp41)、pol、tat、nef、rev vpu、小タンパク
質、(好ましくはp55 gag及びgpl40vデリート)から選択される場合がある
。HIV抗原は、以下の菌株の1つ以上に由来する場合がある:HIVIIIb、HIV
SF2、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN、HIV−1CM235(HIV−1
US4)。
ルス、オルビウイルス又はコルティウイルスに由来する場合がある。レオウイルス抗原は
、構造タンパク質λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、σ1、σ2又はσ3、或いは非構造タ
ンパク質σNS、μNS又はσ1sから選択される場合がある。好ましいレオウイルス抗
原は、ロタウイルスに由来する場合がある。ロタウイルス抗原は、VP1、VP2、VP
3、VP4(又は開裂生成物VP5及びVP8)、NSP1、VP6、NSP3、NSP
2、VP7、NSP4又はNSP5から選択される場合がある。好ましいロタウイルス抗
原には、VP4(又は開裂生成物VP5及びVP8)、及びVP7が含まれる。
来する場合がある。パルボウイルス抗原は、VP−1、VP−2、VP−3、NS−1及
びNS−2から選択される場合がある。好ましくは、パルボウイルス抗原はカプシドタン
パク質VP−2である。
場合がある(例えば米国特許第5,378,814号を参照)。
ウイルス(HSV)、バリセラゾスターウイルス(VZV)、エプスタインバーウイルス
(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、ヒトヘルペスウイルス6型(HHV6)
、ヒトヘルペスウイルス7型(HHV7)及びヒトヘルペスウイルス8型(HHV8)に
由来する場合がある。ヒトヘルペスウイルス抗原は、即初期タンパク質(α)、初期タン
パク質(β)及び後期タンパク質(γ)から選択される場合がある。HSV抗原は、HS
V−1株又はHSV−2株に由来する場合がある。HSV抗原は、糖タンパク質gB、g
C、gD及びgH、融合タンパク質(gB)又は免疫回避タンパク質(gC、gE又はg
I)から選択される場合がある。VZV抗原は、コアタンパク質、ヌクレオカプシドタン
パク質、テグメントタンパク質又はエンベロープタンパク質からを選択してもよい。弱毒
生VZVワクチンが市販されている。EBV抗原は、早期抗原(EA)タンパク質、ウイ
ルスカプシド抗原(VCA)、及び膜抗原(MA)の糖タンパク質から選択される場合が
ある。CMV抗原は、カプシドタンパク質、エンベロープ糖タンパク質(例えばgB及び
gH)、及びテグメントタンパク質から選択される場合がある。
イルスに由来する場合がある。パピロマウイルスには、HPV血清型1型、2型、4型、
5型、6型、8型、11型、13型、16型、18型、31型、33型、35型、39型
、41型、42型、47型、51型、57型、58型、63型及び65型が含まれる。好
ましくは、HPV抗原は血清型6型、11型、16型又は18型に由来する。HPV抗原
は、カプシドタンパク質(L1)及び(L2)、又はE1〜E7、又はその融合体から選
択される場合がある。HPV抗原は、好ましくはウイルス様粒子(VLP)に形成される
。ポリオーマウイルスには、BKウイルス及びJKウイルスが含まれる。ポリオーマウイ
ルス抗原は、VP1、VP2又はVP3から選択される場合がある。
ion(Plotkin and Orenstein ed. 2004);Medi
cal Microbiology 4th Edition (Murrayら、ed
. 2002); Virology, 3rd Edition (W.K. Jok
lik ed. 1988); Fundamental Virology, 2nd
Edition (B.N. Fields and D.M. Knipe, ed
s. 1991)に記載の抗原、組成物、方法、及び微生物も提供される。
本発明で使用する真菌抗原は、以下に記載する真菌類の1つ以上に由来する場合がある
。
ロックソム、ミクロスポルム・オドウニ、ミクロスポルム・カニス、ミクロスポルム・デ
ィストルツム、ミクロスポルム・エクイヌム、ミクロスポルム・ジプサム、ミクロスポル
ム・ナヌム、トリコフィトン・コンセントリカム、トリコフィトン・エクイヌム、トリコ
フィトン・ガリネ、トリコフィトン・ジプセウム、トリコフィトン・メグニニ、トリコフ
ィトン・メンタグロフィテス、トリコフィトン・クインケアナム、トリコフィトン・ルブ
ルム、トリコフィトン・シェーンライニ、トリコフィトン・トンズランス、トリコフィト
ン・ベルコサム、T.ベルコサムvar.アルバム、var.ディスコイデス、var.
オクラセウム、トリコフィトン・ビオラセウム、及び/又はトリコフィトンfavifo
rme。
ギルス・ニガー、アスペルギルス・ニドゥランス、アスペルギルス・テレウス、アスペル
ギルス・シドウィ、アスペルギルスflavatus、アスペルギルス・グラウカス、B
lastoschizomyces capitatus、カンジダ・アルビカンス、カ
ンジダ・エノラーゼ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・クル
セイ、カンジダ・パラシローシス、カンジダ・ステラトイデア、カンジダ・クセイ、カン
ジダparakwsei、カンジダlusitaniae、カンジダ・プソイドトロピカ
リス、カンジダ・ギリエルモンジィ、クラドスポリウム・カリオニイ、コクシジオイデス
・クシジオイデス・イミチス、ブラストマイセス・デルマティディス、クリプトコッカス
・ネオフォルマンス、ゲオトリクム・クラバタム、ヒストプラスマ・カプスラーツム、ク
レブシエラ・ニューモニエ、パラコクシジオイデス・ラジリエンシス、ニューモシスティ
ス・カリニ、ピチウムインシディオサム、ピチロスポルム・オバーレ、サッカロミセス・
セレビシェ、サッカロミセス・ブラウディ、サッカロミセス・ポンベ、セドスポリウム・
アピオスペルム、スポロトリクス・シェンキー、トリコスポロン・ベイゲリ、トキソプラ
スマ、ペニシリウム・マルネッフェイ、マラセジア属、フォンセセア属、ワンギエラ属、
スポロトリクス属、バシディオボールス属、コニディオボルス属、リゾープス属、ケカビ
属、アブシジア属、モルティエラ属、クンニングアメラ属、サクセネア属、アルタナリア
属、クルブラリア属、ヘルミントスポリウム属、フザリウム属、アスペルギルス属、ペニ
シリウム属、モニリニア属、リゾクトニア属、ペシロマイセス属、ピトミセス属及びクラ
ドスポリウム属に由来する場合がある。
4号を参照)。細胞壁を実質的に除去したか或いは少なくとも部分的に除去した真菌性細
胞から得られる不溶部分から抽出され分離された可溶部分を得る好ましい方法において、
プロセスは生きた真菌細胞を得るプロセス、実質的に細胞壁を除去したか或いは少なくと
も部分的に除去した真菌性細胞を得るプロセス、実質的に細胞壁を除去したか或いは少な
くとも部分的に除去した真菌性細胞を破裂させるプロセス、不溶部分を得るプロセス、及
び不溶部分から可溶部分を抽出し分離するプロセスを含むことを特徴とする。
本発明の組成物には、性感染症(STD)に由来する1つ以上の抗原が含まれる場合が
ある。このような抗原は、STD、例えばクラミジア、陰部ヘルペス、肝炎(例えばHC
V)、性器疣贅、淋病、梅毒及び/又は軟性下疳(WO00/15255を参照)の予防
又は治療に提供してもよい。抗原は、ウイルス性又は細菌性STDの1つ以上に由来する
場合がある。本発明で使用するウイルス性STD抗原は、例えばHIV、単純ヘルペスウ
イルス(HSV−1及びHSV−2)、ヒトパピローマウイルス(HPV)及び肝炎(H
CV)に由来する場合がある。本発明で使用する細菌性STD抗原は、例えばナイセリア
・ゴノレエ、クラミジア・トラコマーティス、トレポネーマ・パリダム、ヘモフィルス・
デュクレイ、大腸菌及びストレプトコッカス・アガラクティエに由来する場合がある。こ
れらの病原菌に由来する特異性抗原の例は、上に記載されている。
本発明の組成物には、呼吸器系疾患を引き起こす病原菌に由来する1つ以上の抗原が含
まれる場合がある。例えば、呼吸器系疾患抗原は、呼吸器系ウイルス、例えばオルソミク
ソウイルス(インフルエンザ)、ニューモウイルス(RSV)、パラミクソウイルス(P
IV)、モルビリウイルス(麻疹)、トガウイルス(風疹)、VZV及びコロナウイルス
(SARS)に由来する場合がある。呼吸器系抗原は、呼吸器系疾患を引き起こす細菌、
例えばストレプトコッカス・ニューモニエ、シュードモナス・エルジノーサ、ボルデテラ
・ペルツッシス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコプラズマ・ニューモニ
エ、クラミジア・ニューモニエ、バシラス・アンスラシス及びモラクセラ・カタラーリス
に由来する場合がある。これらの病原菌に由来する特異性抗原の例は、上に記載されてい
る。
本発明の組成物には、小児患者に使用するのに好適な1つ以上の抗原が含まれる場合が
ある。小児患者は一般的に約3歳未満、或いは約2歳未満、或いは約1歳未満である。小
児抗原は、6ヶ月、1年、2年又は3年にわたり複数回投与される場合がある。小児抗原
は、小児群を標的とするウイルス及び/又は小児群が感染しやすいウイルスに由来する場
合がある。小児ウイルス抗原には、オルソミクソウイルス(インフルエンザ)、ニューモ
ウイルス(RSV)、パラミクソウイルス(PIV及びムンプス)、モルビリウイルス(
麻疹)、トガウイルス(風疹)、エンテロウイルス(ポリオ)、HBV、コロナウイルス
(SARS)及びバリセラゾスターウイルス(VZV)、エプスタインバールウイルス(
EBV)の1つ以上に由来する抗原が含まれる。小児細菌抗原には、ストレプトコッカス
・ニューモニエ、ナイセリア・メニンギイテイデイス、ストレプトコッカス・ピオゲネス
(A群ストレプトコッカス)、モラクセラ・カタラーリス、ボルデテラ・ペルツッシス、
スタフィロコッカス・アウレウス、クロストリジウム・テタニ(テタヌス)、コリネバク
テリウム・ジフテリア(ジフテリア)、ヘモフィルス・インフルエンザB型(Hib)、
シュードモナス・エルジノーサ、ストレプトコッカス・アガラクティエ(B群ストレプト
コッカス)及び大腸菌の1つ以上に由来する抗原が含まれる。これらの病原菌に由来する
特異性抗原の例は、上に記載されている。
本発明の組成物には、高齢の個体又は免疫不全の個体に使用するのに好適な1つ以上の
抗原が含まれる場合がある。このような患者は、標的抗原への免疫反応を向上するために
高用量で、又はアジュバント製剤と共に、より頻繁に予防注射を受ける必要があることも
ある。高齢の個体又は免疫不全の個体において使用対象とされる抗原には、以下の病原菌
の1つ以上に由来する抗原が含まれる:ナイセリア・メニンギイテイデイス、ストレプト
コッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス(A群ストレプトコッカス)
、モラクセラ・カタラーリス、ボルデテラ・ペルツッシス、スタフィロコッカス・アウレ
ウス、スタフィロコッカス・エピデルミス、クロストリジウム・テタニ(テタヌス)、コ
リネバクテリウム・ジフテリア(ジフテリア)、ヘモフィルス・インフルエンザB型(H
ib)、シュードモナス・エルジノーサ、レジオネラ・ニューモフィラ、ストレプトコッ
カス・アガラクティエ(B群ストレプトコッカス)、エンテロコッカス・フェカーリス、
ヘリコバクター/ピロリ、クラミジア・ニューモニエ、オルソミクソウイルス(インフル
エンザ)、ニューモウイルス(RSV),パラミクソウイルス(PIV及びムンプス)、
モルビリウイルス(麻疹)、トガウイルス(風疹)、エンテロウイルス(ポリオ)、HB
V、コロナウイルス(SARS)、バリセラゾスターウイルス(VZV)、エプスタイン
バールウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)。これらの病原菌に由来す
る特異性抗原の例は、上に記載されている。
本発明の組成物には、青年患者に使用するのに好適な1つ以上の抗原が含まれる場合が
ある。青年期は、以前に投与された小児用抗原の増強を必要とする場合がある。青年期に
使用するのに好適な小児用抗原については、上に記載されている。又、性活動を開始する
前に予防的・治療的免疫性を確実にするため、青年期をSTD病原菌に由来する抗原を投
与する対象にする場合もある。青年期に使用するのに好適なSTD抗原については、上に
記載されている。
本発明の他の態様では、抗原を吸着した微粒子の生成法を提供する。この方法は以下の
プロセスからなる:(a)(i)水、(ii)界面活性剤、(iii)有機溶媒、及び(
iv)ポリ(αヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルト
エステル、ポリ酸無水物及びポリシアノアクリレートからなる群から選択される生分解性
高分子を含む混合物を分散させることによりエマルジョンを生成するプロセス。高分子は
、一般的に有機溶媒に対して約1〜30%の濃度で混合液中に存在し、界面活性剤は、一
般的に界面活性剤と高分子の重量比が約0.00001:1〜0.1:1(より一般的に
は約0.0001:1〜0.1:1、約0.001:1〜0.1:1又は約0.005:
1〜0.1:1)で混合液中に存在する;(b)エマルジョンから有機溶媒を除去するプ
ロセス;及び(c)微粒子の表面に抗原を吸着させるプロセス。特定の実施形態において
、生分解性高分子は有機溶媒に対して約3%〜10%の濃度で存在する。
のような材料には、ポリ(αヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン
、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、PACA及びポリシアノアクリレートが含まれる
が、これらに限定されない。好ましくは、本発明で使用する微粒子は、ポリ(α−ヒドロ
キシ酸)、特に、ポリ(ラクチド)(PLA)又はD,L−ラクチド、及びグリコリド又
はグリコール酸の共重合体、例えばポリ(D,L−ラクチド−コ−グリコリド))(PL
G又はPLGA)、又はD,L−ラクチド及びカプロラクトンの共重合体に由来する。微
粒子は、種々の分子量を有する種々の高分子出発物質に由来する場合があり、PLGのよ
うな共重合体の場合には、種々のラクチド:グリコリド比の選択は、大部分は部分的に同
時投与する高分子に依存する選択の問題となる。これらのパラメータについては、以下で
詳細に考察する。
581,772に示されている。
以下の参考文献には、本発明の組成物に関して有用な抗原が含まれる。
ク質と結合している。Ramsayら、(2001) Lancet 357(9251
):195−196; Lindberg (1999) Vaccine 17 Su
ppl 2: S28−36; Buttery & Moxon (2000) J
R Coll Physicians Lond 34:163−168; Ahmad
& Chapnick (1999) Infect Dis Clin North
Am 13:113−133, vii; Goldblatt (1998) J.
Med. Microbiol. 47:563−567; 欧州特許第0 477
508号; 米国特許第5,306,492号; WO98/42721; Conju
gate Vaccines (eds. Cruse, et al.) ISBN
3805549326, particularly vol. 10:48−114;
Hermanson (1996) Bioconjugate Technique
s ISBN: 0123423368又は012342335Xを参照されたい。好ま
しい担体タンパク質は、細菌毒素又はトキソイド、例えばジフテリアトキソイド又は破傷
風トキソイドである。特にCRM 197ジフテリアトキソイドが好ましい。
0372501)、合成ペプチド(EPA−0378881及びEPA 0427347
)、熱ショックタンパク質(WO 93/17712及びWO 94/03208)、百
日咳タンパク質(WO 98/58668及びEP A 0471177)、H.influe
nzaeのDタンパク質(WO 00/56360)、サイトカイン(WO 91/0114
6)、C.ディフィシレのリンホカイン、ホルモン、成長因子、トキシンA又はトキシン
B(WO 00/61761)、鉄吸収タンパク質(WO 01/72337)等が含ま
れる。混合物がセリグラフA及びセリグラフCの両方からのカプセル状糖類を含む場合は
、MenA糖類:MenC糖類の比率(w/w)は1以上(例えば2:1、3:1、4:
1、5:1、10:1以上)であることが好ましい。異なる糖類が、種類が同じ又は異な
る担体タンパク質と結合してもよい。必要に応じて、適切な共役結合反応を適切なリンカ
ーと共に使用してもよい。
はによる遺伝学的手段による百日咳毒素の解毒)。
幾つかの実施形態において、本発明の薬学的組成物はBibAポリペプチドを含む(上
に開示した通り他の活性因子を含む場合も含まない場合もある)。他の実施形態において
、薬学的組成物は、BibAポリペプチドをコードする核酸分子を含む(上述のように他
の活性因子をコードする核酸分子を含む場合も含まない場合もある)。核酸ワクチンにつ
いては、例えば以下の文献に記載されている:Robinson & Torres (
1997) Seminars in Immunology 9:271−283;
Donnellyら、(1997) Ann. Rev Immunol 15:617
−648; Scott−Taylor & Dalgleish (2000) Ex
pert Opin Investig Drugs 9:471−480; Apos
tolopoulos & Plebanski (2000) Curr Opin
MoI Ther 2:441−447; Ilan (1999) Curr Opi
n MoI Ther 1:116−120; Dubenskyら、(2000) M
oI Med 6:723−732; Robinson & Pertmer (20
00) Adv Virus Res 55:1−74; Donnellyら、(20
00) Am J Respir Crit Care Med 162(4 Pt 2
):S190−193Davis (1999) Mt. Sinai J. Med.
66:84−90。一般的に、核酸分子は例えばプラスミド状のDNA分子である。他
の実施形態において、薬学的組成物は、BibAポリペプチドに特異的に結合する抗体を
含む。
ましくは6〜8の間、好ましくは7である。pHは、緩衝液を使用して維持することがで
きる。成分は、無菌及び/又はパイロジェン・フリーとすることができる。成分はヒトに
対して等張とすることができる。本発明によるワクチンは、予防又は治療に使用すること
ができるが、一般的に予防用であり、動物(ペット及び実験用哺乳動物を含む)、特にヒ
トの処置に使用することができる。
本発明の組成物は、一般的に上述の成分の他に「薬学的に許容される担体」を1つ以上
含む。これらには、それ自体が組成物の被投与者に害を及ぼす抗体の生成を誘導しない担
体が含まれる。適切な担体は、一般的に大きく、徐々に代謝される高分子、例えばタンパ
ク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー及び
脂質凝集物(例えば油滴又はリポソーム)等である。このような担体は、当業者に周知で
ある。組成物は、希釈液、例えば水、生理的食塩水、グリセロール等を含む場合もある。
更に、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤等の補助剤が存在してもよい。薬学的に許容される
成分については、以下の文献で十分に考察されている:Gennaro (2000)
Remington: The Science and Practice of P
harmacy. 20th ed., ISBN:0683306472。
1. アジュバント
本発明のワクチンは、他の免疫調節剤と共に投与される場合がある。特に、組成物には
通常アジュバントが含まれる。本発明で使用するアジュバントには、以下に記載するもの
の1つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適な組成物含有ミネラルには、ミネ
ラル塩類、例えばアルミニウム塩類及びカルシウム塩類が含まれる。本発明には、ミネラ
ル塩類、例えば水酸化物(例えばオキシ水酸化物)、リン酸塩(例えばヒドロキシリン酸
塩、オルソリン酸塩)、硫酸塩等(例えばVaccine Design... (19
95) eds. Powell & Newman. ISBN: 03064486
7X. Plenum, chs 8 & 9を参照)、又は異なるミネラル化合物の混
合物(例えば、場合によりリン酸塩を多めに含む、リン酸塩及び水酸化物アジュバントの
混合物、)が、適切な形態(例えばゲル、結晶、非結晶、等)の化合物と共に、好ましく
は塩類に吸着して含まれる。組成物含有ミネラルは、金属塩粒子として調製される場合も
ある(WO00/23105)。
にアルミニウム塩類が含まれる場合がある。
ョウバン(硫酸アルミニウムカリウム(AlK(SO4)2))、又はリン酸塩緩衝液に
おいて抗原をミョウバンと混合し、塩基、例えば水酸化アンモニウム又は水酸化ナトリウ
ムを使用して滴定及び沈殿してin−situで形成したミョウバン誘導体である。
ウムアジュバント(Al(OH)3)又はオキシ水酸化アルミニウム結晶(AlOOH)
であり、優れた吸着剤であって、ほぼ500m2/gの表面積を有する。或いは、水酸化
アルミニウムアジュバントの水酸基の一部又は全てを置換したリン酸基を含むリン酸アル
ミニウムアジュバント(AlPO4)又はアルミニウムヒドロキシホスフェートが提供さ
れる。本明細書に示される好ましいリン酸アルミニウムアジュバントは、非晶質で酸性、
塩基性及び中性媒体において可溶性である。
ニウムの両方を含む。より特定のその実施形態において、アジュバントは、水酸化アルミ
ニウムよりリン酸アルミニウムを多く含み、例えばリン酸アルミニウムと水酸化アルミニ
ウムの重量比が2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或い
はそれ以上となる。更に特定の実施形態において、ワクチン中のアルミニウム塩類は、ワ
クチン1用量当たり0.4〜1.0mg、又はワクチン1用量当たり0.4〜0.8mg
、又はワクチン1用量当たり0.5〜0.7mg、又はワクチン1用量当たり約0.6m
g存在する。
とする複数のアジュバント、例えばリン酸アルミニウムと水酸化アルミニウムの割合は、
所望のpHで抗原がアジュバントと反対の電荷を帯びるような分子間の静電引力の最適化
によって選択される。例えば、リン酸アルミニウムアジュバント(等電位点=4)は、p
H 7.4でアルブミンではなくリゾチームを吸着する。アルブミンが標的ならば、水酸
化アルミニウムアジュバントが選択される(等電位点=11.4)。或いは、リン酸塩に
よる水酸化アルミニウムの前処理はその等電位点を低下させ、塩基性の抗原に対して好ま
しいアジュバントになる。
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適な油エマルジョン成分には、スク
アレン−水エマルジョン、例えばMF59(5%のスクアレン、0.5%のTWEENT
M 80及び0.5%のスパン85、マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒
子に調製)が含まれる。WO90/14837を参照されたい。又、Podda, Va
ccine (2001) 19: 2673−2680; Freyら、Vaccin
e (2003) 21:4234−4237も参照されたい。MF59は、インフルエ
ンザウイルス3価サブユニットワクチンFLUADTMにおいてアジュバントとして使用
する。
エマルジョンである。本明細書で使用するのに好ましいサブミクロンの水中油エマルジョ
ンは、場合により異なる量のMTP−PE、例えば4−5% w/vのスクアレン、0.
25−1.0%w/vのTWEENTM 80D(ポリオキシエチレンエチレンソルビタ
ン・モノオレエート)、及び/又は0.25−1.0%のSPAN 85TM(ソルビタ
ントリオレエート)、及び場合によりN−アセチル−L−アラニル−D−イソグルタミニ
ル−L−アラニン−2−(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−(ヒドロキシ
−ホスホリルオキシ))エチルアミド(MTP−PE)、例えば、「MF59」と呼ばれ
るサブミクロンの水中油エマルジョン(国際公開番号WO90/14837、米国特許第
6,299,884号及び6,451,325号、及びOttら、in Vaccine
Design: The Subunit and Adjuvant Approa
ch (Powell, M.F. and Newman, MJ. eds.) P
lenum Press, New York, 1995, pp. 277−296
)を含むサブミクロンの水中油エマルジョンを含むスクアレン/水エマルジョンである。
MF59は、4−5%w/vのスクアレン(例えば4.3%)、0.25−0.5%w/
vのTWEENTM 80、及び0.5%w/vのSPAN 85TMを含み、場合によ
りマイクロフルイダイザー、例えばモデルHOYマイクロフルイダイザー(Microf
luidics[米国マサチューセッツ州ニュートン])を使用してサブミクロン粒子に
調製した種々の量のMTP−PEを含む。本明細書で使用される「MF59−0」という
用語は、上記のサブミクロンのMTP−PE非含有水中油エマルジョンを指し、MF59
−MTPという用語は、MTP−PE含有製剤を表す。例えば、「MF59−100」は
1用量当たり100μgのMTP−PEを含む。本明細書で使用する別のサブミクロンの
水中油エマルジョンであるMF69は、4.3%w/vのスクアレン、0.25%w/v
のTWEENTM 80及び0.75%w/vのSPAN 85TM、及び場合によりM
TP−PEを含む。更に別のサブミクロンの水中油エマルジョンはSAFとも呼ばれるM
F75であり、10%のスクアレン、0.4%のTWEENTM 80、5%のプルロニ
ックブロックポリマーL121、及びサブミクロンのエマルジョンにミクロ流体化したt
hr−MDPを含む。MF75−MTPは、例えば1用量当たり100−400μgのM
TP−PEからのMTPを含むMF75製剤を表す。
えばムラミルペプチドの生成法は、WO90/14837及び米国特許第6,299,8
84号及び第6,451,325号に詳述されている。
も本発明におけるアジュバントとして使用してもよい。
サポニン製剤も、本発明におけるアジュバントとして使用してもよい。サポニンは、種
々の植物類の樹皮、葉、幹、根、及び花に含まれるステロールグリコシド及びトリテルペ
ノイドグリコシドの異種群である。バラ科植物キラヤ(Quillaia sapona
ria Molina)の樹皮から単離されたサポニンは、アジュバントとして広く研究
されている。Smilax ornata (sarsaprilla)、 Gypso
philla paniculata (brides veil)、及びSapona
ria officianalis (soap root)のサポニンも市販されてい
る。サポニンアジュバント製剤には、QS21等の脂質製剤、並びにISCOM等の精製
した製剤が含まれる。
ロマトグラフィー(RP−HPLC)を使用して精製されている。これらの方法を使用し
て精製した特定の画分は特定されており、QS7、QS17、QS18、QS21、QH
−A、QH−B及びQH−Cを含む。好ましくは、サポニンはQS21である。QS21
の生成法については、米国特許第5,057,540号に開示されている。サポニン製剤
には、コレステロール等のステロールが含まれるもある(WO96/33739を参照)
。
るユニークな粒子の形成に使用することができる。ISCOMには、一般的にリン脂質、
例えばホスファチジルエタノールアミン又はホスファチジルコリンも含まれる。任意の既
知のサポニンをISCOMに使用することができる。好ましくは、ISCOMにはQui
l A、QHA及びQHCの1つ以上が含まれる。ISCOMについては、EP0109
942、WO96/11711及びWO96/33739に詳述されている。場合により
、ISCOMSは界面活性剤が無添加である場合がある。WOOO/07621を参照さ
れたい。
d Drug Delivery Reviews (1998) 32:247−27
1を参照されたい。又、Sjolanderら、Advanced Drug Deli
very Reviews (1998) 32:321−338. d. Viros
oraes and Virus Like Particles (VLPs)も参照
されたい。
ることができる。これらの構造体は、一般的に場合によりリン脂質と組み合わせた又は調
製された1つ以上のウイルスタンパク質を含む。これらは一般的に非病原性、非複製性で
あり、一般的に天然のウイルスゲノムを含んでいない。ウイルスタンパク質は、組み換え
で生成しても全ウイルスから単離してもよい。ビロゾーム又はVLPで使用するのに好適
なこれらのウイルスタンパク質は、インフルエンザウイルス(例えばHA又はNA)、B
型肝炎ウイルス(例えばコア又はカプシドタンパク質)、E型肝炎ウイルス、麻疹ウイル
ス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォー
ク・ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、HIV、RNAファージ、Qβファージ(例えばコ
ートタンパク質)、GAファージ、fr−ファージ、AP205ファージ及びTy(例え
ばレトロトランスポゾンTyタンパク質p1)から得たタンパク質を含む。VLPについ
ては、以下の文献で詳しく考察されている:WO03/024480, WO03/02
4481, and Niikuraら、Virology (2002) 293:2
73−280; Lenzら、Journal of Immunology (200
1) 5246−5355; Pintoら、Journal of Infectio
us Diseases (2003) 188:327−338;及びGerberら
、Journal of Virology (2001) 75(10):4752−
4760。ビロゾームについは、例えば以下の文献で詳しく考察されている:Gluck
ら、Vaccine (2002) 20:B10−B 16。免疫増強再構成インフル
エンザ・ビロゾーム(IRIV)は、鼻腔内の3価のINFLEXALTM製品{Mis
chler & Metcalfe (2002) Vaccine 20 Suppl
5 :B 17−23}及びINFLUVAC PLUSTM製品においてサブユニッ
ト抗原送達システムとして使用される。
本発明において使用するのに好適なアジュバントには、以下のような細菌又は微生物の
誘導体が含まれる。
このような誘導体には、モノホスホリル・リピドA(MPL)及び3−O−脱アシル化
MPL(3dMPL)が含まれる。3dMPLは、3 De−O−アシル化モノホスホリ
ル・リピドAと4本、5本又は6本のアシル化された鎖の混合物である。好ましい「小粒
子」形の3 De−O−アシル化モノホスホリル・リピドAは、EP 0 689 45
4に開示されている。3dMPLのこのような「小粒子」は、0.22μの膜を通して無
菌濾過できるほど小さい(EP 0 689 454を参照)。その他の非毒性LPS誘
導体には、モノホスホリル・リピドAの模倣体、例えばアミノアルキル・グルコサミニド
・リン酸塩誘導体、例えばRC 529が含まれる。Johnsonら、(1999)
Bioorg Med Chem Lett 9:2273−2278を参照されたい。
リピドA誘導体には、大腸菌、例えばOM−174のリピドA誘導体が含まれる。OM
−174については、例えばMeraldiら、Vaccine (2003) 21:
2485−2491;及びPajakら、Vaccine (2003) 21:836
−842に記載されている。
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適な免疫刺激性オリゴヌクレオチド
には、CpGモチーフ(グアノシンが後続しリン酸結合によって連結された非メチル化シ
トシンを含む配列)を含むヌクレオチド配列が含まれる。回文配列又はポリ(dG)配列
を含む細菌の2本鎖RNA又はオリゴヌクレオチドも免疫刺激性であることが示されてい
る。
もよく、又、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。場合によりグアノシンは、アナロ
グ、例えば2’−デオキシ−7−デアザグアノシンと置き換えられる場合もある。可能な
アナログ置換の例については、Kandimallaら、Nucleic Acids
Research (2003) 31(9): 2393−2400; WO02/2
6757及びWO99/62923を参照されたい。CpGオリゴヌクレオチドのアジュ
バント効果については、以下の文献で詳しく考察されている:Krieg, Natur
e Medicine (2003) 9(7): 831−835; McClusk
ieら、FEMS Immunology and Medical Microbio
logy (2002) 32:179−185; WO98/40100;米国特許第
6,207,646号;米国特許第6,239,116号及び米国特許第 6,429,
199号。
もよい。Kandimallaら、Biochemical Society Tran
sactions (2003) 31 (part 3): 654−658を参照さ
れたい。CpG配列は、Th1免疫反応の誘導、例えばCpG−A ODNに対して特異
的であってもよく、或いはB細胞反応の誘導、例えばCpG−A ODNに対してより特
異的であってもよい。CpG−A及びCpG−B ODNについては、以下の文献で考察
されている:Blackwellら、J. Immunol. (2003) 170(
8):4061−4068; Krieg, TRENDS in Immunolog
y (2002) 23(2): 64−65及びWOO 1/95935。好ましくは
、CpGはCpG−A ODNである。
に構築する。場合により、2つのCpGオリゴヌクレオチド配列は、それらの3’末端に
結合し「イミュノマー」を形成する場合もある。例えば、Kandimallaら、BB
RC (2003) 306:948−953; Kandimallaら、Bioch
emical Society Transactions (2003) 31(ρa
rt 3):664−658; Bhagatら、BBRC (2003) 300:8
53−861及びWO03/035836を参照されたい。
細菌性のADPリボシル化毒素及びその解毒された誘導体は、本発明においてアジュバ
ントとして使用してもよい。好ましくは、タンパク質は大腸菌(即ち大腸菌易熱性エンテ
ロトキシン(LT))、コレラ(CT)、又はペルツッシス(PT)に由来する。解毒さ
れたADPリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用についてはWO95/172
11に、非経口アジュバントとしての使用についてはWO98/42375に記載されて
いる。好ましくは、アジュバントは解毒されたLT変異体、例えばLT−K63、LT−
R72及びLTR192Gである。ADPリボシル化毒素及びその解毒された誘導体、特
にLT−K63及びLT−R72のアジュバントとしての使用は、以下の参考文献で見る
ことができる:Beignonら、Infection and Immunity (
2002) 70(6):3012−3019; Pizzaら、Vaccine (2
001) 19:2534−2541; Pizzaら、Int. J. Med. M
icrobiol (2000) 290(4−5):455−461; Schart
on−Kerstenら、Infection and Immunity (2000
) 68(9):5306−5313; Ryanら、Infection and I
mmunity (1999) 67(12): 6270−6280; Partid
osら、Immunol. Lett. (1999) 67(3):209−216;
Peppoloniら、Vaccines (2003) 2(2):285−293
; and Pineら、(2002) J. Control Release (2
002) 85(l−3):263−270。アミノ酸置換の参照番号は、好ましくはD
omenighiniら、Mol. Microbiol (1995) 15(6):
1165−1167に記載のADPリボシル化毒素のサブユニットA及びサブユニットB
の配列に基づく。
本発明におけるアジュバントとして生体付着剤及び粘膜付着剤を使用してもよい。好適
な生体付着剤には、エステル化ヒアルロン酸微粒子(Singhら、(2001) J.
Cont. Rele. 70:267−276) 又は粘膜付着剤、例えばポリアク
リル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類及びカルボキシメチルセ
ルロースの架橋結合された誘導体が含まれる。キトサン及びその誘導体を本発明における
アジュバントとして使用してもよい。WO99/27960を参照されたい。
微粒子を本発明におけるアジュバントとして使用してもよい。生分解性で無毒性材料(
例えばポリ(αヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水
物、ポリカプロラクトン等)とポリ(ラクチド−コ−グリコリド)から形成された微粒子
(即ち、直径約100nm〜150μm、より好ましくは直径約200nm〜30μm、
最も好ましくは直径約500nm〜10μmの粒子)が好ましく、場合により、負に帯電
した表面(例えばSDSで)又は正に帯電した表面(例えば陽イオン清浄剤、例えばCT
ABで)を有するように処理される。
アジュバントとして使用するのに好適なリポソーム製剤の例は、米国特許第6,090
,406号、米国特許第5,916,588号及びEP 0 626 169に記載され
ている。
本発明において使用するのに好適なアジュバントには、ポリオキシエチレンエーテル及
びポリオキシエチレンエステルが含まれる。WO99/52549。更にこのような製剤
には、オクトキシノール(WOO 1/21207)と組み合わせたポリオキシエチレン
ソルビタンエステル界面活性剤、並びに少なくとも1つの補助的な非イオン性界面活性剤
、例えばオクトキシノール(WOO 1/21152)と組み合わせたポリオキシエチレ
ンアルキルエーテル又はエステル界面活性剤も含まれる。
ン−9−ラウリルエーテル(ラウレス9)、ポリオキシエチレン−9−ステアリルエーテ
ル、ポリオキシエチレン−8−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−4−ラウリル
エーテル、ポリオキシエチレン−35−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−23
−ラウリルエーテル。
PCPP製剤については、例えば、以下の文献に記載されている:Andrianov
ら、“Preparation of hydrogel microspheres
by coacervation of aqueous polyphophazen
e solutions”, Biomaterials (1998) 19(1−3
): 109−115;及びPayneら、“Protein Release fro
m Polyphosphazene Matrices”, Adv. Drug.
Delivery Review (1998) 31(3):185−196。
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適なムラミルペプチドの例には、N
−アセチル−ムラミルL−トレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−ア
セチル−ノルムラミル−1−アラニル−d−イソグルタミン(nor−MDP)、及びN
アセチルムラミル−l−アラニル−d−イソグルタミニル−l−アラニン−2−(r−2
’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミ
ンMTP−PEが含まれる。
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適なイミダゾキノリン化合物の例に
は、イミキモド及びそのアナログが含まれるが、詳細は以下の文献に記載されている:S
tanley, Clin Exp Dermatol (2002) 27(7):5
71−577; Jones, Curr Opin Investig Drugs
(2003) 4(2):214−218;及び、米国特許第4,689,338号、第
5,389,640号、第5,268,376号、第4,929,624号、第5,26
6,575号、第5,352,784号、第5,494,916号、第5,482,93
6号、第5,346,905号、第5,395,937号、第5,238,944号、及
び第5,525,612号。
チオセミカルバゾン化合物、並びに本発明においてアジュバントとして使用するのに好
適な全化合物の調製法、製造法及びスクリーニング法には、WO04/60308に記載
されるものが含まれる。チオセミカルバゾンは、サイトカイン、例えばTNF−αの生成
のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に効果的である。
トリプタントリン化合物の例、並びに本発明においてアジュバントとして使用するのに
好適な全化合物の調製法、製造法及びスクリーニング法には、WO04/64759に記
載されるものが含まれる。トリプタントリン化合物は、サイトカイン、例えばTNF−α
の生成のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に効果的である。
。例えば、本発明において以下のアジュバント成分が使用される場合がある:
(1)サポニン及び水中油エマルジョン(WO99/11241);
(2)サポニン(例えばQS21)+無毒性LPS誘導体(例えば3dMPL)(WO
94/00153を参照);
(3)サポニン(例えばQS21)+無毒性LPS誘導体(例えば3dMPL)+コレ
ステロール;
(4)サポニン(例えばQS21)+3dMPL+IL 12(場合により+ステロー
ル)(WO98/57659);
(5)3dMPLと例えばQS21及び/又は水中油エマルジョンの組み合わせ(欧州
特許出願第0835318号、第0735898号及び第0761231号を参照);
(6)10%のスクアラン、0.4%のTWEEN 80、5%のプルロニックブロッ
クポリマーL 121及びthr−MDPを含み、サブミクロンエマルジョンにミクロ流
体化されたか、又はより大きな粒子径のエマルジョンを生成するために撹拌されたSAF
;
(7)2%のスクアレン、0.2%のTWEEN 80及びモノホスホリル・リピドA
(MPL)及びトレハロースジミコレート(TDM)及び細胞壁骨格(CWS)、好まし
くはMPL+CWS(DetoxTM)からなる群の1つ以上の細菌細胞壁成分を含むR
ibiTMアジュバントシステム(RAS)、(Ribi Immunochem);
(8)1つ以上のミネラル塩(例えばアルミニウム塩)+LPSの無毒性誘導体(例え
ば3dPML);及び
(9)1つ以上のミネラル塩(例えばアルミニウム塩)+免疫刺激性オリゴヌクレオチ
ド(例えばCpGモチーフを含むヌクレオチド配列)。
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適なヒト免疫調節薬には、サイトカ
イン、例えばインターロイキン(例えばIL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL
−6、IL−7、IL−12等)、インターフェロン(例えばインターフェロンγ)、マ
クロファージコロニー刺激因子及び腫瘍壊死因子が含まれる。
しいアジュバントである。細菌毒素及び生体付着剤は、経粘膜送達ワクチン、例えば点鼻
ワクチンとの使用に好ましいアジュバントである。
うに参考として組み入れられている。
本発明は、上記組成物を使用してS.アガラクティエへの免疫反応を誘導又は増大する
方法を提供する。免疫反応は好ましくは予防的であり、抗体及び/又は細胞媒介性免疫(
全身的及び粘膜の免疫性を含んで)を含んでもよい。免疫反応には既往反応が含まれる。
抗体を含む組成物は、S.アガラクティエ感染症の処置に使用することができる。
炎が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物は、その他のストレプトコッカ
ス菌、例えばGBSに対しても効果的である。
治療の有効性を評価する1つの方法は、本発明の組成物投与後のGBS感染症をモニタ
ーする。予防的治療の有効性を評価する1つの方法は、本発明の組成物投与後の上記組成
物におけるGBS抗原に対する免疫反応をモニターする。
を組み換えにより発現すること、及び免疫ブロット法によって患者血清又は粘膜分泌をス
クリーニングすることである。タンパク質と患者血清の間の陽性反応は、患者が以前、問
題のタンパク質に対する免疫反応起こしたことがある、即ちそのタンパク質が免疫原であ
ることを示す。この方法は、主要抗原タンパク質及び/又はエピトープを特定するために
使用してもよい。
することである。予防的治療の有効性を確認する1つの方法は、本発明の組成物投与後の
本組成物におけるGBS抗原に対する免疫反応を全身的にモニターする(例えばIgG1
及びIgG2a生成レベルをモニターする)及び粘膜的にモニターする(例えばIgA生
成レベルをモニターする)。一般的に、GBS血清特異抗体反応は免疫処置後であるが接
種前に判定するが、粘膜のGBS特異抗体反応は免疫処置後及び接種後に判定する。
in vivoの動物モデルにおいて評価することができる。特に有用なマウスモデルは
、以下の実施例21に記載する能動母体免疫化試験である。これは、試験抗原組成物でメ
スのマウスを免疫化するin vivo保護試験である。続いて、雌マウスを飼育し、致
死量のGBSをその仔獣に接種する。免疫化計画中の雌マウスの血清滴定量を、接種後の
仔獣の生存時間と共に測定する。
Laboratories, Calco Italy)を1つ以上のGBS抗原(例
えば100μLのPBSに懸濁したBibAポリペプチド20μg)で免疫化する。各群
に0日目、21日目、35日目に3回投与する。初回投与は等量の完全フロイントアジュ
バント(CFA)、以下の2回の投与は不完全フロインドアジュバント(IFA)と共に
タンパク質を腹腔内注射して免疫化を行う。各免疫化スキームにおいて、陰性及び陽性対
照群を使用する。0日目及び49日目に得られた血清サンプルを使用して免疫反応をモニ
ターする。各マウス群からのプールとして血清を分析する。
改善或いは増強或いは変質した免疫反応である。免疫反応は、全身及び粘膜免疫反応の1
つ又は両方である。好ましくは、免疫反応は増強されたシステム及び/又は粘膜反応であ
る。
反映される。好ましくは、増強された免疫反応には、IgG1及び/又はIgG2a及び
/又はIgAの生成の上昇が含まれる。
gA生成の上昇が含まれる。
活性化されたTH2細胞は、IL−4、IL−5、IL−6及びIL−10の1つ以上を
分泌する。TH2免疫反応は、将来の保護のためIgG1、IgE、IgA及び記憶B細
胞を生成する場合がある。
−4、IL−5、IL−6及びIL−1O)の1つ以上の上昇又はIgG1、IgE、I
gA及び記憶B細胞の生成の上昇が含まれる。好ましくは、増強されたTH2免疫反応に
は、IgG1生成の上昇が含まれる。
ン(例えばIL−2、IFNγ及びTNFβ)の上昇、活性化マクロファージの上昇、N
K活性の上昇、又はIgG2a生成の上昇の1つ以上が含まれる。好ましくは、増強され
たTH1免疫反応には、IgG2a生成の上昇が含まれる。
ドをコードする核酸分子)を含む免疫原性成分は、単独で或いはその他のGBS抗原と組
み合わせて場合によりTh1及び/又はTh2反応を誘発することができる免疫調節剤と
共に使用される場合がある。
pGモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む免疫原性成分も含む。最も好ましくは、免
疫原性成分には、アルミニウム塩、及びCpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドの何れ
も含まれる。或いは、免疫原性成分には、ADPリボシル化毒素、例えば解毒されたAD
Pリボシル化毒素、及びCpGモチーフを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。好ましく
は、免疫調節剤の1つ以上にはアジュバントが含まれる。アジュバントは、以下に詳述す
るTH1アジュバント及びTH2アジュバントからなる1つ以上の群から選択される場合
がある。
並びに体液免疫反応の両方を誘発する。この免疫反応は、好ましくは持続性の(例えば中
和)抗体及びBibAポリペプチド曝露に迅速に対応することができる細胞性免疫を誘導
する。
疫原性成分は中和抗体反応を誘発する1つ以上のGBS抗原及び細胞性免疫反応を誘発す
る1つ以上のGBS抗原を含んでもよい。このように、中和抗体反応は初期のGBS感染
症を予防又は阻害するが、増強されたTh1細胞反応を誘発することができる細胞媒介免
疫反応は、更にGBS感染症の拡大を予防する。好ましくは、免疫原性成分は1つ以上の
GBS表面抗原及び1つ以上のGBS細胞質抗原、例えばTh1細胞反応を誘発すること
ができる細胞質抗原を含む。
本発明の組成物は、種々の形態で調製してもよい。例えば、組成物は溶液又は懸濁液と
して注射可能に調製することができる。注射前に液体溶媒に溶解又は懸濁することに適し
た固体製剤も調製することができる(例えば凍結乾燥組成物)。組成物は、経口投与用に
、例えば錠剤又はカプセル、スプレー、又はシロップとして(場合により味付けして)調
製することができる。組成物は、例えば微粉又はスプレーを使用する吸入剤として肺内投
与用に調製することができる。組成物は、坐薬又はペッサリーとして調製することができ
る。組成物は、例えば滴剤として点鼻、点耳、点眼投与用に調製することができる。組成
物は、患者に投与する直前に混合組成物を再構成するように設計されたキットの形態にす
ることができる。このようなキットは、液状の形態において1つ以上のGBS又は他の抗
原及び1つ以上の凍結乾燥抗原を含む場合がある。
又はBibAポリペプチドをコードする核酸分子)又はBibA抗体を含む。「免疫学的
有効量」とは、単回投与又は連続投与の一部として個体に投与された場合、測定可能な免
疫反応を増大するか又は臨床症状を予防又は軽減する量である。
型GBS抗原を1つ以上含む組成物の投与後に抗生物質が投与される。GBS感染症の処
置に使用するのに好適な抗生物質の例には、ペニシリン又はその誘導体が含まれるが、こ
れらに限定されない。
本発明の組成物は、一般的に患者に直接投与される。本発明の組成物は、単独で又は組
成物の一部として種々の異なる径路で投与される場合がある。特定の組成物については、
より効果的な免疫反応、好ましくはCMI反応が生じるよう、或いは副作用を誘発しない
よう、或いは投与し易くなるような特定の径路が好ましい。
注射)及び経直腸投与、経口投与(例えば錠剤、スプレー)、経膣投与、局所投与、経皮
投与(例えば、WO 99/27961を参照)、経皮投与(例えば、WO02/074
244及びWO02/064162を参照)、鼻腔内(例えばWO03/028760を
参照)、眼内、耳内及び肺内の粘膜投与が含まれる。
合もあれば、特定の組織に直接投与される場合がある。本明細書で使用される「全身的投
与」という用語には、非経口投与経路が含まれるが、これに限定されない。特に、非経口
投与には、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、胸骨内注射、
或いは静脈内注入、動脈内注入、或いは腎臓透析注入法が含まれるが、これらに限定され
ない。好ましくは、全身的、非経口投与は筋肉内注射である。本明細書で使用される「粘
膜投与」という用語には、経口投与、鼻内投与、膣内投与、直腸内投与、気管内投与、腸
内投与及び眼内投与が含まれるが、これらに限定されない。
とができるが、治療ワクチンは一般的にティーンエイジャー又は成人に投与される。小児
用ワクチンは、例えば安全性、用量、免疫原性、等を評価するために成人に投与される場
合がある。
実施形態においては、本発明の組成物を投与する前に抗生物質が投与される。
、一次免疫処置計画及び/又は追加免疫処置計画において使用される場合がある。複数回
投与計画においては、種々の用量を同一又は異なる径路、例えば非経口プライムと粘膜ブ
ースト、粘膜プライムと非経口ブースト等によって投与される場合がある。
れる個体の分類群(例えばヒト以外の霊長類、霊長類等)、個体の免疫システムの抗体合
成能力、必要な保護度、ワクチンの調製、治療医による病状の評価、及びその他の関連要
因によって異なる。その量は、ルーチン試験を通じて決定することができる比較的広範囲
に及ぶ。
本発明は、本発明の組成物又はその成分を含む1つ以上の容器からなる1つ以上のキッ
トも提供する。組成物は、組成物の個々の成分と同様に液体又は凍結乾燥にすることがで
きる。組成物に好適な容器には、例えば瓶、バイアル、シリンジ及び試験管が含まれる。
容器は、ガラス又はプラスチックを含め種々の材料からを形成することができる。容器は
、無菌のアクセスポートが付いていてもよい(例えば、容器は静脈用注射液バッグ又は皮
下注射ニードルによって貫通できるストッパーの付いたバイアルであってもよい)。
キストロース溶液を含む第2の容器を含んでもよい。又、その他の緩衝液、賦形剤、フィ
ルター、ニードル及びシリンジを含め、エンドユーザにとって有用なその他の材料を含ん
でもよい。キットは、別の活性因子、例えば抗生物質の入った第2又は第3の容器を含ん
でもよい。
付文書を含んでもよい。添付文書は、未公認の草案の添付文書であっても、或いは米国食
品薬品局(FDA)又は他の規制団体によって承認された添付文書であってもよい。
本発明は、BibAに結合するか又は活性を修飾する試験化合物をスクリーニングする
ための試験を提供する。試験化合物は、好ましくは(1)コイルドコイルドメインに結合
し、BibAの補体、例えばC4結合タンパク質との相互作用又はBibAダイマーの形
成を阻害する;或いは(b)プロリンリッチドメインに結合し、BibAの宿主上皮細胞
への結合を阻害する;(c)BibAのN末端領域に結合し、BibAのIgAへの結合
を阻害する;或いは(d)BibAの種々の部分に結合し、IgGのタンパク質への結合
を阻害する。試験は、本発明の全長のBibAタンパク質又はBibAポリペプチドを使
用して実行してもよい。
試験化合物は、当該技術分野で既知の薬理作用物質であっても、或いは薬理作用も有す
ることが以前に知られていなかった化合物であってもよい。化合物は天然であっても、実
験室で設計されてもよい。これらは、微生物、動物又は植物から単離されてもよければ、
組み換えで生成されてもよく、当該技術分野で既知の化学的方法によって合成されてもよ
く、或いは当該技術分野で種々のコンビナトリアルライブラリー法(生物学的ライブラリ
ー、空間的にアドレス可能な平行固相又は液相ライブラリー、デコンボリューションを必
要とする合成ライブラリー法、「1ビーズ1化合物」ライブラリー法、及び親和性クロマ
トグラフィー選別を利用した合成ライブラリー法を含むが、これらに限定されない)を使
用して得てもよい。
当該技術分野で既知の何れの方法も、試験化合物とBibA領域の結合の検出又はBi
bA領域とその生物学的標的との結合を分離するために使用してよい。
何れかが、検知可能なラベル、例えば蛍光、ラジオアイソトープ、化学発光又は酵素ラベ
ル、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ又はルシフ
ェラーゼを含んでもよい。このようなラベルの検出法は、当該技術分野で周知である。或
いは、反応体のどちらかを標識せずに結合を判定してもよい。例えば、McConnel
lら、Science 257, 1906−12, 1992を参照されたい。リアル
タイムの二分子相互作用分析(BIA)(Sjolander & Urbaniczk
y, Anal. Chem. 63, 2338−2345, 1991, and
Szaboら、Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699−
705, 1995)のような技術を使用してもよい。
域に結合するか相互作用する他のタンパク質を特定するために2ハイブリッド試験又は3
ハイブリッド試験における「ベイトタンパク質」として使用してもよい(例えば、以下の
文献を参照:米国特許第5,283,317号;Zervosら、Cell 72, 2
23−232, 1993; Maduraら、J. Biol. Chem. 268
, 12046−12054, 1993; Bartelら、BioTechniqu
es 14, 920−924, 1993; Iwabuchiら、Oncogene
8, 1693−1696, 1993; 及びBrent W094/10300)
。
的標的の間の結合が試験化合物によって阻害又は妨害されるかどうか検知するために使用
することができる。
細書に明示的に組み入れらている。上記の開示内容は、本発明の概要であり、以下の特定
の実施例を参照することでより詳細に理解することができるが、これらの実施例は単に例
示を目的としたものであって、本発明の適用範囲を限定することを目的としたものではな
い。
BibAのダイマー形成可能性
本実施例は、BibAがダイマーを形成することができることを実証する。高解像度分
画法では、分子は大きい順にマトリックスの細孔から溶出する。小さな分子ほどマトリッ
クスの細孔にアクセスし易く、従ってカラムを下降する。図3A及び3Bを参照されたい
。
BibAタンパク質の表面結合
GBS細菌を二次的なFITC結合αマウスIgG抗体のみで培養した。陰性対照とし
てフロイントアジュバント(αPBS)で免疫化されたマウス血清でも細菌を処理した。
図4A及び4Bの「α−PBS」とラベルしたグラフは陰性対照を示す。BibAレベル
は、α−BibA血清及び免疫前血清で処理した細胞間の蛍光の平均値の変化で表す。蛍
光の平均(Δ平均)の変化を得るため、免疫前血清で培養した細菌をα−BibA血清で
処理した細菌と比較した。
が、515株及びCJB 111株は結合を示さなかった(Δ平均=0)。図5も参照さ
れたい。
BibAタンパク質クラスター
GBS 515株(pAM401−SAG2063)をTHB培地(10mL)で一晩
培養した。一晩培養物1mLの細菌細胞を新鮮なTHB培地5mLに再懸濁し、37℃で
OD 0.5(固定相)まで培養した。次に、細菌を室温、3000rpmで10分間遠
心分離し、洗浄後1mLのPBSに再懸濁した。ホルムバール・カーボンコートしたニッ
ケルグリッドをGBS懸濁液の小滴に10分間浮かべた。次に、グリッドを2%のPFA
で15分間固定し、遮断溶液(1%の正常ウサギ血清及び1%のBSAを含むPBS)に
入れた。次に、グリッドをBibAに対する一次抗血清(mαBibA)の小滴(遮断溶
液で1:50に希釈)に室温で30分間浮かし、6滴の遮断溶液で洗浄後、10nmの金
粒子に結合した二次抗体(1%のBSAに1:25に希釈)に30分間浮かべた。次に、
4滴のPBS、続いて4滴の蒸留水でグリッドを洗浄した後、空気乾燥させた。GEOL
1200 EX 11透過型電子顕微鏡を使用してグリッドを検査した。
515 pAM401株の表面におけるBibA発現
図7Aに示す通り、BamH1及びSalI制限部位を使用して、それ自体のプロモー
ター及びターミネーターを含むBibA遺伝子(SAG2063)をpAM401ベクタ
ーにクローニングした。GBS 2603V/R株及び515 Ia株をこの構成で形質
転換した。
63)株表面に露出されることを示した。図7B。
2603株表面におけるBibA発現の増加
FACS分析は、2603(pAM401−SAG2063)株表面におけるBibA
タンパク質の露出が2603 wt株に対して増大することを示した。結果を図8に示す
。
BibAの分泌された形態
GBSタンパク質抽出物をSDS−PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜に移
した。次に、タンパク質をマウスα−BibAポリクローナル抗体でオーバーレイし、H
RP結合二次抗体で染色した。図10に示す通り、BibA 515株及びCJB111
株の分離では、培養液上清(分泌されたタンパク質分画)においてのみBibAタンパク
質が見られた。これは、BibA 515株及びCJB111株においてプロリンリッチ
モチーフを欠くBibAタンパク質の短縮形態が分泌物中に発現されることを実証する。
図10を参照されたい。
BibAのC4結合タンパク質(C4BP)への結合
組み換えBibAタンパク質をニトロセルロース膜上で乾燥させ、組み換えc4結合タ
ンパク質で培養した。次に、マウスa−C4BPモノクローナル抗体を使用して結合タン
パク質を検出し、HRP結合抗体で染色した。図11Aは、異なる濃度のBibAタンパ
ク質をHRP結合抗体で染色したドットブロットであるが、BibAがC4結合タンパク
質に結合することを実証している。
上にブロットした後、組み換えC4結合タンパク質で培養した。次に、マウスa−C4B
Pモノクローナル抗体を使用して結合タンパク質を検出し、HRP結合抗体で染色した。
図11Bは、BibAがC4結合タンパク質に結合することを確証するウェスタンブロッ
トを示す。
BibAタンパク質の上皮細胞表面への結合
BibAタンパク質の存在下及び非存在下でME180頚部細胞を培養し、次にマウス
α−BibAポリクローナル抗体を添加した。次に、ME180頚部細胞をFITC結合
αマウスIgG二次抗体で染色した。ME 180頚部細胞をFITC結合αマウスIg
G二次抗体のみで(即ちマウスα−BibAポリクローナル抗体の非存在下で)処理する
ことによって陽性対照を得た。分析をCaco2腸細胞、A549肺胞細胞及び16HB
E140の気管支細胞で繰り返した。陰性対照として、BibAと同様にクローニングし
たGBS7タンパク質を使用した。
養した細胞間の蛍光強度の差としてFACScan血球計算器によって測定した。結果を
図12に示す。「二次抗体のみ」の領域は、FITC結合抗体でのみで処理された細胞を
示す。Dmeanチャンネル値で表したBibA結合を、BibAの存在下及び非存在下
で培養した細胞間の蛍光強度の差としてFACScan血球計算器によって測定した。陰
性対照として、BibAと同様にクローニングしたGBS7タンパク質を使用した。
プロリンリッチモチーフによるBibAの上皮細胞表面への結合
ビオチニル化BibAタンパク質又はビオチニル化BibA断片の存在下で上皮細胞を
培養し、次にFITC結合ストレプトアビジンで染色した。紫の領域は、FITC結合ス
トレプトアビジンのみで処理した細胞を示す。δ平均チャンネル値として表したBibA
結合を、タンパク質の存在下及び非存在下で培養した細胞間の蛍光強度の差としてFAC
Scan血球計算器によって測定した。
皮細胞表面に結合することを実証する。図25A及び25B、図26も参照されたい。
精製ヒトIgGのBibAタンパク質への結合
精製したGBS3−His、GBS3Nt〜His(Nt)、GBS3−Nt1−Hi
s(Nt1)、GBS3−T−His(T)、GBS3−Ct−His(Ct)、GBS
Mタンパク質(M1)(陽性対照)及びGBS 104(陰性対照)をSDS−4%−
12%PAGEゲル(200V)で分離し、ニトロセルロース膜(35V、1時間、15
分)に移した。ニトロセルロース膜を5%Milk−PBS−0.1% Tween20
(PBS−T)を使用してRTで1時間遮断し、PBS−T内でRTで1時間免疫グロブ
リン(ヒトIgA又はヒトIgG)でオーバーレイした。膜をPBS−Tで3回洗浄し、
5%Milk−PBS−0.1% Tween20において二次HRP結合抗体(1:1
000)でオーバーレイした後、PBS−Tで3回洗浄した。ECLTM基質を使用して
、免疫グロブリンへの陽性結合を検出した。
ヒトIgGに結合することを実証する。
ヒト及びウサギIgGに対するBibA−Hisの特異性
BibA−HisをSDS−PAGEで分離し、次にニトロセルロース膜に移した。遮
断後に、膜を異なる種の血清で培養し、次にHRP結合抗IgG抗体で標識した。比色定
量キットでタンパク質を明らかにした。
gGに対して特異的であり、マウスIgGを結合しないことを実証する。
精製ヒトIgAのBibAタンパク質への結合
精製したBibA−His、BibA−Nt−His(Nt)、BibA−Nt1−H
is(Nt1)、BibA−T−His(T)、BibA−Ct−His(Ct)、GB
S Mタンパク質(M1)(陽性対照)及びGBS104(陰性対照)をSDS−4%−
12%PAGEゲル(200V)で分離し、ニトロセルロース膜(35V、1時間、15
分)に移した。ニトロセルロース膜を5%Milk−PBS−0.1% Tween 2
0(PBS−T)を使用してRTで1時間遮断し、PBS−T内で結合したヒト−IgA
HRPを使用してRTで1時間オーバーレイした。膜をPBS−Tで3回洗浄した。EC
LTM基質を使用して、免疫グロブリンへの陽性結合を検出した。膜を5%Milk−P
BS−Tを使用してRTで1時間培養することによってタンパク質を遮断した。膜をPB
S−T内でヒトIgGHRP(5μg/mL)を使用して1.5時間培養し、次にPBS
−Tで3回洗浄した。ECLTM基質(PIERCEキット: SuperSignal
West Pico化学発光基質)及び4−CNキット(BIO−RAD)を使用して
、免疫グロブリンへの陽性結合を検出した。
に結合することを実証する。
ゲルで分離した。h−IgAHRP(1mL/mL)をニトロセルロース膜に移すタンパ
ク質にオーバーレイした。結果を図16に示す。トリプシンによる消化は、まだh−Ig
Aに結合する32kDaの断片を生成する。
に示す。FACS分析は、BibA過剰発現突然変異株の表面に結合するIgAの増加を
明らかにした。
BibAタンパク質の完全型又は短縮型の生成
BibAタンパク質の完全型又は短縮型をコードするプラスミドを以下のように構築し
た。2603ゲノムをテンプレートとして使用して、BibA領域をPCRによって増幅
した。使用したオリゴヌクレオチドプライマーを表1に示す。順方向プライマーは全てN
deI制限部位を含んでいた。逆方向プライマーは全てXhoI制限部位を含んでいた。
PCR生成物は、NdeI及びXhoIで消化され、NdeI及びXhoI制限pET2
1b(+)でゲル精製及び連結された。全構成は、DNA塩基配列決定によって確認され
た。組換え型タンパク質は、発現されたHis−tagタンパク質であった。
る。
一部を含んでいた。
34aa〜609aa
(実施例14)
実験手順
細胞の培養
ヒト頚部上皮細胞株ME 180を米国菌株保存機関(ATCC;米国メリーランド州
ロックヴィル)から購入した。ME180細胞を熱不活性化したウシ胎児血清(FBS)
10%が入ったRPMI 1640培地において培養した。肺癌細胞株A549(II型
肺胞上皮細胞)及び結腸癌上皮細胞株Caco2もATCCから購入し、10%のFBS
、4.5g/Lのグルコース及び非必須アミノ酸を添加したDMEMにおいて培養した。
SV40ラージT抗原で形質転換したヒト気管支上皮細胞株16HBE 14(Grif
antiniら、2002)を、10%のFBS、1.5mMのグルタミン及び100μ
g/mLの硫酸カナマイシンを添加したDMEMにおいて培養した。
本研究では、S.アガラクティエ2603V/R株及び515 Ia株を使用した。B
ibAタンパク質保存を判定するために、S.アガラクティエ株のパネルを分析した。大
腸菌DH5α及びDH10BT1をクローン目的に、大腸菌BL21(DE3)をBib
A融合タンパク質の発現用に使用した。S.アガラクティエを37℃のトッド・ヒューウ
ィット培地(THB)においてOD600 0.4まで増殖した。プラスミドpAM40
1bibAを有するS.アガラクティエ株をクロラムフェニコール(10μg/mL)の
存在下で培養した。大腸菌は、ルリア培地において培養した。プラスミドpAM401b
ibA、pJRS233ΔbibA又はpET21(b)+誘導体を有する大腸菌クロー
ンをクロラムフェニコール(20μg/mL)、エリスロマイシン(400μg/mL)
又はそれぞれアンピシリン(100μg/mL)の存在下で培養した。
Lauerら、2005に記載されている手順に従ってBibA遺伝子をS.アガラク
ティエ2603V/R株から除去した。プライマー
を使用して、スプライシングオーバーラップ伸長(SOE)PCR法によりインフレーム
欠失断片を得た。この断片をXhoI消化pJRS233プラスミドにクローニングする
ため、XhoI制限酵素開裂部位をプライマーの5’末端(太字イタリック体)に組み込
んだ。インフレーム欠失断片をpJRS233にクローニングした後、プラスミドpJR
S233ΔbibAを得た。
形質転換し、1μg/mLエリスロマイシンを含む30℃の寒天プレートにおいて培養後
に形質転換細胞を選択した。次に、Maguinら、1996の記載に従って、形質転換
細胞を37℃のエリスロマイシン選択で培養した。組み込み株をエリスロマイシン選択の
ない30℃の液体培地において5日間連続して継代培養してプラスミドpJRS233Δ
bibAの除去を促進させ、染色体上のBibAを欠失させた。連続継代培養物の希釈液
を寒天プレートに塗布し、pJRS233ΔbibAの除去を確認するため単一コロニー
のエリスロマイシン感受性を試験した。
それ自体のプロモーター及びターミネーターを含むBibA遺伝子を、プライマー
を使用して、PCR法によってS.アガラクティエ2603V/R株の染色体DNAから
増幅した。PCR生成物をBamHI/SalI消化大腸菌ストレプトコッカスpAM4
01発現コンストラクトにクローニングするため、制限酵素開裂部位BamHI及びSa
lIをプライマーの5’末端(太字のイタリック体)に組み込んだ。BibA遺伝子をp
AM401にクローニングすることによってプラスミドpAM401bibAを得た。電
気穿孔法によりプラスミドpAM401bibAを以下のクロラムフェニコール選択で2
603V/R株及び515 I株に転換した。
BibAの組み換え型を発現するため、テンプレートとしてS.アガラクティエ260
3株のBibA遺伝子のオープンリーディングフレームを使用した。以下のNdeI及び
XhoIの制限酵素部位を導入した特定のプライマーを使用したPCRによってコンスト
ラクトを増幅した:
5’−GGAATTCCATATGCACGCGGATACTAGTTCAGGA−3’
(配列番号50)、及び
5’−CCCGCTCGAGAATTGCTAAGAGTGGACTTGC−3’(配列
番号51)。
イマーを使用した:
5’−GGAATTCCATATGCACGCGGATACTAGTTCAGGA−3’
(配列番号52)、及び
5’−CCCGCTCGAGACCTCTGGTAAGGTCTTGAA−3’(配列番
号53)。
マーを使用した:
5’−GGAATTCCATATGCCAGACCTTACCAGAGGT−3’(配列
番号54)、及び
5’−CCCGCTCGAGCGTAATAAGACCTGCACTT−3’(配列番号
55)。
3)細胞を転換するために使用した。BL21(DE3)細胞をLB−Amp(100の
μg/mLのアンピシリン)で培養し、最終濃度1mMのIPTGで3時間誘導した。得
られたバイオマスを0.3MのNaCl、50mMのNa−PO4緩衝液(pH 8.0
)に懸濁し、ベーシックZモデル細胞破砕機(Constant Systems[英国
ダベントリー])を使用して18,000psiで細胞を2代まで溶解した。次に、サン
プルを5mL/minの流量でHis−Trap Ni−Activatedキレーティ
ングセファロースFFカラム(Amersham Biosciences[イタリア
ミラノ])に投入した。次に、500mMのイミダゾール、0.3MのNaCl、50m
M のNaリン酸塩緩衝液(12 CVにおいてpH 8.0)の0〜50%の勾配を通
すことによって結合タンパク質をカラムから溶出した。IMAC(固定化金属アフィニテ
ィカラム)に溶出した物質を2.5mL画分に収集し、BibA−Hisタンパク質を含
む画分をプールした。次に、収集したプールをHiLoad 26/60 Superd
ex 200ゲル濾過カラム(Amersham Biosciences[イタリア
ミラノ])に投入した。タンパク質を2.5mL/分の流量で均一濃度溶出し、2.5m
Lの画分を収集した。
細菌をOD600 0.4まで増殖し、GBSタンパク質抽出物を調製した。得られた
ペレットをPBSで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤及びムタノリシン400 U/mL(S
IGMA[米国モンタナ州])を含む37℃のトリス塩酸5OmM(pH6.8)500
μLにおいて1時間培養した。次に、細菌懸濁液をペレットにし、ペプチドグリカン結合
タンパク質を含む上清を使用してBibAのウェスタンブロット分析を行った。分泌され
たタンパク質分画を含むGBS抽出物を調製するため、OD600 0.4まで増殖した
細菌培養物の上清を収集し、PAGEにおいて直接使用した。
細菌表面におけるBibAの露出を定量化するため、GBSをOD600 0.4まで
増殖し、0.1%のBSAと20%の正常子ウシ血清(NCS)を加えた4℃のウサギ抗
BibA血清又はウサギ抗PBS血清(陰性対照)において1時間培養した。次に、細菌
を0.1%のBSAを含むPBSで洗浄し、4℃のフィコエリトリン(PE)結合二次抗
体(Jackson Immuno Research[米国ペンシルベニア州])にお
いて45分培養した。洗浄後、2%のPFAにてRTで20分細菌を固定、200μLの
PBSに再懸濁して、FACSscanフローサイトメーター(Becton Dick
inson)によってBecton DickinsonのCell Questソフト
ウェアプログラムを使用して分析した。
℃で1時間培養した。次に、細胞を5%のFCS中のウサギ抗BibA血清で、4℃で4
5分培養した。次に、細胞をPBSで2度洗浄し、4℃のPE結合二次抗体で45分培養
した。細胞結合蛍光を、細胞探究プログラムを使用してFACSで分析した。タンパク質
の存在下又は非存在下で培養した細胞のMFI値を比較した。
200μLに2%のFBSを加えた感染培地(抗生物質を含まない基本培地)において
、ME180及びA549上皮細胞を約10細菌/細胞で感染させた。5%のCO2(v
/v)における37℃で3時間の培養終了時に、ウェル内容物に1%のサポニンを添加後
に総コロニー形成単位(c.f.u)を推定した。試験中に存在する総c.f.uに対す
る細胞内c.f.uの割合の決定により粘着性を定量化した。
GBS株2603V/R、2603ΔbibA、515 Ia及び515pAM401
bibAをTHB培地(10mL)にて一晩培養した。一晩培養物1mLの細菌細胞を新
鮮なTHB培地5mLに再懸濁し、37℃でOD 0.3(指数増殖期)まで増殖した。
次に、細菌を3000rpm(RT)で10分間遠心分離し、洗浄後、1mLのPBSに
再懸濁した。ホルムバール・カーボンコートしたニッケルグリッドをGBS懸濁液の小滴
に5分間浮かべた。次に、グリッドを2%のPFAにおいて5分間固定し、遮断溶液(1
%の正常ウサギ血清及び1%のBSAを含むPBS)に30分浸した。次に、遮断溶液に
おいてグリッドをBibAタンパク質に対して1:20に希釈した一次抗血清の小滴にR
Tで30分浮かべ、6滴の遮断溶液で洗浄し、1%のBSAにおいて1:10に希釈した
10nmの金粒子に結合した二次抗体に30分浮かべた。TEM GEOL 1200E
X II透過型電子顕微鏡を使用して、グリッドを検査した。
A549細胞を10%のFBS、4.5g/Lのグルコース及び非必須アミノ酸を加え
た1mLのDMEMにおけるLab−TekIIチャンバースライドシステム(Nalg
ene)において密集するまで増殖させた。次に、細胞をMOI 10:1で細菌に感染
させ、37℃で2時間培養した。次に、細胞を2%のパラホルムアルデヒドにおいて室温
(RT)で30分又は4℃で一晩固定した。固定後、単一層を3%のBSAで遮断し、1
%のBSAに希釈したマウス抗カプセル及びウサギ抗BibAポリクローナル抗体の混合
物と共にRTで1時間培養した。次に、細菌をヤギ抗マウス及び抗ウサギのAlexa
fluor(Molecular Probes)結合抗体(それぞれ568nm及び4
88nmで励起)によりRTで1時間染色した。F−アクチンをAlexa Fluor
622結合ファロイジンで染色した。次に、スライド・グラスからチャンバー壁を除去
した。スローフェード試薬キット(Molecular Probes)を使用してカバ
ーグラスを載せた。Bio−Rad共焦点走査型顕微鏡を使用してスライドを観察した。
ドットブロット分析において、BIORADドットブロットシステムを使用して精製し
た組み換えBibAタンパク質(範囲約2〜0.01μg)をニトロセルロース膜に吸収
させた。5%のミルクで飽和後、膜を0.5μg/mLの血清精製ヒトIgA(Pier
ce)又はヒトIgG(SIGMA)で培養した。洗浄後、膜をHRP結合ウサギ抗ヒト
IgA(Dako)或いはHRP結合ヤギ抗ヒトIgG(BD)で培養し、ECLによっ
て陽性結合を検出した。
血漿から得た精製C4BPをKordia Life Science(オランダ ライ
デン)から購入した。BibAのC4BPへの結合を明らかにするために、マウスモノク
ローナル抗C4BP抗体(BIOTREND Chemikalien[ドイツ ケルン
])を使用した。
によって、BibAのIg又はC4BPへの結合のウェスタンブロット分析を行った。次
に、膜を5%のミルクにおいて遮断し、5μg/mLの(a)正常ヒト血清から精製した
IgG(SIGMA)、(b)正常マウス血清から精製したIgG(SIGMA)c)ウ
シ血清から精製したIgG(SIGMA)、d)ヒト血清から精製したIgA(Pier
ce)、(e)ヒト初乳から精製したIgA(SIGMA)、或いは(f)ヒト血漿C4
BP(Kordia Life Science[オランダ])で1時間オーバーレイし
た。洗浄後、膜をそれぞれのHRP結合二次抗体で培養し、ECLにて検出を行った。
ClustalW(Thompsonら、1994)を使用して、2603V/R株(
GenBank受入番号NP_689049;配列番号56)、18RS21株(AAJ
O00000000;配列番号57)、515 Ia株(AAJP00000000;配
列番号58)、NEM316株(NP_736451;配列番号59)、H36B株(A
AJS000000O0;配列番号60)、CJB111株(AAJQ00000000
;配列番号61)、A909株(YP_330593;配列番号62;配列番号67も参
照)及びCOH1株(AAJR00000000;配列番号63)のアライメントを行っ
た。
BibAがGBS表面に露出されることを示す追加の証拠
図19Aに示す通り、指数増殖期(OD600=0.35)で増殖した2603V/R
株のFACS分析は、抗BibA抗体染色後の細菌蛍光の変化を明らかにした。これは、
BibAがGBS表面に暴露されることを示した。この結果は、2603V/R表面上の
BibAの陽性免疫金ラベルを示す透過型免疫電子顕微鏡(IEM)によって更に確認さ
れた(図19B)。2603V/Rの細菌抽出物のウェスタンブロット分析は、ペプチド
グリカン結合タンパク分画及び細菌上清の両方において抗BibA抗体によって認識され
た単一バンドの存在を示した(図19C)。BibAとして同定されたバンドは、予想で
は66kDMWであるのに対して見かけ上は約80kDmWであった(図19C)。Bi
bAのC末端領域のプロリンリッチモチーフの存在は、このような差によるものと考えら
れる。実際、プロリンリッチドメインがタンパク質の電気泳動の移動を遅らせることが分
かっている(Hollingsheadら、1986)。指数増殖期又は定常期で増殖し
た細菌の比較分析は、表面露出又は分泌タンパク質としてのBibAの発現の差を示さな
かった(データ非表示)。予想通り、BibAノックアウト突然変異株は、BibA F
ACS陽性蛍光又は免疫金表面標識を示さなかった(図19D及び19E)。
証するため、フレームシフトによりタンパク質がLPXTG(配列番号3)モチーフを欠
き、従って短縮型で発現されると予測される515 Ia株におけるBibAの表面露出
を調べた(Tettelinら、2005)。FACS分析及びIEMは何れも、このよ
うな株では、BibAは表面に露出されなかったことを立証した(図19E及び19F)
。更に、ウェスタンブロット分析は、BibAが515 Iaの細菌上清において見られ
るが、ペプチドグリカン結合画分では見られないことを示した(図19G)。見かけの分
子量38kDは、予測された短縮型と一致している。BibA遺伝子及びその調節要素(
pAM401bibA)を含む2603V/R領域を有するプラスミドを515 Ia株
に導入した場合、ウェスタンブロット、FACS及びIEM分析によって実証されたよう
にBibAは転座、細菌表面に固定された(図19H、19I及び19L)。
BibAのヒト免疫グロブリンへの特異的結合
BibAの配列分析がストレプトコッカスの免疫グロブリン結合タンパク質との類似性
を示したため、精製した血清由来免疫グロブリン(Ig)でオーバーレイした組み換えB
ibAのウェスタンブロット分析を行った。実験的な陽性対照は、IgG及びIgA結合
タンパク質であるGBSのM1タンパク質であった(Cunningham, 2000
)。最近報告されたGBS線毛成分のタンパク質GBS 104 (Lauerら、20
05)を無関係な陰性対照として使用した。図20Aに示す通り、BibAは精製ヒト血
清IgGに特異的に結合するがマウス又はウシIgGには結合しない。一方、M1タンパ
ク質はヒト、マウス及びウシIgGアイソフォームと同レベルで反応した。
た。M1タンパク質については、BibAは血清由来IgA及び分泌型IgAの両方を明
確に認識する(図20B)。結合特性がゲル変性条件によらないことを実証するため、固
有のドットブロット実験を行った。組み換えBibAタンパク質をニトロセルロース膜上
で連続して希釈し、0.5μg/mLの精製ヒト血清IgG及びIgAで調べた。図20
C及び20Dに示す通り、天然BibAのIgによるプロービングはヒトIgG及びIg
Aへの結合を立証した。ヒトIgAに対するBibAの反応性はヒトIgGより強いこと
が示された。実際、IgAへの陽性結合は既に0.4μgのBibA濃度で観察されたが
、IgGでは結合に必要なBibA濃度は1.0μgであった(図20D)。一方、Bi
bAへの強い結合はIgGでのみ検出された(図20C)。
34−394)又はC末端部分(aa 400−600)を含む2つのコンストラクトを
生成した。オーバーレイ免疫ブロット試験により、これら2つのBibAコンストラクト
のヒトIgG及びIgAへの結合について試験した。図20Eに示す通り、ヒトIgGに
結合するBibAは主にタンパク質のN末端領域に存在するが、C末端部分が関与する結
合も観察された。一方、ヒトIgAへの結合は専らBibAのN末端部分が関与した(図
20F)。
BibAのヒト補体制御因子C4bpへの結合
BibA及びMタンパク質の両方がヒトIgAに結合するため、以前に記載された(C
arlssonら、2003)Mタンパク質がC4b結合タンパク質(C4bp)と結合
する能力がBibAにもあるか調べた。変性条件及び非変性条件の両方において、C4b
pオーバーレイブロットによってBibA結合活性を試験した。図21に示す通り、SD
S−ゲル電気泳動で分離した組み換えBibA(図21A)或いはニトロセルロース膜上
に天然型で点在した組み換えBibA(図21B)は、5μg/mLでC4bpオーバー
レイと高度に反応する。M1も両条件において同様にC4bpに結合したが、2603V
/Rゲノムから無作為選択した陰性対照タンパク質(GBS201)は結合しなかった。
興味深いことに、BibAは、補体活性化第2経路制御H因子に対して結合を示さなかっ
た。BibAのN末端及びC末端コンストラクトをC4bp結合についても試験した。図
21Cに示す通り、SDS−PAGE分離BibAのオーバーレイブロットは、タンパク
質のN末端領域がC4bpに特異的に結合するのに十分であることを示した。C末端部分
では、結合が見られなかった。
BibA組換え型タンパク質の上皮細胞への結合
BibAがコイルドコイルドメインを形成する傾向のコンピュータシミュレーションに
よる予測は、接着型表現型を示唆した。最初に2603V/R株に発現された組み換えB
ibAのME 180頚部上皮細胞に結合する能力を試験した。異なる濃度の組換え型タ
ンパク質で細胞を、4℃で1時間培養してBibA結合を行った。組み換えBibAを免
疫原として得たウサギポリクローナル血清を一次抗体として使用し、結合をRフィコエリ
トリン結合二次抗体によって検出した。抗体非特異的結合を決定するために、タンパク質
の非存在下で一次ポリクローナル抗体により細胞を培養した。BibAの濃度を増加した
ME 180細胞の培養後、BibAの結合は約5μg/mL濃度でプラトーに達するこ
とを発見した。
、遊離BibA濃度に対するBibA受容体複合体の蛍光強度の平均値をプロットするこ
とによって組み換えBibAの推定受容体に対する親和性を評価した(図22B)。次に
、Kd値を細胞上の推定受容体の50%の飽和を決定するBibA濃度として計算し、約
4×10−8Mのレベルと評価した。組み換えBibAの腸(Caco2)、肺(A54
9)及び気管支(16HBE)上皮細胞株への結合も試験した。これらの細胞を10μg
/mLの組み換えBibAにおいて培養した場合、偏移強度が細胞型によって異なっても
、BibA−受容体複合体の蛍光の平均値は有意に増加した(図22C)。
GBSの上皮細胞への付着におけるBibAの関与
組み換えBibAの付着性が上皮細胞との相互作用における機能的役割に関係すること
を確認するため、2603V/R野生型株を細菌表面にタンパク質を発現しない同質遺伝
子型BibAノックアウト突然変異株と比較する結合試験を行った(図19D)。図23
A及びBに示す通り、2603V/R株表面のBibAの欠如はGBSがME 180及
びA549細胞の両方に結合する能力を有意に減少させた(p<0.05)。pAM40
1bibAプラスミドの挿入による突然変異の補充は接着型表現型を復元した(データ非
表示)。2603ΔbibA株が上皮細胞に付着する能力の阻害も、共焦点イメージング
実験から明らかであった。2603V/R野生型株及び同質遺伝子型BibAノックアウ
ト突然変異株をウサギ抗BibA及びマウス抗血清型Vポリクローナル抗体で染色した。
結合細菌数は、BibA突然変異株において減少した。これらの結果は、結合試験によっ
て得られた結果と全体的に一致した。pAM401bibAプラスミドによる2603V
/R野生型株の形質転換を細菌表面のBibA露出を増加させるツールとして使用した。
FACS実験は、2603 pAM401bibA株が野生型株と比較して蛍光強度チャ
ンネル数を30%上昇したことを立証した。結合試験は、BibA過剰発現がGBSの上
皮細胞に付着する能力と機能的に関係することを実証した。実際、野生型株2603と比
較して、pAM401bibA株はME180及びA549細胞の両方に対して付着の増
加を示した(図23A及び23B)。
3V/R型のBibA(515 pAM401bibA)を発現することができた。
このような発現が2603V/Rの野生型株の場合と同様に機能的な接着型表現型に関連
することを実証するため、515 Ia野生型株及び515 pAM401bibAの間
の上皮細胞への結合レベルを比較した。515 Ia表面のBibA露出により、ME
180及びA549細胞の両方に結合する細菌の割合が有意に増加した(図23A及び2
3B)。この表現型は、共焦点顕微鏡イメージングによっても明らかであった(図23E
及び23F)。
BibAゲノムの特性解析
最近ゲノム配列が決定された2603V/R(Tettelinら、2002)、NE
M316 III型(Glaserら、2002)、COH1 III型、CJB111
V型、515 Ia型、18RS21 II型及びA909 Ia型(Tetteli
nら、2005)株におけるゲノム分析によると、bibAはこれらの全株に存在するが
、A909の反対のストランドにおける2つの推定トランスポザーゼの挿入によって阻害
されることが示された。この挿入は、ヌクレオチド580におけるリーディングフレーム
を阻害する。515 Ia株に存在するbibA遺伝子は、タンパク質がN末端376ア
ミノ酸から成りプロリンリッチ及び細胞壁固定領域を欠く短縮型となるフレームシフトを
示す(図19G)。類似したフレームシフトはCJB111株にも生じ、N末端469ア
ミノ酸が翻訳される。このようなタンパク質断片は、CJB111の上清に見られた。最
も一般的な血清型を代表する31の菌株のGBS上清のウェスタンブロット分析は、Bi
bAが菌株の81%に存在することを明らかにした(表4)。
ではBibAが専ら細菌上清において回収されることが示された。しかし、BibAの細
菌表面の露出は、上清における存在と完全に関係していた。
される。1つは、N末端領域又はプロリンリッチドメインに見られる短いアミノ酸モジュ
ールの可変性配列数の存在である。特に、IKAESIN(配列番号65)及びKIQX
KXNT(配列番号66)の反復を有する91アミノ酸領域の存在がA909、CJB1
1及びH36BのN末端領域に見られるが、PEAK/PDVKモジュールの複写数は1
7〜42の間で変動する(表3を参照)。これは、転置要素の挿入/除去を示唆する。
り、515、NEM316、H36B、CJB111及びA909株を特徴付ける。総体
として、配列分析により、タンパク質は3つの異なる変異型で存在し、1つは2603、
18RS21及びCOH1株によって形成され、もう1つはNEM316及び515株に
よって形成され、最後の1つはCJB111、H36B及びA909株によって形成され
ることが明らかとなった(図24)。しかし、BibAアミノ酸配列の複数のアライメン
トは、タンパク質が一般的に十分に保存される(アミノ酸同一性は、異なる菌株のN末端
領域の63.3〜100%の範囲である)ことを示すが、COH1の例外で、N末端領域
は他の対立形質に対して平均で約25%アミノ酸同一性を示す。
能動的母体免疫試験
マウスにおける抗原の予防効果を確認するために、GBS感染症の母体免疫/新生仔チ
ャレンジモデルを使用する。Rodewaldら、J. Infect. Diseas
es 166, 635, 1992を参照されたい。CD−1雌マウス(週齢6〜8週
)を出産前に免疫化する。マウスに、単一の抗原で免疫化する場合は1用量当たり20μ
gのタンパク質を投与し、抗原を組み合わせて免疫化する場合は1用量当たり60μgの
タンパク質(各抗原15μg)を投与する。マウスは最後の免疫接種の2−7日後に出産
する。誕生から48時間以内に、仔獣にGBS培養物50μlを腹腔内注射する。使用前
に冷凍培養物から開始しTHBで適切な濃度に希釈してチャレンジ接種物を調製する。予
備実験において、試験株毎に1仔獣当たりのチャレンジ用量を、死亡率が90%となるよ
うに決定する。仔獣の生存をチャレンジの2日後にモニターする。予防率を100×(対
照群死亡率−ワクチン投与群死亡率)/対照群死亡率で計算する。フィッシャーの正確確
率検定によりデータの統計的有意性を評価する。
ヒト血液におけるBibAノックアウト突然変異株の除去の容易性
ヒトドナーから採血した新鮮な血液において、in vivoの細菌生存におけるBi
bA発現の重要性を評価した。GBSをOD600 0.4まで増殖し、洗浄後、PBS
に再懸濁した。100μL中10 4 CFUの接種原を、抗凝血剤としてヘパリンを使
用してヒトから採血した新鮮な血液300μLと混合した。試験管を37℃で撹拌しなが
ら3時間培養し、CFUを測定するため希釈液を塗布した。
アウト突然変異株のヒト全血液における複製能力について比較した。試験終了時に回収さ
れた細菌数の時間0の細菌に対する割合として、細菌の生存指数を計算した。5人のドナ
ーについて試験し、2603V/R野生型株は、ヒト血液において2603ΔbibA突
然変異株より5倍効率的に増殖することを発見した。しかし、生存率はドナーによって異
なった。血液において野生型株が徐々に複製した(5〜14回)3人のドナーにおいては
、bibAノックアウト突然変異株は殆ど除去された。対照的に、野生型株が血液におい
て高度に複製した(77回及び41回)2人のドナーでは、より非効率的であるが(それ
ぞれ37回及び5回)bibA突然変異株はなお増殖した。これらの結果は、抗細菌活性
の低下したドナーにおいては、血液中のGBS生存に対するBibAの寄与はあまり顕著
でないことを示唆する。
BibA発現によって影響される多核白血球(PMN)による補体媒介GBS殺滅
ヒト血液によるGBSの食細胞クリアランスは、主として補体存在下でオプソニン化細
菌を殺滅するPMNが媒介する。ヒトPMNによる2603V/R野生型株及びbibA
突然変異株の殺滅を比較した。PMNを、Maioneら、Science 309,
148−50の記載に従ってデキストラン沈降、フィコール−ハイパーク密度勾配遠心分
離法及び残余赤血球の低張溶解によって、正常で健康なボランティアのヘパリン抗凝固処
理静脈血から得た。
603ΔbibAを増殖の中対数期(OD600 0.4)に収集し、HBSS(Gib
co−BRL)で洗浄後、107 CFU/mLの濃度に調整した。GB(106 CF
U)を、抗GBS抗体を含む、37℃、5%のヒト血清で15分間オプソニン化した。細
菌をPMNで3時間培養し、TSAプレート上の定量接種によって生存細菌数を決定した
。
時間の培養終了時、bibA突然変異株は野生型株より効率的に殺滅された。実際、PM
Nの食作用に対して野生型株の30%が生存したが、変異体細菌では7%のみが生存した
。補体の熱不活性化により、野生型及びbibA突然変異株の両方が生存し、実験中5〜
6倍複製した(図30)。
Claims (1)
- 明細書に記載の発明。
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